TW200916775A - Nucleic acid sequencing by selective excitation of microparticles - Google Patents

Description

200916775 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明大體而言係關於核酸定序領域，且争4主^ 又付疋&之， 係關於藉由微粒之選擇性激發進行D N A (去氧核糖核酸）定 序之方法及系統。 【先前技術】 圖1說明使用微粒進行DNA定序的習知方法。圖丨之方法 由微粒陣列102經由定序反應1〇4、微粒之非選擇性激發 (1 106及光學特徵偵測108之循環得到DNA序列資料112。微 粒陣列102中之各個微粒通常含有具有待確定之未知序列 及用於定序反應中之已知序列的DNA分子。如圖2(其說明 微粒陣列102之一實例）中概念性展示，將數以千計至百萬 計（至可能數十億或更多）之此等微粒分布且固定於玻璃基 板表面上。微粒陣列Ϊ 〇2包括分布且固定於基板2〇2上之 DNA定序微粒204。該等微粒2〇4可呈許多形式，諸如經油 包水乳液PCR(聚合物酶鏈反應）技術擴增之DNA分子覆蓋 I 之1微米直徑珠粒，或經橋擴增技術擴增之dna分子簇， 或個別未經擴增之DNA分子。該等微粒2〇4可隨機（例如不 規則間隔）或以有序圖案（例如規則間隔之圖案，諸如方形 網格圖案或六邊形網格圖案）分布於基板2〇2上。基板2〇2 通常係由玻璃製成且位於流槽内部，其使微粒2〇4曝露於 一系列試劑以執行定序反應。在定序反應之各循環結束 時，各微粒呈現一光學特徵，此通常為併入四種螢光團 (諸如Cy3、Cy5、德州紅（丁exas Red)及螢光共振能量轉移 133810.doc 200916775 —者之結果，該四種螢光團顯示DNA之 應驗基腺嗓吟(簡寫為”a")、胞㈣(簡寫為·，〇、鳥〜 (簡寫為"g”）及胸腺嘧啶（簡寫為” t")。 ， 圖心c說明可用於DNA定序之個別定序微粒之不同類 圖3A說明由經已事先經油包水乳液pcR技術擴增之純 '、DNA分子304覆蓋之m米直徑珠粒3()2形成的個別微粒 2〇4。在流體306中珠粒如直接連接至基板2〇2。圖把說明 連接至基板202且置於流體3〇6中之呈純系嶋分子取鎮 形式的個職粒204。料DNA分子事先已經橋擴增技術 擴增。圖3C說明連接至基板2〇2且置於流體3〇6中之呈單個 DNA刀子3〇4形式之個別微粒。該單個]〇]^八分子係在未 經擴增之情況下定序。 再參看圖1以及圖2及3A-3C，使用微粒之DNA定序包括 對U粒陣列丨02執行定序反應丨〇4以使各微粒呈現顯示 DNA序列資訊之光學特徵。將微粒陣列1〇2曝露於定序試 劑，其使定序反應之各循環能以整體平行之方式執行。例 士 個疋序反應循環可包含使錯引子雜交及連接經螢光 才不°己之珣探引子（query primer)池《在定序反應104之各循 環、’"束時，各微粒呈現顯示與彼微粒相關之DNA序列資訊 的光學特徵。例如，該光學特徵可為併入對應於DNA 304 之驗基”a”、”c”、”g，，及”t，，之四種螢光團之一者之結果。 下—步驟為光學激發1 〇6微粒2〇4且偵測1 08該等微粒之 光學特徵參照圖4a_4C可知，習知之光學激發為非選擇 性的。多次重複此反應104、非選擇性激發106及光學特徵 133810.doc 200916775 偵測⑽之循環以對各微粒2Q4中之囊_定序。匪序 列資料112係自此過程輸出。 一使用微粒之習知嶋定序方法受低產量（以每秒驗基數 量測)之苦’ ®為谓測微粒光學特徵之速度受到限制。此 主要係歸因於如在習知DNA定序方法中所使用，使用習知 非選擇性激發《案’隨後使用光學顯微法進行光學成像。 圖4A 4C D兒明用於激發微粒以用於隨後使用光學顯微法成 像之I知非選擇性激發圖案。具體言之，圖从說明基板 2〇2上之微粒204所用之寬視場激發圖案402，#中該視場 (FOV)中之所有微粒均被照明。圖4B說明列掃描激發，其 中微粒204經掃描基板2G2之—列光術照明。圖4c說明點 掃描激發’其中微粒204經掃描基板2〇2之光點4〇6照明。 習知非選擇性激發圖案可由多種方法產生。寬視場激發 圖案402通常係藉由經由顯微鏡光學元件串以柯勒頂置式 照明組態（Kohler epi_illuminati〇n c〇nfigurati〇n)聚焦狐光 燈源產生’或藉由轉㈣或全内反射（TIR)照明組態以 大錐角照射雷射源產生。列掃描激發圖案4〇4通常係藉由 將空間相干雷射經由顯微鏡光學^件串聚焦且併人掃描元 件中產生。點掃描激發圖案4〇6通常係藉由以共焦組態經 由顯微鏡光學元件串聚焦空間相干雷射源產生。 在該等習知DNA定序方法中，通常藉由使由如圖4A_4c 中所示之非選擇性激發圖案照明之微粒光學顯微鏡成像執 行微粒光學特徵之偵測《此方法之速度基本上受若干原因 之限制。第一，光學顯微鏡之視場（F〇v)*本上與解析度 133810.doc 200916775 聯繫在一起，亦即解析度越高，F〇v越小。類似地，光學 顯微鏡之視場深度（D0F)基本上與解析度聯繫在一起，亦 即解析度越高，越小。因為制f知定序方法解析微 粒需要高解析度光學顯微鏡，因此FOV&D〇F相對較小。 因此，使u粒基板成像需要獲得成百上千像瓷磚一樣集體 覆盎於載>1上之較小影像。在各影像之間，基板或光學顯 微鏡必須關於顯微鏡物鏡移位且精確聚焦，在此期間，光 學顯微鏡不能獲得序列資料。第二，微粒載片之高解析度 影像非常無效地表示微粒中所含之序列資訊。例如，在典 型之微粒載片之高解析度影像中，影像中之像素數極大超 過影像中之微粒數。然而，假定各微粒可呈現僅四種光學 特徵中之一種，則各微粒攜帶僅2位元之序列資訊。因 此，根據習知定序方法，獲得比產生序列資訊所必需之資 料多數千倍之資料= 因此，需要更有效、更快且更便利之核酸定序方法。 【發明内容】 本發明之實施例包括一種藉由選擇性激發核酸微粒且使 用影像處理演算法提取該等微粒之光學特徵以快速定序核 酸（諸如DNA或RNA(核糖核酸））之方法。本文中之術語”核 酸'，包括DNA及RNA。此方法之一優點為其允許相對低解 析度之光學顯微鏡進行經選擇性激發之微粒的成像，其使 得能以極大視場（FOV)及視場深度（D〇F)執行微粒光學特 徵之偵測。此方法之另一優點為，相比使用非選擇性激發 所得之微粒之高解析度影像，使用選擇性激發所得之微粒 1338 丨 0.doc 200916775 之相對低解析度影像為序列資訊之更有效資料表示，其使 所獲得之定序所需之資料量極大減少。 在—實施例中，用於定序核酸微粒之方法包含使用—或 夕種疋序試劑對核酸微粒執行定序反應；以激發圖案選擇 性激發核酸微粒；以不足以解析個別微粒之解析度使受激 發核酸微粒光學成像；及使用關於激發圖案之資訊處理受 激發核酸微粒之光學影像以確定至少一種光學特徵之存在 與否。光學特徵之存在與否表明核酸之序列資訊。儘管以 不足以解析個別微粒之解析度獲得受激發核酸微粒之影 像，但核酸微粒之選擇性激發係以足以解析個別微粒之解 析度執行。可使用相同或不同試劑重複定序反應、選擇性 激發及影像處理步驟以完成定序。 在一實施例中，用於核酸微粒之光學激發的裝置包含用 於產生第 运射光束之雷射、經耗合以接收第一雷射光束 之光纖、耦合至第一光纖且接收經由光纖傳遞之第一雷射 光束之干擾圖案產生模組，其中干擾圖案產生模組將第一 雷射光束分成第二雷射光束及第三雷射光束，且藉由第二 雷射光束與第三雷射光束之間之干擾產生激發圖案用於選 擇性激發目標。 干擾圖案產生模組可包括光束分光器，其用於將第一雷 射光束分成第二雷射光束及第三雷射光束；及鏡面，其反 射第三雷射光束，其中該鏡面在一定範圍内可移動以改變 第三雷射光束之光程長度。或者，干擾圖案產生模組可包 括光束分光器，其用於將第一雷射光束分成第二雷射光束 133810.doc -10- 200916775 及第三雷射光束；及視窗，其耦合至第三雷射光束且旋轉 以調節第三雷射光束之光相位。 本發明之核酸定序方法因至少兩個原因而快速且有效。 第一，因為用於偵測微粒光學特徵之F〇v及D〇F增加，因 此掃描及聚焦所需要之機械運動極大減少。第二，因為所 獲得之定序所需之資料量減少（在處理光學影像過程中使 用關於激發®案之資訊使得能使料足讀析個別微粒之 低解析度影像）’因此定序所需時間亦極大減少。 描述於本說明書中之特徵及優點並非包涵一切的，且詳 言之’ t於H說明書及巾請專利範圍，許多額外特徵 及優點對於-般熟習此項技術者將為顯而易見的。此外， 應注意，本說明書中所用之語言主要係出於可讀性及指導 之目的選擇，且並非選擇用來界定或限定本發明之標的 物。 【實施方式】 同隨附圖式可易於理解本發明 藉由考慮以下實施方式連 之實施例之教示。 佳=二以下描述係關於僅出於說明之目的之本發明之較 實例。應注意，自以下論述，將易於切1 離所Φ4的 竹勿於μ硪作為在不偏 張之本發明之原理的情心可採肖 的本〇所揭*之結似方法之替代實施例。代選擇 中干本發明之實施例，其實例將在隨附圖式 = 應注意，只要可實行，類似或相同來考數字 均可用於諸圖中且 /亏數予 “類似或相同功能性。圖式僅出於 I338I0.doc 200916775 說明之目的描繪本發明之實施例。熟習此項技術者將容易 自以下論述中認識到，在不偏離本文所描述之本發明之原 理的情況下，可採用本文所說明之結構及方法的替代實施 例。 圖5說明一種藉由使用結構化照曰月選擇性激發微粒進行 核酸（例如DNA或RNA)定序之方法。儘管本文之揭示案係 在DNA定序情況下描述核酸定序方法，但術語”定序"之使 用並不意欲將本發明之範疇限於DNA定序，且本文中之"定

