TW200848508A - Vaccine for periodontal disease - Google Patents

Description

200848508 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於引起寵物牙周病的新菌種、聚核苷酸序 列、此序列所編碼的多胜肽以及疫苗；此菌株的鑑定根據 1 6 S rRN A DN A而得，疫苗則包含去活性或減毒的細菌菌 株或聚核苷酸或多胜肽。同時本發明也提供治療及預防牙 周病的方法以及檢測、治療與預防牙周病的套組。 【先前技術】 牙周病包含一群有關牙齒支撐組織的感染。嚴重程度 可以自輕微且可逆性的牙齦發炎，到急性牙周組織（牙 齦、牙周初帶、齒槽骨）的破壞，最後導致牙齒脫落。大 多數有關牙周病的實驗數據多半建立於人類及分離自人類 細菌的硏究，對於非人類動物，例如寵物（特別是貓、 狗）的牙周病硏究相對較少。 以微生物的觀點來看，此病有幾個特色相當有趣。有 關細菌的病因學相當複雜，人類自發病到病情的發展過程 中有多種微生物參與，即使不是全部也是多數的微生物， 是存在於牙周健康的個體中，而且可以與宿主和平共處。 已知在人類牙齒及牙齦下能形成菌落者，必須要能與棲息 在此區域的許多其他（超過600種）微生物共存。 牙齒鈣化的硬組織及牙齦的上皮細胞都是可以形成菌 落的地方，這些組織暴露於宿主的唾液及牙齦溝內液體 (一種血清滲出物），其中所含的某些分子便與細菌直接 -5- 200848508 作用，轉變爲有利微生物生長的環境。此局部環境會對牙 齦上牙齒表面及牙齦溝（位於牙根及牙齦間的管道，在牙 周病發展過程中會加深而形成牙周囊袋）內組成微生物造 成多種獨特的壓力。人類牙周病的發病學硏究便因爲微環 境的複雜性而變得更錯綜複雜，而病症便在細菌與宿主間 之生態平衡中轉變，例如：某些微生物的絕對或相對數 量、潛在病原的變化、或是宿主特定因子的調節。 有關人類牙周病表癥的分類一直不斷在改變，但仍不 脫離疾病嚴重程度、發展速度、受影響的牙齒數目、以及 在第一顆牙發病後易感年齡群的變化。而致病物的本質可 能因不同人而產生個體差異，也可能在同一人的不同患部 產生差異。一般而言，疾病的嚴重程度與革蘭氏陰性厭氧 細菌的數量有關。以人類來說，許多證據都將此類細菌指 向牙齦卟啉菌（Porphyromonas gingivalis，之前爲擬桿菌 屬B a c t e r 〇 i d e s )，這類微生物的存在是影響致病活性的 基本條件，但可能單獨存在或與其他細菌混合感染，也可 能與有益細菌的缺席或宿主免疫反應有關。 牙齦卟啉菌之所以進入人口中的蛀牙洞，最早應該是 由已經感染的個體所傳染，也可能是經由其他媒介來傳 播。硏究顯示，這些個體通常被單一基因型（或至少是一 種主要基因型）入侵而形成菌落，而與菌落形成位置或臨 床狀態無關。相反地，不同個體也存在不同品系來源的菌 株。此結果足以支持先前的理論，牙齦卟啉菌基本上是一 種伺機入侵的病原菌’帶有毒性且不受限於特定品系。 -6 - 200848508 除牙齦卟啉菌以外，擬桿菌（Bacteroides)也與人的 牙周病有關，一株新的福氏擬桿菌（Bacteroides forsythus)，最早由厭氧的牙周囊袋中分離出來（Tanner et al.，’’A study of the bacteria associated with advancing periodontitis in man’’， Journal of Clinical

Periodontology( 1 979)，6,278-3 07 )。此菌因許多生化特性 被重新分類爲福氏田納菌Tannerella forsythus ( Sakamoto et al·，M Reclassification of Bacteroides forsythus(Tanner et al., 1 9 8 6 ) as Tannerella forsythus corrig., gen. no v., comb. Nov·’，， International Journal of Systematic and Evolutionary M i c r e b i o 1 o g y (2 0 0 2 )，52，8 4 1 -849 ) 〇 雖然對人類牙周病的了解很多，但對於寵物的此類疾 病了解甚少。雖然卩卜啉單胞菌（Porphyromonas)也與動 物的牙周病有關，但這些分離株的特性仍與人體所分離出 的菌株特性有所區隔（根據 Harvey 的文獻回顧 ” Periodontal disease in dogs. Etiopathgenesis，prevalence, and significance”，Veterinary Clinics of North America -Small Animal Practice ( 1 99 8), 2 8,1 1 1 1 - 1 1 2 8 ) 。

Forrnier，D.等人對於來自不同動物宿主所分離出的不同 生物型牙齦卩卜琳菌也做過特性描述（’’Porphyromonas gulae sp. no v., an Anaerobic, Gram-negative

Coccobacillus from the Gingival Sulcus of Various Animal Hosts”， International Journal of Systematic and

Evolutionary Microbiology(2001)，51，1179-1189) 〇 作者 200848508 假設咽喉卩卜啉菌（Porphyromonas gulae)代表P卜啉單胞菌的 一個種，而與牙齦卟啉菌有所不同。在WO 031054755中 描述分離自猫狗的新種卟啉單胞菌，以及治療與預防牙周 病的方法與套組。 從診斷患有牙周病貓狗的下牙齦處也可以分離到擬桿 菌。 ( Forsblom et al., M Characterization of Anaerobic,

