TW200932220A - Functionalized, solid polymer nanoparticles comprising epothilones - Google Patents

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200932220 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明描述具有陽離子表面電位之聚合物奈米顆粒其 中可囊封中性之疏水性及親水性之醫藥學活性物質。藉由 /、帶電t 5物進行離子錯合，藉由共沈丨殿將親水性且因此 水/谷物質雄、封於顆粒核中。治療劑（尤其埃坡黴素 (epothilone))與診斷劑均可用作用於囊封之醫藥學活性物 質。陽離子顆粒表面容許用帶部分相反電荷之化合物進行 穩定之靜電表面改質，該等帶部分相反電荷之化合物可含 有靶向特異性配位體以改良被動及主動靶向。 【先前技術】 奈米顆粒藥物傳遞系統之特殊性質主要係基於其小尺 寸，因此可克服各種生理學障壁^讣瓜丫TM，FongRM等 人Mater. Today，2005; 8(8): 18-26]。相關改變之於有機體 中之分布可用以有利於（例如）各種贅生性疾病之診斷與治 療。 將可用於偵測與治療疾病之奈米顆粒系統稱為治療診斷 劑（i/^ra«〇w/cs)(=治療劑+診斷劑）。相關治療監測在未來將 容許更快地識別對治療之抵抗性且經由及早使用替代療法 來極大地改善患者復原[Emerieh D.F,，Than()s C G，

Nanosci·，2005; 1: 177-188]。 細胞抑制劑代表極成功地用於腫瘤治療中之一類物質。 該等物質破壞身體中所有迅速分裂之細胞（包括腫瘤細 胞）。然而，此不僅導致腫瘤細胞死亡，且其通常亦影響其 136765.doc 200932220 他生命器官及組織，諸如骨髓、黏膜或心臟血管》相關非 所需毒性通常為療法中之劑量限制因素[Silacci D.，Neri M., Modern Biopharmaceuticals: Design, development and optimization’ 第 3卷，第 V部分，Wiley-VCH，Weinheim，2005; 1271-1299]。 舉例而言，已展示藉由將諸如阿黴素（(1〇乂〇1^111)丨(；丨11)之細胞 ' 毒素物質囊封於奈米顆粒系統中，對健康組織損害較小且 可在腫瘤組織中達成局部較高濃度之活性物質[Silacci D.， ❹

Neri M., Modern Biopharmaceuticals: Design, development and optimization，第 3卷，第 V部分，Wiley-VCH，Weinheim， 2005; 1271-1299]。 在阿黴素之脂質調配物的情況下，該物質之心臟毒性可 顯著降低。藉由降低劑量限制心臟毒性，轉而有可能達成 較高治療效率。由於可證實之臨床優勢，已以名稱Doxil® 或Cealyx成功地核准囊封於脂質體中之阿黴素用於腫瘤治 • 療。 埃坡黴素代表一類引起細胞凋亡之新穎抗腫瘤化合物。 已在各種公開案及研究結果之報導（例如IDrugs，2002, 5(10):949-954)中說明其抗癌作用。亦自研究報導或其他公 • 開案獲知其投與劑量，例如自WO 99/43320獲知埃坡黴素A 及B。使用奈米顆粒調配物，藉由利用特定分布機制，可正 面影響此類新穎物質之治療作用或副作用概況。 已將增強之滲透及滯留效應（EPR效應）視為造成此情況 之主要原因。Matsumura及Maeda已在1986年將此EPR效應 136765.doc 200932220 描述為在實體腫瘤中乾向藥物累積之策略[Matsumura Υ.， Maeda H., Cancer Res., 1986; 46: 6387-6392][Maeda H., Adv. Enzyme Regul., 2001; 41: 1 89-207]。此涉及被動累積 機制，其利用腫瘤組織或亦發炎組織之結構特性[Ulbrich K.，Subr V.，Adv. Drug Deliv. Rev., 2004; 56(7): 1023-1050]。 詳言之，由於其快速生長及各種信使物質（messenger substance)，因此腫瘤組織一般具有開窗"有孔”組織結構且 不存在淋巴排泄之特徵《視腫瘤類型而定，一般將開窗尺 寸置為介於380 nm與780 nm之間，因此此範圍亦稱為奈米 尺寸視窗[Hobbs S.K.，Monsky W.L.等人，卩1*〇〇.他1:1.人〇&(1· Sci. USA, 1998; 95: 4607-4612][Brigger I., Dubernet C.# 人 ’ Adv. Drug Deliv· Rev·，2002; 54(5): 631-651]。相比之 下’諸如心臟、腦或肺之正常組織具有所謂緊密結合（其具 有小於10 nm( —般為2 nm至4 nm)之直徑），膠體藥物媒劑不 可透過該等正常組織[Hughes G.A.，Nanomedicine，2005; 1(1): 22-30]。 在血流中循環之奈米顆粒因此能夠藉由自血流擴散而被 動地累積於腫瘤組織中。淋巴排泄之不存在促進在腫瘤中 之持久累積或防止奈米顆粒之快速洗脫（EpR效應）。 為使此累積機制具有可能性，奈米顆粒必須在金流中循 環足夠長時間。此需要介於約1〇11〇1與38〇11111之間的粒度及 合適顆粒表面。舉例而言1乙二醇化顆粒表面可防止身 體自身之蛋自質將該等顆粒識別為外來物，同時經由網狀 136765.doc 200932220 内皮系統（RES)之器官將其迅速清除[Otsuka Η.等人，Adv. Drug Deliv. Rev.，2003; 55(3): 403-419]。藉由使用顆粒表 面上之活性配位體（例如抗體），可進一步最佳化組織特異性 累積[Nobs L.等人，Pharm. Sci·，2004; 93: 1980-1992] [Yokoyama M., J. Artif. Organs, 2005; 8: 77-84] 〇 對於待吸收至細胞中之活性物質而言，必須克服又一生 理學障壁一細胞膜。對於許多醫學物質而言，困難之一在 於細胞具有極有效之輸送機制（例如P-醣蛋白）來驅逐外來 或毒性物質。然而，若藉助於奈米顆粒，藉由内飲作用將 活性物質引入細胞中’則可避免驅逐輸送體且可防止所謂 多藥抗藥性（multidrug resistance; MDR)[Bharadwaj V.，J. Biomed. Nanotechnol·，2005; 1: 235-258] [Huwyler J.等人， J. Drug Target·，2002; 10(1): 73_79] 〇 一般藉由内飲作用將奈米顆粒併入細胞中。為此，在吸 收過程後’顆粒包含於内體（end〇s〇me)或内溶酶體 (end〇lySOSOme)中[Κοο 〇·Μ·等人，Nanomedicine，2〇〇5; 1(3):193-212]。倘若未發生顆粒自内溶酶體中之釋放，則 存在活性物質及膠體媒劑系統在小泡内之酶促降解。因此 顆粒及因此活性物質自内溶酶體中之釋放對於細胞内治療 作用而言為必需的。 另外可藉由聚合物之適當選擇來控制活性物質自奈米顆 粒之釋放特性。奈米顆粒調配物可因此將施用頻率降至最 低且引起治療必需劑量降低。此外，可藉由囊封於奈米顆 粒中來避免非所需峰值血|水平，且可達成延遲釋放。 136765.doc 200932220 概括言之’以下優勢對於開發聚合物奈米顆粒而言具決 定性： ⑴活性物質之靶向累積， (a) 藉由EPR效應被動地進行， (b) 藉助於組織特異性或細胞特異性配位體（例如抗體） 來主動地進行， (π)藉由適當選擇聚合物而產生之可控活性物質釋放， ❹ ❹ (111)避免血漿水平大的波動， (iv) 降低劑量或增加在相等劑量下之有效性， (v) 較少副作用及改良安全性概況， 〇1)降低施用頻率’同時改良順應性，及 (vii)阻遏抵抗性機制（p_醣蛋白） [Rosen H., Abribat T., Nature Reviews Drug Discovery, 2005年 5 月，4(5): 381-5][McLennan D.N·，Porter C.J.H.等 人，Drug Discovery Today: Technologies，2005年春；2(1): 89-96]° 在技術現狀中尚未開發出已滿足所有所述優勢之奈米顆 粒系統。此外’根據文獻中所述之眾多奈米顆粒媒劑系統 明顯認識到，目前不存在針對所有可預計問題之最佳奈米 調配物。除尺寸之外’顆粒之整體結構、形成基質之物質 及尤其其表面對於活體内行為具有決定性重要性[Ch〇i S.W., Kira W.S., Kim J.H., Journal of Dispersion Science and Technology, 2003; 24(3&4): 475-487]。此外，不同活性物質 之物理化學特性、尤其活性物質之種類顯著改變。因此， 136765.doc 200932220 仍需要開發具有改良性質之膠體藥物媒劑系統。 對於未來治療方法而言，將有必要（例如）藉由診斷性偵 測有機體中之顆粒分布來證實累積主要發生於染病組織中 (例如腫瘤中）。

諸如超曰波知·描、X射線診斷、斷層成像技術（Ct , MRT) 及核醫學（PET，SPECT)之成像技術可用於活體内偵測。另 一相對較新之方法為光學成像，其偵測原理係基於近紅外 螢光之使用。光學成像為在無電離輻射之情況下操作的非 侵襲性方法，且與諸如MRT之方法相比，其成本有效性極 大且耗時較少。為此等應用開發之諸如靛菁綠（Indocyanine Green)之NIR染料具有極佳水溶性，因此難以將其有效囊封 於疏水性聚合物基f中。此情況之原因在於親水物質（例如） 在藉由奈米沈澱製造期間迅速變成水相。 為將親水性物質囊封於奈米顆粒巾，僅幾種技術可用， 且其具有各種缺點。 ▲ & σ卿蒞（P〇1ymeros〇me)之兩親媒性特徵使得 有可能（例如）將親水性物f密封於顆粒之水性㈣中，而可 將疏水性化合物併入膜中。由於侷限於顆粒之核或殼中， 因此負載極為有限且因此—般不充分。另-缺點詳t之在 於親水性物質在水性環境中自此等系、料速洗脫。 因為諸如散菁綠（ICG)之染料為具有少數帶電 分子，所以雷共T。 、 厅以電何不足以用於靜電錯合，因此僅可能 =度^將水溶性物f替代性囊封於聚電解質錯合物中。此 ，水溶液形式之聚電解質錯合物為極動態之系統，因 136765.doc 200932220 此其-般在也聚中具有不足之膠體穩定性[伽此则如a f 等人，Adv. Polym. Sci·，2〇〇4; 166: 113 i7i]。

如已描述’未來將有必要藉助於診斷性奈米顆粒來證實 顆粒累積主要發生於目標位置(例如腫瘤)處。若提供此證 據，則因為已使用診斷系統證實奈米顆粒之所需分布所 以可將治療活性物質囊封於同—個系統中且其可於作用位 點處達成最大治療作用。為避免改變顆粒之分布特性，對 於診斷性㈣及後續治療而言能夠使用同—個奈米顆粒系 統因此為重要的。#已描述，存在斜種不同奈米顆粒系 統，然而其僅適於囊封親水性㈣或疏水性物質。自文獻 已知’即使奈米顆粒性質(諸如粒度)、表面材料、基質聚合 物類型之微小變化或甚至使用不同界面活性劑亦對體内顆 粒分布具有巨大影響。因此，能夠以同一個系統進行診斷、 /台療且或許甚至監測治療為重要的。 因此’理想地’應可能在同—個奈米顆粒系統中有效地 且在足夠抗洗脫穩定性下囊封因其疏水性#而—般具有低 水溶性之診斷物質及治療物質之水溶性染料。 另-技術«㈣由使用合適表面來確保—方面足夠之 顆粒穩定性及另-方面在目標組織中之特異性累H是 否保留於累積位點(目標組織)處尤其取決於顆粒經吸收至 組織及細胞中之程度。 自文獻已知，陽離早顆#主工t 嗯雕于顆粒表面促進吸收至細胞中 [M〇Unkes L.C·等人，j·咖 ，1998; 273_: 26164-26170] [Mislick K.A., Baldeschwieler J.D., Pr〇c. 136765.doc 200932220

Natl· Acad· Sci· USA，1996; 93: 12349-12354]。此係因為帶 負電荷細胞膜（硫酸化蛋白聚糖）與陽離子顆粒表面（一般為 質子化胺官能基）之間的靜電相互作用。另外，已知帶有胺 基之¾^合物或物質具有内滲活性（end〇osrn〇lytic activity)， 亦即其藉由破壞内溶酶體膜來促進顆粒自内溶酶體中之細 胞内釋放[DeDuve C.等人，Bi〇chem. pharmac〇i，1974; 23:2495-253 1]。若顆粒保持在内溶酶體中之細胞内，則顆 粒基質及併入其中之物質係由細胞自身之酶降解。因此自 内溶酶體釋放囊封之活性物質對治療作用而言為必需的。 然而，存在以下問題：在具有帶強陽離子電荷表面之多 聚物（polyplex)及脂質之活體内研究期間有時已描述嚴重 毒物學效應[Kircheis S.等人，j. Gene Med.，1999; 1. lll-120][Ogris Μ.等人，Gene Ther” 1999; 6: 595-605]。原 因在於陽離子顆粒聚集帶負電荷之紅血球且此導致血管阻 塞。另外，在靜脈内施用後顆粒以第一毛細管床穿過肺臟， 此一般引起顆粒在肺中大量累積[Kircheis R.等人，Drug Deliv. Rev.，2001; 53(3): 341-58]。在此情況下，存在由顆 粒與紅丘球或其他血液組份之聚結物促進之肺栓塞的風險 [Kircheis S.等人，j. Gene Med” 1999; 1: lll-120][〇gris μ 等人，Gene Ther., 1999; 6: 595-605]。 理想地，奈米顆粒系統因此應制為具有陽離子表面特 性，但不具有可能妨礙活體内使用之毒理學可疑性質。另 外，顆粒表面對於身體自身之防禦機制（調理素（〇ps〇nin)， RES)而言應微不足道’從而首次允許足夠長循環時間，此 136765.doc -13- 200932220 為來自血流之顆粒在目標組織中相應累積之先決條件。奈 米顆粒系統亦應促進吸收至標靶細胞中且促進内溶酶體釋 放。 製造奈米顆粒系統之另一困難為在顆粒表面上應用合適 物質或目標識別結構。 通常藉助於共價偶合反應來改質顆粒表面。此之先決條 件為在聚合物主鏈上或在顆粒表面上存在官能基，其可藉 由化學偶合反應與目標識別分子不可逆地接合[Nobs L.等 人，J· Pharm. Sci” 2004; 93: 1980-1992]。因為膠體分散液 之穩定性通常藉由試劑或在反應條件下而極大地降低，所 以化學方法一般為昂責且有問題的[Κ〇〇 〇_M.等人，

