TW200936159A - Attenuated oncolytic paramyxoviruses encoding avian cytokines - Google Patents
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Description
200936159 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種重組溶瘤RNA新城雞瘟病毒，其包含 至少一個編碼鳥類細胞激素之轉殖基因，其中該重組溶瘤 RNA新城雞瘟病毒可自強毒型或中間毒型溶瘤RNA新城雞 癌·病毒獲得。該細胞激素在天然宿主細胞中之病毒介導表 '現導致該病毒對鳥類物種之致病性降低。 本發明中之病毒適用於治療疾病，尤其適用於溶瘤性腫 〇 瘤治療。製得編碼鳥類細胞激素之重組病毒，其中該病毒 對鳥類物種之致病性降低，從而減弱該病毒之環境毒性。 該病毒之溶瘤活性不因所述致病性降低方法而受損。該病 ' 毒基因組可編碼其他治療性轉殖基因，較佳為結合蛋白 (抗體、錨蛋白重複分子、肽等）、前藥轉化酶或/及蛋白 酶。此等結合蛋白、前藥轉化酶及/或蛋白酶之活性增強 該病毒之抗腫瘤作用。此外，本發明描述用於治療癌症之 該等經修飾病毒之製造及用途。 ® 【先前技術】 新城難瘟病毒 一般用於治療腫瘤之溶瘤病毒評述於Chiocca(2002)中。 新城雞瘟病毒（NDV)已作為實驗治療劑使用40多年且 Sinkovics 及 Horvath(2000)已評述。Alexander(1988)在書中 大體描述了新城雞瘟病毒。正在研發NDV病毒株PV701作 為神經膠母細胞瘤之抗癌治療（Lorence等人，2003)。NDV 病毒株MTH68已用於實驗性癌症治療且已投與人類30多年 137749.doc 200936159 (Csatary 等人，2004)。
Stojdl等人（2003)在論文中描述，在所有經測試之腫瘤 細胞株之80%範圍中，存在水泡性口炎病毒（VSV)感染後 之干擾素反應不足。由於VSV與NDV均為單股負鏈病毒目 (order mononegavirales)之成員，因此可假定類似百分比之 腫瘤細胞株易感染NDV。亦已證明NDV在腫瘤細胞中之選 擇性複製機制係基於抗該病毒之細胞干擾素反應不足（例 如參見US 20030044384)。 副黏液病毒含有具有15-19 kb長之基因組（野生型）之負 極性單股RNA基因組且該等基因組含有6-10個基因。病毒 包膜係由表面醣蛋白及源自宿主細胞之膜部分形成。表面 醣蛋白（F及HN或Η或G)介導病毒自宿主細胞進出。核鞘位 於包膜内且含有RNA基因組及負責細胞間病毒轉錄及複製 的核鞘蛋白（ΝΡ)、磷蛋白（Ρ)及大蛋白（L)。基質蛋白（Μ)連 接病毒包膜與核鞘。除此等編碼結構蛋白之基因外，副黏 液病毒科（Paramyxoviridae)亦可含有"附屬"基因，其可為 散置有上述基因之其他轉錄單元。附屬基因主要為與P基 因轉錄單元重疊之ORF。副黏液病毒之綜述可見於Lamb (2001)中。 NDV為屬於單股負鏈病毒目之副黏液病毒科中之禽副黏 液病毒屬（genus Avulavirus)的原型成員。該病毒基因組為 編碼以下6種主要蛋白質之單股負義RNA :核鞘蛋白 (NP)、磷蛋白（P)、基質蛋白（M)、融合蛋白（F)、血球凝集 素蛋白（HN)及聚合酶蛋白（L)。藉由編輯P蛋白mRNA，可 137749.doc 200936159 轉譯一或兩種其他蛋白質v(及w)。 NDV詳細描述於 Alexander (198 8)及Lamb (2001)中》 作為烏類病原體之新城難瘟病毒 根據對雞的致病性將NDV病毒株分類為引起全齡雞急性 致命性感染之強毒型病毒株（高毒性）、僅在幼雞中具有致 命性之中間毒型分離株（中間毒性）及以疾病之輕微或不明 顯形式顯現之弱毒型病毒株（無毒性）。NDV分離株之強毒 型、中間毒型或弱毒型之分類係依據9曰齡受精蛋 (embryonated eggs)中之雞胚在接種殺死胚胎之最小致命劑 量後的平均死亡時間（MDT)來判定。NDV毒性的決定因素 之一似乎為前驅體F蛋白之分裂位點。 1926 年在 Newcastle-upon-Tyne，England及 Java, Indonesia 觀察到NDV的第一次爆發。自疾病首次出現以來已描述三 種NDV廣泛性動物流行病。 NDV主要係經由易感鳥所吸入的煙塵或大飛沫傳播》在 感染期間，新的感染性病毒顆粒自受感染呼吸道散發出或 排泄於糞便中。經由健康鳥攝入此含有病毒的物質，可建 立起新的感染且可維持一隻鳥向另一鳥的病毒傳播。 作為鳥類病原體之NDV詳細描述於Alexander (1997)， Diseases of Poultry 中。 新城雞瘟疫苗接種
在上世紀初已認識到NDV為家禽飼養的一種威脅且需要 疫苗接種。Iyer及Dobson在二十世紀三十年代已進行關於 毒性NDV病毒株減毒之研究，從而研發一些中間毒型NDV 137749.doc 200936159 疫苗株。活疫苗的研發因弱毒型疫苗株Hitchner B1及 LaSota的建立而向前發展，該等疫苗株為目前最廣泛使用 之NDV疫苗。此外，疫苗接種策略包括使用滅活NDV疫苗 (例如，藉由福馬林（formalin)、β-丙内酯滅活），其係與載 劑佐劑（氫氧化敍、油乳液）一起給與。 NDV疫苗研發的歷史及現狀詳細描述於Alexander (1997) Diseases of Poultry 中0 基於藉由反向遺傳技術所產生之重組NDV的新一代獸醫 用疫苗評述於Huang等人（2003)中且重組NDV疫苗描述於 以下專利中。 US 6,699,479 B1描述一種新城雞瘟病毒（NDV)突變體， 其以減低之水準表現其V蛋白且用於孵化前胚胎之疫苗接 種。 US 2004/0043035係關於一種重組NDV突變體，其不能 表現核蛋白（NP)之免疫顯性抗原決定基且適用作標記疫苗
US 2003/0224017描述一種用於製造重組NDV疫苗之 NDV的反向遺傳系統。此系統允許自NDV基因組表現轉殖 基因，例如鳥類細胞激素（雞IL-2、雞IL-4)，以產生NDV 疫苗株。 EP 1 300 157係關於一種適用於鳥類物種胚内疫苗接種 之減毒突變型新城雞瘟病毒株，其包含編碼HN及/或F醣蛋 白之基因序列中的突變。 US 6,719,979係關於一種完全自經選殖之全長cDNA產生 137749.doc 200936159 感染性新城雞瘟病毒（NDV)之方法及使用該方法所產生或 所獲得之疫苗及診斷檢定之用途。 WO 2007/02543 1描述一種製造重組減毒新城雞瘟La Sota病毒株之方法及其用於製備供預防由新城雞瘟病毒 (NDV)所引起之疾病之用之疫苗的用途。 W0 2000/067786係關於用於製造減毒感染性新城雞瘟病 毒（NDV)之cDNA。包含減毒感染性NDV之疫苗屬於該發 明之範疇内。 重組副黏液病毒 ΕΡ-Α-0 702 085係關於經遺傳操作之感染性複製型不分 段負股RNA病毒突變體，其包含病毒基因組之開放閱讀框 架、假基因區域或基因間區域中之插入及/或缺失。 W0 99/66045係關於自病毒基因組之全長cDNA分子獲得 之經遺傳修飾之NDV病毒。 WO 00/62735係關於一種腫瘤治療方法，其包含投與干 擾素敏感性、有複製能力之選殖RNA病毒，例如NDV。 在 WO 01/20989(PCT/US00/261 16)中，描述一種使用重 組溶瘤副黏液病毒治療患有腫瘤之患者之方法。藉由投與 有複製能力之副黏液病毒來減輕腫瘤。描述可用於工程化 病毒基因組以改良溶瘤特性之各種方法。 W0 03/005964係關於重組VSV，其包含編碼細胞激素之 核酸。 US 2004/01 70607係關於藉由投與不為常見人類病原體 之病毒來治療黑色素瘤。 137749.doc 200936159 NDV之遺傳操作 NDV可如（例如）ΕΡ-Α-0 702 085中所述使用反向遺傳技 術來遺傳操作。舉例而言，已知製造包含其他核酸之重組 NDV構築體，該等核酸編碼分泌鹼性磷酸酶（Zhao及 Peeters，2003)、綠色螢光蛋白（Engel-Herbert 等人， 2003)、感染性法氏囊病病毒（bursal disease virus)之VP2蛋 白（Huang等人，2004)、流感病毒血球凝集素（Nakaya等 人，2001)及氣黴素乙醯基轉移酶（chloramphenicol acetyl transferase)(Huang等人，2001)(Krishnamurthy等人，2000)。 此等重組NDV尚未構築用於治療人類疾病。製造該等重組 NDV可研究NDV之基本病毒學或研發家禽疫苗株。弱毒型 NDV病毒株充當親代病毒株。此等病毒株不具有顯著溶瘤 特性。 病毒之遺傳操作 遺傳操作RNA病毒之方法如上所述已熟知。此外，溶瘤 病毒之遺傳操作評述於（例如）Bell等人（2002)中。作為病毒 治療劑之RNA病毒評述於Russell (2002)中。任何此等文件 之内容均以引用的方式併入本文中。 鳥類細胞激素 鳥類細胞激素評述於Staeheli等人（2001)中。雞細胞激素 及趨化激素之基因組分析描述於Kaiser等人（2005)中。 【發明内容】 自二十世紀六十年代早期以來，對溶瘤NDV病毒株作為 腫瘤治療劑一直在研究。大多數用於溶瘤性腫瘤療法之病 137749.doc 200936159 毒株屬於描述為家禽病原體之中 作為抗腫瘤生物藥之溶瘤NDV， 、 ^ :"研發 ^ 應減低潛在的現有環境毒 ::二：：豕禽致病性。然而，相對於家禽減毒之NDV必 、有寺續的溶解腫瘤細胞之能力且保持其溶瘤潛力。現 有的疫苗研發策略不適用’原、因在於其集中在藉由施用完 全滅活病毒顆粒或無致病性弱毒型病毒株來刺激鳥免疫系 統。兩種疫苗_均不能在癌細胞中複製且繼而喪失溶解 腫瘤細胞之潛力。
