TW200906436A - Novel uses - Google Patents

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200906436 九、發明說明： 此專利申請案係請求2007年3月23曰申請之美國專 利臨時申請案號60/896855和2007年7月25曰提出之案 號60/952002的優先權。 5【發明所屬之技術領域】 本發明一般係關於IL-18 (亦已知為7 -干擾素誘導因 子（IGIF))與表現於癌細胞表面上之單株抗體組合之用途。 【先前技術】 活性人類IL-18含有157個胺基酸殘基。其具有強效 ίο 生物活性，包括藉由T細胞和脾細胞誘發γ _干擾素的產 生、增強ΝΚ細胞的殺滅力和促進初始CD4+T細胞分化成 Thl細胞。此外，人類il-18可增加GM-CSF以及降低iL-l〇 的產量。CD4+T細胞為免疫反應的中樞調節元件。其被分 成Thl和Th2兩種亞群。各亞群具有不同細胞活素的分泌 15能力。有趣的是’細胞活素本身為最強效的分化誘導劑。 IL-4誘導初始前驅物形成Th2細胞。在發現il- 1 8、IL-12 之前其被認為是主要的Th 1誘導細胞活素。

Thl細胞分泌IL-2、r -干擾素和ΤΝρ_0。r _干擾素、 標記Thl細胞活素直接作用於巨噬細胞以增強其殺菌和噬 2〇 ，活性。因此，被活化巨噬細胞可有效地破壞細胞内病原 菌和腫瘤細胞。Th2細胞可產生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 和IL-13，其幫助B細胞形成抗體產生細胞。總之，τΜ 細胞主要負責細胞性免疫反應，同時Th2細胞負責體液性 5 200906436 免疫反應。 根據IL-18的廣效免疫刺激性質，其已在各種臨床前 腫瘤模式中被研究。IL-18已在免疫原性的腫瘤中觀察其用 作為單一療法的抗腫瘤活性。其最強效抗腫瘤效應被i現 5於M〇pC-315漿細胞瘤（高度免疫原性腫瘤）的惡化腫瘤 (>100立方釐米）模式中。在此模式中，鼠每天投予18(5 毫克/公斤）約30天導致可重複性腫瘤消退和痊癒。再以親 代腫瘤細胞刺激可產生腫瘤排斥作用而認為可誘發免疫記 憶反應。此模式中涉及細胞性免疫的其他證據係來自無法 1〇復原之惡化MOPC-3 15腫瘤的重症複合免疫不全鼠（scid) 中利用類似IL-18療程所進行的試驗。il-18介導細胞性免 疫的其他證據亦來自在對照和IL_18治療小白鼠的經確定 MOPC-315腫瘤上所獲得的免疫組織化學結果。已證明經 IL-18治療動物與對照組比較可增加細胞浸潤液内的cd8+ 1 5 T淋巴球、Νκ細胞、活化巨噬細胞和樹突狀細胞。在體外， 經1處理的動物PBMCs或脾臟細胞具有對抗腫瘤，的 NK和CTL細胞毒性。此外’完整的Fas/Fas配體徑路似乎 有利其抗腫瘤反應。 利妥昔單抗（rituximab)係由可辨認融合至人類igGl恒 20定區之人類CD20抗原的鼠抗原結合部位所構成的一種嵌 合單株抗體。作為單藥的利妥昔單抗在溫和型NHL中具有 明顯的活性。在166位復發或頑固型溫和NHL病人的重要 單組臨床試驗中，其整體反應率為48%以及完全（CR)反應 率為 6%。McLaughlin 等人，/· C/z.«. 16 : 2825〜2833 6 200906436 (1998)。在先前未治療的溫和型NHL病人中，利妥昔單抗 具有64至73%的整體反應率以及15至26%的完全反應 率。1^1118评〇111;]1等人，万/〇〇^/ 95:3052〜3056(2000);0〇1〇11^31 等人，5/⑽ί/97 : 101〜106(2001)。此外，多重隨機III期試 5 驗已顯示習知化療法中加入利妥昔單抗可改善NHL病人 的存活率。Marcus 等人，105 : 1417〜1423(2005); Marcus 等人，104 : 3064〜3071(2004) ; Hiddemann 等人，5/⑽d 106 : 3725〜3732(2005) ; Feugier 等人，乂（："《. 0似〇/. 23: 4117〜4126(2005)。然而，由於化療法的高毒性， 10 因此溫和型淋巴瘤病人仍考慮選擇使用利妥昔單抗的單藥 療法。 正進行加強抗腫瘤活性和改善利妥昔單抗效力之機制 的研究。許多機制可歸因於利妥昔單抗在體内的效力。利 妥昔單抗結合至淋巴瘤細胞表面的CD20可觸發細胞内導 1 5 致細胞凋亡或細胞程序性死亡的信號徑路。Shan等人， 5/00i/91:1644〜1652(1998);Pedersen#A，5/ood99:1314〜 1319(2002)。此外，利妥昔單抗可活化補體系而導致補體 依賴性細胞溶解。Cragg等人’ 5/如3 101 : 1045〜1052 (2003) ; Manches 等人，方/⑽ί/ 101 : 949〜954(2003)。然而， 20 累積的證據認為ADCC在投予利妥昔單抗的腫瘤細胞清除 上扮演重要角色。Manches等人’如上述；Golay等人， 88: 1002〜1012(2003); Clynes 等人， 6 : 443〜446(2000)。當抗體恒定區（Fc)結合至例如NK細胞 或單核細胞/巨嗟細胞系列之效應細胞（effector)的表面上 7 200906436

Fc受體時則觸發ADCC。在人類B細胞淋巴瘤的大鼠模式 中，缺乏活化Fc受體的小白鼠無法發揮利妥昔單抗的效 力。具Fc受體的效應細胞為此模式中利妥昔單抗效力的關 鍵。人類的主要活化Fc受體為CD16(Fc r RIIIA)，其被表 5 現於NK細胞及單核細胞。人類Fey RIIIA基因在158位 置（苯丙胺酸對纈胺酸）的多態性已顯示與利妥昔單抗的反 應有關。158VV同質基因型與體外人類NK細胞較強IgG 結合至和觸發ADCC有關（Koene等人，召/⑽d 90 : 1109〜 1114(1997) ; Dall’Ozzo 等人，Cawcer 64 : 4664〜4669 1 0 (2004)) ’以及亦與利妥昔單抗治療後較高反應率有關。