Nanomedicine, 2005; 1 (3): 193-212][Choi S.W·等人，j Dispersion Sci. Technol.，2003; 24(3&4): 475-487]。分子與 顆粒表面之共價偶合另外應特定適用於待應用於表面上之 各新分子以避免可能之不期望的化學反應。亦需要避免常 用於共價偶合反應之有機溶劑以減少環境污染且簡化反應 之實施。 因此，理想地，表面改質應為非共價，易於進行，且因 此靈活但仍穩定。 自文獻已知之膠體系統一般僅適於囊封疏水性物質或者 親水性物質》在顆粒之頻繁使用之共價表面改質的情況 下，就在同一個核顆粒上使用極不同之表面結構而言存在 極小靈活性。另外，用於特異性累積之配位體通常不利地 影響在實際腫瘤組織中之吸收及詳言之細胞吸收。儘管顆 136765.doc -14- 200932220 粒確保足夠循環且在目標組織中被動地或主動地累積良 好，但一般内化及内溶酶體釋放並非為最佳[van〇sd〇l见，

Cancer Res” 1991; 51: 4776-4784] [Weinstein J.N·等人， Cancer Res.，1992; 52(9): 2747-2751] 〇 ❹

因此，仍需要醫藥奈米顆粒調配物，其：⑴有效地且在 足夠抗洗脫穩定性下囊封水溶性及水難溶性醫藥學活性物 質，（η)容許非共價、易於進行（靈活性）且仍穩定之表面改 質，（iii)允許足夠循環時間，（iv)可有效吸收至目標組織中 及（v)以細胞内方式自内溶酶體釋放於彼處。 本發明之一個任務因此為使得其中可囊封親水性及疏水 性活性物質之改良醫藥調配物可用。另一方面，靈活且足 夠穩定之表面改質應容許在染病組織中之最佳累積。為能 夠達成最大診斷或治療作用，亦應將此膠體系統有效吸收 至目標組織中且吸收至可發生内溶酶體釋放之個別細胞 中。此外，製造方法應為可行的以容許以合理時間且以可 接受之成本製造。 【發明内容】 本發明係關於具有陽離子表面電位之聚合物奈米顆粒， 其包含陽離子聚合物及水難溶性聚合物，特徵在於該等聚 合物奈米顆粒含有囊封於一起或獨立囊封之診斷劑=治療 劑（尤其為埃坡黴素）’或僅含有埃坡黴素。 〃 ，親水 令人驚訝地發現藉由水溶性陽離子聚合物與水難，容性聚 合物共沈厥’可製得具有陽離子官能化表面之穩定聚合物 奈米顆粒。此外，在本發明之意義上，令人驚訝地 136765.doc 200932220 性之易溶於水之物質與疏水性之微溶於水之物質均可囊封 於上述奈米顆粒之聚合物基質中。出乎意料地，低分子量 之水溶性物質與帶電陽離子聚合物之離子錯合使得^由= 米沈澱成功囊封於顆粒之聚合物基質中。在本發明之意^ 上，可將適於診斷及/或治療各種疾病之物質囊封於聚 顆粒中。 ° 穩定且靈活地 面改質。

此外’發現可用帶部分相反電荷之化合物 以靜電方式對陽離子官能化顆粒表面進行表 所述本發明之—目的因此為使用本發明之奈米顆粒來識 別疾病（診斷）、治療疾病（治療）以及監測治療。 本發明之另一態樣為由獨立製備之具有相同組成之奈米 顆粒系統（a)及（b)組成的套組，其包含： (a)囊封於顆粒中之診斷劑及（b)囊封於顆粒中之埃坡黴 素，其中該等顆粒可視情況以稀釋形式一起或獨立投與， 該套組或由包含囊封在一起之活性物質與診斷劑之奈米 顆粒系統組成。 不、、 本發明之另-態樣為如上所述之套組，其中組份⑷及⑻ 係以固態存在，例如呈凍乾物（ly〇philizate)形式，且另外視 隋况存在適於視情況分開或一起地分散奈米顆粒系統及 (b)之試劑（c)。 在一態樣中，本發明涉及具有陽離子表面電位之聚合物 奈米顆粒，其含有陽離子聚合物及水難溶性聚合物，特徵 在於該等聚合物奈米顆粒含有診斷劑及埃坡黴素或僅含有 埃坡黴素。 136765.doc -16· 200932220 ^ 、本發明包含使用特定醫藥形式所需之醫藥學上可 又之賦形劑用奈来顆粒系統製備合適醫藥形式的用途。 =本發明之意義上開發之醫藥形式可經由各種投藥途徑用 二類或動物中。其較佳以靜脈内方式投與。熟習此項技 • Γ已知之必要施用系統亦構成本文中所述本發明之部 分。 奈米顆粒之組合物包含水難溶性聚合物，其較佳為可生 ❹ 物降解之聚合物或各種可生物降解聚合物之混合物。可生 物降解之聚合物可就藉由聚合或其他方法形成該聚合物之 個別單體單70而言來描述。此外，聚合物可由其名稱來界 定。 在一實施例中，水難溶性聚合物係來自天然及/或合成聚 σ物之群或相應單體之均聚物及共聚物。詳言之，聚合物 係來自氰基丙烯酸烷酯之群（例如氰基丙烯酸丁酯及氰基 丙稀酸異丁酯）、丙烯酸酯（諸如甲基丙烯酸酯）、丙交酯（例 〇 如L-丙交酯或DL-丙交酯）、乙交酯、己内酯（諸如ε-己内酯） 及其他。 在另一實施例中’該聚合物或聚合物之部分係選自包含以 下各物之群：聚氰基丙烯酸酯及聚氰基丙烯酸烷酯 (PACA)，例如聚氰基丙稀酸丁酯（Pbca)， 聚酯，例如聚（DL-丙交酯）、聚（L-丙交酯）、聚乙交酯、聚 二氧雜環已酮（polydioxanone)、聚〇惡*坐琳、聚（乙交醋-共-三亞甲基-碳酸酯）、聚丙交酯-共-乙交酯（PLGA)(例如聚（L-丙交酯-共-乙交酯）或聚（DL-丙交酯-共-乙交酯））、聚（L-丙 136765.doc 17- 200932220 共-三亞甲基）、聚（碳酸酯 交酯-共-DL-丙交酯）、聚（乙交酯 -共-二氧雜環已酮），

❹ 褐藻酸、玻糖醛酸、聚唾液酸 衍生物， 多醣，例如葡聚糖、褐藻酸鹽 萄胺糖， 醭眾胺基酸、聚合蛋 酸纖維素衍生物 酸澱粉 環糊精、玻糖醛酸、聚葡 W如膠原蛋白、明膠或白 聚醯胺，例如聚(天冬胺酸)、聚(麩胺酸)， 聚（亞胺基碳酸酯）（衍生自酪胺 之聚碳酸酗）、聚（β-羥基 酸醋）， 丁 聚酸野’例如聚癸二酸（聚（SA) ))聚（己一酸）、聚（CppjA)、 聚（CPH)、聚（CPM)、芳族聚酸酐， 聚原酸酯， 聚己内酯，例如聚_ε_己内酯或聚己内酯， 聚鱗酸，諸如聚麟酸醋、聚膦酸西旨、聚鱗氮烯、聚（酿胺_ 烯胺）、偶氮聚合物、聚胺基甲酸酯、樹枝狀聚合物、假聚 胺基酸以及該等化合物之所有混合物及共聚物。 在一較佳實施例中，水難溶性聚合物係選自以下聚合物 之群： 聚丙烯酸酯、聚丙交酯及聚乙交酯及其共聚物。 在一尤其較佳實施例中，水難溶性聚合物係來自聚氰基 丙烯酸烷酯（PACA)之群。 由下文給出之結構（式I)來展示此等聚氰基丙烯酸烷酯之 結構’其中所述殘基R較佳表示具有1至16個碳原子之直鏈 136765.doc -18- 200932220 及分支鏈烷基、環己基、苄基或苯基。

CN COOR' ⑴ 式（I) : PACA之結構式，n=5-20000，較佳 n=5-6000 或 n=5-100 。 在另一尤其較佳實施例中，水難溶性聚合物為聚氰基丙 烯酸丁酯（PBCA)(式II)。

CN 和2-+ 0 人(II) 式 II : PBCA 之結構式；11=5-20000，較佳 n=5-6000 或 11=5-100 在本發明之意義上，水難溶性聚合物構成顆粒之聚合物 基質之較大部分。 令人驚訝地，發現藉由將具有胺基之化合物（尤其陽離子 聚合物）併入水難溶性固態聚合物基質中，製得具有帶陽離 子表面電位（ζ電位）之奈米顆粒。 在一實施例中，陽離子聚合物係來自天然及/或合成聚合 物之群或相應單體之均聚物及共聚物。 具有可與任何低分子酸形成鹽（該等鹽可溶於水性-有機 溶劑中）之游離第一胺基、第二胺基或第三胺基之聚合物適 用作本發明意義上之陽離子聚合物。帶有第四銨基且可溶 於有機溶劑中之聚合物或其鹽亦為合適的。 在一較佳實施例中，陽離子聚合物、聚陽離子及聚胺化 136765.doc -19· 200932220 合物或來自相應單體之均聚物及共聚物之聚合物的以下群 尤其合適：改質天然陽離子聚合物、陽離子蛋白質、合成 陽離子聚合物、不同鏈長之胺基烷烴、改質陽離子葡聚糖、 陽離子多Si、陽離子殿粉或纖維素衍生物、㈣萄胺糖、 瓜爾衍生物、陽離子氰基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯及甲基 丙烯醯胺及諸如可用於形成相應合適化合物及相應鹽（其 可與合適之無機酸或低分子有機酸來形成）之單體及共聚 單體。 ^

此尤其包括：二乙基胺基乙基改質葡聚糖、羥甲基纖維 素三甲胺、聚離胺酸、硫酸魚精蛋白、羥乙基纖維素三甲 胺、聚烯丙胺、氣化魚精蛋白、聚烯丙胺水合鹽、聚胺、 聚乙烯基苄基三曱基銨鹽、聚二烯丙基二甲基銨鹽、聚咪 °坐琳、聚乙稀胺及聚乙稀η比β定、聚乙稀亞胺（PEJ)、腐胺（丁 -1，4 -一胺）、亞精胺（Ν-(3-胺基丙基）丁 ·ι，4_二胺）、精胺 (Ν，Ν·-雙（3-胺基丙基）丁-1,4-二胺）、二曱基胺基乙基丙烯酸 酯、聚-Ν，Ν-二甲基胺基乙基甲基丙婦酸酯=p(DMEAMA)、 二曱基胺基丙基丙烯醯胺、二甲基胺基丙基甲基丙烯醯 胺、二甲基胺基苯乙烯、乙烯基吡啶及甲基二烯丙基胺、 聚DADMAC、膠豆（guar)、去乙醯化甲殼素及可與合適無機 酸或低分子有機酸形成之相應鹽。 以下聚合物構成本發明之一特定態樣：聚胺，尤其二乙 基胺基乙基改質葡聚糖、聚離胺酸、硫酸魚精蛋白、氣化 魚精蛋白、聚烯丙胺及聚烯丙胺水合鹽、聚二烯丙基二曱 基銨鹽、聚乙烯基苄基三曱基銨鹽、聚咪唑啉、聚乙烯胺 136765.doc -20· 200932220 及聚乙烯吡啶、聚乙烯亞胺（PEI)、聚DADMAC、膠豆或去 乙酿化甲殼素及可與合適無機酸或低分子有機酸形成之相 應鹽。

❹ 以下單體尤其合適：羥甲基纖維素三甲胺、羥乙基纖維 素三甲胺、腐胺（丁-1，心二胺）、亞精胺（N_(3-胺基丙基）丁 -M-二胺）、精胺（Ν，Ν·-雙（3-胺基丙基）丁 _ι，4·二胺）、二甲 基胺基乙基丙烯酸酯、二甲基胺基丙基丙烯醯胺、二甲基 胺基丙基甲基丙烯醯胺、二甲基胺基苯乙烯、乙烯基„比啶 及甲基二烯丙胺’以及可與合適無機酸或低分子有機酸形 成之相應鹽。 用於成鹽之合適酸例如為：鹽酸、硫酸，但尤其亦為乙 酸、乙醇酸或乳酸。 在一實施例中，可將帶有胺基之化合物（尤其陽離子聚合 物）溶解於可與水完全混溶之有機溶劑（較佳為丙酮、曱醇、 乙醇、丙醇、二甲亞硬（DMSO))或此等溶劑與水之混合物 中。 在一較佳實施例中，聚合物奈米顆粒含有陽離子改質聚 丙烯酸酯（聚·Ν，Ν-二曱基胺基乙基甲基丙烯酸酯， P(DMAEMA))(式3)作為帶有胺基之化合物。 CH， -fcHj 一N、 (III) n=5-20000 ，較佳 式（III) : P(DMAEMA)之結構式 n=5-6000 ，或n=5-l〇〇 136765.doc •21 - 200932220 或 式（IV) : P(DMAPMAM)=聚（N，N-二甲基胺基丙基甲基丙 烯醯胺）

藉由奈米沈澱將生物學上可降解之陽離子改質聚丙烯酸 酯（例如P(DMAEMA)、P(DMAPMAM))囊封於聚合物基質、 尤其PBC A聚合物基質中。由於陽離子聚合物之胺基，因此 所得奈米顆粒之表面具有正（陽離子）表面電位（ζ電位）。陽 離子顆粒表面確保良好之細胞吸收且容許用帶部分陰離子 之化合物進行靈活的靜電表面改質。 在另一較佳實施例中，聚合物奈米顆粒含有改質聚丙烯 酸酯聚（二甲基胺基丙基曱基丙烯醯胺）(P(DMAPMAM))作 為陽離子聚合物。 在另一實施例中，聚合物奈米顆粒含有不同分子量（尤其 1.8kDa、10kDa、70kDa 及 750 kDa)之聚乙烯亞胺（PEI)(式 4)作為陽離子聚合物。 PEI為頻繁用於DNA多聚物（PEK)之非病毒基因治療領域 中且因此已經充分研究之聚陽離子[Remy J.-S.等人，Adv. Drug Deliv. Rev·，1998; 30(1-3): 85-95]。 136765.doc -22- (V) 200932220 {-(CH2)2-NH 丑