在本發明中’可藉助於反向遺傳技術達成在不減弱病毒 溶瘤活性的情況下使NDV相對於家禽減毒。藉由將編碼細 胞激素（尤其是抗病毒或免疫刺激性細胞激素）之轉瘦基因 插入來製造重組減毒NDV。 此外，由於疫苗之目標係誘導具有長期持久免疫性之強 免疫反應以保護動物免於繼發感染，因此NDV疫苗不適用 於該方法。在本發明中，所述NDV減毒之主要目的在於允 許動物控制（不良）原發感染且因此降低環境毒性且增加病 毋·在用於增生性疾病療法中時之安全性。 本發明之一目標係藉由溶瘤病毒溶解腫瘤細胞。該溶瘤 病毒方法之適應症為人類癌症療法。相比而言，如us 2003/0224017中所揭示之家禽Ndv疫苗係用於動物且因此 屬於動物保健領域。 因此’本發明之一目標為一種重組溶瘤RNA新城雞瘟病 毒，其包含至少一個編碼鳥類細胞激素之轉殖基因，其中 該重組溶瘤RNA新城雞瘟病毒可自強毒型或中間毒型溶瘤 137749.doc -10- 200936159
Rna新城雞瘟病毒獲得， 本發明之病毒可包含至少一個备 1U *由病毒感染之腫瘤細胞 表現時具有治療活性之其他轉殖基因。 該至少-個其他轉殖基因相對於宿主部分地為異基因或 同基因。 在本發明之另-態樣中，本發明之病毒可為減毒病毒。 ”減毒"包括減低病毒對鳥_種之致病性及減低具有預 測性之生物檢定系統對鳥類物種之致病性（參見實例5)。 本發明之另一態樣係一種相對於家禽減毒之重組溶瘤 RNA病毒，其包含含有至少一個編碼細胞激素之轉殖基因 的核酸。特定言之，病毒係相對於雞減毒。"編碼細胞激 素之轉殖基因"尤其為如本文中所述之”編碼鳥類細胞激素 之轉殖基因”。 此外’本發明係關於本發明之重組病毒之核鞘，其包含 與衣殼蛋白複合之病毒RNA。此外，本發明係關於一種 RNA，其為本發明之病毒之RNA。本發明亦係關於一種與 本發明之病毒之RNA互補的RNA。 此外，本發明係關於一種DNA，例如編碼本發明之rna 之cDNA及/或與本發明之rnA互補之DNA。此外，本發明 係關於預防或治療腫瘤疾病、癌症或/及增生性疾病。 本發明之RNA或/及DNA可以分離形式提供。 在本發明中’由如本文中所述之轉殖基因編碼之細胞激 素可自感染本發明之病毒之鳥細胞分泌，且結合至鄰近細 胞上之其適當干擾素受體後可在受體承載細胞中誘導抗病 137749.doc 200936159 毒狀態。因此，可至少部分地抑制本發明之病毒在經干擾 素刺激之鳥細胞中的複製。雞I型干擾素與哺乳動物I型干 擾素之間的相似性極低（在胺基酸水準上一致性小於25%) (Staeheli等人，2001)。因此，在鳥細胞中呈現該抗病毒作 用之細胞激素在人類細胞中基本上不展示生物活性且可能 對人類腫瘤細胞中之病毒複製基本上無影響。此外，預期 此等細胞激素在人類生物體中基本上不引起不良反應。
如本文中所述之編碼細胞激素之轉殖基因之表現導致病 毒對鳥類物種（尤其家禽，尤其雞）之致病性降低及因此減 弱之環境毒性。如本文中所述之編碼細胞激素之轉殖基因 之活性對病毒之治療作用基本上無不良影響。 【實施方式】 病毒 本發明大體係關於RNA病毒，較佳為負股RNA病毒，更 佳為具有溶瘤特性且可經遺傳工程化之該等病毒。該等病 毒為： -副黏液病毒，較佳為新城雞瘟病毒（NDv)、麻疹病毒、 腿腺炎病毒、仙台病毒（Sendai Virus); •正黏液病毒’較佳為流感病毒； -桿狀病毒，較佳為水泡性口炎病毒。 尤其為家禽之病 較佳地，本發明之病毒為鳥類病原體， 原體，更尤其為雞之病原體。 '、 地，本發明之病毒為負股RNA病毒。本發明之 組魏病毒可為副黏液病#，較佳為新域雞瘦病毒 137749.doc 200936159 間毒型； Α強毒型病毒株。NDV較佳為 本發明之病毒可自強毒型 —主丄、4 4 T間毋型溶瘤RNA新城雞瘟 病毋、尤其自病毒株ΜΤΗ68獲得。 本發明之病毒較佳具有複製能力。 尤其相對於可產生重組病毒之病毒，本發明之病毒對鳥 類物種可具有降低之致病性。
較佳地’在本發明之病毒中，致病性降低為以圆0.01 感染約48 h後、藉由増加細胞存活率所量測之病毒降低鳥 細胞溶解之能力，#中相對於可產生重組病毒之病毒，細 胞存活率增加至至少約25%(諸如至少約25%至多達約別％) 存活、.田胞t佳增加至至少約(諸如至少約至多達 約75%)存活細胞且最佳增加至至少約75%(諸如至少約75% 至多達100%)存活細胞。 亦較佳地，在本發明之病毒中，致病性降低為藉由平均
(NDV)。NDV可為中 中間毒型NDV。 死亡時間（MDT)測定所量測、n曰齡受精蛋中之病毒感染 雞胚的存活時間延長’其中與可產生重組病毒之病毒相 比’ MDT延長至少約15 h(諸如至少約15 h至長達約2〇h)， 更佳至少約20 h(諸如至少2〇 h至長達約30 h)且最佳延長30 h以上。 在另一實施例中，本發明之病毒對於人類腫瘤細胞之溶 瘤活性基本上不降低。 較佳地’在本發明之病毒中，在感染48 h後、藉由細胞 存活率所量測之病毒對人類腫瘤細胞之溶瘤活性與可產生 137749.doc -J3- 200936159 重組病毒之病毒相比降低不超過50%且更佳相對於可產生 重組病毒之病毒基本上不降低。 細胞激素 由至少一個如本文中所指示之轉殖基因編碼之細胞激素 ' 了為任何細胞激素。特定言之，細胞激素可為能夠至少部 ‘ 分地抑制鳥細胞、尤其家禽細胞、更尤其雞細胞中之病毒 複製的細胞激素。較佳地，病毒複製基本被完全抑制。 φ 細胞激素可為哺乳動物中、尤其人類中基本上無生物活 性之細胞激素。在本上下文中，"生物活性"尤其係指細胞 . 激素至少部分地抑制病毒複製、尤其本發明之病毒複製之 此力。"生物活性"亦指細胞激素可在非哺乳動物細胞或/及 非哺乳動物中呈現之任何其他活性。 細胞激素可為能夠至少部分地抑制鳥、尤其家禽、更尤 其雞中之病毒複製的細胞激素，且可在哺乳動物令、尤其 在人類中基本上無生物活性。 ❹ ㈣胞激素可選自鳥類細胞激素’尤其選自家禽細胞激 素’更尤其選自雞細胞激素。
細胞激素可選自干擾+ , #使、狂& A 丁馊京尤其選自鳥類干擾素’更尤其 選自雞干擾素，更尤其選自雞〗型干擾素。 干擾素可為干擾素·卩或干擾素家族之成員。 在一較佳實施例中，重組溶瘤RNA病毒為包含含有編碼 雞干擾素-α或/及雞干擾素-p之轉殖基因之核酸的丽。 轉殖基因 在贿基因組之情形下，轉殖基因定義為引入病毒基因 137749.doc 200936159 組中之其他核酸。核酸可選自不同基因組來源(例如， NDV基因組、不同病毒類別、原核或真核來源、哺乳動物 或非哺乳動物物種）。來自兩種或兩種以上不同基因組來 融合轉殖基因亦可。亦可基於核酸序列之重新合成構 . 築合成轉殖基因。核酸必須位於至少一個轉錄匣内。較佳 地’轉殖基因在受感染細胞中轉譯為蛋白質。因此，轉殖 基因序列應包括轉譯起始及終止密碼子。 0 本發明之重組溶瘤病毒可包含編碼至少一個其他轉殖基 因之核酸，該轉殖基因係獨立選自編碼結合蛋白、前藥轉 化酶及蛋白酶之轉殖基因。 至少一個其他轉殖基因較佳編碼當由病毒感染之腫瘤細 胞表現時具有治療活性之結合蛋白。 ，另一較佳實施例中，至少一個其他轉殖基因編碼當由 病毒感染之腫瘤細胞表現時具有治療活性之前藥轉化酶。 在另一較佳實施例中’至少一個其他轉殖基因編碼當由 Φ 病毒感染之腫瘤細胞表現時具有治療活性之蛋白酶。 除非另外說明，否則如本文中所用之”轉殖基因，，或"至 ^個轉殖基因係指編碼鳥類細胞激素之轉殖基因，或 至少一個當由病毒感染之腫瘤細胞表現時具有治療活性之 其他轉殖基因，或其組合。除非另外說明，否則，"轉殖 基因之此定義具體涉及如本文中所述之轉殖基因在病毒 基因組内之位置及數目。 