TW200944228A - Non-pathogenic and/or attenuated bacteria capable of inducing apoptosis in macrophages, process of manufacturing and uses thereof - Google Patents

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200944228 六、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明關於能誘發巨噬細胞凋亡之非致病性及/或減 毒之細菌及製造彼之方法。這些非致病性及/或減毒之細 菌可被用來作爲藥物，特別是用於治療各種腫瘤。 【先前技術】

西元1 893年，威廉柯里（William B. Coley)描述急性 鏈球菌感染之病患中的腫瘤消退（Coley WB，Clin Orthop Relat Res, 1991: 3-11)。 自彼時起，陸續發現其他細菌會在腫瘤中浸潤、複 製，然後優先地聚積其中（Yu YA. et al·, Nat Biotechnol 2004，22: 3 1 3-320; Jain RK & Forbes NS，Proceedings of the National Academy of Sciences 200 1，98: 14748-14750; Dang LH et al., Proc Natl Acad Sci USA 2001，98: 1 5 1 5 5-15160; Parker RC et al., Proc Soc Exp Biol Med 1947，66: 461-467; Malmgren RA & Flanigan CC，Cancer Res 1 955， 1 5: 473-478; Moese JR, Med Klin 1964，59: 1 1 89-1 1 92; Geri eke D et al., Cancer Res 1 964，24: 21 7-221; Thiele EH et al., Cancer Res 1 964, 24: 222-233; Carey RW et al., Eur. J. Cancer 1 967，3: 37-46; Kohwi Y et al. 5 Gann 1 978， 69: 613-618; Brown JM & Giaccia A J, Cancer Res 1 998，

5 8: 1 408-1 4 1 6; Fox M et al·，Gene Ther. 1 996，3: 1 73-1 78; Lemmon M et al·，Gene Ther. 1 997，4: 791 -796; Sznol M -5- 200944228 et al., J Clin Invest 2000, 10 5: 1027-1030; Low KB et al., Nat Biotechnol 1999，17: 37-41; Clairmont C et al.，J Infect Dis 2000，1 8 1: 1 996-2002; Yazawa K et al., Cancer Gene Ther 2000，7: 269-274; Yazawa K. et al.，Breast

Cancer Res Treat 2001，66: 165-1 70; Kimura NT et al·,

Cancer Res 1 980，40 : 206 1-2068) 〇 人們提出一些可能導致細菌在腫瘤中增殖的因素。在 腫瘤中發現的異常血管供應被認爲是細菌定植在腫瘤中的 重要因素。當腫瘤或轉移發生時，它們刺激血管生成以促 進新血管之形成。然而，該新形成之血管係高度解組，其 內皮內襯不完整且具有盲端，導致血液流動遲緩且無法有 效率地將養分及氧氣輸送至腫瘤或轉移處。該解組及有洞 之血管結構可能有利細菌進入腫瘤組織，且血管化不足之 腫瘤生長導致腫瘤內部多個低氧及無氧區域（Jain RK & Forbes NS， Proceedings of the National Academy of Sciences 2001，98: 1 4748- 1 4750; Dang L H et al·，P r o c

Natl Acad Sci U S A 2001，98: 15155-15160; Brown JM， Cancer Res 1 999，59: 5 863-5 8 70; Vaupel PW, Tumour Oxygenation. Gustav Fischer Verlag 1 995，2 1 9-232)。

營養輸送不良及氧氣匱乏之組合導致腫瘤內部非增生 性之低氧/無氧細胞且促進細胞外厭氧性（如梭菌類）及兼性 厭氧細菌如大腸桿菌之生長（Jain RK & Forbes NS， Proceedings of the National Academy of Sciences 200 1, 98: 1 4748-14750; Dang LH et al., Proc Natl Acad Sci U S 200944228 A 2001，98: 1 5 1 55- 1 5 1 60; Brown JM, Cancer Res 1999，59: 5863-5870; Y aupel P W, Tumour Oxygenation. Gustav Fischer Verlag 1 995，2 1 9 -23 2 )。 該細胞外細菌之抗腫瘤效果，如經基因改質之絕對嗜 氧菌梭菌，可歸因於局部產生對缺氧區域之腫瘤細胞具毒 性之因子及誘發發炎（Agrawal N et al·，Proc Natl Acad Sci USA. 2004， 101(42)： 15172-15177)° φ 兼性細胞內細菌如沙門氏桿菌也被用於腫瘤治療，在 —些實驗模型中係爲有效（Jain RK & Forbes NS， Proceedings of the National Academy of Sciences 2 0 0 1, 98: 14748-14750; Low KB et al.，Nat Biotechnol 1 999，17: 3 7-4 1; Clairmont C et al.，J Infect Dis 2000，1 81: 1 996-2 0 0 2; Pawelek，J. M ., Low, K. B. and Bermudes，D. Cancer Res. 1 997，57: 4537-4544)。同樣的，誘發發炎反應被認 爲是媒介該抗腫瘤效果。然而，沙門氏桿菌作爲人抗腫瘤 φ 劑之效果僅爲中等程度。 最近’使用細胞內細菌運送DNA至真核細胞中已被 描述。因此’細胞內細菌如沙門氏桿菌、志賀氏桿菌或李 氏桿菌可被用來直接運送治療性分子例如毒素或藥物前體 轉換酶至腫瘤細胞中。相對於誘發發炎反應或利用細胞外 細菌之治療方式’細胞內細菌之腫瘤標靶效果受制於受感 染之腫瘤細胞的份量及特性。 然而’目前無法獲得有關被細胞內細菌感染之腫瘤細 胞的份量之定量資訊，同時也不知道該受感染之細胞的特 200944228 性。 事實上，腫瘤並非完全由惡性細胞組成，而是由轉化 細胞及腫瘤基質之複合性混合物所組成。此外，非轉化之 基質細胞相較於在它們生理周圍環境中之相等細胞通常展 現明顯的表現型。在許多腫瘤中，屬於單核球-巨噬細胞 系之細胞係腫瘤白血球浸潤的主要成分。腫瘤相關性巨噬 細胞（ΤΑΜ)源自循環血液單核球。它們的原位補充及存活 係由腫瘤衍生性細胞激素及化學激素所引導（Mantovani A et al., Immunol Today 1 9 9 2, 13: 265-270)。在本文中，用 語TAM係用來描述存在於腫瘤中之F4/80+ CDllb +巨噬細 胞，並不暗示額外之功能性特徵。 在組織學上，許多巨噬細胞似乎聚集在血管化不足、 缺氧之部位或其鄰近部位，該處可能已經發生大量組織傷 害。有報告指出在乳癌（Leek RD et al _, C ancer Res 1 996, 56: 4625-4629; Leek RD et a 1., Br J Cancer 1 9 9 9, 79: 9 91-995; Lewis J S et al., J Pathol 2000, 1 92: 150-158)及 卵巢癌（Negus RP et al., Am J Pathol 1 9 9 7, 1 50: 1 723- 1 73 4)之無血管及壞死部位有大量之巨噬細胞，並與不良 預後有關。腫瘤內之環境包括缺氧可誘發巨嗟細胞之分泌 活性的顯著變化，引起巨噬細胞釋放出血管生成前驅性及 發炎性細胞激素二者，此亦可由獨特表面標記如CD2 06 之表現上明顯得知（Cazin M. et al. Eur Respir J 1990，3: 1015-1022; Yun JK et al. Proc Natl Acad Sci USA 1 997, 94: 13903-13908; T sukamoto Y et al. J Clin Invest 1 996, 200944228

98: 1 9 3 0-1 94 1; Rymsa B et al., Res Commun Chem Pathol Pharmacol 1 990， 68: 2 6 3-266; Rymsa B et al., Am J

Physiol 1 99 1, 26 1 : G602-G607; Leeper-Woodford SK &

Mills JW Am J Respir Cell Mol Biol 1 992, 6: 326-334; Luo Y et al. J Clin Invest 2006, 1 1 6: 21 32-2 141 )。 一些作者認爲TAM之特徵爲表現數種前腫瘤功能之 M2巨噬細胞，該些功能包括促進血管生成、基質重塑及 抑制適應性免疫（Mantovani A et al·, Cancer Metastasis Rev 2006，25: 3 1 5-322; Luo Y et al. J Clin Invest 2006, 116: 2132-2141; Mantovani A et a 1., European Journal of Cancer 2004, 4 0 : 1 6 60-1 667)。另外，大部分 T AM 與在試 管內培養之巨噬細胞相比，似乎也無法產生活性氧及氮中 間體（Siegert A et al·，Immunology 1 999，98: 55 1 -556;

Murdoch C et al.，Int J Cancer 2005，1 1 7: 70 1 -708)且吞喷 作用受損。這些缺陷可能是造成細菌在腫瘤組織中延長增 殖的主要原因，包括在正常狀況下輕易地被吞噬細胞清除 之非致病性細菌，雖然有大量巨噬細胞存在。 最近，韋伯等人（Weibel et al·, Cell Microbiol 200 8, Postprint; doi: 1 0.1 1 1 1/j. 1 462-5 822 · 200 8.0 1 1 22 . x)指出， 專性胞外菌大腸桿菌K12在腫瘤組織中也有巨噬細胞存 在之區域聚集及複製。這些作者指出，大部分細菌存在於 細胞外，只有一些細菌被巨噬細胞攝入，然而此僅見於組 織學上。値得注意的是，細菌的存在導致（至少部分）巨噬 細胞由M2表型重編程爲Ml表型。然而，該治療無法在 -9- 200944228 4T1乳癌模型中顯示任何治療效果。 與胞外細菌不同的是，致病性胞內細菌已經發展出在 巨噬細胞內存活之策略。重要的是，吞噬細胞如巨噬細胞 或樹狀細胞係經口胞內病原體包括沙門氏桿菌、志賀氏桿 菌及李氏桿菌之主要目標。在生理情況下，全身性使用這 些細菌將導致它們被脾臟、肝臟或小腸中之吞噬細胞從血 流中清除。在巨噬細胞內，沙門氏桿菌及志賀氏桿菌可藉 由特殊之毒力機制存活。値得注意的是，二者皆可在受感 染之巨噬細胞中透過活化半胱胺酸天冬胺酸酶-1以誘發 進一步之發炎及凋亡，該半胱胺酸天冬胺酸酶-1之活化 係由第三型分泌系統（TTSS)所分泌之IpaB (志賀氏桿菌） 及SipB (沙門氏桿菌）蛋白質介導（Suzuki T et al.，J Biol Chem 2 0 0 5, 280: 14042-14050; Zy chlinsky A. et al., Mol

Microbiol 1994, 1 1: 6 19-627; Chen LM et al., Mol Microbiol 1996, 2 1 : 1101-1115; Hilbi H et al. ,J. Biol.

Chem. 1 998, 273: 32895-32900)。與生理情況不同的是， ΤΑΜ之吞噬缺陷（此亦可見於由韋伯等人所示之胞外細菌 (Weibel et al., Cell Microbiol 2 0 0 8, Postprint; do i: 10.1111/j. 1462-5822.2008.01122.x))可能阻止胞內細菌之 攝入且有助於直接感染腫瘤細胞。 其他相關之先前技術文件包括：Sica A et al.，Eur. J· Cancer 2006，42: 71 7-727; Cardenas L. and Clements J.D. Clin Microbiol Rev 1 992, 5: 328-342; Forbes, N.S., Munn, L. L., Fukumura, D . and Jain, R. K. Cancer Res. 2003 , 63: 200944228 5188-5193 。 【發明內容】 本發明之課題在於提供新穎之腫瘤疫苗，藉由該疫苗 可將腫瘤相關性巨噬細胞（ΤΑΜ)部分或完全清除且可達成 有效之腫瘤治療。 本發明之課題在一態樣中意外地藉由提供能誘發巨噬 細胞凋亡之非致病性及/或減毒之細菌解決。 在較佳之實施例中，上述細菌能感染巨噬細胞。 在另一較佳之實施例中，該細菌係選自革蘭氏陰性細 菌或革蘭氏陽性細菌。 在其他較佳之實施例中，該細菌係選自志賀氏桿菌屬 (Shigella spp.)、沙門氏桿菌屬（Salmonella spp·)、李氏桿 菌屬（Listeria spp.)、分枝桿菌屬（Mycobacterium spp.)、 埃希氏桿菌屬（Escherichia spp.)、耶氏桿菌屬（Yersinia spp.)、弧菌屬（Vibrio spp.)或假單胞菌屬（Pseudomonas spp·) 0 在其他較佳之實施例中，該細菌係選自副痢疾桿菌 (Shigella flexneri)、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium)、牛分枝桿菌卡介苗株（Mycobacterium bovis BCG)、單核球增多性李氏菌（Listeria monocytogenes)、大 腸桿菌（Escherichia coli)、傷寒沙門氏菌（Salmonella typhi)、小腸大腸炎耶氏桿菌（Yersinia enterocolitica)或 霍亂弧菌（Vibrio cholerae)。 -11 - 200944228

在較佳之實施例中，該減毒係藉由刪除或不活化至少 一個選自 aroA 、 aro 、 asd 、 gal 、 pur 、 cya 、 crp 、 phoP/Q 或omp之基因所造成。 在較佳之實施例中，該減毒導致營養缺陷細菌。 在其他較佳之實施例中，該巨噬細胞係Ml巨噬細胞 及/或M2巨噬細胞且較佳爲M2巨噬細胞。 在其他較佳之實施例中，誘發凋亡係藉由半胱胺酸天 冬胺酸酶活化（較佳爲半胱胺酸天冬胺酸酶-1活化）達成。 在另一較佳之實施例中，該細菌係重組細菌。 在另一較佳之實施例中，該細菌攜帶至少一個染色體 整合DNA，較佳爲重組DNA，該DNA編碼至少一個選自 IpaB或SipB之蛋白質。 在另一較佳之實施例中，該細菌攜帶至少一個染色體 整合調節DNA，較佳爲重組DNA，該DNA導致持續表現 至少一個選自IpaB或SipB之蛋白質。 在另一較佳之實施例中，該細菌攜帶至少一個染色體 刪除或不活化至少一個導致持續表現至少一個選自IpaB 或SipB之蛋白質之調節DNA。 在另一較佳之實施例中，該細菌攜帶至少一個質體， 較佳爲重組質體。 在另一較佳之實施例中，該至少一個質體，較佳爲重 組質體，編碼至少一個選自IpaB或SipB之蛋白質。