Gram-Negative, N o np i g m e nt e d， S a c c h ar ο 1 y t i c Rods from Subgingival Sites in Dogs”， Clinical Infectious D i seases( 1 979)，25，S 1 00- 1 06 ) 對於寵物牙周病仍須要一種安全且效的疫苗來治療與 預防。 【發明內容】 本發明提供一種有色、厭氧性細菌，因該菌單獨感染 或與其他病原性物質混合感染以致引起寵物牙周病。 在另一實施例中，本發明所提供的一種有色、厭氧性 細菌，因該菌單獨感染或與其他病原性物質混合感染以致 引起寵物牙周病，而其中的細菌可以用來製備疫苗，用來 預防或治療哺乳類（包括寵物）的牙周病，而此疫苗包含一 種免疫學上有效的細菌劑量，其中包括至少一或多種已經 去活性或經減毒處理的細菌。 在某一實施例中，此類細菌是由口牙擬桿菌 (Bacteroides denticanoris)、 利氏 卩卜啉單胞菌 (Porphyromonas 1 e vi i)及福氏田納菌（Tannere 11 a 200848508 forsythensis)當中所選出的菌。 理想狀態下，此類菌所含1 6 S r RN A DN A序 SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、10、11、" 及 1 5 有著 9 5 °/〇、9 5.5 %、9 6 %、9 6 · 5 %、9 7 % 9 8 %、9 8 · 5 %、9 9 %、9 9 · 5 % 的相似度。 在更進一步實施例中，本發明提供一分離的 子，包含與 SEQ ID N0:3、4、5、6、7、8、9、 1 2、1 3、1 4及1 5與類似物中任一核苷酸，至少 95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、9 8%、 99%、99.5%的相似度。本發明所述的分離多胜 義如下的片段與變種。 就另一方面來說，本發明提供一產生免疫的 包含至少一種本發明所指的有色、厭氧性細菌以 學上可接受的載體。此組成份的細菌可以是活菌 細菌，也可選擇性含有一種藥物佐劑。 更進一步來看，本發明提供一種預防及治療 (包含寵物）牙周病的疫苗，此疫苗包含至少一種 劑量的有色、厭氧性細菌，以及製藥學上可接受 此疫苗的細菌可以是活菌或失活性細菌，也可選 一種藥物佐劑。 以另一方面來看，本發明提供一種預防及治 物（包含寵物）牙周病的方法，此方法包含本發明 疫苗組成份，以及給予需要治療哺乳動物之給藥 再另方面來看，藉由本發明的樣本細菌或多 列至少與 、13 、 14 9 7.5%、 多胜肽分 10、 11、 有 95%、 9 8.5% ^ 肽包括定 組成份， 及一製藥 或失活性 哺乳動物 免疫有效 的載體。 擇性含有 療哺乳動 所提供的 方式。 胜肽或聚 -9- 200848508 核苷酸的分析，提供一種可以診斷哺乳動物（包含寵物）牙 周病的方法，而細菌或多胜肽或聚核苷酸的存在與否乃作 爲疾病判斷的指標。理想的分析步驟包括利用聚合酶連鎖 反應、雜交與抗體偵測等方法來分析樣本。 以另一觀點來看，本發明提供一套組，包含裝在一容 器中的成份，此成份可以治療及預防哺乳動物（包含寵物） 的牙周病，其中包含至少一種失活或減毒的單離有色厭氧 細菌，或是此菌的多胜肽或聚核苷酸，以及製藥學上可接 受的載體。 就另方面來看，本發明提供一套組，此套組包含至少 一裝在容器中的單離DNA分子，此分子包含的核苷酸序 列至少有15個連續核苷酸，此核苷酸爲選自SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 及 15 中，可以在高嚴格條件下與SEQ ID NO:3、4、5、6、7、 8、9、1 0、1 1、1 2、1 3、1 4及1 5的互補序列雜交；另外 包含第二個單離DNA分子於第二個容器中，此分子包含 的核苷酸序列至少有1 5個連續核苷酸，此核苷酸爲選自 SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 及1 5中任一序列的互補序列，可以在高嚴格條件下與 SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 及1 5的序列雜交；此套組還包含一組指示單，說明此套 組可以有效偵測擬桿菌（Bacteroides )、卟啉單胞菌 (Porphyromonas )及田納菌（Tannerella)，而此方法可以 用在所有哺乳動物（包含寵物）。 -10- 200848508 在一進一步觀點，本發明提供一雜交套組，此套組包 含至少一裝在容器中的單離DNA分子，此分子包含的核 苷酸序列至少有15個連續核苷酸，此核苷酸選自SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 及 15 或 其互補者中任一，而此雜交特定指擬桿菌 (Bacteroides)、卩卜啉單胞菌（Porphyromonas)及田納 菌（Tannerella )。同時此套組更進一步包含一組指示 單，說明此套組對擬桿菌、卟啉單胞菌及田納菌的偵測有 效。較理想狀態是在高嚴格度的條件下進行雜交。 此發明更進一步提供一生物學上純種細菌，此菌包含 之 16S rRNA DNA 序列至少與 SEQ ID N0:3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14 及 15 有著 95%、9 5.5% > 9 6%、9 6.5% > 97%、97.5%、98%、98.5% ' 99%、99.5% 的相似度。 本發明所提供生物學上純種的細菌是 ATCC PTA-5 8 8 1，或所有特性與ATCC PTA-5 8 8 1相同之菌種，本發 明也提供另一生物學上純種的細菌是 ATCC PTA-5 8 82， 或所有特徵與ATCC PTA-5 8 82相同之菌種，本發明所提 供另一生物學上純種的細菌是 ATCC PTA-6063，或所有 特徵與ATCC PTA-6063相同之菌種。 本發明亦包含分離自本發明細菌的多胜肽或聚核苷 酸，可以有效作爲治療及預防哺乳動物（包括寵物）牙周病 的疫苗。 -11 - 200848508 序列表簡單說明 Seq ID No.l---序列引子 Seq ID No.2 -…序列引子 Seq ID N0.3---DNA 編碼 Bacteroides (B78)的部份 1 6S rRNA Seq ID No.4 DNA 編碼 p〇rphyr〇monas 的部份16S rRNA Seq ID No.5 DNA 編碼 Tannereiia (B343 -24)的部份 16S rRNA Seq ID No.6--- DNA 編碼 Bacteroides (B78)(全長）的部份16S rRNA Seq ID No.7 DNA 編碼 Bacteroides (B80)的部份 1 6S rRNA Seq ID Νο·8-_- DNA 編碼 Bacteroides (B83)的部份 1 6S rRNA Seq ID No.9--- DNA 編碼 Bacteroides (B241)的部份 16S rRNA Seq ID No.10-·- DNA 編碼 Bacteroides (B242)的部份 16S rRNA Seq ID No.11·-· DNA 編碼 Bacteroides (B342)的部份 1 6S rRNA Seq ID No.12--- DNA 編碼 Bacteroides (B45 8)的部份 1 6S rRNA Seq ID No.13--- DNA 編碼 Bacter〇ides denticanoris levii (B22) forsythensis denticanoris denticanoris denticanoris denticanoris denticanoris denticanoris denticanoris denticanoris 、12- 200848508