本發明之RNA病毒、基因組、反基因組、核鞘及/或 DNA分子可包含可位於如本文中所述之轉錄匣内之如本文 137749.doc 200936159 中所述之轉殖基因。 本發明之重組溶瘤病毒可包含至少兩個、至少三個、至 少四個或至少五個各自包含如本文中所述之轉殖基因之核 酸。本發明之重組溶瘤病毒可包含最多5個各自包含如本 文中所述之轉殖基因的核酸。特定言之，本發明之重組溶 瘤病毒包含叫固、兩個、三個、四個或五個各自包含如本 文中所述之轉殖基因的核酸。若本發明之重組病毒包含至 少兩個轉殖基因’則其可相同或不同。 包含至少-個轉殖基因之核酸可位於該病毒基因閱讀框 架之間的任何位置。特定言之，包含至少一種轉殖基因之 核酸可位於N基因之5’端、N基因與p基因之間、p基因與m 基因之間、Μ基因與F基因之間、F基因與HN基因之間、 HN基因與L基因之間’或/及[基因之3，端。該核酸較佳位 於更靠近5,端之位置（諸如N基因之5，端）、N基因與p基因之 間或/及P基因與Μ基因之間，因為與更靠近3,端之定位相 比’該定位導致改良之表現。 較佳地’本發明之病毒呈現腫瘤選擇性感染，其導致如 本文中所述之轉殖基因之腫瘤選擇性表現。 本發明之重組RNA病毒可包含總共多達五個轉殖基因、 多達四個轉殖基因或多達三個轉殖基因。 在本發明中，編碼鳥類細胞激素之轉殖基因 或至少一 個由病毒感染之腫瘤細胞表現時具有治療活性之其他轉殖 基因’或其組合’較佳與本發明之重組RNA病毒所基於之 溶瘤RNA病毒異源。本文中所用之術語"異源•，係指完整基 137749.doc -16- 200936159 因或其一部分，可為該基因之編碼區或其一部分。 ;源核酸可為人造核酸，或可獲自天然來源，或可藉由 =個核酸（選自天㈣源獲得之核酸及/或人造核酸）重 :"天然來源"包括動物，諸如哺乳動物；植物；真 - 路及微生物，諸如細菌、原生動物及病毒，其可不同於 _ 本發明之溶瘤RNA病毒。 、 轉殖基因亦可編碼融合蛋白。 ❿ 在本發明之另—實施例中’編碼鳥類細胞激素之轉殖基 因^至少-個由病毒感染之腫瘤細胞表現時具有治療活性 t其他轉殖基因可位於至少兩個分_㈣單元上。 因：：：！包含含有至少一個編碼鳥類細胞激素之轉殖基 中因之核酸的轉錄單元亦可轉錄於如本文中所述之腫瘤細胞 且個包含含有至少一個當由病毒感染之腫瘤表現時 性之第二轉殖基因之核酸的轉 ❹於如本文中所述之鳥細胞ι 了轉錄 至少兩個分離的轉錄單元可各自轉錄於如本文中 腫瘤細胞中及在如本文中所述之鳥細胞中。 一替代性較佳實施例中，至少一個編碼鳥類細胞激素 之轉殖基因及至少-個當由病毒感染之腫瘤細胞表現時旦 有治療活性之其他轉殖基因轉譯於如本文中所述之通瘤2 胞中及在如本文中所述之鳥細胞中。 結合蛋白 在本發明之溶瘤重組驅病毒中，至少一個當由病毒感 137749.doc 17 200936159 染之腫瘤細胞表現時具有治療活性之其他轉殖基因可編碼 結合蛋白β 因此’本發明之目標為一種醫藥組合物，其包含本發明 之重組溶瘤病毒、本發明之病毒基因組、本發明之病毒反 基因組及/或本發明之DNA分子作為活性成份，以及視需 要之醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及/或佐劑，該病 毒、病毒基因組、反基因組及/或DNA分子包含至少一個 ❹ ❹ 編瑪結合蛋白、當由病毒感染之腫瘤細胞表現時具有治療 活性之其他轉殖基因。 結合蛋白為當表現於靶細胞中時能夠結合至該細胞及/ 或鄰近細胞之組份的蛋白質。較佳地，結合蛋白為結合至 細胞内組份之蛋白質。 在一較佳實施例中，結合蛋白選自由以下各物組成之群 組：天然配體、經遺傳修飾之配體、天然受體及其經修飾 型式之重組可溶性域、肽配體、多肽配體、抗體分子及其 片段及衍生物，及抗體樣分子（如錨蛋白重複蛋白）及其片 段及衍生物。
Ladner及 Ley(2001)給 述 如本文中所述之結合蛋白可來源於人類、鼠科動物或密 切相關者’或為嵌合型式’亦即可為包含來自不 (例如，人類及小鼠）之序列之融合蛋白的蛋白質。 基於以上說明之重組結合分子可為單體、二聚體 體、四聚體或多聚體。基於以上說明之重組結合分子；具 137749.doc -18- 200936159 單特異性、雙特異性或多特異性。 較佳結合蛋白係選自具有治療活性之結合蛋白。 如本文中所述之天然配體可為生長因子或肽。經遺傳修 飾之配體可為天然存在之生長因子或肽之類似物。 • 如本文中所述之天然受體或其經修飾型式之重組可溶性 域為細胞表面受體之重組表現可溶性細胞外域及/或其片 段、細胞黏附分子之重組表現可溶性細胞外域及/或其片 段。 、 如上文所提及之抗體分子可為具有任何已知特異性及同 種型之單株免疫球蛋白抗體、其片段及/或融合至效應蛋 白之其片&。抗體分子可為欲合、人類化或人類抗體。抗 體片段含有抗體之至少一個抗原結合域。抗體片段已詳盡 描述於文獻中（評述於例如AUen (2002)中，其以引用的方 式併入本文t)。較佳實例為單鏈Fv片段、Fab片段、 F(ab2’）、稱為微型抗體之域缺失型式及其他免疫活性蛋 φ 白、片段、區段，及其他更小或更大部分抗體結構，其中 後者具有足夠的靶向特性或免疫刺激或抑制活性以在本發 明之方法中具有治療實用性。 該等抗體可源自使用轉殖基因小鼠之融合瘤選殖實驗或 源自噬菌體呈現選擇、核糖體呈現選擇或含有人類抗體序 列之抗體文庫之集落過濾篩檢或相關方法。 具有如本文中所述之抗體樣特性之結合蛋白可為經遺傳 t飾之蛋白質或其域，其中一或多個肽環在胺基酸水準上 以疋方式隨機化以使得可藉由噬菌體呈現、核糖體呈 137749.doc -19· 200936159 ❹ ❹ 現、集落過濾筛檢或相關方法自該等分子之文庫中針對任 何抗原富集具有高特異性之高親和力結合分子。所選蛋白 質通常具有高的熱穩定性及熱力學穩定性且良好表現於重 組表現系統中，諸如大腸桿菌（E. CGli)、酵母、昆蟲及哺 乳動物表現系統β該等具有抗體樣特性之結合蛋白之實例 為如Binz等人（2004)所述之錨蛋白重複蛋白如咖 (2000)所述之脂質運載蛋白、如DE 199 32 _ 6中所述之 γ-晶體蛋白、如H〇gbc)m等人（2GG3)或黯d等人（2_所述 之經修飾蛋白A骨架（親和蛋白）或纖維結合蛋白構架及其 他蛋白。抗體樣分子可為構築為單鏈分子或多鏈分子之 體或重複分子’其中抗體樣分子具有足夠的靶向特性或免 疫刺激或抑制活性以在本發明之方法中具有治療實用性。 本發明之另-目標為—種治療增生性錢、尤其過度辦 生疾病（諸如腫瘤或癌症）之方法，其包含向有需要之個體 投與醫藥學上有效量之本發明之重組溶瘤病毒、本發明之 病毒基因組、本發明之病毒反基因組及/或本 該等物質包含至少—個如本文中所述之當由病毒感 =之腫瘤細胞表現時具有治療活性之編碼結 轉殖基因。 卉他 具有其他功能之結合分子 結合蛋白可為包含5 ,丨、 至少-個異源域之域（例如，來自抗體）及 因之情形下所討論之含義異源"具有如上文在異源基 上述結合蛋白能夠作為所謂胞内抗體或作為細胞外可用 137749.doc •20. 200936159 結合蛋白向疾病特異性位點（例如，腫瘤Μ專遞有效負載。 所傳遞之有效負載可為異源域，例如毒素，諸如人類核糖 核酸酶（De Lorenzo 等人，2004)(Zewe 等人，1997)、假單 胞菌外毒素（Chaudhary 等人，1989)(Kreitman 及 Pastan， 1995)(Batra等人，1992)、白喉毒素（Kreitman等人，1993) (Chaudhary等人，1990)(Batra等人，1991);或酶，諸如具 有治療功效之β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶（Roffler等人， 1991)(Wang等人，1992)(Bosslet等人，1992)、β-葡糖苷酶 (Rowlinson-Busza，1992)、叛肽酶（Antoniw等人，1990) (Bagshawe等人，1998)、β-内醯胺酶；或具有細胞激素活 性之免疫刺激蛋白，諸如IL-2、IL-12、TNF-α、IFN-β或 GM-CSF(例如參見Allen(2002)之評述）。 在另一實例中，上述結合蛋白本身具有有治療實用性之 拮抗或激動功效。拮抗/阻斷型結合分子之實例為VEGF抑 制性抗體阿瓦斯汀（Avastin)(Ferrara 等人，2004)、HER2/neu 受體阻斷抗體赫賽；丁（Herceptin)(Noonberg 及 Benz，2000) 或EGF受體阻斷抗體艾比特思（Erbitux)(Herbst及Langer， 2002)。激動型結合蛋白可為誘導（例如）細胞凋亡（Georgakis 等人，2005)或對DNA、RNA或蛋白質具有調控活性（例如， 誘導轉錄、穩定蛋白質）之結合蛋白。