在另一較佳之實施例中，該至少一個質體，較佳爲重 組質體，編碼至少一個導致持續表現至少一個選自IpaB -12- 200944228 或SipB之蛋白質之調節DNA。 在另一較佳之實施例中，該非致病性及/或減毒之細 菌係選自副痢疾桿菌M90T delta-aroA株、鼠傷寒沙門氏 菌 delta-aroA 株或副痢疾桿菌 BS176 delta-aroA pWRIOO 株。 在另一態樣中，本發明之課題意外地藉由提供一種醫 藥組成物解決，該醫藥組成物包含至少一種如上述態樣及 φ 實施例中之細菌，較佳爲至少一種經凍乾之細菌，及藥學 上可接受之載劑。 在另一態樣中，本發明之課題意外地藉由提供一種藥 物解決’該藥物包含至少一種如上述態樣及實施例中之非 致病性及/或減毒之細菌或如上述態樣及實施例中之醫藥 組成物。 在另一態樣中，本發明之課題意外地藉由提供一種藥 物解決’該藥物包含至少一種如上述態樣及實施例中之非 Ο 麵 毒之細菌或如上述態樣及實施例中之醫藥 組成物’該藥物係用於治療及/或預防選自下列之生理及/ 或病理生理症狀：涉及巨噬細胞發炎之疾病（其中巨噬細 胞係與疾病開始或疾病進展有關）、腫瘤疾病、不受控制 之細胞分裂、惡性腫瘤、良性腫瘤、實體腫瘤、肉瘤、 癌、過度增生性疾病、類癌、尤因肉瘤、卡波濟氏肉瘤、 腦腫瘤、源自腦部及/或神經系統及/或腦脊膜之腫瘤、神 經膠質瘤、神經母細胞瘤、胃癌、腎癌、腎細胞癌、前列 腺癌、前列腺腫瘤、結締組織腫瘤、軟組織肉瘤、胰腫 -13- 200944228 瘤、肝腫瘤、頭腫瘤、頸腫瘤、食道癌、甲狀腺癌、骨肉 瘤、視網膜母細胞瘤、胸腺瘤、翠九癌、肺癌、支氣管 癌、乳癌、乳房腫瘤、小腸癌、結腸直腸腫瘤、結腸癌、 直腸癌、婦科腫瘤、卵巢腫瘤、子宮癌、子宮頸癌、子宮 頸腫瘤、子宮體癌、子宮體腫瘤、子宮內膜癌、膀胱癌 (urinary bladder cancer)、膀腕癌（bladder cancer)、 皮虜 癌、基底細胞癌、棘細胞瘤、黑色素瘤、眼內黑色素瘤、 白血病、慢性白血病、急性白血病、淋巴瘤、感染、病毒 或細菌感染、流行性感冒、慢性發炎、器官排斥、自體免 疫性疾病、糖尿病及/或第二型糖尿病。 在另一態樣中，本發明之課題意外地藉由提供一種藥 物解決’該藥物包含至少一種如上述態樣及實施例中之非 致病性及/或減毒之細菌或如上述態樣及實施例中之醫藥 組成物’該藥物係用於治療及/或預防選自下列之生理及/ 或病理生理症狀：涉及巨噬細胞發炎之疾病（其中巨噬細 胞係與疾病開始或疾病進展有關）、腫瘤疾病、不受控制 之細胞分裂、惡性腫瘤、良性腫瘤、實體腫瘤、肉瘤、 癌、過度增生性疾病、類癌 '尤因肉瘤、卡波濟氏肉瘤、 腦腫瘤、源自腦部及/或神經系統及/或腦脊膜之腫瘤、神 經膠質瘤、神經母細胞瘤、胃癌、腎癌、腎細胞癌、前列 腺癌、前列腺腫瘤、結締組織腫瘤、軟組織肉瘤、胰腫 瘤、肝腫瘤、頭腫瘤、頸腫瘤、食道癌、甲狀腺癌、骨肉 瘤、視網膜母細胞瘤、胸腺瘤、睪九癌、肺癌、支氣管 癌、乳癌、乳房腫瘤、小腸癌、結腸直腸腫瘤、結腸癌、 -14 - 200944228 直腸癌、婦科腫瘤、卵巢腫瘤、子宮癌、子宮頸癌、子宮 頸腫瘤、子宮體癌、子宮體腫瘤、子宮內膜癌、膀胱癌 (urinary bladder cancer)、膀胱癌（bladder cancer)、皮膚 癌、基底細胞癌、棘細胞瘤、黑色素瘤、眼內黑色素瘤、 白血病、慢性白血病、急性白血病、淋巴瘤、感染、病毒 或細菌感染、流行性感冒、慢性發炎、器官排斥、自體免 疫性疾病、糖尿病及/或第二型糖尿病，使得 ❹ (a)凋亡係於腫瘤相關性巨噬細胞（ΤΑΜ)中誘發且腫瘤 相關性巨噬細胞（ΤΑΜ)被部分或完全清除及/或 (b)凋亡係於疾病相關性巨噬細胞中誘發且疾病相關 性巨噬細胞被部分或完全清除。 . 在另一態樣中，本發明之課題意外地藉由提供一種如 上述態樣及實施例中之藥物於治療及/或預防如上述態樣 及實施例所述之生理及/或病理生理症狀上之用途解決， 其中該藥物係於至少一種額外之藥理活性物質治療之前及 〇 /或期間及/或之後投予。 在較佳之實施例中，該額外之藥理活性物質係選自 DNA拓撲異構酶I及/或II抑制劑、DNA嵌入劑、烷化 劑、微管去穩定劑、荷爾蒙及/或生長因子受體激動劑及/ 或拮抗劑、信號傳導抑制劑、抗生長因子及其受體之抗 體、激酶抑制劑或抗代謝物。 在其他較佳之實施例中，該額外之藥理活性物質係選 自放線菌素D、胺基乙哌啶酮、天冬醯胺酸酶、癌思停 (avastin) ' 咪哩硫嘌啼、BCNU (卡氮芥（carmustine))、博 -15- 200944228 萊黴素 （bleomycin)、 白消安 （busulfan)、 卡鈾 (carboplatin)、CCNU (羅氮芥（lomustine))、氯芥苯 丁酸、 順氯氨鉑、左旋天冬醯胺酶、環磷醯胺、阿糖胞苷、達克 黴素（dactinomycin)、正定黴素（daunorubicin)、己嫌雌 酣、阿黴素（doxorubicin)(亞德里亞黴素（adriamycin))、 DTIC (氮嫌哩胺）、表阿黴素（epirubicin)、爾必得舒 (erbitux)、紅羥基壬基腺嘌呤、乙炔雌二醇、依托泊苷 (etoposide)、碟酸氟達拉濱（fludarabine phosphate)、氟經 甲基睪酮、拂勃猫（flutamide)、吉西他濱（gemcitabine)、 基立克（Gleevec/Glivec)、賀癌平（Herceptin)、六甲三聚 氰胺、羥基脲、羥孕酮己酯、伊達比星（idarubicin)、依 弗醯胺（ifosfamide)、干擾素、艾瑞莎（iressa)、伊立替康 (irinotecan)、L-天冬醯胺酸酶、菊白葉酸、甲基二氯乙基 胺、甲孕酮、甲地孕酮、黴法蘭（melphalan)、疏乙擴酸 鈉、氨甲蝶呤、絲裂黴素C、米托坦（mitotane)、雙羥葱 醌' N-膦醯乙醯基-L-天冬胺酸（PALA)、草酸鉑、噴司他 丁（pentostatin)、普卡徽素（plicamycin)、潑尼松龍 (prednisolone)、潑尼松（prednisone)、甲基苄胼、雷洛昔 芬（raloxifen)、 雷怕徽素（rapamycin)、 賽氮芥 (semustine)、索拉非尼（sorafenib)、鏈脲佐菌素、它莫西 芬（tamoxifen)、得舒緩（tarceva)、剋癌易（taxotere)、鬼臼 噻吩甙、丙酸睪固酮、硫鳥嘌呤、噻替派（thiotepa)、拓 撲替康（topotecan)、三甲基三聚氰胺、尿嘧啶核苷、長春 化驗、長春花新驗、長春地辛（vindesine)、長春瑞濱 200944228 (vinorelbine)、2’，2’-二氟脫氧胞嘧啶核苷、5-氟脫氧尿嘧 啶核苷單磷酸、5-氮雜胞嘧啶核苷克拉屈濱（5-azacytidine cladribine)、5-氟脫氧尿嘧啶核苷、5-氟尿嘧啶（5-FU)或 6-锍基嘌呤。 在另一態樣中，本發明之課題意外地藉由提供一種如 上述態樣及實施例中之藥物於治療及/或預防如上述態樣 及實施例所述之生理及/或病理生理症狀上之用途解決， φ 其中該藥物係於放射療法及/或手術之治療之前及/或期間 及/或之後投予。 在另一態樣中，本發明之課題意外地藉由提供一種製 備如上述態樣及實施例中之非致病性及/或減毒之細菌之 方法解決，該方法包含下列步驟： (a)將非致病性及/或非減毒細菌中之至少一個選自 下列之基因刪除或不活化：aroA、aro、asd、gal、pur、 cya、crp、phoP/Q 或 omp ;及/或 〇 (b)將DNA，較佳爲重組DNA，整合至該非致病性及/ 或減毒之細菌之基因組中，該DNA包含編碼至少一個選 自IpaB或SipB之蛋白質之DNA;及/或 (c) 將至少一個質體，較佳爲重組質體，導入至該非 致病性及/或減毒之細菌中，該質體包含編碼至少一個選 自IpaB或SipB之蛋白質之DNA;及/或 (d) 將DNA，較佳爲重組DNA，整合至該非致病性及/ 或減毒之細菌之基因組中，該DNA包含至少一個能使至 少一個選自IpaB或SipB之蛋白質持續表現之調節 -17- 200944228 DNA ;及/或 (e) 染色體刪除或不活化至少一個導致持續表現至少 一個選自IpaB或SipB之蛋白質之調節DNA;及/或 (f) 將至少一個質體，較佳爲重組質體，導入至該非 致病性及/或減毒之細菌中，該質體包含至少一個能使至 少一個選自IpaB或 SipB之蛋白質持續表現之調節 DNA。 在另一態樣中，本發明之課題意外地藉由提供一種醫 藥套組解決，該醫藥套組包含至少一種如上述態樣及實施 例中之非致病性及/或減毒之細菌或如上述態樣及實施例 中之醫藥組成物或如上述態樣及實施例中之藥物及供靜脈 注射用之藥學上可接受之緩衝液。 在另一態樣中，本發明之課題意外地藉由提供一種治 療罹患疾病之哺乳動物（較佳爲人）之方法解決，該方法包 含投予至少一種如上述態樣及實施例中之非致病性及/或 減毒之細菌或如上述態樣及實施例中之醫藥組成物或如上 述態樣及實施例中之藥物至該哺乳動物（較佳爲人），使得 (a) 凋亡係於腫瘤相關性巨噬細胞（ΤΑΜ)中誘發且腫瘤 相關性巨噬細胞（ΤΑΜ)被部分或完全清除及/或 (b) 凋亡係於疾病相關性巨噬細胞中誘發且疾病相關 性巨噬細胞被部分或完全清除。 在較佳之實施例中，該疾病係選自下列：涉及巨噬細 胞發炎之疾病（其中巨噬細胞係與疾病開始或疾病進展有 關）、腫瘤疾病、不受控制之細胞分裂、惡性腫瘤、良性 -18- 200944228 腫瘤、實體腫瘤、肉瘤、癌、過度增生性疾病、類癌、尤 因肉瘤、卡波濟氏肉瘤、腦腫瘤、源自腦部及/或神經系 統及/或腦脊膜之腫瘤、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、胃 癌、腎癌、腎細胞癌、前列腺癌、前列腺腫瘤、結締組織 腫瘤、軟組織肉瘤、胰腫瘤、肝腫瘤、頭腫瘤、頸腫瘤、 食道癌、甲狀腺癌、骨肉瘤、視網膜母細胞瘤、胸腺瘤、 睪九癌、肺癌、支氣管癌、乳癌、乳房腫瘤、小腸癌、結 Φ 腸直腸腫瘤、結腸癌、直腸癌、婦科腫瘤、卵巢腫瘤、子 宮癌、子宮頸癌、子宮頸腫瘤、子宮體癌、子宮體腫瘤、 子宮內膜癌、膀胱癌（urinary bladder cancer)、膀胱癌 (bladder cancer)、皮膚癌、基底細胞癌、棘細胞瘤、黑色 素瘤、眼內黑色素瘤、白血病、慢性白血病、急性白血 病、淋巴瘤、感染、病毒或細菌感染、流行性感冒、慢性 ' 發炎、器官排斥、自體免疫性疾病、糖尿病及/或第二型 糖尿病。 定義 在本發明中，關於細菌「感染巨噬細胞」一語係指細 菌侵入或進入巨噬細胞且變成該巨噬細胞之細胞內成分， 類似病毒感染細胞。 在本發明中，關於細菌「誘發巨噬細胞凋亡」一語係 指細菌在該巨噬細胞中誘發計畫性細菌死亡（凋亡），以使 該巨噬細胞自殺且死亡。 在本發明中，「Ml巨噬細胞」或「Ml型巨噬細胞」 -19- 200944228 或「Ml型極化巨噬細胞」之用語係指通常不存在於腫瘤 部位之巨噬細胞（Sica A et al·，Eur. J. Cancer 2006, 42: 717-727)。 在本發明中，「M2巨噬細胞」或「M2型巨噬細胞」 或「M2型極化巨噬細胞」之用語係指通常存在腫瘤部位 之巨噬細胞且包括M2a、M2b及M2c亞群（Sica A et al.， Eur. J. Cancer 2006，42: 717-727)。該巨噬細胞可爲（但不 —定是）腫瘤相關性巨噬細胞（ΤΑΜ)。最有可能的是， ΤΑΜ代表偏斜之M2族群。 在本發明中，「腫瘤相關性巨噬細胞（ΤΑΜ)」一語係 指存在腫瘤中之F 4/8 0+ CD llb +巨噬細胞。 在本發明中，用語「營養缺陷細菌」係指攜帶至少一 個導致感染宿主生長速率降低之突變之細菌。