序’’包括RNA定序或其他類型核酸定序。本文中之”定序|， 或’’序列'’亦意欲涵蓋所有序列變化，諸如單核㈣多態現 象（SNP)、基因複本數目變卩、單驗基重複、反轉、插入 及缺失，及該定序之所有應用，諸如基因型、基因表現分 析及藥物應用。 ，、有A之微粒陣列5〇2首先經歷定序反應504之循環。 定序反應504包括將微粒曝露於一系列試劑且在_系列溫 度下培育該等微粒。作為定序反應循環之終產物，各微粒 呈現顯不與彼微粒相關聯之序列資訊的光學特徵。光學特 徵可為併人-或多種光學可制標記之結果，㈣標記諸 =光染#、勝體金及量子點。例如，各定序反應⑽可 、至°又^以使光學特徵為併入對應於DNA 304之鹼基”a”、 V、’V’及V’之四種瑩光團之一者之結果。注意該等微粒 可為圖⑷C中所示之類型中之一者或適用於職定序之 某一 /、他類型。亦注意可能需要執行許多額外習知步驟以 自DNA樣本製傷具有DNA之微粒陣列，其不為本發明之標 133810.doc 12 200916775 的且本文中未加描述。 如參考圖6A-6C更詳細地說明，與習知DNA定序方法不 同，接著可以選擇性激發圖案選擇性激發506微粒204。接 著使用光學顯微鏡使受選擇性激發之微粒陣列成像5〇8。 接著，確定510當前選擇性激發圖案是否為應用之最後圖 案。若其並非最後圖案，則將激發圖案改變512，且重複 步驟506、5 08、510中之激發及成像循環。 圖6A-6C說明如何藉由如步驟506、508、5 10中之激發及 成像循環中所示之激發圖案的序列選擇性激發微粒。參看 圖6A，在時間N時，在微粒2〇4上產生選擇性激發圖案 6〇2。參看圖6B ,在時間N+1時，在微粒2〇4上產生另一選 擇性激發圖案604。參看圖6C，在時間N+2時，在微粒2〇4 上產生另一選擇性激發圖案6〇6。 注意此等選擇性激發圖案6〇2、604、606具有，，選擇性" 係因為其以非不重要之圖案序列激發微粒204。相比之 下，圖4A-4C中所示之習知激發圖案以不重要之圖案無差 別地激發空間區域，旨在產生隨空間及/或時間變化之區 域影像（亦即照相複本）。例如，圖4A之寬視場掃描激發將 產生隨二維空間變化之區域影像。圖4B之列掃描激發將產 生隨一維空間及一維時間變化之區域影像。圖4(：之點掃描 激發將產生隨二維時間變化之區域影像。換言之，習知激 發係用於產生作為微粒陣列5〇2之照相複本之單一高解析 度影像。相比之下，根據本發明之選擇性激發係用於產生 微粒陣列502之低解析度影像之序列，其辛該低解析度影 I33810.doc 13 200916775 像並非微粒陣列5G2之照相複本H，選擇性激發在低 解析度〜像集（其中該解析度未高至足以解析個別微粒2〇4) 中編碼序列資訊’且使料擇性激發圖案之知識處理該等 影像以將該等序列資訊解碼。另彳，使用習知激發需要的 只是簡單地移位不重要之激發圖案（諸如矩形4〇2、線形 404或圓形406)。相比之下，使用根據本發明之選擇性激 發需要更為複雜之圖案變化，諸如改變特徵尺寸及/或方 向，及使用更為複雜之圖案。