Adams及Weiner (2005) 之評述描述了亦可併入溶瘤病毒中之各種治療性抗體。 前藥轉化酶 在本發明之溶瘤重組RNA病毒中，至少一個當由病毒感 染之腫瘤細胞表現時具有治療活性之其他轉殖基因可編碼 137749.doc 21 200936159 前藥轉化酶。 别藥為治療活性化合物之衍生物或前驅體，其可經酶轉 化為/舌性化合物。前藥轉化酶為能夠將前藥轉化為治療活 性藥物之酶。 . 因此，本發明之目標為一種醫藥組合物，其包含本發明 • 之重組溶瘤病毒、本發明之病毒基因組、本發明之病毒反 基因組及/或本發明之DNA分子作為活性成份，以及視需 Φ 要之醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及/或佐劑，該病 毒、病毒基因組、反基因組及/或DNA分子包含至少一個 當由病毒感染之腫瘤細胞表現時具有治療活性之編碼前藥 轉化酶之其他轉殖基因。 醫藥組合物可進一步包含可經由該病毒、病毒基因組、 反基因組及/或DNA分子所編碼之前藥轉化酶轉化為治療 活性化合物之前藥。醫藥組合物可適用於治療及/或減緩 增生性病症。 φ 鈉藥可與作為活性成份之本發明之重組溶瘤病毒、本發 明之病毒基因組、本發明之病毒反基因組及/或本發明之 舰分子調配於單一組合物中，或可調配於與溶瘤病毒調 配物不同之組合物中。 若本發明之溶瘤重組RNA病毒編碼前藥轉化酶，則本發 明之溶瘤病毒促使通常不表現或不充分表現前藥轉化酶之 病毒感染靶細胞（尤其腫瘤細胞）選擇性表現前藥轉化酶。 因此，在治療有需要之個體期間，前藥在靶細胞、尤其腫 瘤細胞中特異性轉化為醫藥活性化合物，但在非乾細胞、 137749.doc •22· 200936159 尤其所治療之個體之健康細胞中基本上不轉化為治療活性 化合物。因此’與單獨治療活性化合物之治療相比，治療 活性化合物之不良副作用降低。 ’、 在本發明之上下文下，前藥可為適用於治療及/或減緩 * 增生性病症、腫瘤或/及癌症之治療活性化合物的衍生物 4前驅體’該前藥可由前藥轉化酶轉化。前藥可為熟習此 項技術者已知之化合物。衍生物及/或前驅體為熟習此項 技術者所知。 ❿ 前樂較佳基本上無醫藥活性及/或無毒性。 ▲本發明之前藥轉化酶之實例為卜葡料酸酶、β_半乳糖 #酶、β·葡糖㈣、叛肽酶、β_内醯胺酶、D•胺基酸氧化 酶。其他實例為熟習此項技術者所知。 ^圭地’前藥轉化酶基本上不表現於非腫瘤細胞中。 ⑴某轉化酶可獲自選自哺乳動物、植物、真菌及微生物 (諸如細菌、原生動物及病毒）之生物體。 e 前藥轉化酶與錢之最佳組合為大腸桿® μ糖《酶 與可藉由β-葡糖苷酸酶轉化為活性細胞毒性化合物之前 某實例為可轉化為阿黴素（doxorubicin)之HMR1826(阿黴 素-葡糖苷酸），阿黴素為用於治療癌症之已知化合物。 本發明之另一目標為一種治療增生性疾病 '尤其過度增 生疾病（諸如腫瘤或癌症）之方法，其包含向有需要之個體 才又與醫藥學上有效量之本發明之重組溶瘤病毒、本發明之 病毒基因組、本發明之病毒反基因組及/或本發明之 刀子’該等物質包含至少一個如本文中所述之編碼前藥轉 137749.doc •23- 200936159 化酶之其他轉殖基因。 特定言之’本發明之目標為—種治療增生性疾病、尤其 過度增生疾病（諸如癌症）之方法，其包含以醫藥學有效量 向有需要之個體投與： . (1)包含至少一個編碼前藥轉化酶之轉殖基因的本發明之 重組溶瘤病毒、本發明之病毒基因組、本發明之病毒 反基因組及/或本發明之DNA分子，及 ⑼適用於治療增生性疾病之前藥，該前藥可藉由⑴之前 藥轉化酶轉化為醫藥活性化合物。 . 該方法可包含投與包含組份⑴與（ii)之單一醫藥組合 物，或可包含投與兩種不同醫藥組合物，其一者包含組份 (i)且另一者包含組份（ii)。 蛋白梅 在本發明之溶瘤重組RNA病毒中，至少一個當由病毒感 染之腫瘤細胞表現時具有治療活性之其他轉殖基因可2碼 © 蛋白酶。 因此，本發明之目標為一種醫藥組合物，其包含本發明 之重組溶瘤病毒、本發明之病毒基因組、本發明之病毒反 基因組及/或本發明之DNA分子作為活性成份，以及視需 要之醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及/或佐劑，該病 毒、病毒基因組、反基因組及/或DNA分子包含至少一個 當由病毒感染之腫瘤細胞表現時具有治療活性之編碼蛋白 酶之其他轉殖基因。醫藥組合物可適用於治療及/或減緩 增生性病症。 > 137749.doc -24· 200936159 若本發明之溶瘤重組RNA病毒編碼蛋白酶，則本發明 溶瘤病毒可促使通常不表現或不充分表現蛋白酶之病毒^ 染靶細胞（尤其腫瘤細胞）選擇性表現蛋白酶。因此，在= 療有需要之個體期間，蛋白酶可使把細胞中之乾多肽不; 《地分裂’從而抑制靶細胞之增殖及/或生長或殺死靶細 • &，但在㈣細胞、尤其所治療之個體之健康細胞中基本 上不使乾分子分裂。藉由此策略降低蛋白酶治療之不良副 作用。 田 蛋白酶較佳為序列特異性蛋白酶。特異性分裂靶多肽的 , 蛋白酶更佳。蛋白酶可為天然來源且可源自任何物種或其 m程化。適用於特異性分裂預定靶多肽之胺基酸序列 可由熟習此項技術者（例如）基於公開可獲得之序列資料庫 來判疋。US 2005-0175581 及 US 2004-0072276 描述具有預 定受質特異性之蛋白質工程化蛋白酶的產生。此兩份文件 以引用的方式併入本文中。 〇 蛋白酶之靶分子可為如下文針對結合蛋白之標靶所述之 任何分子。 本發明之另一目標為一種治療增生性疾病、尤其過度增 • 生疾病（諸如腫瘤或癌症）之方法，其包含以醫藥學有效量 向有需要之個體投與本發明之重組溶瘤病毒、本發明之病 t基因組、本發明之病毒反基因組及/或本發明之DNΑ分 子’該等物質包含至少一個當由病毒感染之腫瘤細胞表現 時具有治療活性之編碼蛋白酶之其他轉殖基因。 本發明之轉殖基因可編碼如上文所定義之前藥轉化酶、 137749.doc -25· 200936159 如上文所定義之結合分子與/或如上文所定義之蛋白酶之 融合蛋白。尤其較佳為前藥轉化酶與結合分子之融合蛋白 或蛋白酶與結合分子之融合蛋白。 治療性應用 本發明係關於一種醫藥組合物，其包含如本文中所述之 病毒、病毒核鞘、病毒基因組或編碼基因組之DNA分子或/ 及病毒反基因組作為活性成份，以及視需要之醫藥學上可 ❿ 接受之載劑、稀釋劑及/或佐劑。 醫藥組合物可以溶液、懸浮液、凍乾劑或任何其他合適 形式提供。除活性成份之外，組合物亦可包含如此項技術 中已知之載劑、緩衝劑、界面活性劑及/或佐劑。組合物 可（例如）經口、局部、經鼻、經肺或藉由局部或靜脈内注 射來投與。視病症類型、患者病況及體重、投藥途徑等而 定，以醫藥學有效量投與醫藥組合物。較佳地，每次施用 投與1〇9至1〇12個病毒顆粒，1〇8至10"、1〇7至1〇1❹或1〇6至 ο ι〇9個病毒顆粒。溶瘤療法可視情況與其他腫瘤療法組 合，該等療法諸如手術、放射及/或化學療法（諸如環磷醢 胺治療及/或高熱治療）。 另一態樣為一種治療增生性疾病或/及癌症之方法，其 包含以醫藥學有效量向有需要之個體投與如本文中所述之 重組溶瘤病毒、病毒核鞘、病毒基因組或編碼基因組之 DNA刀子或/及病毒反基因組，以及視需要之醫藥學上可 接受之載劑、稀釋劑及/或佐劑。 根據本發明，重組溶瘤副黏液病毒可表現可保留於感染 137749.doc •26- 200936159 細胞中或可被分泌的可溶性結合蛋白、前藥轉化酶及/或 蛋白酶，諸如抗體、抗體片段、錨蛋白重複蛋白或如下文 所說明之其他結合分子。 ❹
以NDV為例’本申請案中選擇病毒株MTH68的原因在於 其具有固有溶瘤特性，具有來自患者實驗性臨床治療之令人 期望之資料（Sinkovics及Horvath，2000)。然而，原則上大 多數具有多鹼基融合蛋白分裂位點之NDV病毒株均可用作 治療腫瘤之溶瘤劑《反向遺傳學技術適用於所有病毒株。 如本文中所述之結合蛋白已證明具有高治療潛力。 溶瘤NDV與具有上述特性之治療性結合蛋白、前藥轉化 酶及/或蛋白酶之組合將具有兩種治療成份之相加或甚至 協同功效。溶瘤性自我複製病毒使結合蛋白藥物、前藥轉 化酶及/或蛋白酶靶向於其受高局部濃度原位表現之較佳 作用位點。預期該蛋白質表現極具選擇性且具有各別作用 模式之結合蛋白、前藥轉化酶及/或蛋白酶將增加NDy之固 有治療溶瘤活性。基於所用病毒有複製能力之性質及在腫 =胞中之選擇性複製，預期經表現轉殖基因[結合蛋白' 前藥轉化酶及/或蛋白酶]之量與腫瘤質量大致成比例。 抗體分子或抗體樣分子或料生物為與贿系統—起使 用之理想結合蛋白。抗體分子已為深入研究之目標且目前 已有可用技術來產生無免疫原性、極具選擇性且具有高親 和力之抗體分子。抗體分子受高濃度之局部表現導致極顯 者的激動或拮抗功效或效應分子之有縣向，與標準療法 相比具有降低的毒性概況。 ’、 137749.doc -27- 200936159 預期在NDV系統中使用抗體樣分子將更為優良。此等分 子係針對選擇性高親和力結合來設計，與普通抗體相比具 有極n熱穩定性及產率。在基於錨蛋白之抗體樣分子之情 況下’可根據優化㈣、結合、抑制或活化之各別目標調 整分子之重複性質。亦可在-個錯蛋白分子内組合不同結 合特異性，從而開拓將具有不同結合特異性之數個單元接 合於-個錫蛋白重複序列分子中的可能性。與可用於抗體
