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TW200911835A - Methods and compositions for inducing apoptosis in cancer cells - Google Patents

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TW200911835A
TW200911835A TW097121278A TW97121278A TW200911835A TW 200911835 A TW200911835 A TW 200911835A TW 097121278 A TW097121278 A TW 097121278A TW 97121278 A TW97121278 A TW 97121278A TW 200911835 A TW200911835 A TW 200911835A
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TW
Taiwan
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seq
group
antibody
amino acid
light chain
Prior art date
Application number
TW097121278A
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English (en)
Inventor
Peter Flynn
Original Assignee
Irm Llc
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Publication date
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Description

200911835 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於與死亡受體5 ("DR5")特異性結合之抗體。 本申請案主張2007年6月8曰申請之美國臨時申請案第 60/942,862唬之權利，該案之全文以引用方式併入本文 中。 【先前技術】 細胞凋亡係所有後生動物生物體之發展及組織内穩態所 必需的高度保守之細胞自殺程序。防止或延遲正常細胞更 新之細胞凋亡途徑變化在疾病發病機制中正如細胞週期調 節之異常一樣重要。如同通過細胞週期調節蛋白間之複雜 相互作用所控制之細胞分裂，在正常情形下，細胞凋亡類 似地藉由防止或誘導細胞死亡之基因產物之相互作用調 ΛΛτ 郎° "、腫瘤壞死因子（TNF)相關之細胞凋亡誘導配體 (trail，亦稱為/^〇21^係TNF細胞因子家族之成員。一旦 ” DR5結合’ tRAIL即藉由細胞凋亡誘導細胞死亡。參 見例如，Pan等人，277:815-8 (1997) ; Sheridan 等人’知·咖e 277:818-21 3 (1997) ; Walczak等人，£細〇 乂 16.5386-97 4 (1997)。在活體外，已顯示TRAIL可殺死 表現DR5之廣譜腫瘤細胞，但對正常細胞相對無毒性。 考慮到癌症在人類群體中之高度流行性，始終存在研發 新賴更加有效之用於癌症治療之治療策略的需要。本發明 將解決該及其他相關需要。 131613.doc 200911835 【發明内容】 在第一態樣中，本發明提供結合死亡受體5 (DR5)之抗 體。在一些實施例中，該等抗體包含 (a) 包含人類重鏈V-區段、重鏈互補決定區3 (CDR3)及 重鏈框架區4 (FR4)之重鏈可變區，及 (b) 包含人類輕鏈V區段、輕鏈CDR3及輕鏈FR4之輕鏈 可變區，其中 i) 重鏈CDR3包含胺基酸序歹ij HEEGI (SEQ ID NO:49);且 ii) 輕鏈CDR3可變區包含胺基酸序列QXHXXTP (SEQ ID NO:5 0)，其中X表示任何胺基酸。 在另一態樣中，本發明提供結合死亡受體5 (DR5)之包 含重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體，其中該重鏈可變區及 該輕鏈可變區各自包含以下三個互補決定區（CDR): CDR1、CDR2及CDR3 ;其中： i) 該重鏈可變區之CDR1包含選自由SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3組成之群之胺基酸序列； ii) 該重鏈可變區之CDR2包含選自由SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:5及SEQ ID NO :6組成之群之胺基酸序歹ij ; iii) 該重鏈可變區之CDR3包含選自由SEQ ID NO:7、 SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9組成之群之胺基酸序歹ij ; iv) 該輕鏈可變區之CDR1包含選自由SEQ ID NO:10、SEQ ID ΝΟ:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13及 SEQ ID NO:14組成之群之胺基酸序列； 131613.doc 200911835 V) 該輕鏈可變區之CDR2包含選自由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17組成之群之胺基酸 序列； vi) 該輕鏈可變區之CDR3包含選自由SEQ ID NO:19 ' SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21組成之群之胺基酸 序列，條件係該抗體不包含所有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:15及 SEQ ID NO:19。 在一些實施例中，該等抗體包含與SEQ ID NO:44共有至 少 90%、93%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列一致性 之重鏈V-區段。在一些實施例中，該等抗體包含與SEQ ID NO:46 或 SEQ ID NO:48 共有至少 90%、93%、95%、96%、 97%、98%或99%序列一致性之輕鏈V-區段。 在該等抗體之一些實施例中： i) 重鏈CDR3包含胺基酸序列基元HEEGIYFX1X2 (SEQ ID NO:51)，其中X〗係D、T或K且X2係Y、K或V ;且 ii) 輕鏈CDR3包含胺基酸序列基元QX3HX4X5TP (SEQ ID NO:52)或 QX3HX4X5TPFT (SEQ ID NO:53)，其中 X3係Q或 H，X4係 Y、L或 K，且X5係T、Q、I、E、H或 G。 在該等抗體之一些實施例中： i) 重鏈CDR3包含選自由下列組成之群之胺基酸序 列：HEEGIYFDY (SEQ ID NO:7)、HEEGIYFDK (SEQ ID NO:8)、HEEGIYFDV (SEQ ID NO:54)、HEEGIYFTY (SEQ ID NO:55)及 HEEGIYFKY (SEQ ID NO:56);且 131613.doc 200911835 ϋ) 輕鏈CDR3包含選自由下列組成之群之胺基酸序 列：QQHYTTP (SEQ ID NO:57)、QQHYQTP (SEQ ID NO:58)、QQHYITP (SEQ ID NO:59)、QQHYETP (SEQ ID NO:60)、QQHYHTP (SEQ ID NO:61)、QQHYGTP (SEQ ID NO:62) > QQHLTTP (SEQ ID NO:63) > QQHKTTP (SEQ ID NO:64)及 QHHYTTP (SEQ ID NO:65);或 iii)輕鏈CDR3包含選自由下列組成之群之胺基酸序 列：QQHYTTPFT (SEQ ID NO:19)、QQHYQTPFT (SEQ ID NO:66)、QQHYITPFT (SEQ ID N〇:20)、QQHYETPFT (SEQ ID NO:67)、QQHYHTPFT (SEQ ID NO:68)、 QQHYGTPFT (SEQ ID NO:69)、QQHLTTPFT (SEQ ID NO:70)、QQHKTTPFT (SEQ ID NO:71)及 QHHYTTPFT (SEQ ID NO:72)。 在一些實施例中，重鏈FR4係人類種系FR4。在一些實 施例中，FR4係人類種系JH4 (SEQ ID NO:28)。 在一些實施例中，重鏈包含人類種系J-區段。在一些實 施例中，重鍵人類種系J-區段係JH4。在一些實施例中， 重鏈人類種系J-區段係胺基酸序列YFD(Y/K)WGQGT(L/T) (V/L)TVSS (SEQ ID NO:73) ° 在一些實施例中，輕鏈FR4係人類種系FR4。在一些實 施例中，FR4係人類種系JK2 (SEQ ID NO:38)。
在一些實施例中，輕鏈包含人類種系J-區段。在一些實 施例中，輕鏈人類種系J-區段係JK2。在一些實施例中， 輕鏈人類種系J-區段係胺基酸序歹，!（Y/F)TFG(Q/S)GTKLEIK 131613.doc 200911835 (SEQ ID NO:74)。 在該等抗體之一些實施例中： i) 重鏈之CDR1包含選自由SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3組成之群之胺基酸序列； ii) 重鏈之CDR2包含選自由SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6組成之群之胺基酸序列； iii) 輕鏈之CDR1包含選自由SEQ ID NO:1 1、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13及SEQ ID ΝΟ:1 4組成之群之胺基酸 序列；且 iv) 輕鏈之CDR2包含選自由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17及SEQIDNO:18組成之群之胺基酸序列。 在該等抗體之一些實施例中： i) 重鏈CDR3包含選自由SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9組成之群之胺基酸序列；且 ii) 輕鏈 CDR3 包含選自由 SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21及SEQIDNO:22組成之群之胺基酸序列。 在該等抗體之一些實施例中： i) 重鏈V-區段之CDR1包含SEQ ID NO:2 ; ii) 重鏈V-區段之CDR2包含SEQ ID NO:5 ; iii) 重鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO:8 ; iv) 輕鏈V-區段之CDR1包含SEQ ID NO:l 1 ; v) 輕鏈V-區段之CDR2包含SEQ ID NO:16 ;且 vi) 輕鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO:20。 在該等抗體之一些實施例中： 131613.doc -10- 200911835 i) 重鏈V-區段之CDR1包含SEQ ID NO:2 ; ii) 重鏈V-區段之CDR2包含SEQ ID NO:5 ; iii) 重鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO:8 ; iv) 輕鏈V-區段之CDR1包含SEQIDNO:12; v) 輕鏈V-區段之CDR2包含SEQ ID NO:17 ;且 vi) 輕鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO:20。 在該等抗體之一些實施例中： i) 重鏈V-區段之CDR1包含SEQ ID NO:2 ; ii) 重鏈V-區段之CDR2包含SEQ ID NO:5 ; iii) 重鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO:8 ; iv) 輕鏈V-區段之CDR1包含SEQIDNO:U; v) 輕鏈V-區段之CDR2包含SEQ ID NO:17 ;且 vi) 輕鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO:20。 在一些實施例中，重鏈可變區與SEQ ID NO:43之可變區 共有至少 90%、93%、95%、96%、97%、98°/。或 99%胺基 酸序列一致性。在一些實施例中，輕鏈可變區與SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47之可變區共有至少90%、93%、 95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性。 在一些實施例中，該抗體以小於1 X 1 〇'8 Μ之平衡解離 常數（KD)與DR5結合。 在一些實施例中，該抗體係FAb'片段。在一些實施例 中，該抗體係IgG。在一些實施例中，該抗體係單鏈抗體 (scFv)。在一些實施例中，該抗體包含人類恆定區。 在一些實施例中，該抗體係DR5激動劑。在一些實施例 131613.doc 200911835 中，該抗體係DR5拮抗劑。 在一些實施例中，該等抗體包含與SEQ ID NO:39具有至 少95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之重鏈 及與選自由 SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41 及 SEQ ID NO:42組成之群之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、 98%或99°/。序列一致性之輕鏈。 在一些實施例中，該等抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈包 含SEQ ID NO:39，該輕鏈包含選自由SEQ ID NO:40、SEQ ID NO :41及SEQ ID NO:42組成之群之胺基酸序列。在一些 實施例中，輕鏈包含SEQ ID NO:40。在一些實施例中，輕 鏈包含SEQ ID NO:41。在一些實施例中，輕鏈包含SEQ ID NO:42。 在相關態樣中，本發明提供包含本發明抗-DR5抗體及生 理上可相容之賦形劑的醫藥上可接受之組合物。該等組合 物中之抗體的實施例係如上文及整篇申請案所述。 在又一態樣中，本發明提供誘導癌細胞細胞凋亡之方 法，其包含使該細胞與本發明抗-DR5抗體接觸，其中該抗 體係DR5之激動劑。該等方法中之抗體的實施例係如上文 及整篇申請案所述。 在相關態樣中，本發明提供誘導個體中癌細胞細胞凋亡 之方法，其包含向該個體投與治療有效量之本發明抗-DR5 抗體，其中該抗體係DR5之激動劑。 在該等方法之一些實施例中，使該細胞進一步與細胞凋 亡誘導劑接觸。 131613.doc -12- 200911835 【實施方式】 定義 ’’士抗入體”係Μ夠非共價土也可逆地且以特冑方式與對應抗 ' 免疫球蛋白豕族之多肽或包含免疫球蛋白片段之 多肽。例示性抗體結構單元包含四聚體。每一四聚體由兩 個相同的藉助二硫鍵連接之多肽鏈對構成，每—對具有一 個輕鏈1 (約25 kD)及-個，，重鏈”（約5〇_7〇 kD)。公認的免 疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、£及_定區基因以及 無數免疫球蛋白可變區基因。輕鏈分為κ*λ。重鏈分為 γ、μ、α、δ或ε，其又分別定義免疫球蛋白種類igG、 IgM、IgA、IgD&IgED每一鏈之N_端定義主要負責抗原 識別之具有約100至110或更多胺基酸的可變區。術語可變 輕鏈（VL)及可變重鏈（vH)分別係指輕鏈及重鏈之該等區 域本申明案中所用之”抗體”涵蓋特異性地具有特定結合 (例如，對於DR5)之抗體及其片段之所有變體。因此，在 該概念範圍内者係具有相同結合特異性之全長抗體、礙合 抗體、單鏈抗體（ScFv)、Fab、Fab'及該等片段之多聚形式 (例如，F(ab’）2)。 ”互補性決定結構域”或"互補決定區"（"CDR")可互換， 其均指VL& VH之超變區。CDR係隱匿對靶蛋白之特異性的 抗體鏈之把蛋白結合位點。在每一人類vL或vH中存在三個 CDR (CDR1-3 ’自N-端依序編號），佔可變結構域之約15_ 20%。CDR與靶蛋白之抗原決定部位結構上互補且因此係 造成結合特異性之直接原因。VL或VH之其餘片段（所謂框 131613.doc -13 · 200911835 架區）展示胺基酸序列之較小變化（Kuby，Immunology，第 4版’第 4章 ’ W.H. Freeman & Co., New York，2000)。 CDR及框架區之位置係使用熟習此項技術者所熟知之多 種定義確定，例如，Kabat，Chothia，國際免疫遺傳學資 料庫（international ImMunoGeneTics database)(IMGT)(在全 球資訊網imgt.cines.fr/上）及AbM(參見，例如，Johnson等 人，Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001) ； Chothia 及 Lesk, J. Mol. Biol.，196:901-917 (1987); Chothia等人， Nature，342:877-883 (1989); Chothia等人，J. Mol· Biol.， 227:799-817 (1992) ; Al-Lazikani 等人，J. Mol. Biol., 273:927-748 (1997))。抗原結合位點之定義亦闡述於以下 文獻中：Ruiz 等人，Nucleic Acids Res·，28:219-221 (2000) ；及 Lefranc，M.P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001) ; MacCallum 等人，J. Mol. Biol,，262:732-745 (1996);及 Martin 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 86:9268-9272 (1989) ; Martin 等人 ’ Methods Enzymol., 203:121-153 (1991);及 Rees 等人，In Sternberg M.J.E.(編 輯），Protein Structure Prediction，Oxford University Press, Oxford，141-172 (1996)。 術語”結合特異性決定簇"或"BSD”可互換，其均指互補 決定區内測定抗體之結合特異性所必需之最小連續胺基酸 序列。最小結合特異性決定簇可在一或多個CDR序列内。 在一些實施例中，最小結合特異性決定簇存在於抗體重鏈 及輕鍵之一部分或全長CDR3序列内（即’僅藉由其決定）。 131613.doc 14 200911835 本文所用之”抗體輕鏈|，或，，抗體重鍵 VH之多肽。内源Vl係藉由基因區段”可變的)及"接合： 編碼，且内源VH係藉由v、D(多樣性）及埃碼。每一 VH均包括CDR以及框架㊣。在該申請案中，抗體輕二 或抗體重鏈有時可統稱為”抗體鏈"。熟f此項技術者 易地意識到，該等術語涵蓋含有不破壞WH之基本結: 之突變的抗體鏈。
抗體以完整免疫球蛋白形式或以許多經充分定性之藉由 用多種肽酶消化所產生之片段形式存在。因此，例如，胃 蛋白酶消化在鉸鏈區中於二硫鍵下之抗體以產生Η讣），2 (Fab，之二聚體）’ Fab，本身為藉由二硫鍵與Vh_Ch1連接之2 輕鏈。可將F(ab)’2在適度條件下還原以使鉸鏈區中之二硫 鍵斷裂，由此將F(ab)，2二聚體轉化成Fab，單體。Fab，單體 基本上為Fab與部分鉸鏈區。Paul，A"⑽ ㈣〇/〇灯第3版（1993)。雖然各種抗體片段係就完整抗體 消化予以定義，但熟習此項技術者應瞭解該等片段可以化 學方式或藉由使用重組DNA方法從頭合成。因此，本文所 用之術語”抗體”亦包括藉由所有抗體修飾所產生之抗體片 段或彼等使用重組DNA方法從頭合成者（例如，單鏈Fv)或 彼等使用嗟菌體顯示庫所識別者（參見，例如，McCafferty 等人，348:552-554 (1990))。 對於製備單株或多株抗體，可使用熟習此項技術者所習 知之任何技術（參見’例如’ Kohler & Milstein，jVaiwre 256.495-497 (1975) ’ Kozbor等人，4:72 131613.doc -15- 200911835 (1983) ’ Cole 等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy ’ 第 77_96 頁。Aiari r Liss公司，1985)。用於產 生單鍵抗體之技術（美國專利第4,946,778號）可經修改以產 生本發明之多肽抗體。而且，轉基因小鼠或諸如其他哺乳 動物等其他生物體可用以表現人類化抗體。或者，可使用 嗟菌體顯示技術來識別與所選擇抗原特異性結合之抗體及 雜聚Fab片段（參見’例如，McCafferty等人，見上文； Marks等人，价。⑽以士尽少，1〇:779_783,（1992))。 用於人類化或靈長類化非人類抗體之方法為熟習此項技 術者所熟知。通常而言’人類化抗體具有自非人類來源引 入至其中之一或多個胺基酸殘基。該等非人類胺基酸殘基 通常稱為引入殘基’其通常取自引入可變結構域。人類化 可基本按照Winter及同事之方法藉由用齧齒類動物CDR序 列取代人類抗體對應序列來實施（參見，例如，J〇nes等 尺 ' Nature, 321:522-525 (1986) ; Riechmann 等人， TVaiwre，332:323-327 (1988) ; Verhoeyen 等人， 239:1534-1 536 (1988)及 Presta, Cwrr. (9/?. β;·〇/· 2:593-596 (1992))。因此’該等人類化抗體為嵌合抗體（美 國專利第4,81 6,567號），其中實質上少於一個完整人類可 變結構域已由來自非人類物種之對應序列所取代。實際 上，人類化抗體一般為其中一些互補決定區（"CDR")殘基 及可能一些框架（"FR")殘基由來自齧齒類動物抗體中類似 位點之殘基所取代的人類抗體。 "嵌合抗體”係其中如下之抗體分子：（a)恆定區或其部分 131613.doc 16 200911835 紅改k、替換或代換以使抗原結合位點（可變區）與不同或 經改變之種類、效應功能及/或物種的恆定區、或賦予= 合抗體新穎特性之完全不同之分子（例如，酶、毒素、激 素、生長因子及藥物）連接；或（b)可變區或其部分經具有 不同或經改變之抗原特異性之可變區改變、替換或代換。 術語”可變區"或"v_區”可互換，其均指包含 FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4之重鏈或輕鏈。參見圖2。内源 可變區係藉由免疫球蛋白重鏈v_D_j基因或輕鏈v_j基因編 碼。V-區可天然存在、重組或合成。 本文所用之術語”可變區段"或” V—區段”可互換，其均指 包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3之可變區序列。參見圖2。 内源V-區段係藉由免疫球蛋白v_基因編碼。v_區段可天然 存在、重組或合成。 本文所用之術s吾1 J-區段"係指包含CDR3之C-端部分及 FR4之可變區序列。内源j_區段係藉由免疫球蛋白；_基因編 碼。參見圖2。J-區段可天然存在、重組或合成。 "人類化"抗體係保留非人類抗體之反應性而在人類中具 有較低免疫原性之抗體。此可藉由（例如）保留非人類CDR 區並用人類對應物替換抗體其餘部分獲得。參見，例如，
Morrison等人，Proc. AW. 5W. tAS^，81:6851-6855 (1984); Morrison及 Oi, di/v. 7mm㈣〇/., 44:65-92 (1988); Verhoeyen等人 ’ Sczewce, 239:1534-1536 (1988) ; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991) ； Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)。 131613.doc 200911835 術^對應人類種系序列 石丨七工生”扣編碼人類可變區胺基酸序 列或子序列之核醆序列，與藉 人類種糸免疫球蛋白可變 區序列編碼之所有其他經