式（V):分枝聚乙烯亞胺之通用結構式，其中x、y及 z=10%-50°/〇 ’較佳地x、丫及2=2〇% 4〇%，合計達 1〇〇%。 由於將陽離子聚電解質PEI囊封於pBCA_聚合物基質 中，因此顆粒殼包含產生陽離子表面電位之pEI聚合物鏈。 另外，根據本發明，亦可能藉由奈米沈澱將診斷或治療

❹ 物質連同前述陽離子聚合物或具有胺基之化合物一起囊封 於聚合物基質中。 可採用以下各類物質作為用於囊封之診斷物質以便各種 分子成像方法，且詳言之可為以下分子成像方法提及對比 劑或示蹤劑：光學成像，例如D〇T(漫射光學成像）、us(超 音成像）、OPT(光學投影斷層攝影術）、近紅外螢光成像、 螢光蛋白質成像及BLI(生物發光成像）及磁共振斷層攝影 術(MRT，MRI)或X射線照射。然而，其他方法亦為可能的。 囊封來自所述物質群之合適診斷物質容許在活體外及/或 活體内偵測顆粒。 然而，本專利之申請專利範圍並不涵蓋僅包含一種診斷 性活性物質之本發明奈米顆粒系統。 在一較佳實施例中，診斷劑包含尤其選自以下群之染 料··螢光素、螢光素異硫氰酸鹽、羧基螢光素或鈣黃綠素 (calcein)、四溴螢光素或伊紅（e〇sin)、四碘螢光素或赤蘚紅 (erythrosine)、二氟螢光素（諸如 〇reg(m GreenTM 488、0^。^

Green™ 500 或 〇reg〇n GreenTM 514)、羧基對甲胺基酚 I36765.doc •23 · 200932220 (carboxyrhodol)(Rhodol Green™)染料（US 5,227,487; US 5,442,045)、叛基羅丹明（carboxyrhodamine)染料（Rhodamine (3!^611頂染料）（1；8 5,366,860)、4,4-二氟-4-硼-3&,4&-二氮雜-二環戊二烯幷苯（例如 Dodipy FL、Bodipy 493/503 或 Bodipy 530/550及其衍生物）(US 4,774,339 ; US 5，187,288 ; US 5,248,782 ; US 5,433,896 ; US 5,451，663)、聚次甲基染料、 香豆素染料（例如香豆素6,7-胺基-4-甲基香豆素）、DTPA或 四氮雜大環稀（環稀（Cyclene)、略稀（Pyvlene))與铽或銪或 四吡咯染料（尤其卟啉）之金屬錯合物。 在一實施例中，診斷物質包含螢光活性染料。 在另一實施例中，診斷劑包含螢光近紅外（NIR)染料。較 佳用於光學成像之此等NIR染料吸收且發射在650 nm與 1000 nm之間之NIR區域中的光。較佳染料屬於聚次曱基染 料類且係選自以下群：羰花青，例如二乙基氧雜幾花青 (DOC)、二乙基氧雜二羰花青（DODC)、二乙基氧雜三幾花 青（DOTC)、吲哚二羰花青或吲哚三羰花青、三幾花青，部 花青素（merocyanines)、氧喏（oxonol)染料（w〇 96/17628)、 羅丹明（rhodamine)染料、啡噁嗪或啡噻嗪染料、四n比洛染 料（尤其為苯并卟啭）、克啭（chorines)及耿菁。 上述染料可以呈酸或鹽之形式使用。此等染料之合適無 機陽離子或平衡離子為（例如）鋰離子、鉀離子、氮離子及尤 其鈉離子。有機鹼之合適陽離子尤其為第一胺、第二胺或 第二胺（例如乙酵胺、一乙醇胺、嗎嚇、還原葡糖胺、N N_ 二曱基還原葡糖胺及尤其N-甲基還原葡糖胺及聚乙稀亞 136765.doc 24- 200932220 胺）之陽離子。胺基酸之合適陽離子為（例如）離胺酸、精胺 酸及鳥胺酸之陽離子及其他酸性或中性胺基酸之醯胺。 此外，染料可以其鹼或鹽之形式使用。 在一項尤其佳實施例中，診斷物質包含羰花青染料。該 羰花青之通式結構如下： (式 VI)

R*

R2® (VI)

R3G表示氫原子、羥基、羧基、具有1至4個碳原子之烷氧 基或氯原子， R31表示氫原子或具有1至4個碳原子之烷基， X及Y彼此獨立地表示片段-〇-、-S-、-CH=CH-或 -C(CH2R32)(CH2R33)-， R2G至R29、R32及R33彼此獨立地表示氫原子、羥基、羧基、 136765.doc -25- 200932220 磺酸根或具有至多10個碳原子之羧烷基、烷氧羰基或烷氧 基侧氧基烧基或具有至多4個碳原子之磺酸基烷基，或非特 異性結合大分子’或通式（VII)之殘基： -(0)v-(CH2)〇-CO-NR34.(CH2)s-(NH-CO)q-R35 (VII)， 其限制條件為X與Y均表示〇、S、-CH=CH或-C(CH3)2-，殘 基R2G至R29中至少一者對應於非特異性結合大分子或通式 VI， 其中： ❹

〇及s等於0或彼此獨立地表示1至6之整數， q及v彼此獨立地表示〇或1， R34表示氫原子或曱基， R35為具有3至ό個碳原子之烷基，其具有2至n“個羥基， 其中η為碳原子之數目，或 經1至3個羧基取代之具有1至6個碳原子之烷基、具有6 至9個碳原子之芳基或具有7至15個碳原子之芳烷基，或通 式（Villa)或（Vlllb)之殘基，

^COOH

C00H (Villa) (Vlllb) 其限制條件為q表示1， 或表示非特異性結合大分子， R20與 R21、R2、R22、r^r23、r24與 r25、r2、r26、r26 136765.doc -26- 200932220 與R連同位於其間之碳原子一起形成5員或6員芳族或飽 和稠環， 及其生理上相容之鹽。 在幾花青之情況下，進-步參考申請案觀445〇65及抓 侧贿’亦將其内容併入本申請案中。將其中提及之幾 化青用於本發明之奈米顆粒為本發明内容中之特定離樣。 出乎意料地，可將陰離子性易溶於水之物質（諸如某也幾 花青）穩定密封於所述奈米顆粒之疏水性聚合物基質中。 在本發明之意義上’藉由藉助於與陽離子聚合物之離子 錯合及共《之奈米沈„陰離子水溶性物質囊封於水難 溶性聚合物基質中’形成具有衫尺寸之顆粒。 藉由將NIR活性螢光染料併入顆粒之聚合物基質中，可藉 由在組織巾非㈣性光學成像根㈣光來賴顆粒之聚I 活體㈣測螢光標記奈米顆粒之分布或累積 變得有可能。

在一尤其較佳實施例中1花青染料包含易溶於水 離子四磺酸基花青（TSC)(式ΙΧ)β ^

在較佳實施例中，幾花青染料包含mcco弓卜朵二幾花 136765.doc -27· 200932220 青）（式χ)

COOH (X)

式（X):吲哚二羰花青/IDCC 在另一較佳實施例中，羰花青染料包含ICG(靛菁綠）（式 XI)。

❹ (XI) ❿ 式（XI):靛菁綠（ICG) 在根據本發明之實施例中，經囊封之醫藥學活性物質為 埃坡黴素。 在本發明之其他實施例中，埃坡黴素係由通式（XII)界定：

136765.doc -28- (XII) 200932220 其中：

Rla、Rlb 彼此獨立地為氫、丨Q烷基、芳基、芳烷基 或其一起為基團-(CH2)m-，其中m為2至5 ; R2a、R2b 彼此獨立地為氫、Ci-Cn)烷基、C2-C1Q烯基、 C2_C10炔基、芳基、芳烷基，或其一起為基團 _(CH2)n-，其中 η為 2至 5， R3 為氫、Ci-CiG烷基、芳基、芳烷基； R4a、R4b 彼此獨立地為氫、烷基、芳基、芳燒基， 或其一起為基團-(CH2)p-，其中p為2至5 ; R5 為氫、eve!。烧基、芳基、芳烷基、c〇2H、c〇2_ 烧基、CHzOH、CHzO-Ci-C5烧基、CHzO-醯基、 CN、CH2NH2、烷基），醯基）以或 CH2Ha卜 CHal3 ; R6、R7 彼此獨立地為氫，或其一起為另一鍵或環氧官 能基； ❹ G D-E 為〇或CH2 ; 一起為基團-H2C-CH2-、-HC=CH-、、 -CH(OH)-CH(OH)-、-CH(OH)-CH2-、-CH2-CH(OH)-、 -CHrO-、-O-CH2·或c—，其中若G為氧，則 D-E不可為CH2-0 ;或 D-E-G 一起為基團H2C-CH=CH ; W 為基團C(=X)R8或雙環或二環芳族或雜芳族基 團； X 為〇或基團CR9R1Q ; 136765.doc -29- 200932220 R8 為氫、CVC〗*)烷基、芳基、芳烷基鹵素、cN R9、R10 彼此獨立地為氫、烷基、芳基、芳烷基 或連同亞甲基碳原子一起為5員至7員碳環； Z 為〇或氫及基團OR11 ; R" 為氫或保護基PGZ ; A-Y 為基團 0-C(=〇)、〇_CH2、CH2_c(=〇)、 NR丨2-C(=〇)、NRI2-S〇2 ; R丨2 為氫或CVCw烷基； PGZ 為C1-C20烷基、環中可含有一或多個氧原子之 CVC7環烷基、芳基、芳烷基、G C20酿基芳 醯基、q-Cw烷基磺醯基、芳基磺醯基、三 (C丨-C2〇烷基）矽烷基、二（Ci C2〇烷基）芳基矽烷 基（CrC20烧基）二芳基石夕烧基或三（芳烧基）石夕 院基； 其：从個別立體異構體或不同立體異構體之混合物及/或 ❹ 醫藥學上可接受之鹽的形式囊封。 對於本發明之另—實施例而言，埃坡黴素係由 定： ' 其中： 彼此獨立地為氫、Ci_C4烷基，或其一起為基團 -(CH2)m- ’ 其中 m為 2至 5 ; 彼此獨立地為氫、Ci-Cs烷基，或其一起為基團 -(CH2)m-(其巾„!為2至5)，或^^稀基，或C2_C6 炔基；

Rla、Rib R2a、R2b 136765.doc 200932220 R3 R4a、R4b R5 R6 ' R7 為氫；彼此獨立地為氫、Ci_C4烷基 為氫、Cl_C4烧基、C(Hal)3 ;均為氫，或其一起為另一鍵 官能基； 或其 起為環氧 ❹

G D-E D-E-G W ❹ 為 CH2 ; 為基團H2C-CH2，或 一起為基團H2C-CH=CH ;為基團C(=X)R8或雙環或三環芳族或雜芳族美 團； 、土 為基團CR9R10 ;為氫、CVC4烷基、鹵素； 均彼此獨立地為氫、Ci_c4烧基、芳基、芳貌基； 為氧； 為基團0-C(=〇)或基團NRl2_c(=〇);為氫或Crq烷基； 其係以個別立體異構體或不同立體異構體 醫藥學上可接受之鹽的形式囊封。 及成 在另實施例中’囊封之物為通式（XII)之埃坡黴素其

X R8 R9、R10 Z A-Y

R 12 中 R】

R lb

R2a > R 2b 均彼此獨幻也為氫、Ci_c2烷基，或其一起為基 團-(CH2)m-，其中m為2至5 ;@彼此獨立地為氫、基’或其-起為基 團_(CH2)n· ’其中n為2至5，或(：2-(：6烯基，或 136765.doc -31 _ 200932220 C2-C6炔基； 為氫； 均彼此獨立地為氫、CrCz烷基； 為氫或曱基或三氟曱基； 一起為另一鍵，或其一起為環氧官能基； 為 CH2 ; 為基團H2C-CH2， Ο

R3 R4a、R4b R5 R6、R7 G D-E D-E-G W 一起為基團H2C-CH=CH ; 為基團C(=X)R8或》塞唾基、。惡嗤基、β比咬基、 N-側氧基吼啶基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、 笨并咪唑基，其可視情況經。,-^烷基、Ci-G 經烷基、Ci-Cs胺基烷基、CrCs烷基磺醯基取 代； X 為基團CR9R10 ; R8 為氫、甲基、氣、氟；

R ' R 0 均彼此獨立地為氫、烷基、噻唑基、噁唑 基、《比啶基、N-側氧基吡啶基，其可視情況經 CrC3烷基、羥烷基、芳烷基取代； Z 為氧； A Y 為基團 〇-C(=〇)或基團 nr12-C(=0); R 為氫或C1-C4院基； 其呈個別立體異構體或不同立體異構體之混合物及/或醫 藥學上可接受之鹽的形式。 在另一實施例中，囊封之物為通式（XI)之埃坡黴素，其 136765.doc •32- 200932220

Α-Υ . 〇_C(=〇) . d_e . H2C cH2 ； 〇 ; CH2 . z ： 〇 ； rU R2a .二基或其—起為-(叫。·基團，其中P為2至3 ; 其R彼此獨立地為氫、C,-Ci。貌基、C2々。稀基或Μ“ =基；R為氣；R4a、R4b彼此獨立地為氫或C,-C,0貌基且f 為Ci-C1()燒基。 在另實施例中’囊封之物為通式（XI)之埃坡徽素，其 中广、R b彼此獨立地為氫、C2_Ci〇稀基或C2_Ci〇快基；r6、