之蛋白質表面相比，此模組化結構允許更大蛋白質表面之 多價結合，此對於阻斷蛋白質-蛋白質相互作用極為重 要。亦可開發僅以-個單阻斷性錨蛋白重複蛋白阻斷數個 效應子的模組化結構。 由於錫蛋白重複分子甚至在還原條件下亦極為穩定因 此此等分子可設計成靶向細胞内蛋白質("胞内蛋白")。 亦可使用結合蛋白編碼序列之文庫與NDV進行活體内標 靶識別。 $ ❹ 結合分子或/及蛋白酶之可能標乾 白或/及蛋白酶識別且與特定類型之 細胞或靶細胞周圍細胞外基質之所有纟士構 結構蛋白、酶、生長因子、生長因子受體 因子等。 可為可由所述結合蛋 病理表現型相關的靶 此等結構可為 整合素、轉錄 之標靶（蛋白質·蛋白 本發明甚至可針對小分子不可藥化 質相互作用、DNA結合等）。 如本文中所述之溶瘤NDV與治療性結合蛋白、前藥轉化 酶及/或蛋白酶之組合可望用於治療發炎性疾病(例如，風 137749.doc -28- 200936159 濕性關節炎）及癌症。 對於治療癌症而言，可無向造成癌症發展之所有路徑。 此等路徑為：生長信號之自《、對生長抑制(抗生長)信號 不敏感性、逃避細胞凋亡、無限複製潛力、持續血管新生 及組織侵襲及轉移。此等路徑概述於Hanahan及Weinb^g (2000)中。涉及腫瘤發生過程且可由所述方法靶向之信號 傳導路徑為受體酪胺酸激酶路徑（RTK)、RB&p53路徑、 細胞凋亡路徑、APC路徑、HIF1路徑、GLI路徑、PI3K路 徑及SMAD路徑。此等信號傳導路徑詳細說明於v〇geistein 及 Kinzler (2004)中 ° 所述結合蛋白可干擾之其他信號傳導路徑為ras、臂加及 刺螺因子（Hedgehog)路徑，其中例如可阻斷蛋白質.蛋白質 相互作用。 有益干預癌細胞中上述路徑之結合蛋白之實例為： -自主活性生長因子受體（例如EGFR、Met)之阻斷蛋白 -生長因子之競爭結合劑（拮抗劑） -Rb-碌酸化之阻斷蛋白 -E2F依賴性轉錄之阻斷蛋白 -P53穩定劑 •抗細胞凋亡蛋白（例如Bcl-2)之拮抗結合劑 -細胞週期素（cyclins)之拮抗結合劑 -Ras效應子（例如GEFs)之拮抗結合劑 -缺氧誘導蛋白（例如HIFla)之拮抗結合劑 -干擾二聚化、DNA結合或/及輔助因子結合之轉錄因子 137749.doc • 29· 200936159 (例如Myc/Max)之抑制劑 -分化誘導劑 -smad信號傳導/易位之抑制劑 -細胞黏附相互作用（飼黏素（cadherins)、整合素，例如 α5β1、ανβ3)之抑制劑 -降解細胞外基質之酶（例如MMPs)之抑制劑 '促血管新生（proangiogenic)配體（例如可溶性VEGF-R)之 拮抗結合齊lj -有絲分裂激酶（例如Plk-1)之抑制劑 • •促血管新生受體之拮抗結合劑 -骨架複合物形成（例如KSR/Ras)之抑制劑 -轉譯起始（eIF4E、EIF2a)之抑制劑。 本發明之蛋白酶、前藥轉化酶及/或由本發明之前藥經 前藥轉化酶衍生的治療活性化合物亦可有益地干預癌細胞 之上述路徑。 p 重組病毒 重組病毒意謂在基因組RNA序列中具有工程化限定改變 之病毒。此改變可為一或多個插入、缺失、點突變或其組 合。 本發明之重組RNA病毒可包含天然（未經修飾）rna病毒 之全長基因組序列或其衍生序列且可另外包含至少一個重 、·且轉錄h該至少—個轉錄g可位於病毒基因組之兩個基 因（轉錄單元）之間。在此情況下，該至少-個轉㈣側接 轉錄起始及終止序列。該至少一個轉錄昆亦可位於病毒基 137749.doc •30· 200936159 因組之轉錄單元内。在此情況下’不需要其他轉錄起始及 終止序列。 該至少一個轉錄匿可包含可為單一的限制位點，諸如
Pacl或/及AscI。若存在兩個轉錄匡，則其可包含不同限制 . 位點。 本發明之RNA病毒較佳包含一或兩個重組轉錄匣。 可編碼如本文中所述之結合蛋白、前藥轉化酶及/或蛋 ❹ 白酶之轉殖基因位於本發明之至少一個轉錄匣中。 病毒基因組中每兩個基因（轉錄單元）之間的任何基因間 - 區域適於至少一個重組轉錄匣引入。若存在一個以上重組 轉錄匣，則其可位於相同或不同的基因間區域中。至少一 個重組轉錄匣較佳位於病毒F與HN基因之間，尤其本發明 之RNA病毒為重組新城雞痙病毒時。 對於副黏液病毒基因組之尺寸無已知上限。因此，對於 引入本發明之重組RNA病毒中之轉殖基因之數目及尺寸無 ❹ 上限。轉殖基因（如本文中所述，編碼鳥類細胞激素之轉 殖基因，或至少一個當由病毒感染之腫瘤細胞表現時具有 治療活性之其他轉殖基因，或其組合）較佳獨立地具有至 多約10 kb、更佳至多約5 kb、最佳至多約2 kb之尺寸。 在如本文中所述之轉殖基因之表現（包括病毒RNA轉錄 為mRNA及mRNA之轉譯）中，使用表現控制序列，諸如轉 錄起始及終止序列及控制轉譯之序列。可使用RNA病毒之 表現控制序列，該RNA病毒可為本發明之重組RNA病毒所 基於之RNA病毒。特定言之，轉錄起始及終止序列可獲自 137749.doc •31 . 200936159
Rna病毒。表現控制序列（尤其控制轉譯及/或蛋白質轉運 之序列）亦可獲自靶細胞。 基因組或反基因組RNA因副黏液病毒之複製機制而一般 不以裸RNA呈現。基因組及反基因組RNA係與核蛋白一起 組裝。因此，本發明之另一目標為一種本發明之重組溶瘤 ,RNA病毒之核鞘。核鞘包含編碼RNA病毒之基因組或/及 反基因組之RNA分子及核鞘蛋白。核鞘亦可包含聚合酶蛋 白L或/及鱗蛋白ρβ 本發明之目標亦為如本文中所述之本發明之基因組之反 基因組。 本發明之另一態樣為一種DNA分子，其編碼本發明之重 組溶瘤RNA病毒之基因組或/及反基因組。DNA分子可為 質體。本發明之DNA分子可用於本發明之RNA病毒之遺傳 工程化。此外，DNA分子亦可用於製造本發明之RNA病 毒。因此’ DNA分子彳經操作性地連接至轉錄控制序列， 例如原核或真核轉錄控制序列。 本發明之另一態樣為一種製造由編碼本發明之重組溶瘤 病毒（尤其本發明之重組溶瘤NDV)之基因組及/或反基因組 之DNA分子所表現之重組溶瘤RNA病毒之方法。 本發明之另一態樣為一種細胞，其包含本發明之重組溶 瘤病毒、本發明之病毒基因組、本發明之病毒反基因組及/ 或本發明之DNA分子。該細胞可為原核細胞或真核細胞。 該細胞可為細胞株’尤其為哺乳動物細胞株，更尤其為人 類或鼠科動物細胞株。該細胞可用於製造本發明之RNA病 137749.doc •32· 200936159 毒的本發明之方法中。適用於轉錄DNA分子之系統為熟習 此項技術者所知’例如原核系統（諸如大腸桿菌）或真核系 統（諸如海拉細胞（HeLa)或CHO)。 另一態樣為一種溶瘤RNA病毒、其基因組或反基因組或 . DNA分子，該溶瘤RNA病毒、其基因組或反基因組*dna 分子包含副黏液病毒之全套基因或副黏液病毒之一組基 因’其中至少一個基因或基因間區域經遺傳修飾，且進一 ❹ 步包含至少一個如本文中所述之重組轉錄匣。該病毒、基 因組或反基因組或DNA分子可用於製造藥劑及/或治療癌 • 症。該RNA病毒、基因組、反基因組或DNA分子適用於藉 • 由遺傳工程化技術構築重組副黏液病毒，尤其重組新城雞 痙病毒，以將重組序列引入轉錄匣中。為此，至少一個轉 錄匣可包含限制位點《若存在一個以上轉錄匣，則轉錄匣 之單一限制位點可不同。一實例為w〇 2〇〇6/〇5〇984之圖i 之質體pflMTH68—ASC_PaC ’該案之揭示内容以引用的方 φ 式併入本文中。另一實例為如WO 2006/050984之圖2中所 揭示之Ρ·ΤΗ68鼠科IgG EDB，該案之揭示内容以引用的 方式併入本文中。 治療相關性 癌症或/及腫瘤之治療包括抑制腫瘤生長，較佳藉由感 染殺死腫瘤細胞或阻斷間隙期内之增殖。NDv選擇性複製 於腫瘤細胞中。 本發明之病毒可用於治療增生性病症，尤其過度增生病 症。較佳地，可用所述病毒治療贅瘤，較佳選自由肺癌、 137749.doc -33· 200936159 結腸癌、前列腺癌、乳癌及腦癌組成之群的癌症。 更佳可治療實體腫瘤。 更佳可治療具有低增生速率之腫瘤。具有低增生速率之 腫瘤之實例為前列腺癌或乳癌。 更佳可治療腦腫瘤。 更佳可治療神經膠母細胞瘤。 哺乳動物包括人類、小鼠及大鼠。 重組RNA病毒之製造 ® 本發明之重組RNA病毒、尤其重組NDV可如Romer-