^貝之了父區胺基酸序列相比， 變區胺基酸序列或子序列與參考可變區胺基酸序 =子序㈣有最高決定絲酸序列—純。對應人類^ 系序列亦可係指與所有其他料價之可㈣胺基酸序列相 比與參考可變區胺基酸序列或子序列具有最高胺基酸序列 一致性之人類可變區胺基酸序列或子序列。對應人類種夺 序列可僅為框架區、僅為互補決定區、框架區及互補決定 區、可變區段(如上文定義)或包含可變區之其他序列或子 序列組合°序列—致性可使用本文所述方法収，例如， 使用BLAST、ALIGN或熟習此項技術者所習知之另一比對 算法來實施兩個序列之比對。對應人類種系核酸或胺基酸 序列可與參考可變區核酸或胺基酸序列具有至少約9〇%、 致性。對應人類種系 際免疫遺傳學資料庫 92〇/〇、94%、96%、98%、99%序列― 序列可藉助（例如）可公開獲得之國 (IMGT)(在全球資訊網imgt.cines.fr/上）及v_庫（在全球資訊 網 vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk上）涓丨J 定。 當用於闡述抗原（例如，蛋白質）與抗體或抗體衍生結合 劑間之相互作用情形中時，詞組"特異性（或選擇性）結合,， 係指決定在蛋白質及其他生物製劑之異質群體中存在抗原 之結合反應。因此，在指定免疫分析條件下，具有特定余士 合特異性之抗體或結合劑以至少兩倍於背景之量盘特定才^ 原結合且基本上不與樣品中所存在之其他抗原大量結合。 131613.doc -18- 200911835 在該等條件下與抗體& &人 -、、、。5蜊特異性結合可能需要對該抗 體或結合劑對於特定蛋白皙 — 貪白貝之特異性加以選擇。該選擇可 藉由自其他物種中；^口略/ , 、、 扣除與（例如）DR5分子交叉反應之抗體 達成。夕種免疫分析形式可用丨、联埋λ ^ 八·J用以選擇與特定蛋白質特異性 免疫反應之抗體。例如，固相ELISA免疫分析通常用於選 擇與蛋白質特異性免疫反應之抗體（參見，例如，加⑽ & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)-閣述可用於測定特異性免疫反應之免疫分析形式及條 件）。-般而言’特異性或選擇性結合反應將產生至少兩 倍於月厅、k號且更一般而言至少丨〇至丨〇〇倍於背景之信
術語”平衡解離常數（κ〇, M)”係指解離速率常數（kd，時 間’除以締合速率常數(ka，時間' M，。平衡解離常數 可使用熟習此項技術者所習知之任何方法量測。本發明抗 體通常將具有小於約1〇-8 Μ(例如，小於約1〇·9 Μ或1〇1〇 Μ，在一些實施例中，小於約1〇-丨丨Μ，1〇-12 乂或1〇-13⑷ 之平衡解離常數。 本文所用之術語”抗原結合區"係指造成本發明DR5_結合 分子與DR5間特異性結合之該分子的結構域。抗原結合區 包括至少一個抗體重鏈可變區及至少一個抗體輕鏈可變 區。在每個本發明DR5-結合分子中存在至少一個該等抗原 結合區’且每個抗原結合區可彼此相同或不同。在一些實 加例中，本發明DR5-結合分子之抗原結合區的至少一個起 DR5之激動劑的作用。 131613.doc 19 200911835 本文所用之術語 讀文動劑"係指能夠特異性結合及活化受
別。''抗體激動劑•’ 特異性地與該受體結合並誘導經Dr5介 ’情形下’ DR5激動劑可藉由其與DR5結 h細胞（jurkat ceU)細胞凋亡之能力來識 係指其中該激動劑係活化抗體之情形。 術語”核酸，’或”聚核苦酸，，係指脫氧核糖核酸（D N A)或核 糖核I (RNA)及其以單鏈或雙鏈形式之多聚體。除非明確 限制，否則該術語涵蓋含有與參考核酸具有類似結合特性 且以類似於天然存在核苷酸之方式代謝的天然核苷酸之已 知類似物的核酸。除非另有說明，否則特定核酸序列亦暗 示涵蓋其保守修飾變體（例如，簡併密碼子取代）、等位基 因、同源體、SNP及互補序列以及明確指示之序列。特別 地，藉由產生其中一或多個所選擇（或全部）密碼子之第三 位經混合鹼基及/或脫氧次黃嘌呤核苷殘基取代的序列可 達成簡併密碼子取代（Batzer等人， 19:5081 (1991); Ohtsuka等人，价〇/. 260:2605- 2608 (1985);及Rossolini等人，Mo/· Ce//_ Proves 8:91-98 (1994)) 〇 術語"多肽”、"肽”及"蛋白質"在本文中可互換使用，其 皆指胺基酸殘基之多聚體。該等術語適用於其中一或多個 胺基酸殘基係對應天然存在胺基酸之人造化學模擬物之胺 基酸多聚體以及天然存在之胺基酸多聚體及非天然存在之 胺基酸多聚體。 131613.doc -20- 200911835 術語"胺基酸"係指天然存在及合成之胺基酸以及以類似 於天然存在之胺基酸的方式起作用之胺基酸類似物及胺基 酸模擬物。天然存在之胺基酸係彼等藉由基因代碼編碼者 以及彼等經稍後修飾之胺基酸，例如，羥基脯胺酸、”羧 基麵胺酸鹽及〇-磷酸絲胺酸。胺基酸類似物係指與天然存 在之胺基酸具有相同基本化學結構（即，與氫、缓基、胺 基及R基團結合之α-碳）之化合物，例如，高絲胺酸、正白 胺酸、甲硫胺酸亞砜、甲硫胺酸甲基鎳。該等類似物具有 經修飾之R基團（例如’正白胺酸）或經修飾之肽骨架，但 保留與天然存在之胺基酸相同之基本化學結構。胺基酸模 擬物係指具有不同於胺基酸通常化學結構之結構但以類似 於天然存在胺基酸之方式起作用的化學化合物。
子（AUG(其通常為甲硫胺酸之唯— 到，核酸中之每一密碼 密碼子）及丁GG(其通常 中編碼多每一個核酸序列亦闡述該核酸之 沈默變異。熟f此項技術者將認識Μ，核酸中 131613.doc •21 - 200911835 為色胺酸之唯—密碼子）除外）可經修飾以產生功能相同之 刀子。相應地，編碼多肽之核酸的每一沈默變異皆隱含在 每一所述序列中。 對於胺基酸序列而言，熟習此項技術者將認識到，核 :豸、肽、多肽或蛋白f序列之改變、添加或缺失所編碼序 歹中單個胺基酸或小部分胺基酸的單獨取代、缺失或添加 ·- 為”保守修飾變體，，，其中該改變導致胺基酸經化學上類似 之胺基酸所取代。提供功能類似胺基酸之保守取代表已為 熟習此項技術者所熟知。該等保守修飾變體亦包括且不排 除多態變體、種間同系物及本發明等位基因。 以下八個群組中每一組含有之胺基酸互為保守取代： 1) 丙胺酸（A)、甘胺酸（G); 2) 天冬胺酸（D)、麩胺酸（E); 3) 天冬醯胺（N)、麵胺醯胺（q); 4) 精胺酸（R)、離胺酸（κ); 〇 5)異白胺酸（1)、白胺酸（L)、曱硫胺酸（M)、纈胺酸（v); 6)苯丙胺酸（F)、酪胺酸（γ)、色胺酸（w); • 7)絲胺酸（S)、蘇胺酸（T);及 ·， 8)半胱胺酸（C)、甲硫胺酸（M)(參見，例如，Creight〇n， /Voie/如（1984))。 序列一致性百分比”係藉由在比較窗口内比較兩個最優 比對序列而測定，其中比較窗口内之多核苷酸序列部分與 不包含添加或缺失之參考序列（例如’本發明多肽）相比可 包含添加或缺失（即，間隙）以對兩個序列進行最優比對。 131613.doc • 22- 200911835 該百分比係藉由以下步驟舛筲. 〜 彈十异·測疋兩個序列中相同核酸 驗基或胺基酸殘基出現位置的數量以㈣mm㈣ 量’將匹配位置的數量除以比較窗口中位置的總數，並將 所得結果乘以100，便可得到序列一則生百分比。 在兩個或更多個核酸或多肽序列之情形下，術語”一致
的或致性百分比係指為相同序列之兩個或更多個序 列或子序列。當在比較窗口或指定區域内比較及比對以獲 得最大對應時，如使用以下序列比較算法之—或藉由人工 比對及目測所量測，若兩個序列之相同的胺基酸殘基或核 苷酸為指定百分比（即，在指定區域内或當未指定時在參 考序列之整個序列内，70%、75%、80%、85%、9()%、 95%、96%、97°/。、9 8%或99%序列一致性），則兩個序列 基本上一致”。本發明提供與本文中所例示之多肽或聚核 苦酸（例如’在SEQ ID NOS:l-22、54-56及66-72之任何一 個中所例示之CDR)分別基本上一致的多肽或聚核苷酸。 視情況’該一致性存在於長度至少約丨5、25或50個核苷酸 之區域内’或更佳在長度為10〇至5〇〇或1〇〇〇或更多個核苷 酸之區域内或在全長參考序列内。對於胺基酸序列，一致 性或基本一致性可存在於長度為至少5、1 〇、1 5或20個胺 基酸、視情況長度為至少約25、30、35、40、50、75或 100個胺基酸、視情況長度為至少約15〇、200或250個胺基 酸之區域内或在全長參考序列内。對於較短之胺基酸序列 (例如’具有2〇個或更少胺基酸之胺基酸序列）’當一個或 兩個胺基酸殘基按照本文所定義之保守取代經保守取代時 131613.doc •23- 200911835 存在基本一致性。 對於參考序列之序列—致性百分比 /列比較而言，—個序列-般將作為參考序列與測試 序列進行比較。當採科列比㈣法時，將測試序列及參 考序列輸人電腦中，必要時指定子序列㈣，並指定序列 具法程序參數1採用缺省程序參數，或可指定其它參 數。隨後’序列比較算法將基於程序參數計算測試序列相
本文所用之”比較窗口"包括對選自由2〇至6〇〇、通常約 50至約200、$通常為約1〇〇至約15〇個位置組成之群之多 個連續位置中任一位置的一個區段之參考，在該比較窗口 中，序列與具有相同數量連續位置之參考序列在經過最佳 比對後可進行比較。用於比較之序列比對方法為熟習此項 技術者所熟知。用於比較之最佳序列比對可藉由以下實 施.例如，Smith 及 Waterman (1970) Wv, 偷仏 2_482〇之局部同源性算法、化6(116111狂11及'\^11115(：11 (1970)1/ Mo/·仏0/. 48:443之同源性比對算法、Pears〇n及Upman (1988) Proc. jVa〆/· dead C/iSJ 85:2444之類似方法研 究、該等算法之電腦化實施（GAP、BESTFIT、FASTA及 TFASTA，在 Wisconsin遺傳學軟體包，Genetics Computer
Group, 5 75 Science Dr.，Madison, WI 中）或人工比對及目測 (參見，例如 ’ Ausubel等人，Cwrreni Proioco/s Mo/ecw/ar (1 995 年增刊））。 適於測定序列一致性及序列相似性百分比之算法的兩個 實例係BLAST及BLAST 2.0算法，其分別闡述於Altschu丨等 131613.doc •24- 200911835 人，（1977)版如n 25:3389_34〇uAitschui等人， (靡以财心/. 215:4〇3_41〇中。用於實施blast分析 之軟體可通過國家生物技術資訊中心㈣如』如 Biotechnology Inf()_iGn)公開獲得。該算法首先涉及藉 由識別詢問序列中之代碼長度縮寫W來識別高分值序列對 ⑽心當代碼與-個資料庫序列中具有相同長度的代碼 進行比對時，其將與某—正閾值分值τ相匹配或滿足其條 件。Τ指的是相鄰代碼分值閾值（Ahschui等人，見上文）。 該等初始相鄰重複代碼將作為引子以啓動發現含有其之更 長朦的搜索。將重複代碼沿每_序列之兩個方向延伸， 儘S能夠使帛積比對分值增加。對於核苦酸序列，累積分 值係使用參數Μ(匹配殘基對之獎勵分值；始終大於〇)及 Ν(不匹配殘基之懲罰分值；始終小㈣）來計算。對於胺基 酸序列，使用分值矩陣來計算累積分值。重複代碼在每一 方向上之延伸在以下時候將停止：累積比對分值自其所達 成之最大值降低了Χ數量；由於—或多個負分值殘基比對 累加而使累積分值變為零或負值；或達到任一序列之端 .‘』BLAST算法參數w、Τ及X確定比對的靈敏度及速度。 BLASTNfe序⑼於核；g：酸序列）使用的缺省值有代碼長度 (w) 11、預期值（E) 10、M=5、N=_4及兩條鏈之比較值。對 於胺基酸序列’該BLASTN程序使㈣缺省值有代瑪長度 3及預期值（E) 10及BLOSUM62分值矩陣（參見Henikoff及
Hemk〇ff (1989)&，·· 89:10915)比對 (B)50、預期值（E) 1〇、M=5、N_4及兩條鏈之比較值。 131613.doc -25· 200911835 該BLAST算法亦對兩個序列間之相似性實施統計學分析 (參見，例如，Karlin及Altschul〇993)户⑽細/ — ⑽㈣73_5787)β該BLAST算法提供之—種相似性 量測係最小和概率（P(N))，^於指示兩個核芽酸或胺基 酸序列之間偶料生匹配之概率。例如，若在測試核酸與
參考核酸之比較中最J、条如 φ、玄I 早乂甲敢小和概率小於約〇·2，更佳小於約 〇.(Η ’且最佳小於約’則認為該核酸與該參考序列相 似。
如下文所述，表明兩個核 係藉由第一個核酸編碼之多 之多肽產生的抗體發生免疫 第一個多肽基本一致，例如 別之情形。如下文所述，表 一種情形係在嚴格條件下該 表明兩個核酸序列基本—致 物來擴增序列。 酸序列或多肽基本一致之情形 肽與抵抗藉由第二個核酸編碼 父又反應。因此’多肽一般與 ’該兩個肽僅存在保守取代差 明兩個核酸序列基本一致之另 兩個分子或其補體相互雜交。 之再一種情形係可使用相同引 當用於闡述抗原結合區在本發明DR5_結合分子内如何連 接之情形中時，術語"連接”涵蓋所有可能使區域物理連接 之手#又。大抗原結合區經常藉由化學鍵連接，例如共價 鍵（例如，肽鍵或二硫鍵）或非共價鍵，其可為直接鍵（即， 兩個抗原結合區之間無連接體）或間接鍵（即，在兩個或更 多個抗原結合區之間藉助至少一個連接體分子）。 SMAC係4曰線粒體多肽，其與細胞色素〇 一起響應細胞 凋亡刺激素自線粒體釋放。SMAC藉由結合並中和lAp促進 131613.doc -26- 200911835 半胱天冬酶活化。參見，例如’ Du等人，〇// 102:33-42 (2000)，Verhagen等人，CW/ 102:43-53 (2000)。 術語”治療上可接受之量"係指足以實現期望結果（即，靶 細胞細胞洞亡）的量。較佳地，治療上可接受之量不會招 致不期望之副作用。治療上可接受之量可藉由首先投與低 劑量並隨後遞增該劑量直至達成期望效果來確定。 1. 介紹 DR5係在多種癌細胞表面上表現之所謂的死亡受體（參 見，Chaudhary 等人，/膽賺.沙 7:821·83〇 (1997)及 GenBank 登錄號AF016268)。一旦與其配體（TRAIL4Ap〇2L)結合， DR5即經由其細胞質死亡結構域觸發一系列信號轉導事件 最終導致細胞凋亡。本發明提供特異性結合〇115且含有衍 生自非人類抗-DR5參考單株抗體（例如，小鼠）之最小結合 決定簇序列及藉由對應人類種系可變區序列編碼之可變區 胺基酸序列的抗體。 2. 結合死亡受趙5 (DRS)之經改良抗想 a.概述 本發明抗體特異性地與DR5結合。如此’該等抗體可阻 礙固有配體結合，起拮抗劑作用或起激動劑作用。在一些 實施例中，本發明抗-DR5抗體起DR5受體激動劑之作用。 DR5抗體激動劑係特異性結合DR5並活化經DR5介導之俨 號轉導之抗體。該等抗_DR5抗體可視情況經多聚（例如， 二聚）並按照本發明方法使用。該等抗_DR5抗體可為全長 四聚抗體（即，具有兩條輕鏈及兩條重鏈）、單鏈抗體（例 131613.doc -27- 200911835 如，ScFv)或包含形成―少 結合特異性之抗體片段的八夕固抗原結合位點並賦予DR5-變區(例如，其他類1片;二'，包含重鏈及輕鏈可 由热g此項技術者所習知 乃奴了错 重组茅可手段產生，包括但不限於 、，，表現、化學合成及抗體 、 株抗體可藉由(例如)雜交瘤或重二'長單 此項技術者所習知之任 -仔可自熟習
哺乳動物宿主細胞、細菌二胞重組表5見，例如， 宿主細胞等。當存纽5細胞、酵母宿主細胞、昆蟲 ^ . 、抗-DR5抗體之恆定區可為任何類 型或亞型（禎堂u (視而要），且可選自擬藉由本發明方法所户療之 個體物種(例如，人 所…療之 、卜人類宽長類動物或其他哺乳動 物，例如，農業哺乳動物（ ^ 馬科動物、綿羊科動 物、豬科動物）、馴養哺乳動物（例如，犬科動 物、描科動物)或齧齒類動物(例如，大鼠、小鼠、倉鼠、 兔子）。 b·抗-DR5抗體可變區 本發明抗-DR5抗體之可變區係衍生自已知以高親和力結 合DR5之參考單株抗體，並起激動劑作用。藉由減少對應 於非人類物種(例如，小鼠)之胺基酸序列區段並增加對應 於人類種系胺基酸序列之胺基酸序列區段對該等抗體實施 改良或最佳化。以此方式，使可在人類宿主十潛在誘導抵 抗抗-DR5抗體之免疫反應的序列減少、最少化或消除。用 於設計人類抗體之方法已有闡述。參見，例如，美國專利 公開案第2005/0255552號及美國專利公開案第 131613.doc -28- 200911835 2006/0134098號，該兩案之揭示内容全文為了各種目的而 以引用方式併入本文中。 本發明經改良之抗-DR5抗體係經設計具有與人類種系 V-區序列具有基本胺基酸序列一致性之v_區序列而保留參 考抗體特異性及親和性之人類抗體。參見，美國專利公開 案第20〇5/0255552號及美國專利公開案第2〇〇6/〇134〇98
號。改良過程識別確定來自參考抗體可變區之抗原-結合 特異性所需要之最小序列資訊並將該資訊傳遞至人類部分 V-區基因序㈣以產生人類抗體¥_區之抗原決定部位集中 庫。可使用基於微生物之分泌系統來表現作為抗體片 段之該庫成員並（例如）使用菌落轉移結合分析筛選針對該 庫之抗原結合Fab'。參見，例如，美國專利公開案第 2007/0020685號。可將陽性純系進一步定性以識別彼^具 有最咼親和力者。所得經設計之人類Fab，保留親本（參考 抗-DR5抗體）之結合特異性，與親本抗體相比—般具有相 等或較高之對抗原之親和力且具有與人類種系抗體ν·區相 比具有局程度序列一致性之V _區。 產生抗原決疋部位集中庫戶斤愛夕导t纟士人 卞τ渾所而之取小結合特異性決定簇 (BSD) —般由重鍵CDR3 ("CDRH3”）内之一個序列及輕鏈 CDR3 ("CDRL3”）内之-個序列代表。娜可包含一部分或 全長CDR3。BSD可由連續志_ 』田逕躓或非連續胺基酸殘基構成。在 一些情形下’該抗原決定部位隼中庙 |位集中庫係由人類V-區段序列 與含有BSD及人類種系區 仅序列之參考抗體的獨特 CDR3-FR4區連接所構建（來 竹 ^見圖2及美國專利公開案第 131613.doc -29- 200911835 2005/0255552號）。或者，人 a甘上 又庫可由序列盒替換產 生，其中最初僅部分參考抗俨V F P I '產 體^段由人類序列庫替換。 敁後在殘餘參考抗體胺基酸序 、 文汴π τ叉符結合之經識別 ”益"在第二庫筛選中重《且以&人' p k 丫更、、且以几全產生人類ν_區段（參見 國專利公開案第2006/0 1 34098號）。 、
在各情形下，使用含有參考抗體之特異性決的成對 重鏈及輕鏈CDR3區段、CDR3_FR4區段或區段來拘束结 合特異性以使自該庫所獲得之抗原結合劑保留參考抗體^ 抗原決定部位特異性。可在該庫構建期間在各鏈之cd们 區中引入其他成熟改變以識別具有最佳結合動力學之抗 體。所得經設計之人類抗體具有衍生自人類種系庫之^ = 段序列’保留CDR3區内之短BSD序列，且具有人類種系 框架4 (FR4)區。 ' 因此，在一些實施例中，該等抗_〇115抗體在衍生自原單 株抗體之重鏈及輕鏈CDR3内含有一個最小結合序列決定 簇（BSD)。重鏈 CDR3 包含 BSD HEEGI (SEQ ID NO:49)’ 輕鏈 CDR3包含 BSD QXHXXTP (SEQ ID NO:50)，其中x係 任何胺基酸。參見例如圖3、8及11。重鏈及輕鏈可變區之 其餘序列（CDR及FR)(例如V-區段及J-區段）係來自對應之 人類種系胺基酸序列。V-區段可選自人類V_區段庫。其他 序列改進可藉由親和力成熟完成。 在另一實施例中，該等抗-DR5抗體之重鏈及輕鏈含有來 自對應人類種系序列之人類V-區段（FR1-CDR1-FR2-CDR 2-FR3)(例如，選自人類V-區段庫）及來自原有單株抗體之 131613.doc • 30· 200911835 CDR3-FR4序列區段。該CDR3-FR4序列區段可藉由用對應 人類種系序列替換序列區段及/或藉由親和力成熟進一步 改進。例如，BSD周圍之FR4及/或CDR3序列可用對應人 類種系序列替換，同時保留來自原有單株抗體之CDR3之 BSD。 在一些實施例中，重鏈V-區段之對應人類種系序列係 VH1 46。在一些實施例中，重鏈J-區段之對應人類種系序 列係JH4。可變區基因係按照免疫球蛋白可變區基因之標 準命名法提及。當前免疫球蛋白基因資訊可通過全球資訊 網獲得，例如，ImMunoGeneTics (IMGT)、V-庫及 PubMed 資料庫。亦參見 Lefranc，Clin Immunogenet. 2001; 18(2):100-16 ； Lefranc, Exp Clin Immunogenet. 2001; 18(3):161-74 ； Exp Clin Immunogenet. 2001; 18(4):242- 54 ;及 Giudicelli 等人，jYwc/ez'c iies. 2005 年 1 月 1 日；33(資料庫刊）：D256-61。在一些實施例中，重鏈J-區 段具有胺基酸序列 YFD(Y/K)WGQGT(L/T)(V/L)TVSS (SEQ ID NO:73)。 在一些實施例中，輕鏈V -區段之對應人類種系序列係 VKIV或VKIL4。在一些實施例中，重鏈J-區段之對應人類 種系序列係JK2。在一些實施例中，輕鏈J-區段具有胺基 酸序列（Y/F)TFG(Q/S)GTKLEIK (SEQ ID NO:74)。 在一些實施例中，重鏈V-區段與胺基酸序列（E/Q)VQLV QSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSY(Y/T)MHWVRQAP GQGLEWMG(I/W)I(N/Y)P(S/G)GG(S/Y)T(S/K)YAQKF(Q/F) 131613.doc -31 - 200911835