(B473)的部份 1 6S rRNA

Seq ID No.14 DNA 編碼 Bacteroides denticanoris (B4748)的部份 16S rRNA

Seq ID No.15 DNA 編碼 Bacteroides denticanoris (B476)的部份 1 6S rRNA

Seq ID No. 1 6——序歹fJ弓f子

Seq ID No . 1 7——序列引子 發明之詳細說明 細菌分離株 本發明提供一種新分離出的厭氧細菌，此細菌會引起 寵物牙周病及其他多種疾病與臨床表癥的厭氧細菌，經 16S rRNA DNA序列鑑定，更特定的說，此菌屬於擬桿菌 (Bacteroides)、卩卜啉單胞菌（Porphyromonas)及田納 菌（Tannerella)中之成員。 此外，提供一種引起寵物牙周病的新型厭氧細菌◦此 新型菌株在小鼠的實驗模型中會引起（造成）齒槽骨的流 失。根據此細菌的細胞型態學及生化學特性，指出它是屬 於擬桿菌的一員。比較其16S rRNA基因序列，再根據其 他生化、分子親緣關係與病理學證據顯示，此菌是先前未 被定義的新品種，將之命名爲口牙擬桿菌 Bacteroides denticanoris sp. nov.。口牙擬桿菌的標準株是 strain B78T ( =ATCC PTA- 5 8 8 1 )。雖然本發明也分離出其他種 或其他品系的細菌，但本發明所分離出的理想細菌是口牙 -13- 200848508 擬桿菌（Bacteroides denticanoris(B78))、利氏卩卜啉 單胞菌（Porphyromonas levii(B222))及福氏田納菌 (Tannerella forsythensis ( B343-24))。在比較理想的 一個實施例中，本發明菌株可以根據其16S rRNA DNA序 歹[J，與 SEQ ID N0:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 1 3、1 4及1 5所顯示之序列比對鑑定出來。 本發明所提的細菌所引起的疾病包括：寵物牙周病、 寵物口腔異味（口臭）、牛隻腐蹄病、犬冠心病及犬系統 性感染，而且還不僅限於這些疾病而已。此屬的細菌還與 與許多人類疾病有關，包括：冠心病、腮腺炎、口臭、牙 齦炎、牙周病、中風、動脈硬化、高血脂、陰道細菌增生 症、子宮內胎兒生長遲滯（IUGR )，並增加低體重胎兒 早產的發生率。 本發明除提供自細菌分離出的聚核苷酸分子外，所提 供聚核苷酸序列與 SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、 1 0、1 1、1 2、1 3、1 4及1 5的任一相似度至少9 0 %，或理 想上至少有 9 5 %、9 5 · 5 %、9 6 %、9 6 · 5 %、9 7 %、9 7 · 5 %、 9 8 %、9 8.5 %、9 9 %、9 9.5 % 的相似度。 此外，本發明提供之聚核苷酸序列與SEQ ID NO:3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14 及 15 所顯示的 任一聚核苷酸序列的互補序列在高嚴格度的條件下雜交。 在另一個特定實施例中，亦提供一種在高嚴格度的條 件下可以與 SEQ ID N0:3、4、5、6、7、8、9、10、11、 1 2、1 3、1 4及1 5或互補序列雜交的核酸。舉例來說（但 -14- 200848508 並不僅限於此例），超過9 0核苷酸的雜交區在如此高嚴 格度的條件下之操作程序如下。含有DNA的濾膜與緩衝 液（6Χ SSC， 50mM Tris-HCl(pH7 · 5 )， ImM EDTA， 0.020/〇PVP，0.02%Ficoll，0.02%BS A)及 5 00pg/mL 變性鮭魚 精子DNA在65t下8小時至隔夜進行預雜交。濾膜在65 °C下與含有5-20xl06cpm的32P標記探針及lOOpg/mL變 性鮭魚精子DNA的預雜交混合物進行雜交48小時。用含 有 2 X S S C，0.0 1 % P V P，0 · 0 1 % F i c ο 11，0 · 0 1 % B S A 的溶液在 3 7 °C下清洗一小時，用 0 . 1 X S S C在5 0 °C下再洗4 5分 鐘，然後進行自動放射顯影。 其他高嚴格度條件完全視核酸的天然特性（如：長 度、GC含量等）以及雜交的目的（如：偵測、放大等） 而定，這些都在已知技術中。例如在一聚合酶連鎖反應 (PCR)中一將近15-40鹼基的寡核苷酸與互補序列在下列 嚴格條件下進行雜交：50MmKCl鹽溶液，1〇111]\4丁1*15-HC1，1.5Mm鎂離子溶液，ΡΗ7_7·5，及黏合溫度 55-60 °C。 在某一較佳實施例中，雜交後清洗條件下：每張瀘膜 以 4〇1111^磷酸鈉、？117.2、5%808、1111%£0丁八、0.5%牛 血清蛋白在4 0 °C清洗2次每次3 0分鐘，之後再以磷酸 鈉、pH7.2、1%SDS、ImM EDTA共洗4次每次30分鐘。 在高嚴格度雜交時，濾膜額外以40mM磷酸鈉、ρΗ7·2、 1%SDS、ImM EDTA在5 0°C下洗4次每次30分鐘，接著 以磷酸鈉、PH7.2、1%SDS、ImM EDTA 在 65°C 下洗 4 次 -15- 200848508 每次30分鐘。 本發明還提供疫苗及疫苗配方，當以有效劑量施以寵 物時，可以有效治療及預防（也就是抵抗）寵物的牙周 病。 在某一實施例中本發明提供一種疫苗包含至少一種減 毒（修飾活性）或去活性的全細胞製備（細菌素）。在另 一實施例中此疫苗包含一來自一或多種細菌可以引起免疫 反應的部分次體。減毒（修飾活性）或去活性疫苗（細菌 素）可以與疫苗其他調製成份混合，包括可相容的佐劑、 稀釋劑或載體。 定義及縮寫 核苷酸序列的”視爲相同’’或”序列相似度，，一詞是透過 比對視窗比較2種最佳比對序列所得。此處最佳比對序列 提供最高度吻合度，同時可以導入核苷酸插入受試或參考 序列。序列相似度的測定則計算受試與參考序列在全部核 苷酸的每個位置的類似程度的百分比。最佳比對序列與序 列相似度可以用人工測定或最好用電腦演算，例如 TBLASTN， FASTA， GAP， BESTFIT 及 CLUSTAL W (Altschul et al.? 1990,J. Mol. Biol. 215(3):403-10; Pearson and Lipman，1 98 8，P r o c. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-8; Thompson, et al.，1 994，Nucleic Acids Res. 22(22):4673 -80; Devereux et al., 1 984, Nuc. Acids. Res. 1 2:3 8 7-3 95; Higgins， et al., 1 996， Methods Enzymol. -16- 200848508 266:3 83 -402 )，但並不僅限於以上所述。最 NCBI Blast Server ( http://www.ncbi.nlm.nih.go^ 錯參數來搜尋相似序列資料庫。 ’’異源性’’一詞在此處是指來自不同種或品系 ”相似”或’’ 一致性”一詞在此處是指聚核苷酸 序列間相似的程度。 ”同源性’’一詞在此處是指來自相同種或品系 ”分離”一詞在此處是指自原生環境中移除， 獨或在異源寄主細胞或染色體媒介載體（如質體 等）。 ”分離出的厭氧細菌”、”分離細菌分離 此處是指在培養基中與其他微生物分開或與原 離。”生物學上的純種”在本發明中是指細菌菌 微生物分離的意思。 ”分離出的聚核苷酸”一詞在此處是指所分離 苷酸含量佔總組成份的至少5 0%以上，更理想是 9 9%。 ”功能等同π —詞在此處是指一重組多胜肽可 抗體所辨認，而此特定抗體產自引起寵物牙周病 產生的天然多胜肽，或一重組多胜肽所引起的免 內生細菌天然蛋白相類似。所以因功能等同多胜 的抗體也能辨認天然多胜肽（此多胜肽由引起寵 的細菌所產生）。 ’’免疫性’’ 一詞在此處是指一蛋白質或多胜肽 好是利用 / )設定除 的細菌。 或多胜肽 的細菌。 不論是單 、幢囷體 菌株”在 生環境分 種與他種 出的聚核 佔95%或 以爲特定 的細菌所 疫反應與 肽所產生 物牙周病 能針對引 -17- 200848508 起寵物牙周病的細菌所引起的免疫反應。 ”抗原性”一詞在此處是指一蛋白質或多胜肽所能與其 產生之抗體發生免疫特異性鍵結的能力。 ”抗體”一詞在此處是指可以與抗原結合的免疫球蛋白 分子。抗體可以是多株混合或單株來源。抗體可以是保持 完整免疫球蛋白（無論是天然或重組）或是其免疫反應區 的部分。抗體可以用多種方式存在，包括如Fv、Fab’、 F(ab’）2或以單鏈形式存在。 ”寵物’’ 一詞在此處是指任何非人且可當作寵物的動 物，包括狗、貓、馬、兔、猴子及嚼齒類如大白鼠、小白 鼠、砂鼠、倉鼠及雪貂，但不僅限於上述所說種類。 ’’保護”一詞在此處是用在疫苗，意指由造成此疾病的 微生物所取得製成的疫苗，可以預防或減少該疾病所造成 的病癥。”保護”一詞或類似詞也可以用來表示”疫苗可以 用來治療疾病或許多病癥之一 ”。 ’’有效治療劑量’’ 一詞意指足以引起受藥者免疫反應的 一定量細菌或次體（如多胜肽或多胜肽序列）及混合物。 免疫反應可以包含細胞或/及體液免疫，但並不僅限於 此。 ”預防感染” 一詞意指用來預防或抑制引起寵物牙周病 的細菌複製，或抑制細菌的傳播或預防細菌在寄主體內生 存或減輕因感染所造成的病癥。如果能讓細菌量減少則此 類處理可視爲治療。 ”製藥學上可接受的載體”一詞意指一種攜帶介質，此 -18- 200848508 介質不會干擾活性成份之生物活性的有效性，同時受藥個 體也不會產生毒性。 ”治療劑”一詞意指任何分子、化合物或處理，主要是 指一種抗細菌的、可以用來輔助細菌性感染或疾病或其所 引起狀況的處理治療。 ’’片段或變種” 一詞意指本發明的部份核苷酸序列，也 包含相似物和可能擁有核苷酸殘基缺失、插入或替代的一 ， 或多種變種聚核苷酸，以及同源變種。 細菌種類之分離及特徵化 本發明的細菌可以由已知的取樣、培養及分離技術所 取得，例如微生物樣本可以自患病寵物（如貓、狗）族群 中取得。牙周病的判斷可以利用已知的測定標準，例如： 狗的牙周囊袋大於3mm、貓的牙周囊袋大於2mm。已知 描述牙周病特性的參數包括：牙齒指數（牙齦指數及牙周 指數）及牙周囊袋深度，可以由寵物樣本族群中測得。個 別樣本可以取自特定動物的牙周囊袋，在厭氧狀態下用各 種已知培養基培養。 臨床菌株可以利用已知技術，例如一系列生化測試及 16S rRNA DNA序列分析來決定其屬別和種別。個別菌株 可以移植到平板培養基上，然後在培養基上放置抗生紙錠 (Anaerobe Systems)，來測定每種菌株對於抗生素的抗 藥模式。純化的菌落可以用已知的吲哚及觸酶試驗 (Anaerobe Systems )，個別菌株再測定脂肪酶與卵磷脂 -19- 200848508 酶的生產模式。 菌株可以依其1 6S rRNA DNA序列加以分類，分離良 好的菌落可以用作聚合酶連鎖反應（PCR )的樣板，利用 引子 D0056 及 D0057 (見表一的 Seq. ID N0.1 及 Seq· ID NO.2)放大 16S rRNA DNA 區域。全部的 16S rRNA DNA 可以利用Seq. ID NO. 16及17所揭露的引子加以放大。 PCR 產物可以利用 PCR preps kits (Promega Corp·; Madison，WI)純化並加以收集。接著將純化的PCR產物 脫鹽，然後進行DNA序列分析。最後，DNA序列利用現 有的DNA資料庫搜尋，細菌就可以根據搜尋結果比對鑑 定而加以分類。 - 20- 200848508 表一、DNA序列鑑定名單，所有寡核苷酸引子皆由 Gibco-BRL(USA)所合成