Weng 等人，《/. C7b. 〇«co/. 21 : 3940〜3947(2003) ; Cartron 等人，万/叩6/ 104 : 2635〜2642(2004)。這些資料支持NK細 胞介導性ADCC影響利妥昔單抗療法對淋巴瘤病人之有效 性的假設。 15 一種改善利妥昔單抗效力的方法為投予能擴增及/或 活化具Fc受體效應細胞包括NK細胞和單核細胞/巨噬細 胞系列之細胞的細胞活素。第I期臨床試驗已顯示利妥昔 單抗可結合IL-2、IL-12或GM-CSF安全地被投予至淋巴 瘤病人。Rossi 等人，5/〇〇3 106 : 2760(摘要 2432)(2005); 2 0 McLaughlin 等人，4m 16(補充 5):第 68 卷（摘要 104)(2005); Ansell 等人，5/⑽ί/ 99 : 67〜74(2002); Eisenbeis 等人，C仰 cer 及以.10: 6101 〜6110(2 004); Gluck 等人， C//m. 10 : 2253〜2264(2004) ; Friedberg 等人， 万r. J. eflewah/. 117: 828〜834(2002)。這些試驗的整體客 8 200906436 觀反應率為22至79%以及完全反應率為5〜45%。此外，例 如絕對NK數目和體外ADCC活性的生物指標與反應率有 關。大部分這些試驗主要包括患有復發和頑固型疾病以及 患有惡性淋巴瘤亞型（DLBCL和被套細胞淋巴瘤）的病人。 5這些不良病人族群的極高客觀反應率值得在β細胞淋巴瘤 中對細胞活素和利妥昔單抗的組合物做進一步的研究。 【發明内容】 發明之摘要 在一態樣中，本發明係關於一種有需要病人治療癌症 10之用於預防及/或治療腫瘤性疾病的組合物，其含有：（i)人 類IL-18夕肽（序列辨識編號：16);以及（η)對抗抗 原的抗體（又簡稱為抗_CD20抗體）。 在一態樣中’本發明係關於使用人類IL-18多肽（序列 辨識編號：16)和抗_CD20抗體於預防及/或治療腫瘤性疾 15 病（癌症）。 在一態樣中’本發明係關於同時或依序使用（投予）人 類IL-18多肽（序列辨識編號：16)和抗_CD2〇抗體於預防及 /或治療腫瘤性疾病（癌症）。 在一態樣中，本發明係關於人類IL_18多肽（序列辨識 2〇編號：16)於製造結合抗-CD20抗體之預防及/或治療腫瘤 性疾病（癌症）藥物的用途。 在一態樣中’本發明係關於抗_CD2〇抗體於製造結合 人類IL-18多肽（序列辨識編號：16)之預防及/或治療腫瘤 9 200906436 性疾病（癌症）藥物的用途。 在一態樣中，本發明係關於人類IL-18多肽（序列辨識 編號：16)和抗-CD20抗體於製造用於預防及/或治療腫瘤 性疾病（癌症）藥物的用途。 5 在一具體實施例中，於抗-CD20抗體之前投予人類 IL-18多肽。 在一具體實施例中，於人類IL-18多肽之前投予抗 -CD20抗體。 在本發明的一具體實施例中，該抗_CD20抗體係單株 〇 抗體。 在一具體實施例中，該抗-CD20抗體具有抗體依賴細 胞介導性細胞毒性（ADCC)的效應細胞功能。 在本發明的一具體實施例中，該抗_CD20抗體係嵌 合、人源化或人類單株抗體。 5 在本發明的一具體實施例中，該對抗CD20的單株抗 體（抗-CD2〇抗體）係選自由全長IgG1抗體、全長IgG2抗 體、全長IgG3抗體、全長igG4抗體、全長IgM抗體、全 長IgAl抗體、全長IgA2抗體、全長IgA抗體、全長IgD 抗體和全長IgE抗體構成之群組的全長抗體，其中該抗體 〇 被糖化入真核細胞内。 在本發明的一具體實施例中，該抗-CD20抗體係全長 抗體，例如全長IgGl抗體。 在本發明的一具體實施例中，該抗-CD20抗體係一抗 體片段，例如scFv或UniBody™(如WO 2007/059782中所 200906436 述的單價抗體）。 在本發明的一具體實施例中，該對抗CD20的抗體係 結合域免疫球蛋白融合蛋白，其含有⑴形成序列辨識編 號.1的重鏈可變區或序列辨識編號：2的輕鏈可變區之融 5合至免疫球蛋白絞鏈區多肽的結合域多肽；（ii)融合至該 絞鏈區的免疫球蛋白重鏈CH2恒定區；以及（iii)融合至該 CH2恒定區的免疫球蛋白重鏈CH3恒定區。在本發明的一 具體實施例中，該對抗CD2〇的抗體以至少與人類CD2〇 相同的親和力結合至突變P172S CD2〇(位置172的脯胺酸 10 突變成絲胺酸）。 在本發明的一具體實施例中，該對抗CD20的抗體結 合至CD20上的抗原決定部位。 (1)其在位置172不含有或需要脯胺酸殘基； (ii) 其在位置170不含有或需要丙胺酸殘基或在位置 15 172的脯胺酸； (iii) 其在位置163含有或需要天冬胺酸殘基以及在位 置166的天冬胺酸； (iv) 其在位置172不含有或需要脯胺酸殘基，但其在 位置163含有或需要天冬胺酸殘基以及在位置166的天冬 2 0 胺酸；或 (V)其在位置170不含有或需要丙胺酸殘基或在位置 172的脯胺酸，但其在位置163含有或需要天冬胺酸殘基 以及在位置166的天冬胺酸。 11 200906436 在本發明的一具體實施例中，該對抗CD20的抗體結 合至人類CD20之小胞外第一環肽内的抗原決定部位。 在本發明的一具體實施例中，該對抗CD20的抗體結 合至CD20上不連續抗原決定部位。 5 在本發明的一具體實施例中，該對抗CD20的抗體結 合至CD20上不連續抗原決定部位，其中該抗原決定部位 含有部分的第一小胞外環肽以及部分的胞外第二環肽。 在本發明的一具體實施例中，該對抗CD20的抗體結 合至CD20上不連續抗原決定部位，其中該抗原決定部位 1〇 具有小胞外第一環肽的AGI YAP殘基以及胞外第二環肽的 MESLNFIRAHTPYI 殘基。 在本發明的一具體實施例中，該對抗CD20的抗體具 有一或多個選自下列群組的特徵： ⑴存在補體之下能誘發表現CD20之細胞的補體依 15 賴細胞毒性（CDC); (Π)存在補體之下能誘發表現CD20之細胞的補體依 賴細胞毒性（CDC)以及高濃度的CD55及/或CD59 ; (iii) 能誘發表現CD20之細胞的細胞凋亡； (iv) 存在效應細胞之下能誘發表現CD20之細胞的抗 20 體依賴細胞介導性細胞毒性（ADCC); (v) 能誘發表現CD20之細胞的同質黏附； (vi) 在結合至CD20時能轉位入脂筏（lipid rafts); (vii) 能耗盡表現CD20的細胞； 12 200906436 (viii) 能耗盡表現低濃度CD20的細胞（低CD20細 胞）；以及 (ix) 能有效地耗盡人類組織内原位B細胞。 在本發明的一具體實施例中，該對抗CD20的抗體含 5 有選自序列辨識編號：5、9或11的VH CDR3序列。 在本發明的一具體實施例中，該對抗CD20的抗體含 有序列辨識編號：3的VH CDR1、序列辨識編號：4的VH CDR2、序列辨識編號：5的VH CDR3、序列辨識編號：6 的VL CDR1、序列辨識編號：7的VL CDR2和序列辨識編 ίο 號：8 的 VL CDR3。 在本發明的一具體實施例中，該對抗CD20的抗體含 有序列辨識編號：10的VH CDR1〜VH CDR3跨膜序列。 在本發明的一具體實施例中，該對抗CD20的抗體具 有分別含說明於序列辨識編號：1和序列辨識編號：2的人 15 類重鏈和人類輕鏈可變區；或分別與說明於序列辨識編 號：1和序列辨識編號：2之胺基酸序列具有至少95%同源 的胺基酸序列。 在本發明的一具體實施例中，該CD20結合分子係選 自揭示於WO 2004/03 5607的其一抗-CD20抗體例如歐法 2〇 目單抗（ofatumumab)(2F2)、11B8 或 7D8 ;揭示於 WO 2005/103081 的其一抗體例如 2C6;揭示於 WO 2004/103404 的其一抗體；ΑΜΕ-133(Applied Molecular公司研發的人化 和最佳化抗-CD20單株抗體）；揭示於US 2003/0118592的 13 200906436 其一抗體、TRU-015(CytoxB20G，Trubion製藥公司研發衍 自抗-CD20抗體上關鍵區的一種小模組免疫醫藥融合蛋 白）；揭示於W0 2003/68821的其一抗體；IMMU-106(人化 抗-CD20單株抗體）；揭示於W0 2004/5 6312的其一抗體； 5 ocrelizumab(2H7.vl6、70769、R-1594) ; Bexxar®(托西莫單 抗（tositumomab));以及 Rituxan®/MabThera®(利妥昔單抗）。 此處名詞”CD20”和’’CD20抗原”可互用，以及包括人 類CD20的變異株、同種型和同系物，其自然表現於細胞 或轉染CD20基因的細胞。技術中已知的CD20同義物包 1 〇 括B-淋巴細胞表面抗原Bl、Leu-16和Bp35。人類CD20 被 UniProtKB/Swiss-Prot 登錄為 P1 1836。 此處名詞”免疫球蛋白”指由兩對多肽鏈構成的類似糖 蛋白構造’其為全部以雙硫鍵連接的一對低分子量輕鏈（L) 和一對重鏈（H)。已充分瞭解免疫球蛋白的構造。請看例如 15 基礎免疫學第七章（Paul, W.編輯，第2版，紐約Raven出 版社（1989))。簡言之，各重鏈通常含有一重鏈可變區（簡稱 為VH)及一重鏈恒定區。該重鏈恒定區CH —般含有CH1、 CH2和CH3三個區。各輕鏈一般含有一輕鏈可變區（簡稱 為VL)及一輕鏈恒定區。該輕鏈恒定區一般含有CL區。 2 〇該VH和VL·區可進一步被細分成亦稱為互補決定區（cdrs) 的高變異區（或為序列及/或結構上定義環肽型高變異的超 變區）’其被點綴稱為骨架區（FRs)的更保守區。 各VH和VL —般由三個CDRs和四個FRs所構成， 其從胺基端至羧基端以下列順序配置：FR1、CDR1、FR2、 14 200906436 CDR2、FR3、CDR3、FR4(亦請參考 chothia 和 Lesk，Mo/. 脱/. 196 : 901〜917(1987))。藉由Kabat等人，重要免疫蛋 5 10 20 白的序列第5版，麻州Bethesda市國家衛生研究院衛生福 利部（1991)(如可變區殘基之詞係根據Kabat或此處用於重 鏈可變區或輕鏈可變區的K a b a t編號系統進行編碼）所述方 法進行此區内的胺基酸編號。利用此編號系統，該胜肽的 實際線性胺基酸序列可含有較少或相當於插入可變區 或CDR的附加胺基酸。例如，一重鏈可變區在 的殘基52之後可含有單一胺基酸插入物（如根據Kabat的 殘基52a)以及在重鏈FR殘基82之後含有插入殘基（如根 據Kabat的殘基82a、82b和82c等）。一已知抗體的Kabat 殘基編號可藉由該抗體序列之同源區與一，，標準，，Kabat編 碼序列之間的比對。 此處”抗體”一詞指一免疫球蛋白分子、一免疫球蛋白 分子片段或其衍生物，其在一般生理條件下可於一特定期 間内專一性地結合至一抗原，例如至少約3 〇分鐘、至少約 45分鐘、至少約i小時、至少、約2小時、至少約4小時、 至少約8小時、至少約12小時、約24小時或更長、約48 小時或更長、約3、4、5、6、7天或更長等；或任何其他 相關的功此性疋義期間（例如足夠誘發、促進、加強及/或 調節與抗體結合至該抗原及/或抗體足夠匯聚Fc—介導效應 細胞活性之時間有關的一生理反應）。 〜 免疫球蛋白 互作用的結合區 分子之重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相 。該抗體的恒定區可調節免疫球蛋白至宿 15 200906436 主組織或因子的結合，其包括免疫系統的各種細胞（例如效 應細胞）以及補體系統的成分例如Clq，其為補體活化傳統 途徑中的第一種成分。 該抗-CD20抗體可為單-、雙-或多重專一性。事實上， 5本發明提供的雙專一性抗體、雙鏈抗體等除了 一部分CD20 之外可結合任何適當的標的物。 如上所述’除非另有明述或與本文有明顯的矛盾，此 處”抗體”一詞包括藉由任何已知技術所提供的抗體片段， 例如酵素切斷、胜肽合成和可保留專一性結合至抗原之能 0力的重組技術。已顯示可藉由全長（完整）抗體的片段進行 抗體的抗原結合功能。屬於，，抗體，，定義範圍内之抗原結合 片段的實例包括’但不侷限於：（i) Fab片段，由VL、VH、 CL和CH1功能區構成的單價片段；（⑴F(ab)2和F(ab，)2 片段，含有兩個Fab片段在絞鏈區藉由雙硫鍵連接的雙價 5片段；（出）主要由VH和CH1功能區構成的Fd片段；（iv) 主要由單臂抗體之VL和VH功能區構成的Fv片段；（v) dAb 片段（Ward 等人，341 : 544〜546(1989))，其主 要由亦稱為區域抗體（Holt等人（2003年11月 ⑽/. 21(11) : 484〜90)的VH區所構成；（Vi)駱駝抗 〇 體或奈米抗體（Revets等人（2005年1月）五尤/?6以（9户/^7._5/〇/·