GRVTMT(R/G)DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR (SEQ ID NO:92)共有至少 90%、93%、95%、96%、97%、98%、 99%或1 00%序列一致性。在一些實施例中，輕鏈V-區段與 選自 DIVMTQSPDSLA(V/A)SLGE(R/K)ATINCKSSQS(V/F) L(Y/G)SSN(N/G)KNY(L/V)AWYQQKPGQPPKLLIYWAS(T/ M)R(E/V)SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (SEQ ID NO:93)及（A/D)IQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS Q(G/D)(I/V)S(S/G)ALAWYQQKPG(K/Q)(A/P)PKLLIY(D/W) AS(S/T)(L/R)ESGVP(S/D)RFSGSGSGTDFTLTISSLQ(P/A)E 0(?/¥)八（17¥)丫丫(3(8£(5 10>40:94)之胺基酸序列共有至少 90% ' 93% ' 95%、96%、97%、98%、99% 或 100%序歹>J 一 致性。 在一些實施例中： i) 重鏈CDR3包含胺基酸序列基元HEEGIYFX〗X2 (SEQ ID NO:5 1)，其中乂丨係口、T或K且X2係Y、K或V ;且 ii) 輕鏈CDR3包含胺基酸序列基元QX3HX4X5TP (SEQ ID NO:52)，其中 X3係 Q 或 Η，X4係 Y、L 或 K，且 X5 係T、Q、I、E、Η或 G。 在一些實施例中： i) 重鏈CDR3包含選自由下列組成之群之胺基酸序 列：HEEGIYFDY (SEQ ID NO:7)、HEEGIYFDK (SEQ ID NO:8)、HEEGIYFDV (SEQ ID NO:54)、HEEGIYFTY (SEQ ID NO:55)及 HEEGIYFKY (SEQ ID NO:56);且 ii) 輕鏈CDR3包含選自由下列組成之群之胺基酸序 131613.doc -32- 200911835 列：QQHYTTP (SEQ ID NO:57)、QQHYQTP (SEQ ID NO:58)、QQHYITP (SEQ ID NO:59)、QQHYETP (SEQ ID NO:60) ' QQHYHTP (SEQ ID NO:61) ' QQHYGTP (SEQ ID NO:62)、QQHLTTP (SEQ ID NO:63)、QQHKTTP (SEQ ID NO:64)及 QHHYTTP (SEQ ID NO:65);或 iii)輕鏈CDR3包含選自由下列組成之群之胺基酸序 列：QQHYTTPFT (SEQ ID NO:19)、QQHYQTPFT (SEQ ID NO:66) ' QQHYITPFT (SEQ ID NO:20) ' QQHYETPFT (SEQ ID NO:67)、QQHYHTPFT (SEQ ID NO:68)、 QQHYGTPFT (SEQ ID NO:69)、QQHLTTPFT (SEQ ID NO:70)、QQHKTTPFT (SEQ ID NO:71)及 QHHYTTPFT (SEQ ID NO:72)。 在一些實施例中，本發明之該等抗體包含重鏈可變 區，該重鏈可變區包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1包 含胺基酸序列SY(Y/T)MH (SEQ ID NO:95);該CDR2包含 胺基酸序列（I/W)(I/F)(N/Y)P(S/G)GG(S/Y)(T/I)(S/K/R/N)Y (A/N/S/T/D)(Q/E)KF(Q/K)(G/D)(SEQ ID NO:96);該 CDR3 包含胺基酸序列 HEEGIYF(D/T/K)(Y/K/V)(SEQ ID NO:51)。 在一些實施例中，本發明之該等抗體包含輕鏈可變區， 該輕鏈可變區包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1包含選 自 KSSQS(V/F)L(Y/G)SSN(N/G)KNY(L/V)A (SEQ ID NO:97) 及 RASQ(G/D)(I/V)S(S/G)ALA (SEQ ID NO:98)之胺基酸序 列；該 CDR2 包含胺基酸序列（W/D)AS(S/T/M)(R/L)(E/V)S (SEQ ID NO:99);該 CDR3 包含胺基酸序列 Q(Q/H)(Y/H/F) 131613.doc -33- 200911835 (Y/N/L/K)(S/I/E/H/G/Q/T)(T/Y)P(Y/F)T (SEQ ID N0:100)。 在一些實施例中，抗體不包含所有SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:15 及 SEQ ID NO:18。 在一些實施例中，重鏈可變區包含FR1、FR2 ' FR3及 FR4，該 FR1 包含胺基酸序列（E/Q)VQLVQSGAEVKKPGAS VKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO:101);該 FR2 包含 SEQ ID NO:25 ;該FR3 包含胺基酸序列RVTMT(R/G)DTSTSTVYME LSSLRSEDTAVYYCAR (SEQ ID NO:102);該 FR4 包含 SEQ ID NO:28。所識別之胺基酸序列可具有一或多個經取代之 胺基酸（例如，來自親和力成熟）或一個或兩個經保守取代 之胺基酸。 在一些實施例中，輕鏈可變區包含FR1、FR2、FR3及 FR4，該 FR1 包含選自 DIVMTQSPDSLA(V/A)SLGE(R/K) ATINC (SEQ ID NO:103)或（A/D)IQLTQSPSSLSASVGDRV TITC (SEQ ID NO:104)之胺基酸序列；該FR2包含胺基酸 序列 WYQQKPG(Q/K)(P/A)PKLLIY (SEQ ID NO:105);該 FR3 包含胺基酸序列 GVP(D/S)RFSGSGSGTDFTLTIS SLQ (A/P)ED(V/F)A(V/T)YYC (SEQ ID NO:106);該 FR4 包含 SEQ ID NO:37。所識別之胺基酸序列可具有一或多個經取 代之胺基酸（例如，來自親和力成熟）或一個或兩個經保守 取代之胺基酸。 在本發明抗-DR5抗體之可變區全長内，其與對應人類種 系可變區胺基酸序列通常將具有至少約90%(例如，至少約 131613.doc -34- 200911835 91%、92%、93%、94%、95% ' 96%、97%、98%、99% 或 100%)之總體（例如 ’ FR1-CDR1-FR2- CDR2-FR3-CDR3-FR4)胺基酸序列一致性。例如’該等抗-DR5抗體之重鏈可 與人類種系可變區VH146/JH4共有至少約91¾、92%、 93%、94%、95°/。、96°/。、97%、98%、99% 或 100%胺基酸 序列一致性。該等抗_DR5抗體之輕鏈可與人類種系可變區 VKIV/JK2 或 VKIL4/JK2 共有至少約 91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%胺基酸序列一 致性。 在一些實施例中，本發明抗-DR5抗體包含與選自SEQ ID NOS:39及43之重鏈可變區具有至少90%、91%、92%、 93%、94%、95°/。、96%、97%、98%、99% 或 100%胺基酸 序列一致性之重鏈可變區且包含與選自SEQ ID NOS:40、 41、42、45及47之輕鏈可變區具有至少90°/。、91%、 92% ' 93% ' 94% ' 95% > 96% ' 97% ' 98% > 99%^ 100% 胺基酸序列一致性之輕鏈可變區。 在一些實施例中，本發明抗-DR5抗體包含與SEQ ID NO:39之重鏈可變區具有至少90❶/。、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%胺基酸序列一 致性之重鏈可變區且包含與選自SEQ ID NOS:40、41及42 之輕鏈可變區具有至少90°/。、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97°/。、98%、99°/。或 100%胺基酸序列一致性之 輕鏈可變區。
在一些實施例中，本發明抗-DR5抗體包含與SEQ ID 131613.doc -35- 200911835 NO:43之重鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%胺基酸序歹丨J 一 致性之重鏈可變區且包含與選自SEQ ID NOS:45及47之輕 鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96°/。、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性之輕鏈 可變區。 對於經識別之長度小於20個胺基酸之胺基酸序列，可容 忍一個或兩個保守胺基酸殘基取代，同時仍保留期望之特 異性結合及/或激動劑活性。 本發明抗-DR5抗體通常將以小於約10·8 Μ或ΙΟ·9 Μ(例 如，小於約10 —μ Μ或ΗΤ11 Μ，在一些實施例中小於約10·12 Μ或10_13 Μ)之平衡解離常數（KD)結合DR5。 c. DR5抗體激動劑及篩選方法 抗-DR5抗體先前已在（例如）美國專利申請案第 10/723,383 號、美國專利第 2005/0079172 號、PCT WO 01/83560(抗體 TRA-8 ； ATCC PTA-1428)及 PCT WO 02/0793 77中闡述。例示性抗-DR5抗體激動劑之重鏈及輕 鏈可變區已在美國專利第2005/0079172號中公佈。在一些 實施例中，本發明之DR5-結合分子含有至少一個與美國專 利第2005/0079 172號中所例示之抗體競爭與DR5結合之 DR5-結合區。在其他實施例中，本發明之DR5-結合分子 含有至少一個具有與美國專利第2005/0079172號中所例示 之CDR胺基酸序列基本類似之CDR的DR5-結合區。 可按照本發明方法使用任何DR5抗體激動劑類型。通 131613.doc -36- 200911835 常’所用抗體係單株抗體，其可藉由熟習此項技術者所習 知之任何一種方法產生（例如，雜交瘤及重組表現）^在一 些貫施例中，使用包含重鏈及輕鏈可變區之抗體片段而非 全長抗體來構建本發明之DR5-結合分子。 在一些實施例中’該DR5-結合分子之抗原結合區係單鏈 抗體（ScFv)。可用於產生ScFv及抗體之技術闡述於（例如） 美國專利第4,946,778號及第5,258,498號；Huston等人， 输仏〇心 k 203:46-88 (1991) ; Shu等人，户r〇c 心"· dcW. 5W· 90:7995-7999 (1993);及 Skerra 等 人 ’ *SWe«ce 240:1038-1040 (1988)中。 與DR5特異性結合之DR5抗體可使用熟習此項技術者所 熟知之技術識別’例如’ ELIS A、表面電漿共振、干涉量 測法（例如’使用ForteBio Octet生物傳感器系統）。DR5抗 體激動劑可藉由測試抗體觸發DR5介導之事件之能力來識 別，例如，誘導表現DR5之癌細胞細胞凋亡。熟習此項技 術者所習知之多種分析可用於檢測細胞凋亡之誘導。 在種刀析中，使尤爾卡特細胞與為候選激動劑之d r 5 抗體接觸。隨後以抗體濃度作為函數監測該等細胞之生存 能力。由細胞凋亡增加所造成之細胞生存能力下降與抗體 漢度增加對應表明該抗體係激動劑。可藉由向細胞培養物 中添加Alamar藍（Alamar blue)來分析細胞生存能力。該染 料在活而非死細胞存在下發螢光。 DR5抗體激動劑亦可藉由篩選在dR5下培育之雜交瘤並 隨後篩選雜交瘤上清液誘導尤爾卡特細胞細胞凋亡之能力 131613.doc -37- 200911835 來識別。適合陽性及陰性對照可用於證實結果。例如，未 經歷DR5介導之TRAIL誘導的細胞凋亡的細胞系應不經歷 響應候選DR5抗體激動劑之細胞凋亡。 3.誘導細胞凋亡之方法 若本發明之該等抗體可用作DR5受體之激動劑，則可使 用其來誘導靶細胞細胞凋亡。為此，使一或多種本發明 抗-DR5抗體以足以誘導靶細胞細胞凋亡的量與一或多種靶 細胞（例如，癌細胞）上之DR5受體在活體内或活體外接 觸。在一些實施例中，使本發明抗體兼與第二細胞凋亡誘 導劑與靶細胞上之DR5受體接觸。 a.細胞凋亡誘導劑 本發明提供抗-DR5抗體激動劑與第二細胞凋亡誘導劑之 改良效果。細胞凋亡誘導劑包括可誘導細胞細胞凋亡之任 何試劑。在一些實施例中，與非癌細胞相比，細胞凋亡誘 導劑優先誘導癌細胞細胞凋亡。一般而言，細胞凋亡誘導 劑係細胞凋亡之激動劑或活化劑或細胞凋亡之拮抗劑或抑 制劑。 例示性細胞凋亡誘導劑包括（例如）以下激動劑或模擬 物：SMAC、Bax、Bik、Bok、Bim、Bak、Bid、Noxa、 Puma、Hrk 或 Bad ; BH3、p53、TRAIL、Fadd、Myc 及
Mekkl、信號識別顆粒72kD (SRP72)、半胱天冬酶_8 ' Bid、B淋巴酪胺酸激酶（BLK)、類似於丙酮酸激酶之基因 產物、M2同功酶（LOC148283)、糖原合酶激酶3 α (GSK3A)、假設蛋白FLJ32312 (FLJ3 2312)、促分裂原活化 131613.doc -38- 200911835 蛋白激酶10 (MAPK10)、TCF4 :轉錄因子4、v_abl Abelson鼠科動物白血病病毒癌基因同系物2 (arg，Abels〇n 相關基因）(ABL2)、V-ros鳥類UR2肉瘤病毒癌基因同系物j (ROS 1)及v-myc鳥類趙細胞瘤病病毒癌基因同系物以及以 下结抗劑或抑制劑：26S蛋白酶體抑制劑' c_nip ' NFkB通 路、1AP 家族成員（例如，XIAP、cIAPl、CIAP2、NAIP、 MLIAP/Livin、存活素）、蛋白酶體通路成員（例如，μ、 E2 及 E3) ’ 激酶 pi3、Aktl、2及 3、Rip、Nik ; CD40 ; Bcl2 豕族成員（例如’ Bcl2、Bcl-xl、A1、Mcll)、泛素結合酶 UbcH10(編碼人類UbcHl〇變體之聚核苷酸序列包括⑼如） 登錄號 NM—181803 、NM_181802 、NM—181801 、 NM—181800、NM—181799、NM—007019 及 BC050736)、骨 保濩素、叢蛋白（plexin) B1 (PLXNB1)、含有SET結構域之 蛋白7 (SET7)、促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶5 (MAP3K5)、STE20樣激酶（JIK)、MAP激酶相互作用絲胺 酉文/蘇胺酸激酶1 (MKNK1)、假定内質網多跨跨膜蛋白 (RFT1) ’ 5-激酶，第j型，γ (PIP5K1C)、促分裂原活化蛋 白激酶-活化蛋白激酶2 (MAPKAPK2)、促分裂原活化蛋白 激酶激酶5 (MAP2K5)、細胞週期調節蛋白依賴激酶6 (CDK6卜活化素A受體第II型-1樣（ACVRL1)、Gardner-Rasheed描科動物肉瘤病毒（v-fgr)癌基因同系物（FGR)、假 §更蛋白FLJ21802 (FLJ21802)、肌肉、骨骼、受體酪胺酸激 酶（MUSK)、染色體20開放讀碼框88 (C2〇orf88)、未經苯 并米0坐抑制之芽殖1 (budding uninhibited by benzimidazoles 131613.doc -39- 200911835 1)(酵母同系物）（BUB1)、核糖體蛋白S6激酶，90kD，多肽 5 (RPS6KA5)、v-yes -1 Yamaguchi肉瘤病毒相關癌基因同 系物（LYN)、促分裂原活化蛋白激酶7 (MAPK7)及v-akt鼠 科動物胸腺瘤病毒癌基因同系物1 (AKT1)、ΡΑΚΙ(包括（例 如）任何以下Ρ21 (CDKN1A)活化激酶1、卩八反八、？65-ΡΑΚ、Ρ68-ΡΑΚ、α-ΡΑΚ ' MUK2、ΡΑΚ1Β (ρ21 活化激酶 IB)、P21/Cdc42/Racl活化激酶1(與酵母Ste20相關）、 Cdc42/Rac 效應激酶 PAK-A、蛋白激酶 MUK2)、nsurf、 stkl2(包括（例如）絲胺酸/蘇胺酸激酶12、aurora相關激酶 2、aurora/IPLl 樣激酶 2、AIK2、ARK2、AIM-1 及 AIM1)、 細胞凋亡信號調節激酶1 (Askl)、TLK1(例如，登錄號 NM_012290)、NLK(例如，登錄號NM_016231)、GRAF(例 如，登錄號NM_015071)、GCK(例如，登錄號 NM_000162)、ERK5(例如，登錄號NM_002749)、FGR(例 如，登錄號NM_005248)、ACVRL1(例如，登錄號 NM—000020)、MEKK5(例如，登錄號 NM_002757)、 PIP5K1C(例如，登錄號 XM_047620)、MAPKAPK2(例如， 登錄號 NM_004759)、RFT1(例如，登錄號NM—052859)、 MKNK1(例如，登錄號NM—003684)、PLXNB1(例如，登錄 號NM_002673)。額外例示性細胞凋亡誘導劑包括（例如）可 增強DR5表現及/或穩定性之試劑、可增強半胱天冬酶活性 或穩定性之試劑及可誘導或增強DNA損傷反應之試劑。上 文列示中之激動劑或模擬物包括其本身基因產物，例如， p53係p53激動劑；TRAIL係TRAIL激動劑。拮抗劑包括直 • 40- 131613.doc 200911835 接抑制活性之試劑及通過降低靶分子mRNA(例如，siRNA) 或蛋白之表現或穩定性間接抑制活性之試劑。 可藉由乾向該等基因產物識別之細胞凋亡誘導劑包括具 夕種化冬性貝之化合物。例如，該等基因產物之調節劑 可用以下庫進行篩選：多肽、β_轉角模擬物、多糖、磷 脂、激素、前列腺素、類固醇、芳族化合物、雜環化合 物、苯并二氮卓、寡聚Ν_經取代之甘胺酸、寡胺基甲酸 酉e、多肽、糖類、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、衍生 物、結構類似物或其組合。 在一些實施例中’細胞凋亡誘導劑係聚核苷酸。例如， 其可為把向抑制TRAIL誘導之細胞凋亡的基因之siRNA(例 如 ’ UbcHlO、叢蛋白⑼exin) B1 (PLXNB1)、含有 SET結 構域之蛋白7 (SET7)、促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶5 (MAP3K5) ; STE20樣激酶（JIK)、内質網多跨跨膜蛋白 (RFT1)、MAP激酶相互作用絲胺酸/蘇胺酸激酶！ (MKNK1)、促分裂原活化蛋白激酶-活化蛋白激酶2 (MAPKAPK2) '磷脂醯肌醇_4_磷酸5_激酶，第1型，丫 (PIP5K1C)、MAP2k5、細胞週期調節蛋白依賴激酶6 (CDK6)、肌肉、骨骼、受體酪胺酸激酶（MUSK)、活化素 A受體第II型-1樣（acvRLI)、Gardner-Rasheed貓科動物肉 瘤病毒（v-fgr)癌基因同系物（FGR)、核醣體蛋白S6激酶， 90kD ’多肽5 (RPS6KA5)及促分裂原活化蛋白激酶7 (MAPK7);參見，美國專利公開案第2〇〇5/〇〇79172號之圖 28)。 131613.doc 41 200911835 在一些實施例中，細胞凋亡誘導劑係小分子化合物（例 如’分子量小於1500道爾頓且在一些情形下小於1〇〇〇道爾 頓之分子）。例如，細胞凋亡誘導劑可為抑制基因產物（該 基因產物抑制TRAIL誘導之細胞凋亡）表現或活性之小分子 化合物（例如，UbcHl 0、叢蛋白（plexin) b 1 (PLXNB 1)、含 有SET結構域之蛋白7 (SET7)、促分裂原活化蛋白激酶激 激S# 5 (MAP3K5)，STE20樣激酶（jik)、内質網多跨跨膜 蛋白（RFT1)、MAP激酶相互作用絲胺酸/蘇胺酸激酶1 (MKNK1)、促分裂原活化蛋白激酶-活化蛋白激酶2 (MAPKAPK2)、磷脂醯肌醇-4-磷酸5-激酶，第1型，γ (PIP5K1C)、MAP2k5、細胞週期調節蛋白依賴激酶6 (CDK6)、肌肉、骨骼、受體酪胺酸激酶（MUSK) '活化素 A受體第II型-1樣（ACVRL1)、Gardner-Rasheed貓科動物肉 瘤病毒（v-fgr)癌基因同系物（FGR) '核醣體蛋白S6激酶， 90kD，多肽5 (RPS6KA5)及促分裂原活化蛋白激酶7 (MAPK7);參見’美國專利公開案第2〇〇5/〇〇79172號之圖 28)。 細胞凋亡誘導劑亦可為增強基因產物（該基因產物促進 TRAIL誘導之細胞凋亡）表現或活性之小分子化合物（例 如 ’ UbcHIO、叢蛋白（plexin) B1 (PLXNB1)、含有 SET結 構域之蛋白7 (SET7)、促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶$ (MAP3K5) ; STE20樣激酶（jik)、内質網多跨跨膜蛋白 (RFT1)、MAP激酶相互作用絲胺酸/蘇胺酸激酶1 (MKNK1)、促分裂原活化蛋白激酶-活化蛋白激酶2 131613.doc •42- 200911835 (MAPKAPK2)、磷脂醯肌醇_4_磷酸5_激酶，第1型，丫 (PIP5K1C)、MAP2k5、細胞週期調節蛋白依賴激酶6 (CDK6)、肌肉、骨骼、受體酪胺酸激酶（MUSK)、活化素 Αχ 體第 Π型 _1 樣（ACVRL1)、Gardner-Rasheed貓科動物肉 瘤病毒（v-fgr)癌基因同系物（FGR)、核醣體蛋白S6激酶， 90kD ’多肽5 (RPS6KA5)及促分裂原活化蛋白激酶7 (MAPK7);參見，美國專利公開案第2005/00791 72號之圖 28)。 用於篩選基因及其所編碼多肽之調節劑（包括小分子調 卽劑）之方法及聚合製備siRNA或已知基因之其他抑制聚核 苷酸之方法皆為熟習此項技術者所熟知。參見，例如，美 國專利苐 6,573,099 號及苐 6,506,559 號；/Vkcz.p/e·? Practice of High Throughput Screening，K. Murray(編 輯），CRC Press (2003) ; Throughput Screening:
MeMoA and /Voiocok，W. Janzen(編輯），Humana Press (2002) ; PCT 公開案 W〇 95/35503、WO 95/30642 及 WO 91/18980 ; Schultz等人，Bioorg Med Chem Lett 8:2409-2414，1998 ;及 Weller等人 ’ Mol Divers. 3:61-70，1997。 可用於篩選該等基因及其產物之調節劑之額外方法揭示於 (例如）Sambrook等人，Mo/ecw/ar CVomig·· J Manual, Cold Spring Harbor Press ’ Ν.Υ·，第 3版（2001); 及 Ausubel 寺人，Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley & Sons公司，New York (1987-2006)。 在一些實施例中，細胞凋亡誘導劑與抗-DR5抗體激動劑 131613.doc -43- 200911835 、结合。在其他實施例中，細胞凋亡誘導劑未與抗-DR5抗體 激動劑結合。
1. SMAC 在—些實施例中，細胞凋亡誘導劑係SMAC/Diablo或 SMAC模擬物或激動劑。SMAC/Diablo藉由結合細胞凋亡 蛋白（IAP)抑制劑促進半胱天冬酶活性。參見，例如，Du 等人 ’ CeU 102:33-42 (2000) ; Verhagen 等人，Ce// 102 43-53，2000 ;美國專利申請案第2002/01 10851號。本 發明涵蓋在細胞中投與或表現SMAC。亦可表現或投與 SMAC片段，例如SMAC之N-端肽（例如，N-端四肽或七肽 (Guo等人’ 99(9):3419_3426 (2〇〇2); 人 ’乂 出〇/. C/zem. 275:36152-36157 (2000))。亦參見，美 國專利申請案第2002/0 132786號。 另外’亦可根據本發明使用SMAC模擬化合物。該等化 合物可具有有用之醫藥特性且因此與抗-DR5抗體一起投與 可能更加有效。例示性SMAC模擬物包括（例如）包含在IAP 之BIR結構域内結合表面凹槽之四肽（包括式之四 肽，其中乂]係A，Χ2係V、Τ或I，Χ3係Ρ或Α且Χ4係F、Υ、 I或V)的肽或闡述於PCT WO 02/26775中之其他SMAC肽、 激動劑或肽模擬物。其他例示性SMAC模擬物包括 LBP672。參見，例如’來自美國專利公開案第2005/0079172 號之圖15。 2. 26S蛋白酶體抑制劑 在一些實施例中，細胞凋亡誘導劑係26S蛋白酶體抑制 131613.doc •44- 200911835 劑。蛋白酶體抑制劑係抑制蛋白酶體-泛素通路由此防止 ΙκΒ降解及隨後ΙκΒ之配偶體NFkB核定位之試劑。蛋白酶 體具有兩個功能組件：20S核心催化亞單位及19S調節亞單 位。20S及19S亞單位形成添加泛素時對降解靶向之蛋白質 實施降解的26S複合物。例示性蛋白酶體抑制劑包括（例 如）乳胞素、PS-341 (NSC號為681239)及類似物（Adams， Cur. Opin. Chem Biol. 6:493-500 (2002))、PS-273 (NSC號 為 681226) ; PS-293 (NSC號為 681227) ; PS-296 (NSC號為 681228)，PS-303 (NSC 號為 681229) ; PS-305 (NSC 號為 68123 1)，PS-313 (NSC 號為 681234) ; PS-321 (NSC 號為 681236) ; PS-334 (NSC 號為 681237) ; PS-364 (NSC 號為 681242) ; PS-325 (NSC 號為 683086) ; PS-352 (NSC 號為 683094) ; PS-383 (NSC號為 683098)、YU101 (ac-hFLFL-環 氧化物）（參見，例如，Elofsson等人，C/zem. 5ζ·ο/·6:811- 822 (1999))、MG262、MG132、MG115、PSI(蛋白酶體抑 制劑N-苄基氧基羰基_iie_Glu(0-第三丁基）-Ala-白胺酸）。 用於谶別蛋白_體抑制劑之分析物可自（例如）Disc〇verx (Fremont, CA)購得。 雖然26S蛋白酶體抑制劑與DR5激動劑（例如，本發明抗-DR5抗體）之組合可為多種過度增殖性病症之有效療法，但 該組合尤其可有效抵抗具有β似或線粒體缺陷之癌細胞。 例如，結腸癌患者通常具有Bax具有缺陷之腫瘤細胞。因 此’與DR5拮抗劑組合之蛋白酶體抑制劑尤其可有效治療 包括β αχ或線粒體缺陷之結腸癌。 131613.doc -45- 200911835 在一些實施例中，蛋
白酶體抑制劑係式I化合物
其W係未經取代或經取代之芳基；芳纽基_， 泫方基部分未經取代或經取代；未 ，、 基；或雜璟美俨其姑且 * 士# 取代之雜環 、1土烷基叛基，其中遠雜環基部分未經取 取代；R2係未經取代或經取代之之雜芳基…、未經取代或經二==取:未經取代或經以下取代：未經取代或經取代：環：：二 經取代或經取代之芳基、或包含至 土 個Si原子之未經取 代或經取代之雜芳基；&係式U部分， 、’
B--A2 A1 (ΙΑ) 其:ΑΑΑ2係經基或經取代經基或與結合删原子及兩個结 合氧原子一起形成式ΙΑ*環，