SEQ ID NO. 名稱 標的 DNA 序歹！j • - 1 D0056 16S rRNA GGATTAGATACCCTGGTAGTC 2 D0057 16S rRNA CCCGGGAACGTATTCACCG 3 □牙擬桿菌 (B78) 16S rRNA 聚核苷酸序列 (Not applicable) GCACAGTAAACGATGMTACTCGCTGTTT GCGATACACTGTAAGCGGCCAAGCGAAA GCGTTAAGTATTCCACCTGGGGA GTACGCCGGCAACGGTGAAACTCAAAGG AATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAG GAACATGTGGTTTAATTCGATGATA CGCGAGGAACCTTACCCGGGGTTAAATT GCGCTGGCTTTTACCGGAAACGGTATTT TCTTCGGACCAGCGTGAAGGTGCT GCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGA GGTGTCGGCTTMGTGCCATAACGAGCG CAACCCTTATCTTrAGTTACTAAC · AGTTTTGCTGAGGACTCTAMGAGACTG CCGTCQTAAGATGCGAGGAAGGTGGGG ATGACGTCAAATCAGCACGGCCCTT ACGTCCGGGGCTACACACGTGTTACAAT GGGGAGCACAGCAGGTTGCTACACGGC * GACGTGATGCCAATCCGTAAAACTC CTCTCAGTTCGGATCGAAGTCTGCAACC CGACTTCGTGAAGCTGGATTCGCTAGTA ATCGCGCATCAGCC -21 - 200848508

SEQ ID NO. 名稱 標的 DNA序列 4 利氏卟啉菌·· (B222) 16S rRNA polynucleotide sequence (Not applicable) CGCTGTAAACGATGATTACTCAGAGTATG CGATATAATGTATGCTCTCAAGCGAAAGC GTTAAGTAATCCACCTGGGGAG TACGTCGGCAACGATGAAACTCAAAGGA ATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGG AACATGTGGTTTAATTCGATGATAC GCGAGGAACCTTACCTGGGATTGAAATG TATATGCCGGTATCCCGAAAGGGGTGCT ATTCACTTCGGTGACGTATATGTA GGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTG CCGTGAGGTGTCGGCTTAAGTGCCATAA CGAGCGCAACCCTTATCGTCAGTT GCTAGCAGGTAAAGCTGAGGACTCTGGC GAGACTGCCGTCGTAAGGCGAGAGGAA GGTGGGGATGACGTCAAATCAGCAC GGCCCTTAT.ATCCAGGGCGACACACGTG TTACAATGGTGAGGACAAAGGGTCGCTA CCCGGTGACGGGATGCCAATCTCC AAACCTCATCTCAGTTCGGATCGGAGTC TGCAACTCGACTCCGTGAAGCTGGATTC GCTAGTAATCGCGCATCAGCCATG 5 福氏田納菌^ (B343-24) 16S rRNA polynucleotide sequence (Not applicable) TACTAGGAGTTTGCGATATACAGTAAGCT CTACAGCGAAAGCGTTAAGTAATCCACC TGGGGAGTACGCCGGCAACGGTG AAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGC ACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAATTC GATGATACGCGAGGAACCTTACCC GGGATTGAAATGTAGACGACGGACAGTG AGAGCTGTCTTCCCTTCGGGGCGTCTAT GTAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCA GCTCGTGCCGTGAGGTGTCGGCTTAAGT GCCATAACGAGCGCAACCCtGACTGTCA GTTGCTAACAGGirTAAGCTGAGGA CTCTGGCGGGACTGCCGGCGTAAGCTG TGAGGAAGGTTGGGATGACGTCAAATCA GCACGGCCCTTACATCCGGGGCGAC ACACGTGTTACAATGGCAGGGACAAAGG GCAGCTACCGGGCGACCGGATGCCAAT CTCCAAACCCTGTCTCAGTTCGGAT CGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGC TGGATTCGCTAG -22- 200848508 以下寵物牙周病菌株皆寄存在美國菌種中心 (ATCC ) ，1 0 80 1 University Blvd·，VA，201 10，USA :

Bacteroides denticanoris(B78; (PTA-5881))、利氏卩卜啉 單胞菌(Porphyromonas levii ( B222; (PTA-5 8 82)))及 Tannerella forsythensis ( B343-24; (PTA-6063) ) o 細菌核苷酸序列之選殖 有許多已知的方法或技術可以應用於本發明核苷酸序 列的選殖。序列可以分離爲限制片段並複製殖入選殖載體 及/或表現載體，PCR放大序列可以並複製殖入選殖載體 及/或表現載體，或序列可以混合上述這些方法加以複 製。 已知的標準分子生物學技術可以根據以下來源（但並 不僅限於此）：Sambrook et al·，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press， New York ( 1 989) ; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons， Baltimore， Maryland ( 1 98 9) ； Perbal, A Pratical Guide to Molecular Cloning，John Wiley and Sons，New York (1988); Watson et al., Recombinant DNA，Scientific American Books, New York ; Birren et al (eds) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Vols. 1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York ( 1 98 8);以及美國專利號碼 4,666,82 8、 4,683,202、4,801，531、5, 192,659、5,272,057 所介紹的方 -23- 200848508 法。聚合酶連鎖反應（PCR )可以根據以下所述：PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications,