在本發明中，用語「減毒細菌」係指藉由至少一個感 染宿主所需之毒力因子喪失功能及/或藉由導致宿主生長 受阻之營養缺陷突變使細菌之毒力減低，也就是該毒力相 較於非減毒之野生型對應細菌係經減低，例如攜帶刪除或 不活化之 aroA、aro、asd、gal、pur、cya、crp、phoP/Q 或omp基因或溫度敏感性突變或抗生素依賴性突變之細 菌（Cardenas L. and Clements J.D. Clin Microbiol Rev 1992; 5: 328-342) ° 在本發明中，用語「重組DNA」係指透過組合或插 入或刪除一或多個DNA股（之部分）所得到之分子基因工 程化人工DNA，藉此組合在天然中通常不會同時出現之 200944228 DNA序列。以基因調節來說，重組DNA係透過在現存生 物基因組（諸如細菌之染色體及/或質體）中加入相關DN A 或刪除現存生物基因組中之相關DNA，以編碼或改變不 同特徵以達特定目的（諸如免疫）。這與基因重新組合不 同，因爲它不會透過在細胞內或核糖體內之過程發生，而 是完全由分子基因工程進行。 在本發明中，用語「重組質體」係指以質體形式存在 之重組DNA。 在本發明中，用語「重組細菌」係指帶有重組DNA 及/或重組質體及/或以人工方式導入該細菌內之非重組 DNA之細菌。 在本發明中，用語「核苷酸序列」係指dsDNA、 ssDNA、dsRNA、ssRNA 或 dsDNA/RNA 雜交物。較佳爲 dsDNA 〇 在本發明中，用語「上基因改變」係指在DNA濃度 上的改變，也就是藉由DNA甲基化或去甲基化、結合多 梳蛋白、組蛋白乙醯化等，該改變影響至少一個基因之表 現量。 在本發明中，用語「調節DNA」係指在DNA上之區 域，該區域藉由與調節蛋白質結合或藉由誘發上基因改變 以影響至少一個基因之表現。 就本發明之目的而言’與任何細菌相連之用語「屬」 係意圖用來包含特定屬中之所有成員’包括種、亞種及其 他。舉例來說，「沙門氏桿菌屬」係意圖包含該沙門氏桿 -21 - 200944228 菌屬之所有成員’諸如傷寒沙門氏菌及鼠傷寒沙門氏菌。 在本發明中與「細菌」一起使用之用語「非致病性」 係指不會造成宿主之疾病或疾病症狀之細菌。 細菌感染包含但不限於炭疽病、細菌性腦膜炎、肉毒 症、布氏桿菌症、曲桿菌症、貓抓病、霍亂、白喉、流行 性斑疹傷寒、膿皰症、退伍軍人症、痲瘋（韓森氏病）、鉤 端螺旋體病、李氏桿菌病、萊姆病、類鼻疽、MRSA感 染、奴卡菌病、百日咳、鼠疫、肺炎球菌肺炎、鸚鵡病、 Q熱、落磯山斑點熱（RMSF)、沙門氏桿菌症、猩紅熱、 志賀桿菌病、梅毒、破傷風、砂眼、結核病、兔熱病、傷 寒熱、斑疹傷寒、泌尿道感染、細菌造成之心臟病。 病毒感染包含但不限於愛滋病、愛滋病相關複合症 (ARC)、7JC痘、感冒、細胞巨大病毒感染、科羅拉多壁蝨 熱、登革熱、伊波拉出血性熱、手足口症、肝炎、單純皰 疹、帶狀皰疹、人類乳突病毒、流行性感冒、拉色熱、痲 疹、馬堡出血性熱、感染性單核球增多症、流行性腮腺 炎、小兒麻痺症、進行性多部腦白質病、狂犬病、德國麻 疹、嚴重急性呼吸系統綜合症、天花、病毒性腦炎、病毒 性腸胃炎、病毒性腦膜腦炎、病毒性肺炎、西尼羅河病、 黃熱病。 慢性發炎或慢性發炎疾病包含但不限於慢性膽囊炎、 支氣管擴張症、類風濕性關節炎、橋本甲狀腺炎、發炎性 腸道疾病（潰瘍性結腸炎及克隆氏症）、矽肺病及其他肺塵 埃沉著病。 -22- 200944228 自體免疫性疾病包含但不限於系統性症候群（諸如全 身性紅斑狼瘡、休格倫氏症候群、硬皮症、類風濕性關節 炎及多發性肌炎）及局部性症候群（諸如胰島素依賴型糖尿 病、橋本甲狀腺炎、愛迪生氏病、尋常天皰瘡、牛皮癬、 異位性皮膚炎、異位性症候群、氣喘、自體免疫溶血性貧 血'多發性硬化症）。 以上說明之細菌以及較佳之實施例在此處被稱爲本發 〇 明之細菌。 本發明之細菌係有益地適用於腫瘤治療，以作爲腫瘤 標靶療程中之活疫苗。也就是利用本發明之細菌，能誘發 腫瘤相關性巨噬細胞（ΤΑΜ)之凋亡以部分或完全清除該腫 . 瘤相關性巨噬細胞。因此，可使該腫瘤揭露並利用傳統抗 腫瘤藥物攻擊。 本發明之細菌係有益地適用於治療與巨噬細胞發炎有 關之慢性發炎性疾病，以作爲活的治療劑。也就是利用本 〇 發明之細菌，能誘發與該疾病相關之巨噬細胞凋亡以自該 發炎部位部分或完全清除這些巨噬細胞。藉此，使得導致 持續發炎之一個因子消失’慢性發炎得以消退。該疾病之 實例爲與發炎有關之良性增生性疾病如良性前列腺增生或 慢性自體免疫性疾病如克隆氏病、發炎性腸道疾病、類風 濕性關節炎、氣喘。 本發明之非致病性及/或減毒之細菌可利用已知之方 式投予。因此投予途徑可爲任何可有效傳送該細菌至該適 當或所欲作用部位之途徑，例如非經口或經口，尤其是經 -23- 200944228 靜脈、局部、經皮、經肺、經直腸、經陰道、經鼻腔或非 經腸或經植入物。較佳爲經靜脈投予。 非經口投予可利用多種方式進行，例如經靜脈、皮 下、肌肉注射無菌含水或油性溶液、懸浮液或乳液，經植 入物或經軟膏、乳膏或栓劑。以適當之持續釋放形式投予 也是可以的。植入物可能包含惰性物質，例如生物可分解 性聚合物或合成性矽酮諸如矽酮橡膠。經陰道投予是可能 的’例如利用陰道環。子宮內投予是可能的，例如利用子 宮帽或其他適當之子宮內裝置。另外提供經皮投予，特別 是利用適用於此目的之調合物及/或適當之裝置諸如貼 布。 經口投予可利用例如固體形式如錠、膠囊、軟膠囊、 膜衣錠、顆粒或粉末進行，但也可以利用可飮用溶液之形 式進行。用於經口投予之本發明之化合物可與已知及慣常 使用之生理相容性賦形劑及載劑組合，諸如阿拉伯膠、滑 石、澱粉、糖類諸如甘露醇、甲基纖維素、乳糖、明膠、 表面活性劑、硬脂酸鎂、環糊精、含水或不含水載劑、稀 釋劑、分散劑、乳化劑、潤滑劑、保存劑及調味劑（諸如 精油）。本發明之細菌也可以被分散於微顆粒例如奈米顆 粒組成物中。 本發明之非致病性及/或減毒之細菌之可能製造模式 爲： (A)藉由突變形成、選擇及/或目標基因組修飾，將毒 性細菌株較佳爲沙門氏桿菌株減毒，較佳爲形成營養缺陷 -24- 200944228 細菌。該減毒之細菌株（較佳爲沙門氏桿菌株）係經下列步 驟處理： (i) 基因組刪除負向調節DNA導致持續性SipB/IpaB 之表現，有需要的話可與額外之DNA操縱組合以確保誘 發巨噬細胞凋亡所需之額外元件之表現（侵入、分泌系 統、運送系統） (ii) 基因組或質體插入正向調節DNA導致持續性 φ SipB/IpaB之表現，有需要的話可與額外之DNA操縱組合 以確保誘發巨噬細胞凋亡所需之額外元件之表現（侵入、 分泌系統、運送系統） (iii) 基因組或質體插入編碼 SipB/IpaB之DNA，該

. DNA係第III型持續表現，有需要的話可與額外之DNA 操縱組合以確保誘發巨噬細胞凋亡所需之額外元件之表現 (侵入、第III型運送系統） (B) 藉由突變形成、選擇及/或目標基因組修飾，將毒 φ 性細胞內致病性細菌（諸如李氏桿菌或志賀氏桿菌）減毒， 較佳爲形成營養缺陷細菌。該減毒之細菌係經下列步驟處 理： (0基因組或質體插入編碼 SipB/IpaB之DNA，該 DNA係持續表現，有需要的話可與額外之DNA操縱組合 以確保誘發巨噬細胞凋亡所需之額外元件之表現（侵入、 第III型運送系統） (C) 藉由突變形成、選擇及/或目標基因組修飾，將無 毒之志賀氏桿菌株減毒，較佳爲形成營養缺陷細菌。該減 -25- 200944228 毒之志賀氏桿菌係經下列步驟處理： (i)基因組或質體插入編碼SipB/IpaB之DNA’該 DNA係持續表現，有需要的話可與額外之DNA操縱組合 以確保誘發巨噬細胞凋亡所需之額外元件之表現（侵入' 第III型運送系統） (D)藉由突變形成、選擇及/或目標基因組修飾，將非 致病性或細胞外致病性細菌（諸如大腸桿菌、弧菌）減毒’ 較佳爲形成營養缺陷細菌。該減毒之細菌係經下列步驟處 理： (i)基因組或質體插入編碼SipB/IpaB之DNA，該 DN A係持續表現，有需要的話可與額外之DNA操縱組合 以確保誘發巨噬細胞凋亡所需之額外元件之表現（侵入、 第III型運送系統） 【實施方式】 所有引述之參考文獻及專利之內容在此以參照方式納 入此處。本發明利用以下之實施例進一步詳細解說，但不 是用來限制本發明。 本發明之詳細說明 實施例 實施例1 方法 質體。載有質體 pKD3、pKD4 (Datsenko，K.A. & 200944228

Wanner, B.L. Proc Natl Acad Sci USA 2000, 97:6640-6645)及 pCP20 (Cherepanov, P.P. & Wackernagel, W. Gene 1 995，158:9-14)之大腸桿菌株係得自維爾茨堡大學 生物技術學系。質體pKD3及pKD4爲π依賴性且分別帶 有氯黴素及卡那黴素抗性基因，其二端爲FLP重組酶辨 識部位（FRT部位）。pCP20質體包含溫度敏感性複製子及 在1 C1857抑制子之控制下轉錄自IpR啓動子之酵母菌 ❹ FLP 重組酶（Cherepanov, P.P. & Wackernagel，W. Gene 1995， 158:9-14)° 培養基、化學物及其他試劑。在含有100、25及30 微克/毫升之下列個別抗生素的胰酪酶大豆瓊脂（1.2%瓊脂） (TSA)(Difco Laboratories)上選擇具有胺苄青黴素抗性、 氯黴素抗性（CmR)及卡那黴素抗性（KmR)之轉形株。使用 總量1毫莫耳之L-阿拉伯糖（Sigma)。寡核苷酸係來自 MWG。酵素係來自Fermentas除非另外說明。Taq聚合酶 φ 係用於所有的聚合酶連鎖反應試驗。根據廠商說明書使用 Taq (Biotherm，Genecraft)聚合酶以製備用於選殖及突變 形成之DNA。使用凱傑公司（Qiagen)產品（德國希爾登市） 分離質體DNA、膠體純化片段或純化PCR產物。 細菌株、生長條件及基因程序。本發明所使用之鼠傷 寒沙門氏菌delta-aroA獲得質體基底之卡那黴素抗性（質 體pTolCKan ’ Hotz等人，未公開資料）。質體在活體內之 穩定性爲100%，因此使用此菌株允許以卡那黴素篩選（資 料未顯示）。本發明所使用之副痢疾桿菌5a菌株爲來自法 -27- 200944228 國尼斯大學之野生型M90T [鏈黴素（Sm)抗性](Allaoui，A., Mounier, J., Prevost, M.C., Sansonetti, P.J. & Parsot, C. Mol Microbiol 1992，6: 1605-1616)及其非侵入性變異株 BS176 (缺乏毒性質體 pWR100)(Sansonetti，P.J.，Kopecko, D. J. & Formal, S. B. Infect Immun 1 982, 3 5: 852-860;

Buchrieser, C. et al. Mol Microbiol 2 0 0 0, 38: 760-7)° 戶斤 有菌株例行性地以胰酪酶大豆培養液（TSB)(Bect〇n Dickinson and Cο ·)、 胰酪酶大豆瓊脂（1 · 2°/。瓊 脂）（T S A)(Difco Laboratories)、盧瑞亞-貝爾塔尼（Luria-Bertani)培養液（LB)(Miller, J.Η. A short course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1 992)或腦心浸液（BHI)培養。每 公升包含100毫克剛果紅染料（Cr)之TSA被用於選擇志賀 氏桿菌屬之 Cr+選殖株（Maurelli，A.T., Blackmon，B. & Curtiss，R·，3rd. Infect Immun 1984，43: 195-201)。視需 要添加Amp (100微克/毫升）、Kan (25微克/毫升）或Cm (30毫克/毫升）（所有均來自西格瑪化學公司（Sigma Chemical))至細菌培養液中。包含pCP20之菌株係於30 °C 培養，除非以下另外說明。從M90T中分離220千鹼基之 毒性質體PWR100係以大型建構套組（QIAGEN)進行。 線性 DNA製備。使用達特森柯（Datsenko)及華納 (Wanner)描述之方法，從pKD3或pKD4製備包含抗生素 抗性基因之線性 DNA (Datsenko, K.A. & Wanner，B.L· Proc Natl Acad Sci U S A 2000，97: 6640-6645)。聚合酶 200944228 連鎖反應之引子係經設計以包含與所欲基因具有50個鹼 基對之同源性及用於引導PKD3或pKD4之P1及P2部 位。插入識別點（以下）係利用引子AroAup及aroAdown進 行。根據製造商（Biotherm, Genecraft)之建議，使用 Taq 聚合酶進行聚合酶連鎖反應。 以菌落PCR進行PCR分析。簡言之，將菌落再懸浮 於50微升之水中，煮沸10分鐘以製備DNA溶解產物。 每個溶解產物利用適當之引子設計以聚合酶連鎖反應測 試。根據製造商（Biotherm，Genecraft)之建議，使用 Taq 聚合酶進行聚合酶連鎖反應。使用下列引子：

AroAup GGGGTTTTTATTTCTGTTGTAGAGAGTTGAGTTCATGGAATCG

TGTAGGCTGGAGCTGCTTC

AroAdown GGCCGTGCATTTGGGATCAAGAATCGTCACTGGTGTATCTGC

ATATGAATATCCTCCTTA AroAFr一up GATTTCTACCGCAATGACG

AroAFr一down GGAAACAAGTGAGCGTTTC C1 TTATACGCAAGGCGACAAGG (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L.

Proc Natl Acad Sci U S A 2000, 97: 6640-6645) C2 GATCTTCCGTCACAGGTAGG (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L.

Proc Natl Acad Sci U S A 2000, 97: 6640-6645) K1 CAGTCATAGCCGAATAGCCT (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L.

Proc Natl Acad Sci U S A 2000, 97: 6640-6645) K2 CGGTGCCCTGAATGAACTGC (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L.

Proc Natl Acad Sci U S A 2000, 97: 6640-6645) -29- 200944228 要創造一種在生長上被減緩但毒性未經降低之菌株， 我們從工程化之菌株副痢疾桿菌BS176delta-ar〇A開始。 使用大型建構套組（QIAGEN)分離副痢疾桿菌M90T之200 千鹼基毒性質體PWR100。之後，將此帶有胺苄青黴素抗 性之毒性質體及幫助質體PCP20轉形至已經被建構之 BS176delta-aroA菌株。經過此雙重轉形及於30°C培養隔 夜後，在胺苄青黴素抗性菌落中篩選毒性質體PWR100 (pWR100_up 5,-GATGCAGGCCAAGAGGTTAG-3,； pWR100_down 5 ’ - GC GT T G A T G AC C G C AT C - 3 ’）及 ar〇A 剔 除株(AroAFr_up 5 ’-GATTTCTACCGCAATGACG-3 ’ ；

AroAFr_down 5 ’ - G G A A A C A A G TG A G C GT TT C - 3，）。此菌株 被稱爲副痢疾桿菌M90Tdelta-ar〇A。該包含溫度敏感性複 製子之PCP20質體於43°C隔夜培養以移除。