〇~—w (ΙΑ*) 其中w係伸烷基、經取代伸烷基、未經取代或經取代之伸 環烷基、未經取代或經取代之伸二環烷基或未經取代或經 取代之伸三環烷基；且Rs係未經取代或經取代之烷基、未 1316l3.doc •46· 200911835 二取代或經取代之芳基、未經取代或經取代之雜環基、戈 未經取代或經取代之環烷基；或其鹽。 在式1情形中，所用之一般術語具有以下含義：芳基較 佳具有不多於20個碳原子、尤佳不多於12個碳原子之環系 •充較佺為單環、二環或三環，且未經取代或經取代，在 每一情形下較佳為未經取代或經取代之苯基或（尤佳卜或、) 茗基—或多個取代基較佳獨立選自由下列組成之群：脂 肪族基；游離、醚化或酯化羥基；游離或酯化羧基；甲醯 基，烷醯基；未經取代、經單_或二_取代之胺基；巯基丨 石尹、基’燒硫基；胺曱醯基；烷基-胺曱醯基；二-燒 基-胺甲醯基；苯基；萘基；雜環基，尤佳為吡啶基；氰 基及硝基，更佳選自烷基，例如，甲基、乙基或丙基；烷 氧基’例如’曱氧基或乙氧基；經二-取代之胺基，例 如’ 一甲基胺基；_素’例如氯或溴；鹵代烷基，例如， 二氟甲基；及苯基，（尤佳丨_或2_)_萘基，及尤其如下文所 疋義之雜環基’尤佳為吡啶基’例如，3-、4-或尤佳2-吡 咬基’其各未經取代或經一或多個（尤其至多三個）尤其獨 立選自剛剛提及之其他芳基取代基之取代基取代。芳基& 更佳為聯苯基，尤佳2-、4-或較佳3-聯苯基；吼啶基苯 基’尤佳4-、3-或最尤佳2-吡啶基-(2-、4-或較佳3-)苯 基’或低碳數院基-苯基’尤佳丙基·苯基，例如2_、4-或 尤佳3-異丙基苯基。芳基烷基羰基Ri(芳基未經取代或較佳 經取代）較佳為芳基如上文所定義之芳基-低碳數烷基羰 基’更佳為苯基-低碳數烷基氧基-苯基_低碳數烷基羰基， I31613.doc -47- 200911835 尤佳2-、4-或（較佳）3-苄基氧基-苯基-乙醯基或_丙醯基； 吡啶基-低碳數烷基氧基苯基-低碳數烷基幾基，尤佳2_、 4-或（較佳）3-(吡啶-2-、-4-或（較佳乙醯基或-丙醯 基；或苯基-低碳數烷基羰基，尤佳苯基或（較佳）3_苯 基-丙酿基或本基乙醯基’其中苯基未經取代或經至多三 個獨立選自低碳數烷氧基（尤佳曱氧基）、南素（尤佳氟或 氯）或鹵代-低碳數烷基（例如三氟甲基）之取代基取代。未 經取代或經取代之芳基&或（獨立地）&較佳為經單、二_或 三-取代之苯基，尤佳經至多四個獨立選自對於芳基所提 及者之取代基取代之苯基，取代基尤佳選自羥基、低碳數 烷氧基（最佳）（較佳為甲氧基）、_素（較佳為氟或氯）及鹵 代-低碳數烷基（較佳為三氟甲基），尤佳為經至多三個低碳 數烷氧基（較佳為甲氧基）取代基取代之苯基，或在&之情 形下未經取代之苯基或其他未經取代或經取代之萘基，尤 佳未經取代或經至多四値獨立選自對於芳基所提及者之取 代基取代之1_或2_萘基，取代基尤佳選自减、低碳數院 氧基（最佳K較佳為甲氧基）、_素（較佳為氟或氯）及齒代_ 低碳數烧基（較佳為三氟甲基）。 未經取代之雜環基較佳為如下之雜環基：鍵結環不飽 和、飽和或部分飽和且較佳為單環狀或更廣義而言為二環 狀或—％狀％，具有3個至24個、更佳4個至Μ個環原子； 其中至少在與式1分子基團鍵結之環中對應芳基之一或多 1車“圭j固至四個、尤佳一個或兩個碳原子經選自由 氮、氧及硫組成之群之雜原子取代，鍵結環較佳具有4個 131613.doc -48- 200911835 至12個、尤佳5個至7個環原子；雜芳基未經取代或經一或 多個、尤佳1個至3個獨立選自由上文所定義作為經取代芳 基之取代基的取代基組成之群的取代基取代；且尤佳為選
自由下列組成之群之雜芳基：咪唑基、噻吩基、。夫喃基' 四氫呋喃基、吡喃基、噻蒽基、異苯并呋喃基 '笨并呋喃 基、吮烯基、2/7-吡咯基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯啶 基、咪唑基、咪唑啶基、苯并咪唑基、吡唑基、π比唑啶 基、吡喃基、噻唑基、異噻唑基、噁唑基、異噁唑基、吡 啶基、吡嗪基、嘧啶基、六氫吡啶基、六氫吡嗪基、嗒嗪 基、嗎啉基、硫嗎啉基、吲嗪基、異吲哚基、3吲哚 基、吲哚基、吲唑基、三唑基、四唑基、嘌呤基、4仏喹 嗪基、異喹啉基、喹啉基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、 十氫喹啉基、八氫異喹啉基、苯并呋喃基、笨并噻吩基、 呔嗪基、萘啶基、喹噁啉基、喹唑啉基、喹唑啉基、唓啉 基、喋啶基、咔唑基、β-°弄啉基、啡啶基、吖啶基、萘嵌 :二氮雜苯基、啡琳基、D夫咕基、吩嗓基、吩d塞嗪基、吩 心秦基、異咬基及吹基’每_該等基團未經取代或經—個 或兩個選自由下列組成之群之基團取代：低碳數烷基(尤 佳為甲基或第三丁基）' 低碳數烷氧基（尤佳為甲氧基）、及 ^素（尤佳為演或氯）；吼咬基（尤佳為2或3_吼咬基卜或巧 °朵基尤佳，在更廣泛態樣中為低碳數炫基·⑼基、嘴咬 基或低蚨數烷基嘧啶基、鹵代_低碳數烷基吡啶基、低碳 :烷氧基-吡啶基、二-低碳數烷基_吡啶基或處代_吡啶 土。雜環基未經取代或經一或多個（較佳至多三個）獨立選 131613.doc -49- 200911835 自以下之取代基取代··彼等上文對於芳基所提及者（其中 作為雜環絲代基之雜環基n定基或㈣基外不帶有其 他雜環基取代基）及如上文所定義之芳基，尤佳為苯基， 尤其彼等作為較佳者提及者。未經取代之雜環基較佳。 在雜環基烷基羰基心中，雜環基部分較佳為如上文所提 及之經取代或尤佳未經取代之雜環基；較佳者係經取代或 較佳未經取代之雜環基-低碳數院基，尤佳末端經取代或 較佺未經取代之雜環基（雜環基如上文所述”較佳者係呲 啶基-低碳數烷基羰基（例如_乙醯基或、丙醯基）。 作為R〗’未經取代或經取代之芳基或經取代之芳基-低 碳數烷基羰基較佳。雜芳基I較佳為如上文所提及之未婉 取代或經取代之雜芳基，尤佳為未經取代或經一或多Z (尤其至多三個）獨立選自彼等上文對於經取代之芳基所提 及者之取代基取代之，絲，取代基尤其選自祕、低碳 數烧氧基（最佳）(較佳為甲氧基）、齒素（較佳為氟或幻及: 代-低碳數烷基（較佳為三氟甲基）。&較佳為經取代之 基。 π 丁入I 土土夕/個碳原 子，最佳至多4個碳原+’且為脂肪族烴基，例如未經取 代或經取代之炔基、烯基或較佳為燒基，更佳為低碳數& 基，尤佳為甲&、乙基、正丙基、異兩基、正丁基、第二 丁基、異丁基或第三丁基。 可為具支鏈或直鏈之院基較佳具有至多12個碳原子，且 更佳為低碳數烷基。烷基&較佳為低碳數烷基，尤佳異丁 131613.doc -50- 200911835 基。 前綴”低碳數，，表示具有至多且包括7個、較佳至多且包 括4個碳原子之基團。 低碳數烷基較佳為正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、 第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基 或正庚基’較佳為異丁基、第二丁基'第三丁基、異丙 基、乙基或曱基，最佳為異丙基、乙基或甲基。 醚化羥基係（例如）烷氧基，尤佳低碳數烷氧基，例如乙 氧基或曱氧基；芳基氧基，尤佳苯基氧基；芳基-低碳數 烷氧基，尤佳苯基-低碳數烷氧基；雜環基氧基，尤佳吡 啶基氧基，或雜環基-低碳數烷氧基，尤佳吼啶基-低碳數 烷氧基（芳基及雜環基較佳具有上文所給出之含義）。 醋化赵基較佳為藉由有機羧酸（例如鏈烷酸）酯化之羥 基’例如低碳數烷醯基氧基。 酉旨化叛基係（例如）烷氧基羰基，尤佳低碳數烷氧基羰基 (例如甲氧基羰基）。 經單-或二-取代之胺基較佳為烷基胺基或二烷基 胺基，尤佳為I低碳數烷基胺基或低碳數见沁二-低碳數 烧基胺基’例如7V-甲基胺基或二甲基胺基。 鹵素為氟、氣、溴或碘，較佳為氟、氣或溴。 未經取代或經取代之環烷基較佳具有至多丨2個、更佳3 個至8個環碳原子且經一或多個（尤其至多三個）獨立選自彼 等對於經取代之芳基所提及者之取代基取代，或較佳未經 取代。較佳者係環戊基、環己基或環庚基。 131613.doc -51 · 200911835 在經未經取代或經取代之環烷基取代之烷基&中烷基 車乂佳如上文所疋義’更佳為低碳數烷基，尤佳異丙基，且 (較佳末端）經如上文所定義之環烷基取代。 在經未經取代或經取代之芳基取代之烧基^中，烧基較 ^如最近段落中所定義，且芳基係如上文所定義且經一或 夕個（尤”至夕二個）獨立選自彼等對於經取代之芳基所提 及者之取代基取代，或未經取代；尤佳芳基係經—或多個 (U夕—個）獨立選自齒素（尤佳為氣）、經基或低碳數 烧氧基（尤佳為甲氧基）之取代基取代，或其為未經取代之 苯基。 ^在經未經取代或經取代之雜環基取代之烷基R3中，烷基 車又U對於經基取代之烧基R3所定義，且雜環基係如 上文所定義且經-或多個（尤其至多三個）獨立選自彼等對 U代之雜％基所提及者之取代基取代，或未經取代。 ^ 1及八2各為經取代之羥基，則經取代之羥基較佳為烷 ^尤仏低碳數烷基氧基；芳基氧基，尤佳具有如上 =所定義之未經取代或經取代之芳基者；或具有如上文所 疋^之未t取代或經取代之環炫基的環烧基氧基。 „a2與結合硼原子及氧原子一起形成上文所示之式 衣貝J W較#帶有與在兩個不同碳原子上之石朋原子結 合之兩個ϋ ；§ 2 _ 山 ，、子，该兩個不同碳原子為空間上鄰近或相鄰 之奴原子’尤其在Β比鄰C'1，2-”)或'3”-位置(相對彼此)。 八、元基較佳為非具支鏈C2-Ci2-，車交佳為c2_c7伸烧基部 1伸乙基或伸丙基’在更廣泛態樣中為伸丁基、伸 1316I3.doc •52· 200911835 戊基或伸己基，其級由如剛才所述之兩個不同碳原子（較 佳毗鄰或在”1，3，，-位置）結合。一或多個（尤其一個）未與氧 原子（與硼原子結合）結合之碳原子可由選自〇、s或較佳 N(分別帶有需要數目之H原子）之雜原子替換，例如在1,5-(3-氮雜-伸戊基）中。 . 、’二取代之伸烷基較佳為如上文所定義之非具支鏈低碳數 伸烷基刀，其未經取代或經一或多個（尤其至多三個）較 f^獨立選自以下之取代基取代··低碳數烷基（例如曱基或 乙基），例如在i-甲基伸乙基、丨，2_二甲基伸乙基中；羥 ^例如在2_經基-伸丙基中；或羥基-低碳數烷基，例如 羥基甲基，例如在1-羥基曱基-伸乙基中。 未經取代或經取代之伸環烷基較佳為經由如對於貨所述 之兩個不同碳原子（較佳抵鄰或在"1，3，,-位置）結合之C3_ k '更佳為c3-c8_伸環烧基’例如伸環己基或伸環戍 2人八中或夕個（尤其一個）未與氧原子（與硼原子結合） υ 、、“之碳原子可由選自〇、s或Ν(分㈣有需要數目之Η原 :之雜原子替換’例如在伸四氫咬。南基或伸四氫^南基 :可未經取代或經一或多個(尤其至多三個)獨立選自 〜取代基取代··低碳數院基（例如甲基或乙基）、經 二、二基-低碳數烧基（例如甲氧基）或單_或 泰糖基（泰糖基"較佳包含至多五個糖基部分）。 述之=代或經取代之伸二環烧基較佳為經由如對於w所 同碳原子(較佳峨在'3'心 %坑基，其中一或多個（尤其一個）未與氧原子（與 131613.doc •53· 200911835 删原子結合）結合之碳 料可由選自◦、(分別帶有需 、 原子）之雜原子替換，且可未經取代或經一或多 Γ:二其至多三個)獨立選自以下之取代基取代：低碳數烷 土（列如甲基或乙基）、經基及經基_低碳數院基（例如尹氧 基）較佳者係伸蒎烷基（pinanyiene；)(2,3-(2,6,6-三甲基-二 環[3.1.1]庚烷》。 土― 、未經取代或經取代之伸三㈣基較佳為經由如對於W所
述之兩個不同碳原子（較佳毗鄰或在”丨，3，，_位置）結合之 C12-伸三環院基，其中一或多個（尤其一個）未與氧原子（與 蝴原子結合）結合之碳原子可由選自◦、s或N(分別帶有需 要數目之Η原子）之雜原子替換，且可未經取代或經一或多 個（尤其至多三個）獨立選自以下之取代基取代：低碳數燒 基(例如甲基或乙基）、羥基及羥基-低碳數烷基(例如曱氧 基）。 ^佳地，r4係·Β(〇Η)2或2,9,9_三甲基_3,5_二氧雜_4,_ 一％[6.1.1.〇2’6]癸_4_基，尤其（18,25，此，88)_2,9,9_三曱基_ 3,5-二氧雜-4-硼_三環[611〇2,6]癸_4_基。 在未經取代或經取代之烷基Rs中’可為具支鏈或直鏈之 烷基車乂佳具有至多12個碳原子，且更佳為低碳數烷基。烷 、5較佳為低奴數烧基，尤佳異丙基。可存在一或多個 (尤其至多兩個）之取代基獨立選自未經取代或經取代之芳 土（尤佳笨基或备基苯基）、未經取代或經取代之雜環基（尤 仏米唑基或吲哚基）、未經取代或經取代之環烷基，各自 如上文所定義；羥基（較佳）、羧基（較佳）、胺曱醯基、巯 131613.doc -54- 200911835 基、低碳數烷硫基（例如曱硫基）、苯基、羥基苯基、吲哚 基、味嗤基、胺基、三-低碳數烷基胺基（例如三曱基胺 基）、低奴數烷醯基胺基(；例如乙醯基胺基）、胍基、N_低碳 數烷基胍基（例如N-甲基胍基）或使包含心之胺基酸完整之 任何其他取代基。較佳地，R5可為曱基、異丙基、異丁 基、第一丁基、酼基曱基、2_曱硫基乙基、苯基曱基、羥 基苯基甲基、叫丨°朵-3-基甲基、羥基曱基、丨_羥基乙基、2_ 經基乙基、胺甲醯基甲基、2_胺甲醯基乙基、4_胺基丁 基、3-胍基丙基、5_咪唑基甲基、羧基曱基或2_羧基乙 基。 所存在之式I化合物之不對稱碳原子可以（R)、（s)或（R,s) 構型存在，較佳以（R)或（S)構型，最佳以下文式中所表 不之構型。在雙鍵或環上之取代基可以順式_(=z_)或反式 (-E-)形式存在。因此，該等化合物可以同分異構體之混合 物形式或較佳以純同分異構體形式存在。 式I化合物中之鹽形成基團係具有鹼性或酸性特性之基 團或基。具有至少一個鹼性基團或至少一個鹼性基（例如 胺基、不形成肽鍵之二級胺基或。比咬基）之化合物可形成 酸加成鹽，例如與諸如鹽酸、硫酸或磷酸等無機酸，或與 適宜有機羧酸或磺酸’例如脂肪族單-或二-羧酸，例如三 氟乙酸、乙酸、丙酸、羥基乙酸、琥珀酸、馬來酸、富馬 I、赵基馬來酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸或草酸；或諸 如精胺酸或離胺酸等胺基酸；芳族羧酸，例如苯甲酸、2_ 苯氧基-苯甲酸、2-乙醯氧基-苯甲酸、水楊酸、4_胺基水 131613.doc •55· 200911835 « H脂肪族缓酸’例如扁桃酸或肉桂酸；雜芳族 竣酸’例如煙酸或異煙酸；脂肪族續酸，例如甲烧-、乙 烷-或2/规基乙烷磺酸；或芳族磺酸，例如苯_、對曱苯-或 萘-2-¾酸。當存在若干鹼性基團時，可形成單-或多-酸加 成鹽。 具有酸性基團（例如游離硼酸基團（_b(〇h)2，即，在式 IA*中AjA2各為經基）或叛基）之式r化合物可形成金屬或 銨鹽’例如鹼金屬或鹼土金屬鹽(例如鈉、鉀、鎂或鈣鹽) 或與氨或適宜有機胺（例如三級單胺，例如三乙基胺或三_ (2-經基乙基）_胺或雜環驗’例如^乙基_六氫。比。定或 二曱基六氫吡嗪）形成之銨鹽。可為鹽之混合物。 具有酸性及驗性基團二者之式!化合物可。形成内鹽。例 不性式ί化合物包括彼等以下者：其中、係經取代之芳基_ 低碳數烧絲基或未經取代或經取代之芳基；Μ經取代 之芳基或未經取代或經取代之雜環基；Μ低碳數烧基、 未經取代聽取代U基或縣㈣代❹取狀芳基取 代之低碳數烧基；R4係上文所給出之式ια部分，其中〜及 Α2係經基、低碳數烧基氧基、具有未經取代或經取代之芳 基之方基乳基或具有未經取代或經取代之環炫基之環烧基 氧基’或其中Al及Α2與結合蝴原子及兩個結合氧原子-起 形成上文所給出之式ΙΑ*環，其中w係未經取代或經取代 之低碳數伸縣，其經由空間上鄰近^鄰之兩個不同碳 原子（尤其田比鄰或相對彼此在Ά位置）結合；认係低礙 數烷基，或其鹽。 131613.doc •56- 200911835 例不性式I化合物包括彼等以下者：其中Rl係苯基氧基 苯基-低碳數烧基羰基；苯基_低碳數烷氧基苯基_低碳數烷 基&基’《比啶基氧基苯基-低碳數烷基羰基；苯基-低碳數 烧基幾基’其經低碳數烷氧基（尤佳甲氧基）、鹵素（尤佳氟 " 或氯）或函代-低碳數烷基（尤佳三氟甲基）取代；或較佳為 未經取代或經取代之苯基或萘基，其中在兩種情形下取代 - 基（若存在）均獨立為一或多個（尤其一個至三個）選自由下 列組成之群之取代基：低碳數烷基、羥基、低碳數烷氧 C、 基、低碳數烷醯基氧基、羧基、低碳數烷氧基羰基、曱醯 基、低碳數烧醯基、胺基、Ν-低碳數烷基胺基、Ν，Ν-二-低碳數烧基胺基、巯基、磺基、低碳數烷硫基、胺甲醯 基、低碳數烷基-胺曱醯基；7^，二_低碳數烷基_胺曱醯 基、苯基、萘基、吼啶基、氰基及硝基，更佳為低碳數烷 氧基烧氧基（尤佳曱氧基或乙氧基）；r2係經一或多個（尤其 一個至三個）獨立選自由下列組成之群之部分取代之苯 I 基：經基、低碳數烷氧基（尤佳甲氧基）、鹵素（尤佳氟或 氯）及鹵代-低碳數院基（尤佳三氟甲基）；R3係低碳數烧基 (尤佳異丁基）、苯基或經一或多個（尤其至多三個）獨立選 ^ 自由下列組成之群之取代基取代之苯基：羥基、低碳數烷 -氧基（尤佳甲氧基）、_素（尤佳氟或氣）及_代-低碳數烷基 (尤佳三氟甲基）；尺4係-8(〇11)2(尤佳）或2,9,9-三甲基-3，;5- 二氧雜-4-硼-三環[6.1.1.〇2,6]癸-4-基，尤佳（13,23,6尺，88)-2,9,9-三甲基-3,5-二氧雜-4-硼-三環[6,1·1·〇2,6]癸-4-基；且
Rs係低碳數烷基，尤佳異丙基；或其鹽。 131613.doc -57- 200911835 例示性式i化合物包括彼等以下者：其中心係苯基氧基 苯基乙醯基、f基氧基苯基乙醯基m氧基笨基乙酿 基、聯苯基、吼啶基苯基、低碳數烷基苯基或經取代之苯 基丙醯基氧基，其中苯基取代基係至多三個獨立選自由甲 氧基、氟、氯及三氟曱基組成之群之取代基；1係經至多 三個曱氧基取代基取代之苯基，尤佳2,3,4_三甲氧基苯基 或3,4,5-二甲氧基苯基；尺3係異丁基或未經取代或經至多 二個獨立選自羥基、氟及甲氧基之部分取代之苯基；尺4係 (lS，2S，6R，8S)-2,9,9-三甲基-3,5-二氧雜-4-石朋-三環 [6.1.1.02’6]癸-4-基或尤佳-B(〇H)2 ;且R5係異丙基，或其 〇 例示性式I化合物包括彼等以下者：其中Rl係聯苯基、 低碳數烷基-苯基、苯基-低碳數烷基-羰基、苯氧基-苯基_ 低碳數烷基-羰基、笨基-低碳數烷氧基-苯基-低碳數烷基_ 羰基或吡啶基-苯基；R2係經1個至3個低碳數烧氧基取代 之苯基或苯基-低碳數烷氧基-苯基；R3係低碳數烷基或苯 基-低碳數烷基；R4係4,4,5,5-四曱基-[1，3,2]二氧雜硼咮-2-基、（18,28,611，88)-2,9,9-三甲基-3,5-二氧雜-4-硼-三環 [6.1.1_02’6]癸-4-基或-8(〇1^)2;且115係低碳數炫>基；或其 〇 其他例示性式I化合物或其鹽包括彼等其中立體化學係 如式I*中所繪示者： I31613.doc -58- 200911835
其中所示構型代表絕對構型且其 中R,、R2、r3、R4及尺5具 尤其彼等上文闡述為較 有如對式I化合物所定義之含蠢、 佳之含義。 或其鹽包括彼等其中立體化學係 其他例示性式I化合物 如式I * *中所繪示者：
R2、R3、尺4及115具 彼等上文闡述為較 其中所示構型代表絕對構型且其中R1、 有如對式I化合物所定義之含義，尤其 佳之含義。 其他例示性式I化合物或豆 物 4 1 a括非對映異構體之混合 ，其中立體化學係如式I* * *中所繪示：
其中所示構型代表絕對構㉝且其tR,、R2、R3、〜及^具 有如對式I化合物所定義之含義，尤其彼等上文闡述為較 佳之含義。 最尤佳者係實例中所闡述之式I化合物或其醫藥上可接 131613.doc -59- 200911835 受之鹽。 式1化合物或其鹽係按照習知方法製備 包含：a)使式II之二肽類似物 該等方法較佳
其中R3、R4及R5具有式I下所給出之含義 與式III之胺基酸
〇
或具反應性衍 I '八八Z穴匁八1下戶斤給出之 含義，式II及/或III化合物中所存在 /α 廿牡I g此團（除芩與該反 應之基團外）視需要藉由容易移除之徂1 刃砂陈之保4基團保護，並移
除所存在之任何保護基團；4b)為產 或雜環基烷基羰基且其他部分r2至R
含義的式I化合物’使式IV之胺基化合物 生Ri係芳基烷基羰基 5具有式I下所給出之
其中R2、 R·3、R4及Rs具有式Ιτ所給出 之含義’與式V之碳酸
Ri
(V) 或其反應性衍生物反應 其中Ri係芳基烷基羰基或雜環基 131613.doc -60- 200911835 烷基碳基，式IV及/或V化合物中所存在之官能團（除參與 *亥反應之基團夕卜）視需要藉由容易移除之保護基團保護， 並移除所存在之任何保護基團，且若需要，將藉由方法a) 或b)所獲得之式Ϊ化合物轉化成另一式丨化合物，將所獲得 之式I游離化合物轉化成鹽，將所獲得之式〗化合物之鹽轉 化成不同鹽或轉化成其游離形式，及/或將異構式丨化合物 之混合物分離成單獨異構體。 式I化合物之不同可能立體異構體可藉由使用具有適合 構型之離析物製備。例如，式p化合物或其鹽可藉由以4 製備：a)使式II*之二肽類似物
其中R3、 R4及R5具有式I下所給出之含義，與式ΠΙ*之胺基酸
“-一、“久^…’丨u皆物中所存在之官 勿中所存在之官能團（除參與該 容1易移除之保護某® _ 反應之基團外）視需要藉由容易移除之保負
1316I3.doc 61 200911835
(ΙΝΛ) 其中r2
R3、化及汉5具有式I下所給出Rl\ OH 之含義，與式V之碳酸 (V) 或其反應性衍生物反
丹T K丨係方基烷基恢丞或 烷基羰基，式IV*及化人榀由斛六士 X雜衣基 久化合物中所存在之官能團（除參與 該反應之基團外)視需要藉由容易移除之保護基團保護:、並移除所存在之任何保護基團，且若需要將藉由方法a)或 b)所獲知之式I*化合物轉化成另一式p化合物，將所獲得 之式I*游離化合物轉化成鹽，或將所獲得之式化合物之 鹽轉化成不同鹽或轉化成其游離形式。
式I之終產物可含有亦可在用於製備式丨之其他終產 物的起始材料中用作保護基團的取代基，例如在1不 為·Β(ΟΗ)2之情形下。因此，在本文範圍内，除非文中另 有Α明’否則僅將非特別期望式I終產物之構成之可容易 移除之基團稱為"保護基團”。 該等保護基團對官能團之保護、保護基團本身及其切除 反應闡述於（例如）標準參考著作中，例如j. F. w. Mc〇mie， 'Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, London and New York 1973 ; T. W. Greene 及 P.G.M.
Wuts，"Protective Groups in Organic Synthesis"，第 3版， Wiley，New York 1999 ;，，The Peptides” ’ 第 3卷（編者·· E. 131613.doc -62- 200911835
Gross及 J· Meienhofer), Academic Press, London and New York 1981; "Methoden der organischen Chemie" (Methods of organic chemistry), Houben Weyl，第 4版，第 15/1 卷， Georg Thieme Verlag，Stuttgart 1974; H.-D. Jakubke及 Η· Jescheit, "Aminosauren, Peptide, Proteine" (Amino acids, Peptides, Proteins), Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach, and Basel 1982 ;及 Jochen Lehmann, "Chemie der Kohlenhydrate: Monosaccharide und Derivate" (Chemistry of Carbohydrates: Monosaccharides and Derivatives)， Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974 ° 保護基團之特徵係其可藉由（例如）溶劑分解、還原、光 解或另一選擇為於生理條件下（例如藉由酶促切除）容易地 移除（即不發生不期望之副反應）。 -Β(ΟΗ)2、基團保護基團之移除（以獲得其中尺4係_b(〇h)2 之式I化合物）較佳用酸（例如，鹽酸）在合適溶劑（例如低碳 數烧醇（例如曱醇）或低碳數烷烴（例如己烷）或其混合物）中 於0-50°C之溫度（例如，室溫）下發生。 至少兩種方法可用以合成式丨之蛋白酶體抑制劑。在方 法"a"中’該反應係藉由如下實施：將式m化合物溶解 於適宜溶劑（例如二曱基曱醯胺、見二曱基乙醯胺、 甲基-2-吼哈咬酮、二氯曱烷或兩種或更多種該等溶劑之 混合物）中’並添加適宜鹼（例如三乙基胺、二異丙基乙基 胺（DIEA)或iV-曱基嗎啉）及可原位形成式m碳酸之較佳反 應性衍生物的適宜偶合試劑，例如二環己基碳化二亞胺_ 131613.doc • 63 - 200911835 羥基苯并三唑（DCC/HOBT);四氟硼酸二氫_2_氧 代-卜吡啶基）-HA^’，A^-四甲基脲鑌（Τρτυ);四氟硼酸〇_ (苯并三唑-1-基）-N，N,N'，N’-四曱基腺鑌（TBTU);或丨_(3_二 曱基胺基丙基）-3 -乙基碳化二亞胺鹽酸鹽（edC)。對於其他 可能偶合试劑之评論，參見例如，Klauser; Bodansky 办价心❿1972，453-463。較佳在介於約_2〇〇c與5〇〇c之 : 間、尤其介於〇°C與室溫之間之溫度下攪拌反應混合物以 產生式I化合物。反應較佳在諸如氮氣或氬氣等惰性氣體 ^ ' 中實施。 在方法”b"中，反應較佳在與彼等對於方法a)所述之條件 類似之條件下實施。 具有鹽形成基團之式I化合物之鹽可以本身已為吾人所 習知之方式製備。因此，式J化合物之酸加成鹽可藉由用 酸或用適宜陰離子交換試劑處理而獲得。 鹽通常可（例如）藉由用適宜鹼性試劑處理轉化成游離化 〇 合物，例如用鹼金屬碳酸鹽、碳酸氫鹽或氫氧化物（一般 而s為碳酸卸或氫氧化鈉）處理。 宜分離方法以本身已為吾人所習知 異構體。舉例而言，非對映異構體 法層析、/谷劑分佈法及類似程序 立體異構混合物（例如非對映異構體之混合物）可藉助適 習知之方式分成其對應同分