Academic Press, San Diego, CA (1990)。本發明所採用的 核苷酸選殖與定序方法實例將於實施例中介紹。 抗體的生產 抗體可以是單源或多源或重組而產生。通常抗體是由 免疫原或其部份製備，或以選殖技術重組製得，或是分離 天然基因產物和/或部份作爲免疫原而製得。以標準的抗 體製造技術，利用免疫原來生產抗體的方法，可以根據： Harlow and Lane，Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988 以及 Borrebaeck, Antibody Engineering - A Practical Guide, W.H. Freeman and Co.，1 992。由抗體製備抗體片 段（包括Fab、F(ab’）2及Fv)的方法也在這些已知技術當 中。 在抗體生產及所需抗體篩選方面皆可以利用現在已知 的免疫學標準方法完成，這些技術包括以下來源（但並不 僅限於此）：Stites et al.(eds), Basic and Clinical Immunology (8th Edition), Appleton & L an g e , Norwalk, CT ( 1 994)、Mishell and Shiigi(eds), Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Co., New York (1980)。通常酵素連接免疫吸附分析法（ELISA)及西方 點墨法（Western blotting)是比較常用的免疫分析方法， -24- 200848508 這些也都是一般熟知的分析技術。在這些分析當中單株抗 體或多株抗體都可以適用。抗體可以結合在一固體的支撐 物上，也可以形成可偵測的部份共軛結構，無論何種結合 都屬於熟知技術（有關共軛或螢光或酵素本體可以參考 Johnstone & Thorpe, Immu no chemistry in Practice, B lack well Scientific Publications，Oxford, 1 9 8 2 ) 〇 有關 抗體結合在一固體的支撐物上的技術可以參考以下來源： Harlow & Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York ( 1 9 8 8)以及 Borrebaeck，Antibody Engineering - A Practical Guide, W.H. Freeman and Co.，1 992。本發明所準備採用的可偵 測部份包括（並不僅限於此）：螢光性、金屬性、酵素性或 放射性標記，這些標記如：生物素、金、鐵蛋白、鹼性磷 酸酶、β-半乳糖酶過氧化酶、尿素酶、螢光黃、玫紅、 氣、1 4 C及碘化作用。 其餘的免疫分析法，例如放射免疫分析法（RIA )爲 已知技術，許多專利及文獻中對於可利用的免疫分析法也 有深入的描述，例如：美國專利號 3,791，93 2、 3,839,153 、 3,850,752 、 3,850,578 、 3,853,987 、 3,879,262 、 3,901,654 、 3,935,074 、 3,984,533 、 3,996,3 45、4,034,074、4,098,876、4,879,2 1 9 > 5,01 1,771 和 5，281，521 ;以及 Sambrook et al·，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor， New York 1 989 ° -25- 200848508 偵測診斷及預防套組 本發明尙提供偵測擬桿菌（Bacteroides )、卟啉單胞 菌（Porphyromonas )及 Tannerella的套組。此套組包含 可以分析上述微生物、多胜肽或核苷酸序列的試劑’而其 中核苷酸序列的存在是此生物存在與否的指標。此方法具 有價値之處在於可以在病癥出現前就先診斷出來’如此可 以在疾病對病患造成傷害前先加以預防。細菌、多胜肽或 核苷酸序列的存在與否可以利用抗體、PCR、雜交或其他 已知技術的方法加以判斷。 在一實施例中，此套組所提供的試劑可以偵測用來對 抗擬桿菌（Bacteroides)、卩卜啉單胞菌 (Porphyromonas)及田納菌（Tannerella)所生產的抗 體。在某些實施例中，此套組還包括一套印刷好的指示或 標籤，指出此套組可用來偵測擬桿菌（Bacteroides )、卟 B林單胞菌（Porphyromonas)及田納菌（Tannerella)。在 另一實施例中此套組提供可以用來偵測擬桿菌 (Bacteroides)、卩卜啉單胞菌（Porphyromonas)及田納 菌（T a η n e r e 11 a )核酸的試劑。在某一實施例中，此套組 提供可以利用PCR偵測擬桿菌（Bacteroides)、卟啉單 胞菌（Porphyromonas)及田納菌（Tannerella)核酸的試 劑，而且包含至少一個容器，其中包含第一個分離出的 DNA分子，此分子包含一片段至少約15、20、25、30個 核苷酸，而此片段在高嚴格度條件下與一 DNA分子雜交 -26- 200848508 (此DNA分子包含SEQ ID NO:3-5的聚核苷酸中任一者 中，至少 15、30、45、60、75、90相連核苷酸的序 列）；以及第二個分離出的DNA分子，此分子包含一片 段至少約15、20、25、30個核苷酸，而此片段在高嚴格 度條件下與一 DNA分子的互補分子雜交（此DNA分子包 含 SEQ ID ΝΟ:3·5的聚核苷酸中任一者中，至少 15、 30、45、60、75、90相連核苷酸的序列）；而第一、第 二DNA分子可以用來放大擬桿菌（Bacteroides)、卟琳 單胞菌（Porphyromonas) 及田納菌（Tannerella) 的核 酸，此核酸編碼一 16S rRNA，而此16S rRNA爲SEQ ID NO :3-5中選出的DNA分子所編碼。 疫苗配方及給藥方法 本發明之疫苗可以用有效劑量施藥於寵物，以便提供 治療或對抗或預防寵物的牙周病。本發明的疫苗對於引起 牙周病的細菌可以有效控制。本發明疫苗特別針對治療寵 物的獸醫領域之應用，以及對抗一些已知會引起牙周病的 細菌來維護公共衛生。 本發明之疫苗的價値在於可以控制細菌可能造成的傷 害，或散播，或成爲人與寵物間感染媒介，例如此處所描 述。本發明之疫苗對於寵物身上所存在的細菌之控制特別 有效，給藥的方式可以根據已知的方式，如口服、靜脈注 射、鼻內給藥、皮下或局部外用等方式，但不僅限於上述 所舉方式。 -27- 200848508 根據本發明的另一觀點，本發明所提供疫苗的組成份 是包含可相容的佐劑、稀釋劑或載體的掺和物。在一較佳 實施例中，本發明的疫苗配方是由水性懸濁液或溶液所組 成，其中包含至少一種本發明所提之細菌或/和至少一次 體蛋白、在生理酸鹼値下較佳的緩衝液，以隨時可以注射 的方式存在。 本發明進一步提供一治療及預防細菌感染的方法，包 括以有效劑量之疫苗或疫苗配方所提供的處理，而處理包 括細菌感染的預防及病癥的緩解。 本發明的疫苗或疫苗配方可以用來引起一反應，以預 防牙周病菌所造成的疾病特徵之病理變化。用在哺乳動物 的疫苗配方中，一免疫產生量的細菌、純化蛋白、核酸或 組成物，需要的話可以混合適當的習知疫苗佐劑與生理性 載體。 用來預防寵物牙周病的疫苗配製，可以利用至少一種 分離且純化的去活性或減毒細菌、純化的多胜肽（如天然 蛋白、次體蛋白或多胜肽），混合以上一或多種再配上可 相容的佐劑、稀釋劑或載體。 本發明進一步提供混合疫苗，包含至少一種去活性或 減毒細菌，再混合一或多種額外的免疫產生成份。此疫苗 在受藥動物體內產生的效益遠比各成份單獨施藥時要好得 多，因爲混合疫苗可能刺激動物產生抗體協力作用。 用在混合疫苗中的免疫產生成份包括：犬瘟熱病毒 (CD )、犬腺病毒-2型（CAV-2 )、副流行性感冒病毒 -28- 200848508 (CPI )、犬病毒性出血性胃腸炎（CPV )、犬冠狀病毒 (CCV)、犬瘤疹病毒、狂犬病病毒等，但不僅限於上述 所列成份。由這些免疫產生成份作爲本發明的疫苗成份中 的ί几原’可以經過修釋病毒活性或將病毒去活性之製備而 得。病毒株之減毒方法及病毒去活性方法爲美國專利號 4,567,042及4,567,043所提供之技術。 根據本發明，混合疫苗通常包括一獸醫學上可接受之 載體，包括··任何及所有的溶劑、分散介質、被覆劑、佐 劑、安定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌與抗真菌劑、等張 劑、延遲吸附劑及其類似物。稀釋劑可以包括：水、生理 食鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油及其類似物。等張劑可以包 括氯化鈉、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖及其他。 安定劑包括白蛋白及其他。 