Oberdorfer等人（1999)所述來構築。在cDNA水準上構築新 核酸序列，接著在真核細胞中使用以下起始質體將其轉譯 為 RNA : pCITE P、pCITE N、pCITE L、ρΧ8δΤ flNDV。 NDV可為新城雞瘟病毒之任何病毒株，更佳為其野生型 具有溶瘤性之病毒株。 質體 ρΧ8δΤ描述於 EP 0 702 085(Conzelmann KK)中。 π 本發明之重組RNA病毒、尤其重組NDV最初可自T7聚合 ❹ 酶表現細胞（例如ΒΗΚ Τ7細胞或經Τ7聚合酶瞬時轉染之 CHO細胞）中回收。其可擴增於如293、CEC32、ΗΤ29或 Α431之細胞中。其亦可擴增於受精雞蛋之尿囊液中。 重組RNA病毒、尤其重組NDV在以下條件下儲存。重組 RNA病毒、尤其NDV在5% D-甘露糖醇/l%(w/v)L-離胺酸/ pH 8.0或標準細胞培養基中： 在-20°C下穩定長達1個月； 在-80°C下穩定長達10年。 137749.doc -34- 200936159 本發明之重組RNA病毒可使'用野生型病毒或重組病毒作 為起始物質來製造。亦可使用核酸，諸如DNA，包括該野 生型或重組序列。舉例而言，可使用如WO 2006/050984中 所述之重組RNA病毒或/及DNA分子作為起始物質。一實 例為 WO 2006/050984之圖 1之質體pflMTH68—Asc_Pac。另 一實例為 WO 2006/050984 之圖 2 之 pflMTH68 鼠科 IgG EDB。WO 2006/050984之揭示内容以引用的方式併入本文 中。特定言之，WO 2006/050984中有關重組溶瘤RNA病毒 及其構築之揭示内容以引用的方式併入本文中。 重組NDV作為藥劑之用途 本發明之重組RNA病毒、尤其本發明之經純化重組NDV 因其展示藥理作用而可用作藥劑。 本發明之重組RNA病毒（尤其本發明之NDV)、病毒基因 組、反基因組、核鞘及/或DNA分子可用於製造藥劑，該 藥劑尤其用於預防、減緩或/及治療癌症、腫瘤或/及增生 性疾病，尤其用於預防、減緩或/及治療癌症，諸如肺 癌、前列腺癌、腦癌、結腸癌、乳癌。 本發明之醫藥組合物視情況包含醫藥學上可接受之載劑 及稀釋劑。該等載劑及稀釋劑描述於Remington's Pharmaceutical Science，第 15版，Mack Publishing Company， Easton Pennsylvania (1980)中。視治療適應症而定，該醫 藥組合物中所用或/及本發明之治療方法中所用之病毒效 價可在每劑109至1〇12 pfu之範圍内，在1〇8至1011 pfu之範圍 内，在107至1010pfu之範圍内或在1〇6至l〇9pfu之範圍内。 137749.doc •35- 200936159 本發明之醫藥組合物可用於預防或/及治療增生性病 症，諸如癌症。 本發明之醫藥組合物可包含本發明之重組溶瘤RNA病 毒、尤其本發明之NDV之乳液且可藉由吸入、靜脈内輸 液、皮下注射、腹膜内注射或腫瘤内注射來投與。
在本發明之預防或/及治療增生性病症（尤其癌症）之方法 中，醫藥學有效量為本發明之溶瘤RNA病毒（尤其本發明 之NDV)、本發明之病毒基因組或本發明之DNA分子預 防、減緩或/及抑制疾病之效價。 對於治療作用而言，可接受劑量可視（例如）構築體、患 者、投藥途徑及癌症類型而定。 個體（患者）較佳為哺乳動物，更佳為人類患者。 藉由以下圖式及實例進一步說明本發明。 實例1 :
形成具有引起難細胞激素之表現之烏類源轉殖基因之重組 NDV 使用NDV之溶瘤病毒株MTH68獲得病毒RNA。使用RT-PCR獲得數個cDNA片段且以多步選殖程序將其組裝為全 長基因組cDNA，將其選殖入載體pX8ST(Schnell等人， 1994)中而產生質體pflMTH68。此載體可用於轉染以自T7-聚合酶表現細胞株中救出重組病毒。 另一轉錄匣選殖於NDV MTH68(pflMTH68)之全長基因 組質體内、編碼F蛋白與HN蛋白之基因之間、單一 Sfil限 制位點内。將兩個DNA寡核苷酸： 137749.doc -36- 200936159
Sfi ^ (5'-aggccttaattaaccgacaacttaagaaaaaatacgggtagaacggcctgag-3，，SEQ. ID. NO: 1)與
Sfi 後（5’-aggccgttctacccgtattttttcttaagttgtcggttaattaaggcctctc-3’， SEQ. ID. NO: 2) 黏接且隨後接合於pflMTH68之Sfil位點内。 藉由 PCR 擴增編碼 ChIFN-a(NM_205427)及 ChIFN-β (NM_001024836)之兩個DNA轉殖基因。使用Schultz等 人，1995及Sick等人，1996所述之ChIFN-α及ChIFN-β表現 構築體作為聚合酶鏈反應之模板。對於擴增ChIFN-a轉殖 基因而言，使用以下引子對：ChIFN-a fw(5.'-ccttaattaagcc accatggctgtgcctgcaagccc-3' SEQ· ID. NO: 3)及 ChIFN-a-rev (5'-ccttaattaactaagtgcgcgtgttgcctgtg-3’ SEQ. ID. NO: 4)，且 對於擴增ChIFN-β編碼序列而言，使用以下兩個引子：PacI ChIFN-β fw(5'-ccttaattaacgcaccatgactgcaaaccatcagtctccagg-3' SEQ. ID· NO: 5)及 ChIFN-P_rev(5'-ccttaattaatcactgggtgttgag acgtttggatg-3' SEQ. ID. NO: 6)。 將兩個chIFN轉殖基因之每一者分別選殖入質體 pflMTH68Pac之PacI位點内。將基因組總長調整為6的倍數 以遵循病毒基因組長度之"6位規則"。藉由核苷酸定序確 認ChIFN-β插入物之序列一致性。在ChIFN-α插入物中，與 序列NM_205427相比，偵測到位置89處之一核苷酸交換（G 交換為A)。藉由標準病毒拯救技術自經含有ChIFN-α(圖1) 或ChIFN-β(圖2)基因之全長病毒基因組質體感染的T7表現 細胞中救出重組病毒。將所得表現ChIFN-a之病毒命名為 137749.doc -37- 200936159 NDV-ChIFN-α且將表現 ChIFN-β之 NDV命名為 NDV-ChlFN-β。將病毒在組織培養物或雞蛋之尿囊液中培養以產生高 效價。 實例2 : 由重组NDV所表現之ChIFN-α及ChIFN-p具有生物活性 材料及方法： 將CEC-32細胞（鳥類鵪鶉細胞株）或海拉細胞（子宮頸癌 細胞株）以lx 105個細胞/孔接種於6孔培養盤中。在黏附 後，用表現GFP之對照病毒NDV-GFP、NDV-ChIFN-a、 NDV-ChIFN-β 或 MOCK使用 MOI 0.01感染細胞。64 h後， 收集上清液且藉由UV照射滅活感染性病毒顆粒》 為證明病毒感染之細胞之上清液中之ChIFN-a或ChIFN-β 之生物活性’使用雞干擾素特異性生物檢定（Schwarz等 人’ JICR, 2005) ^該檢定係基於載有由IFN反應性雞Mx啟 動子所控制之螢光素酶基因的經穩定轉染之鵪鶉細胞株 CEC-511。當將CEC-511指示細胞與ChIFN-α或ChIFN-β — 起培育時，誘導螢光素酶活性。為執行此檢定，將15,000 個CEC-5 11細胞接種於96孔培養盤中。接種24 h後，將細 胞用具有病毒感染之海拉細胞或CEC-32細胞之經UV處理 的上清液處理。將細胞用75 μΐ經1:100稀釋的各別上清液 培育。作為陽性對照，將細胞用經ChIFN-a或ChIFN-β之表 現質體轉染之293T細胞之1:1000稀釋上清液（sick等人， 1996)培育或僅用培養基培育。6 h培育時間後，遵循製造 商所提供之方案執行Steady-Glo®螢光素酶檢定（Promega)。 137749.doc -38 - 200936159 為測定平均值，各資料點重複量測三次。 結果： 感染 64 h 後，經 NDV-ChIFN-α 及 NDV-ChIFN-β 感染之 CEC-3 2及海拉細胞之上清液對CEC-511細胞具有強螢光素 酶誘導活性，從而表明病毒介導所感染之細胞表現ChlFN-α及ChIFN-β。相比而言，經MOCK感染之細胞或經表現 GFP之對照病毒感染之細胞的上清液未展示針對CEC-5 11 指示細胞株之螢光素酶誘導活性。含有重組ChIFN-α或 ❹ ChIFN-β之1:1000稀釋上清液亦展示ChIFN依賴性Mx啟動 子誘導活性。 表1 :經表現ChIFN-a或ChIFN-β之重組NDV感染之CEC-32及海拉細胞之上清液中之干擾素活性。量測載有Mx啟 動子控制之螢光素酶報導基因的指示細胞中之IFN反應。 量測值以相對螢光素酶計數給出。 CEC-32 NDV-GFP NDV-ChlFN- a NDV-ChlFN- 3 MOCK 平均偉 308 11991 8033 246 標準偏差 86 283 423 27 海拉細胞 NDV-GFP NDV-ChlFN- a NDV-ChlFN- 3 MOCK 平均值 237 11739 5095 290 標準偏差 19 1835 78 39 ChIFN-a ChIFN-β 培養基 平均值 4849 2128 237 標準偏差 107 15 21 137749.doc -39- 200936159 實例3 : 經表現ChIFN-α或ChIFN-p之重組NDV感染之烏類細胞免 於病毒溶解而腫瘤細胞不免於病毒溶解 材料及方法： 3 a·)將CEC-32細胞（鳥類鵪鶉細胞株）或海拉細胞（子宮 頸癌細胞株）以1χ1 〇5個細胞/孔接種於6孔培養盤中。在黏 附後，用對照病毒 NDV-GFP、NDV-ChIFN-α、NDV-ChIFN-β或MOCK使用MOI 0.01感染細胞。48 h後，將細胞 ® 4%甲醛溶液固定且用吉姆沙（Giemsa)溶液染色。隨後使用