:7:起為環氧官能基且貿為2_甲基笨并噻唑_5_基或2_甲基 苯并°惡唆-5-基或啥嘴-7-基。 在-較佳實施财，囊封之物為列於以下清單中之通式 (XI)之埃坡黴素： -16-(2-甲基苯并噁唑 -2 -稀-1-基）環十六_ΐ3- (4S，7R，8S，9S，13E/Z，16S)-4,8-二經基 -5-基）·1-氧雜_5,5,9，13-四甲基-7-(丙 烯-2,6-二酮； -1-基）-3-(2-甲基苯并噁唑-5-基）-8,8，12，16_四甲基_4，17_二 氧雜雙環Π4·1·0]十七烷_5,9·二酮； (48,7尺，88,98，13丑/7，168)-4,8-二羥基_16_(2_甲基苯并噻唑 -5-基）·1-氧雜-5,5,9，13-四甲基-7-(丙_2烯_丨基）環十六_13_ 烯-2,6-二酮； -1-基）-3-(2-甲基苯并噻唑-5-基）-8,8，12，16四甲基_4，17_二 氧雜雙瓖Π4·1·0]十七燒-5,9_二_ ; (1S，3S，7S，1〇r，11s，12S，16R)-7，U' 二羥基 _1〇_(丙 _2_ 烯-卜 136765.doc -33- 200932220 基）-3-(2-甲基苯并噻唑-5-基）-8,8,12,16-四甲基-4,17-二氧 雜雙環[14.1.0]十七烷-5,9-二酮； (1S/R，3S，7S，10R，11R，12S，16R/S)-7，11-二羥基-10-(丙-2-烯 -1-基）-3-(2-甲基苯并噻唑-5-基）-8,8,12,16-四甲基-4,17-二 氧雜雙環[14.1.0]十七烷-5,9-二酮； • (48,711，88,98，13£/乙，168)-4,8-二羥基-16-(2-甲基苯并噻唑 -5-基）-1-氧雜-9，13-二曱基-5,5-(l，3-三亞曱基）-7-(丙-2-烯 -1-基）環十六-13-烯-2,6-二酮； ® (1S/R，3S，7S，10R，11R，12S，16R/S)-7，11-二羥基-10-(丙-2-烯 -1 -基）-3-(2-曱基苯并噻唑-5-基）-12,16-二曱基-8,8-(l，3-三 亞甲基）-4,17-二氧雜雙環[14.1.0]十七烷-5,9-二酮； (4S,7R,8S，9S，13E/Z，16S)-4,8-二羥基-16-(2-曱基苯并噻唑 -5-基）-1-氧雜-5,5,9，13-四曱基-7-(丙-2-炔-1-基）環十六-13-烯-2,6-二酮； (1S/R，3S，7S，10R,11R，12S，16R/S)-7，11-二羥基-10-(丙-2-炔 ^ -1-基）-3-(2-曱基苯并噻唑-5-基）-8,8,12,16_四曱基-4，17-二 氧雜雙環[14_1.0]十七烷-5,9-二酮； (4S，7R，8S，9S，13E/Z,16S)-4,8-二羥基-16-(喹啉-7-基）-l-氧 雜-5,5，9,13-四曱基- 7- (丙-2 -稀-1 -基）J衣十六-13-稀-2，6-二 • 酮； (1S/R，3S，7S，10R，11R，12S，16R/S)-7，11-二羥基-10-(丙-2-烯 -1-基）-3-(喹啉-7-基）-8,8,12,16-四曱基-4,17-二氧雜雙環 [14.1.0]十七烷-5,9-二酮； (48,7尺，88,98,13£/2，168)-4,8-二羥基-16-(1，2-二曱基-111-苯 -34- 136765.doc 200932220 并咪唑-5-基）-1-氧雜-5,5,9,13-四甲基-7-(丙-2-烯-1-基）環 十六-13 -稀-2，6 -二酿I， (1S/R，3S，7S，10R，11R，12S，16R/S)-7,11-二羥基-10-(丙-2-烯 -1-基）-3-(1，2-二甲基-111-苯并咪唑-5-基）-8,8,12，16-四甲基 -4,17-二氧雜雙環[14丄0]十七烷-5,9-二酮； • (4S,7R，8S，9S，13E/Z,16S)-4,8-二羥基-16-(2-曱基苯并噻唑 • -5-基）-1-氮雜-5,5,9,13-四曱基-7-(丙-2-烯-1-基）環十六-13-烯-2,6-二酮； ® (1S/R，3S，7S，10R，11S，12S，16R/S)-7，11-二羥基-10-(丙-2-烯 -1-基）-3-(2-曱基苯并噻唑-5-基）-8,8，12，16-四甲基-4-氮雜 -17-氧雜雙環[14.1.0]十七烷-5,9-二酮； (1S/R，3S，7S,10R，11R，12S，16R/S)-7，11-二羥基-10-(丙-2-烯 -1-基）-3-(2-曱基苯并噻唑-5-基）-8,8，12，16-四甲基-4-氮雜 -17-氧雜雙環[14·1·0]十七烷-5,9-二酮； (1S，3S(E),7S,10R，11S，12S，16R)_7，11-:.S-8,8，10，12，16-編 五甲基- 3- [l-(2-甲基-1，3-0塞0坐-4-基）丙-1 -稀-2-基]-4，17-二 氧雜雙環[14.1.0]十七烷-5,9-二酮； (18,38(£)，78，1011，118，128，1611)-7，11-二羥基-8,8，10，12，16-五曱基-3-[l-(2-甲基-1，3-噻唑-4-基）丙-1-烯-2-基]-17-氧雜 • -4-氮雜雙環[14·1·0]十七烷-5,9-二酮； (4S，7R，8S，9S，13Z，16S(E))-4,8-二羥基-5,5,7,9，13-五甲基 -16-[l-(2-曱基-1，3-噻唑-4-基）丙-1-烯-2-基]氧雜環十六 -13-烯-2,6-二酮； (48,711，8 8,98，10丑，137，168口））-4,8-二羥基-5,5,7,9，13-五曱 136765.doc -35 - 200932220 基-16-[1-(2-甲基-1，3-嗟峻-4-基）丙-1-稀·2-基]氧雜環十六 -10，13-二烯 _2,6_二酮； (48,7尺’88,98，10丑，132，168(丑))-4,8-二羥基_5,5 7 9_四曱基 -13-三氟曱基-16-[1·(2-曱基_1，3-噻唑·4-基）丙_丨_烯_2_基] 氣雜核十六-10,13 -二稀-2,6 -二嗣； (13’33即，78，10尺，118，128，16尺)-7，11-二羥基_8,81〇，1216_ • 五曱基-3-Π-(2·甲基硫基-1，3-噻唑-4_基）丙+烯·2_ 基]-4,17-二氧雜雙環[h.I.O]十七烷-5,9-二酿I ; β 其呈個別立體異構體或不同立體異構體之混合物及/或醫 藥學上可接受之鹽的形式。 尤其較佳為埃坡黴素： (43,711，88’98，13丑/2，168)-4,8-二羥基-16-(2-甲基苯并噻唑 _5-基）-1-氧雜-^^-四曱基一兴丙-厂烯-卜基^衰十六-^-稀-2,6-二阔；及 (18/尺’38’78，1〇11，118，1611/8)_7，11_二羥基_1〇_(丙_2_烯_1_ 〇 基）-3·(2-曱基苯并噻唑-5-基）-8,8，12，16-四曱基_4，17-二氧 雜雙％[14.1.〇]十七烷_5,9_二_ ’其呈個別立體異構體或不 . 同立體異構體之混合物及/或醫藥學上可接受之鹽的形式。 極其較佳為（1S，3S，7S，10R，11S，12S，16R)-7，11-二羥基 _1〇-(丙-2-烯_1_基）_3_(2_甲基苯并噻唑_5_基）_8,8，12，16_四 曱基4’17 一氧雜雙環[14丄〇]十七烧-5,9·二酮，其呈個別 立體異構體或不同立體異構體之混合物及/或醫藥學上可 接受之鹽的形式。 由於適用作腫瘤病症或與發炎反應相關之病症之治療劑 136765.doc -36- 200932220 的埃坡黴素之性質，因此將包含埃坡徽素之本發明奈米顆 粒詩治療腫瘤病症或與發炎反應相關之病症構成本發明 、樣本發明之另一態樣為一種治療腫瘤病症或與發 炎反應相關之病症的方法，其中向人類或動物投與有效量 t包含於本發明奈米顆粒系統中之活性化合物。 在另-實施例中’將診斷劑與埃坡黴素一起囊封於顆粒 ' 巾°因此’使用此等奈米顆粒來治療腫瘤病症或與發炎反 ❹ 冑相關之病症且同時診斷及/或監測治療進展為本發明之 -態樣。詳言之，治療及監測為本發明之一態樣。 因此’本發明之另-態樣為—種治療、診斷及/或監測腫 瘤病症或與發炎反應相關之病症的方法，其中向人類或動 物投與有效量之包含於本發明奈米顆粒系統中之活性化合 物。詳言之，治療及監測治療之方法為本發明之一態樣f 在另-實施例中，診_及埃坡黴素存在於獨立之相同 奈米顆粒系統中，該等奈米顆粒系統尤其具有相同構造。 〇 因此，本發明亦係關於一種包含共同包含診斷劑及埃坡 徽素之本發明之顆粒的套組，且係關於一種包含以下各物 • 之套組：⑷包含診斷劑之本發明之顆粒及（b)獨立地包含埃 坡黴素之本發明之顆粒，且係關於該套組用於治療及診斷/ ‘ 監測之用途。 y 在-較佳實施例中，如專利之中請專利範圍所主張之聚 合物奈米顆粒包含藉由奈米沈澱產生之沈澱聚集體。 為此，以下製造方法尤其可用： •藉由將聚合物質之溶解混合物添加至含有界面活性劑之 136765.doc -37· 200932220 =溶液h接著使用磁力_器充分混 接沈澱。 J仕式管中直 •藉由使用微混合器系統將兩種溶液合 混合物沈殿於含有界面活性劑之水溶液中。聚口物質之 •使用超音以將聚合物質之混合物均一分 性劑之水溶液中。 3有界面活 由奈米沈殿產生奈米顆粒時’若將含聚合物之有機 ❹ ❹ :物及其所溶解之物質中突然移除。令人驚舒地= 期間將溶解於聚合物相中之具有胺基之化合物(水溶2 水不溶性）共同囊封於微溶性聚合物中。必要條件為有機溶 劑（尤其合適者為例如丙酮、乙醇)與水之完全混溶性，及基 質聚合物於水相中之不溶性。 在本發明之顆粒的一實施例中，診斷劑帶負電荷且與陽 離子聚合物以離子對形式囊封於顆粒中。 〃 在較佳實施例中，對於所有前述聚合物奈米顆粒而 ®，以靜電方式改質聚合物奈米顆粒之表面。 陽離子奈米顆粒表面之靜電改質為本發明之顯著優勢。 基於離子相互作用’可在無化學偶合反應的情況下，使用 σ適物質改質顆粒表面。其必要條件為改質劑部分地具有 與顆粒表面電荷相反之電荷。此方法（藉由電荷滴定進行靜 電表面改質）容許在顆粒表面上進行簡單、靈活且變通之改 質。另外’可能在顆粒表面上吸附不穩定之活性物質，且 其因此可保護防止被酶降解，且因此可產生較大治療作用。 136765.doc -38- 200932220 來自企流之奈米顆粒累積於（主動及被動靶向）目標組織 中之前提在於顆粒應在血流中循環足夠長時間。根據本發 明’藉助於上述表面改質，尤其藉由使用聚氧化乙烯或聚 乙二醇’可個別調整在體内之循環時間（參見實例5)。 另一顯著優勢在於本文中所述之靜電表面改質可在使用 前迅速進行且無任何問題。此係藉由將適量之奈米顆粒分 散液與改質劑簡單混合來達成。 因此’亦可能與表面改質劑分開獨立製造及儲存核顆 粒° 一方面，此對於長期膠體穩定性而言尤其有利。另一 方面’可在合適條件下儲存極其不穩定之表面改質物質（如 肽或抗體）直至其使用時為止。 根據患者之個別需求，分開之核顆粒與改質劑亦可進行 表面改質。基於模組原理之表面改質即可為診斷、治療及 監測提供最大靈活性，使得使用者容易地、直接地進行改 質。 在式5中展示陽離子官能化聚合物奈米顆粒（尤其所述之 PBC A奈米顆粒）之表面改質劑的較佳結構。帶部分陰離子 之部分經由靜電相互作用實現對帶正電荷顆粒表面之錨定 功能。導向周圍水性介質之中性部分包含不同長度之聚乙 二醇及/或聚氧化乙烯單元（PEG單元）。分子量為1〇〇道爾頓 (dalton)至30000道爾頓之peg鏈為較佳，且分子量為3000 道爾頓至5000道爾頓之PEG鏈為尤其較佳。此部分或者亦 可包含其他合適結構，例如經乙基殿粉（he S)及其所有可能 之聚合化合物。殘基R較佳為氫或曱基單元。 136765.doc -39· 200932220 不=^改質劑之通用結構式("、⑽基或 團之混口物）’ η=5·7〇〇，較佳地，n=5_200。

, 較佳為H ch3，亦包㈣合物中基 陰離子錨 （XIII) 陰離子錯可（例如）為5至50單位麵胺酸（Glu)或天冬胺酸 (Asp)之聚合物’或該等酸之鹽。其亦可為所提及子單元之

混合聚合物。此外’亦可能將諸如中性胺基酸之不帶電子 單元以規則或無規方式併人陰離子嵌段中。合適帶負電荷 分子部分（錯）通常為具有諸如以下基團之化合物或聚合結 構：乙酸根、碳酸根、檸檬酸根、丁二酸根、硝酸根、羧 酸根、磷酸根、磺酸根或硫酸根基團，以及此等基團之鹽 及游離酸。 在一實施例中，陰離子錨可較佳為聚胺基酸。 在一實施例中，"陰離子錨”係由至多20單位麩胺酸（Glu) 或天冬胺酸（Asp)之聚合物或其鹽或其混合聚合物組成，其 亦可視情況包含中性胺基酸。 在一實施例中，以<3111(1〇)_1)_1>£(3〇1(〇、（3比（10)-1)_1^(3 (114)或 Asp(15)-b-PEG(114)改質表面。 在一實施例中’以Glu(10)-b-PEG(110)或Asp(15)-b-PEG (114)改質表面。 在一尤其較佳實施例中，以Glu(10)-b-PEG(110)(式XIV) 改質聚合物奈米顆粒之表面。嵌段共聚物之麩胺酸子單元 136765.doc •40- 200932220 之羧酸根基團充當陰性部分（錨）。