HeLa細胞侵入試驗及存活試驗。如前所述 (Elsinghorst EA, 1 994)用HeLa細胞進行健他黴素保護試 驗，加以一些小修正。在75平方公分細胞培養瓶中使 HeLa細胞（ATCC CCL-2)單層生長至半滿，使用包含10% 胎牛血清（FBS，Gibco)、2毫莫耳L-麩醯胺酸（Gibco)、青 黴素及鏈黴素（二者皆爲180微克/毫升，Gibco)之都爾貝 可改良式伊格爾培養基（DMEM，Gibco)。一個培養瓶加入 0.25 %胰蛋白酶（Pan)消化，將DMEM中之細胞濃度調整成 2x1 05細胞/毫升。在六個孔槽之培養盤上接種2毫升之 HeLa細胞，令其於37°C、5%二氧化碳中隔夜生長至大約 長滿90%。清洗HeLa細胞，在加入細菌之前2小時更換 200944228 DMEM。以100之預估感染複數添加對數期之細菌培養液 (在LB培養基中生長）。加入細菌後，將培養盤置於37 °C、5 %二氧化碳中培養1小時。用D-磷酸鹽緩衝食鹽水 (Gibco)沖洗培養盤3次，然後加入含有健他黴素（100微 克/毫升）之DMEM於37°C、5%二氧化碳中培養1小時。 經過特定時間點後，將HeLa細胞溶解於0.1% Triton X-100溶液中10分鐘。將細菌接種於LB瓊脂培養基上，於 0 37°C生長18小時後計算細菌菌落。 細胞內及細胞間生長試驗。要了解細胞內複製及細胞 至細胞播散之行爲，初期使用吉姆沙染色細胞。簡言之， 在45毫米直徑之細胞培養板中HeLa細胞（lxlO5)蓋玻片 (直徑20毫米）以100:1之感染複數感染1小時，用1倍 PBS清洗二次並於室溫下用甲醇固定5至7分鐘。風乾該 培養板，以吉姆沙染劑（Sigma)染色15至60分鐘，該染 劑依廠商說明製備。以蒸餾水清洗培養板三次後，令其風 φ 乾然後在油鏡下觀察。在感染後1小時及4小時之時間點 檢查。 L-Top瓊脂試驗。L-Top瓊脂試驗係用來測定細胞間 播散。以 500:1之感染複數感染6孔細胞培養板中之 HeLa細胞（7χ105) 1小時，並用1倍PBS清洗二次。之 後，感染細胞接受20葛雷放射線照射20分鐘。接著以 70:1之比例將未經感染之HeLa細胞與該放射線照射之志 賀氏桿菌感染HeLa細胞共同培養2小時、8小時及12小 時。在以1〇〇微克/毫升之健他黴素培養1小時後’將健 -31 - 200944228 他黴素之濃度減少至ίο微克/毫升。在所有時間點，將 SeaPlaque 瓊脂糖（Biozym Scientific GmbH，Oldendorf)所 製備而成之連續稀釋液接種於BHI瓊脂培養皿上。於37 °C隔夜培養該瓊脂培養皿。計算菌斑以測量細菌菌落數。 每個菌落代表一個受感染之HeLa細胞。 小鼠。六至八週齡之母鼠皮下注射lxl 04鼠4T1乳癌 細胞（ATCC: CRL-2539)、lxlO6 B78-D14 (Rymsa，B·， Becker, H.D., Lauchart, W. & de Groot, H. Res Commun Chem Pathol Pharmacol 19 9 0, 68: 263-266; Lode, H.N. et al. J Clin Invest 2000, 1 05·· 1 623- 1 630)黑色素瘤細胞或 1 xlO6 P815-PSA (J Fensterle, J., Bergmann, B, Yone, CLRP, Hotz, C, Meyer, SR, Spreng, S, Goebel, W, Rapp, UR and I Gentschev. Cancer Gene Therapy 2007)肥大細胞瘤細 胞，各再懸浮於100微升之磷酸鹽緩衝食鹽水（PBS)。 所有有關小鼠之試驗方法皆根據下弗蘭肯政府（德國 烏玆堡）之規定進行。Balb/c ola HSD、C57/BL6、DBA-2 及MMTV-Her2/new FVB係訂購自哈蘭威克曼公司（Harlan Winkelmann GmbH)(德國布洛肯）。所有動物被安置在醫療 放射學及細胞硏究中心（MSZ)之動物照護中心。 腫瘤之組織學及免疫組織化學分析。4T1細胞（lx 104)、B78-D14 細胞（lxlO6)及 P815-PSA 細胞（lxlO6)經皮 下注射至Balb/c、C57/BL6及DBA/2小鼠。當腫瘤長到 直徑1.5至2公分時，以無菌方式將它們切除。腫瘤以福 馬林固定，切片，以蘇木精及伊紅素染色。 -32- 200944228 爲了識別在腫瘤部位之巨噬細胞，組織在4%緩衝三 聚甲醛中固定1天，經石蠟包埋，並進行切片處理。接著 切片如戶斤述（Gouon-Evans，V.，Rothenberg，M.E. & Pollard, J.W. Development 2000，1 27: 2269-2282)利用全巨噬細胞 抗 F4/80大鼠單株抗體（Acris Antibodies GmbH)免疫染 色，特異性反應利用以過氧化酶爲基底之偵測套組 (Vector Laboratories)偵測。抗 CD45 抗體（BD Pharmingen) Q 及過氧化酶基底偵測套組（Vector Laboratories)也被用於 檢査發炎程度。 經靜脈感染荷瘤小鼠。細菌在對數中期（志賀氏桿菌） 或靜止期（沙門氏桿菌）收集，以1倍PBS清洗三次，在注 • 射前用1倍PBS稀釋。將100微升之懸浮液注射至細胞 植入後14天之4T1荷瘤小鼠Balb/c之尾靜脈中，或注射 至0.5歲之MMTV-Her2荷瘤母鼠。爲了測定在腫瘤及脾 臟組織中之細菌量，小鼠被犧牲，器官被切除、秤重並以 〇 70微米及40微米之細胞過濾器均質化。每個細胞組份之 細胞數經過計算，並測定菌落形成單位或感染細胞數。 測定菌落形成單位及感染細胞數。爲了測定菌落形成 單位之數量，將包含0.1% Triton-X (Roth)之1倍PBS連 續稀釋液接種於LB瓊脂培養皿上。在鼠傷寒沙門氏菌 delta-aroA之試驗中，使用含有25微克/毫升卡那黴素之 pTolCKan LB瓊脂平板。將瓊脂平板上下顛倒地於3 7°C隔 夜培養。計算菌斑以決定細菌菌落數。每個菌斑代表一個 細菌菌落。在L-Top瓊脂試驗中，準備1倍PBS之連續 -33- 200944228 稀釋液，然後在約40°C與5毫升之SeaPlaque瓊脂糖 (Biozym Scientific GmbH，Oldendorf)混合。將稀釋液小 心地滴加至LB瓊脂平板上。於37 °C使瓊脂平板底部朝下 隔夜培養。計算菌斑以測量細菌菌落數。每個菌落代表一 個受感染之真核細胞。 分離腫瘤相關性巨噬細胞。磁珠分離之染色方法。選 用以磁珠標示細胞之二步驟方法。首先，以全巨噬細胞抗 F4/80 (IgG, Acris Antibodies GmbH; IgG, Santa Cruz)抗 體標示細胞。第二，用標示有磁珠（Miltenyi Biotec GmbH) 之抗IgG抗體染色該標示細胞。總染色時間約30分鐘。 以抗體標示細胞係於4°C在含有1%牛血清白蛋白（BSA)及 0.01 %疊氮化鈉之1倍PBS中進行10至15分鐘。用1倍 PBS清洗一次後，細胞與二次微珠標示之抗體一起培養。 經過4°C培養10分鐘後，首先用一次清洗步驟移除未結 合之顆粒。然後將微管柱（Miltenyi Biotec GmbH)放置於 約0.6特斯拉之磁場（MACS永久磁鐵，Miltenyi Biotec) 中，以500微升之含有1%牛血清白蛋白（BSA)及0.01%叠 氮化鈉之1倍PBS平衡，然後分離細胞。經磁珠標示之 細胞被滯留於磁場中，並與鋼絲絨纖維結合。將管柱從外 磁場移出時，鋼絲絨很快地去磁化，磁性細胞不再與之結 合並可以單一細胞懸浮液被沖提。

製備用於FACS分析之細胞。腫瘤細胞之細胞表面抗 原的表現係藉由在以 FcrRn/III (2.4G2, BD Bioscience) 處理後用抗體染色分析及利用 FACScan (BD 200944228

Immunocytometry Systems)進行流式細胞分析。使用下列 單株抗體：螢光異硫氰酸鹽（FITC)抗鼠 CDllb (M1/70.15.11.5，Miltenyi Biotec)、藻紅素（PE)抗鼠 Gr-1 (RB6-8C5，Miltenyi Biotec)及 PE 抗鼠 F4/80 (BM4008R， Acris Antibodies) ° 效果試驗。要了解志賀氏桿菌感染對腫瘤生長之治療 效果，經皮下注射施予lxl〇4 4T1細胞至28隻六至八週 齡之母鼠Balb/c。每隔一天以尺測量腫瘤生長。當腫瘤體 積達到約170立方毫米時（細胞植入後14天），以隨機方 式決定三組小鼠（n = 8)。如前所述製備副痢疾桿菌 M90Tdelta及BS176delta，將 100微升之懸浮液注射至 4T1荷瘤小鼠Balb/c之尾靜脈中。未受感染之組施予100 微升之1倍PBS。每隔一天觀察腫瘤生長。腫瘤細胞植入 後 31 天，未受感染及 BS76delta-aroA 組及二隻 M90Tdelta-aroA小鼠被犧牲，比較腫瘤大小（資料未顯 示）。感染後第48天，三隻M90Tdelta-ar〇A小鼠被犧牲 以測定腫瘤、肝臟及脾臟組織中之菌落形成單位。除此之 外，我們進行FACS分析如前所述以測定腫瘤組織中巨噬 細胞之量。感染後第49天，再次經靜脈施予lxl 06副痢 疾桿菌Μ90ΤΔ aroA。在第一次感染後68天，再次測定腫 瘤、肝臟及脾臟組織中之菌落形成單位。此外，我們準備 2個腫瘤以進行如前述之組織學及免疫組織化學分析。 活體外感染人類腹水細胞。腹水細胞由二種不同的細 胞族群組成，一種是黏附細胞，另一種是懸浮細胞。這二 -35- 200944228 種細胞族群被當作不同的細胞種類處理。如前所述分離腫 瘤細胞及腫瘤相關性巨噬細胞。從病患分離出細胞後，以 野生型副痢疾桿菌M90T、副痢疾桿菌M90Tdelta-aroA及 副痢疾桿菌BS176delta-aroA活體外感染該三種不同的細 胞組份。將生長至對數生長期之細菌離心（於4°C每分鐘 4000轉10分鐘）並以DMEM培養液清洗3次。以感染複 數100:1感染1小時後，將細胞置於300微克/毫升健他 黴素中培養1小時。之後使用50微克/毫升之健他黴素。 感染2小時後收集細胞以測定菌落形成單位或製備細胞以 進行西方墨漬法。 西方墨漬法分析。將來自6孔細胞培養板之志賀氏桿 菌感染或未感染細胞以PBS清洗二次並溶解於120微升 之2倍蘭里緩衝液（1莫耳Tris-HCl，pH 6.8 ;甘油86% ; 冷-酼乙醇；20% SDS，蒸餾水）。不可溶物質以離心方式 移除（20000g，30分鐘）。在免疫轉漬法方面，以10或 15% SDS-PAGE分離10至30微升之溶解產物（Laemmli, U.K. Nature 1 970, 227: 680-685)並將之轉印至硝化纖維素 膜。1小時後以添加5%脫脂奶粉之1倍PBS中斷反應， 在膜上以適當之經含有5%脫脂奶粉（牛血清蛋白；Sigma· Aldrich)之1倍PBS稀釋之初級抗體（抗半胱胺酸天冬胺 酸酶-1 (ICE)，得自 Sigma ;抗剪切 PARP抗體（BD Pharmingen)、抗 GAPDH 抗體（Chemicon international)、 抗/9肌動蛋白抗體（Sigma))探測，然後與過氧化酶共軛之 二次抗體培養，以增進化學發光物質（ECL試劑； 200944228

Amersham Biosciences，英國）偵測並暴露在 X光底片 (Kodak，XO-MAT-AR)上 1 至 10 分鐘。 結果

巨噬細胞浸潤已經在一些人類腫瘤中描述，包括乳癌 (Leek，R.D. et al. Cancer Res 1 996，56: 4625-4629; Leek, R.D., Landers, R.J., Harris, A.L. & Lewis, C.E. Br J Cancer 1 999, 79: 99 1 -995; Lewis, J.S., Landers, R.J.,

Underwood, J.C., Harris, A.L. & Lewis, C.E. J Pathol 2000，1 92: 1 5 0- 1 5 8)及卵巢癌（Negus, R.P., Stamp, G.W·， Hadley, J. & Balkwill, F.R. Am J Pathol 1 997, 1 50: 1 723-1 734)。要測定在不同之實驗腫瘤模型中浸潤TAM之量， 將不同腫瘤模型之石蠟包埋組織中的巨噬細胞（圖1)染 色。在所有受檢查的腫瘤中，偵測到巨噬細胞熱點（棕色 染色）。由於ΤΑΜ係廣泛分散於人類乳癌中（Kelly，P.M., Davison, R.S., Bliss, E. & McGee, J. Ο. Br J Cancer 1 9 8 8, 5 7: 1 7 4- 1 77; Volodko , N ., Reiner, A., Rudas , M. & Jakesz, R. The Breast 1 998, 7: 99- 1 05; Lin, E. Y., Nguyen, A.V., Russell, R.G. & Pollard, J.W. J Exp Med 2001, 193: 727-740; Bingle, L., Brown, N.J. & Lewis, C.E. J Pathol 2002, 1 96: 254-265)且與不良預後有關，因此後續試驗使用4T1 模型及基因轉殖MMTV-Her2腫瘤模型。 一開始我們要探討的是沙門氏桿菌及志賀氏桿菌在細 胞外及細胞內區劃之定量分布以及腫瘤之不同的細胞種 -37- 200944228 類。因此使用移植（4T1)及自發性（MMTV-Her2)腫瘤建立 模型。使荷瘤小鼠被細菌感染’並在感染後不同的時間點 移除腫瘤。腫瘤細胞經過分離以獲得腫瘤細胞懸浮液。使 腫瘤細胞懸浮液經過健他黴素或不經健他黴素處理，以區 別細胞外及細胞內之細菌。同時’將細胞分成巨噬細胞及 巨噬細胞清除組份以分析細菌含量（見圖13)。接種係於真 核細胞溶解之後進行以測定總菌落形成單位力價’或藉由 接種在上層瓊脂上以避免細胞溶解以測定感染細胞數。 在第一組試驗中，將鼠傷寒沙門氏桿菌delta-aroA經靜脈施予至已經建立4T1腫瘤（圖2)或自發性乳癌 (見圖17)之小鼠。如圖2所示，鼠傷寒沙門氏菌delta-aroA株在感染後4小時及6小時以活體內ΤΑΜ爲主要目 標，雖然此菌株在試管內輕易地感染4Τ1細胞（資料未顯 示）。感染後7天，在脾臟中只能偵測到少量細菌’這與 之前的硏究結果相符（Arnold, Η. et al. Infect Immun 2004, 72: 6546-6553)。在4小時、6小時及7天後，相較於巨 噬細胞清除之腫瘤細胞，有顯著較多之細菌被發現在巨噬 細胞組份中。在感染後4及6小時，大部分細菌爲細胞 內，然而在感染7天後，在細胞外發現10倍以上的細 菌，這是以源自於健他黴素處理組之菌落形成單位數相較 於未處理之總腫瘤細胞組而得知。 接下來我們要問的是，透過分泌SipB所介導之半胱 胺酸天冬胺酸酶-1活化是否可誘發巨噬細胞凋亡。此 外，我們想知道的是，在凋亡時腫瘤組織中之巨噬細胞是 -38- 200944228 否減少。因此在感染鼠傷寒沙門氏桿菌delta-aroA之後， 分析細胞族群中之半胱胺酸天冬胺酸酶-1活化及誘發凋 亡（圖3)。半胱胺酸天冬胺酸酶-1活化（圖3a)及PARP剪 切（圖3b)可於感染後6小時之腫瘤總細胞及巨噬細胞組份 中偵測到，但是巨噬細胞清除組份則否，無論是半胱胺酸 天冬胺酸酶-1活化或半胱胺酸天冬胺酸酶-1表現均無法 偵測得到。半胱胺酸天冬胺酸酶-1誘發無法在感染後7 φ 天的任何組份中測得。在感染後7天，ΤΑΜ之相對量係 由FACS測定（圖3c)。相較於未感染小鼠，沙門氏桿菌不 會影響這個時間點之巨噬細胞數量，這進一步證實凋亡誘 發係暫時性或至少爲不足的。暫時性凋亡誘發可由沙門氏 . 桿菌之感染生物學解釋，其在感染之早期時間點表現致病 性島SP1 (包括SipB)，及在晚期從SP1轉變成SP2。SP2 致病性島不包含毒性因子如可直接活化半胱胺酸天冬胺酸 酶-1 處理之 SipB (Panthel，K. et al. Infect. Immun. 2005, ❹ 73:334-341)。 和沙門氏桿菌不同的是，志賀氏桿菌在感染期間的每 個時間點均表現 IpaB (Schroeder，G.N., Jann，N.J. &