131613.doc •64- 200911835 助層析（例如藉由HPLC)，使用層析基質及對掌性配體。 可按照標準程序（例如）使用異丁基-硼酸（i_BuB(〇H)2)在 酸（尤佳氫鹵酸）存在下於水/甲醇/己烷混合物中在較佳介 於0 C至50 C範圍内之溫度（例如，在室溫下）下將其中&不 為-B(OH)2之式I化合物轉化成其中&係_b(〇h)2之式〗化合 物。 在方法a)及b)二者中，對於中間體或起始材料之轉化或 合成，除非在方法闡述中另有聲明，否則從中可選擇出彼 等適於所述反應者之溶劑包括（例如）水、g|(通常係低碳數 烷基-低碳數鏈烷酸酯，例如乙酸二乙酯）、醚（通常係諸如 二乙醚等脂肪族醚，或諸如四氫呋喃等環醚）、液體芳族 烴（通常係苯或甲苯）、醇（通常係曱醇、乙醇或〖_或2_丙 醇）、腈（通常係乙腈）、鹵代烴（通常係二氣曱烷）、酸醯胺 (通¥係一甲基甲胺）、驗（通常係雜環氮驗，例如。比 啶）、羧酸（通常係低碳數烷烴羧酸，例如乙酸）、羧酸酐 (通常係低碳數烷烴酸酐，例如乙酸酐）、環狀、直鏈或具 支鏈烴（通常係環己烷、己烷或異戊烷）、或該等溶劑之混 合物（例如水性溶液）。該等溶劑混合物亦可用於（例如）經 由層析或分佈處理中。 新穎起始材料及/或中間體以及其製備方法同樣係本發 明之目標。在較佳實施例中，使用該等起始材料且反應條 件經選擇以容許製備較佳化合物。 式II-V之起始材料或其前體已為吾人所習知，其可按照 白知方法製備，或可購得；具體而言，其可使用與彼等實 131613.doc -65- 200911835 例中所述之方法相同或類似之方法製備。 其中取代基係如上文式I下所定義之式π化合物可藉由 (例如）以下反應獲得： 首先’使式VI胺基酸之硼酸類似物
其包含（例如）式VI*中所表示之構型
(VI*) 其中R3具有上文對於式I化合物所給出之含義且、具有上 文對於式I化合物所提及之不為_Β(〇Η)2之含義，尤佳為 (lS，2S，6R，8S)-2,9,9-三曱基-3,5·二氧雜-4-硼 _ 三環 [6.1.1 ·02’6]癸_4_基，或其酸加成鹽（尤佳其三氟乙酸鹽）， 與式VII之胺基酸
(VII) 其包含（例如）式VII*中所表示之構型
Rc (VII*) 或其反應性衍生物（其中Rs具有上文對於化合物所給出 之含義且Pri係經保護之胺基，較佳為第三丁氧基羰基胺 1316l3.doc -66 - 200911835 基）在與彼等對於上文反應a)所述之反應條件類似之反應條 件下（亦為縮合反應，亦較佳原位形成活性碳酸衍生物）縮 合’由此產生呈經N_保護形式之式Η化合物（其隨後去义保 護）’例如’使用上文所提及之標準教科書中所闡述之條 件’在第二丁氧基羰基胺基情形下，例如，用鹽酸在合適 溶劑（例如二噁烷及/或二氯甲烷）中給出可在方法a)中直接 使用之式II化合物。 式VI之爛酸為已知’可購得及/或可按照已知程序合 成。例如’其中R3係低碳數烷基（尤佳異丁基）且尺4係如對 於式VI化合物所闡述（較佳為（1S，2S,6R，8S)_2,9,9_三甲基_ 3,5-二氧雜_4_硼_三環[61102’6]癸_4_基）之式VI化合物可 藉由如下製備：使式VIII化合物
R4 (viii)
其中I具有剛才所闡述之含義，在合適溶劑（例如二氯曱 烷）中與正-低碳數烷基鋰（尤佳正丁基鋰）及隨後與氯化鋅 反應’產生式IX化合物，
(IX) 其中R4具有上文式VI下所給出之含義。隨後使該化合物與 LiN(SiCH3)2反應，並使所得該式化合物在三氟乙酸存在下 131613.doc •67- 200911835 反應產生式x鹽
其中R4具有式VI下所給出之含義，其為式VI化合物且可隨 後如上文所示直接用於與式VII化合物反應。 式III化合物為已知，可購得及/或可按照標準程序碎 得0 例如’其中Ri係♦基（尤佳聯苯基）之式hi化合物可藉由 如下製備：使式XI化合物 2\
R
(XI) 其包含（例如）式XI*中所表示之構型
(XI*) ^具有對於式!化合物 可
R.-X 其中R 1係芳 (XII) 131613.doc 基且X係i素（尤佳漠），在合適溶 如 ^ 68 - 200911835 甲基甲醯胺）中於鹼（尤佳驗金屬碳酸鹽，例如，碳酸鉀）存 在下在介於5 0 C與1 0 0 C之間之溫度（例如，在9 t下）下較 佳在惰性氣體（例如，氮氣或氬氣）中反應。此直接產生對 應之式III化合物。 式VII之胺基酸衍生物為已知，可購得及/或可按照標準 程序獲得。其較佳以胺基經保護之形式使用，例如用第三 丁氧基羰基胺基代替游離胺基。 Γ 式ΠΜ匕合物可藉由以下獲得：例如，使包含（例如 中所表示之構型之如方法a)中所定義之式n化合物與式 XIII之N-經保護的胺基酸
(XIII) 其包含（例如）式XIII*中所表示之構型
(XIII*) 或其反應性衍生物在如上文方法a)下所 應條件下反應’其中尺2係如式!下所定 Η圭縮合反 胺基(尤佳第三丁氧基羰基胺基)隨後自所卩Γ2係經保護之 端胺基係以經保護形式存在之式以化入彳卞化合物（其中N- 基團，例如，在第三丁氧基幾基胺5物）移除N-端保護 烷中。 渭形下用鹽酸在二噫 131613.doc •69- 200911835
2,4-二胺基 _3_ 一胺基-3-羥基羧酸， 在其他實施例& 經基羧酸化合％ 00/64863。例如， XIV之 2,4-二胺 | 劑。參見，PCT WO 蛋白酶體抑制劑係式
其中A及B獨立代表鍵或未經取代或 經取代之胺基醯基部 分:R,代表氫；胺基保護基團；或式RsY基團，其中^代 表氫或未經取代或經取代之烷基、烯基、炔基、芳基、芳 基烧基、㈣基、雜芳基烧基、雜環基或雜環基烧基；且 -S02- ; -O-CO-;或 _〇_ Y代表-CO- ; -NH-CO- ; -NH-CS-; CS- ; R2代表天然胺基酸之側鏈；烷基、芳基烷基、雜芳 基烷基或環烷基烷基；或三甲基甲矽烷基甲基、2_噻吩基 曱基或苯乙烯基甲基；R3代表鹵素、烷基、烷氧基或羥基 烷氧基；且R_4代表2(R)-羥基二氫茚-1(S)-基；（s)-2-羥基-1·苯基乙基；或未經取代或在4位上經甲氧基取代之2_經 基-苄基；其中該2,4-二胺基-3-羥基羧酸係呈游離形式， 係其醫藥上可接受之鹽或醫藥組合物。 未經取代或經取代之烷基較佳為具有1個至5個碳原子、 較佳1個至4個碳原子之烷基；例如，曱基、乙基、異丙基 或第三丁基；其尤佳具有1個或4個碳原子。取代基係（例 如）苯氧基、羥基或未經保護或經保護之胺基。 131613.doc -70- 200911835 未經取代或經取代之芳基烷基係（例如）總共具有7個至 1 0個碳原子之苯基烷基，例如苄基或2-苯基乙基。其未經 取代或在芳基或烷基部分經（例如）羥基（例如在苄基-CH(OH)-或苯基-CH(CH2OH)-中）、經烷基、胺基或烷基胺 基取代；或為（例如）在伸烷基部分具有1個至4個碳原子之 萘基烷基，尤佳為萘基甲基。 胺基保護基團較佳為节基氧基羰基、環烷基烷氧基羰 基，尤佳環己基曱氧基羰基或第三丁氧基羰基。未經取代 或經取代之雜芳基烷基較佳為吡啶基烷基，尤佳2-吡啶基 甲基及4-"比啶基甲基。 芳基、雜芳基及芳基烷基及雜芳基烷基之芳基部分可為 單環狀或多環狀，例如吡啶基、萘基、9-苐基曱氧基羰基 (FMOC)或苯并咪唑基。芳基烷基或雜芳基烷基之伸烷基 部分可經（例如）羥基取代。 雜環基及雜環基烷基之雜環基部分係具有一或多個選自 氮、氧及硫之雜原子的飽和雜環基團。其較佳具有5個或6 個環構成原子，且較佳至多3個雜原子。 環烷基烷基較佳為環己基烷基；其伸烷基部分較佳具有 1個至4個碳原子。 鹵素係II、氣、漠或块，較佳為氯或漠。 烷基及烷氧基較佳具有1個至4個碳原子，尤佳具有1個 或2個碳原子，更尤佳為曱基或曱氧基。 羥基烷氧基較佳為具有2個至4個碳原子之ω-羥基烷氧 基，尤佳為2-羥基乙氧基。 131613.doc 200911835 鹽係諸如鹽酸鹽等酸加成鹽。 式I化合物具有數個對掌性中心且因此可以多種立體異 構體形式存在。除非另有說明，否則本發明提供所有立體 異構體以及外消旋混合物。該等同分異構體可藉由諸如層 析等習用技術解析或分離。自式I看出，在2位上之碳原子 的構型為R，在3及4位上之為S。 1較佳係氫、吼啶基烷氧基羰基、萘基烷氧基羰基、萘 基烷基羰基、苄基-CH(OH)-羰基、苯氧基甲基羰基、苯基 烷基羰基或胺基保護基團，例如第三丁氧基羰基、環烷基 烷氧基羰基（尤佳環己基甲氧基羰基）或未經取代或經烷基 或胺基取代之苄基氧基羰基；其尤佳為萘基曱氧基羰基、 萘基甲基羰基、°比啶基甲氧基羰基、苯基丙醯基、胺基苯 基丙醯基、第三丁氧基羰基、胺基苄基氧基羰基、烷基苄 基氧基羰基、二烷基苄基氧基羰基或苄基氧基羰基，甚至 更佳為苄基氧基幾基。 當A係未經取代或經取代之胺基醯基部分時，其較佳為 未經取代或經取代之α-胺基醯基部分，例如丙胺酸、白胺 酸、異白胺酸、天冬醯胺、纈胺酸、第三丁基甘胺酸、第 三白胺酸或組胺酸。其較佳係天然α-胺基酸之經保護或未 經保護部分，較佳係為蛋白質正常構成部分之胺基酸的經 保護或未經保護部分，或第三白胺酸。其較佳具有L構 型。Α尤佳為甘胺酸、L-纈胺酸、L-第三白胺酸或鍵，甚 至更佳為L-第三白胺酸。 R2較佳係天然胺基酸之側鏈，較佳係α-胺基酸之側鏈， 131613.doc -72- 200911835 較佳係為蛋白質正常構成部分之胺基酸的側鏈。其係（例 如）異丙基、胺基羰基甲基、甲基、1_曱基丙基、苄基、4 羥基苄基或異丁基，較佳為苄基。 當B係未經取代或經取代之胺基醯基部分時，其較佳為 未經取代或經取代之α-胺基醯基部分，例如苯丙胺酸、缚 胺酸、白胺酸、異白胺酸、丙胺酸或天冬醯胺。其較佳係 天然α-胺基酸之經取代或未經取代部分’較佳係為蛋白質 正常構成部分之胺基酸的經取代或未經取代部分。具有第 一羧基之α-胺基酸（例如，麩胺酸）較佳用C|_C3醇（尤佳曱 醇）酯化。其較佳具有L_構型。B尤佳為L_纈胺酸、L_麵胺 酸曱基酯或鍵，甚至更佳為L-纈胺酸。 R3較佳係鹵素、曱基或曱氧基，尤佳係甲氧基。 R4較佳係如上文所定義之未經取代或經取代之2(R)-羥 基二氫茚-l(S)-基或2-羥基苄基，尤佳為2_羥基_4_甲氧基_ 苄基。 土 γ較佳係-CO-或-O-CO-，尤佳為-〇_c〇_。 I較佳係未經取代或經取代之烷基、芳基烷基或雜芳基 烧基尤佳為烧基；當其為未經取代或經取代之雜芳基烧 土每其較佳為0比。定基烧基，尤佳為2 - °比σ定基甲基；當其 為未經取代或經取代之芳基烷基時，其較佳為节基_ ;當其為經取代之烷基時，其較佳為苯氧基甲 基。 在—些實施例中，蛋白酶體抑制劑係2_胺基_3_羥基-4_ 第一白fee酿基_胺基_5_苯基_戊酸酿胺衍生物。參見，例 131613.doc -73- 200911835 如，PCT 01/89282。 例如，在一些實施例中’本發明 於式XV化合物 柄體抑制劑係關
其中η係。或1 ;…2獨立於另-方為脂肪：基、或芳 ::肪ΓΓ::、_、脂環族-脂肪族、雜環或雜環-月曰肪族基’各基具有不多於20個碳原子；R3係氫、氧雜 烧基、脂肪族基或式_(YVR6之具有至多2G個碳原子的基 團，其中Y係烧基，係具有5個或6個環成員 含有至多3個選自由氮、氧及硫組成之群之雜原子的未經 取代或經取代之單環狀基，#中該單環狀基亦可稍合成苯 并環；RAR5獨立選自由了列組成之群：A ;脂肪族基； 游離、醚化或酯化羥基；游離或酯化羧基；曱醯基；烷 醇；未經取代、經單_或二-取代之胺基；巯基；磺^ ; 2 硫基；胺曱醯基；N_烷基-胺甲醯基；N,N_:_烷基-胺曱醯 基；氰基及硝基；其中含有碳之基團心及尺5具有至多丨之個 碳原子，條件係若!^係i，&及Rs不均為氫，&係苄基或第 三丁基，R2係苄基或4_曱氧基_苄基，R3係異丙基且χ係氧 及若η係0或1，R4不為曱氧基，尺2係4_甲氧基_苄基，化係 氫且X係氧；且X係氮、氧或硫；或其鹽。 131613.doc -74- 200911835 在2-胺基-3-羥基_4_第三白胺醯基-胺基-5-苯基-戊酸酸 胺衍生物之情形中，上文及下文中所用之一般術語較佳具 有以下含義：η係〇或1，較佳係〇。 脂肪族基具有至多12個碳原子，較佳至多7個碳原子， 最佳至多4個碳原子，且為彼—未經取代或經取代之脂肪 族烴基，換言之彼一未經取代或經取代之炔基、稀基或 (較佳）烧基’一或多個取代基較佳獨立選自由下列組成之 群：游離、喊化或酯化羥基；游離或酯化羧基；曱醯基； 烧醇；未經取代、經單-或二_取代之胺基；胍基；巯基； 石黃基；烧硫基；胺甲醯基；Ν_烷基_胺曱醯基；Ν，Ν_二-烧 基-胺曱醯基；氰基及硝基。 脂肪族基R,較佳係低碳數烷基，例如尤佳為第三丁基。 脂肪族基R3較佳係未經取代之低碳數烷基或經羥基、羧 基、胺基、胺甲醯基、胍基、巯基或烷硫基取代之低碳數 烷基’最佳為胺基酸丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺 蚊、蘇胺酸、半胱胺酸、曱硫胺酸、天冬醯胺、麩胺醯 胺、天冬胺酸鹽、麩胺酸鹽、離胺酸或精胺酸之側鏈，尤 佳為纈胺酸之側鏈。脂肪族基&較佳係甲氧基。芳族基心 或1具有不多於20個碳原子，尤其不多於12個碳原子，且 未經取代或經取代，較佳在每一情形下為未經取代或經取 代之苯基或萘基，尤佳為丨_萘基，一或多個取代基較佳獨 立自由下列組成之群：脂肪族基；游離、醚化或酯化羥 基；游離或酯化羧基；甲醯基；烷醇；未經取代、經單_ 或一取代之胺基；毓基；磺基；烷硫基；胺甲醯基；N_ 131613.doc -75- 200911835 烷基-胺甲醯基；N，N-二-烷基_胺甲醯基；氰基及硝基， 更佳選自烷基，例如，甲基、乙基或丙基；烷氧基，例 如，甲氧基或乙氧基；經二-取代之胺基，例如，二曱基 胺基；鹵素，例如，氯或溴；及鹵代烷基，例如，三氣甲 基。 —
在具有不多於20個碳原子之芳族-脂肪族基心或心中， 芳族部分係如上文収義且脂肪族部分較佳係低碳數烧 基，例如尤佳為CrC2烷基，其較佳如對於芳族基所定義 經取代或較佳未經取代。芳族_脂肪族基心較佳係节基或 萘-1-基曱基。芳族-脂肪族基R2較佳係苯部分經丨_5個、較 佳經1-3個曱氧基取代之节基；苯部分（較佳在*位）經二甲 基-胺基取代之节基；或萘_丨_基甲基。最佳地，芳族-脂肪 族基R·2係2,3,4-或3,4,5-三甲氧基-苄基。 脂環族基心或尺2具有至多20個、尤佳至多1〇個碳原子， 為單環狀或多環狀且較佳如料Μ基所定義絲代或較 佳未經取代，例如環烷基，尤佳（例如）5_或6-員環烷基， 例如較佳為環己基。 在具有不多於20個碳原子之脂環族·脂肪族基 中’脂環族部分係如上文所定義且脂㈣部分較佳為低碳 ㈣基’例如尤佳為Cl_C成基’其較佳如對於芳族基所 定義經取代或較佳未經取代，例如環己基_甲基。 雜環基含有至多2〇個碳原子，通常至多12個碳原 子，且較佳如料芳族基所定義經取代或未經取代，且較 佳為具有5個或6個環成員及i個至3個較佳選自由氮、氧： 131613.doc •76· 200911835 硫組成之群之雜原子的飽和或不飽和單環狀基（例如，噻 吩基或吼啶基）、或二—或三-環狀基，其中，例如，苯基稠 合成提及之單環狀基，尤其（例如）諸如5_吲哚基等吲^基 或諸如8-喹啉基等喹啉基。 ： 在具有不多於20個碳原子之雜環-脂肪族基1或汉2中， ； 雜環部分係如上文所定義且脂肪族部分較佳為低碳數烷 . 基，例如尤佳為Ci-C2烷基，其較佳如對於芳族基所定義 ρ 經取代或較佳未經取代。雜環-脂肪族基心或尺2係（例如）D引 木基-甲基（尤佳為5-吲哚基_甲基）或喹啉基曱基（尤佳為8_ 喹啉基-甲基）。 氧雜-烷基&係式-CKO-CHrCHA-R7基，其中G&R7係烷 基，較佳為低碳數烷基，且1係丨至3，較佳係2，且尤佳係 2-(1,4-二氧雜-己基）_乙基。 在具有至多20個碳原子之式_(Y)m_R6基中，γ係烷基， 較佳係低碳數烷基，爪係〇或i且基團I係具有5個或6個環 成員及至多3個選自由氮、氧及硫組成之群之雜原子且或 者含有稠合苯并環的飽和或不飽和單環狀基，該基團較佳 如對於芳族基所定義經取代或較佳未經取代。 基團I較佳經由環碳原子與γ結合且係（例如）選自由下 列組成之群之未經取代或經取代的成員：環戊基、環己 基環戊一稀基、苯基、吼σ各咬基 '。比。坐咬基、_。坐咬 基、四氫呋喃基、六氫吡啶基、六氫吡嗪基、嗎啉基、吡 土 比°坐基、〇米〇坐基、咬喃基、tr塞吩基、。比〇定基、η比嗓 基、°合σ秦基、嘧啶基、節基、萘基、吲哚基及喹啉基。 131613.doc -77- 200911835 最幺地，式_(Y)m_R6基係六氫°比啶基（尤佳為4-六氫。比啶 基）’ /、氫吡嗪-乙基（尤佳為六氫D比嗪_丨_基乙基）；嗎啉基_ 乙基（尤佳為嗎啉-4-基乙基）；吡啶基-甲基（例如2_、3_或 4比啶基-曱基）或胺基酸苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸或組 - 胺酸之側鏈。X較佳係氧。 烷基較佳係低碳數烷基。前綴，，低碳數，，表示具有至多且 - 包括7個、較佳至多且包括4個碳原子之基團。低碳數烷基 (' 係（例如）正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、 第一丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基或正庚基， 較佳為異丁基、第二丁基、第三丁基、異丙基、乙基或甲 基’最佳為異丁基'乙基或曱基。 醚化羥基係（例如）烷氧基，尤佳低碳數烷氧基，例如乙 氧基或甲氧基。酯化羥基較佳為藉由有機羧酸（例如鏈烷 酸）或無機酸（例如氫_酸）酯化之羥基，例如低碳數烷醯基 氧基或尤佳鹵素（例如碘或尤其氟、氯或溴）。 V 酷化緩基係（例如）烷氧基羰基，尤佳低碳數烷氧基羰 基’例如甲氧基羰基。 烷醇係（例如）烷基羰基，尤佳低碳數烷基羰基，例如乙 - 醯基。 . I單-或二-取代之胺基係（例如）N_烷基胺基或N，N_二烷 基胺基’尤佳N_低碳數烷基胺基或低碳數N，N-二-低碳數 烧基胺基’例如N-曱基胺基或ν,Ν-二曱基胺基。 函素係氟、氣、溴或碘’較佳為氟、氣或溴。 如上文所示之式XV結構表示絕對構型。 131613.doc -78- 200911835
式xv化合物中之鹽形成基團係具有鹼性或酸性特性之 基團或基。具有至少一個鹼性基團或至少一個鹼性基（例 如游離胺基、吡嗪基或吡啶基）之化合物可形成酸加成 鹽，例如與諸如鹽酸、硫酸或填酸等無機酸，或與適宜有 機羧酸或續酸，例如脂肪族單-或二-致酸，例如三氟乙 酸、乙酸、丙酸、經基乙酸、琥ϊέ酸、馬來酸、富馬酸、 經基馬來酸、蘋果酸、酒石酸、擰檬酸或草酸；或諸如精 胺酸或離胺酸等胺基酸；芳族羧酸，例如苯甲酸、2_苯氧 基-苯曱酸、2-乙臨氧基-苯曱酸、水揚酸、4_胺基水楊 酸；芳族·脂肪族羧酸，例如扁桃酸或肉桂酸；雜芳族幾 酸’例如煙酸或異煙酸；脂肪族磺酸，例如甲烧_、乙燒_ 或2 -輕基乙院續酸；或芳族項酸，例如苯_、對甲苯-咬蔡 2-磺酸。當存在若干鹼性基團時，可形成單_或多-酸加成 轉 〇 具有酸性基團（例如基Rio中之游離羧基）之式χν化合物 可形成金屬或銨鹽，例如鹼金屬或鹼土金屬鹽（例如鈉、 鉀、鎂或鈣鹽）或與氨或適宜有機胺（例如三級單胺，例如 三乙基胺或三_(2_羥基乙基)_胺或雜環鹼，例如乙基·六 氫吡啶或；ν,π-二甲基六氫吡嗪）形成之銨鹽。 ’、 /、有' ϋ及鹼性基團二者之式χν化合物可形成内鹽。 出於为離或封j /卜夕曰从 、’ 之目的，以及在化合物進一步用作中門 體之情形下，亦可使用醫藥上不可接受之鹽。 θ 然而，僅醫藥上可接受之無毒鹽可用於治療目的，且因 此彼等鹽較佳。 1因 131613.doc -79- 200911835 鑒於該等新穎化合物之游離形式與其鹽（包括彼等可用 作中間體之鹽）形式間之緊密關係，例如在該等新穎化合 物之純化或其識別中，上文及下文任何提及該等游離化合 物之處皆應理解為包括對應鹽（若合適且方便）。 4.投與及醫藥組合物
可將本發明抗體及試劑直接投與給哺乳動物個體來治療 (例如）包括癌症之過度增殖性病症，癌症係例如但不限 於：癌瘤、神經膠質瘤、間皮瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白 血病、腺癌…乳癌、卵巢癌、宮頸癌、膠質細胞瘤、白血 病、淋巴瘤、前列腺癌及伯基特淋巴瘤（Burkiu,s 丨ymphoma)、頭頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、非小細胞肺 癌小細胞肺癌、食官癌、胃癌、騰腺癌、肝膽管癌、膽 囊癌、小腸癌、直腸癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、陰莖 癌、尿道癌、睪丸癌、宮頸癌、陰道癌、子宮癌、印巢 癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、騰臟内分泌癌、 類癌、骨癌、皮膚癌、成視網膜細胞瘤、多發性骨髓瘤、 何傑金氏淋巴瘤（腦此lymph麵)及非何傑金氏淋巴瘤麵_ H〇dgkinis lymph0酿（其他癌症參見，cancer:principles AND PRACTICE (DeVita，ν τ 等人編輯，Μ”））。 哺乳動物個體意指人類及非人類靈長類動物及包括農業 哺乳動物（例如’馬科動物 斗右I韦上丄* 行動物牛科動物、綿羊科動物及豬 科動物等)及剩養或伴低哺乳動物(例如，犬科動物及I苗科 動物)以及實驗哺乳動物(例如，包括兔子、大鼠、倉鼠及 小鼠等齧齒類動物）之其他哺乳動物。 131613.doc •80- 200911835 本發明組合物之投與係拉ώ a 、你精由通常用於引入化學治療化人 物以使其與擬治療組織最終接觸之任何途徑。該等抗肢 試劑（視情況）與醫藥上可接受之載劑係以任何適宜方式投 與。可利用投與該等抗體及試劑之適宜方法且該等方法已 為彼等熟習此項技術者所熟知’且儘管一種以上途徑可用 以投與特定組合物’但特定途徑通t可提供較另—途徑更 直接且更有效之反應。
醫藥上可接$之載劑部分由所投與之特^組合物以及由 用於投與該組合物之特定方法決定。因此，存在多種本發 明醫藥組合物之適宜調配物（參見，例如，…如叹化心 Pkr廳⑽"W咖以，第21版，㈤糟吻〇f加
Sciences in Philadelphia (USIP), Lippincott . Williams & Wilkins (2005))。 可將本發明抗體及試劑（單獨或與其他適宜組份組合）製 成氣溶膠調配物（即，其可經”霧化„)以經由吸入投與。可 將氣溶膠調配物置於經加壓之可接受推進劑（例如二氟二 氯甲烧、丙烧、氮、及諸如此類）中。 適於杈與之調配物包括水性及非水性溶液、等滲無菌溶 液（其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑、及使該調配物 等滲之'合貝）及水性及非水性無菌懸浮液（其可包括懸浮 劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑及防腐劑）。在本發明實踐 中’組合物可如下投與，例如，經口及非經腸，包括局 部、經皮、經黏膜、靜脈内、經皮下、瘤内、肌内、腹膜 腔内、膀胱内或鞘内。視情況，該等組合物係經鼻或吸入 131613.doc -81- 200911835 投與。該等化合物調配物可存在於單位劑量一 容5| φ，办丨i a 片丨里役封 谷盗中你J如安瓶及小玻璃瓶。溶液及懸浮液可自 述種類之無菌粉劑、顆粒劑及錠劑製備。調節劑亦可 製備食品或藥物之一部分投與。本 為 田 月匕α物亦可端視期 1療法或效果與一或多種額外活性試劑（例如，化與、么 劑）有效地組合使用。 ’、 適：於本發明之醫藥組合物包括其中活性成份係以治療 有效量含有之組合物。當然’所投與組合物的量將端視所 治療之個體、個體重量、痛苦之嚴重程度、投與方式及處 方醫師之判斷等而定。有效量之麵為彼#熟習此項技術 者所熟知，尤其可根據本文所提供之詳細揭示内容確定。 通常而言，一或多種抗-DR5抗體之靈驗或有效量係藉由以 下確定：首先投與低劑量或少量抗_DR5抗體並隨後遞增所 投與之劑量（dose或dosage)及/或視需要添加細胞凋亡劑， 直至在所治療之個體中觀察到誘導靶細胞群體細胞凋亡之 期望效果而毒性副作用最小或沒有。用於確定本發明醫藥 組合物投與之合適劑量及服用時間表之適用方法闡述於 (你\ 如、Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of ，第 n版，Brunt〇n等人編輯，McGraw-Hill (2006、反 Remington: The Science and Practice of Pharmacy， 見上文’二者均以引用方式併入本文中。 在其中該試劑係多肽或抗體之實施例中，典型劑量可介 於約0.1 pg/kg體重到至多且包括約i gm/kg體重範圍内， 較佳介於約1 pg/kg體重至約500 mg/kg體重之間。更佳 131613.doc -82- 200911835 地，約 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 10 、 20 、 30 、 40 、 50 、 6〇 、 7〇 80 ' 90或 100 mg/kg體重。 在其中該試劑係核酸之實施例中，典型劑量可介於約 〇·1 mg/kg體重到至多且包括約100 mg/kg體重範圍内，較 佳介於約1 mg/kg體重至約50 mg/kg體重之間。更佳地，約 1、2、3、4、5、10、15、20、30、40 或 50 mg/kg體重。 η