來自其他病原的一或多種抗原，以及獸醫學上可接受 的載體，可以利用任何便利及實際的方式加以混合製成一 混合疫苗，例如：掺合、溶解、懸浮、乳化、膠囊化、吸 收及其他類似方式，所製成的劑型可以是錠劑、膠囊、粉 狀、糖漿狀、懸濁劑，以適合注射、植入、吸入、消化或 類似方式。 本發明之疫苗的製備可以混合至少一種去活性或減毒 細菌，與一製藥學上可接受之載體，且最好含一佐劑。 本發明疫苗之適合製備方式包括：可注射式，無論 '液 體或懸濁劑；也可以製備出固體型式，在注射前再混合製 藥學上可接受之液狀載體，製成注射用溶液或懸濁劑。疫 -29- 200848508 苗也可以用乳化製備。活性免疫產生物最好與製藥學上可 接受及可相容之佐劑混合。這些佐劑包括（但不僅限於 此）：礦物，凝膠（如氫氧化鋁），表面活性物資（如溶 血卵磷脂），糖苷（如皂素衍生物Quil A或 GPI-0100 (美國專利號 5,97 7,0 8 1 ))，陽離子界面活性劑（如 DDA、Pluronic Polyols)，聚陰離子，非離子嵌段聚高分 子（如 Pluronic F-127 ( B.A.S.F·，USA))，多胜肽，礦 物油（如 Montanide ISA-50 ( Seppic, Paris, France) Carbopol、Amphigen ( Hydronics， Omaha, NE USA)、 Alhydrogel ( Superfos Biosector, Frederikssund, Denmark))，油乳劑（例如BayolF/Arlacel A與水的乳 劑、植物油與水的乳劑以及卵磷脂類的乳化劑），明礬， 膽固醇，rmLT，細胞激素及其混合物。在疫苗調製時也 可以將免疫產生成份加入微脂粒或與多醣或其他高分子共 軛結合。在本發明的方法中也可能包含額外添加物質，包 括（但不限於）一或多種防腐劑，如乙二胺四乙酸二鈉、 乙二胺四乙酸四鈉、乙基汞化鈉水楊酸鹽及其類似物。 理想的疫苗給藥對象爲寵物，最好是貓、狗。 在疫苗組成中本發明之疫苗最好是以單位使用劑量較 爲理想，一免疫產生量在本發明中是指給藥量內包含約 1 xlO4〜lxl 013失活細菌細胞。當一疫苗組成含有多種成份 時，可以使用相同量或較少的免疫產生量。 利用已知技術可以隨時因上述免疫產生量、使用狀 況、動物生理特性來決定適當的有效治療劑量。因此疫苗 -30- 200848508 的製備乃提供一劑量的活性成份所生成一免疫產生量的無 菌製備。此處活性成份爲至少一種細菌’在有其他活性成 份存在時，此單位劑量可以依現有技術隨時調整。 一理想的劑量管理包含至少一劑量理想的疫苗成份之 給藥。其中每部分的抗原含量如前面所述，本疫苗的有效 劑量（免疫化劑量）可以由模型測試系統所得到的劑量-反應曲線圖外插而得。本發明疫苗的給藥模式可以是任何 將疫苗傳送到寄主的適當途徑，包括（但不限於）：口 服、皮內、肌肉注射、腹腔、皮下、鼻腔或劃痕（如用分 叉針頭在皮膚表面刻劃）。無論如何，疫苗較好的給藥方 式是皮下或肌肉注射，其他如皮內、靜脈注射或扁桃腺內 給藥在需要時也可以使用。 根據硏究顯示，以上所描述的每一疫苗組成，都需要 以8周齡以上年輕動物啓動原始的免疫機制，並在1 2周 齡及1 6周齡時注射加強劑。並建議每年追加接種一次。 本發明的給藥及劑量依據良好作業規範（GMP )，並 斟酌個體臨床狀況、給藥位置及方法、給藥時程、個體年 齡、性別體重及其他醫生已知的因子。 本發明進一步提供預防寵物牙周病的套組。在某一實 施例中，此套組提供一容器包含一有效治療劑量，以預防 寵物牙周病。此套組也可以額外包含一佐劑以輔助本發明 成份產生反應。同時此套組也可以包含一給藥器以分散成 份，最好是以單位劑量型式，給藥器可以包含鐵及塑膠 箔，例如泡殼包。此套組可以伴有一標籤或印刷的指示 -31 - 200848508 單，描述施以其中成份可以預防寵物牙周病，此成份包含 一本發明之疫苗成份，再調以製藥學上可接受的載體，放 置在適當容器中，並標示可以治療所指示的牙周病狀況。 疫苗效力測定 本發明疫苗及疫苗成份的特定保護機制是引起接種動 物抗體和/或細胞免疫反應，一如以下體外動物試驗所指 出。 本發明的細菌、疫苗及疫苗成份對於治療及預防寵物 牙周病、牛腐足病、犬冠心病或犬系統性感染有效。本發 明將以下列不設限的例子及所附表格詳細說明。 【實施方式】 例一 寵物牙齦溝內液體樣本 以獸醫臨床處理牙周病或某些經認可機構在對貓狗做 一般例行性檢查時所採取貓狗的微生物樣本進行化驗。狗 的牙周囊袋大於3mm、猫的的牙周囊袋大於2mm皆屬本 硏究範圍。記錄牙指數（牙齦指數及牙周指數）及牙周囊 袋深度。個別以粗略刻度紙（Henry Schein; Melville, NY )無菌插入牙周囊袋中，當取出刻度紙時立刻插入裝 有含預還原厭氧無菌（PRAS)之 Anaerobic Dental Transport ( AD T )培養基(Anaerobe Systems; Morgan Hills，CA )的瓶子中。 -32- 200848508 瓶子移到Bactron IV厭氧室（Scheldon Manufacturing，Cornelius，OR)中’在 90% 氣氣、5% 氨热 及5 %二氧化碳環境下處理。刻度紙無菌移到含5 0 μί的 PRAS Brain Heart Infusion ( BHI) 、PYG 或 SSYG 培養基 (Anaerobe Systems)，旋轉 30 秒。配 BHI、PYG 或 S S Y G培養基以1 : 1 0 0及1 : 1 0 0 0的倍率稀釋。將此稀釋液 等分成 100μί 塗抹於 PRAS Burcella Blood Agar ( BRU) (Anaerobe Systems)平板培養基上，在37 °C厭氧室中培 養5-7天，計算細菌菌落總數及黑色厭氧細菌（BPAB ) 菌落數目。BPAB單獨菌落移到BRU平板培養基上，再按 上述方法培養。 臨床分離株特性描述 每一臨床分離株接受一系列生化分析及16S rRNA DNA序列分析，利用引子D005 6及D00 5 7 (表一之SEQ ID ΝΟ:1及 NO:2)來決定其屬名及種名。個別分離株在 BRU平板培養基表面劃線。康那黴素、萬古黴素及可利 斯汀錠（Anaerobe Systems)放在培養基表面以測定每分 離株的抗KVC (康那黴素、萬古黴素及可利斯汀）模 式。純化的菌落接受吲哚及觸酶（Anaerobe Systems )試 驗。個別分離株移至Egg Yolk Agar ( EYA)平板培養基 (A n a e r 〇 b e S y s t e m s )，以測定其脂肪酶及卵磷脂酶的生 產模式。這些資料整理於以下圖1。 與牙周病嚴重程度的系統分類息息相關的牙周指數， -33- 200848508 必須考慮此複雜多面疾病的多樣角度，包括（但不限 於）：牙周囊袋深度、牙齦失附、探測流血、牙齒搖動與 牙齦炎。與牙齦發炎嚴重程度的系統分類息息相關的牙齦 指數’影響其分類的現象包括（但不限於）：浮腫程度、 色澤、自發性出血、牙齦凹陷、高可塑性。 取自五個福氏田納菌（Tannerella forsythus)分離株 的部份16S rRNA序列特徵，發現在約5 20-bp區域有 100%的相似度。二個利氏卩卜琳單胞菌（Porphyromonas levii)分離株在部份16SrRNA序列分析中有超過99%的 相似度，只有一核苷酸的差異（在SEQ ID NO :4的13位 置）。 擬桿菌新種（Bacteroidesdenticanoris)的鑑定 將本硏究過程中所鑑定的許多臨床分離株之1 6 S rRNA序列與現有資料庫比對，找不出高度類似者，表示 此菌有可能是新種分離株。以下表2所示的一群此類分離 株，顯示出現新的品種，基於此處所呈現的資料，我們建 議此類分離株可以稱做 Bacteroides denticanoris sp. ηον·，其標準菌株爲 Β78τ ( =ATCC ΡΤΑ-5881)。 -34- 200848508 表2 .本硏究所利用的犬臨床細菌株 品系 牙齒 牙周囊袋 深度（mm) 位置 16SrRNA 的 SEQIDNO: Bacteroides denticanoris Β78τ 上左前臼齒#4 5 賓州 3(片段)與 6(全長） Bacteroides denticanoris B80 上左前a齒#4 5 賓州 7 Bacteroides denticanoris B83 上左前臼齒#4 5 賓州 8 Bacteroides denticanoris B241 上左前臼齒#4 4 印地安 那州 9 Bacteroides denticanoris B242 上左前臼齒#4 4 印地安 那州 10 Bacteroides denticanoris B342 下左第一臼齒 5 賓州 11 Bacteroides denticanoris B458 上右犬齒 未測得 加州 12 Bacteroides denticanoris B473 上右前臼齒#4 3 加州 13 Bacteroides denticanoris B474 上右前臼齒#4 3 加州 14 Bacteroides denticanoris B476 上右前臼齒#4 3 加州 15