5(1) : 111〜24) ; (vii)分離互補決定區（CDR)例如VH CDR3 ; (viii) UniBodyTM，揭示於 WO 2007/059782 的一種 單價抗體；（ix)單鏈抗體或單鏈Fv(scFv)，請參考例如Bird 等人，242 : 423〜426(1988)和 Huston 等人，PTNMS 200906436 85 : 5879〜5883(1988)) ; (χ)雙鏈抗體（一種 scFv 雙 體）’其可為單專一性或雙專一性（請參考例如 90(14) : 6444〜6448(1993)、EP 404097 或 WO 93/11161 的 雙鏈抗體說明）；三鏈抗體或四鏈抗體。此類片段雖然通常 5包含於抗體的定義範圍内，但是其共同及各別具有本發明 的獨特性質、呈現不同生物學性質及實用性。此處將進一 步討論本發明内文中的諸如此類有用抗體片段。 、應瞭解抗體一詞通常包括單株抗體以及多株抗體。該 抗體可為人類、人源化、嵌合、鼠等。可產生任何同種型 10 的抗體。 此處”人類抗體”一詞意指包括具有衍自人類胚系免疫 ^白序列之可變區和恒定區的抗體。本發明的人類抗體 二Ϊ編碼人類胚系免疫球蛋白序列(例如藉由體外的 :異位點大變或藉由體内的體細胞突變)的胺基酸 歹基。然而，此處’’人_於辨，， ^ ^ 類抗體—詞不包括其CDR序列衍自 =被移植人人類骨架序列㈣另—哺乳 如小白鼠的抗體。 j胜示1夕j 右该抗體係獲得自利用人+ 〇 例如藉由免疫攜帶人類免产球球蛋白序列的系統’ 藉由人類免疫球蛋白基基因的：殖基因小鼠或 為，，衍自，,-特定以；^ 則此處人類抗體被稱 編碼該㈣免疫球蛋白A該選取的人類抗體與 少卯％、至少95%、至；9:胺基酸序列比較具有例如至 21 , y〇/〇、至少 97%、5 少 98%，+、 至夕99%的胺基酸序列同一 或 注。通常’衍自一特定人類胚 200906436 系序列的人類抗體與編碼該胚系免疫球蛋白基因的胺基酸 序列比較將展現不超過1 〇個胺基酸的差異度，例如不超過 5個如不超過4、3、2或1個胺基酸差異度。就VH抗體 序列而言，此類比較不包括VH CDR3功能區。 5 “嵌合抗體”一詞指含有來自一抗體的一或多個區以及 來自一或多各其他抗體的一或多個區之抗體。“般合抗體” 一詞包括單價、雙價或多價抗體。一單價嵌合抗體係藉由 一嵌合Η鏈經由雙硫鍵與一嵌合L鏈結合所形成的雙體 (HL·)。一雙價嵌合抗體係藉由兩個HL·雙體經由至少一個 1〇 雙硫鍵相結合所形成的四聚體（H2L2)。亦可製造多價嵌合 抗體例如藉由利用可組合入具有2 +結合位點之分子（例如 從一 IgM Η鏈或#鏈）的CH區。通常，一嵌合抗體指一抗 體其一部分重鏈及/或輕鏈與衍自一特定品種之抗體内對 應序列一致或同源或屬於一特定抗體的群或亞群，同時其 15 餘的鏈與衍自另一品種之抗體内對應序列一致或同源或屬 於另一抗體的群或亞群，或具有所欲生物活性之此類抗體 的片段（請看例如US 4,816,567和Morrison等人，PAMS 81 : 6851〜6855( 1984))。藉由重組過程的已知技術製造嵌 合抗體（請參考例如〇&1^117等人，尸兄45(^/5^ 81:3273〜3277 20 (1984) ; Morrison 等人，尸81 : 6851 〜6855(1984);

Boulianne 等人，312 : 643〜646(1984) ; EP 125023 ; Neuberger 等人，314 : 268〜270(1985) ; EP 171496 ; EP 173494 ; W0 96/01533 ; EP 184187 ; Sahagan 等人，《/· 137 : 1066〜1074(1986); W0 87/02671 ; Liu 等人， 200906436 尸见4夕 84 : 3439〜3443(1987); Sun 等人，84 : 214〜218(1987); Better 等人，240: 1041 〜1043(1988) 和Harlow等人，戎禮.·#潑室手發，冷泉港實驗室出版， 紐約冷泉港（1988))。 5 “人源化抗體”一詞指含有最少衍自非人類抗體序列的 一種人類抗體。通常，人源化抗體為人類免疫球蛋白（受體 抗體），例如具有所欲專一性、親和力和效力的小白鼠、大 鼠、兔或非人類靈長動物。 此外，人源化抗體可含有未發現於受體抗體或供體抗 10 體内的殘基。這些修飾可進一步增加抗體的性能。一般而 言，一人源化抗體將含有實質上全部或至少一及一般為兩 個可變區，其中全部或實質上全部相當於非人類免疫球蛋 白的超變量環以及全部或實質上全部人類免疫球蛋白序列 的FR區。人源化抗體視需要亦含有至少一部分的人類免 15 疫球蛋白恒定區。進一步詳細資料請參考Jones等人， 321 : 522〜525(1986); Riechmann 等人，332 : 323〜329(1988)和 Presta，Cwrr. Op. «Sirwci. 2 : 593〜596 (1992)。 此處名詞”單株抗體”或”單株抗體組成物”意指單一分 2 〇 子組成物的抗體分子製劑。一單株抗體組成物對特定抗原 決定部位具有單一結合專一性和親和力。因此，，’人類單株 抗體”一詞指具有衍自人類胚系免疫球蛋白序列之可變和 恒定區之展現單一結合專一性的抗體。可藉由雜交瘤產生 該人類單株抗體，其包括獲得自轉殖基因或轉染色體之非 19 200906436 人類動物如轉殖基因小鼠的B細胞，其具有融合至一永生 化細胞之含有人類重鏈轉殖基因和輕鏈轉殖基 組。 此處，，重組人類抗體，，一詞包括藉由重組方法製備、表 5現、產生或分離的全部人類抗體，例如⑷分離自具有轉 殖基因或轉染色體之人類免疫球蛋白基因的動物（例如小 白鼠）或製備自其雜交瘤的抗體（將進一步說明）；⑻分離 自轉〔匕至表現該抗體之宿主細胞的抗體，例如從轉染瘤； ⑷分離自重組、組合人類抗體庫的抗體；以及⑷藉由任 1 0何β及將人類免疫球蛋白基因序列剪切成其他⑽A序列 之其他方法所製備、表現、產生或分離的抗體。此類重組 人類抗體具有衍自人類胚系免疫球蛋白序列的可變和恒定 區…、:而，在某些具體實施例中，此類重組人類抗體可進 订體外的突變（或者當使用人類Ig序列的轉殖基因動物時 15 :在體内進行突變）以及因此該重組抗體之¥11和VL區的 胺基馱序列可被定序，其雖然衍自及與人類胚系和VL 序列有關但非天然存在於體内的人類抗體胚系族群中。 非人類轉殖基因動物” 一詞指具有含一或多個人類重 鏈及/或輕鏈轉殖基因或轉染色體之基因組（整合或未整合 2〇入該動物的天然基因組DNA)及能表現全部人類抗體的非 人類動物。例如，一轉殖基因小白鼠具有一人類輕鏈轉殖 基因及一人類重鏈轉殖基因或人類重鏈轉染色體，因此該 小白鼠當以CD20抗原及/或表現CD20之細胞免疫時可產 生人類抗-CD20抗體。該人類重鏈轉殖基因如同轉殖基因 20 200906436 小白鼠可被整合入該小白鼠的染色體01^八内，例如hc〇7 或HCoU小白鼠之HuMAb-Mouse®，或該人類重鏈轉殖美 因可如同WO 02/43478中所述轉染色體KM_M〇use⑧被維^ 於染色體外。此類轉殖基因和轉染色體小白鼠（此處統稱 5為”轉殖基因小白鼠，’)藉由V-D-J重組及同種型轉換能產生 針對一已知抗原的多重同種型人類單株抗體（例如IgG、