如參考圖7A_7B所說明，在—實施例中，選擇性激發圖 案602、604、606係由用於結構化照明之合成孔徑光學裝 置產生（亦稱為圖案化激發或駐波激發）。選擇性激發圖案 602、604、606係以對微粒陣列5〇2最佳之方式產生。例 如，如參考圖ίο所說明’選擇性激發圖案6〇2、6〇4、6〇6 確定樣本在頻率域中之分布。樣本在頻率域中之分布範圍 與微粒陣列之特徵尺寸_相匹配。以足以解析個別微粒 之解析度執行核酸微粒204之選擇性激發。例如，可使用 週期為微粒中^ 2G4之間之間距之兩倍的正弦波照明來產 生選擇性激發圖案6G2、6〇4、6〇6，但在其他實例中可使 用多種其他照明週期。 又’激發圖案之序列及數目經設計以確保受激發微粒陣 列502之相對低解析度影像仍產生微粒2〇4之光學特徵的有 ，而完整且精確之表示，且相應地微粒陣列5〇2中^序列 資訊亦如此。例如，如參考圖1〇所說明，選擇性激發圖案 6〇2、604、6〇6確定樣本在頻率域中之分布。頻率域中樣 133810.doc ，14 · 200916775 本之數目與微粒陣列5 02之光學特徵之特徵密度相匹配。

再參看圖5，在最後激發圖案510處完成最後之激發及成 像循環後，確定5 1 4當前FOV是否為微粒陣列502之最後 FOV。若當前f〇v並非最後FOV，則將微粒陣列502移位 (移動平台）5 16至下一 FOV且對於該下一 FOV重複步驟 506、508、5 10、5 12中之激發及成像循環。例如，可將微 粒陣列502移動5 1 6以曝露微粒陣列502之另一 FOV。或 者’可移動產生選擇性激發圖案之結構化照明裝置以曝露 微粒陣列502之另一 FOV。 當整個微粒陣列502成像後（亦即達步驟5 14中之最後 FOV後），確定518微粒陣列是否應經歷另一定序反應循 環。若當前反應504並非最後反應，則用相同或不同定序 試劑執行新定序反應504循環，且接著重複步驟5〇6至 518。在最終之定序反應循環518後，關於微粒陣列5〇2之 光學特徵資料執行影像處理52〇以提取含於微粒陣列5〇2中 之DNA分子中之序列資料522。 圖7 A說明根據本發明 之一實施例之用於選擇性激發微粒 之合成孔徑光學結構化照明裝置 準產生多個相互相干之雷射光束 結構化照明裝置以高水 該等雷射光束之干擾產 生干擾圖案 擇性激發微粒204 將°亥等干擾圖案投射於微粒陣列5 02上且選 案因許多理由而有利。例如 具有極大FOV及DOF。儘管 502之激發圖案為實例描述 使用多個雷射光束之干擾產生干擾 ’此使得高解析度激發圖案 在本文以產生用於微粒陣 結構化照明裝置圖7A(及 圖 能 列 圖 133810.doc •15· 200916775 7B)，但應注意圖7A(及圖7B)之結構化照明裝置可用於任 何其他類型之應用以產生用於任何其他_目標之激發圖 案。 參_看圖7A，結構化照明裝置7〇〇包括雷射7〇2 ;光束分光 器704 ;擋板705、707 ;光纖耦合器7〇8、7〇9 ; 一對光纖 710、711 ,及一對干擾圖案產生模組712、713。藉由光束 分光器704將雷射702之光束703分成兩個光束74〇、742。 使用一對高速擋板705、707分別將各光束74〇、742 ”接通，， 或”切斷"，或分別調節各光束74〇、742之振幅。將該等轉 換之雷射光束經由光纖耦合器7〇9、7〇8耦合至一對偏振保 持光纖711、710。各光纖711、71〇分別與相應干擾圖案產 生模組713、712連接。干擾圖案產生模組713包括準直透 鏡714’、光束分光器716，及移位鏡面71 8，，且類似地，干擾 圖案產生模組712包括準直透鏡714、光束分光器716及移 位鏡面71 8。 將來自光纖710之光束744藉由準直透鏡714準直且藉由 光束分光器716分成兩個光束724、726。藉由致動器72〇移 位鏡面718以改變光束726之光程長度。因此，在基板2〇2 上於兩個雷射光束724、726之間之重疊區域中產生干擾圖 案722，其中該圖案由於光束726之一者之光程長度改變 (亦即藉由使用移位鏡面718調節光束726之光相位）而改 變。 類似地，將來自光纖7U之光束746藉由準直透鏡714，準 直且藉由光束分光器71 6,分成兩個光束728、730。藉由致 I33810.doc -16- 200916775 動益720移位鏡面718'以改變光束728之光程長度。因此， 在基板202上於兩個雷射光束728、73〇之間之重疊區域中 產生干擾圖案722，其t該圖案由於光束72 8之一者之光程 長度改變（亦即藉由使用移位鏡面718調節光束728之光相 位）而改變。實際上，干擾圖案722係在基板2〇2上於四個 雷射光束726、724、728、730之間之重疊區域中產生。在 實知例中，為產生正弦曲線干擾圖案，僅使用兩相（〇及 90度）或二相（〇、120及240度）且足以進行微粒之選擇性激 發。 雖然為簡單起見而使用圖7A中所說明之此實施例，但在 本發明範疇内可使用各種其他方法。例如，除光振幅及相 位之外亦可調節光束724、726、728、730中一或多者之振 幅、偏振、方向及波長，或可調節光束724、726、728、 730中一或多者之振幅、偏振、方向及波長而非光振幅及 相位，以改變激發圖案722。結構化照明亦可關於微粒陣 列簡單地移位以改變激發圖案。類似地，微粒陣列可關於 結構化照明移位以改變激發圖案。除移位鏡面7丨8、71 8，之 外亦可使用各類光學調節器，或可使用各類光學調節器替 代移位鏡面718、718,，諸如聲光調節器、電光調節器及微 電子機械系統（MEMS)調節器。此外，儘管本文中所述之 圖7A(及圖7B)之結構化照明裝置使用雷射7〇2作為相干電 磁輻射之照明源’但可使用其他類型之相干電磁幸畐射源 (諸如SLD(超輻射發光二極體））來替代雷射7〇2。 另外，儘管圖7A說明使用四個光束724、726、728、 133810.doc •17- 200916775 產生干擾圖案722，但可藉由將源雷射光束分成兩個以上 光束來使用較大數量之雷射光束。例如，可使用64個光束 產生干擾圖案722。此外，光束組合無需侷限於成對組 合。例如，可使用三個光束724、726、728，或三個光束 724、726、730’或三個光束724、728、73〇，或三個光束 726、729、730，或所有四個光束 724、726、728、73〇 來 產生干擾圖案722。通常，必要時選擇一組最少之光束組 合以使速度最大化。在—實施例中，光束組合之數目與微 粒陣列502中未知資訊之量相匹配。例如，在已知微粒陣 列502中微粒之位置後，即可使用相對少量之激發圖案來