Hilbi, H. Microbiology 2007，1 5 3: 2862-2876; Cossart，P. & Sansonetti, P. J. Science 2004, 3 04: 242-248; Tamano, K et al. Embo J 2000，19:·3876-3887)。因此我們要問的是， 副痢疾桿菌是否也以ΤΑΜ爲目標，也能減少巨噬細胞數 目。在此試驗使用副痢疾桿菌株Μ90Τ及BS 176 (後者爲 無質體之非毒性變異株）。爲了得到適用於動物試驗之毒 -39- 200944228 性未受影響之減毒株，建構帶有染色體刪除aroA基因座 之菌株。在其他細菌諸如沙門氏桿菌中’刪除對製造芳香 族胺基酸而言爲重要之aroA基因將導致細菌之減毒 (Schafer, R. & Eisenstein, T.K. Infect Immun 1 992, 60: 79 1 -797)。爲了能夠進行生長減毒之毒性與非毒性菌株之 間的基因定義比較（Sansonetti，P.J.，Kopecko, D_J. & Formal，S.B. Infect Immun 1982，35: 852-860)，我們嘗試 刪除非毒性副痢疾桿菌株BS 176之aroA基因座，然後將 毒性質體pWRl 00以電穿孔法送入。要剔除副痢疾桿菌株 BS176株之aroA基因座，使用達特森柯（Datsenko)及華納 (Wanner)(2000)之方法。該形成之菌株副痢疾桿菌 B S 1 76delta-aro A 在以下被稱爲 B S 1 7 6 de 11 a - ar o a 或 BS176delta。接著，將分離自副痢疾桿菌M90T之毒性質 體pWRIOO轉形至菌株BS176delta，形成菌株副痢疾桿菌 BS176delta-aroA pWRIOO。由於此菌株帶有毒性菌株副痢 疾桿菌 M90T之主要特性，此菌株在以下被稱爲 Μ 9 0 T d e 11 a - a r ο A 或 Μ 9 0 T d e 11 a。 相當於副痢疾桿菌 M90Tdelta-aroA之副痢疾桿菌 BS176delta-aroA pWRIOO 菌株係以編號 DSM 2 1 05 8 儲存 於德國微生物及細胞保存中心（DSMZ)。 在建構aroA突變之後，該菌株之特徵爲細胞外及細 胞內生長、早期黏合、侵入及試管內之細胞至細胞播散 (圖4)。該不含質體之無毒性菌株副痢疾桿菌BS 176之特 徵爲在LB培養液中之最高生長速率爲每小時0.3個光密 -40- 200944228 度値，然而毒性菌株副痢疾桿菌M90T具有稍微較低之最 高生長速率每小時0.2個光密度値（圖4a)，這可能是因爲 有大型毒性質體pWRIOO之存在。如預期般，帶有aroA 突變之菌株的最高生長速率顯著下降。M90Tdelta-aroA之 最高生長速率相較於野生型副痢疾桿菌M90T慢2.5倍。 再者，BS176delta-ar〇A 之最高生長速率稍微高於 M90Tdelta-aroA 〇 0 其後，我們探討ar〇A突變對早期黏合、侵入、細胞 內複製及細胞至細胞播散之影響。 如圖4b所示，菌株M90Tdelta-aroA在其黏合及侵入 速率上相較於野生型副痢疾桿菌M90T並無顯示差異。相 反的，BS176delta-aroA之侵入行爲則如預期地減低。 在二小時期間，野生型M90T之細胞內複製速率相較 於aroA突變株高出12倍（圖4c)。這些資料顯示菌株副痢 疾桿菌M90Tdelta-aroA之細胞內複製能力如預期地被大 Q 幅減低。 由於aroA突變株之細胞內複製能力有所缺陷，使得 細胞至細胞播散難以用習知試驗評估。因此我們發展出一 種新的播散試驗’其對細胞內複製較不敏感（圖4d)。首 先，以500:1之高MOI (感染複數）感染HeLa細胞1小 時。接著使該感染細胞接受放射線照射以阻斷該HeLa細 胞之複製。以1:70之比例將該受到感染並接受放射線照 射之Hela細胞與未經感染之HeLa細胞單層在健他黴素存 在下共同培養。感染細胞之數量係藉由接種在SeaPlaque -41 - 200944228 瓊脂糖上測定，以避免細胞溶解。如預期般，野生型 M9 0T在8小時後使感染細胞數量增加12倍。在稍後之時 間點，該非減毒之毒性菌株對細胞顯示毒性，因此無法再 測定菌落形成單位。在M90Tdelta之例子中，感染細胞數 量在共同感染8小時後增加6倍，1 2小時後增加1 7倍， 然而無毒性菌株BS176delta之感染細胞數量在8小時後 僅增加3倍，到1 2小時仍無進一步增加。這些資料顯示 M90Tdelta之細胞至細胞播散能力未經受損。不帶有細胞 至細胞播散之基因資訊的BS176delta顯示少量增加，這 可能是在早期時間點由於高度感染之放射照射細胞有部分 細胞溶解所致，爲了保護真核細胞在12小時期間使用相 對較低之健他黴素濃度僅10微克/毫升只能殺滅部分之細 胞外細菌。要進一步檢查細胞感染之特徵，感染細胞以吉 姆沙染色進行組織學評估（圖4e)°HeLa細胞在感染後1 小時（見圖11)及4小時（圖4e)之吉姆沙染色顯示，菌株 M9 0T及M9 0Tdelta之細菌主要位於細胞-細胞接觸點。也 可以偵測到細胞至細胞播散。相反的，菌株BS176delta 幾乎無法偵測到細胞內細菌，即使在感染後4小時。此 外，無毒性菌株並未顯示細胞至細胞播散之徵兆。 要測定aro A突變誘發半胱胺酸天冬胺酸酶-1活化（圖 4f)及凋亡誘發（圖4g)之能力，使J774A.1小鼠巨噬細胞 接受感染並分析細胞溶解產物。M90Tdelta可誘發半胱胺 酸天冬胺酸酶-1活化及凋亡，但BS176delta則否。應注 意的是，由M90Tdelta所誘發之凋亡係半胱胺酸天冬胺酸 200944228 酶-ι依賴性，因爲半胱胺酸天冬胺酸酶-1特異性抑制劑 YVAD-CHO可完全阻斷半胱胺酸天冬胺酸酶-1及PARP 活化（圖4f及4g)。 隨後要分析的是，志賀氏桿菌是否和沙門氏桿菌一樣 以巨噬細胞爲較佳之目標。因此，採用和前述沙門氏桿菌 類似之試驗設計，經靜脈注射志賀氏桿菌至已經建立4T1 腫瘤（圖5及圖16)之Balb/c小鼠。同樣的，在任何時間 φ 點之巨噬細胞組份中可發現每個細胞中有顯著較多之細菌 (圖 5a，b)及較多之感染細胞（圖 5b，d)。另外’大部分 M90Tdelta-aroA被發現在細胞內（圖5a，b)，然而以無毒性 菌株BS176delta-aroA感染6小時後有50倍以上之細菌 被發現在細胞外（圖5a) » 我們也分析細胞組份之半胱胺酸天冬胺酸酶-1表現 及活化及誘發凋亡（圖6及圖20)。在感染後4小時、6小 時及7天後，以西方墨漬法分析半胱胺酸天冬胺酸酶-1 φ 活化（圖6a)及PARP剪切（圖6b)。半胱胺酸天冬胺酸酶-1 活化及PARP剪切可在M90Tdelta感染後4小時及6小時 於來自小鼠腫瘤之總細胞及巨噬細胞組份中偵測到，也可 在感染後7天之巨噬細胞組份中偵測到，但是BS176delta 感染則否。此外，感染後7天腫瘤相關性巨噬細胞之相對 量係以 FACS測定（圖 6c)。M90Tdelta感染導致荷瘤 Balb/c小鼠及MMTV-Her2小鼠之巨噬細胞數量顯著降 低，但BS176delta感染則否（補充性資料）（Lin, E.Y., Nguyen, A.V., Russell, R.G. & Pollard, J.W. J Exp Med -43- 200944228 200 1，1 9 3: 727-740; Bingle, L.5 Brown, N.J. & Lewis，C. E. J Pathol 2002，1 96: 254-265; Scholl，S.M., Crocker, P.， Tang, R., Pouillart, P. & Pollard, J.W. Mol Carcinog 1 993, 7: 207-2 1 1; Kirma, N. et al. Cancer Res 2004, 64: 4 1 62-4 17 0; Gouon-Evans，V·，Rothenberg，M.E. & Pollard, J.W. Development 2000， 12 7: 2269-2282; Pollard, J.W. &

Hennighausen, L. Proc Natl Acad Sci USA 1994，91: 93 12-93 16; Van Nguyen, A. & Pollard, J.W. Dev Biol 2002，247: 1 1 -25; Pollard, J.W. Nat Rev Cancer 2004，4: 7 1-78; Murdoch, C·，Giannoudis，A. & Lewis, C. E. Blood 2004， 1 04: 2224-2234; F ilderman, A. E., Bruckner, A.，