IgA、IgM、IgD及/或IgE)。亦可藉由導入編碼此類專一性 抗體的基因使用轉殖基因、非人類動物於製造對抗特定抗 原的抗體’例如藉由將該基因連接至表現於動物乳汁内的 1〇 基因。 可被預防及/或治療的腫瘤性疾病（癌症）包括B細胞淋 巴瘤如非何杰金氏淋巴瘤（NHL);前驅B細胞淋巴母細胞 白血病/淋巴瘤以及成熟B細胞腫瘤如B細胞慢性淋巴性白 血病（CLL)/小淋巴球淋巴瘤（SLL) ; B細胞前淋巴球性白血 15 病；淋巴漿細胞樣淋巴瘤；被套細胞淋巴瘤（MCL);濾泡 型淋巴瘤（FL)，包括低度、中度和高度FL ;皮膚濾泡中心 細胞淋巴瘤；邊緣區B細胞淋巴瘤（MALT型、結節和脾臟 型）；髮樣細胞白血病；瀰漫性大B細胞淋巴瘤；伯基特淋 巴瘤（Burkitt’s);漿細胞瘤；漿細胞骨髓瘤；移殖後淋巴增 20 生性疾病；瓦氏巨球蛋白血症（Waldenstrom’s);間變性大 細胞淋巴瘤（ALCL) ; T-細胞非何杰金氏淋巴瘤；以及何杰 金氏淋巴瘤。 21 200906436 發明之諜鈿銳.明 由於腫瘤通常為非免疫原性，因此臨床前研究著重於 IL-18與單株抗體的組合療法。結合兩種各具有不同殺腹瘤 機制的不同藥物可產生協同的抗腫瘤活性。下文中將說明 5 IL-18組合療法的實例。 實例1為使用IL-18結合Rituxan®於人類1細胞淋巴 瘤。此試驗的目的為評估IL_18與Rituxan®的組合物在人 類B細胞淋巴瘤模式中是否優於單獨α_18或則比以/的 單一療法。IL-18與單株抗體例如與IL-18和利妥昔單抗 1 〇 (Rituxan®)的組合物在惡化期腫瘤模式（SCID小白鼠異種 移植）中具有協同的抗腫瘤活性。由於利妥昔單抗僅結合至 表現CD20的人類腫瘤細胞，因此在SCID小鼠的人類淋巴 瘤異種移植模式中測定其抗腫瘤活性。 a另一實例係評估1L-18結合其他臨床上有關癌症療法 15是否具有優於單一療法的強化抗腫瘤活性。我們目前已證 實ofatumumab在Ramos人類異種移植模式的組合療法中 與1L_18具有協同效應。因此抗-CD20抗體與il-18的組合 優於單獨以IL-18或抗-CD20抗體的單一療法。 結合單株抗體可強化殺死腫瘤的ADCC機制。對抗 20 CD20的抗體在結合mIL-18(序列辨識編號：17)時可增強抗 腫瘤活性。許多機制例如Rituxan®可增強其效力；然而， 累積的證據認為ADCC在投予Rituxan®之後扮演消滅腫瘤 細胞的關鍵角色。當一抗體的恒定區（Fc)結合至效應細胞 如天然殺手（NK)細胞或單核細胞/巨噬細胞系列的表面上 22 200906436

Fc受體時可觸發ADCC。一項無Fc受體的小白鼠試驗顯 示未產生Rituxan®對人類B細胞淋巴瘤的效應（Uchida等 人，2004 ; 199(12) : 1659)。因此，具有Fc受體的效應細 胞為Rituxan®是否發揮效力的關鍵。CD16(Fcr RIIIA)為人 5 類的重要Fc受體，其被表現於NK細胞和巨噬細胞。實例 1的數據證明NK細胞介導的ADCC對以Rituxan®治療淋 巴瘤病人的效果極為重要。 一項用於改善Rituxan®效力的有效方法為投予如 IL-18的細胞活素，其可導致具有Fc受體之效應細胞包括 ίο NK細胞和單核細胞/巨噬細胞系列的擴增及/或活化。實例 1中以IL-18結合Rituxan®的臨床前小白鼠腫瘤模式試驗顯 示其效果優於單一療法。在此模式中，由於需要僅具有NK 功能細胞之SCID免疫缺陷小白鼠内的人類異種移植，因 此無法測定IL-18的全部效益。實例1的數據證明這些 15 ADCC NK效應細胞的擴增有利於IL-18和Rituxan®的組 合。Rituxan®在單一療法的最高測試劑量時具有活性。然 而’當結合mIL_18(序列辨識編號：17)時以較低的Rituxan® 劑量即可獲得相同程度的活性，此可證明兩種模式均對 Rituxan®機制具有敏感性及藉由IL_18可增強其反應。此 2〇外，此處（第9、10圖）另一種抗_CD2〇 抗體（ofatumumab，