確定微粒之光學特徵且隨後確定序列資訊。光束亦可經準 直、會聚或發散。儘管與圖7A及7B之特定實施例不同， 且用於不同應用中，但其他關於使用多個光束對產生干擾 圖案之一般背景資訊可在以下文獻中發現：（i) 2〇〇〇年U 18 日頒予 Mermelstein 之標題為"Muhiple Beam pair 〇pUcai Imaging"之美國專利第6 016 196號，（u) 2〇〇〇年1〇月31日 頒予 Mermelstein 之標題為"〇pticai Synthetic Apenure Array"之美國專利第6，14〇,66〇號，及2〇〇3年4月i5日 頒予 Mermelstein 之標題為"〇ptical Synthetic Aperture

Array”之美國專利第6,548,82〇號，該等專利皆係以引用之 方式併入本文中。 圖7B έ兒明根據本發明另—實施例之可與圖7 a之裝置一 起使用之不同類型之干擾圖案產生模組。可使用圖76之干 擾圖案產生模組750替代圖7A之干擾圖案產生模組712或 1338I0.doc -18- 200916775 713。儘管圖7B說明圖7A之干擾圖案產生模組川經圖π =擾圖案產生模組75。替代之情況，但干擾圖案產生模 3亦可類似地經圖7B之干擾圖案產生模組75〇替代。