Zeiss Axiophot成像系統執行攝像記錄。 3 b·)將CEC-32細胞（鳥類鵪鶉細胞株）或海拉細胞（子宮 頸癌細胞株）以15,000個細胞/孔接種於96孔培養盤中。在 黏附後，用對照病毒 NDV-GFP、NDV-ChIFN-α、NDV-ChIFN-β或MOCK(=未經感染）使用MOI 0.01感染細胞。48 h培育時間後，遵循製造商所提供之方案執行CellTiter- ©Glo®蝥光素酶檢定（Promega)以量測細胞存活率。為測定 平均值，各資料點由6個獨立值產生。 結果： 圖3. a) 48 h後，鳥類CEC-32細胞被表現GFP之NDV (NDV-GFP)溶解。相比而言，經表現ChIFN-α之病毒感染 之細胞部分地免於溶解。經NDV-ChIFN-a感染之CEC-32單 層25-50%完整。更強之保護見於表現ChIFN-β之NDV。48 h後，CEC-32單層幾乎90-100%完整且免於病毒溶解。此 單層之密度與經MOCK感染之CEC-32細胞之單層類似。 137749.doc -40- 200936159 三種病毒對致瘤性海拉細胞株之感染展示病毒NDV-GFP、NDV-ChIFN-α與NDV-ChIFN-β之間類似的溶瘤活 性。48 h後，經NDV-GFP、NDV-ChIFN-a或 NDV-ChIFN-β 感染之海拉細胞之單層幾乎被完全破壞。吉姆沙染色細胞 . 之藍色指示，經MOCK感染之海拉細胞之細胞單層完整。 圖3 b)在第二個實驗中，在表現ChIFN之NDV感染48 h 後量化細胞存活率。經NDV-GFP感染之鳥類CEC-32細胞 展示僅3%剩餘細胞存活率。在經NDV-ChIFN-a感染之 ❹ CEC-32細胞中，剩餘細胞26%完整。CEC-32鵪鶉細胞株經 NDV-ChIFN-β感染48 h後，94°/。細胞存活且免於病毒溶 解。 相比而言，致瘤性海拉細胞株經三種病毒NDV-GFP、 NDV-ChIFN-a或NDV-ChIFN-β感染後，觀察到細胞破壞幾 乎無任何差異。48 h後，對於所有三種病毒，細胞存活率 值均在3%-9%之間，表明腫瘤細胞幾乎完全破壞。 ❹ 實例4 : 表現ChIFN-a或ChIFN-p之重組NDV對踵瘤細胞而不對原 代細胞選擇性溶瘤 材料及方法： 將5000個原代纖維母細胞或3000個海拉細胞接種於96孔 培養盤之各孔中。接種16 h後，製備NDV-GFP病毒稀釋液 (NDV-GFP)、NDV-ChIFN-a病毒稀釋液（NDV-ChIFN-a)及 NDV-ChIFN-β病毒稀釋液（NDV-ChIFN-β)。將纖維母細胞 用指定濃度病毒感染。作為陰性對照，纖維母細胞經 137749.doc -41 - 200936159 MOCK感染。1 h後，移除接種體，將細胞用PBS洗滌且在 細胞培養恆温箱中用200 μΐ細胞培養基培育4天。隨後，將 剩餘細胞用4%甲醛溶液固定且用結晶紫（crystal violet)染 色。使用10%冰醋酸溶解色斑且以ELISA閱讀器、在595 nm下量測各孔之吸光度。 結果： 感染4天後，使用MOI 0.001至MOI 0.1之間的MOI、經 三種病毒 NDV-GFP、NDV-ChIFN_a及 NDV-ChIFN-β感染之 原代纖維母細胞幾乎未展示增殖抑制（圖4)。增殖抑制之初 始跡象僅在每個細胞使用1或10個病毒顆粒感染之MOI下 觀察到。相比而言，在MOI 0.001與MOI 10之間的MOI下 感染之致瘤性海拉細胞展示極強的增殖抑制。此結果表明 重組NDV尤其在如MOI 0.1及MOI 0.001之低MOI下具有極 佳治療窗，在該等MOI下量測到對原代細胞幾乎無溶解作 用而量測到對致瘤性海拉細胞中具有極強的生長抑制作 用。在腫瘤細胞及原代細胞之殺死曲線形狀方面，觀察到 對照病毒NDV-GFP與表現ChIFN之病毒NDV-ChIFN-a及 NDV-ChIFN-β之間無差異。 實例5 : 經表現ChIFN-a或ChIFN-P之重組NDV感染之難胚的存活 時間延長 材料及方法： 分別用 NDV-ChIFN-a、NDV-ChIFN-β、NDV-GFP或非致 病性NDV病毒株LaSota感染15個11日齡受精雞蛋之群組。 137749.doc -42- 200936159 使用經無菌PBS稀釋之尿囊液中之蛋生長病毒作為感染物 質。施用200 μΐ總體積中4000 PFU之感染劑量。將接種體 注射入尿囊腔中。感染後，將蛋在蛋孵化箱（breader)中、 在37°C及50%-60%濕度下培育。每天兩次、在指定時點 (圖5)對光檢查蛋且檢查胚胎的生命跡象。此檢定允許藉 由比較受感染胚胎之存活時間來比較不同NDV病毒株之 致病性。該方法係基於R.p. Hans〇n(1980)所述之"最小致 死劑量之平均死亡時間（MDT/MLD)"測定。此方案修改 成，將病毒原液之非連續稀釋液接種於蛋中’而非以高於 最小致命劑量之濃度注射一劑限定病毒劑量。出於倫理原 因，此檢定修改減少測試所用胚胎數目° MDT由下式測 定：
MDT=((X hr之死亡數）x(x hr) + Y hr之死亡數）My hr>等V 總死亡數 結果： 與經NDV-GFP感染之胚胎相比’經NDV-chIFN-a及 NDV-ChIFN-β感染之雞胚的存活提高。經NDV-GFP感染之 受精蛋在24 h與62 h之間喪失生命跡象，得到50 h之 MDT(平均死亡時間）。經NDV-ChIFN-a感染之胚胎存活長 達96 h，具有69 h之MDT計算值。對經NDV-ChIFN-β感染 之胚胎量測到類似存活時間及74 h之MDT。經NDV-ChIFN-β感染之胚胎大多數在48 h與96 h之間死亡。檢定靈 敏度藉由使用無致病性或弱毒型病毒株LaS〇ta指示。甚至 經NDV LaSota病毒株接種之受精蛋在62 11至115 h之間死 137749.doc • 43· 200936159 亡，具有85 h之MDT計算值。此實驗展示中間毒型NDV MTH68之MDT向弱毒型NDV病毒株偏移。 參考文獻
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Zhao，H.及Peeters, B.P· (2003) Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication. J Gen Virol, 84, 781-788· 【圖式簡単說明】 圖1描述包含NDV之全基因組及一個包含雞干擾素-a(ChlFN-a)轉殖基因之轉錄匣的質體pflMTH68 ChIFN-α。 囷2描述包含NDV之全基因組及一個包含雞干擾素-P(ChlFN-P)轉殖基因之轉錄匣的質體pflMTH68 ChIFN-β。 圖3a展示鳥類CEC-32細胞株在NDV-ChIFN-α感染48 h後 部分地免於溶解且在NDV-ChIFN-β感染後受到強保護。表 現GFP之NDV感染完全破壞CEC-32單層。相比而言，在感 染致瘤性海拉細胞株後，三種病毒NDV-GFP、NDV-ChIFN-α與NDV-ChIFN-β之間未見溶解作用差異。與所用 病毒無關，海拉細胞單層在感染48 h後完全破壞。 圖3b定量展示CEC-32及海拉細胞經病毒NDV-GFP、 NDV-ChIFN-α及NDV-ChIFN-β感染48 h後之細胞存活率。 137749.doc -53- 200936159 經NDV-GFP感染後，觀察到CEC-32細胞幾乎被完全殺 死，僅3%細胞存活。鵪鶉細胞經NDV-ChIFN-α感染後， 感染細胞26%保持存活。經NDV-ChIFN-β病毒感染後觀察 到最佳保護，CEC-32細胞96%存活。相比而言，與所用重 組NDV無關，感染48 h後致瘤性海拉細胞之存活率降低至 10%以下。 圖4展示大治療窗存在於腫瘤細胞及纖維母細胞經NDV-ChIFN-α 及 NDV-ChIFN-β感染後。溶瘤病毒NDV-ChIFN-a 及NDV-ChIFN-β對腫瘤細胞之增殖抑制作用極強且相比而 言，原代纖維母細胞尤其在如MOI 0.1及〇.〇1之低MOI下感 染後，觀察到幾乎無生長抑制作用。 囷 5a描述經四種病毒 NDV-GFP、NDV-ChIFN-a、NDV-ChIFN-β及無致病性病毒株LaSota NDV感染之受精雞蛋的 存活曲線。經NDV-ChIFN-α或NDV-ChIFN-β感染之雞胚存 活長於經NDV-GFP感染之胚胎。該等曲線明顯朝弱毒型 NDV LaSota病毒株存活曲線之方向偏移。 圓5b :根據存活曲線之結果，計算各感染組之MDT(平 均死亡時間）。與NDV-GFP相比，病毒NDV-ChIFN-α及 ChIFN-β之MDT增加。對無致病性病毒株LaSota觀察到最 高 MDT。 137749.doc -54-