COOH

COOH (XIV) 式 XIV: Glu(10)-b-PEG(110)之結構式； φ 在另一實施例中，存在目標識別結構。 此目標識別結構具有至少一個帶負電荷部分，藉由靜電 相互作用將其施加於陽離子顆粒表面上。 在式XV中展示陽離子官能化聚合物奈米顆粒（尤其為所 述PBCA奈米顆粒）之表面改質劑的另一尤其較佳結構。 ^ 陰離子錨 （式XV) 式XV :表面改質劑之通用結構式，η=5-700，較佳地 Ο η=5-200，有可能X為一個可能之目標識別結構且陰離子錨 為聚合物嵌段。陰離子錨可根據上述式XIII之描述來構築。 . 帶部分陰離子之部分藉由靜電相互作用而在帶正電荷顆 粒表面上實現錨功能。中心之中性部分包含不同長度之聚 乙二醇單元及/或聚氧化乙烯單元（PEG單元）。分子量為100 道爾頓至30000道爾頓之PEG鏈在本文中為較佳，且分子量 為3000道爾頓至5000道爾頓之PEG鏈為尤其較佳。此部分 或者亦可包含其他合適結構，例如羥乙基澱粉（HES)及其所 136765.doc •41 · 200932220 有可能之聚合化合物。 表面改質劑之配位體x(下文中亦稱為目標識別結構）係 用於改良聚合物奈米顆粒之被動及主動累積機制。 作為目標識別、结構之合適配位體又可為抗體、u己位體 冑擬物或適體之受體配位體。可將以下各項視為結構：胺 基酸、狀、CDR(互補決定區）、抗原、半抗原、酶促物質、 酶辅因子、生物素、類胡蘿萄素、激素、維生素、生長因 子、淋巴激素Gymphokine)、碳水化合物 '寡醣、印磷脂、 葡聚糖、脂質、核苷（例如含有DNA或RNA分子之天然核 苷、改質核苷或人造核苷）、核酸、寡核苷酸、多醣、6螺 旋、A螺旋、2螺旋或髮失結構、改質多膽以及受體結合物 質或其片段。目標識別結構亦可為運鐵蛋白或葉酸或其部 分或上述各物之所有可能組合。 本發明之一態樣為目標識別結構係選自包含以下各物之 清單的情形：抗體、蛋白質、多肽、多醣、DNA分子、rna _ 分子、化學單元、核酸、脂質、碳水化合物或上述各物之 組合。 根據本發明，此等配位體係藉由靜電相互作用與奈米顆 粒結合，但亦可能經由共價鍵使配位體與顆粒表面結合。 此外可能在配位體與奈米顆粒之間併有連接子。 藉由在陽離子顆粒表面上與至少一個帶負電荷部分之電 荷相互作用而發生目標識別結構之靜電連接。具有諸如以 下基團之化合物或聚合結構適用作帶負電荷部分（錨）：乙酸 根、碳酸根、檸檬酸根、丁二酸根、硝酸根、羧酸根、磷 I36765.doc -42- 200932220 酸根、磺酸根或硫酸根基團，及此等基團之鹽及游離酸。 在一實施例中，奈米顆粒之尺寸在1 nm與800 nm之間。 在另一實施例中，奈米顆粒之尺寸在5 nm與800 nm之間。 在一實施例中，奈米顆粒之尺寸在1 nm與500 nm之間。 在一較佳實施例中，奈米顆粒之尺寸在1 nm與300 nm之 間。 在一尤其較佳實施例中，奈米顆粒之尺寸在5 nm與500 nm之間。 在又一尤其較佳實施例中，奈米顆粒之尺寸在5 nm與300 nm之間。 在又一尤其較佳實施例中，奈米顆粒之尺寸在10 nm與 3 00 nm之間。 所得聚合物奈米顆粒之尺寸係藉由光子相關光譜（PCS) 來測定。 在一尤其較佳實施例中，製造聚合物奈米顆粒之特徵在 於實施以下方法步驟： •將水不溶性聚合物溶解於可與水完全混溶之合適有機溶 劑（較佳為丙酮、甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、二曱亞砜 (DMSO))中或此等溶劑與水之混合物中。 •將陽離子聚合物溶解於可與水完全混溶之合適溶劑（較 佳為丙酮、甲醇、乙醇、丙醇、二甲亞砜（DMSO))中或 此等溶劑與水之混合物中。 •將活性物質（診斷劑及/或埃坡黴素）溶解於可與水完全混 溶之有機溶劑（較佳為丙酮、曱醇、乙醇、丙醇、二甲亞 136765.doc -43- 200932220 碗（職〇)、異丙醇）中或此等溶劑與水之混合物中。 •藉由合併先前獨立產生之溶液，自陽離子聚合物、水不 溶性聚合物及活性物質產生完全均質溶液。 將聚合物質之溶解混合物添加至含界面活性劑之溶液 中，尤其以p】uronicF68、TritonX_1〇(^Synper〇nicT7〇7 作為界面；g·性劑，使得自發形成膠狀沈;殿聚集體。

•接著在大氣壓或減壓下藉由束乾或藉由加熱或其他合適 方法來完全移除有機溶劑。 •視情況為改質顆粒表面，將上文產生之水性穩定奈米顆 粒分散液與溶解於水中之改㈣以合適比例混合。藉由 用改質劑逐步滴定顆粒分散液來測定適當比例。藉由測 定ς電位來監測靜電表面改質（電荷滴定）之程度電位之 目標值視預期施用途徑而定。舉例而言，對於靜脈内施 用中性至負《電位將為較佳，對於經口或經頻施用，相 反地較佳為甲性或陽離子ζ電位，等等。 •視情況再次移除分散劑。 在另實施例中’在移除有機溶劑之後，例如藉由用合 適溶液洗滌顆粒來進行純化步驟。 洗務步驟之合適溶液例如為0·1%·2%之界面活性劑水溶 液’以及純水。 隹另一 色例中’在移除有機溶劑及視情況純化後，或 表面改質後，可將產㈣乾。錢奈米顆粒隨後 可以套組形式麟售且經復水及投與來使用。 因此’本發明亦提供-種包含呈;東乾物形式之顆粒的套 136765.doc -44- 200932220 組’該等顆粒包含囊封― 在起或獨立囊封之診斷劑及埃城 黴素或僅埃坡黴目浩 、坡· 、 '視隋況呈凍乾物形式或呈溶液#八 散液之形式。 叹及合 套』可另外包含適於將滚乾物復水之試劑例如生理 鹽水或注射/輸注用水。 本發月此外提供—種包含非表面改質顆粒及用於製備表 面改質劑溶液之試劑的套組。

在另f施例中’可使用合適醫藥賦形劑將所述奈米顆 粒進步加工成適於向人類或動物投與之各種醫藥形式。 ，等醫藥形式尤其包括水性分散液、♦乾物、固體經口醫 藥形式’諸如速溶錠劑、膠囊及其他。合適醫藥賦形劑可 為：用於象乾之糖醇（例如山梨糖帛、甘露糖醇）、鍵劑助劑、 聚乙二醇等。 可藉由經口、非經腸（例如靜脈内）、皮下、肌肉内、眼 内肺内經鼻、腹膜内或真皮途徑及用於人類或動物之 所有其他可能投藥途徑來施用水性奈米顆粒分散液或另外 開發之醫藥形式。 本發明係關於一種製造聚合物奈米顆粒之方法，其特徵 在於進行以下方法步驟： •將陽離子聚合物溶解於有機溶劑或溶劑/水混合物中， •將水不溶性聚合物溶解於有機溶劑中， •將活性物質（診斷劑及治療劑或僅治療劑）分開或一起溶 解於有機溶劑或溶劑/水混合物中， 藉由合併所製備之個別溶液來製備陽離子聚合物、水不 136765.doc -45· 200932220 溶性聚合物及活性物質之完全溶解混合物， •將混合物添加至含界面活性劑之溶液中，從而自發形成 沈澱聚集體， •移除溶劑， •視情況純化顆粒分散液， •視情況凍乾， •藉由一起添加奈米顆粒分散液與適量（可選）改質劑來視 情況進行顆粒之靜電表面改質， •視情況藉由凍乾來視情況移除溶劑及/或分散劑。 【實施方式】 定義 如本文中使用之術語"活性物質”包含具治療及診斷活性 之化合物。其亦包含在除人類外之動物及植物中具活性之 化合物。

術語"埃坡黴素"包括所有天然埃坡黴素及其衍生物。埃 坡黴素衍生物獲知於例如WO 93/10102、WO 93/10121及DE 41 38 042 A2、WO 97/19086 及 WO 98/25929、WO 99/43320 > WO 2000/066589 > WO 00/49021 ' WO 00/71521 > WO 2001027308、WO 99/02514、WO 2002080846。 適用於本發明中之埃坡黴素及其製備揭示於DE 19907588、WO 98/25929、WO 99/58534、WO 99/2514、 WO 99/67252、WO 99/67253、WO 99/7692、EP 99/4915、 WO 00/1333、WO 00/66589、WO 00/49019、WO 00/49020、 WO 00/4902卜 WO 00/7152卜 WO 00/37473、WO 00/57874、 136765.doc -46- 200932220 WO 01/92255、WO 01/81342、WO 01/73103、WO 01/64650、 WO 01/70716 ' US 6204388、US 6387927、US 6380394、 US 02/52028、US 02/58286、US 02/62030、WO 02/32844、 WO 02/30356、WO 02/32844、WO 02/14323及 WO 02/8440 中。尤其合適者為WO 00/66589中所揭示之化合物。 在本發明之上下文中，較佳為式II中包括之埃坡黴素。 術語埃坡黴素亦包括將選自技術方案21之所揭示清單之 各種埃坡黴素衍生物囊封於製劑中的可能性。 如本文中所用之術語”基質聚合物”描述構成顆粒質量之 量上較大部分的聚合物，其可能均一地及/或非均一地囊封 其他囊封物質（任何所需添加劑與醫藥學活性物質）。 如本文中所用之術語"（奈米）沈澱"描述藉由水難溶性聚 合物在經引入水相中（其中溶劑充分混合）時發生沈澱而形 成膠狀沈澱物。在共沈澱之情況下，存在若干種物質之同 時沈澱，在本發明之意義上可為水溶性物質與水難溶性物

如本文中所用之"沈澱聚集體"出現於奈米沈澱過程中。 根據本發明，此沈澱聚集體包含基質聚合物，其中可部分 或完全囊封其他聚合物質以及醫藥學活性物質。在基質聚 合物中可存在共囊封物質之均一或非均一分布。 如本文中所用之"錨"描述改質劑之離子部分，其容許藉 由帶相反電荷之化合物之間的離子相互作用在帶電顆粒表 面上固定且因此定位改質劑。 "電荷滴定”描述錨在顆粒表面上靜電耦合之方法，其係 136765.doc -47- 200932220 使用ζ電位之量測來實現。帶電錨接著將顆粒之ζ電位改變 為錨之電荷。 術語"中性胺基酸，，在本發明之意義上包含個別電荷之總 和之分子電荷為中性（亦即零）的所有胺基酸。此包括其基團 R並不帶有任何電荷之所有天然胺基酸r_CH(c〇〇h) (NH2)(例如丙胺酸、綠胺酸、白胺酸、異白胺酸等），以及 ' 滿足此要求之合成胺基酸（諸如環己基丙胺酸）。 "界面活性劑"在本發明之意義上一方面為降低兩個不可 混溶相之間的界面張力以使膠體分散液之穩定變得可能的 表面活性物質。此外，根據本發明之界面活性劑可為能夠 以空間及/或靜電方式穩定化膠體分散液之任何種類的物 質。 術語"腫瘤病症"涵蓋與細胞生長、細胞分裂及/或增殖相 關之疾病或病況，諸如惡性腫瘤。此術語包括之更特定病 症例如為骨質疏鬆症、骨關節炎、子宮癌及宮頸癌、胃癌（包 _ 括所有上腹部區域之癌）、腸癌、腺癌（例如腺肉瘤）、乳癌、 肺癌（例如SCLC及NSCLC)、頭頸癌、惡性黑素瘤、急性淋 . 巴球性白血症或骨髓性白血症、前列腺癌、骨轉移Y腦瘤 及腦轉移’其中在此列舉中，術語，•癌症"與"癌"係同義使用。 • 實體腫瘤構成子態樣。 較佳將’’腫瘤病症"理解為意謂子宮癌及宮頸癌、乳癌、 肺癌及前列腺癌、惡性黑素瘤、骨轉移、腦瘤及腦轉移。 術語"目標結構"意謂識別目標之結構。在"被動靶向"之情 況下，目標結構可間接支持在目標位點處富集；舉例而言， 136765.doc -48- 200932220 藉由延長顆粒在血流中之循環時間，經由在腫瘤内皮中開 窗而富集之可能性增加。 當將組織特異性或細胞特異性配位體用於靶向累積時， 使用術語”主動靶向"。可使活性配位體與活性物質直接偶 合（配位體/活性物質接合物）且與膠體媒劑系統之表面偶 合。 虽活性物質係由於（非特異性）物理、生物化學或免疫學 方法而分布時，使用術語"被動靶向"。將增強之滲透及滯 留效應（EPR效應）視為造成此情況之主要原因。其為被動累 積機制，其利用腫瘤或發炎組織之結構特性[Ulbrich K.，