參看圖7B ’光纖710之輸出光束77〇藉由準直儀754準 直’且藉由光束分光器756分成兩個光束爪、Μ。將光 學窗760插入一個光束774之光學路徑令且旋轉，使用電流 汁來調即光束774之光程長度，藉此調節相應光束”4之光 相位’且產生經調節之光束776。每兩個光束僅有一個相 位調節器（旋轉光學窗鳩)使干擾圖案產生模組750之設計 緊凑且有效° ^個固^鏡面758、762分別反射光束772、 776,產生干擾圖樣78〇 ’同時維持大致匹配之光程長度。 圖7A及7B之結構化照明裝置與習知結構化照明裝置相 比具有許多技術優點。此等優點包括： (0使用多個雷射光束之干擾產生高解析度激發圖案， 使柃此夠達成在使用習知透鏡投射系統時不可達成之極大 FOV及 DOF。 ⑴）用於傳遞雷射光束之光纖710、711消除雷射7〇2源之 振動傳輸’其提供較佳晦準（p()inting)穩定性及較佳可製造 性。 (111)使用干擾圖樣產生模組之模組化設計提供更為靈活 之光束幾何學設計’其使得能藉由減少製造複雜性及成本 而使用大量光束。 (w)基於光纖之設計啟用緊湊且輕質之裝置，其提供較 佳機械及熱穩定性。該緊湊組合件亦使自由空間光束傳播 133810.doc -19- 200916775 最小化，從而減少由大氣亂流造成之擾動。 (V) 圖7B之干擾圖樣產生模組提供標稱匹配之光程長 度，其消除對於單縱模式雷射源之需求。 (VI) 基於光纖之設計執行光束分光進入兩個平台（一個平 口在光束分光器704處且另一個平台在干擾模組產生模組 712 71 3中之光束分光器7丨6、7丨&處），從而使得光纖之 溫度變化及機械擾動不會顯著影響干擾圖案。 (vii) 因為僅使用兩相（〇及9〇度）或三相（〇、及度）產 生正弦曲線干擾圖案，所以與8或8個以上相位相比，資料 獲取所需之時間極大減少。 (viii) 為調節振幅及相位而使用擋板及旋轉光學窗會使得 緊湊且輕質之裝置具有低成本、簡單控制電子學及高光學 效率。例如，圖7B中所示之干擾圖案產生模組750之光學 效率可大於95%。 圖7C、7D及7E根據本發明之實施例說明來自圖7A或圖 7B之結構化照明裝置之光束可如何耦合至流體中以照明微 粒。具體吕之’圖7C說明雷射光束724經由視窗792進入流 體3 0 6以照明及選擇性激發基板2 〇 2上直立微粒陣列5 〇 2之 微粒204。可經由視窗792使微粒204成像。圖7D說明雷射 光束724經由基板202背面（亦即與置放微粒2〇4之側面相對 之基板202之側面）進入流體306以照明反轉微粒陣列5〇2。 可經由基板2 0 2使微粒2 0 4成像。圖7 E說明雷射光束7 2 4經 由耦合稜鏡794進入流體306以照明且選擇性激發基板2〇2 上反轉微粒陣列502之微粒204，以TIR(全内反射）照明組 133810.doc •20- 200916775 態離開基板202。微粒204可經由基板202成像。為清楚起 見，在圖7C-7E中僅說明一個光束。 圖8更詳細地說明根據本發明之一實施例之用於定序之 圖5之影像處理520。將自光學成像508(圖5)輸出之受選擇 性激發之微粒的原始影像802輸入影像合成演算法804。注 意原始影像802為低解析度影像-選擇性激發5〇6(圖5)及對 選擇性激發圖案之認識消除對高解析度影像之需求。原始 衫像之低解析度不足以解析個別微粒。然而，影像合成演 算法804處理原始影像802，連同關於用於激發微粒之激發 圖案的資訊806及關於微粒陣列502之資訊808(諸如微粒之 尺寸及位置），以產生微粒陣列5〇2之合成高解析度影像 8 1 〇。將合成影像8 10輸入處理合成影像8 1 〇連同關於微粒 陣列502之資訊808之微粒特徵識別（MSI)演算法812，以確 定各微粒之光學特徵814。將微粒光學特徵資料814輸入產 生DNA鹼基之序列522的鹼基響應演算法816。雖然圖8之 實施例由於其簡單透明而有益，但各種其他方法亦可用於 影像處理520。 圖8中之影像合成演算法8〇4利用干擾圖案產生模組 712、713(圖7)產生正好近似於正弦曲線或正弦曲線之和之 激發圖案的[生貝。圖9說明可如何使所偵測之光學圖案模 型化成微粒勞光團分布函數與激發㈣之乘積。如圖9中 維丨生展不，接著可將藉由光學成像508(圖5)偵測之光學 圖案802(圖8)表不為微粒螢光團分布函數與正弦曲線函數 (或正弦曲線函數之和)之乘積，其適用於傅立葉和(Fourier 133810.doc -21 · 200916775 二)：.不法。例如，所偵測之光學圖案902可為微粒螢光 之:風函數（f(X)) 908與激發圖案（gI(x)) 910之乘積。所偵剩 予圖案9G4可為相同微粒勞光困分布函數（_ 908與不 兄激發圖案（g2(x)) 912(在此實施例中其與激發圖案（gi(、 91〇具有180度之相移)之乘積。所偵測之光學圖案 相同微粒螢光團分布函數（f(x))9〇8與另—不同激發圖^ ㈤⑻）914(與激發圖案9】〇、9〗2相比，其在此實施 不同週期）之乘積。 "有 將原始影像資料8G2表示為傅立葉和後，產生合成高解 析度影像81G之問題即可轉為-般傅立f反演變換 (F〇Urier-inVerSi〇n)問題，其可使用大量眾所周知之方法解 決。注意，影像合成演算法之較為常見之實施例並不假定 激發圖案為正弦曲線或正弦曲線之和。在此情況下，原始 影像802資料可表示為更為常見之矩陣乘法。接著產生: ，高解析度影像8U)之問題可轉為常見之矩陣反演變換問 題，其可使用大量眾所周知之方法解決。 圖10說明頻率域中之取樣圖案與用於產生激發圖案之雷 射光束之幾何學之間的關係。如圖10中所示，該等樣本在 頻率域中之分布係由結構化照明裝置中雷射光束之幾何學 :確定。例如’若雷射光束在幾何學職中具有k階向 =，則頻率樣本將具有直線分布1〇〇4(亦稱作2DFT分布、 笛卡爾分布（Cartesian distribution)，或均衡分布）。又例 如，若雷射光束在幾何學1〇〇6中具有k階向量，則頻率樣 本將具有非直線分布1008。 133810.doc -22- 200916775 圖8中之MSI消鼻法812及驗基響應演算法（base-calling algorithm) 81 6將微粒陣列之高解析度合成影像8 1 〇視為輸 入且產生各微粒之DNA鹼基序列522。圖11概念性地說明 根據本發明之一實施例之該識別各微粒之DNA鹼基之方 法。參看圖Π ’ 1 2個影像1 1 02至11 22各自展示相同F0V， 且在此實例中在各FOV中存在兩種定序微粒1172、1174。

合成影像集11 5 0說明在第一個定序反應循環後之微粒 11 72、11 74。在該第一個反應循環過程中，微粒i丨72、 U74呈現對應於各微粒1172、1174之第一未知〇]^人鹼基之 四種光學特徵中之一者。合成影像集1丨5 〇係由四個高解析 度合成影像810構成’該等影像之每一者均經最佳化以偵 測四種光學特徵之一者。該影像集115〇之第一影像11〇2經 最佳化以偵測對應於DNA鹼基” a”之光學特徵。該影像集 1150之第二影像ι1〇4經最佳化以偵測對應kDNA鹼基"t”之 光學特徵。該影像集1150之第三影像丨1〇6經最佳化以偵測 對應於DNA鹼基"g”之光學特徵。該影像集115〇之第四影 像1106經最佳化以偵測對應於DNA鹼基"c"之光學特徵。 第二合成影像集1160說明在第二個定序反應循環後之微 粒1172、1174。在該第二個反應循環過程中，微粒HI 1174呈現對應於各微粒1172、1174之第：未知霞驗基之 四種光學特徵中之一者。合成影像集116〇係由四個高解析 度合成影像81〇組成，料影像之每—者均經最佳化以偵 測四種光學特徵之-者。該影像集U6q之第—影像⑴〇經 最佳化以偵測對應於DNA驗基"a ”之光學特徵。該影像集 133810.doc •23- 200916775 11 6 0之第一影像1112經最佳化以伯刺料處 参 取亿以偵測對應於DNA鹼基"Γ之 光學特徵。該影像集丨丨6〇之第= 乐一办像Π 1 3經最佳化以偵測 對應於DNΑ驗基πgπ之光學转料。兮& a g尤予将微该影像集1160之第四影 像"Η經最佳化以偵測對應於驗鹼基"。”之光學特徵。 第三合成影像集⑽說明在第三個定序反應循環後之微 拉1172、1174。在該第三個反應循環過程中，微粒1172、