HuMax-CD20)與IL-i8具有類似的協同效應。因此認為結 合IL-18與任何其他抗_CD20抗體將具有相同的協同效應。 實例3為評估IL-18結合利妥昔單抗於具有CD20+ B 細胞非何杰金氏淋巴瘤（NHL)病人體内之安全性和生物活 23 200906436 性的第I期臨床s式驗。此試驗使用利妥昔單抗妹人上 IL-18劑量的標準治療法以在選定生物指標之下二活= NK細胞）鑑定產生最大生物效應的安全和可忍受劑量。若 作為單一療法的IL_18劑量對轉移性黑色素瘤病人具有^ 5全性和忍受性時，則此試驗中的組合物將不會達到其最大 耐受劑量（MTD);然而，此試驗係藉由鑑定非何杰金氏淋 巴瘤病人的劑量限制性毒性而定義其MTD。 實例1的數據顯示結合抗腫瘤劑與IL_〗8具有臨床上 的效益’其原因為該組合物可提供兩種不同的作用機制： 1〇其一為對腫瘤細胞的直接效應，同時il-18可強化病人的 免疫細胞。由於IL-18可產生免疫記憶反應，因此該兩種 機制可互補而產生長效而極佳的抗腫瘤活性。整體而言， 實例1證明IL-18與CD20抗體的組合可產生協同的極佳 活性。 15 人類1多肽揭示於 EP0692536A2、EP0712931A2、 EP 0767178A1 和 WO 97/2441。初始人類 iL-18(hIL-18)的 胺基酸序列說明於序列辨識編號：16。人類il-18多肽係 干擾素-r-誘導多肽。其在細胞性免疫的誘導上扮演重要 角色’包括誘導T細胞和脾臟細胞產生干擾素、加強 20 Νκ細胞的殺滅活性，以及促進初始CD4+ T細胞分化成 Thl細胞。 IL_18多肽 可藉由已知方法從重組細胞培養收獲及純化本發明的 24 200906436 IL-18多肽，包括硫酸氨或乙醇沈澱法、酸萃取法、陰離子 或陽離子交換層析法、磷酸纖維素層析法、疏水性交互層 析法.、親和性層析法、羥基磷灰石層析法、植物血凝素 (lectin)層析法和高效液態層析法。處理細胞内合成、分離 5及/或純化過程中的變性多肽時可利用蛋白復性的已知技 術再形成活性構型。純化和產生人類IL_18的方法說明於 WO 01/098455。 殺ί發明亦提供含有人類IL_18多肽（序列辨識編號：16) 的百藥組成物。此類組成物含有治療有效量的化合物以及 f、步含有醫藥上可接受載劑、稀釋劑或賦形劑。此類醫 藥載劑可為滅菌液體例如含有石油、動物、植物或合成的 水和油如大丑油、礦油、芝麻油等。當靜脈投予該醫藥組 ，物時可利用水作為載劑。食鹽溶液、含水葡萄糖和甘油 溶液亦可被用作為例如注射用的液體載劑。適合的醫藥賦 15形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽糖、米、 ，叙、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、 氯化納、乾脫脂乳、甘油、丙二醇、水、乙醇等。需要時 =組成物亦可含有微量的濕潤劑、乳化劑或pH缓衝劑。 2 1些組成物的型態可為溶液、懸浮液、乳液、錠劑、藥丸、 囊粕末、緩釋配製物等。該組成物可利用習知黏合劑 和载劑如二酸甘油脂被配製成栓劑。口服配製物含有標準 化載劏例如醫藥級的甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、 糖精納、纖維素、碳酸鎮等。適當醫藥載劑的實例已述於 E.W.Martin的蒙矽登I#存#。此類組成物含有通常為純 25 5 10 15 20 200906436 化之治療有效量的化合物以及適量的載劑而可形成適合投 予至病人的劑型。該配製物必需配合其投藥模式。 在本發明的一具體實施例中，根據適合用於靜脈投予 至人類之醫藥組成物的例行途徑配製該組成物。通常，用 於靜脈投藥的組成物為滅菌等張水性緩衝液内的溶液。適 當時該組錢亦可含有助溶劑及例如利都卡因〇ign〇caine) 的局部麻醉劑以減輕注射部位的疼痛。通常，1成分可分 開施予或被混合成單-劑型例如置於註明活性劑含量之密 =容器如安織或藥包㈣冷;東乾燥粉末或無水濃縮物。 虽利用滴注法投予該組成物時，其可被 :級水Γ鹽水的滴注瓶内。當藉由注射投予 :各用於注射的安瓶滅菌水或食鹽水而在投藥前混 因此，該多肽可被用於製造一藥物。本發明的 成用j腸道外投予的溶液或冷康乾燥粉末。 在使用别可加入適當的稀釋劑或其他醫 粉末。液體配製物可為經緩衝等張含水溶i。適Ϊ 溶液内葡等萄水或缓衝醋酸納或； 卜才又柰，但亦可被用於口服或被置旦 ^ 氣的噴霧器内。此類醫藥組成物較佳為！吸=用於灌 甘露糖醇、氯化鈉或檸檬酸鈉。 夕聚乙一醇、 或者’該多肽可被製成用於口服投予的勝囊、健劑或 26 10 15 20 200906436 ^糖聚。可加入醫藥上可接受固體或液體載劑以增強 ^ ^該組成物，或便於製備該組成物。固體載劑包括澱 /八乳糖一水硫酸弼、石膏粉、硬脂酸鎂或硬脂酸、滑 f叙、果膠、阿拉伯膠、瓊脂或明膠。液體载劑包括糖漿、 钯生油撖欖油、食鹽水和水。該載劑亦可含有一遲釋型 材料例如單獨的單硬脂酸甘油醋或雙硬脂酸甘油醋或混合 石蠟。固體載劑有不同的含量，但每劑量單位通常介於約 二，克至約1克之間。根據習知製藥技術配製該醫藥製劑 ”匕括利用研磨、混合、顆粒化和擠壓製成錠劑；或研磨、 填製成凝膠硬膠囊。當使用液體載劑時，其將被 、酏劑：乳液’或含水或不含水懸浮液。此類液 春-己勿可直接經D (口服）被投藥，或被充填人凝膠軟膠 囊内。 人類IL_18多肽可被製成含有效量多肽之醫藥上可接 :載劑内之活性成分的醫藥組成物。在本發明的組成物 :=使用含有該經緩衝成生理pH之注射即用型多狀的 3水4洋液或錢。該用於腸道外投藥的組成物通常含有 本發明多肽的溶液或其溶解於醫藥可接受載劑如含水載劑 的：：物。可使用各種的含水载劑例如〇.4%食鹽水、〇 3% 甘胺酸等。这些溶液通常經過滅菌並且不含有雜質。可藉 由習知的滅菌技術（例如過遽）進行這些溶液的滅菌。^ 成物含有使其接近生理條件所需的辅助物質例如仲調節 劑和緩衝，等。本發明之多肽在此類醫藥配製物内有極寬 廣的範圍濃度，即從低於约〇.5%，通常在或至少約以至 27 200906436 有1 :二之用於肌肉注射的本發明醫藥組成物可含 本發液以及介於約1奈克至約100毫克的 至約25 -古 約5〇奈克至約3〇 *克，或從約5毫克 物可含Am’製備用於靜隸射的本發明醫藥組成 、 宅升的林格氏液以及約1毫克至約30毫克 10 1;且:、1毫f至約25毫克的本發明多肽。已習知腸道外投 更詳"的製備方法或為本領域技術人員所顯而易見以及 司如市⑽_15版出版公 本發明多肽當被製成醫藥製劑時可為單位劑型。本領 f技術人員可輕易地測定其適當的治療有效劑量。醫生可 j反應期的適當間隔時間投與此劑型。此外，可選擇性地 15利用體外檢測法鑑定其最適當的劑量範圍。正確的配製物 使用劑量亦將視投藥途徑及疾病或障礙的嚴重程度而定， 以及取決於醫生的判斷和各別病人的狀況。可從體外劑量 反應曲線或動物模式測定系統推論其有效劑量。

j皮投予至一病人之多肽的劑量一般為〇1毫克/公斤至 20 =0笔克/公斤的病人體重15投予至一病人的劑量可介於0.J 毫克/公斤和20毫克/公斤病人體重之間，或者在〗毫克/ A斤至1〇毫克/公斤病人體重之間。通常，由於對抗外來 ^肽的免疫反應，人類多肽在病人體内比來自其他品種的 多肽有較長的壽命。因此，可投予較低劑量的人類多肽及 28 200906436 較少的投藥頻率。此外，藉由舉例如脂化的改良可提高多 肽的吸收和組織穿透力（例如，進入腦内）而降低本發明多 肽的劑量和投藥頻率。 本發明亦提供含有充填一或多種本發明醫藥組成物之 5 成分的一或多個容器之包裝或套組。此類容器視需要可標 示政府機關管理藥物或生物產品之製造、使用或銷售的有 關許可資料。在本發明的另一具體實施例中，一套組提供 用於治療一特定適應症所需劑量之適當數目的容器。 在另一具體實施例中，該化合物或組成物可在特別指 ίο 脂質體的微泡（vesicle)内被傳遞（請參考Langer，Science 249 : 1527〜1533(1990) ; Treat等人，廯#邀於燁袭炫疾减 命痛症的洛#，Lopez-Berestein和Fidler(編輯）Liss，紐約 第 353〜365 頁（1989) ; Lopez-Berestein，同書，第 317〜327 頁；通常見於同書）。 15 在又另一具體實施例中，該化合物或組成物可在控釋 系統内被傳遞。在一具體實施例中，可利用一泵浦（請參考 Langer » Ji » Sefton > CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14 · 201(1987); Buchwald 等人，Swrger少 88 : 507(1980) ; Saudek 等人，从五叹/· J. MW. 321 : 574(1989))。在另一具體實施 2〇 例中，可利用聚合材料（羥釋彦的夢學肩摩，Langer和 Wise(編輯），CRC 出版社，佛州 B〇ca Raton 市（1974) ; # 釋藥生物可利用率、藥物產品設計和性能，和 Ball(編輯），Wiley 紐約（1984) ; Ranger 等人，J. Macromo/· Sci. Rev. Macromol. Chem. 23 ： 61(1983)；亦請看 Levy 等 29 200906436 人，Scze臟 228 : 190(1985); During 等人，d耻 25 : 351(1989)，Howard 等人，j. _/VgWrc>iyWrg. 71 : 1〇5(1989)) 〇 在又另一具體實施例中，控釋系統可被置於治療標靶即腦 部附近而使其僅需使用部分全身劑量（請參考例如G〇〇ds〇n 5於遂淨痧麥矽夢學應摩’如上，第2卷第ι15〜138頁 (1984))。其他控釋系統被討論於Langer的綜述0以⑼以 249 : 1527〜1533(1990))。 可藉由任何適當内部途徑投予人類IL_18多肽（序列辨 識編號：16) ’以及需要時可被重複投予例如每天一至三次 1〇於一天至約三週至每週一次或每兩週一次。或者，可