Bacteroides denticanoris Β78τ 的表現型特徵描述 自一隻五歲雌性牙周病的混種狗身上分離出口牙擬桿 菌 Bacteroides denticanoris Β78τ。臨床上，此狗的牙周 指數爲3，牙齦指數爲2(Harvey，1998)。左上及第四前 臼齒所取得的刻度紙樣本，顯示牙周囊袋深度有5mm。 檢體經上述方法加工處理，純化的細胞爲革蘭氏陰性、無 孢子生成、不會移動、桿狀、觸酶陰性。菌落在Burcella -35- 200848508

Blood Agar上以37 °C厭氧培養約5天。在培養7天後口 牙擬桿菌Bacteroides denticanoris Β78τ菌落開始出現顏 色（深至黑色）。分離株在Burcella Blood Agar上顯示 溶血現象，對康那黴素敏感，對萬古黴素及可利斯汀有抗 性（Anaerobe Systems 的抗生素錠）。在 Egg Yolk Agar (A n a e r o b e S y s t e m s )上的菌落顯示有卵磷脂酶活性，但 沒有脂肪酶活性。沒有證據顯示此細菌有群集現象，因爲 在許多培養基中菌落都是獨立分開的（資料並未顯示於 此）。 生化分析

口牙擬桿菌 Bacteroides denticanoris Β78τ 以 RapID ANA II臨床檢驗套組（Remel; Lenexa，KS)進行生化分 析。簡而言之，口牙擬桿菌 Bacteroides denticanoris B78T Burcella Blood Agar培養基上的3個菌落，再平 均懸浮於McFarland#3。此懸浮液加入受試孔盤中，在37 °C下培養4小時，培養完後記錄1 8項不同生化測試結 果。 圖 2 所示爲口牙擬桿菌 Bacteroides denticanoris Β78τ和六對照組細菌的 RapID ANA II分析結果。在 RapID ANA II套組所進行的18項檢測中，口牙擬桿菌 Bacteroides denticanoris Β78τ 有 6 項（ONPG、PGLU、 aFUC、NAG、P04及L G Y )呈現陽性反應。比較之下， 牙齦卩卜啉菌 Porphyromonas gingivalis ATCC 33277，中間 -36- 200848508 普氏菌 Prevotella intermedia ATCC 25611,福氏田納菌 T annerella for sy thens i s ATCC 43037，多形擬桿菌 Bacteroides thetaiotaomicron ATCC 29148，脆弱擬桿菌 Bacteroides fragillis ATCC 25 2 8 5， Bacteroides splanchnicus ATCC 29572 分别]在第 5、4、10、12、9 及 8 項呈陽性反應。 親緣關係分析

Bacteroides denticanoris Β78τ 之全長 16S rRNA 基因 以弓[子 D134 ( 5，-GAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3，---SEQ ID NO:16)及 D57(5’-CCCGGGAACGTATTCACCG-3’---SEQ ID NO:17) (Invitrogen Corp.)經 PCR 力口 以放大 (Slots，J., e t a 1. Clin Infect Dis 20 Suppl 2，S304-307, 1995) °

PCR產物加以收集、純化、脫鹽，然後進行DNA序 列分析。BLAST-N ( Altschul，S. F. et al·，J Mol Biol 21 5, 403-410 ) ( 1 9 9 0 )。利用 Bacteroides denticanoris B 7 8T 之 16S rRNA 基因序列在 National Center for Biotechnology Information的非重複核苷酸資料庫中搜 尋，資料顯示Bacteroides denticanoris Β78τ分離株與擬 桿菌屬其中成員有親緣關係。資料庫中與其親緣關係最接 近的序列是 Bacteroides sp. 0 1 03 800 ( 檢索碼 AJ4 1 6906 )的1 6S rRNA基因序列，超過1，463鹼基對有 9 7%的相似度，此菌分離自厭氧的腦腫瘍。 -37- 200848508 以CLUSTER X 1 ·8 1版軟體進行1 6S rRNA基因序 列的親緣分析，利用臨近連接法得到親緣關係樹（Saitou， N. & Nei，M. Mol Biol Evol 4，406-425 ) ( 1 987 )。 重複算1000次得到之重複値（boostrap value)。圖 3 顯不口牙擬桿菌 Bacteroides denticanoris Β78τ* 離株的 親緣分析結果。其主要屬別（卟啉菌屬、擬桿菌屬、普氏 菌屬、田納菌等）的位置與先前發表的黏液桿菌-黃桿菌-擬桿菌門（CFB )的親緣位置一致（Paster, et al ( 1 994 ). J Bacteriol. 1 7 6,725 -732., Shah, Η. N. et al. Bacteroides, Pre votella, and P o r p hy r o m ο n a s . In Microbiology and microbial infections，pp.1305-1330. Edited by A. Balows and B. I. Duerden. London: Oxford University Press (1998))。 口牙擬桿菌 Bacteroides denticanoris B78T、擬桿菌 屬 Bacteroides sp. 0103 800 及未馴化口牙擬桿菌

Bacteroides Bisii27分離株被歸類於脆弱單胞桿菌（Β· fragilis )群組的分支，其他分支還包括產酸擬桿菌B· acidofacien 及多形擬桿菌 B. thetaiotaomicron (圖 1)。 在來自脆弱單胞桿菌次群組之 Bacteroides denticanoris B 7 8 τ次群組的分支點上有9 9.9 %的重複信心値，更加強了 新鑑定出生物的親緣位置。 自其他9隻狗身上臨床取得的口牙擬桿菌 Bacteroides denticanoris Β78τ 分離株（表 1)中 16S rRNA基因在約5 60-bp的區域，利用D56及D57引子將 -38- 200848508 其放大3倍。其PCR產物經純化、脫鹽並集中。然後測 定此PCR產物的DNA序列，其結果顯示於下列表3。分 離株根據其16S rRNA基因序列加以分類。個別分離良好 的菌落用來作爲PCR放大的模板，利用引子D0056及 D0057 (表一之 SEQ ID NChl 及 NO:2)將 16S rRNA 區 域放大3倍。PCR在50 μΐ反應容量下進行，其中含有 1PCR 緩衝液（Life Technologies; Rockville，MD)、 l.OmM氯化鎂、1.25μΜ每引子、3 00μΜ各去氧核苷酸三 磷酸鹽及 2.5U 白金 Pfx DNA 聚合酶 （Life Technologies )。以下的PCR循環所利用的條件爲：一個 941：的2分鐘變性、94 °C變性40秒循環30次、60 °C粘合 40秒、72t延長1分鐘、最終延長步驟在72 °C下進行2 分鐘，最後爲4 °C的冷卻步驟。所有PCR放大均利用 Gene Amp 9 7 0 0 thermocycler ( Perkin Elmer Applied Biosystems ; Foster City, C A )。 最後 PCR 產物利用 PCR preps kits ( Promega Corp·; Madison, WI)加以純化並依分離株集中，純化的PCR產 物接著利用 0.025 μιη 硝化纖維濾紙 （Millipore Corp.;Bedford，MA)以 25ml 無菌水經 drop analysis 力口 以 脫鹽處理。這些經純化脫鹽的PCR產物利用Dye Deo xy終 結反應，在一台ABI自動DNA定序儀上進行基因序列分 析。用合成的寡核苷酸引子D0056及D0057 (表一之SEQ ID ΝΟ:1及 NO:2 )以獲得雙股DNA序歹ij。最後DNA序 列利用取自美國國家生技資訊中心公開的BLAST-N計畫 -39- 200848508 所公開提供的DNA資料庫加以搜尋。 表3 DNA鑑定名單，所有寡核苷酸引子皆由Gibco-BRL所合成