1174呈現對應於各微粒1172、1174之第三未知膽人驗基之 四種光學特徵中之一者。合成影像集117〇係由四個高解析 度合成影像8H)組成，該㈣像之每—者均經最佳化以偵 測四種光學特徵之-者。該影像集mQ之第—影像⑴幢 最佳化以偵測對應於DNA鹼基"a”之光學特徵。該影像集 11 70之第二影像丨丨丨8經最佳化以偵測對應於dna鹼基”t"之 光學特徵。該影像集1170之第三影像112〇經最佳化以偵測 對應於DNA鹼基” g”之光學特徵u該影像集丨丨川之第四影 像1122經最佳化以偵測對應於DNA鹼基,，c，，之光學特徵。 在對應於第一未知DNA鹼基之合成影像集丨丨5〇中，在對 應於"a"之影像U02中第一微粒1172最明亮，且在對應於 ” gn之影像1106中第二微粒1174最明亮，但在分別對應於 ” t”及” c，’之影像U04、1108中微粒均不明亮。在對應於第 一未知DNA驗基之合成影像集π 60中，在對應於”a"之影 像1110中兩種微粒U 72、1174均最明亮，但在分別對應於 ”t”、”g”及”c”之影像1112、1113、1114中微粒均不明亮。 在對應於第三未知DNA鹼基之合成影像集117〇中，在對應 於"t”之影像1118中第一微粒11 72最明亮且在對應於"c"之 133810.doc -24- 200916775 影像1122中第二微粒1174最明亮，但在分別對應於”a'，及 V之影像1116、1120中微粒均不明亮。因此，在此簡單 的概念性實例中，與第一微粒丨172相關聯之DNA序列為 aat"且與第二微粒1丨74相關聯之DNA序列為"gac„。儘管 上文使用成像微粒之亮度確定序列資訊來說明圖丨丨中之實 例’但亦可藉由偵測成像微粒之不同光譜特徵得到序列資 訊。 在不同於此簡單的概念性實例之實施例中，定序反應循 %或多或少常常發生，且光學特徵數多於或少於四種。例 如，在一實施例中，定序反應可在高解析度合成影像 1102、1104之間而非合成影像集115〇、116〇之間發生。在 另實施例中，各微粒11 72、11 74呈現僅一種光學特徵， 且光學特徵之缺乏傳達序列資訊。在又一實施例中，各微 粒1172、1174同時呈現多種光學特徵u在又一實施例中， 光學特徵與DNA鹼基之間簡單的一一對應被更複雜之用於 以光學特徵編碼DNA序列資訊（例如，兩鹼基編碼）之方案 替代。注意存在許多其他習知定序化學。本發明之定序方 法可使用且與大多數定序化學相容。 再參看圖8，MSI演算法812在各高解析度合成影像丨丨… 至1122中識別微粒1172、1174，且提取各微粒之光學特徵 資料。實際上，此舉可藉由以下步驟實現：限定影像之閾 值以識別在各合成影像巾可見之微粒，且接著將各微粒之 影像與一維面斯函數（Gaussian functi〇n)擬合以估計位置及 亮度。 133810.doc -25- 200916775 再參看圖8 ’鹼基響應演算法81 6將微粒光學特徵資料 / 4視為輸入且產生各微粒之DNA序列。第一步驟為經由 微粒光學特徵資料814集追蹤各微粒之位置。實際上、，在 各成像循環中，微粒陣列之位置並不相同。因此，微粒光 千特徵資料8 1 4集通常需要空間定位。在一實施例中，藉 由使用與疋序微粒混合之定位微粒來幫助空間定位。通 常疋位微粒為比定序微粒亮數倍之丨微米直徑珠粒。定 ㈣粒之亮度使其易於與定序微粒相區別，且定位微粒與 j序微粒之比率較低（大約為1比1_)致使定序產量未受顯 著影響。定位步驟後，第二步驟為關於各微粒光學特徵資 料814集確定各微粒之光學特徵。如上所述，各微粒可在 各微粒光學特徵資料814集中呈現四種光學特徵之—者。 四種光學特徵對應於四種可能之驗基響應（亦即"a”、、"、 ’V’及’V’)。通常對於各鹼基響應指定品質度量。注 二异法來解釋原始鹼基響應，其不為本發明之 才示的且在本文中未加描述。 圖12說明校準圖5中所示之結構化照明裝置之方法。為 以一定精確度瞭解激發圖案，為 處理成功地產生罐序列資料。便月^由影像 例如’此激發圖荦資祖 :咐圖8)為影像合成演算法8〇4(圖 錢' =成孔徑光學結構化_置中之典型校準= 先束724、726、728、73〇之方向、 ^數為各 振、波長及相對光相位。參看：狀、振幅、偏 置放权準目標12。2代替微粒陣列來執行校準。理：上精由 133810.doc * 26 - 200916775 心12 〇 2 ~T為具已知特徵之任何目標。例如，校準目標 1202可為具有大體上相同之亮度之1微米直徑螢光珠粒之 隨機陣列。類似於圖5令所述之方法，以一激發圖案將校 準目標1202選擇性激發506。接著使用光學顯微鏡使受選 擇性激發之校準目標微粒陣列成像508。接著將激發圖案 變5 1 2且重複激發及成像循環直至達到最後圖案$ 1 〇。 在最後之激發及成像循環完成510後，接著處理圖像52()。 基於校準目標1202及結構化照明裝置之舊校準參數12〇6之 知識可預測校準影像之内容。使用經預測校準影像（基 於舊杈準參數）與經由影像處理52〇所得之經量測校準影像 之間之差異產生新校準參數丨204。 圖13概念性地說明根據本發明之一實施例之用於藉由微 粒之選擇性激發進行^序之硬體线m統包括流槽 1302、試劑處置模組13〇4、溫度控制模組13〇6、選擇性微 粒激發模組1308、光學成像模組131〇、影像處理模組i3i2 及序列資料儲存模組13 14。微粒陣列5 0 2通常位於流槽 13〇2(其使微粒曝露於定序試劑）内。試劑處置模組⑽應 用試劑以將微粒陣列502曝露於定序試劑。溫度控制模組 1306將流槽13〇2之反應溫度控制在適於與定序試劑反應之 溫度。選擇性微粒激發模組削選擇性激發如上所述:微 粒，且光學成像模組131〇獲得受選擇性激發之微粒之影 像。使用影像處理模組1312中之影像處理演算法分析受選 擇性激發之微粒之影像以提取該等微粒之 序列資訊。將序列資訊儲存於序列資料儲存模組中。 133810.doc -27- 200916775 圖14說明圖13之定序硬體之控制系統架構。控制系統架 構包括具有使用者介面1404之資料獲取電腦14〇2、框接收 器1410、相機1418、平台控制器與可程式化邏輯控制器 (PLC) 1414、（掃描）平台142〇、擋板1422、光束調節器 1424、自動取樣器1426、泵1428、溫度控制器143〇、焦點 控制器1432及影像處理電腦集群14〇6。框接收器1 4 1 〇經由 周邊組件互連（PCI)介面1412連接於資料獲取電腦14〇2。 框接收器1410與相機141 8在資料獲取電腦14〇2之控制下一 起獲得受選擇性激發之微粒之影像。為求高速，使用pLC Ml4控制擋板1422及光束調節器1424改變激發圖案，移動 平台1420 ’並觸發相機1418以確保緊密同步。PLC 1414經 由Firewire介面1416與資料獲取電腦14〇2連接。其他時間 不太緊要之硬體（諸如自動取樣器1426、泵1428、溫度控 制器1430及焦點控制器1432)係經由諸如rs-232之較慢介 面控制。自動取樣器1426對定序試劑取樣。泵1428將定序 試劑泵入流槽1302以將微粒陣列502曝露於定序試劑。溫 度控制器1430將流槽1302之反應溫度控制在適於與定序試 劑反應之溫度。焦點控制器1432動態地調節光學成像模組 13 之焦點以在平台1420移動時將微粒陣列502保持在焦 點。資料獲取電腦1402運行使用者介面（UI) 1404，控制各 種硬體’並接收來自相機141 8之影像資料。將影像資料經 乙太網路（Ethernet)介面1408傳送至電腦集群1406以用於影 像處理。掃描平台1420及焦點控制器1432使跨越多個視場 之大面積微粒陣列能夠成像。 133810.doc • 28- 200916775