Kacinski, Deng, N. & Remold, H.G. Cancer Res 1 992，52: 3661-3666) 〇 未受感染鼠（圖6e上方）、BS176delta感染鼠（圖6e中 間）及M90Tdelta感染鼠（圖6e下方）之組織學檢查證實， 感染後7天源自M90Tdelta之腫瘤中的巨噬細胞顯著減少 及巨噬細胞凝聚干擾（e，抗F4/8 0染色，左圖），並顯示嚴 重發炎（e，抗 CD45染色，右圖），但是未受感染或 BS176delta感染鼠中貝[f否。 要探討由M90Tdelta所誘發之巨噬細胞數量及嚴重發 炎顯著減少是否與治療效果有關，將細菌施予至荷瘤 Balb/c小鼠並評估腫瘤生長（圖7a)。感染BS176delta導 致少量但顯著之腫瘤生長降低。相反的，單次靜脈感染 M9 0Tdelta導致實質上且顯著地腫瘤生長降低。應注意的 200944228 是，在治療後19天腫瘤生長被完全阻斷。不生長之腫瘤 顯示非常低之巨噬細胞數量（3-4%)，在感染後48天無法 偵測到細菌（圖7c)。第49天時，經靜脈施予ixl〇6細菌 至剩餘的3隻小鼠。未偵測到腫瘤大小進一步縮小。第 68天測定菌落形成單位，隨後進行組織學檢査。在腫 瘤、肝臟及脾臟中未偵測到細菌（資料未顯示）。 要探討副痢疾桿菌M90Tdelta-aroA之治療是否適用 φ 於人類’以M90Tdelta-aroA感染衍生自卵巢癌病人新鮮 分離腹水之細胞（圖8a及見圖20)。M90Tdelt a-aroA有效 感染分離自人類腫瘤之腫瘤相關性巨噬細胞，且在這些細 胞中誘發半胱胺酸天冬胺酸酶_丨活化及凋亡（圖8b)。同 . 樣的’感染衍生自人類腫瘤分離細胞之ΤΑΜ相較於巨睡 細胞清除組份至少有效1 00倍。 實施例2 :副痢疾桿菌之ipaB基因（NC_00485 1 )於革 ❿ 蘭氏陰性細菌（大腸桿菌K1 2)中之表現及分泌 2a)選殖副痢疾桿菌之ipaB基因（NC_00485 1 )至分泌 質體 lUZi 沙門氏桿菌可如志賀氏桿菌般，透過SipB蛋白質所 介導之半胱胺酸天冬胺酸酶-1活化來誘發感染巨噬細胞 之發炎及凋亡，SipB蛋白質係由第三型分泌系統（TTSS) *m(Suzuki，T.etal.JBiolChem 2005，280:1 4042-1 4050; Zychlinsky, A. et al. Mol Microbiol 1 9 9 4, 1 1： 619-627; Chen, L.M. et al.，Mol Microbiol 1 996，21: 1101- -45- 200944228 1115; Hilbi, H. et al. J. Biol. Chem. 1 998, 273: 32895-32900)。沙門氏桿菌藉由SipB活化半胱胺酸天冬胺酸酶-1並於早期誘發ΤΑΜ凋亡’但在晚期則無法誘發ΤΑΜ凋 亡且無法減少ΤΑΜ之相對量。相反的，在4Τ1及自發性 乳癌模型中，代謝性減毒之毒性志賀氏桿菌株能藉由 IpaB活化半胱胺酸天冬胺酸酶-1並於所有時間點誘發 ΤΑΜ凋亡，但無毒性志賀氏桿菌株則否。 沙門氏桿菌之暫時性凋亡誘發可從感染之早期時間點 表現致病性島SPI1 (包括SipB)及在晚期從SPI1轉變成 SPI2來加以解釋。SPI2致病性島不包含毒性因子如可直 接活化半胱胺酸天冬胺酸酶-1處理之SipB (Panthel，K. et al. Infect. Immun. 2005，73: 334-34 1)。和沙門氏桿菌不 同的是，志賀氏桿菌在感染期間的每個時間點均表現 IpaB (Schroeder, G.N., et al., Microbiology 2007, 153: 2862-2876; Cossart, P. & Sansonetti, P. J. Science 2004, 3 0 4: 242-248; Tam ano, K. et al. Embo J 2000, 19: 3876-3 887 卜 要評估在革蘭氏陰性菌株中功能性表現及分泌功能性 ipaB之可能性，將ipaB基因選殖至pMoHly表現載體導 致表現及分泌ip aB蛋白質。分泌係由編碼大腸桿菌之第j 型溶血素分泌系統（T1SS)之質體介導。該分泌質體在先前 被描述’在多種革蘭氏陰性目的中有效。要證實這個槪 念，進行選殖至大腸桿菌株。 以下描述包含第I型分泌系統之大腸桿菌K12菌株之 200944228 建構，該分泌系統用於分泌ipaB。原則上，任何減毒之 兼性細胞內革蘭氏陰性菌株可被用於此目的。 ipaB基因被選殖至第I型輸送質體pMOhlyKan。單一 Nsil限制酶切位係位於hlyA基因之二個殘差序列之間， 以決定異源性蛋白質之符合讀框之插入序列（Fensterle et al. Cancer Gene Therapy 2008)。要導入包含 Nsil 限制酶 切位之序列，在pMOhlyKan中建立新的多接頭。下列限制 0 酶切位被用於大型多克隆位點（mcs) : Xhol、Pvul、Nhel 及 Kpnl。 將包含限制酶切位序列並具有與Nsil切位（5’-TGCA-3’）互補之突出末端之寡核苷酸 (CGGTACCGCTAGCCGATCGCTCGAGATGCA 及 TCTCGAGCGATCGGCTAGCGGTACCGTGCA)黏合，以產 生具有該導入限制酶切位之序列區段。黏合此形成之雙股 DNA區段之後，該多接頭被導入Nsil消化之pMOhlyKan φ 以形成新的質體pMOhlyKan mcs。之後篩選抗生素抗性克 隆。正確的導入mcs係由限制酶消化及定序證實。 ipaB之編碼序列在位置1138 (驗基對）包含一個Nsil 限制酶切位。因此該新鮮建構之pMOhlyKan mcs被用於導 入ipaB之開放閱讀框架。ipaB基因係由PCR放大，引子 爲 Salm: mcs ipaB Xhol hin (AAAAAACTCGAGATGCATAATGTAAGCACCAC)及 Salm: mcs ipaB Kpnl ruck (AAAAAAGGTACCTCAAGCAGTAGTTTGTTGC)。前置弓[ -47- 200944228 子被設計以產生一個Xhol限制酶切位，反置引子一個 Kpnl 切位。PCR 產物及 pMOhlyKan mcs 被 Xhol 及 Kpnl 消化，之後將ipaB連接導入PM0hlyKan mcs。以PCR篩 選抗生素抗性克隆，導入係由定序證實。該稱爲 pMOhlipa之序列克隆質體係由Mini Prep分離，並用於其 他試驗（圖22)。 該質體被轉形至大腸桿菌DH5a中以評估其功能性。 圖23顯示該重組大腸桿菌株成功表現及分泌融合蛋白。 大腸桿菌pMOhlipa及大腸桿菌ATolC pMOhlipa之ipaB 表現顯示一個70千道爾頓之產物，因爲該經選殖之IpaB 係與pMOhlyKan模型中C端HlyA分泌信號融合。IpaB係 於M90T溶解產物、大腸桿菌pMOhlipa之沉澱物及上清 液中偵測。在大腸桿菌△ TolC pMOhlipa之上清液中無法 偵測到IpaB，因爲此菌株缺乏大腸桿菌第I型分泌機制作 用所需之tolC基因。 要探討半胱胺酸天冬胺酸酶-1是否可由不同的大腸 桿菌DH5a菌株活化，感染RAW 264.7巨噬細胞並在感 染後不同的時間點進行西方墨漬法分析（圖24)。 西方墨漬分析顯示，大腸桿菌pMOhlipa菌株活化 RAW 264.7巨噬細胞中之半胱胺酸天冬胺酸酶-1 (圖 24)。此外，大腸桿菌△ TolC pMOhlipa在感染後6小時顯 示非常少量之半胱胺酸天冬胺酸酶-1活化。西方墨漬分 析進行2次都得到此結果，這可能是技術問題因爲半胱胺 酸天冬胺酸酶-1可透過大腸桿菌△ TolC pMOhlipa活化。 200944228 大腸桿菌pMOhlipa在感染後3小時活化半胱胺酸天冬胺 酸酶-1，但是相較於M90T對照組半胱胺酸天冬胺酸酶-1 活化相當少。未受感染之RAW 264.7巨噬細胞被用來作 爲陰性對照。被大腸桿菌△ TolC感染之RAW 264.7巨噬 細胞顯示無半胱胺酸天冬胺酸酶-1活化但是有半胱胺酸 天冬胺酸酶-1酶原。 下一步驟是在活體內測試該系統之效果。由於ΤΑΜ 0 在感染非侵入性細菌時缺乏（參見BS176之結果，大腸桿 菌之資料未顯示），經IV施予後我們評估大腸桿菌△ TolC pMOhlipa誘發脾臟巨噬細胞凋亡之能力。如圖25所示， 大腸桿菌ATolC pMOhlipa成功地在脾臟巨噬細胞誘發半 胱胺酸天冬胺酸酶-1活化，如果該系統在活體內係有效 的。 要影響ΤΑΜ，該系統必須被轉移至侵入性革蘭氏陰 性細菌，其包括但不限於志賀氏桿菌、沙門氏桿菌及侵入 〇 性大腸桿菌株。系統在經靜脈施予後誘發巨噬細胞半胱胺 酸天冬胺酸酶-1活化之功能以及侵入性、ipaB表現之志 賀氏桿菌可誘發ΤΑΜ凋亡之事實將導致根據此系統進行 目標性刪除巨噬細胞之重組細菌。 2b)在革蘭氏陽性細菌（單核球增多性李氏菌EGDe)中 選殖副痢疾桿菌之ipaB基因 有關李氏菌之半胱胺酸天冬胺酸酶-1活化的資料有 所衝突，但在巨噬細胞中半胱胺酸天冬胺酸酶-1活化及 凋亡誘發之效果相較於志賀氏桿菌至少爲不佳（Cervantes， -49- 200944228 J. et al., Cell Microbiol 2008，10: 41-52; Franchi, L. et al.，J Biol Chem 2007，282: 1 88 1 0- 1 88 1 8)。然而，李氏菌 爲細胞內細菌，以腫瘤內之巨噬細胞爲目標，因此（Singh， R· & Paterson, Y. Expert Rev Vaccines 2 0 0 6. 5: 541-552) 可能適用於巨噬細胞目標性細菌腫瘤療法。要達到持續凋 亡誘發，建構持續表現及分泌ip aB之減毒李氏菌株。 要在單核球增多性李氏菌 EGDe △ aroA中表現 1口&8，使用來自&(^八基因（？&(^八）之李氏菌啓動子。要在 單核球增多性李氏菌EGDe △ aroA中分泌IpaB，將李斯 特菌素之分泌信號（SShly)融入該啓動子之3’端。利用下 列引子，以PCR自分離自單核球增多性李氏菌EGD之基 因組 DNA 放大 PactA : PactA Pstl Ncol hin (TATCGACTGCAGCCATGGGAGCTCGCGGCCGCTGAA)作 爲前置引子及作爲反置引子之 PactA overhang rtick (CTAGCATTATTTTTTTCATTTATACTCCCTCCTCGTGATA CGC)。反置引子係設計爲具有與來自分泌信號SShly之 序列互補之突出末端。且分泌信號係利用下列引子放大： SS hiy overhang hin (GCGTATCACGAGGAGGGAGTATAAATGAAAAAAATAAT G C T A G)及 S S h 1 y B a m ΗI r ti c k (AAAAAAGGATCCATCCTTTGCTTCAGTTTG)。之後以 PactA SShly之放大PCR產物進行重組PCR，使用下列引 子：PactA Pstl Ncol hin (前置）及 SS hly BamHl riick (反 置）。之後該重組PCR之產物PactA + SShly及質體PUC18 200944228 經限制酶Pstl及BamHl消化。以連接方式將鄰近之 PactA + SShly導入PUC18中，適當之導入係由限制酶消化 及定序加以確認。由於 SShly之反置引子，整合一個 BamHl限制酶切位。因此ipaB係由PCR放大，使用產生 分別限制酶切位BamHl於起始處及Sacl於末端之引子： ipaB BamHl hin (AAAAAAGGATCCATGCATAATGTAAGCACCAC)及 ipaB Sacl rilck (AAAAAAGAGCTCTCAAGCAGTAGTTTGTTGC)。然後該 ipaB基因無縫地選殖至PUC18中之信號序列之後，然後 被定序。 接著該建構物PactA + SShly + ipaB係以限制酶Pstl及 Sacl自pUC18切出，並以連接方式導入經Pstl及Sacl消 化之革蘭氏陽性表現載體pSP〇中以導致新的質體pSPR17 (圖 26)。 此建構物可被轉形至減毒之李氏菌株，並用於目標性 刪除ΤΑΜ» 【圖式簡單說明】 圖1不同之小鼠腫瘤模型可偵測到大量ΤΑΜ。自皮 下注射 lxl〇6 B78-D14 細胞（a)、ΙχΙΟ4 4Τ1 細胞（b)及 lx 106 P815-PSA細胞（c)之小鼠中分離直徑1至1.5公分之 腫瘤。另外，自基因轉殖MMTV-Her2/new FVB小鼠分離 自發性乳房腫瘤（d)。腫瘤組織被固定及包埋於石蠟中。 -51 - 200944228 將腫瘤切片以生物素基化之抗F4/8 0單株抗體免疫染色， 然後以蘇木精複染（右圖）。利用不含F4/80抗體之抗生物 素蛋白-辣根過氧化酶進行染色以作爲對照組（左圖）。 圖2鼠傷寒沙門氏菌delta-aroA株在活體內以ΤΑΜ 爲主要目標。以lxl〇6鼠傷寒沙門氏菌delta-aroA株經靜 脈感染荷瘤小鼠（每組及每個時間點n = 3隻小鼠）後4小 時、6小時及7天後，測定經分離之腫瘤細胞及作爲對照 之脾臟細胞之菌落形成單位/細胞數（a)及感染細胞/細胞數 (b)。菌落形成單位係藉由平板接種細胞溶解產物之連續 稀釋液測定。感染細胞數係藉由將未經溶解之健他黴素處 理細胞平板接種於L-Top瓊脂中測定。由上往下之斜線柱 代表未經健他黴素處理之全脾臟細胞，由下往上之斜線柱 表示健他黴素處理之脾臟細胞。橫線柱代表未經健他黴素 處理之全腫瘤細胞組份。直線柱代表經健他黴素處理之總 腫瘤細胞組份。黑色柱代表巨噬細胞組份，白色柱代表巨 噬細胞清除組份。在任何時間點，巨噬細胞組份相較於巨 噬細胞清除之腫瘤細胞發現顯著較多之細菌。在感染後4 及6小時，大部分細菌位於細胞內，然而在感染後7天， 以健他黴素處理相較於未處理之總腫瘤細胞中所測得之 cfu數發現’ 10倍以上之細菌位於細胞外。所有結果係以 平均値士標準差表示；: p<0.01，*** : p<0.001，學生t 檢定。 圖3沙門氏桿菌經靜脈感染荷瘤小鼠在感染後6小 時於腫瘤相關性巨噬細胞中誘發半胱胺酸天冬胺酸酶-1 -52- 200944228 活化及凋亡，但在7天後則否。沙門氏桿菌感染4T1荷瘤 小鼠後4小時、6小時及7天，以西方墨漬法分析經分離 及溶解細胞之半胱胺酸天冬胺酸酶-1活化（a)及PARP剪 切（b)。半胱胺酸天冬胺酸酶-1抗體偵測半胱胺酸天冬胺 酸酶-1之活性20千道爾頓次單位，PARP抗體偵測85千 道爾頓之剪切PARP片段。半胱胺酸天冬胺酸酶-1活化及 PARP剪切可在感染後6小時於來自小鼠腫瘤之總細胞及 0 巨噬細胞組份中偵測到，但在巨噬細胞清除組份中則否。 在感染後7天，任何組份中均無法偵測到半胱胺酸天冬胺 酸酶-1或凋亡。GAPDH係用來作爲載入對照。在感染後 7天，ΤΑΜ之相對量係由FACS測定，長條代表按組別分 ， 析之三個腫瘤之平均値+/-標準差（c)。在感染後7天，沙 門氏桿菌不影響巨噬細胞數量。 圖4 aroA突變之副痢疾桿菌株之特徵。（a)測定於37 t、每分鐘180轉之LB培養液中之生長速率。隔夜培養 ❹ 物經1 :20倍稀釋以作爲主要培養物，每小時測量其光密 度値。該不含質體之無毒性菌株副痢疾桿菌BS 176之特 徵爲在LB培養液中之最高生長速率爲每小時0.3個光密 度値，然而毒性菌株副痢疾桿菌M90T具有稍微較低之最 高生長速率每小時0.2個光密度値（a)。帶有aroA突變之 菌株的最高生長速率顯著下降》M90Tdelta-aroA之最高生 長速率相較於野生型副痢疾桿菌M90T慢2.5倍。再者， BS176delta-aroA之最高生長速率稍微高於 M90Tdelta-aroA。（b)利用HeLa細胞進行侵入試驗。以100:1之感染 -53- 200944228 複數感染細胞。經過35分鐘之感染（黏合）及1小時感染 後（侵入），接著測定相對於野生型菌株M90T之菌落形成 單位。該副痢疾桿菌M90Tdelta-aroA菌株（M90Tdelta)在 其黏合或侵入行爲上相較於野生型菌株並無顯示差異，但 是無毒性菌株副痢疾桿菌 BS176delta-aroA (BS176delta) 顯示受損之侵入行爲。（c)爲了測定細胞內複製能力，以 1〇〇:1之感染複數感染細胞1小時。接著，使細胞在健他 黴素存在的條件下額外培養2小時，並測定溶解細胞之菌 落形成單位。該野生型菌株可進行細胞內複製，但 M90Tdelta及BS176delta皆無法進行細胞內複製。（d)要 測定細胞間播散之能力，以500:1之感染複數感染HeLa 細胞1小時。接著使該感染細胞接受20葛雷放射線照射 20分鐘以阻斷該HeLa細胞之複製。以70··1之比例將該 受到感染並接受放射線照射之Hela細胞與未經感染之 HeLa細胞在健他黴素存在下共同培養2小時、8小時及 12小時。接著，將SeaPlaque瓊脂糖中非溶解細胞之連續 稀釋液接種於BHI瓊脂培養皿上。共同感染12小時後 M90Tdelta之菌落形成單位增加17倍，但是無毒性菌株 BS176delta之菌落形成單位僅增加 3倍，這表示 M90Tdelta之細胞至細胞播散能力未經受損。（e) M90Tdelta之細胞至細胞播散能力藉由吉姆沙染色感染後 1小時（補充資料）及4小時之HeLa細胞證實。爲了測定 aro A突變誘發半胱胺酸天冬胺酸酶-1活化及凋亡誘發之 能力，使J7 74 A. 1小鼠巨噬細胞接受感染並在不同的時間 200944228 點以西方墨漬法分析細胞溶解產物，使用可辨識半胱胺酸 天冬胺酸酶-1之活性20千道爾頓片段之半胱胺酸天冬胺 酸酶-1抗體（f)及辨識經剪切之85千道爾頓片段之PARP 抗體（g)。M9 0Tdelta可誘發半胱胺酸天冬胺酸酶-1活化及 凋亡，但BS176delta則否。由M90Tdelta所誘發之凋亡 及半胱胺酸天冬胺酸酶-1活化被半胱胺酸天冬胺酸酶-1 特異性抑制劑 YVAD-CHO (2.5毫莫耳）完全阻斷。冷-肌 φ 動蛋白係用來作爲載入對照。長條代表三個不同試驗之平 均値+ /-標準差，*** : p<0.0001，學生t檢定。 圖5 副痢疾桿菌M90Tdelta-aroA株在活體內以ΤΑΜ 爲主要目標。以副痢疾桿菌 M90Tdelta-aroA (c，d)及 BS176delta-ar〇A (a, b)經靜脈感染荷瘤小鼠（每組及每個 時間點n = 3隻小鼠）後6小時及7天後，測定經分離之腫 ' 瘤細胞及作爲對照之脾臟細胞之菌落形成單位/細胞數（a， c)及感染細胞/細胞數（b, d)。菌落形成單位係藉由平板接 Q 種細胞溶解產物之連續稀釋液測定，感染細胞數係藉由將 未經溶解之健他黴素處理細胞平板接種於L-Top瓊脂中測 定。由上往下之斜線柱代表未經健他黴素處理之全脾臟細 胞，由下往上之斜線柱表示健他黴素處理之脾臟細胞。橫 線柱代表未經健他黴素處理之全腫瘤細胞組份。直線柱代 表經健他黴素處理之全腫瘤細胞組份。黑色柱代表巨噬細 胞組份，白色柱代表巨噬細胞清除組份。在任何時間點， 巨噬細胞組份相較於巨噬細胞清除之腫瘤細胞發現顯著較 多之細菌。在任何時間點，大部分之M90Tdelta-ar〇A被 -55- 200944228 發現位於細胞內，然而以無毒性菌株BS176delta-aroA感 染6小時後發現50倍以上之細菌位於細胞外（a, b)。所有 結果係以平均値±標準差表示；: ρ<〇·〇1，*** : ρ<0·001，學生t檢定。 圖6副痢疾桿菌M90Tdelta-aroA經靜脈感染荷瘤小 鼠在感染後4、6小時及7天後於腫瘤相關性巨噬細胞中 誘發半胱胺酸天冬胺酸酶-1活化及凋亡，且顯著降低感 染後7天之巨噬細胞數量，但BS176delta-aroA則否。副 痢疾桿菌感染4T1荷瘤小鼠後4小時、6小時及7天後， 以西方墨漬法分析經分離及溶解細胞之半胱胺酸天冬胺酸 酶-1活化（a)及PARP剪切（b)。半胱胺酸天冬胺酸酶_1抗 體偵測半胱胺酸天冬胺酸酶-1之活性20千道爾頓次單 位，PARP抗體偵測85千道爾頓之剪切PARP片段。半胱 胺酸天冬胺酸酶-1活化及PARP剪切可在M90Tdelta感染 後4小時及6小時於來自小鼠腫瘤之總細胞及巨噬細胞組 份中偵測到，也可在M90Tdelta感染後7天之巨噬細胞組 份中偵測到，但是BS176delta感染則否。GAPDH係用來 作爲載入對照。在感染後7天，ΤΑΜ之相對量係以FACS 測定（Ο、（d) ; M90Tdelta感染導致巨噬細胞數量在感染 後7天顯著降低，BS176delta感染則否。未受感染鼠、 BS176delta感染鼠及M90Tdelta感染鼠之組織學檢查（e) 顯示，在感染後7天源自M9 0Tdelta之腫瘤中巨噬細胞顯 著減少（抗F4 80染色）且嚴重發炎（抗CD45染色），同時細 胞角蛋白陽性4T1腫瘤細胞（抗CK染色）幾乎完全減少， 200944228 但是未受感染或BS176delta感染鼠中則否。長條代表按 組別分析之四個腫瘤之平均値+/-標準差（c)，** : ρ<〇·〇1，*** : p<0.001，學生 t 檢定。 圖7 M90Tdelta經靜脈感染4T1荷瘤小鼠阻斷腫瘤生 長，但BS176delta則否。U)腫瘤移植後14天，經靜脈施 予lxlO6細菌至每組n=8隻小鼠。對照組係施予1倍PBS 靜脈注射。在感染M90Tdelta後腫瘤生長顯著降低，然後 0 腫瘤生長被抑制。感染BS176delta導致少量但顯著之腫 瘤生長降低。未受感染及BS176delta感染小鼠在腫瘤接 種後31天因動物福利原因犧牲，在第一次感染後1至18 天、18至 48天、48至 68天分別爲所有組別n = 8， M90Tdelta感染動物n = 6 (2隻小鼠被犧牲以比較腫瘤生長） 及n = 3 (3隻小鼠被犧牲以測定菌落形成單位及用於FACS 分析）。: ρ<〇.〇1，…：p<0.001 = (b)感染後 48 天，巨 噬細胞數目及菌落形成單位分別利用FACS及連續稀釋法 φ 測定。（c)不生長之腫瘤顯示非常低之巨噬細胞數量，且 無法偵測到細菌。第49天時，經靜脈施予lxl 〇6細菌至 剩餘的3隻小鼠。未偵測到腫瘤大小縮小。第68天測定 菌落形成單位，隨後進行組織學檢查。在腫瘤、肝臟及脾 臟中未偵測到細菌。 圖8 M90Tdelta-aroA在活體外以ΤΑΜ爲主要目標且 在自人類腹水細胞分離之巨噬細胞中誘發半胱胺酸天冬胺 酸酶-1活化及凋亡。（a)自病患分離細胞後’以野生型副 痢疾桿菌M90T、副痢疾桿菌M90Tdelta-aroA及副痢疾桿 -57- 200944228 菌BS176delta-ar〇A活體外感染三種不同的細胞組份，以 100:1之感染複數感染1小時。與300微克/毫升之健他黴 素培養1小時後，將連續稀釋液接種於BHI瓊脂上。隔 天測定菌落形成單位。以西方墨漬法分析感染細胞中之半 胱胺酸天冬胺酸酶-1活化及PARP剪切（b)。抗體偵測半 胱胺酸天冬胺酸酶原-1 (45千道爾頓）及活化之20千道爾 頓次單位。要注意的是，巨噬細胞清除組份不包含可偵測 量之半胱胺酸天冬胺酸酶原-1。PARP抗體偵測85千道爾 頓之經剪切之PARP片段。GAPDH係用來作爲載入對 照。所有結果係以平均値士標準差表示；*** : P <〇.〇〇1， 學生t檢定。 圖9:半胱胺酸天冬胺酸酶-1係專門由巨噬細胞表 現。以反轉錄聚合酶連鎖反應（左圖）及西方墨漬法（右圖） 分析半胱胺酸天冬胺酸酶-1表現。使用下列引子：肌動 蛋白 si 5’-GTCGTACCACAGGCATTGTGATGG-3’；肌動蛋 白 5’-GCAATGCCTGGGTACATGGTGG-3 ’ ； CasplRT_ 左 5,-TGCCCTCATTATCTGCAACA-3, » CasplRT_^ 55-GGTCCCACATATTCCCTCCT-3’。 圖10··沙門氏桿菌及志賀氏桿菌於RAW巨噬細胞中 試管內活化半胱胺酸天冬胺酸酶-1。在不同的時間點以副 痢疾桿菌M90T、副痢疾桿菌M90Tdelta-aroA (生長對數 中期）及鼠傷寒沙門氏菌delta-aroA (靜止生長期）感染 RAW 264.7巨噬細胞，感染複數爲10:1。接著，進行西方 墨漬法分析細胞溶解產物中之半胱胺酸天冬胺酸酶-1活 -58- 200944228 化。包含aroA刪除之志賀氏桿菌株在半胱胺酸天冬胺酸 酶-1活化上顯示稍微延遲，但是在2小時後達到與野生 型志賀氏桿菌株相同之活性。沙門氏桿菌株在培養後3小 時誘發半胱胺酸天冬胺酸酶-1活化。在對數期收集之沙 門氏桿菌株在此試驗中不誘發半胱胺酸天冬胺酸酶活 化（資料未顯示）。所有後續感染試驗使用在靜止期收集之 菌株。 φ 圖 11: J77 4A.1 巨噬細胞經 M90T (左）、M90Tdelta- aroA (中）及BS176delta-aroA (右）感染1小時後以吉姆沙 染色。 圖12:健他黴素對鼠傷寒沙門氏菌delta-aroA之細 . 胞外及細胞內活性。（a)以50、100、200及300微克/毫升 之健他黴素處理lxl〇6鼠傷寒沙門氏菌delta-aroA共1/2 小時、1小時及2小時，以連續稀釋法測定菌落形成單 位。（b)J774A.l巨噬細胞感染lxl〇6鼠傷寒沙門氏菌 φ delta-aroA (對數生長期）。以DMEM培養液沖洗細菌3 次，並以每分鐘4000轉離心10分鐘（4°C )。經過1小時 感染後，以50、100、200及3 00微克/毫升之健他黴素培 養細胞1小時，然後以10微克/毫升之健他黴素培養1小 時。在細胞溶解後以連續稀釋測定菌落形成單位。爲了避 免在MACS分離期間再感染細胞並測量細胞外細菌之數 量，必須在1小時的培養期間殺死或實質上減少細胞外細 菌。如（a)所示，以50、100或200微克/毫升之健他黴素 培養1小時導致菌落形成單位降低3倍、10倍或1〇〇 -59- 200944228 倍。相對的，以3 00微克/毫升培養1小時後減少游離細 菌超過1 000倍，並且在2小時後完全清除細菌。要測定 這些濃度對細胞內細菌之活性，採用用來分離細胞之類似 方法（b)。介於100至3 00微克/毫升健他黴素之劑量相較 於50微克劑量顯示稍微增加活性（1.5倍），50微克是在這 些短暫的培養時間內對細胞外細菌有活性的最低劑量。在 介於1〇〇至3 00微克/毫升之健他黴素劑量之間，對細胞 內菌落形成單位並無顯著差異。因此，未來的試驗選擇最 高劑量300微克/毫升之健他黴素，此將可在細胞分離所 採用之試驗設計中導致高於1〇〇〇倍之細胞外細菌減少。 圖13:細胞分離之試驗步驟。（a)在腫瘤移除及以 0.001%去氧核糖核酸酶及2微克/毫升分散酶處理以分離 總腫瘤細胞（b)後，一部分之總腫瘤細胞①經過300微克/ 毫升健他黴素或無健他黴素處理1小時。在處理後，分析 細胞之菌落形成單位及半胱胺酸天冬胺酸酶-1活化。經 健他黴素處理之備製物主要由細胞內細菌組成，但未經處 理之備製物包含細胞外及細胞內細菌。第二部分之總腫瘤 細胞②係以抗F4/80 (IgG)抗體標示。然後加入第二個以 磁珠標示之抗IgG抗體。在磁場中利用MACS管柱進行分 離，形成二個細胞組份：巨噬細胞組份及巨噬細胞清除組 份。巨噬細胞組份之純度係介於96至99%之間（n = 7)。這 些在整個過程中皆與300微克/毫升之健他黴素一起培養 以避免遊離細菌再次感染細胞之組份亦測定菌落形成單位 及半胱胺酸天冬胺酸酶-1活化。應注意的是，巨噬細胞 -60- 200944228 組份（C)相較於巨噬細胞清除（d)組份包含實質上較低之細 胞數量。關於菌落形成單位之計數，應在接種後進行常態 化（菌落形成單位/細胞數、感染細胞/細胞數），至於西方 墨漬法應載入相等之細胞數。 圖14:細胞分離後之三種細胞組份之光學顯微鏡照 片（100倍）。爲了評估細胞分離之效果以免影響感染細胞 數之結果，對三種不同的細胞組份進行光學顯微鏡檢察。 φ 左圖顯示總腫瘤細胞組份。中間爲經分離之巨噬細胞。左 圖顯示巨噬細胞清除組份。所有細胞組份之細胞主要呈現 爲單一細胞。 圖15:以lxlO6鼠傷寒沙門氏菌delta-aroA活體內感 染Balb/c荷瘤小鼠。6小時後以L-Τορ瓊脂試驗測定菌落 形成單位（a)及感染細胞數（b)。以鼠傷寒沙門氏菌仏1^-aroA (lxlO6)感染Balb/c荷瘤小鼠（n = 4)。感染後6小時移 除脾臟及腫瘤，並分離細胞。總菌落形成單位係藉由連續 φ 稀釋溶解細胞測定，感染細胞數係藉由將完整細胞之連續 稀釋液接種於L-Top瓊脂測定。 圖16 :以lxlO6副痢疾桿菌M90Tdelta-aroA活體內 感染Balb/c荷瘤小鼠。4小時、6小時及7天後以L-Top 瓊脂試驗測定菌落形成單位（a,b)及感染細胞數（c，d)。以 副痢疾桿菌M90Tdelta-ar〇A (1χ1〇6)感染Balb/c荷瘤小鼠 (n = 4) 〇感染後4小時、6小時及7天後移除脾臟及腫瘤， 並分離細胞。總菌落形成單位係藉由連續稀釋溶解細胞測 定，感染細胞數係藉由將完整細胞之連續稀釋液接種於 -61 - 200944228 L-Top瓊脂測定。 圖17 :以lxlO6鼠傷寒沙門氏菌delta-aroA活體內感 染MMTV-Her2/new FVB荷瘤小鼠。6小時後以L-Top瓊 脂試驗測定菌落形成單位（a，b)及感染細胞數（c,d)。以鼠 傷寒沙門氏菌 delta-aroA (1 X 1〇6)感染 MMTV-Her2/new FVB荷瘤小鼠（n = 4)。感染後6小時移除脾臟及腫瘤，並 分離細胞。總菌落形成單位係藉由連續稀釋溶解細胞測 定，感染細胞數係藉由將完整細胞之連續稀釋液接種於 L-Top瓊脂中測定。感染7天後感染動物及未感染動物之 巨噬細胞相對百分比（e)係由FACS分析測定。和移植腫瘤 所得到的結果類似，在帶有自發性乳房腺癌之基因轉殖動 物模型中沙門氏桿菌以相較於巨噬細胞清除腫瘤細胞高出 約100倍之效率感染腫瘤相關性巨噬細胞（a-d)。同時在這 個模型中，大部分細菌位於細胞內。沙門氏桿菌處理不會 導致感染7天後腫瘤中可測量之巨噬細胞數量減少。