Subr V·，Adv. Drug Deliv. Rev” 2004; 56(7): 1023-1050]。 術語"表面電位"（亦稱為表面電荷）等效於術語"€電位"。 藉由雷射多普勒風速測定法（laser Doppler anemometry， LDA)來測定ζ電位β 表面電位（亦稱為ζ電位）表示遷移顆粒在剪切面上之電 位’亦即由於顆粒運動’因此已剪切去大部分擴散層之情 形。藉由雷射多普勒風速測定法使用"Zetasizer 3〇〇〇" (Malvern Instruments)來測定表面電位。 藉由雷射多普勒風速測定法來測定電場中顆粒之遷移速 度。具有帶電表面之顆粒在電場中向帶相反電荷之電極遷 移’顆粒之遷移速度為表面電荷之量及施加場強度的函 數°為測定遷移速度，以雷射輻射在電場中遷移之顆粒且 偵測散射雷射光。由於顆粒運動，在反射光中與入射光相 比來量測移頻。此頻移之量值視遷移速度而定且稱作多普 136765.doc -49- 200932220 勒頻率（多普勒效應）。可自多普勒頻率、散射角及波長得到 顆粒之遷移速度。自遷移速度與電場強度之商得到電泳遷 移率（electrophoretic mobility)。電泳遷移率乘以係數13對 應於ζ電位，其單位為[mV]。 在稀釋於具有低電解質含量（MilliQ水：電阻值為18.2 mQ.cm，25°C且T0C含量（總有機碳）< 10 ppb)之分散介質中 後且在確定pH值（pH 6.8-7·0)下用來自公司Malvern Instruments Ltd.(Worcestershire， England)之 Zetasizer Advanced 3000及Zetamaster進行量測（n=5)。所用軟體為 PCS VI.41/PCS VI.51 Rev。用來自公司 Malvern Instruments Ltd.之乳膠標準顆粒進行ζ電位之對照量測（-50 mV ± 5 mV)。用公司Malvern Instruments Ltd.之標準設置來進行量 測。 藉由動態光散射（DLS)使用"Zetasizer 3000"(Malvern instruments)來測定奈米顆粒之尺寸。另外，用掃描電子顯 微鏡（SEM)中獲得顯微照片，且實例展示於圖12中。圖12 亦證實奈米顆粒之球形形狀。 藉由DLS測定粒度係基於光子相關光譜（PCS)之原理。此 方法適於量測尺寸在3 nm至3 μπι範圍内之顆粒。在溶液 中，顆粒經受由與分散介質之液體分子碰撞引起之隨機運 動，其推動力為分子之布朗運動（Brownian motion)。粒徑 愈小，隨之顆粒之運動愈快。若用雷射光輻射比色管 (cuvette)中之試樣，則在隨機移動之顆粒處發生光散射。由 於顆粒之此運動，散射並非恆定，而是隨時間波動。對於 136765.doc -50- 200932220 較快移動且因此較小之顆粒而言，在9G。之角度處制之散 射雷射光的強錢動較大。基於強度之此等變&，可藉助 於自相關函數來推斷粒度。根據相關函數之降低來計算平 均粒徑。為正確計算平均粒徑，顆粒應具有^求形形狀（此可 . 由_顯微照W參見上文）證實），且其不應沈降或漂浮於 面上在2 5 c之隍溫及指定溶液黏度下，用經合適稀釋 . 之試樣進行量測。以來自公司Malvern Instruments Ltd.之具 有不同尺寸的標準乳膠顆粒來校正量測儀器。 用來自公司 FEI(Kassel，Germany)之 XL-30-SFEG型場發 射掃描電子顯微鏡獲得用於測定粒度之掃描電子顯微照片 (SEM顯微照片）。用來自公司Cressingt〇n(Watf〇rd，e㈣叫 之高真空SpUtter 208 HR& 5 nm金-鈀膜將試樣預先濺鍍。 物質溶解性表明純物質是^可溶解於溶劑中及在何種程 度上溶解。其目此表徵物質與溶劑均勻分布地（呈原子、分 子或離子形式）混合之性質。化合物之溶解度經定義為作為 ❺ 酿度（室溫）之函數之與不溶解沈降平衡的飽和溶液之濃 度。微溶性化合物之溶解度<〇 lm〇m，適度可溶性化合物 <溶解度在Q.1 mGl/M则1/1之間且易溶性化合物之溶解度 > 1 mol/1。 現將在下文給出之實例中進一步描述本發明，本發明並 不限於該等實例。 資例 實例1:藉由陰離子聚合來製造PBca 將Sicomet 6000用於藉由氰基丙烯酸丁酯（bca)之陰離 136765.doc 200932220

子聚合進行之PBCA製造。藉由緩慢持久地將總共2.5% [w/v] BCA逐滴添加至酸性溶液（pH 1.5-pH 2.5，理想地為 pH 2.2)中之1% [w/v] Triton X-100溶液中來實施聚合方 法。藉助於0.Ί NHC1溶液預先調節pH值。在用冰浴（約4°C) 冷卻之同時在恆定450轉/分鐘下將所得分散液攪拌4小 時。接著藉由經由摺疊紙過濾器過濾來移除較大聚結物。 藉由添加甲醇（或其他合適醇，諸如乙醇），聚合為PBCA之 BCA沈澱且將自其獲得之過濾殘餘物以純水（MilliQ系統） 洗滌若干次。在乾燥箱中在40°C下將PBCA過濾殘餘物乾燥 24小時後，藉由GPC測定平均分子量（Μη為約2000 Da)。使 用聚苯乙烯標準物。 為特定純化沈澱於甲醇中之PBCA，可將PBCA再次溶解 於四氫呋喃中且接著使用庚烷再次沈澱。用庚烷將藉由過 濾（摺疊過濾器，Nutsche或類似物）獲得之殘餘物沖洗2-n 次。在乾燥箱中在40°C-50°C下乾燥殘餘物直至重量保持恆 定（約4天）。 實例2:藉由奈米沈澱製備負載埃坡黴素之 PBCA-P(DMAEMA)奈米顆粒 a)聚合物/物質混合物（=混合物1)及界面活性劑溶液之製備 將30 ml於丙酮中之4%濃度PBCA溶液（w/v)、3 mL於丙酮 中之4%濃度PDMAEMA溶液（w/v)及3 mL於丙酮中之埃坡 黴素溶液（濃度為約60 mg/ml)吸移至具螺旋蓋之小瓶（50 ml)中，且在用旋蓋（screw-on lid)封閉小瓶後，以震盪方式 充分混合（=混合物1)。根據實例1來製備所用PBCA。在各 136765.doc -52- 200932220 情況下，最初將10 rnL之1%濃度Synper〇nic T7〇7溶液（w/v) 镇入具有磁性攪拌珠之20 ml具螺旋蓋玻璃杯中。 b) 藉由奈米沈澱製備顆粒分散液 在高攪拌器速度（600 rpm)下，將1.2 ml混合物1迅速吸移 至10 ml界面活性劑溶液中。在2小時_3小時後，在較低攪拌 器設置（100 rpm)下’在通風櫥中將剩餘丙酮再蒸發約18小 時-2 4小時。 c) 顆粒批料之處理 將根據製備指示a、b之20個批料合併成一個批料且加以 處理。使用1 μπι玻璃纖維過濾器（pall，25 mm，1 μιη P/N 4523Τ)來移除結晶之非囊封埃坡黴素。使用具有聚醚砜濾 膜（lOOkDa)之Amicon超濾單元8050來純化濾液。為進行純 化’將濾液濃縮至其體積之約1/3，且接著藉由添加丨％濃度 Synperonic T707溶液將濃縮物再次補足至原始體積。接著 再次濃縮混合物。將此過程重複兩次，且經由溶液最終體 積來調節埃坡黴素顆粒分散液之目標濃度（埃坡黴素含量 為 0.1 mg/ml-2 mg/ml) 〇 實例3:藉由奈米沈澱製備負載埃坡黴素之pBCA-P (DMAPMAM)奈米顆粒 a)聚合物/物質混合物（=混合物1)及界面活性劑溶液之製備 將30 ml於丙酮中之4%濃度PBCA溶液（w/v)、3 mL於丙酮 中之4%濃度PDMAPMAM溶液（w/v)及3 mL於丙銅中之埃坡 黴素溶液（濃度為約60 mg/ml)吸移至具螺旋蓋之小瓶（50 ml)中’且在用旋蓋封閉小瓶後，在震盪下充分混合（=混合 136765.doc •53· 200932220 物1)。根據實例1來製備所用pbca。在各情況下，最初將 10 mL之1%濃度Synperonic T707溶液（w/v)饋入具有磁性擾 拌珠之20 ml具螺旋蓋玻璃杯中。 b) 藉由奈米沈澱製備顆粒分散液 在高授拌器速度（600 rpm)下，將1.2 ml混合物1迅速吸移 至10 ml界面活性劑溶液中。在2小時-3小時後，在較低攪拌 器設置（100 rpm)下，在通風櫥中將剩餘丙酮再蒸發約18小 時-24小時。 c) 顆粒批料之處理 將根據製備指示a、b之20個批料合併成一個批料且加以 處理。使用1 μπι玻璃纖維過濾器（PALL，25 mm，1 μπι P/N 4523Τ)來移除結晶之非囊封埃坡黴素。使用具有聚醚砜濾 膜（lOOkDa)之Amicon超濾單元8050來純化濾液。為進行純 化，將濾液濃縮至其體積之約1/3，且接著藉由添加1%濃度 Synperonic T707溶液將濃縮物再次補足至原始體積。接著 再次濃縮混合物。將此過程重複兩次，且經由溶液最終體 積來調節埃坡黴素顆粒分散液之目標濃度（埃坡黴素含量 為 0.1 mg/ml-2 mg/ml)。 實例4:藉由奈米沈澱製備負載埃坡黴素之 PLGA-P(DMAEMA)奈米顆粒 a)聚合物/物質混合物（=混合物1)之製備 將30 ml於丙酮中之4%濃度PLGA溶液（w/v)(PLGA RG 752S)、3 mL於丙酮中之4%濃度PDMAEMA溶液（w/v)及3 mL於丙酮中之埃坡黴素溶液（濃度為約60 mg/ml)吸移至具 136765.doc -54- 200932220 螺旋蓋之小瓶（50 ml)中，且在用旋蓋封閉小瓶後，在震盪 下充分混合。 b) 界面活性劑溶液之製備 在各情況下，最初將1〇 mL之1%濃度Synperonic T707溶 液（w/v)饋入具有磁性攪拌珠之20 ml具螺旋蓋玻璃杯中。 c) 藉由奈米沈澱製備顆粒分散液 在高攪拌器速度（600 rpm)下，將1.2 m卜混合物1迅速吸移 至10 ml界面活性劑溶液中。在2小時-3小時後，在較低攪拌 器設置（100 rpm)下，在通風櫥中將剩餘丙酮再蒸發約18小 時_24小時。 d) 顆粒批料之處理 將根據製備指示a-c之2〇個批料合併成一個批料且加以 處理。使用1 μπι玻璃纖維過濾器（PALL ’ 25 mm ’ 1 μηι P/N 4523Τ)來移除結晶之非囊封埃坡黴素。使用具有聚醚颯濾 膜（100 kDa)之Amicon超濾單元8050來純化濾液。為進行純 化，將濾液濃縮至其體積之約1/3，且接著藉由添加1%濃度 Synperonic T707溶液將濃縮物再次補足至原始體積。接著 再次濃縮混合物。將此過程重複兩次，且經由溶液最終體 積來調節埃坡黴素顆粒分散液之目標濃度。 實例5:藉由奈米沈澱製造負載染料之PBC A奈米顆粒 i) PBCA-P(DMAEMA)奈米顆粒（具有 ICG、DODC、IDCC 或香豆素6) 使用標準實驗室震盪器將500 μΐ 2%丙酮PBCA溶液[w/v] 與100 μΐ 2%丙酮P(DMAEMA)溶液[w/v]在密封條件下（以防 136765.doc •55- 200932220 止丙酮蒸發）充分混合。根據實例1製備用於此之PBCA。將 100 μΐ之下文所述染料溶液中每一者添加至此聚合物混合 物中。 染料溶液a:首先在超音浴中將3 mg靛菁綠溶解於300 μΐ 純水中，且接著添加700 μΐ丙酮。 染料溶液b、c、d :將染料DODC、IDCC及香豆素6用於 0.02%丙酮溶液[w/v]中。 將充分混合之染料-聚合物混合物吸於2.5 ml Eppendorf 吸移管中且吸移至10 ml劇烈授拌之1% [w/v] Synperonic T707溶液中。將奈米顆粒分散液在600轉/分鐘下攪拌2小時 (標準磁力攪拌器）且在100轉/分鐘下再攪拌16小時以完全 蒸發溶劑。其係藉由在Eppendorf-Caps中離心來進行。在各 情況下，將1 ml顆粒分散液與0.5 ml 1% [w/v] CETAC溶液 (氯化十六烷基三甲基銨溶液）充分混合且在14000轉/分鐘 下離心10分鐘（於Sigma 2K 15實驗室離心機中）。移除上清 液，將顆粒再分散於1% CETAC溶液中且再次離心。將此洗 蘇過程重複三次，接著最終將顆粒溶解於1% Synperonic T707溶液中。 ii) PBCA-[PEI-IDCC]奈米顆粒 將500 μΐ 2%丙酮PBCA溶液[w/v]與異丙醇中之PEI 1.8 kDa(2% [w/v])—起使用。使用1〇〇 μι之丨）中所述染料溶液 a-d之每一者。 將充分混合之染料-聚合物混合物吸於2.5 ml Eppendorf 吸移管中且吸移至10 ml劇烈攪拌之i% Triton X-100溶液 136765.doc •56- 200932220 中。將奈米顆粒分散液在600轉/分鐘下攪拌2小時（標準磁力 攪拌器）且在100轉/分鐘下再攪拌16小時以完全蒸發溶劑。 其藉由在Eppendorf-Caps中離心來進行。在各情況下，將1 ml顆粒分散液與0.5 ml 1% [w/v] CETAC溶液（氯化十六烷 基三曱基銨溶液）充分混合且在14000轉/分鐘下離心10分鐘 (於Sigma 2K15實驗室離心機中）。移除上清液，將顆粒再 分散於1 % CETAC溶液中且再次離心。將此洗滌過程重複三 次，接著最終將顆粒溶解於l%TritonX-100溶液中。 實例6 :藉由改變界面活性劑相中之聚合物含量來影響奈米 沈澱 圖4中展示在製造期間可藉由改變聚合物濃度來控制 PBCA-P(DMAEMA)奈米顆粒之粒度。用界面活性劑 Synperonic T707來穩定根據實例2(但無埃坡黴素）製造之 PBC A-P(DMAEMA)奈米顆粒。在顆粒製造（奈米沈澱）期 間，將注入界面活性劑相中之有機聚合物溶液之體積保持 恆定且僅相應地改變聚合物濃度。所有其他製造條件（界面 活性劑濃度、聚合物PBCA:P(DMAEMA)之比=10:1、溫度、 攪拌速度/磁力攪拌棒、容器、注射類型）均保持恆定。 在沈澱期間在界面活性劑相中使用較低聚合物濃度產生 較小粒徑。在整個測試期内，在相等聚合物含量下未發現 粒度變化。 實例7 :用Glu(10)-b-PEG(110)對負載埃坡黴素之 PBCA-PDMAEMA奈米顆粒進行靜電表面改質