在閱讀本揭示案後，熟習該項技術者將瞭解關於短由微 粒之選擇性激發進行核酸定序之方法及系統的其他替代性 結構及功能設計。例如，亦可使用空間光調節器(諸如液 晶調節器或MEMS-鏡面-陣列調節器）及投影透鏡來產生激 發圖案。因此，雖然已說明且描述本發明之特定實施例及 應用’但應瞭冑’本發明並不限於本文中所揭示之精確構 造及組件，且在不偏離如附加申請專利範圍中所界定之本 發明之精神及範嘴的情況下，可對本文中所揭示之本發明 之方法及設備之配置、操作及細節作出熟習此項技術者將 顯而易見之各種修改、改變及變更。 【圖式簡單說明】 圖1說明使用微粒進行DNA定序之習知方法。 圖2說明微粒陣列之一實例。 圖3A、3B及3C說明可用於DNA定序之個別定序微粒之 不同類型。 圖4A、4B及4C說明用於激發微粒之習知非選擇性激發 圖案。 圖5說明根據本發明之一實施例之藉由使用結構化照明 選擇性激發微粒來定序核酸（例如DNA或RNA)之方法。 圖6A、6B及6C根據本發明之一實施例說明微粒如何經 激發圖案序列選擇性激發。 圖7 A說明根據本發明之一實施例之用於選擇性激發微粒 之結構化照明裝置。 圖7B說明根據本發明之另一實施例之可與圖7A之結構 I33810.doc -29- 200916775 化照明裝置一起使用之不同類型之干擾圖案產生模組。 圖7C、7D及7E根據本發明之實施例說明來自圖7A或圖 7B之、、Ό構化照日月裝置之光束可如何耗合至流體以照明微 粒。 圖8更詳細說明根據本發明之一個實施例用於dna定序 之圖5之影像處理步驟。 圖9根據本發明之一個實施例說明可如何將所偵測之光 子圖案模製為微粒螢光團分布函數與激發圖案之乘積。 圖10根據本發明之一個實施例說明頻率域中之取樣圖案 與產生激發圖案所用之雷射光束之幾何學之間的關係。 圖11概念性地說明根據本發明之一個實施例之識別各微 粒之DNA鹼基對之方法。 圖12說明根據本發明之一個實施例之一種用於校準圖$ 中所示之結構化照明裝置之方法。 圖1 3概念性地說明根據本發明之一個實施例之藉由選擇 性激發微粒用於DNA定序的硬體系統。 圖14說明根據本發明之一個實施例之用於圖13之定序硬 體之控制系統架構。 【主要元件符號說明】

102 微粒陣列 202 基板 204 微粒 302 珠粒 304 DNA 133810.doc 200916775 i 306 流體 402 寬視場激發 404 列掃描激發 406 點掃描激發 602 激發圖案（時間N時） 604 激發圖案（時間N+1時） 606 激發圖案（時間N+2時） 608 微粒陣列之特徵尺寸 700 結構化照明裝置 702 雷射 703 光束 704 光束分光器 705 擋板 707 擋板 708 光纖柄合器 709 光纖辆合器 710 光纖/輸入光纖 711 光纖 712 干擾圖案產生模組 713 干擾圖案產生模組 714 準直儀 714' 準直儀 716 光束分光器 716' 光束分光器 133810.doc -31 - 200916775 718 718' 720 720' 722 724 726 728 730 740 742 744 746 750 754 756 758 760 762 770 772 774 776 780 移位鏡面 移位鏡面 致動器 致動器 干擾圖案 雷射光束 雷射光束 雷射光束 雷射光束 光束 光束 光束 光束 干擾圖案產生模組 準直儀 光束分光器 鏡面 旋轉視窗 鏡面 輸出光束 光束 光束 經調節光束 干.擾圖案 133810.doc -32- 200916775 792 視窗 794 棱鏡 1102 合成影像集1150之第 一影像 1104 合成影像集1150之第 二影像 1106 合成影像集1150之第 三影像 1108 合成影像集1150之第四影像 1110 合成影像集1160之第 一影像 1112 合成影像集1160之第 二影像 Γ Π13 合成影像集1160之第三影像 1114 合成影像集1160之第四影像 1116 合成影像集1170之第 一影像 1118 合成影像集1170之第 二影像 1120 合成影像集1170之第三影像 1122 合成影像集1170之第四影像 1150 合成影像集 1160 合成影像集 1170 合成影像集 1172 微粒 1174 微粒 1402 資料獲取電腦 1404 使用者介面（UI) 1406 影像處理電腦集群 1408 乙太網路（Ethernet) 1410 框接收器 133810.doc -33- 200916775 1412 周邊組件互連（PCI) 1414 平台控制器與可程式化邏輯控制器（PLC) 1416 Firewire 介面 1418 相機 1420 平台 1422 擋板 1424 光束調節器 1426 自動取樣器 1428 泵 1430 溫度控制器 1432 焦點控制器 133810.doc -34-