Claims (1)
- 200936159 七、申請專利範圍： 1. 一種重組溶瘤RNA新城雞瘟病毒（仏…邮卜以咖“ Virus) ’其包含至少—個編碼鳥類細胞激素之轉殖其 因’其中該重組溶瘤RNA新城雞盘病毒可自強毒： (Wogenic)或中間毒型（mesogenic)溶瘤職新城雞瘂病 毒獲得。 2. 如請求項1之病毒’其包含至少一個其他轉殖基因，當 由病毒感染之腫瘤細胞表現時具有治療活性。 ^ 3. 如請求項2之病毒’其中該至少-個其他轉殖基因相對 於宿主為部分異基因（allGgene)或同基因㈣吨叫。 4. 如請求項⑴中任一項之病毒，其中該病毒 病性降低》 <双 5·如請求項4之病毒，其中該病毒對鳥類之致病性相對於 可產生該重組病毒之病毒降低。 6.如請求項4或5之病毒’其中該鳥類係選自家禽。 ❹ 7·如請求項4至6中任一項之病毒，其中該鳥類為雞。 8·如：求項1至7中任-項之病毒，其為鳥類病原體，尤其 為豕禽之病原體，更尤其為雞之病原體。 、 9. 如請求項1至8中饪一頂夕在主 朴 MT刪獲得。項之病母’其可自中間毒型病毒株 10. 如請求項⑴中任一項之病毒，其中該至少 殖基因編碼結合蛋自，t由病毒㈣之腫瘤表 具有治療活性。 嗯表現時 η.如請求们〇之病毒，其中該結合蛋白係選自由以下組成 137749.doc 200936159 群天然體、經遺傳㈣之配體、天然受體及其修 型：之重組可溶域、肽配體、多肽配體、抗體分子及 2 &及何生物’及如錯蛋白⑽以叫重複蛋白之抗體 樣分子及其片段及衍生物。 12. 13.如請求項之病毒，直 ’八千該結合蛋白為哺乳動物（例 如人類、鼠科動物)或密切相關來源之蛋白，或嵌合蛋 ^ ° 入口 如3月求項10至12中任一 Jl夕.由主 甘丄,> 項之病毋，其中該結合蛋白為單 體、二聚體、三聚體、四聚體或多聚體蛋白。 14·如請求項1G至13中任—項之病毒，其中該結合蛋白具有 單特異性、雙特異性或多特異性。 15. 如請求項1G至14中任—項之病毒，其中該結合蛋白為包 含至少一個結合域及至少一個異源域之融合蛋白。16. 如請求項15之病毒，其中該結合蛋㈣包含毒素（諸如人 類核糖核酸酶（假單胞菌外毒素、白喉毒素）)之融合蛋 白，或包含酶（如β-葡糖苦酸酶（glucur〇nidase)、卜半乳 糖苷酶、β-葡糖苷酶、羧肽酶、0_内醯胺酶)之融合蛋 白，或包含具有細胞激素活性之免疫刺激蛋白（如il_2、 IL-12、TNF-ct、IFN-β 或 GM-CSF)之融合蛋白。 17. 如請求項1〇至16中任一項之病毒’其中該結合蛋白係選 自由以下組成之群•·自主活性生長因子受體（例如 EGFR、Met)之阻斷蛋白；生長因子之競爭結合劑（枯抗 劑）；Rb-磷酸化之阻斷蛋白；E2F依賴性轉錄之阻斷蛋 白；P53穩定劑；抗細胞凋亡蛋白（例如Bci_2)之拮抗結 137749.doc 200936159 合劑；細胞週期素（cyclins)之拮抗結合劑；Ras效應子 (例如GEFs)之拮抗結合劑；缺氧（hypoxia)誘導蛋白（例如 HIFla)之拮抗結合劑；干擾二聚化、DNA結合或/及輔助 因子結合之轉錄因子（例如Myc/Max)之抑制劑；分化誘 導劑；smad信號傳導/易位之抑制劑；細胞黏附相互作用 (鈣黏素（cadherins)、整合素，例如α5β1、ανβ3)之抑制 劑；降解細胞外基質之酶（例如MMPs)之抑制劑；促血管 新生（proangiogenic)配體（例如可溶性VEGF-R)之拮抗結 合劑；促血管新生受體之拮抗結合劑；骨架複合物形成 (例如KSR/Ras)之抑制劑；轉譯起始（例如eIF4E、EIF2a) 之抑制劑；及有絲分裂激酶（例如Plk-1)之抑制劑。 18·如請求項1至9中任一項之病毒，其中該至少一個其他轉 殖基因編碼前藥轉化酶，當由病毒感染之腫瘤細胞表現 時具有治療活性。 19. 如請求項1至9中任一項之病毒，其中該至少一個其他轉 殖基因編碼蛋白酶，當由病毒感染之腫瘤細胞表現時具 有治療活性。 20. 如前述請求項中任一項之病毒，其中駐少一個轉殖基 因編碼之鳥類細胞激素係選自雞干擾素。 21. 如請求項20之病毒’其中該至少一個轉殖基因編碼之鳥 類細胞激素係選自雞I型干擾素。 ° 22·如请求項5至21中任一項之、由主 甘 病f，其中該致病性降低為 以MOI 〇.〇1感染後約48 h兮症表隊你* ,仏 * ’、 η邊涡蚕降低鳥細胞溶解之能 力’藉由增加細胞存活率所測量，其中相對於可產生^ 137749.doc 200936159 重組病毒之病毒，該細胞存活率增加至至少約25%至多 達約5〇%存活㈣，更佳增加至至少約50%至多達約75% 存'舌細胞，且最佳增加至至少約75%至多達100。/。存活細 胞。 ' 23. 如凊求項5至21中任一項之病毒其中該致病性降低為 11日齡爻精蛋（embryonated eggs)中受病毒感染之雞胚的 存活時間延長，藉由平均死亡時間（MDT)測定所測量， 其中相對於可產生該重組病毒之病毒，該MDT延長至少 約15 h至長達約20 h，更佳至少約2〇 h至長達約30 h，且 最佳超過30 h。 24. 如請求項1至23中任一項之病毒，其中該病毒對人類腫 瘤細胞之溶瘤活性基本上不降低。 25·如吻求項1至23中任一項之病毒，其中在感染後48卜後藉 由細胞存活率所測量，該病毒對人類腫瘤細胞之溶瘤活 性與可產生該重組病毒之病毒相比降低不超過5〇%，且 更佳相對於可產生該重組病毒之病毒基本上不降低。 26. —種如請求項1至25中任一項之重組溶瘤rNA病毒之核 勒（nucleocapsid) 〇 27. —種如請求項1至25中任一項之重組溶瘤rNA病毒之基 因組。 28. —種DNA分子’其編碼如請求項1至25中任一項之重組 溶瘤RNA病毒之基因組及/或反基因組。 29. 如請求項28之DNA分子，其係可操作地連接至一個轉錄 控制序列。 137749.doc 200936159 30. —種細胞，其包含如請求項1至25中任一項之重組溶瘤 病毒、如請求項27之病毒基因組或/及如請求項28或29之 DNA分子。 31. —種醫藥組合物，其包含如請求項1至25中任一項之重 組溶瘤病毒、如請求項27之病毒基因組或/及如請求項28 或29之DNA分子作為活性成份，視需要與醫藥學上可接 受之載劑、稀釋劑及/或佐劑。32. 如請求項31之醫藥組合物，進一步包含一種前藥，其可 經由該至少一個其他轉殖基因所編碼之前藥轉化酶轉化 為治療活性化合物。 33. —種治療增生性疾病之方法，該方法包含向需要之個體 投與醫藥學有效量之如請求項1至25中任一項之重組溶 瘤病毒、如請求項27之病毒基因組或/及如請求項28或29 之DNA分子。 34. 如請求項33之方法’其包含以醫藥學有效量向需要之個 體投與： (1)包含至少一個編碼前藥轉化酶之轉殖基因的如請求 項1至25中任一項之重組溶瘤病毒、如請求項27之病 毒基因組或7及如請求項28或29之DNA分子，及 (η)適於治療該增生性疾病之前藥與該病毒組合，該前 藥可藉由（1)之該前藥轉化酶轉化為醫藥活性化合 物。 35. 如凊求項33至34中任—項之方法，其中該個體為人類患 者。 137749.doc 200936159 3 6. —種對於家禽減毒之重組溶瘤RNA病毒，該病毒包含一 種包含至少一個編碼細胞激素之轉瘦基因的核酸。 37.如請求項36之病毒，其對於雞減毒。137749.doc
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