在其中該試劑係小有機化合物之實施例中，典型劑量可 介於約0.1 pg/kg體重到至多且包括約1 gm/kg體重範圍 内，較佳介於約1 pg/kg體重至約500 mg/kg體重之間。更 佳地，約 0.1、1、2、3、4、5、10、20、30、40、5〇、 60、70、80、90或 100 mg/kg體重。 準確劑量將端視上文所論述之多個因素而定，包括特定 抗體或細胞凋亡誘導劑、疾病之嚴重程度及投與途徑。= 確治療有效劑量之確定可無需過多實驗由臨床醫師確定且 可包括上文所揭示範圍内包括之任何劑量。 抗體激動劑及細胞〉周亡誘導劑可以混合物形式一起挎 或可各自單獨投與。該抗體試劑及細胞凋亡誘導 -、 (但無需）同時投與。 同時 提供以下實例用以閣釋而非限制所主張之本發明 實例1:以下實例提供在人類中 μ r具有最小免疫原蛙 DR5抗體的構建及篩選 之抗 方法 亞選殖鼠科動物V-區 131613.doc -83 - 200911835 自質粒PBW212及PBW214對鼠科動物v_區實施亞選殖。 鼠科動物v-區序列參見美國專利公開案第2〇〇5/〇〇79i72 唬。使用PCR來擴增V-重鏈及ν-κ區之v_基因並納入適於 選殖入表現載體中之限制酶位點。在pBR322載體系統中 以具有人類IgGl恆定區之Fab’片段對v_區進行選殖。 係自PTAC啓動子在大腸桿菌（五.⑶/〇中表現。在EUSA* 析中顯示經純化之Fab，蛋白質（純系DR5_1}結合DR5抗原。 该等V-區之核苷酸序列最佳化導致在與CDR3鄰近之框架3 部分中具有人類胺基酸序列之Fab，片段。此容許隨後人類 V-區段庫亞選殖。該等經最佳化之參考Fab，亦具有cdr3 BSD序列及藉由JK2及JH4種系提供之人類；_鏈/框架4序 列。對該等經最佳化之Fab，針對DR5_抗原結合進行測試並 稱為參考序列DR9-1及DR10-1。
Fab’純化
Fab片段係藉由來自大腸桿菌之分泌物使用表現載體表 現。使細胞在2xYT培養基中生長以致在60〇 nm波長下量 測之光學岔度（〇D6〇〇)為0.6。使用異丙基-β-D-半乳糖硫π比 喃糖苷（IPTG)將表現在33。(：下誘導3小時。自胞質部分獲 付經裝配之Fab'並藉由親和層析使用鏈球菌蛋白〇 (HiTrap 蛋白G HP管柱；GE Healthcare)按照標準方法純化。將 Fab'在pH 2.0緩衝劑中溶析，立即調節至pH 7.0並對PBS pH 7.4 (PBS無鈣及鎂）透析。
ELISA 一般而言，藉由在4。(：下培育過夜使100 ng/孔DR5抗原 131613.doc -84- 200911835 結合至96孔微量滴定板上。在33它下用5%牛乳存於含有 〇· 1 % Tween20 (”PBST”）之經磷酸鹽緩衝之鹽水中的溶液將 該板阻斷1小時。將經純化之Fab，或參考Fab,⑴尺^)稀釋 於PBS中並向每一孔中添加5〇 μ1。在於33。〇下培育^小時 後，將該板用PBST沖洗三次。向每一孔中添加5〇 μ1抗人 類-κ鏈辣根過氧化物酶（HRp)結合物（Sigma ;在pBsT中稀 釋至0.1 ng/ml)並將該板在33它下培育4〇 min。將該板用 PBST洗滌三次並用PBS洗滌一次。向每一孔中添加i〇〇 y 3,3’，5,5，-四甲基聯苯胺（7^^受質（34〇^)並將該板在室溫 下培育約5 min。為終止反應，向每一孔中添加丨〇〇 μ1 〇 2 N HjO4。將該板在分光光度計中於45〇 11111處讀數。 篩選
Fab'片段庫之篩選係如美國專利公開案第2005/0255552 號及第2006/01 34098號所述使用塗覆有重組DR5抗原之硝 化纖維素渡器實施。該等專利公開案二者之揭示内容全文 為了各種目的而以引用方式併入本文中。 親和力量測
Fab'片段之結合動力學係使用porteBi〇 〇ctet生物傳感器 進行分析。使用EZ-link生物素化套組（Pierce)按照製造商 方法對重組抗原實施生物素化。隨後使抗原結合至塗覆有 中性鏈親和素（Neutravidin)之傳感器（ForteBio)上。使用生 物層干涉量測分析及製造商提供之軟體實時監測Fab，結 合。自所測定之締合及解離常數計算親和力。 結果 131613.doc -85- 200911835 V-區之選殖及表現 EL1SA證實經亞選殖V-區之DR5抗原結合活性。 對鼠科動物V-區實施選殖、測序及表現。對v_區以具有 人類IgGl恆定區之Fab’片段進行選殖並在大腸桿菌中表 - 現。在DR5抗原結合之稀釋ELISA測試中，經選殖Fab'及 原有Mab NVP-LCR2 1 1產生依賴於抗體濃度之結合曲線。 - 發現Mab具有較Fab'為強之結合信號；此可能係由於抗體 親抗原性作用及頂層ELISA檢測中之差異所致。參見圖 O i。 鼠科動物v -區胺基酸序列
Fab’ DR5-1具有完整之鼠科動物V-區，而參考Fab’ DR9-1及DR 1 0-1經最佳化以用於隨後庫構建。與重鏈及輕鏈二 者上之CDR3鄰近之框架3部分内所作之核苷酸變化容許隨 後庫構建並導致產生人類種系胺基酸序列。DR9-1及 DR10-1二者均具有序列HEEGI (SEQ ID NO:49)之重鏈 / CDR3 BSD及人類種系J-區段序列（JH4)。DR9-1具有包括 QQHYTTP (SEQ ID NO:57)之BSD的輕鏈CDR3序列及藉由 • 人類JK2賦予之框架4序列。DR10-1具有輕鏈BSD序列 · QQHYTTP (SEQ ID NO:57)及人類種系 J-區段（人類 JK2)。 參見圖3。經最佳化之參考Fab1 DR9-1及DR10-1二者均發 現具有DR5抗原結合活性。參見圖4。 庫構建及V-區盒 自與參考Fab，DR9-1之獨特CDR3-FR4區連接之人類V- 區段序列庫構建抗原決定部位集中庫。該等”全長庫用作 131613.doc -86- 200911835 :二盒”庫之基礎，其中最初僅部分鼠科動物v-區段藉由 :列庫替換。V-重鍵及V-K鍵二者之盒係藉由在框架2 /内具有重疊公共序列之橋PCR製得。以此方式構 類V-重鏈！及3及V_K !、職IV|5]型物之"前端"及"中 棘：類盒庫。支持與跡抗原結合之人類盒係藉由菌落 :合分析識別並在ELISA及Forte 〇ctet生物傳感器分 析中按照親和力分級。隨後將最高親和力盒之集人重組於 =筛選中以完全產生人類V·區段。以此方二成之盒 甲、‘別出多個具有DR5_抗原結合活性之人類v 類V-重鏈"前端，，盒。 鍵及人 在替代途徑中，構建突變庫，其中將該cDR2内之每一 殘基突變成鼠科動物序列或來自單一人類種系序列(他_ 46係與所識別之"前端"盒最接近之人類種系序列）之對應殘 基（參見，圖5)。使該突變庫與所選擇的發現支持抗原結合 之，，前端"及人類框架3 (FR3)序列結合。該庫之所有成員 具有DR9-1參考Fab，之公共CDR3/FR4序列。因此，建立經 設計之人類"中間”盒庫，藉由菌落轉移結合分析進行篩^ 並選擇抗原結合純系並藉由EUSA&F〇rte 〇ctet進—步分 析。以此方式，識別出多個支持DR5抗原結合之與人類種 系胺基酸序列接近之CDR序列（參見圖6)。EUS八結合活性 參見圖7。 在識別出與人類種系序列接近之高親和力Fab，集合後， 建立親和力成熟庫。使用兼併物使一組經最佳化之 Fab’純系的公共CDR3序列突變以產生庫。使用菌落轉移結 131613.doc -87· 200911835 合分析對該等突變庫進行篩選。用ELISA及Forte分析針對 親和力對所選擇的Fab'進行分級。識別出與DR9-1參考Fab' 相比支持對抗原之相等或改良親和力的突變。參見圖8。 可在圖9中看出，ELIS A分析顯示所選擇的Fab'對DR5-抗原 具有結合活性。 使用Forte Octet分析之FabU人類DR5抗原之親和力 對藉由菌落轉移結合分析及ELISA自盒及突變庫篩選分 離出之經充分最佳化之Fab’藉由與參考Fab' DR9-1之動力 學比較實施進一步表徵。使用ForteBio Octet系統實時無標 記監測蛋白質-蛋白質相互作用來分析結合動力學。代表 性動力學分析顯示於圖1 0中。計算之締合及解離及總親和 力常數顯示於表1中。 表1 抗體參考 DR9-1 DR106-2 DR114-1 DR112-1 莫耳濃度(M) IE-7 IE-7 IE-7 7.5E-8 解離速率常數(kd[l/s]) 9.63E-5 8.52E-5 1.24E-4 2.25E-4 kd誤差 2.99E-6 2.63E-6 2.63E-6 4.54E-6 締合速率常數(ka[l/Ms]) 1.39E5 9.21E4 1.38E5 1.41E5 平衡解離常數(KD [Μ]) 6.91E-10 9.25E-10 9.02E-10 1.59E-9 表1顯示藉由生物層干涉量測法使用ForteBio Octet生物 傳感器技術之與重組DR5抗原的Fab’結合分析，其顯示締 合速率常數（ka)、解離速率常數（kd)及計算之親和力（KD)。 經改良純系DR106-2、DR1 14-1、DR1 12-1及參考純系DR9-1之動力學分析展示所有皆具有對DR5抗原之低至亞毫微 131613.doc -88- 200911835 莫耳的親和力。 圖1 1顯不與人類種系序列相比經最佳化之Fab' DR 1 06、 DR112及DRll4iV_區序列的胺基酸序列比對。參考及經 最仫化之V-區序列與對應人類種系胺基酸序列之胺基酸序 列一致性百分比顯示於表2中。 表2
表2中之所有序列一致性百分比皆代表與橫跨v_區之單 一人類種系序列之一致性並排除CDR3 BSD序列。可以看
出，所有二個經改良之Fab，的v_區皆極其接近對應人類種 系序列，胺基酸序列一致性百分比為約9〇〇/〇。 儘官已經由出於理解清楚之目的的舉例說明及實例相當 詳細地闡述了前述發明，但根據本發明之教示熟習此項技 術者會容易地明瞭可在不偏離隨附申請專利範圍之精神或 範圍的情形下對本發明進行某些改動及修改。 本說明f中所引用之所有公開案、資料庫、GenBank序 列、專利及專利中請案皆以引用方式併人本文中，彷彿每 一皆明確且單獨表示以引用方式併入一般。 131613.doc -89- 200911835 【圖式簡單說明】 圖1繪示Fab'形式之經亞選殖V-區（DR5-1)(·)與原有 NVP-LCR21 1 Mab (▲)對硫代-DR5抗原結合的稀釋ELISA 比較。在PBS對照樣品中未觀察到顯著結合信號（▼)。 圖2繪示包含抗體V-區之結構單元的示意性繪圖。重鏈 係藉由三個基因家族（重-V、D及J)編碼且輕鏈係藉由兩個 基因家族（κ或λ V及J)編碼。該等基因之重組導致產生完整 V-區。在重鏈情形下，CDR3序列位於重V、D及J基因之 重組位點處，且在輕鏈情形下位於κ或λ V及J基因之重組 位點處。 圖3繪示鼠科動物且經最佳化之參考Fab’之部分框架3區 (FR3)及完全CDR3及框架4區（FR4)的V-區胺基酸序列比對 (SEQ ID NOS :76-78及80-82)。將自原有鼠科動物序列變化 之殘基用紅色突出且加以下劃線。CDR3 BSD殘基用粗體 突出且CDR3區在方框内。人類種系J-區段JH4 (SEQ ID NO:75)及 JK2 (SEQ ID NO:79)亦進行比對。 圖4繪示Fab'形式之經亞選殖V-區DR5-1 ()與經最佳化 之參考對照DR9-1 (▲)及DR10-1 (▼)對硫代-DR5抗原結合 的稀釋ELISA比較。 圖5繪示在每一位置上包含參考（SEQ ID NO:4)或人類種 系（VH1-46) (SEQ ID NO:107)胺基酸之V-重鏈CDR2突變 庫。介於參考與人類之間之公共胺基酸保持恆定且由於使 用簡併密碼子在兩個位置上可能存在額外胺基酸。 圖6繪示按照DR5抗原結合活性自Fab’庫選擇之V-重鏈 131613.doc -90- 200911835 CDR2序歹ij (分另ij為SEQ ID NOS:6、4及83-91)。相對於人類 種系序列之突變加以下劃線。 圖7繪示所選擇的在稀釋ELISA中與DR5抗原結合之V-重 鏈CDR2突變體。與參考對照及對抗原結合為陰性之純系 (DR83-D3)比較可以看出特異性結合活性。 圖8繪示基於序列之DR5-抗原結合活性自CDR3親和力成 熟庫選擇之V-輕鏈CDR3序列（8A)(SEQ ID NOS:19、66、 20及 67-72)及 V-重鏈 CDR3 序列（8B)(SEQ ID NOS:7、8 及 54-56)。將不同於參考CDR3序列之胺基酸標以藍色陰影並 加下劃線。 圖9繪示所選擇CDR3親和力成熟突變體之DR5-抗原結合 活性。ELISA分析顯示與陰性對照Fab’（背景）比較之所選擇 純系的顯著抗原結合。 圖1 0繪示藉由生物層干涉量測法使用ForteBio Octet生物 傳感器技術參考Fab’或所選擇之經充分最佳化之Fab’與重 組DR5抗原結合的動力學分析。 圖 11繪示經改良之Fab’ DR106-2 (SEQ ID NOS:39 及 40)、DR112 (SEQ ID NOS:39 及 41)及 DR114 (SEQ ID NOS :39及42)胺基酸序列的比對V-區胺基酸序列及與最接 近單一人類種系V-基因及J-區段（人類VH1-46/JH4 (SEQ ID NO:43)及 VkIV-B3/Jk2 (SEQ ID NO:45)或 VK1-L4/JK2 (SEQ ID NO:47))之比較。CDR在方框内且不同於種系序列 (排除CDR3 "BSD”序列）中對應位置之殘基標以紅色陰影。 將CDR3之親和力成熟變化標以藍色陰影。 131613.doc -91 - 200911835 序列表 <110>艾姆公司 <120>誘導癌細胞細胞凋亡之方法及組合物 <130> P1281 <140> TW 097121278 <141> 2008-06-06 <150> 60/942,862 <151> 2007-06-08 <160> 107 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>人工序列之描述：合成肽 <400〉 1
Asp Tyr Thr lie His <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 2
Ser Tyr Thr Met His <210> 3 <211〉 5 <212> PRT <213>智人 V， <400> 3
Ser Tyr Tyr Met His <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 4
Trp Phe Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr He Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 15 10 15
Asp <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 200911835 <220〉 <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 5
Trp lie Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Lys Tyr Ala Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Gly <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213>智人 <400> 6
He lie Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gin Lys Phe Gin 15 10 15
Gly <210〉 7 <211〉 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 7
His Glu Glu Gly lie Tyr Phe Asp Tyr <210> 8 <211〉 9 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 8
His Glu Glu Gly lie Tyr Phe Asp Lys <210〉 9 <211〉 4 <212> PRT <213>智人 <400> 9
Tyr Phe Asp Tyr <210> 10 <211〉 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 10
Lys Ala Ser Gin Asp Val Asn Thr Ala lie Ala 1 5 10 -2- 200911835 <210> 11 <211> 17 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 11
Lys Ser Ser Gin Ser Phe Leu Gly Ser Ser Asn Gly Lys Asn Tyr Val 15 10 15
Ala <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 12
Arg Ala Ser Gin Asp Val Ser Gly Ala Leu Ala 1 5 10 <210〉 13 <211> 17 <212> PRT <213>智人 <400> 13
Lys Ser Ser Gin Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu 15 10 15
Ala <210> 14 <211〉 11 <212> PRT <213>智人 <400> 14
Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <>15
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr <210> 16 <211〉 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 200911835 <400〉 16
Trp Ala Ser Met Arg Val Ser <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213>智人 <400> 17
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213>智人 <400> 18
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser <210〉 19 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 19
Gin Gin His Tyr Thr Thr Pro Phe Thr <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 20
Gin Gin His Tyr lie Thr Pro Phe Thr <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213>智人 <400> 21
Gin Gin Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213>智人 <400> 22
Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Phe Thr
<210> 23 <211> 30 <212〉 PRT 200911835 ^久丄二> y乂丄 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 23
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 24 <211> 30 <212> PRT <213>智人 <400> 24
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 25 <211> 14 <212> PRT <213>智人 <400> 25
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly <210> 26 <211> 32 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 26
Arg Val Thr Met Thr Gly Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu 1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 27 <211> 32 <212> PRT <213>智人 <400> 27
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu 15 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 200911835 述：合成肽 <400> 28
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 29 <211> 23 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 29
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15
Glu Lys Ala Thr lie Asn Cys 20
<210> 30 <211> 23 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 30
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Ala Ser Leu Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys 20 <210> 31 <211> 23 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 31
Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys 20 <210> 32 <211〉 23 <212> PRT <213>智人 <400> 32
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys 20
<210〉 33 <211> 23 <212> PRT 200911835 、H 曰 <400〉 33
Ala lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys 20 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 34
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr 15 10 15
<210> 35 <211> 15 <212> PRT <213>智人 <400> 35
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr 15 10 15 <210> 36 <211> 32 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 36
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15
Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 37 <211> 32 <212> PRT <213>智人 <400〉 37