Claims (1)

1. 200916775 十、申請專利範圍： 1 · 一種用於定序核酸微粒之方法，該方法包含以下步驟： 使用一或多種定序試劑對該等核酸微粒執行至少一種 定序反應； 選擇性激發一個激發圖案中之核酸微粒； 以不足以解析個別微粒之解析度使該等核酸微粒光學 成像；及 使用該激發圖案之資料處理該等核酸微粒之光學影像 以測疋至少一種光學特徵（signature)之存在或不存在， 該至少一種光學特徵之存在或不存在表明該核酸之序列 資料。 2.如凊求項1之方法，其中以足以解析個別微粒之解析度 選擇性激發該等核酸微粒。 月长項1之方法，其中該激發圖案係由多個照明光束 之干擾產生。 4.

   5. 6. 如切求項3之方法，其中該多個照明光束經全内反射離 開置放該等微粒之基板。 如μ求項3之方法’其中由該多個照明光束之干擾所產 2激發圖案產生一個頻率域之取樣，其中頻率樣本之 为布範圍係與該等微粒之特徵尺寸相配。

   生：：項3之方法’其中由該多個照明光束之干擾所產 /發®案產生一個頻率域之直線取樣。 如請求項3 t^4.,, 生 ，，，、中由該多個照明光束之干擾所產 之教發圖案產生-個頻率域之非直線取樣。 133810.doc 200916775 8·如請求項1之方法，其進一步包含： 對該等核酸微粒執行另一定序反應； 選擇性激發該等核酸微粒； 以不足以解析個別微粒之解析度使該等核酸微粒光學 成像；及 使用該激發圖案之資料處理該等核酸微粒之光學影像 以測定另一光學特徵之存在或不存在，該另一光學特徵 之存在或不存在表明該核酸之不同序列資料。 9.如請求項1之方法，其中選擇性激發該等核酸微粒包 含： 選擇性激發該等照明光束之干擾所產生之第一激發圖 案中之該等核酸微粒；及 選擇性激發該等照明光束之不同干擾所產生之不同於 第一圖案的苐二激發圖案中之該等核酸微粒。 10. U 如請求項9之方法，其中調節該等照明光束之至少一者 之相位以產生該等照明光束之不同干擾。 11. 如請求項1之方法，其中測定至少一種光學特徵之存在 或不存在包含測定該等微粒之至少一者展示比其他微粒 亮或不同光譜特徵之光學特徵。 12.如請求項丨之方法，其中處理該等核酸微粒之光學影像 包含： 以比基於至少該激發圖案資料之光學影像高之解析度 產生該等微粒之合成影像； 將微粒特徵識別演算法應用於該合成影像以產生微粒 133810.doc 200916775 光學特徵資料；及 應用驗基響應（base 1Π ν宙笪 m # g)肩异法來測定對應於該核 13 14. 15. 酉夂序列資料之該至少光學特徵之存在或不存在。 .如請求項1之古 擇性激發…/、， 一步包含對於不同視野重複選 、光學成像及影像處理步驟。 如請求項1之方法，其進一步包含·· 猎由多個照明光束之干擾選擇性激發-個校準目標； 使該激發之校準目標光學成像；及 〖處，該：發之校準目標之光學影像以產生該激發之校 準目‘之第-光學影像，使用該激發之校準目標之第一 光學影像與基於產生該等照明光束之干擾之第—校準參 數所預測之該校準目標之第二預測光學影像間之差異產 生用於產生該等照明光束之干擾之第二校準參數。 一種用於定序核酸微粒之系統，該系統包含： 序列反應模組，其經組態以將一或多種定序試劑施用 於該等核酸微粒； 選擇性微粒激發模組，其經組態以選擇性激發一個激 發圖案中之該等核酸微粒； 光學成像模組，其經組態以不足以解析個別微粒之解 析度產生該等核酸微粒之一或多個光學影像；及 影像處理模組，其經組態以使用該激發圖案之資料處 理該等核酸微粒之光學影像並測定至少一種光學特徵之 存在或不存在’該至少光學特徵之存在或不存在表明該 核酸之序列資料。 133810.doc 200916775 其中該選擇性微粒激發模組係經組 別微粒之解析度選擇性激發該等核 16.如請求項15之系統， 態以足以解析該等個 酸微粒。 17.如請求項1 5之系綠 甘 —......’/、中該選擇性微粒激發模組係經組 態以藉由多個昭明本杰> ^ …、月先束之干擾產生該激發圖案。 1 8 ·如請求項} 7之车 '、，、中該多個照明光束經全内反射離 開置放該等微粒之基板。

   19.如凊求項17之系統’其中該選擇性微粒激發模組係經組 、藉由夕個照明光束之干擾產生該激發圖案，該激發 圖案產生一個頻率域之直線取樣。 20. 其中該選擇性微粒激發模組係經組 如請求項17之系統 悲以藉由多個照明弁击夕工_ u女， 乃元采之干擾產生該激發圖案，該激發 圖案產生一個頻率域之非直線取樣。 其令該選擇性微粒激發模組係經組 2 1.如請求項1 5之系統 態以便： 選擇性激發該等照明光束之干擾所產生之第一激發圖 案中之該等核酸微粒；及 選擇性激發該等照明光束之不同干擾所產生之不同於 第一圖案的第二激發圖案中之該等核酸微粒。 22. 如請求項21之系統，其令該選擇性微粒激發模組係經組 態以調節該等照明光束之至少—者之相位以產生該等照 明光束之不同干擾。 23. 如請求項15之系統，其中該影像處理模組係經組態以藉 由測定該等微粒之至少—者展示比其他微粒亮或不同光 1338l0.doc 200916775 譜特徵之光學特徵來測定光學特徵之户+ 仔在或不存在。 24,如請求項15之系統’其中該影像處 界乂理杈組係經組態以 便： 以比基於至少該激發圖案 產生該等微粒之合成影像； 將微粒特徵識別演算法應 光學特徵資料；及 >料之光學影像 用於該合成影像 兩之解析度 以產生微粒 應用鹼基響應演算法來測定對應 該至少光學特徵之存在或不存在。 於該核酸序列資料之 133810.doc