圖 18 : Μ90T ' M90Tdelta-aroΑ 及 BS 1 76delta-aroA 在分離自基因轉殖小鼠之自發性乳房腺癌之巨噬細胞中誘 發活體外半胱胺酸天冬胺酸酶-1活化及凋亡。以感染複 數爲100:1之副痢疾桿菌M90T、副痢疾桿菌M90Tdelta-aroA及副痢疾桿菌BS176delta-aroA活體外感染分離自 Balb/c (a，b)及MMTV-Her2 (c，d)之細胞的三種不同細胞組 份1小時。在與300微克/毫升之健他黴素一起培養1小 時後，準備不同的探針以進行西方墨漬法。抗體偵測半胱 胺酸天冬胺酸酶原-1 (4 5千道爾頓）及活化之20千道爾頓 -62- 200944228 次單位。要注意的是，巨噬細胞清除組份不包含可偵測量 之半胱胺酸天冬胺酸酶原-1。PARP抗體偵測85千道爾頓 之經剪切之PARP片段。 圖19: M90Tdelta-aroA主要存在於帶有自發性乳房 腺癌之基因轉殖小鼠之腫瘤的巨噬細胞中，且在感染後7 天大幅減少巨噬細胞數量。7天後以L-Top瓊脂試驗測定 菌落形成單位（a，c)及感染細胞數（b，d)。以副痢疾桿菌 Μ 9 0 Td e 1 ta-aro A 及 B S 1 7 6 d e It a-ar o A ( 1 X 1 0 6)感染 MMT V-Her2/new FVB小鼠（n = 4)。感染7天後移除脾臟及腫瘤， 並分離細胞。總菌落形成單位係藉由連續稀釋溶解細胞測 定，感染細胞數係藉由將完整細胞之連續稀釋液接種於 L-Top瓊脂中測定。感染7天後感染動物及未感染動物之 巨噬細胞相對百分比（e)係由FACS分析測定。副痢疾桿菌 M9 0Tdelta-ar〇A在感染7天後仍以感染腫瘤相關性巨噬細 胞爲主。我們也利用FACS分析測定感染後7天之巨噬細 〇 胞百分比（e)。巨噬細胞之量相較於以BS176delta-ar〇A感 染小鼠7天後有顯著差異。*** : p<0.005。經靜脈感染後 7天，M90Tdelta-ar〇A主要存在於自發性腫瘤之巨噬細胞 內（相較於巨噬細胞清除組份有5倍差異）。非侵入性 BS176delta-ar〇A株仍然存在於細胞數非常低之腫瘤中， 也被發現主要存在巨噬細胞中。與沙門氏桿菌不同的是， 相較於非毒性BS176delta-ar〇A株，在以可誘發半胱胺酸 天冬胺酸酶-1活化及凋亡之感染性M90Tdelta-ar〇A株感 染之小鼠的腫瘤中巨噬細胞數大幅減少超過4倍（***: -63- 200944228 ρ<0.005) 〇 圖 20:以 M90Tdelta 感染 MMTV-Her2/new FVB 荷瘤 小鼠在經靜脈感染後6小時（a)及7天（b)可誘發腫瘤巨噬 細胞組份之半胱胺酸天冬胺酸酶-1活化及凋亡，但 BS176delta-aroA 則否。以副痛疾桿菌 M90Tdelta-aroA 及 副痢疾桿菌BS176delta-aroA (lxlO6)經靜脈感染MMTV· Her2荷瘤小鼠（n = 4)。經過6小時及7天後，分離細胞組 份並利用西方墨漬法加以分析。抗體偵測半胱胺酸天冬胺 酸酶原-1 (4 5千道爾頓）及活化之20千道爾頓次單位。抗 剪切PARP抗體偵測85千道爾頓之經剪切之PARP片 段。以M90Tdelta-ar〇A經靜脈感染自發性荷瘤基因轉殖 小鼠在感染後6小時導致實質上誘發半胱胺酸天冬胺酸 酶-1活化及凋亡。與沙門氏桿菌不同的是，促凋亡活性 持續至第7天。和在移植腫瘤之動物中所觀察到的結果類 似，在感染M90Tdelta-aroA 7天後之小鼠的總腫瘤細胞 組份中無法測量到半胱胺酸天冬胺酸酶原-1誘發，這可 能可以從這些腫瘤中之巨噬細胞大幅減少得到解釋。 圖21 : M9 0Tdelta-ar〇A在活體外以分離自人類腹水 細胞之ΤΑΜ爲主要目標。該腹水細胞由二種不同的細胞 族群組成，一種是黏附細胞，另一種是懸浮細胞。這二種 細胞族群（a，b)被當作不同的細胞種類處理。（c)從病患分 離出細胞後，以感染複數100:1之野生型副痢疾桿菌 M90T、副痢疾桿菌 M90Tdelta-aroA 及副痢疾桿菌 BS176delta-ar〇A對三種不同的細胞組份及作爲對照之 200944228 RAW 264.7巨噬細胞進行活體外感染1小時。與300微克 /毫升健他黴素培養1小時後，將連續稀釋液接種於BHI 瓊脂上。隔天測定菌落形成單位。所有結果以平均値士標 準差表示；***: Ρ<〇·〇〇1，學生t檢定。 圖22 : pMOhlipa質體之圖解。 圖23 :測定大腸桿菌pMOhlipa之IpaB分泌。經 M90T (陽性，IpaB 64千道爾頓）及BS176 (陰性）感染之 ❹ RAW 264.7巨噬細胞被用來作爲對照組。由大腸桿菌 pMOhlipa分泌之IpaB係以70千道爾頓產物偵測，因爲 HlyA信號序列被融入至IpaB。 圖24:試管內大腸桿菌活化半胱胺酸天冬胺酸酶-1 . 之西方墨漬分析。以不同之大腸桿菌DH5 ο：株（靜止生長 期）感染RAW 264.7巨噬細胞3小時及6小時。以副痢疾 桿菌M90T (對數生長中期）感染RAW 264.7巨噬細胞，並 經星形孢菌素（4微莫耳）處理3小時以作爲半胱胺酸天冬 ® 胺酸酶-1活化之陽性對照。GAPDH係用來作爲載入對 照。 圖25:活體內脾臟組織中之半胱胺酸天冬胺酸酶-1 活化之西方墨漬法分析。以lxlO6大腸桿菌pMOhlipa活 體內感染Balb/c荷瘤小鼠，分離脾臟細胞並進行半胱胺 酸天冬胺酸酶-1活化之西方墨漬分析。自Balb/c小鼠所 分離之ΤΑΜ以M90T感染並作爲半胱胺酸天冬胺酸酶-1 活化之陽性對照。GAPDH係用來作爲載入對照。 圖26 :質體pSPR17之圖解。 -65- 200944228 序列表 <11〇>艾特納辛塔瑞斯有限公司 <120>能誘發巨噬細胞渦亡之非致病性及/或減毒之細菌，製造彼之方法及 彼之用途 <140〉 TV 098103097 <141> 2009-01-23 <150> US 61/024,225 <151> 2008-01-29 <150> EP 08101045.6 <151> 2008-01-29 PCR引子 1 gtcgtaccac aggcattgtg atgg 24 <160> <170> <210> <211> <212> © <213> <220> <223> <400> 34 Patent In 版本 3.3 1 24 DNA 人工 ah222s人0717多 11 1A IX 11 <2<2<2<2 <220> <223> PCR 引子 <400> 2 22 gcaatgcctg ggtacatggt gg