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15
Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210〉 38 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400〉 38
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 10 10200911835 <210> 39 <211> 118 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 39
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Lys Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Gly Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg His Glu Glu Gly lie Tyr Phe Asp Lys Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210〉 40 <211> 113 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 40
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Ala Ser Leu Gly 15 10 15
Glu Lys Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Phe Leu Gly Ser 20 25 30
Ser Asn Gly Lys Asn Tyr Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Met Arg Val Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 200911835 丄丄。bcu u!n Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95
His Tyr lie Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie 100 105 110
Lys <210> 41 <211> 113 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 41
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Ala Ser Leu Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Phe Leu Gly Ser 20 25 30
Ser Asn Gly Lys Asn Tyr Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95
His Tyr lie Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie 100 105 110
Lys <210> 42 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 42
Asp He Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Ser Gly Ala 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 -9- 200911835
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ala 65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin His Tyr lie Thr Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 43 <211> 113 <212> PRT <213>智人 <400> 43
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly lie lie Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110
Ser <210> 44 <211> 98 <212> PRT <213>智人 <400> 44
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly lie lie Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60 •10· 200911835
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg <210> 45 <211> 113 <212> PRT <213>智人 <400> 45
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie 100 105 110
Lys <210> 46 <211> 94 <212> PRT <213>智人 <400〉 46
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr -π - 200911835 70 75 80 lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 <210> 47 <211> 107 <212> PRT <213>智人 <400〉 47
Ala lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Ala 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 <210> 48 <211> 88 <212> PRT <213>智人 <400> 48
Ala lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Ala 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys <210> 49 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 -12- 200911835 <220〉 <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 49
His Glu Glu Gly lie <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <220> <221> MOD一RES <222> (2)..(2) <223> Any amino acid <220> <221> MOD-RES <222> (4)..(5) <223> Any amino acid <400> 50
Gin Xaa His Xaa Xaa Thr Pro <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <220> <221〉 MOD RES <222> (8)..(8) <223> Asp, ihr or Lys <220> <221> MOD.RES <222> (9)..(9) <223> Tyr, Lys or Val <400> 51
His Glu Glu Gly lie Tyr Phe Xaa Xaa <210> 52 <211> 7 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <220> <221> M0D_RES <222> (2)..(2) <223> Gin or His <220> <221〉 MOD一RES <222> (4)..(4) <223> Tyr, Leu or Lys 200911835 <220> <221> MOD一RES <222> (5)..(5) <223> Thr, Gin, lie, Glu, His or Gly <400> 52
Gin Xaa His Xaa Xaa Thr Pro <210> 53 <211〉 9 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <220> <221> M0DJRES <222> (2)..(2) <223〉 Gin or His <220> <221> M0D_RES <222> (4)..(4) <223> Tyr, Leu or Lys <220> <221> M0D_RES <222> (5)..(5) <223> Thr, Gin, lie, Glu, His or Gly <400> 53
Gin Xaa His Xaa Xaa Thr Pro Phe Thr <210> 54 <211> 9 <212> PRT <2Π>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成肽 / <400> 54
His Glu Glu Gly lie Tyr Phe Asp Val <210〉 55 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 55
His Glu Glu Gly lie Tyr Phe Thr Tyr <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 56 200911835 ms uiu uiu uiy ne Tyr Phe Lys Tyr <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 57
Gin Gin His Tyr Thr Thr Pro <210〉 58 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 58
Gin Gin His Tyr Gin Thr Pro 1 5 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 59
Gin Gin His Tyr lie Thr Pro 1 5 <210〉 60 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 60
Gin Gin His Tyr Glu Thr Pro <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 61
Gin Gin His Tyr His Thr Pro <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 200911835 <2U>人丄庁列乙描述：合成肽 <400> 62
Gin Gin His Tyr Gly Thr Pro 1 5 <210> 63 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 63
Gin Gin His Leu Thr Thr Pro <210> 64 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 64
Gin Gin His Lys Thr Thr Pro <210> 65 <211〉 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 65
Gin His His Tyr Thr Thr Pro <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 66
Gin Gin His Tyr Gin Thr Pro Phe Thr <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 67
Gin Gin His Tyr Glu Thr Pro Phe Thr <210> 68 <211> 9 <212> PRT 200911835 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 68
Gin Gin His Tyr His Thr Pro Phe Thr <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 69
Gin Gin His Tyr Gly Thr Pro Phe Thr <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400〉 70
Gin Gin His Leu Thr Thr Pro Phe Thr <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 71
Gin Gin His Lys Thr Thr Pro Phe Thr <210> 72 <211> 9 <212> PRT <2i3>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 72
Gin His His Tyr Thr Thr Pro Phe Thr <210> 73 <211> 15 <212> PRT <213>智人 <220> <221〉 MOD—RES <222> (4)..(4) <223> Tyr or Lys <220>
<221> MOD RES 200911835 <223> Leu or Thr <220>
<221> MOD—RES <222> (11)..(11) <223> Val or Leu <400> 73
Tyr Phe Asp Xaa Trp Gly Gin Gly Thr Xaa Xaa Thr Val Ser Ser 15 10 15 <210> 74 <211> 12 <212> PRT <213>智人 <220> <221> MOD一RES <222> (1).. (1) <223> Tyr or Phe <220〉
<221〉 MOD一RES <222> (5)..(5) <223> Gin or Ser <400〉 74
Xaa Thr Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 1 5 10 <210> 75 <211> 15 <212> PRT <213>智人 <400> 75
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10 15 <210〉 76 <211> 28 <212> PRT <213>人工序列 1 - <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 76 . Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg His Glu Glu Gly lie Thr Phe Asp 15 10 15
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 20 25 <210> 77 <211> 28 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400〉 77
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Glu Glu Gly lie Tyr Phe Asp 15 10 15
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser -18- 25 200911835 <210> 78 <211> 28 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 78
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Glu Glu Gly He Tyr Phe Asp 15 10 15
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 20 25 <210〉 79 . <211> 12 <212〉 PRT <213>智人 ^ <400〉 79 I " Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 1 5 10 <210> 80 <211> 25 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 80
Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gin Gin His Tyr Thr Thr Pro Phe Thr Phe 15 10 15
Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 20 25 <210〉 81 <211> 25 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 81
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin His Tyr Thr Thr Pro Phe Thr Phe 15 10 15
Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 20 25 <210> 82 <211> 25 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 82
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin His Tyr Thr Thr Pro Tyr Thr Phe 15 10 15 -19- 200911835
Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 20 25 <210> 83 <211> 17 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 83
Trp lie Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr lie Arg Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Asp <210> 84 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 84
Trp lie Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr lie Lys Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Asp <210> 85 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽
<400> 85
Trp lie Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 15 10 15
Gly <210> 86 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 86
Trp Phe Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Asp <210> 87 -20- 200911835 、厶i i〆 1 / <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 87
Trp lie Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr lie Lys Tyr Ala Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Asp <210> 88 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 88
Trp Phe Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Arg Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Gly <210> 89 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 89
Trp Phe Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr lie Lys Tyr Ser Glu Lys Phe Lys 15 10 15
Asp <210> 90 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 90
Trp Phe Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Lys Tyr Ala Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Asp <210> 91 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 -21 - 200911835 <s4uu^ yi
Trp Phe Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Asp <210> 92 <211> 98 <212> PRT <213>智人 <220>
<221> MOD—RES <222> (1)..(1) <223> Glu or Gin <220> <221> MOD一RES <222> (33)..(33) <223> Tyr or Thr <220> <221> MOD一RES <222> (50)..(50) <223> lie or Trp <220> <221> M0D_RES <222> (52)..(52) <223> Asn or Tyr <220> <221> MOD—RES <222> (54)..(54) <223> Ser or Gly <220> <221> MOD一RES <222> (57)..(57) <223> Ser or Tyr <220> <221〉 MOD一RES <222> (59)..(59) <223> Ser or Lys <220> <221> M0D_RES <222> (65T..(65) <223> Gin or Phe <220> <221> MOD—RES <222> (72)..(72) <223> 入rg or Gly <400> 92
Xaa Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Xaa Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Xaa lie Xaa Pro Xaa Gly Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60 •22- 200911835
Xaa Gly Arg Val Thr Met Thr Xaa Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg <210> 93 <211> 94 <212> PRT <213>智人 <220> <221> M0D_RES <222> (13)..(13) <223> Val or Ala <220> <221> M0D_RES <222> (18)..(18) <223> Arg or Lys <220> <221> M0D_RES <222> (297..(29) <223> Val or Phe <220> <221〉 MOD一RES <222> (3lT..(31) <223> Tyr or Gly <220> <221> MOD—RES <222> (357..(35) <223> Asn or Gly <220> <221> MOD.RES <222> (39)..(39) <223> Leu or Val <220> <221> MOD_RES <222> (59)..(59) <223> Thr or Met <220> <221> MOD—RES <222> (61)..(61) <223> Glu or Val <400> 93