根據實例2來製備此處所用之埃坡黴素PBCA-PDMAEMA 136765.doc -57- 200932220 奈米顆粒。 為改質顆粒表面，將穩定水性奈米顆粒分散液與溶解於 水中之改質劑（Glu(10)-b-PEG(110)/Glu(10)-b-PEG(114))以 合適比例混合。適當比例係藉由用改質劑逐步滴定顆粒分 散液來測定。藉由測定ζ電位來監測靜電表面改質（電荷滴 _ 定）之程度。 • 藉由將改質劑（Glu(lO)-b-PEG(llO)或 Glu(10)-b-PEG (114)逐步添加至顆粒分散液中（電荷滴定），圖3a)展示ζ電位 〇 自（+)25 mV變至約（-)30 mV且圖3b)展示自+35 mV變至-10 mV 〇 實例8 :負載有埃坡黴素之PBCA-P(DMAEMA)奈米顆粒之 SEM顯微照片 根據實例2製備負載有埃坡黴素之PBCA-P(DMAEMA)。 圖5展示負載有埃坡黴素之PBCA-P(DMAEMA)奈米顆粒 之SEM顯微照片。 實例9:細胞培養測試 ❿ 在37°C及5% C02下在225 cm3培養瓶中將HeLa細胞株培 養於添加有10°/。胎牛血清（FCS)及2 mM L-麩胺醯胺之杜貝 ’ 卡氏改良伊格爾培養基（Dulbecco’s Modified Eagles • Medium ; DMEM)中。未使用抗生素（盤尼西林（penicillin)/ 鍵徽素（81：^口1&1117(^11))之添加’以便儘可能少地影響細胞過 程。使細胞定期繼代且出於測試目的進行接種24小時，隨 後開始研究。為進行研究’將細胞接種於來自公司 Falcon/Becton Dickinson之 96孔板中。 136765.doc 58- 200932220 對細胞之活力或典型形態進行目視檢查，隨後開始測 試。接著抽取含FCS培養基且用50 μΐ無血清培養基置換。 在將根據實例5(負載香豆素6之奈米顆粒）製備之奈米顆 粒分散液培育最多60分鐘後，抽取上層顆粒分散液且用PBS 將細胞洗滌2-3次。將預先稀釋於培養基中之來自公司 ‘ Molecular Probes Europe BV, Leiden(NL)之染料 . MitoTracker Red CMXRos(0.25 μΐ/ml)用於將線粒體染色。 在培育箱（37°C，5% C02)中用50 μΐ染料溶液進行培育15分 © 鐘。接著抽取染料溶液且用PBS將細胞洗滌2-3次。在室溫 下用100 μΐ 1.37%曱醛將細胞固定10分鐘。在抽取固定液 後，用PBS將細胞洗滌2-3次。在已固定細胞中用Hoechst 3 3342將細胞核染色。為此，在室溫下將用PBS稀釋之100 μΐ 染料溶液（2 gg/ml)培育10分鐘。在移除染料溶液後，用100 μΐ PBS將細胞洗滌2-3次。在8°C下將固定板以每孔200 μΐ PBS避光儲存於冰箱中直至使用螢光顯微鏡來研究。 實例10:官能化顆粒表面對麵胞吸收之影響 表1 :負載有（非）官能化香豆素6之PBCA-P(DMAEMA)奈米 顆粒（NP)之粒徑dhyd、多分散性指數及ζ電位 尺寸dhyd inml 多分散性指數[PI] ς電位[mV] 1)未改質NP 191 0.13 + 31.5±1.5 2)具有葉酸之NP 195 0.06 + 8.1 ±3.7 3)具有 Glu-PEG 之 NP 208 0.08 -28.4 ±1.2 根據實例5來製備實例9中所用之奈米顆粒。未改質或用 葉酸或Glu(10)-b-PEG(110)進行靜電表面改質後之顆粒具 有表1中所示之特性。 136765.doc •59- 200932220 在用於測試之96孔板中，所有孔均具有相同細胞密 測試前24小時接種：lxl0、細胞)。在培育箱中將恆：顆 粒濃度之表（表1}中所示之顆粒培t6G分鐘之時期。接著將 細胞洗務、固定且於次日量測1自㈣光顯微鏡在2〇倍 放大率及恆定曝光時間下對發螢光細胞攝影（參見圖6)〇

圖6展示同一個奈米顆粒電荷之不同表面特性如何影響 細胞吸收行為。在第丨）列中未以陽離子表面電位改質=顆 粒顯示對細胞表面較高之親和性，如自細胞上或細胞中之 較大螢光對比可見。根據第3)列細胞之放大截面圖可見在 用Glu(l〇)-b-PEG(l 10)滴定（其亦為有效的）後具有負表面電 位之顆粒的内化。 實例11:負載有香豆素6(用於活髏外偵測之螢光染料）之 GludiO-b-PEGdlO)改質 PBCA P(DMAEMA)奈米顆粒的細 胞吸收行為 根據實例5來製備實例9中所用之奈米顆粒。在用 Glu(10)-b-PEG(l 10)進行靜電表面改質後，研究顆粒之細胞 吸收 ^ίΤ 為（dhyd=171 ηπι，mV)。 作為内體或内溶酶體之明亮發螢光點為奈米顆粒藉由内 飲作用有效吸收至細胞中之證據（圖7)。放大率比例證明在 此照片中，個別顆粒因其尺寸小於200 nm而不能看見。此 等小泡（内體/内溶酶體）内部之大量顆粒在細胞質中引起強 烈之點狀螢光對比。在圖8中示意性展示用Glu(10)-b-PEG (110)改質之PBCA-P(DMAEMA)奈米顆粒表面之細胞吸收。 實例 12 : Glu(10)-b-PEG(110)改質 PBCAP(DMAEMA)奈米 136765.doc -60- 200932220 顆粒在鉍胞核中之累積 藉助於共焦雷射掃描顯微鏡對細胞之中平面攝影（圖9) 展示在細胞核中存在顆粒之局部累積。 實例13:用較高顆粒浪度培育來增加顆粒吸收 根據實例5來製備負載有香豆素6之Glu(10)-b-PEG(110) • 表面改質PBCA-P(DMAEMA)顆粒。根據實例9在細胞上用 . 0.21 mg/ml之較低顆粒濃度（圖10)及0.85 mg/ml之較高顆粒 濃度（圖11)培育相同時間長度。圖11展示用較高顆粒濃度培 © 育時相對於圖10增加之顆粒吸收。 實例14 : PBCA-[P(DMAEMA)-ICG】奈米顆粒之表徵 (圖13)展示在為動物實驗製造後7天之時期内，用於動物 實驗之表面改質PBCA-[P(DMAEMA)-ICG]奈米顆粒之粒 度。作為極窄粒度分布之特有特徵的恆定粒度及恆定低多 分散性指數（PI < 0.1)證明表面改質顆粒之良好穩定性。 基於SEM顯微照片（圖12)，可另外宣稱其為尺寸為約200 nm之球形奈米顆粒。 ❹ 藉助於電荷滴定，用嵌段共聚物Glu(10)-b-PEG(110)來改 質PBCA-P(DMAEMA)奈米顆粒之陽離子表面（參見圖Μ)。 ' 自超過中性點約+30 mV直至在約-30 mV下達到解離平衡來 • 相應地滴定以ζ電位形式量測之表面電荷。在滴定後7天之 研究時期内，表面改質PBCA-[P(DMAEMA)-ICG]顆粒未展 示ζ電位之任何變化。不變之粒度及恆定之低PI因此提供良 好顆粒穩定性之證據。 圖15展示ICG水溶液及ICG奈米顆粒分散液（經洗滌及未 136765.doc -61 - 200932220 經洗滌）之UV-Vis吸收光譜。散菁綠為吸收及發射光譜在波 長範圍650 nm-900 nm内之近紅外螢光染料。藉助於陽離子 聚丙烯酸酯P(DMAEMA)進行之ICG之錯合及囊封引起兩個 波長最大值之最小長波基團（bathochrome)位移。 實例15 :動物實驗 所用動物係由公司Taconic M&B供應。其為NMRI裸型雌 性白化變種裸小鼠。在約8週後完全長大之動物具有22 g-24 g之體重。對五隻雌性裸小鼠在右後側腹處接種2 X 1 〇6個F9-畸胎瘤細胞。該等細胞獲自公司ATCC/LGC Promochem GmbH。其為小鼠源腸畸胎癌胚細胞，將其用作用於小鼠中 癌症研究目的之腫瘤模型。18天後，在五隻小鼠之四者中， 腫瘤已生長成約0.5 cm-1 cm直徑之平均尺寸。在實驗之第 一小時内用Rompun-Ketavet注射以每10 g動物1〇〇 μΐ之劑 量將動物永久麻醉。注射溶液包含R0Inpun之1:10稀釋物或 Ketavet之1:5稀釋物與生理鹽水的ι:ι混合物。接著將2〇〇 μΐ 奈米顆粒分散液經靜脈内注射於尾靜脈（caudal vein)中。經 肺臟以Rompun-Ketavet作為吸入麻醉劑來實現後續麻醉， 以使動物循環之負擔最小。在注射該物質後24小時及48小 時之時間範圍内，藉由螢光在視覺上檢查動物。 自圖17可見，在靜脈内施用（尾靜脈）後，Glu(10)-b-PEG (11〇)改質PBCA-[P(DMAEMA)-ICG]奈米顆粒能夠藉由被 動累積機制（EPR效應）累積於腫瘤組織中。離體腫瘤檢查展 示’與未經治療之腫瘤組織相比（比較圖18b與圖1 8a，或比 較圖18c與圖18a) ’經治療腫瘤組織之螢光對比明確增強。 136765.doc -62- 200932220 在24小時及48小時後在同一個動物中螢光之多次延遲偵測 為可能的（圖17)。因此’顆粒可活體内循環足夠長時間且因 此累積於腫瘤中。因此以靜電方式聚乙二醇化表面係與顆 粒表面穩定結合。存在非腫瘤相關顆粒自肝臟之快速膽汁 消除。此係由在24小時或48小時後肝臟中不存在NIR螢光對 比來指示。自有機體（例如肝臟）快速消除未累積於腫瘤中之 顆粒在其他器官之最小負擔下（具有極小副作用之對比劑 系統之先決條件）容許良好之腫瘤對比。 Ο ❹ 用於動物實驗之設備係由公司LMTB(Berlin, Germany)建 構。其具有以下獨立組件： 雷射器： 二極體雷射器（742 nm)，型號Ceralas PDT 742/1.5W ;由 CeramOptec(Bonn， Germany)製造; 激發渡波器·· lxLCLS-750 nm-F ; 1x740 nm干擾遽波 (Excitation filter)器（帶通）； 發射濾波器： lxbk-802.5-22-cl ; lxbk-801-15-cl ; 攝影機： Peltier空氣冷卻CCD攝影機，型號 C4742-95 12ER’ 由 Hamamatsu (Herrsching， Germany)製造;

軟體· 來自 Compix/Hamamatsu 之 Simple PCI 5.0。 【圖式簡單說明】 圖1 : 具有埃坡黴素之PBCA-PDMAEMA奈米顆粒（未經表 面改質）之短期穩定性。 136765.doc •63- 200932220 圖2 :用Glu(10)-b-PEG(110)表面改質之具有埃坡黴素之 PBCA-PDMAEMA奈米顆粒的短期穩定性： a)流體動力學粒徑dhyd及多分散性指數 PI/#EpoPD19Ak2konz PEG-Glu ； b)流體動力學粒徑43^及（電位。 圖3:(滴定ζ電位之過程）在負載埃坡黴素之 PBCA-PDMAEMA奈米顆粒之表面改質期間。

此圖中展示藉由將改質劑（Glu(lO)-b-PEG(l 10))或 (Glu(10)-b_PEG(l 14))逐漸添加至顆粒分散液中（負 載滴定），圖3a)之ζ電位自+25 mV變至約_3〇 mv且圖 3b)之ζ電位自+35 mV變至-10 mV。 圖4 :藉由改變聚合物濃度來控制粒徑； 圖1展示在製造期間可藉由改變聚合物濃度來控制 PBCA-P(DMAEMA)奈米顆粒之粒度。 圖5 :該圖展示負載埃坡黴素之PBCA-P(DMAEMA)奈米 顆粒之SEM顯微照片。 圖6 :官能化.顆粒表面對細胞吸收之影響： a) 比較表面改質後之細胞吸收行為；第丨列：未改質 顆粒；第2列：具有葉酸之奈米顆粒；第3列：具有 Glu(10)-b-PEG(110)之奈米顆粒； b) 細節：第3列/第liL/第15位，點；箭頭指示細胞核 中螢光明確增強（實例10)。 圖7: HeLa細胞中之奈米顆粒吸收；呈灰階影像之奈米顆 粒之螢光； 136765.doc 200932220 該圖展示Glu(10)_b-PEG(110)改質 PBCA P(DMAEMA) 奈米顆粒在HeLa細胞中之細胞吸收行為。 圖8 : 用 Glu(10)-b-PEG(110)表面改質之PBCA-P(DMAEMA) 奈米顆粒之細胞吸收的示意圖； 所用縮寫=PEG-NP :聚乙二醇化含香豆素之 PBCA-P(DMAEMA)奈米顆粒；NP :負載香豆素之 PBCA-P(DMAEMA)奈米顆粒；CP :塗佈内涵蛋白 (clathrin)之凹點；ES :内體；LS :溶酶體；ELS : 内溶酶體；ZK :細胞核；H+ : H+ATP酶；PEG-Glu : 游離Glu(10)-b-PEG(110)嵌段共聚物；尺寸關係並不 符合事實。 圖9 : a)細胞中平面中之螢光圖（CLSM，共焦掃描雷射顯 微鏡），b)螢光之基於電腦之3D圖； ❹圖1〇: 該圖展示 Glu(10)-b-PEG(110)改質 PBCA-P(DMAEMA) 奈米顆粒在細胞核中之累積。此經由負載螢光·活性 染料香豆素6為可能的。 用較低顆粒濃度0.21 mg/ml培育時顆粒吸收減少； 呈灰階影像之NP之螢光； 該圖展示用0.21 mg/ml之顆粒濃度培育後之發榮光 HeLa細胞。使用Glu(10)-b-PEG(110)表面改質 PBCA-P(DMAEMA)顆粒。 圖11 : 用較高顆粒濃度0.85 mg/ml培育時顆粒吸收增加； 呈灰階影像之NP之螢光； 該圖展示用0.85 mg/ml之較高顆粒濃度培育後之更 136765.doc -65- 200932220 強烈發螢光HeLa細胞。使用Glu(10)-b-PEG(ll0)表 面改質PBCA-P(DMAEMA)顆粒。 圖12 : PBCA-[P(DMAEMA)-ICG]奈米顆粒之SEM顯微照 片。 圖 13:用 Glu(10)-b-PEG(110)表面改質之 PBCA-[p * (DMAEMA)-ICG]奈米顆粒之粒徑dhyd ; . 此展示在為動物實驗製造後7天之時期内，用於動 物實驗之表面改質PBCA-[P(DMAEMA)-ICG]奈米 ® 顆粒之粒度。 圖14 :未經滴定（經洗滌/未經洗滌）及經滴定PBCA [P(DMAEMA)ICG]奈米顆粒之ζ電位； 該圖展示用嵌段共聚物Glu(10)-b-PEG(110)改質之 PBCA-P(DMAEMA)奈米顆粒之以ζ電位形式量測的 表面電荷。自約+30 mV經由中性點且超過中性點至 在約-3 0 mV下達到解離平衡而相應地將此滴定。 圖15 : UV-Vis吸收光譜：a)ICG水溶液；b)未經洗滌之 〇 PBCA-[P(DMAEMA)-ICG] NP ; c)經洗滌之 PBCA- [P(DMAEMA)-ICG]奈米顆粒； * 此圖展示ICG水溶液及ICG-奈米顆粒分散液（經洗 * 滌及未經洗滌）之UV-Vis吸收光譜。 圖16 : PBCA-[P(DMAEMA)-ICG]奈米顆粒及ICG水溶液之 發射光譜； 該圖展示ICG水溶液與奈米顆粒分散液相比之相應 發射光譜。 136765.doc 200932220 圖17 :偵測活體内NIR螢光； 該等圖展示在注射以下物質後24小時及48小時之 時間範圍内的腿榮光：⑷24小時，經腹部，_ 小時，經侧部’ c)48小時，經側部，d)空白值，經 腹部。 圖18 :治療後48小時之離體腫瘤組織之nir螢光對比； ， 該圖展示以下各物之NIR螢光對比·· a)未經治療之 腫瘤’無NIR螢光對比；b)經治療之大腫瘤及c)治療 ® 後48小時之中等尺寸之離體經治療腫瘤。 ❹ I36765.doc •67·