該胜肽以降低電荷密度而因此提高口服生物可利用率。产 療的劑量和期間與本發明分子在人類循環内的時間有關了 以及本領域技術人員可視被治療的疾病和該病人的一 體狀況而調整。 X 15 本發明藉由將有效量之含有人類IL.18多肽（序列辨識 編號U6)的本發明化合物或醫藥組成物投予至一人類病^ 而提供治療、抑制和預防的方法。在本發明的—具體=施 例中，該化合物為實質上純化（例如，實質上無限制盆效應 或產生不良副作用的物質）。投予的配製物和方法可利二 20有上述多肽的化合物；其他投予的適當配製物和途柯可： 自下文中所述者。 t J選 已知各種的傳遞系統以及可被用於投予本發明的化人 物，例如被膠囊化入脂質體、微顆粒、微膠囊、沪 I 化合物的重組細胞、受體介導胞吞作用（請參考例二wu ^ 200906436 人，J. 5ζ·ο/. C/^m. 262 : 4429〜4432(1987))、構建核酸成為 逆轉錄病毒或其他載體的一部分等。導入的方法包括，但 不侷限於皮内、肌肉内、腹腔内、靜脈内、皮下、鼻腔内、 硬脊膜外，以及口服途徑。可藉由任何習知的途徑投予該 5化合物或組成物，例如藉由輸注或點滴注射、藉由通過上 皮或黏膜與皮膚内層的吸收（例如，口腔黏膜、直腸和腸黏 膜等）以及可與其他生物活性劑共同被投予。該投藥可為全 身性或局部性。此外，較佳為藉由任何適當途徑將本發明 的醫藥化合物或組成物導入中樞神經系統，包括腦室内和 10鞘内注射；腦室内注射可利用例如連接至一容器的腦室内 導管，例如Ommaya裝置。亦可利用肺内投藥法，例如藉 由吸入器或喷霧器，以及含有霧化劑的配製物。 抗-CD20抗艚 熟習本領域一般技藝的醫生或獸醫可輕易地測定 出含有抗-CD2G抗體之醫藥組成物的有效劑量。例如，醫 生或獸醫可先㈣低於所欲治療效應之本發明醫藥組成物 内化合物的劑量然後逐漸增加劑量直至達到所欲效 止。通常，本發明化合物的適當每日劑量為可產生治療效 2 0 應的最低化合物有效劑量。較佳的給藥方法為經 内、肌肉内、腹腔内，或皮下。雪盱胍 每曰有效劑量可被分成於當曰適;::時: 5;二ffr欠之f位劑型的次劑量。抗-CD2〇抗體雖然可 被早獨投樂’但疋其較佳為以醫藥配製物（組成物）的化合 200906436 物型式被投藥。 通實施例中’藉由10至2_毫克/平方米的每 m予根據本發明的人類單株抗體，通常為1〇 5毫克/平=:,米’例如200至_毫克/平方米如π :克/千”。此類給藥可被重複例如^次，如 久。该給樂可藉由；^ 9 $ οι 2至12小時。 至24小時的連續滴注時間’例如從 在另-具體實施例中’為降 在例如超過24小拄沾4 用这抗體可 10被投藥。 J時的一段較長時間藉由緩慢連續滴注法 至2000毫克的每 例:’該抗體的給藥為使用從25〇 15〇〇 4 2〇〇〇 ^ 300 ' 500 ' 700 ^000 ^ 兮机— 氅見成回至8次例如從4至ό次被於蓮 该技樂可藉由連續滴注從2 技樂。 15 時的-段時間。需要時此類方法可匕複例^ ，〇抗體二特二猎：投予生物樣本内利用靶向該抗 以评估或調整該劑量。 机粒的數里 2 0 :之另一具體實施财，藉由維持 舉例如母週一次達6個月或更長的時間。h亥抗體， :發明亦可為其他具體的特定 基本屬性，以及因此本發㈣_ 精神或 附件而非上述的說明或其實例。心知申清專利範圍 32 5 10 2 0 存在於NK細胞表面的Fc受體被稱為CD16或Fey RIII。 IgG —被結合至Fc受體，該天然細胞可釋出例如εν 200906436 辭彙解釋

I 提供下列的定義以助於瞭解經常用於上文中的某些名 詞。 此處“抗體依賴細胞介導性細胞毒性（ADCC)”和“抗體 依賴細胞介導性細胞毒性（ADCC)效應細胞功能”均指細胞 介導性免疫的機制，因此免疫系統的一效應細胞可溶解已 被專一性抗體結合的一標靶細胞。ADCC為體液免疫反應 的機制之一，經由此抗體可限制和包含感染物。典型ADCC 係被天然殺手細胞（NK)所介導，但一另類ADCC被嗜酸性 白血球用於殺死習稱為螺蟲的某些寄生螺蟲。由於ADCC 依賴先前的抗體反應因此係適應性免疫反應的一部分。 典型ADCC涉及NK細胞的活化以及藉由NK細胞表 面的Fc受體辨識抗體包覆感染細胞。該受體辨識結合 至抗原感染標的細胞表面之抗體如IgG的fc(恒定）部分。 r的細胞活素及例如穿孔素（perforin)和顆粒酶（granzyme) 的細胞毒素而可進人該標乾細胞及藉由觸發細_亡加速 細胞的死亡。此ADCC效應細胞功能類似但 胞毒素T細胞（CTLs)的反應。 、猎由、、.田 此處”载劑”一詞指與治療劑被共同投藥的稀釋 劑、賦形劑或媒劑。 改變或刀取離出’’糟纟人工”從其原始環境的天然狀態中被 ^ 。例如，天然存在於活生物體内的多核苷酸或 33 5 10 1 5 20 200906436 多肽稱為未”分離”，但是分離自天然狀態之至少豆一丑存 細胞材料的相同多核苷酸或多肽則為被，，分離^外藉 由轉殖、基因操作或任何其他重組方法被導入一生物的多 核芽酸或多肽即使其仍存在於該生物中仍被稱為，，分離”， 該生物可為存活或死亡。 此醫藥上”一詞指本發明可應用於包括獸醫的領 此處”治療有效㈣，，指可用於緩解—敎 劑的數量。 ^ 關二匕藥上可接受，，一詞指被聯邦或州政府的管理機 =所核准或被列於適用於特別指人類之動物的美國藥典或 其他一般被認可之藥典内。 〆 夕狀才曰3有—或多個藉由肽鍵或經修飾肽鍵相互連 接之胺基酸，即肽同電異構物的任何多肽。“多肽，，指 肽肽或歸物的短㈣及通常稱為蛋白質的長 狀，有了20個基因編碼胺基酸之外的胺基酸。“多 佟^m然方法例如轉譯後程序或技術中習知化學 的胺基酸序列。此類修飾已被詳述於基礎參 肽内的任何位置，包括壯^獻令。修飾可發生於多 端。㈣㈣Μ, 胺基酸側鍵和胺基或叛基 -已知问或不同程度的相同類型修飾作用於 已矣夕肽的許夕位點。同樣，一已知多肽可且 =:多飾：？肽可為泛蛋白化⑽quitina—造成的分 狀可為有或無分枝的環狀。環狀、分枝和分枝環 夕口導因於轉譯後自然過程或可藉由合成法被製造。 34 200906436 修飾作用包括乙醯化、醯化、ADP-核糖化、醯胺化、生物 素化、核黃素的共價鍵連接、原血紅素基團的共價鍵連接、 核苷酸或核苷酸衍生物的共價鍵連接、脂質或脂質衍生物 的共價鍵連接、磷脂醯肌醇的共價鍵連接、交聯、環化、 5 雙硫鍵形成、去曱基化、形成共價鍵交聯、形成胱胺酸、 形成焦麩胺酸鹽、曱醯化、T -羧基化、糖基化、形成GPI 錯定、經基化、埃化、甲基化、肉苴韹酸化、氧化、蛋白 質融解作用、磷酸化、戊二烯基化、外消旋化、硒基化、 硫化、胺基酸至蛋白質的轉-RNA介導加入如精胺醯基化， ίο 以及泛蛋白化（請參考例如蛋泠#道及分子從#，第二版， T.E. Creighton，W.H. Freeman 公司，紐約，1993 ; Wold, F.， 轉譯後的蛋白質修飾作用：透視和展望，\〜，炝蛋白的 #舉遂為廣參##房，B.C. Johnson編輯，校園出版社， 紐約，1983 ; Seifter 等人，MeM.182 : 626〜646， 1 5 1990;尺汪1^11等人，^4狀.#}^(^汶5^/.663:48〜62(1992))。 【實施方式】 生物學方法/實例 實例1 :鼠人類B-細胞淋巴瘤模式中IL-18與Rituxan®組 合療法的試驗計畫 20 人類IL-18(序列辨識編號：16)係一種表現於大腸桿菌 非病原株的重組成熟型人類白介素-18。IL-18為具有主要 構造極接近IL-1三葉肽子族的一種未糖基化18Kd單聚 體。鼠和人IL-18 cDNA編碼由192和193個胺基酸構成 35 200906436 的前驅蛋白（分別為序列辨識編號：17和16)。Pro-IL-18 為調節其生物活性必需被〉周亡蛋白酵素㈣繼)處理成 生物活性亂蛋白（157個胺基酸）。人和氣IL_18之間的相似 度為65/。。在下述的臨床前試驗中為了提供可分析几_18 5的7G王免疫潛力的體内協同系統而使用鼠il_i8(序列辨識 編號：17)。 在缺乏T和B細胞的遠親雌性同質sCId小白鼠（ICR-Prkdc^d)中進行此試驗。此非近交品系優於近交系的理由 為不產生滲漏（即使於10~12月齡小白鼠）。 1〇 小白鼠被注射取自患有伯基特淋巴瘤的3歲病人之人 類RamosB-細胞淋巴瘤株（ATCC目錄，CRL 1596)。將i : 10腫瘤均質液以每隻0.5毫升的劑量接種入6〜8週齡小白 鼠。每週測量2〜3次的腫瘤體積，以及將小白鼠隨機分配 至各治療組而使各種具有相同的腫瘤體積分佈。當每組的 1 5中數腫瘤體積到達80〜150立方毫米時（在接種腫瘤後第12 天）開始進行治療。此外，試驗排除腫瘤體積超出設定範圍 的小白鼠。 在第一項試驗中’該治療組（數目=6)包括對照組（未治 療）、二種Rituxan®劑量靜脈單一治療組（分別為12.5、25 2〇和50微克每週兩次）、鼠IL-18皮下單一治療組（每天1〇〇 微克/隻），以及各接受每天100微克/隻IL-l8皮下及分別 加上12.5、25或50微克/隻Rituxan®靜脈的三隻組合治療 組0 在第二項試驗中，該投樂係每天一次的1 〇 〇微克/隻 36 200906436 mIL-18(序列辨識編號·· 17)以及每天4/3的25和12.5微克 Rituxan。為提尚統計顯著性意義，動物數目增加至n= 12。 每週利用游標卡尺測量腫瘤體積二至三次。 人類B-細胞淋巴瘤模式中證明IL_18和Rituxan®的組 5合療法較優於單獨IL-18或Rituxan®的單一療法。下述兩 種β式驗的詳細資料顯示組合療法在此模式中具有統計學上 的顯著性差異。 第一項試驗的第3圖中’Rituxan®(l〇〇微克/劑）的高劑 量單藥療法具有強效抗腫瘤活性，而較低劑量Rituxan® ίο (12j微克/劑）則不具活性。鼠IL-18(序列辨識編號：17) 以單藥劑（1 〇〇微克/劑）時不具有活性。然而，較低劑量的 Rituxan®與IL-18(序列辨識編號：17)的組合則具有加成/ 協同活性（12.5微克/劑的Rituxan®結合1〇〇微克的mIL_i8 (序列辨識編號：17)。第4和5圖為利用GraphPad Prism® 15軟體繪圖和分析資料的統計學顯著性。在第4圖的圖1中， 在植入後第19天比較其腫瘤體積。統計分析顯示與未治療 對照組比較全部治療組均明顯縮小腫瘤的生長體積 0.05 ’ **p<〇.(H，_P<0.001)。第 5 圖的圖 2 中，顯示組 合治療較單一療法更為有效（統計顯著性，*p<〇 〇5， 20 **ρ<〇.〇1) 〇 在第二項試驗中，動物數目從增加至n=12以測 定對組合療法之加成/協同抗腫瘤活性反應的統計顯著 性。第6A和6B圖為中數和平均腫瘤生長體積。第7和8 圖為植入後第2 7天之腫瘤體積的統計分析。該資料可證明 37 200906436 與單獨Rituxan®(25微克/隻）或單獨mIL_18(序列辨識編 號：17)的單一療法（1〇〇微克/隻）比較以組合療法（25/_ 微克/隻）治療之小白鼠可明顯減少其在統計學上的腫瘤體 積。 5 此前臨床資料證明1L-18與利妥昔單抗的組合具有協 同抗腫瘤活性。作為單一療法的利妥昔單抗在高測試劑量 時具有活性。然而，當利妥昔單抗結合鼠IL_18時可使用 較低的劑量獲得相同程度的活性而顯示此模式對利妥昔單 抗具有敏感性並且可利用IL-18增強其活性。推測鼠il_18 1〇增強利妥昔單抗活性的原因為NK細胞的ADCC活性被增 強。由於SCID小白鼠缺乏B和丁_細胞反應，因此可經由 NK-細胞的活化而增強IL_18的抗腫瘤反應。 實例2·人類淋巴瘤異種移植模式中iL_18與〇fatumuinab 的組合療法 15 我們的目知^為測定以IL-18(鼠）與ofatumumab的組合 療法在治療皮下人類Ramos淋巴瘤（異種移植於SCID小白 鼠）時是否具有協同抗腫瘤活性。 背景和方法 ♦在常用的Ram〇s人類淋巴瘤異種移植模式（亦稱為，，實 -0 質瘤模式’或”皮下腫瘤”模式）中測定ofatumumab單 株抗體的劑量-反應關係。 •將Ramos淋巴瘤均質液（〇·5毫升來自sciD雌小鼠供體 的1 : 8均質液）在第〇天皮下注射至sciD(ICR背景， 38 200906436