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Xaa Ser Leu Gly 15 10 15
Glu Xaa Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Xaa Leu Xaa Ser 20 25 30
Ser Asn Xaa Lys Asn Tyr Xaa Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Xaa Arg Xaa Ser Gly Val 50 55 60 -23- 200911835
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
He Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 <210> 94 <211> 88 <212> PRT <213>智人 <220> <221> MOD一RES <222> (1)..(1) ‘ <223> Ala or Asp <220〉 <221> MOD一RES <222> (28)..(28) <223> Gly or Asp f、 <220〉 <221> MOD一RES <222> (29)..(29) <223> lie or Val <220〉 <221> MOD一RES <222> (31)..(31) <223> Ser or Gly <220> <221> MOD—RES <222> (42)..(42) <223> Lys or Gin <220> <221> MOD_RES <222> (43j..(43) <223> Ala or Pro <220>
<221> M0D_RES f <222> (5〇T..(50) \ <223> Asp or Trp <220〉 <221> M0D_RES <222> (53)..(53) <223> Ser or Thr . <220> <221> M0D_RES <222> (54)..(54) <223> Leu or Arg <220> <221〉 MOD一RES <222> (60)..(60) <223> Ser or Asp <220> <221〉 MOD一RES <222> (80)..(80) <223> Pro or Ala <220> <221> M0D_RES <222> (83)..(83) <223〉 Phe or Val -24- 200911835 <220> <221> MOD—RES <222> (85)..(85) <223> Thr or Val <400> 94
Xaa lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Xaa Xaa Ser Xaa Ala 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Xaa Xaa Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Tyr Xaa Ala Ser Xaa Xaa Glu Ser Gly Val Pro Xaa Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Xaa 65 70 75 80
Glu Asp Xaa Ala Xaa Tyr Tyr Cys 85 <210> 95 <211〉 5 <212> PRT <213>人工序列 人工序列之描述：合成肽 <220> <221> MOD.RES <222> (3)..(3) <223> Tyr or Thr <400> 95
Ser Tyr Xaa Met His <210> 96 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <220> <221> MOD.RES <222> (1)..(1) <223> lie or Trp <220> <221〉 MOD—RES <222> (2)..(2) <223> tie or fhe <220> <221〉 MOD—RES <222> (3)..(3) <223> Asn or Tyr -25 - <220〉 200911835 <ll\> MUU_Kbi> <222> (5)..(5) <223> Ser or Gly <220>
<221〉 MOD—RES <222> (8)..(8) <223> Ser or Tyr <220〉 <221〉 MOD—RES <222> (9)..(9) <223> Thr or He <220>
<221> M0D_RES <222> (10)..(10) <223> Ser, Lys, Arg or Asn <220〉
<221> MOD—RES <222> (12)..(12) <223> Ala, Asn, Ser, Thr or Asp <220〉
. <221> MOD一RES f <222> (13)..(13) <223> Gin or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Gin or Lys <220> <221> MOD—RES <222> (17)..(17) <223> Gly or Asp <400> 96
Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Gly Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Lys Phe Xaa 1 5 10 15
Xaa
<210> 97 <211> 17 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <220> <221〉MOD—RES <222> (6)..(6) <223> Val or Phe <220> <221> MOD—RES <222> (8)..(8) <223> Tyr or Gly <220> <221〉 MOD一RES <222> (12)..(12) <223> Asn or Gly <220>
<221〉 M〇D_RES <222> (16T..(16) -26- 200911835 <22ό> Leu or vai <400> 97
Lys Ser Ser Gin Ser Xaa Leu Xaa Ser Ser Asn Xaa Lys Asn Tyr Xaa 15 10 15
Ala <210> 98 <211> 11 <212〉 PRT <213>人工序列 人X序列之描述：合成肽 <220> <221> MOD一RES <222> (5),.(5) <223> Gly or 入sp <220〉 <221> MOD-RES <222> (6)..(6) <223> lie or Val <220> <221> MOD 一RES <222> (8)..(8) <223> Ser or Gly <400> 98
Arg Ala Ser Gin Xaa Xaa Ser Xaa Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 99 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 含Si人1序列之描述：合成肽 (^ <220> <221〉 M0D—RES <222> (1)..(1) <223> Trp or Asp <220> <221> M0D.RES <222〉 （4)..(4) <223> Ser, Thr or Met <220〉 <221> M0D—RES <222> (5)..(5) <223> Arg or Leu <220>
<221〉 MOD-RES <222> (6).,(6) <223> Glu or Val <400> 99
Xaa Ala Ser Xaa Xaa Xaa Ser <210〉 100 •27- 200911835 、心x x〆-y <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成肽 <220〉 <221> MOD一RES <222> (2)..(2) <223> Gin or His <220> <221> M0D_RES <222〉 （3),.(3) <223> Tyr, His or Phe <220> <221> MOD一RES <222〉 （4).,(4) <223> Tyr, Asn, Leu or Lys <220> <221> M0D_RES <222> (5)..(5) <223> Ser, lie, Glu, His, Gly, Gin or Thr <220> <221> MOD一RES <222> (6)..(6) <223> Thr or Tyr <220> <221> M0D_RES <222> (8)..(8) <223> Tyr or Phe <400〉 100
Gin Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr <210> 101 <211> 30 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <220> <221〉 MOD一RES <222> (1)..(1) <223> Glu or Gin <400> 101
Xaa Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 102 <211> 32 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 28- 200911835 <221> M0D_RES <222> (6)..(6) <223> Arg or Gly <400> 102
Arg Val Thr Met Thr Xaa Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu 15 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 103 <211> 23 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <220> <221> MOD一RES <222> (13)..(13) <223> Val or Ala <220> <221> MOD一RES <222> (18)..(18) <223> Arg or Lys <400> 103
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Xaa Ser Leu Gly 15 10 15
Glu Xaa Ala Thr lie Asn Cys 20 <210> 104 <211> 23 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <220〉 <221〉 MOD一RES <222> (1)..(1) <223> Ala or Asp <400〉 104
Xaa He Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys 20 <210> 105 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 -29- <220〉 200911835 丄;> MlJU— <222〉 （8)..(8) <223> Gin or Lys <220〉 <221〉 MOD—RES <222〉 （9)..(9) <223> Pro or 入la <400〉 105
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Xaa Xaa Pro Lys Leu Leu lie Tyr 15 10 15 <210〉 106 <211> 32 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成肽 <220> <221〉 M0D—RES <222> (4)..(4) <223> Asp or Ser <220〉 <221〉 MOD一RES <222> (24)..(24) <223> Ala or Pro <220> <221> MOD一RES <222> (27)..(27) <223> Val or Phe <220> <221〉 MOD一RES <222> (29)..(29) <223> Val or Thr <400> 106
Gly Val Pro Xaa Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15
Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Xaa Glu Asp Xaa Ala Xaa Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 107 <211> 17 <212> PRT <213>智人 <220> <221> MOD_RES <222> (10*). .(10) <223> Ser, Asn or Arg <220> <221〉 MOD—RES <222> (12)..(12) <223> Ala, Thr or Asp <400> 107 lie lie Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Xaa Tyr Xaa Gin Lys Phe Gin 15 10 15
Gly -30-

Claims (1)

  1. 200911835 十、申請專利範圍： 1. —種結合死亡受體5 (DR5)之抗體，其中該抗體包含 (a) 包含人類重鏈V-區段、重鏈互補決定區3 (CDR3) 及重鏈框架區4 (FR4)之重鏈可變區，及 (b) 包含人類輕鏈V-區段、輕鏈CDR3及輕鏈FR4之輕 鍵可變區，其中 • 0該重鏈CDR3包含胺基酸序列HEEGI (SEQ ID NO:49);及 Γ) U)該輕鏈CDR3可變區包含胺基酸序列QXHXXTP (SEQ ID NO:5 0)，其中X表示任何胺基酸。 2. 如請求項1之抗體，其中該重鏈v_區段與SEq m NO:44 共有至少90%序列一致性，其中該輕鏈v_區段與SEq ID NO:46或SEQ ID NO:48共有至少90%序列一致性。 3 ·如請求項1之抗體，其中： i) 該重鏈CDR3包含胺基酸序列基元（motif) HEEGIYFXA2 (SEQ ID NO:51)，其中 XjD、T或 K，X2 i„^ 係Y、K或V ;及 ii) 該輕鏈CDR3包含胺基酸序列基元qx3hX4X5TP (SEQ ID NO:52)，其中 X3係 Q或 Η，X4係 Y、L或 K，X5係 T、Q、I、E、H或 G。 k 4.如請求項1之抗體，其中： i)該重鏈CDR3包含一個選自由下列組成之群之胺基 酸序歹|J : HEEGIYFDY (SEQ ID NO:7) > HEEGIYFDK (SEQ ID NO:8)、HEEGIYFDV (SEQ ID NO:54)、 131613.doc 200911835 HEEGIYFTY (SEQ ID NO:55)及 HEEGIYFKY (SEQ ID NO:56);及 ii)該輕鏈CDR3包含一個選自由下列組成之群之胺基 酸序列：QQHYTTP (SEQ ID NO:57)、QQHYQTP (SEQ ID NO:58)、QQHYITP (SEQ ID NO:59)、QQHYETP (SEQ ID NO:60)、QQHYHTP (SEQ ID NO:61)、QQHYGTP (SEQ ID NO:62)、QQHLTTP (SEQ ID NO:63)、QQHKT TP (SEQ ID NO:64)及 QHHYTTP (SEQ ID NO:65)。 5. 如請求項1、3或4中任一項之抗體，其中該重鏈FR4係人 類種系（germline) FR4。 6. 如請求項5之抗體，其中該FR4係人類種系JH4 (SEQ ID NO:28) ° 7. 如請求項1、3或4中任一項之抗體，其中該重鏈包含人 類種系區段。 8. 如請求項7之抗體，其中該重鏈人類種系J-區段係JH4。 9. 如請求項1、3或4中任一項之抗體’其中該輕鏈FR4係人 類種系FR4。 10. 如請求項9之抗體，其中該FR4係人類種系JK2 (SEQ ID NO:38) ° 1 1.如請求項1、3或4中任一項之抗體，其中該輕鏈包含人 類種系區段。 1 2.如請求項1 1之抗體，其中該輕鏈人類種系J-區段係JK2。 1 3.如請求項1之抗體，其中該重鏈V-區段及該輕鏈V-區段 各自包含互補決定區1 (CDR1)及互補決定區2 (CDR2); 131613.doc 200911835 其中： i) 該重鏈v-區段之該CDR1包含一個選自*seqid NO:2及SEQIDNO:3組成之群之胺基酸序列； ii) 該重鏈V-區段之該CDR2包含一個選自由SEQ m NO:5及SEQIDNO:6組成之群之胺基酸序列； in)該輕鏈V-區段之該CDR1包含一個選自由SEq ID ΝΟ:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13 及 SEQ ID N〇:14 組成之群之胺基酸序列；及 iv)邊輕鏈V-區段之該CDR2包含一個選自由sEQ NO:16及SEQIDNO:17組成之群之胺基酸序列。 14.如請求項13之抗體，其中： i) 該重鏈CDR3包含一個選自由SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9組成之群之胺基酸序列；及 ii) 該輕鏈CDR3包含一個選自由SEQ ID NO:20及SEQ IDNO:21組成之群之胺基酸序列。 1 5.如請求項1 3之抗體，其中： i) 該重鏈V-區段之該CDR1包含SEQlDNO:2; ii) 該重鏈V-區段之該CDR2包含SEQlDNO:5; iii) 該重鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO:8 ; iv) 該輕鏈V-區段之該CDR1包含SEQ ID ΝΟ:11 ; v) 該輕鏈V-區段之該CDR2包含SEQ ID NO:16 ;及 vi) 該輕鏈 CDR3 包含 SEQIDNO:20。 16.如請求項13之抗體，其中： i) 該重鏈V-區段之該CDR1包含SEQ ID NO:2 ; 131613.doc 200911835 ii) 該重鏈V-區段之該CDR2包含SEQ ID NO:5 ; iii) 該重鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO:8 ; iv) 該輕鏈V-區段之該CDR1包含SEQ ID NO:12 ;及 v) 該輕鏈V-區段之該CDR2包含SEQ ID NO: 17 ; vi) 該輕鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO:20。 1 7.如請求項1 3之抗體，其中： i) 該重鏈V-區段之該CDR1包含SEQ ID NO:2 ; ii) 該重鏈V-區段之該CDR2包含SEQ ID NO:5 ; 出）該重鏈CDR3包含SEQ ID NO:8 ; iv) 該輕鏈v-區段之該CDR1包含SEQ ID NO:ll ; v) 該輕鏈V-區段之該CDR2包含SEQ ID NO:17 ;及 vi) 該輕鏈 CDR3 包含 SEQIDNO:20。 18·如請求項1之抗體，其中該重鏈可變區與SEQ ID NO:43 之可變區共有至少9 〇 %胺基酸序列一致性，該輕鏈可變 區與SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47之可變區共有至少 9 0 %胺基酸序列一致性。 1 9.如請求項1之抗體’其中該抗體以小於1 X 1 ο·8 Μ之平衡 解離常數（KD)與DR5結合。 20·如請求項1之抗體，其中該抗體係FAb，片段。 2 1.如請求項1之抗體，其中該抗體係IgG。 22.如請求項1之抗體，其中該抗體係單鏈抗體（scFv)。 23 .如請求項1之抗體，其中該抗體包含人類恆定區。 24·如請求項1之抗體，其中該抗體係DR5激動劑（ag〇nist)。 25·如睛求項1之抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO:39具 131613.doc 200911835 有至少95%胺基酸序列一致性之重鏈及與一個選自由 SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41 及 SEQ ID NO:42 組成之群 之胺基Ssl序列具有至少9 5 %序列一致性之輕鏈。 26. 如請求項25之抗體，其中該抗體包含一個包含seq山 NO:39之重鏈及一個包含選自由SEQ id NO:40、SEQ lD NO:41及SEQ ID NO:42組成之群之胺基酸序列之輕鏈。 27. 如請求項26之抗體’其中該輕鏈包含SEq ID N〇:4〇。 28. 如請求項26之抗體’其中該輕鏈包含seq ID NO:4 1。 29·如請求項26之抗體，其中該輕鏈包含SEq ID N〇:42。 30· —種醫藥上可接受之組合物，其包含如請求項丨_28中任 一項之抗體及生理上可相容之賦形劑。 3 1. —種誘導癌細胞細胞凋亡之方法，其包含使該細胞與如 請求項1至28中任一項之抗體接觸，其中該抗體係DR5之 激動劑。 3 2.如請求項3 1之方法，其進一步包含使該細胞與細胞凋亡 誘導劑接觸。 。 33. —種誘導個體中癌細胞細胞凋亡之方法，其包含向該個 體投與治療有效量之如請求項1至28中任一項之抗體， 其中該抗體係DR5之激動劑。 3 4.如請求項3 3之方法，其進一步包含使該細胞與細胞〉周亡 誘導劑接觸。 35. —種結合死亡受體5 (DR5)之抗體，其中該抗體包含重鏈 可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區及該輕鏈可變 區各自包含以下三個互補決定區（CDRs) · CDR1、CDR2 131613.doc 200911835 及CDR3 ;其中： i) 該重鏈可變區之該CDR1包含一個選自由SEQ ID ΝΟ:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3組成之群之胺基酸 序列； - ii)該重鏈可變區之該CDR2包含一個選自由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6組成之群之胺基酸 序列， iii) 該重鏈可變區之該CDR3包含一個選自由SEQ ID (.' NO:7、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9組成之群之胺基酸 序列； iv) 該輕鏈可變區之該CDR1包含一個選自由SEQ ID NO:10、SEQ ID ΝΟ:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13 及SEQ ID NO:14組成之群之胺基酸序列； v) 該輕鏈可變區之該CDR2包含一個選自由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16 及 SEQ ID NO:17 組成之群之胺基 酸序列； ( V vi)該輕鏈可變區之該CDR3包含一個選自由SEQ ID _ NO:19、SEQ ID NO:20 及 SEQ ID NO:21 組成之群之胺基 酸序列，但是該抗體不包含所有SEQ ID ΝΟ:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:15及 SEQ ID NO:19。 131613.doc
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