<210> 3 <211> 20 <212> mk <213>· XX <220> <223> PCR 引子 <400> 3 20 tgccctcatt atctgcaaca <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213>人工 <220> <223> PCR 引子 <400> 4 ggtcccacat attccctcct <210> 5 <211> 62 <212> DNA <213>人工 <220〉 <223> PCR 引子 20 200944228 <400> 5 ggggttttta tttctgttgt agagagttga gttcatggaa tcgtgtaggc tggagctgct 60 tc <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> PCR引子 <400> 6 62 ggccgtgcat ttgggatcaa gaatcgtcac tggtgtatct gcatatgaat atcctcctta 60 <210> 7 <211> 19 <212> mk <213>人工 <220> <223> PCR 引子 <400> 7 gatttctacc gcaatgacg 19 <210> 8 <211> 19 <212> m <213>人工 <220〉 <223> PCR 引子 <400> 8 ggaaacaagt gagcgtttc 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213>人工 <220> <223> PCR 引子 <400> 9 ttatacgcaa ggcgacaagg 20 <210〉 10 <211> 20 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> PCR引子 <400> 10 gatcttccgt cacaggtagg <210> 11 <211〉 20 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> PCR引子 -2- 20 200944228 <400> 11 cagtcatagc cgaatagcct <210> 12 <211> 20 <212> IM <213>人工 <220> <223> PCR 引子 <400> 12 cggtgccctg aatgaactgc <210〉 13 <211> 20 <212> DNA <213>人工 <220>

<223> PCR 引子 <400> 13 gatgcaggcc aagaggttag <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213>人工 <220〉 <223> PCR 引子 <400> 14 gcgttgatga ccgcatc <210> 15 <211〉 32 <212> m <213>人工 <220> <223> PCR 引子 <400> 15 aaaaaacgat cgatgcataa tgtaagcacc ac <210> 16 <211> 31 <212〉 DNA <213>人工 <220> <223> PCR 引子 <400> 16 aaaaaacgat cgtcaagcag tagtttgttg c <210〉 17 <211> 30 <212> DNA <213>人工 <220〉 <223> PCR 引子 <400> 17 cggtaccgct agccgatcgc tcgagatgca 30 200944228 <210〉 <211> <212> <213> 18 30 腿 人工 <220> <223> PCR 引子 <400> 18 agtgctcgct agccgatcgc catggcacgt <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213>人工 <220> <223> PCR 引子 <400> 19 aaaaaaggta ccatgcataa tgtaagcacc ac 32 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213>人工 <220> <223> PCR 引子 <400> 20 aaaaaatcaa gcagtagttt gttgc 25 <210> 21 <211> 32 <212> Wk <213〉人工 <220> <223> PCR 引子 <400> 21 aaaaaaggat ccatgcataa tgtaagcacc ac 32 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213>人工 <220> <223> PCR 引子 <400> 22 aaaaaagagc tctcaagcag tagtttgttg c 31 ah2320测人 '>>>> 012 3 «1 11 «1 2 2 22 < < < < <220> <223> PCR 引子 <400> 23 ctcctttcag atgcgtttac 20 <210〉 24 <211> 20 -4- 200944228 <212> DNA <213〉人工 <220> <223> PCR 引子 <400> 24 gtaaacgcat ctgaaaggag 20 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213>人工 <220> <223> PCR 引子 <400> 25 aaaaaaatgc ataatgtaag caccac 26

O <210> <211> <212> <213>

26SAAX <220> <223> PCR引子 <400> 26 aaaaaaatgc attcaagcag tagtttgttg c 31 <210〉 <211> <212> <213> 27 21 DNA 人工 <220〉 <223> PCR 引子 <400> 27 agctgaaatg attttgctga t 21 ❹ <210〉 <211> <212> <213> 28 21 DNA 人工 <220> <223> PCR 引子 <400〉 28 ctgcagtctg caaagcaatc c 21 <210> 29 <211> 36 <212> DNA <213>人工 <220> <223> PCR 引子 <400> 29 tatcgactgc agccatggga gctcgcggcc gctgaa <210> <211> <212> <213> 30 19 DNA 人工 5- 36 200944228 <220> <223> PCR 引子 <400> 30 ttatactccc tcctcgtga <210〉 31 <211> 22 <212> DNA <213〉人工 <220> <223> PCR 引子 <400> 31 atgaaaaaaa taatgctagt tt <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213>人工 <220> <223> PCR 引子 <400> 32 aaaaaaggat ccatcctttg cttcagtttg <210〉 33 <211> 17 <212> DNA <213> ΛΧ <220> <223> PCR 引子 <400> 33 gtaaaacgac ggccagt <210〉 34 <211> 17 <212> DNA <213>人工 <220> <223> PCR 引子 <400> 34 caggaaacag ctatgac

Claims (1)

1. 200944228 七、申請專利範園 i 一種能誘發巨噬細胞凋亡之非致病性及/或減毒之 細菌。 2.如申請專利範圍第1項之非致病性及/或減毒之細 菌’其中該細菌能感染巨噬細胞。 3 ·如申請專利範圍第1項之非致病性及/或減毒之細 菌’其中該細菌係選自革蘭氏陰性細菌或革蘭氏陽性細 ❹ 菌。 4. 如申請專利範圍第3項之非致病性及/或減毒之細 菌’其中該細菌係選自志賀氏桿菌屬（Shigella spp.) '沙 門氏桿菌屬（Salmonella spp.)、李氏桿菌屬（Listeria spp·)、分枝桿菌屬（Mycobacterium spp.)、埃希氏桿菌屬 (Escherichia spp.)、耶氏桿菌屬（Yersinia spp.)、弧菌屬 (Vibrio spp.)或假單胞菌屬（Pseudomonas spp·)。 5. 如申請專利範圍第4項之非致病性及/或減毒之細 ❹ 菌，其中該細菌係選自副痢疾桿菌（Shigella flexueri)、鼠 傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium)、牛分枝桿菌卡介 苗株（Mycobacterium bovis BCG)、單核球增多性李氏菌 (Listeria monocytogenes)、大腸桿菌（Escherichia coli)、 傷寒沙門氏菌（Salmonella typhi)、小腸大腸炎耶氏桿菌 (Yersinia enterocolitica)或霍亂弧菌（Vibrio cholerae)。 6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之非致病性 及/或減毒之細菌，其中該減毒係藉由刪除或不活化至少 一個選自 aroA、aro、asd、gal、pur、cya、crp、phoP/Q 200944228 或omp之基因所造成。 7. 如申請專利範圍第6項之非致病性及/或減毒之細 菌，其中該減毒導致營養缺陷細菌。 8. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之非致病性 及/或減毒之細菌，其中該巨噬細胞係Ml巨噬細胞及/或 M2巨噬細胞且較佳爲M2巨噬細胞。 9. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之非致病性 及/或減毒之細菌，其中誘發凋亡係藉由半胱胺酸天冬胺 @ 酸酶活化（較佳爲半胱胺酸天冬胺酸酶-1活化）達成。 1 〇.如申請專利範圍第1至5項中任一項之非致病性 及/或減毒之細菌，其中該細菌係重組細菌。 11.如申請專利範圍第10項之非致病性及/或減毒之 細菌，其中該細菌攜帶至少一個染色體整合DNA，較佳 爲重組DNA，該DNA編碼至少一個選自IpaB或SipB之 蛋白質。 1 2 .如申請專利範圍第1 0項之非致病性及/或減毒之 0 細菌，其中該細菌攜帶至少一個染色體整合調節DNA， 較佳爲重組DN A，該DN A導致持續表現至少一個選自 IpaB或SipB之蛋白質。 1 3 .如申請專利範圍第1 0項之非致病性及/或減毒之 細菌，其中該細菌攜帶至少一個染色體刪除或不活化至少 —個導致持續表現至吵一個選自IpaB或SipB之蛋白質之 調節DNA。 1 4.如申請專利範圍第1 0項之非致病性及/'或減毒之 -2- 200944228 細菌，其中該細菌攜帶至少一個質體，較佳爲重組質體。 如申請專利範圍第14項之非致病性及/或減毒之 細菌，其中該至少一個質體，較佳爲重組質體，編碼至少 一個選自IpaB或SipB之蛋白質。 1 6.如申請專利範圍第1 4項之非致病性及/或減毒之 細菌，其中該至少一個質體，較佳爲重組質體，編碼至少 一個導致持續表現至少一個選自IpaB或SipB之蛋白質之 ❹ 調節DNA。 17.如申請專利範圍第1至5項中任一項之非致病性 及/或減毒之細菌，其中該非致病性及/或減毒之細菌係選 自副痢疾桿菌 M90T delta-aroA株、鼠傷寒沙門氏菌 delta-aroA 株或副病疾桿菌 BS176 delta-aroA pWRIOO 株。 18·—種醫藥組成物，其包含至少一種如申請專利範 圍第1至17項中任一項之非致病性及/或減毒之細菌，較 〇 佳爲至少一種經凍乾之非致病性及/或減毒之細菌，及藥 學上可接受之載劑。 19. 一種藥物，其包含至少一種如申請專利範圍第1 至17項中任一項之非致病性及/或減毒之細菌或如申請專 利範圍第1 8項之醫藥組成物。 20. —種藥物，其包含至少一種如申請專利範圍第1 至17項中任一項之非致病性及/或減毒之細菌或如申請專 利範圍第18項之醫藥組成物，該藥物係用於治療及/或預 防選自下列之生理及/或病理生理症狀：涉及巨噬細胞發 -3- 200944228 炎之疾病（其中巨噬細胞係與疾病開始或疾病進展有關）、 腫瘤疾病、不受控制之細胞分裂、惡性腫瘤、良性腫瘤、 實體腫瘤、肉瘤、癌、過度增生性疾病、類癌、尤因肉 瘤、卡波濟氏肉瘤、腦腫瘤、源自腦部及/或神經系統及/ 或腦脊膜之腫瘤、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、胃癌、腎 癌、腎細胞癌、前列腺癌、前列腺腫瘤、結締組織腫瘤、 軟組織肉瘤、胰腫瘤、肝腫瘤、頭腫瘤、頸腫瘤、食道 癌、甲狀腺癌、骨肉瘤、視網膜母細胞瘤、胸腺瘤、睪九 癌、肺癌、支氣管癌、乳癌、乳房腫瘤、小腸癌、結腸直 腸腫瘤、結腸癌、直腸癌、婦科腫瘤、卵巢腫瘤、子宮 癌、子宮頸癌、子宮頸腫瘤、子宮體癌、子宮體腫瘤、子 宮內膜癌、膀胱癌（urinary bladder cancer)、膀腕癌 (bladder cancer)、皮膚癌、基底細胞癌、棘細胞瘤、黑色 素瘤、眼內黑色素瘤、白血病、慢性白血病、急性白血 病、淋巴瘤、感染、病毒或細菌感染、流行性感冒、慢性 發炎、器官排斥、自體免疫性疾病、糖尿病及/或第二型 糖尿病。 2 1.如申請專利範圍第20項之藥物，其係用於治療 及/或預防如申請專利範圍第20項所述之生理及/或病理 生理症狀，使得 (a) 凋亡係於腫瘤相關性巨噬細胞（ΤΑΜ)中誘發且腫瘤 相關性巨噬細胞（ΤΑΜ)被部分或完全清除’及/或 (b) 凋亡係於疾病相關性巨噬細胞中誘發且疾病相關 性巨噬細胞被部分或完全清除。 -4- 200944228 22. —種如申請專利範圍第1至17項中任一項之非 致病性及/或減毒之細菌於製備供治療及/或預防如申請專 利範圍第20項所述之生理及/或病理生理症狀的藥物上之 用途，其中該藥物將於至少一種額外之藥理活性物質治療 之前及/或期間及/或之後投予。 23. 如申請專利範圍第22項之用途，其中該額外之 藥理活性物質係選自DNA拓撲異構酶I及/或II抑制劑、 φ DNA嵌入劑、烷化劑、微管去穩定劑、荷爾蒙及/或生長 因子受體激動劑及/或拮抗劑、信號傳導抑制劑、抗生長 因子及其受體之抗體、激酶抑制劑或抗代謝物。 24. 如申請專利範圍第23項之用途，其中該額外之 _ 藥理活性物質係選自放線菌素D、胺基乙哌啶酮、天冬醯 胺酸酶、癌思停（avastin)、咪唑硫嘌呤、BCNU (卡氮芥 (carmustine))、博萊黴素（bleomycin)、白消安 (busulfan) 卡 |白（carboplatin) 、 CCNU (羅氮芥 0 (lomustine))、氯芥苯丁酸、順氯氨鉑、左旋天冬醯胺 酶、環磷醯胺、阿糖胞苷、達克黴素（dactinomycin)、正 定黴素（daunorubicin)、 己烯雌酚、阿黴素 (doxorubicin)(亞德里亞黴素（adriamycin))、DTIC (氮嫌哩 胺）、表阿黴素（epirubicin)、爾必得舒（erbitux)、紅經基 壬基腺嚷哈、乙炔雌二醇、依托泊苷（etoposide)、碟酸氟 達拉濱（fludarabine phosphate)、氟經甲基睪酮、拂勃猫 (flutamide)、吉西他濱（gemcitabine)、基立克 (Gleevec/Glivec)、賀癌平（Herceptin)、六甲三聚氰胺、 200944228 羥基脲、羥孕酮己酯、伊達比星（idarubicin)、依弗醯胺 (ifosfamide)、干擾素、艾瑞莎（iressa)、伊立替康 (irinotecan)、L-天冬醯胺酸酶、菊白葉酸、甲基二氯乙基 胺、甲孕酮、甲地孕酮、黴法蘭（melphalan)、锍乙磺酸 鈉、氨甲蝶呤、絲裂黴素C、米托坦（mitotane)、雙羥葱 醌、N·膦醯乙醯基-L-天冬胺酸（PAL A)、草酸鉑、噴司他 丁（pentostatin)、普卡黴素（plicamyCin)、潑尼松龍 (prednisolone)、潑尼松（prednisone)、甲基苄胼、雷洛昔 芬（raloxifen)、雷怕黴素（rapamycin)、 賽氮芥 (semustine)、索拉非尼（sorafenib)、鏈脲佐菌素、它莫西 芬（tamoxifen)、得舒緩（tarceva)、勉癌易（taxotere)、鬼臼 噻吩甙、丙酸睪固酮、硫鳥嚷玲、噻替派（thiotepa)、拓 撲替康（topotecan)、三甲基三聚氰胺、尿嘧啶核苷、長春 花驗、長春花新驗、長春地辛（vindesine)、長春瑞濱 (vinorelbine)、2’，2’-二氟脫氧胞嘧啶核苷、5-氟脫氧尿嘧 啶核苷單磷酸、5-氮雜胞嘧啶核苷克拉屈濱（5-azacytidine cladribine)、5-氟脫氧尿嘧啶核苷、5-氟尿嘧啶（5-FU)或 6-毓基嘌呤。 25. 如申請專利範圍第22至24項中任一項之用途’ 其中該藥物係於放射療法及/或手術之治療之前及/或期間 及/或之後投予。 26. —種製備如申請專利範圍第1至17項中任一項 之非致病性及/或減毒之細菌之方法’該方法包含下列步 200944228 (a) 將非致病性及/或非減毒細菌中之至少一個選自下 列之基因刪除或不活化：aroA、aro、asd、gal、pur、 cya、crp、phoP/Q 或 omp ；及/或 (b) 將DNA，較佳爲重組DNA，整合至該非致病性及/ 或減毒之細菌之基因組中，該DNA包含編碼至少—個選 自IpaB或SipB之蛋白質之DNA;及/或 (〇將至少一個質體，較佳爲重組質體，導入至該非 〇 致病性及/或減毒之細菌中，該質體包含編碼至少一個選 自IpaB或SipB之蛋白質之DNA ;及/或 (d) 將DNA，較佳爲重組DNA，整合至該非致病性及/ 或減毒之細菌之基因組中，該DNA包含至少一個能使至 . 少一個選自IpaB或 SipB之蛋白質持續表現之調節 DNA ;及/或 (e) 染色體刪除或不活化至少一個導致持續表現至少 一個選自IpaB或SipB之蛋白質之調節DNA;及/或 〇 (f)將至少一個質體，較佳爲重組質體，導入至該非 致病性及/或減毒之細菌中，該質體包含至少一個能使至 少一個選自IpaB或 SipB之蛋白質持續表現之調節 DNA 〇 2 7. —種醫藥套組，其包含至少一種如申請專利範圍 第1至1 7項中任一項之非致病性及/或減毒之細菌或如申 請專利範圍第1 8項之醫藥組成物或如申請專利範圍第1 9 至21項中任一項之藥物及供靜脈注射用之藥學上可接受 之緩衝液。