Taconic公司）。觀察小白鼠以及利用測徑器每週測定兩 次腫瘤體積。利用下列公式計算腫瘤體積： (0.5xL)xW2(L=腫瘤長度，W=腫瘤寬度）。 ♦在植入後第17天當大部分腫瘤體積到達約ι〇〇〜15〇立 5 方耄米時將小白鼠隨機分配至治療組（試驗中排除較大 /較小體積的小鼠）。每週靜脈投予兩次ofatumumab，以 及每天靜脈投予一次IL-18細胞活素。治療組列於表 1 (如下）。此試驗中每組使用6隻小鼠。 #從該模式中讀取測量腫瘤體積以及治癒/消退/未治癒 10 腫瘤的％。 •連續三次測量腫瘤體積<10立方毫米定義為被治癒小 鼠。連續三次測量時其腫瘤體積 <初始體積的50%定義 為部分消退小鼠。腫瘤體積未改善（如上所述）的小鼠定 義為未治癒小鼠。 15 表1 每天IL-18皮下(微克） 每週兩次ofatumimiab蛰旅(御免） 1 6 0 5 ' 2 6 0 25 3 ----— 6 0 50 4 —---- 6 100 5 5 6 100 25 6 6 100 50 ~~ 7 ------ 6 100 5 8(載劑） 6 0 0 ~~- 第9圖顯示〇fatumumab(Humax-CD20®)單一療法或結 合IL-18對SCID小白鼠皮下Ramos人類淋巴瘤生長的效 39 200906436 @ (二:’平均和偏準偏差）。此外，亦顯示％治癒、％ 、 /σ ;心小白鼠的資料。其定義已說明於（上述）方法 中〇 第9圖由於無法收集雙因子變異數分析（ANOVA)所需 5 f的：部組在全部時間點的全部數據’因此無法被統計分 斤八原因為由於安樂死（腫瘤體積達到預定基準）或自然 死亡所造成小白鼠耗損（而因此喪失資料點）的腫瘤試驗性 質口此在選疋時間點統計分析腫瘤體積資料；在試驗 的第：8天。選擇此時間點的原因為來自全部治療組的腫瘤 10體積資料為該試驗的最後時間點（此時由於人道的理由（腫 瘤過大）將载劑組安樂死）。 第10圖顯示Ramos人類淋巴瘤模式中利用皮下注射 ofatumumab的單一療法或結合IL_18在接種後第28天對 S~CID小鼠的效應（n=6隻/組；平均±標準偏差p對數轉換 1 5資料通過參數檢驗程序的全部標準。 結論（對數轉換資料的參數分析） 獲得的資料證明以0fatumumab單株抗體（mAb)的單一 療法對Ramos淋巴瘤的生長產生可察覺的抑制效應，但是 此生物效應不具統計學上顯著性。然而，當結合細胞活素 20 IL 18進行治療時可被明顯強化。〇fatumumab單株抗體與 IL-18的組合治療在全部投藥組中的腫瘤生長明顯被延 遲’其十以最高劑量（50微克/隻ofatuniUniab+100微克/隻 IL-18)的治療組最為明顯（p<〇 〇〇1)。最高劑量混合組（5〇/ 200906436 1 〇:):明顯比全部ofatumumab單一治療組和IL_ i 8單一治 療組有較佳的結果。 人链=之，QfatUmUmab與1L·18的組合療法在 植模式中具有協同作用。資料顯示劑量依賴的 活性’…8與利妥昔單抗的組合療法對異種移 植腫瘤具有類似的治療效應。 實例f . IL-18結合利妥昔單抗的第J期臨床試驗計畫 第I期為IL-18結合標準利妥昔單抗療法之12週上升 Μ里人類IL-18(1至1〇〇微克/公斤）對CD2〇+ B細胞νη[ j人之安全性和忍、受性調查的開放標4、劑量遞增試驗。 父錯式投予利妥昔單抗和人類IL_18。因此，患者在i至4 週的第1天每週靜脈滴注利妥昔單抗（375毫克/平方米）。 在1至4週的第2天及在5至12週的第2天（±1天）每週靜 脈滴注人類IL-18。人類IL-18的初始劑量為i微克/公斤， 15以及將劑量逐漸增加至1〇〇微克/公斤的額定最高劑量。 各組群中一病人的第一劑量以第1天投予利妥昔單抗 和第2天投予人類iL_18的方法被交錯投藥然後在院内至 少觀察24小時。若未發生安全或容忍性問題時，該組内下 一位病人在至少24小時後被投藥以及在其人類IL_18第一 2〇劑量之後亦在院内觀察24小時。在其後數週（第2至12 週）病人在投予人類IL-18後被觀察6小時然後離開診 所。全部病人的投藥至少相隔2小時。任何組群中病人的 技樂母天不超過兩位。 200906436 以第一劑量濃度（1微克/公斤/週）治療三位病人。若完 成該組群投藥之後（即，全部三位病人已完成第1至6週$ 式驗）未產生大於”疑似或可能”與試驗藥物有關的第^級 毒性’則以下列劑量濃度治療各其後組群中的三位病人，3 5微克/公斤/週、10微克/公斤/週、20微克/公斤/週、3〇微 克/公斤/週，和100微克/公斤/週。 就利妥昔單抗的滴注而言，從開始至結束滴注的完成 劑量傳遞時間必需不超過4小時。在2小時的過程中完成 人類IL-18的滴注。 此试驗的目標為測疋人類IL -18結合標準利妥昔單广 用於治療CD20+ B細胞淋巴瘤病人時該人類化_18在安全 上的最高生物有效劑量。為評估在先前第丨期試驗中為鐘 形的人類IL-18劑量-反應關係’將使用1至ι〇〇微克/公斤 的劑量範圍以測定對CD20+ B細胞淋巴瘤病人之生物活性 1 5範圍的較低（低限）和較高（中或高限）劑量。 該利妥昔單抗劑量為核准用於CD20+ B細胞NHL病 人的標準推薦劑量。根據先前第I期的安全性、藥物動力 學、藥效學資料從腎細胞癌和轉移性黑色素瘤病人的試驗 選擇人類 IL-18 的劑量。Robertson 等人，j. C7z>2. 2〇 22: 176s(摘要 2553)(2004): R0bertS0n 等人，j 〇_厂 23 : 169s(摘要 2513)(2005); Koch 等人，乂 C//„. 〇卿/. 23 : 174s(摘要 2535)(2005) ’ Koch 等人，j Cawcrer 4(12): 86(270)(2006)。在最高劑量試驗中，每週投予2〇〇〇微克/ 公斤咼達24週時不造成明顯的毒性而無法確認其最大容 42 200906436 忍劑量；因此，此試驗利用其藥效學資料選擇其劑量範圍 的上限。