Claims (1)

1. 200932220 十、申請專利範圍： 1. 一種具有陽離子表面電位之聚合物奈米顆粒，其包含陽 離子聚合物及水難溶性聚合物，其特徵在於該聚合物奈 米顆粒含有診斷劑及埃坡黴素（epothilone)或僅含有埃坡 黴素。 2. 如請求項1之聚合物奈米顆粒，其特徵在於該水難溶性聚 合物為聚氰基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸烷酯（PACA)、聚 酯、褐藻酸、玻糖醛酸、聚唾液酸、酸纖維素衍生物、 聚醯胺、聚酸酐、聚 酸澱粉衍生物、多醣、聚合蛋白、 原酸酯、聚己内酯、聚磷酸、聚（醯胺_烯胺）、偶氮聚合 物、聚胺基甲酸酯、聚原酸酯、樹枝狀聚合物、假聚胺 基酸或該等化合物之所有混合物及共聚物。 3·如凊求項1之聚合物奈米顆粒，其特徵在於該陽離子聚合

   電方式改質。 如請求項4之聚合物奈米顆 顆粒， (XIII)化合物： 其中表面改質劑為式

   其中： 陰離子錨（XIII) 136765.doc 200932220 R為氫、C1-C3烧基、中性胺基酸，且 陰離子錨為至多20單位麩胺酸（giu)或天冬胺酸（As^之 聚合物或其鹽，或其混合聚合物， 其亦可視情況含有中性胺基酸。 6. 如請求項1至5中任一項之聚合物奈米顆粒，其特徵在於 該診斷劑帶負電荷且與該陽離子聚合物形成離子對形式 • 囊封於該顆粒中。 7. 如請求項1或2之聚合物奈米顆粒，其中該埃坡黴素為通 © 式（XI)之化合物：

   其中： Rla、Rlb彼此獨立地為氫、q-Cu)烷基、芳基、芳烷基， 或其一起為基團-(CH2)m-，其中01為2至5; R2a、R2b彼此獨立地為氫、Cl_c丨ο烷基、C2_Cw烯基、 C2-C10炔基、芳基、芳烷基，或其一起為基團 -(CH2)n-，其中 η為 2至 5， R 為氫、Ci-Ci〇烧基、芳基、芳烧基； R4a、R4b彼此獨立地為氫、CrCM烷基、芳基、芳烷基， 或其一起為基團-(CH2)P- ’其中p為2至5 ; R5 為氫、ci-ci〇烷基、芳基、芳烷基、c〇2h、c〇 136765.doc •2- 200932220 炫基、CH2OH、CHzO-C^-Cs燒基、CH2〇·醯基、 CN、CH2NH2、CHaNGCVCs 烷基），醯基）12 或 CH2Hal > CHal3 ； R、R彼此獨立地為氫，或其一起為另一鍵或環氧官能 基； G 為Ο或CH2 ;

   D-E —起為基團 _H2C-CH2-、-HC=CH-、、 -CH(OH)_CH(OH)_ 、 -CH(OH)-CH2- 、 -CH2-CH(OH)-、-CH2-〇-、-〇-CH2-或 C#CH，其中 若G為氧，則D-E不可為CH2-0 ;或 D-E-G—起為基團 H2C-CH=CH ; W 為基團C(=X)R8，或雙環或三環芳族或雜芳族武 團； A X 為0或基團CR9R1G ; R8 為氫、Ci-Ci 〇烧基、芳基、芳烧基、鹵素、CN. R9、R1Q彼此獨立地為氫、C丨-Cm烷基、芳基、芳烷基 或連同亞曱基碳原子一起為5員至7員碳環； z 為〇或氫及基團OR11 ; RU 為氫或保護基PGZ; A-Y 為基團 〇-C(=〇) 、〇_CH2 、 CH2-c(=〇) NRi2-C(=0)、NR丨2_S02 ; R12 為氫或烷基； PGZ 為Ci-C^o烧基、環中可含有一或多個氧原子之 eve·；環院基、芳基、芳貌基、C^-C^o酿基、芳酿 136765.doc 200932220 基、Ci-C2〇烧基績酿基、芳基續醢基、三（c丨-C20 烧基）石夕院基、二（CVC2G烷基）芳基矽烷基、（q-Czo 烷基）二芳基矽烷基或三（芳烷基）矽烷基； /、2以個別立體異構體或不同立體異構體之混合物及/或 醫藥學上可接受之鹽的形式囊封。 8.如請求項7之聚合物奈米顆粒，其中該埃坡徽素係選自包 含以下各物之清單： ❹

   …，7R，8S，9S，13E/Z，16S)-4，： 一沿甲丞承井噁 唾-5-基M-氧雜-5,5,9，13_四甲基_7，_2稀· •Π-烯-2,6-二酮； 烯小基）·3_(2·甲基苯并鳴唾_5_基）8,8，i2 i6•四甲基 -4，17-二氧雜雙環[14.1.0]十七烷_5,9_二鲷； 土 _(4S，7R，8S’9S，13E/z，16S)_4,8_nl6(m^^ 基^-氧雜巧^^-四甲基^丙-:^烯+基續十六 -13-稀 _2,6-二酮； (18/反，38,78，1〇11，118，128，1611/8)-7，11_二羥基-1〇_(丙2 烯+基）-3-(2-甲基苯并喧唾_5_基广以从…四甲基 -4，17·二氧雜雙環[14.1.0]十七烷·5,9-二綱； 基·1〇 (丙 _2•稀小 基）-3-(2-甲基苯并噻唑_5_基）_8,8，1216_四甲基_417_二 氧雜雙環[14.1 .0]十七烷-5,9-二酮； (18化’38,78，10尺，111128，16尺/8)_7，11_二羥基_1〇(丙^ 稀-1-基）-3_(2_曱基苯并嗟0坐_5_基）_8,812，16四甲基 136765.doc 200932220 -4,17-二氧雜雙環[14.1.0]十七烷-5,9-二酮； (48,711，88,98，13£/2，168)-4,8-二羥基-16-(2-甲基苯并噻 唑-5-基）-1-氧雜-9，13-二曱基-5,5-(l，3-三亞甲基）-7-(丙 -2-烯-1-基）環十六-13-烯-2,6-二酮； (lS/R，3S，7S，10R，llR，12S，16R/S)-7，ll-:M*-10-(i-2-' 烯-1-基）-3-(2-甲基苯并噻唑-5-基）-12，16-二甲基 - -8,8-(1，3-三亞甲基）-4，17-二氧雜雙環[14.1.0]十七烷-5,9- 二酮； © (4S，7R，8S，9S，13E/Z，16S)-4,8-二羥基-16-(2-甲基苯并噻 唑-5-基）-1-氧雜-5，5,9,13-四甲基-7-(丙-2-炔-1-基）環十六 -13-烯-2,6-二酮； (lS/R，3S，7S，10R,llR，12S，16R/S)-7,ll-:.*-10-(i-2-炔-1-基）-3-(2-甲基苯并噻唑-5-基）-8,8,12,16-四曱基 -4，17-二氧雜雙環[14.1.0]十七烷-5,9-二酮； (4S，7R，8S，9S，13E/Z，16S)-4,8-二羥基-16-(喹啉-7-基）-l-氧雜-5,5,9,13-四曱基-7-(丙-2-烯-1-基）環十六-13-烯-2,6-二酮； (18/11，38,78，1011，1111，128，1611/8)-7，11-二羥基-10-(丙-2- • 烯-1-基）-3-(喹啉-7-基）-8,8，12，16-四甲基-4,17-二氧雜雙 • 環[14.1.0]十七烷-5,9-二酮； (4S，7R，8S，9S，13E/Z，16S)-4,8-:g*-16-(l，2-:f*-lH-苯并咪唑-5-基）-1-氧雜-5,5,9，13-四曱基-7-(丙-2-烯-1-基） 環十六-13-烯-2,6-二酮； (1S/R，3S，7S，10R，11R，12S，16R/S)-7，11-二羥基-10-(丙-2- 136765.doc 200932220 稀-1-基）-3-(ι，2_二甲基 _111_苯并咪唑-5-基）-8,8，12，16-四 甲基_4，17-二氧雜雙環[14.1.0]十七烷-5,9-二酮； (48,711，88’93，13丑/乙，163)-4,8-二羥基-16-(2-甲基苯并噻 唑-5_基）-1-氮雜_5,5,9，13-四甲基-7-(丙-2-烯-1-基）環十六 -1 3-稀-2,6-二酮； (1S/R，3S，7S5l0R>11S}12S,16R/S)-7,ll-^ ^ _2

   烯-1-基）-3-(2_甲基苯并噻唑_5_基）_881216四曱基_4 氮雜-17-氧雜雙環[I4.1.0]十七烷·5,9二酮； (1S/R,3S57S51〇r,iirj12S516R/S)-7511.^ M & -i〇.(^ _2 烯-1-基）-3-(2-甲基苯并噻唑_5_基）_8,8，1216•四甲基 氮雜-17-氧雜雙環^4.^]十七烷·59二酮； (1S，3S(E)，7S，10R，11S，12S，16R)-7，11_ 二羥基 _8 81〇 12 ^ 五曱基-3-[l-(2-甲基-1,3-噻唑-4-基）丙烯_2基]_4i7_ 二氧雜雙環[14.1.0]十七统-5,9二酿| ; (1 S，3S(E)，7S，10R，11S，12S，16R)-7，11 -二赖 | c 0 ^ & -».8,10,12,16. 五曱基·3-[1·(2-曱基-I，3-嗟嗤_4·基）丙4_烯_2_基]·氧 雜-4-氮雜雙環[14.1.0]十七烷-5,9二網； (48,711,88,98，132，168問）-4,8-二羥基_557(5112 土 J，D，’，9，13-五甲義 -16-Π-(2-甲基山3-嗟嗤-4-基）丙+稀_2_基]氧雜環十二 -13-烯-2,6 二酮； ^ (48,711，83,98，1(^，13乙，163(£))-4,8-二經基_5 5 7 9 13 曱基-16-[l-(2-甲基-1，3-嗟峻_4·基）丙烯_2基]氧杂 十六-10，13-二烯 _2,6 二酮； (4S，7R，8S，9S，l〇E，13Z，16S(E))-4,8-二經基 土 ，），7’9-迅 136765.doc -6 - 200932220 基_13_三盡田« 一机T基-16_[1-(2-甲基-1，3-噻唑-4-基）丙-1-烯-2-基]氧雜環十六_1〇，13-二締_2,6二酮； (1S，3S(E)’7S，10R，11S，12S，16R)-7，11-二經基-M，l〇，12，16- 9?甲 〇 p 土 LI_(2·甲基硫基-1,3-噻唑-4-基）丙-1-烯-2-基]4’17-二氧雜雙環[14.1.0]十七烷-5,9-二酮， 八呈個別立體異構體或不同立體異構體之混合物及/或醫 藥子上可接受之鹽的形式。 9. ❹ 10. 11. ❹ 12. . 13. 如-青求項8之聚合物奈米顆粒，其特徵在於該表面改質劑 含有目標識別結構。 如°嗜求項9之聚合物奈米顆粒，其特徵在於該目標識別結 構具有一個帶負 電荷部分且係藉由靜電相互作用施加於 該陽離子顆粒表面上。 如請求項9之聚合物奈 米顆粒，其特徵在於該目標識別結 構係選自包含以下各物之清單：抗體、蛋白質、多肽、 夕膽、DN A分子、rnA分子、核酸、脂質、碳水化合物 或上述各物之組合。 如清求項1至5中任一項之聚合物奈米顆粒，其特徵在於 該等顆粒之尺寸在1 nm-800 nm範圍内。 一種製造如請求項1至12中任一項之聚合物奈米顆粒的 方法’其特徵在於進行以下方法步驟： a) 將陽離子聚合物溶解於有機溶劑或溶劑/水混合物中， b) 將水不溶性聚合物溶解於有機溶劑中， c) 將一或多種活性物質分開或一起溶解於有機溶劑或溶 劑/水混合物中， 136765.doc 200932220 二):1=:個別製得之溶液，來製備陽離子聚合物、水 物及活性物質之完全溶解混合物， e)將該混合物添加至含界面活性狀溶液中， 0移除該溶劑且視情況純化顆粒分散液， g) 視情況凍乾， h) 視情況藉由一起添加合 通量比率之該奈米顆粒分散液 ' 與改㈣’進行該等齡之靜電表面改質， 視1諸’視情況再切除财劑及/或分散劑。 14.種如凊求項丨至12中任—項之奈米顆粒的用途，其係用 於使用醫藥學上可接受之賦形劑來製造醫藥製劑/醫藥形 式。 、 月求項14之用途，其中該醫藥製劑/醫藥形式適用於治 療贅生性疾病或伴有發炎反應之疾病及/或用於診斷或監 測治療。 一 16.種套組，其係由如請求項u 12中任一項之 φ 成’該等奈米顆粒包含共同或獨立囊封之診斷劑及埃坡 黴素。 、 17·如明求項16之套組’其係由具有與請求項1至12中任一項 相同組成之分開製備之奈米顆粒系統⑷及（b)組成’其包 * 含： 、 (a)囊封於顆粒中之診斷劑及（b)囊封於顆粒 撕去孙 ％吸 ‘、，其中該等顆粒可視情況呈稀釋形式一起或獨立投 與。 18.如请求項17之套組，其中該等組份⑷及⑼係以固態形式 136765.doc 200932220 存在，且另外視情況存在適於視情況分開或一起分散或 溶解該等奈米顆粒系統（a)及（b)之試劑（c)。

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