SEQ ID ： 1 2F2Vh EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCA ASGFTFNDYAMHWVRQAPGKGL EWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFT ISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTA LYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQ GTTVTVSS SEQ ED ： 2 2F2Vl EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRA SQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLI YDASNRATGIPARFSGSGSGTDFT LTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPI TFGQGTRLEIK SEQ ID ： 3 2F2VhCDR1 DYAMH SEQ ID ： 4 2F2VhCDR2 TISWNSGSIGYADSVKG SEQ ID ： 5 2F2VhCDR3 DIQYGNYYYGMDV SEQ ID ： 6 2F2VlCDR1 RASQSVSSYLA SEQ ID ： 7 2F2 VlCDR2 DASNRAT SEQ ID ： 8 2F2VlCDR3 QQRSNWPIT SEQ ID ： 9 11B8 VhCDR3 DYYGAGSFYDGLYGMDV SEQ ID ： 10 2F2Vh CDR1-CDR3 DYAMHWVRQAPGKGLEWVSTIS WNSGSIGYADSVKGRFTISRDNA KKSLYLQMNSLRAEDTALYYCAK DIQYGNYYYGMDV SEQ ID ： 11 2C6VhCDR3 DNQYGSGSTYGLGV SEQ ID ： 12 人類 VH DP-44 /D3-10/JH6b 胚系 序列 EVQLVQSGGGLVHPGGSLRLSCA GSGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLE WVSAIGTGGGTYYADSVKGRFTIS RDNAKNSLYLQMNSLRAEDMAV YYCARDYYGSGSYYYYYYGMDV WGQGTTVTVSS SEQ ID ： 13 人類VlL6/JK4胚 系序列 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRA SQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLI YDASNRATGIPARFSGSGSGTDFT LTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPL TFGGGTKVEIK SEQ ID ： 14 人類 Vh3-09/D4- EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCA 43 200906436 ll/JIKb胜系岸列 SEQ ID ： 15 人類VlL6/JK5胚 系序列

ASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGL

EWVSGISWNSGSIGYADSVKGRF

TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDT

ALYYCAKDIDYYYYYYGMDVWG QGTTVTVSS_ EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRA SQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLI YDASNRATGIPARFSGSGSGTDFT LTISSLEPEDFAYYYCQQRSNWPI TFGQGTRLEIK_ 【圖式簡單說明】 第1圖為初始人類UM8(序列辨識編號：16)的胺基酸 5 序列； 第2圖為鼠IL-18(序列辨識編號·· ι7)的胺基酸序列； 第圖為序列辨識編號：2)結合Rjtuxan®於人 類B-細胞淋巴瘤大鼠模式内的抗遁瘤活性。cr代表完全 恢復； 0 第4圖為第3圖之GraphPad Prism®繪圖和分析資料的 統計顯著性。明確而言，此圖為在移植後第19天比較腫瘤 體積。 第5圖為鼠IL-18(序列辨識編號：i7)/Rituxan®組合物 於人，B-細胞淋巴瘤模式内在移植後第25天的腫瘤體積。 5 第6A和6B圖為鼠IL-18(序列辨識編號：17)/Rituxan® 、组合物於人類B_細胞淋巴瘤模式内的中數和平均腫瘤生 長體積。 第7和8圖為鼠IL_18(序列辨識編號：17)/Rituxan® 組合物比車父各別單獨藥物於人類B-細胞淋巴瘤模式内在 200906436 移植後第27天的腫瘤體積。 第9圖為ofatumumab(Humax-CD20®)單一療法或結合 鼠IL-18(序列辨識編號·· 17)對SCID小白鼠（數目=6隻/每 組；平均土標準偏差）體内皮下Ramos人類淋巴瘤生長的效 5 應 ° (Humax 指 ofatumumab) ° 第 10 圖為 ofatumumab(Humax-CD20®)單一療法或結 合鼠IL-18(序列辨識編號：17)對SCID小白鼠（數目=6隻/ 每組；平均士標準偏差）體内皮下Ramos人類淋巴瘤模式中 在接種後第28天的效應。（Humax指ofatumumab)。 10【主要元件符號說明】 無 45

Claims (1)

1. 200906436 、申請專利範圍： ,1. 一種治療或預防癌症病人的組合物，其含有：（i)人 犬、_18多肽（序列辨識編號：16);以及（ii)抗cD抗體。 夕.如申明專利範圍第1項之組合物，其中該人類IL-1 8 夕狀（序列辨識編號：16)和該抗體係被同時投藥。 夕 如申明專利範圍第1項之組合物，其中該人類IL-18 =肽（序列辨識編號：16)和該抗體係依序被投藥，其中先 技予遠人類IL-18多肽（序列辨識編號：！ 6)。 1夕4.如申請專利範圍第1項之組合物，其中該人類IL_18 1〇夕肽（序列辨識編號：16)和該抗體係依序被投藥，其中先 投予該抗體。 5. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該抗體係選 自矛】妥曰单抗（rituximab)或歐法目單抗（ofatumumab)。 6. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該癌症係選 15自由非何杰金氏淋巴瘤（NHL) ; B細胞淋巴母細胞白血病/ 淋巴瘤；成熟B細胞腫瘤、B細胞慢性淋巴性白血病（CLL)/ 小淋巴球淋巴瘤（SLL) ; B細胞前淋巴球性白血病；淋巴漿 細胞樣淋巴瘤；被套細胞淋巴瘤（MCL);濾泡型淋巴瘤（FL) 包括低度、中度和高度FL ;皮膚濾泡中心細胞淋巴瘤；邊 20 緣區B細胞淋巴瘤（MALT型、結節和脾臟型）；髮樣細胞 白血病；瀰漫性大B細胞淋巴瘤；伯基特淋巴瘤；漿細胞 瘤；漿細胞骨髓瘤；移殖後淋巴增生性疾病；瓦氏巨球蛋 白血症；間變性大細胞淋巴瘤（ALCL);以及T-細胞非何杰 46 200906436 金氏淋巴瘤構成的群組。 抗^^種⑴广類1L_18多狀（序列辨識編號· 16)結合⑼ 體於衣邊治療或預防癌症病人的藥物之用途。 多肽(It,申請專利軸1項之用途，其中該人類㈣ 夕肽（序列辨識編號：16)和該抗體係被同時投藥。 多丄如申請專利範㈣1項之用途，其中該人類IL·18 列辨識編號：16)和該抗體係依序被投藥，其中 又予该人類IL-18多肽（序列辨識編號：16)。'、、 10 夕1〇·如申請專利範圍帛1項之用途，其中該人類IL_18 夕肽（序列辨識編號：16)和該抗體係依序被投藥，其中先 投予該抗體。 ’、〃 11. 如申睛專利範圍第丨項之用途，其中該抗體係選 自利妥昔單抗或歐法目單抗。 12. 如申請專利範圍第丨項之用途，其中該癌症係選 15自由非何杰金氏淋巴瘤（NHL) ·，B細胞淋巴母細胞白血病 /淋巴瘤，成熟B細胞腫瘤、B細胞慢性淋巴性白企病（cll)/ 小淋巴球淋巴瘤（SLL) ; B細胞前淋巴球性白血病；淋巴 漿細胞樣淋巴瘤；被套細胞淋巴瘤（MCL);濾泡型淋巴瘤 (FL)包括低度、中度和高度FL ;皮膚濾泡中心細胞淋巴 2 0 瘤，邊緣區B細胞淋巴瘤（MALT型、結節和脾臟型）；髮 樣細胞白血病；瀰漫性大B細胞淋巴瘤；伯基特淋巴瘤； 漿細胞瘤；漿細胞骨髓瘤；移殖後淋巴增生性疾病；瓦氏 巨球蛋白血症，間變性大細胞淋巴瘤（ALCL);以及T-細胞 47 200906436 非何杰金氏淋巴瘤構成的群組。 48