SEQ ID NO. 名稱 DNA序列 . 7 CAGTAMCGATGAATACTCGCTGTTTGCGATACACTGTAAGCGGCCAAGCGAAA 口牙擬桿菌 GCGHMGTATTCCACCTGGGGAGTACGCCGiGCAACGGTGAAACTCAAAGGAA (B80) 16S rRNA TTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAATTCGATGATACGC 聚核苷歹GAGGAACCTTAGCCGGGmAAATTGCGCTGGCTTTTACCGGAAACGCTATTTT -40- 200848508

SEQ ID NO. 名稱 DNA序列 • CTTCGGACCAGCGTGAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAQCTCGTGCCQTGAG GTGTCGGCTTMGTGCCATAACGAGCGCAACCCTTATCTTTAGTTACTAACAGT TTTGCTGAGGACTCTAAAGAGACTGCCGTCGTAAGATGCGAGGAAGGTGGGGA TGACGTCAAATCAGCACGGCCCTTACGTCCGGGGCTACACACGTGTTACAATG GGGAGCACAGCAGGTTGCTACACGGCGACGTGATGCCAATCCGTAAAACTCCT CTCAGTTCGGATCGAAGTCTGCAACCCGACTTCGTGAAGCTGGATTCGCTAGT AATCGCGCATCAGCCACGGCGCGGTGAATAC 8 □牙擬桿菌 (B83) 16S rRNA 聚核苷酸序列 CAGTMACCBATeAATACTCGCTGTTTGCGATACACTGTAAGCGGCCAAGCGAAA GCGTTAAGTATTCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAACGGTGAMCTCAAAGGAA ttgacgggggcccgcacaagcggaggaacatgtggtttaattcgatgAtacgc GAGGAACCTTACCCGGGCTTAAATTGCGCTGGCTTtTACCGGAAACGGTATTTT CTTCGGACCAGCGTGAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAG GTGTCGGCTTAAGTGCCATAACGAGCGCAACCCTTATCTTTAGTTACTAACAGT TTTGCTGAGGACTCTAAAGAGACTGCCGTCGTAAGATGCGAGGAAGGTGGGGA TGACGTCAAATCAGCACGGCCCTTACGTCCGGGGCTACACACGTGTTACAATG GGGAGCACAGCAGGnGCTACACGGCGACGTGATGCCAATCCGfAAAACTCCT CTCAGTTCGGATCGAAGTCTGCMCCCGACrrCGTGAAGCTGGATTCGCTAGT AATCGCGCATCAGCCACGGCGCGGTGAATAC 9 □牙擬桴菌 (B241) 16S rRNA 聚核苷酸序列 GCACAGTAAACGATGAATACTCGCTGTTTGCGATACACTGTAAGCGGCCAAGC GAAAGCGTTAAGTATTCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAACGGTGAAACTCAAA GGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAATTCGATGAT ACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTAAATTGCGCTGGCTTTTACCGGAAACGGT ATTTTCTTCGGACCAGCGTGMGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCG TGAGGTGTCGGCTTAAGTGCCATAACGAGCGCAACCCTTATCTTTAGTTACTAA CAGTTTTGCTGAGGACTCTAAAGAGACTGCCGTCGTAAGATGCGAGGAAGGTG GGGATGACGTCAAATCAGCACGGCCCTTACGTCCGGGGCTACACACGTGTTAC AATGGGGAGCACAGCAGGTTGCTACACGGCGACGTGATGCCAATCCGTAAAAC TCCTCTCAGTTCGGATCGAAGTCTGCMCCCGACTTCGTGAAGCTGGATTCGCT AGTAATCGCGCATCAACCACGGCGCGGTGMTA f 10 α牙擬桿菌 (Β242) 16S rRNA 聚核苷酸序列 ACAGTAAACGATGAMTACTCGCTGTTTGCGATACACTGTAAGCGGCC AAGCGAAAGCGTTAAGTATTCCACCTGiGGGAGTACGCCGGCAACGGTGAAACT CAAAGGMTTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGMCATGTGQTTTAATTCGA TGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTAAATTGCGCTGGCTTTTACCGGAAA C^GTATTTTCTTCGGACCAGCGTGMGGTGCTGCATGGTtGTCGTCAGCTCGT GCCGTGAGGTGTCGGCTTAAGTGCCATAACGAGCGCAACCCTTATCTTTAGTTA CTAACAGTTTTGCTGAGGACTCTAAAGAGACTGCCGTCGTAAGATGCGAGGAA GGTGGGGATGACGTCAAATCAGCACGGCCCTTACQTCCGGGGCTACACACGT GmCAATGGGGAGCACAGCAGGTTGCTACACGGCQACGTGATGCCAATCCQT AAAACTCCTCTCAGTTCGGATCGAAGTCTGCAAQCCGACTTCGTGAAGCTGGAT - 41 - 200848508

SEQ ID NO. 名稱 DNA序列 TCGCTAGTAATCGCGGATCAACCACGGCGCGGTGAATA 11 口牙擬桿菌 (B342) 16S rRNA 麥核苷酸序列 CGCACAGTAAACGATGAATACTCGCTGTTTGCGATACACTGTAAGCGGCCAAG CGAAAGCGTTAAGTATTCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAACGGTGAAACTCAA AGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAATTCGATGA TACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTAAATTGCGCTGGCTTTTACCGGAAACGG TATTTTCTTCGGACCAGCGTGAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCC GTGAGGTGTCGGCTTAAGTGCCATAACGAGCGCAACCCTTATCTTTAGTTACTA ACAGTTTTGCTGAGGACTCTAAAGAGACTGCCGTCGTAAGATGCGAGGAAGGT GGGGATGACGTCAAATCAGCACGGCCCTTACGTCCGGGGCTACACACGTGTTA CAATGGGGAGCACAGCAGGTTGCTACACGGCGACGTGATGCCAATCCGTAAAA CTCCTCTCAGTTCGGATCGAAGTCTGCAACCCGACTTCGTGAAGCTGGATTCG CTAGTAATCGCGCATNACCACGGNGCGGTGAATAC 12 口牙擬桿菌· (B458) 16S rRNA 聚核苷酸序列 GCACAGTAAACGATGAATACTCGCTGTTTGCGATACACTGTAAGCGGCCAAGC GAAAGCGTTAAGTATTCCACCTGGGGAGTAC(3CCGGCAACGGTGAAACTCAAA GGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAATTCGATGAT ACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTAAATTGCQCTGGCTTTTACCGGAAACGGT ATTTTCTTCGGACCAGCGTGAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCG TGAGQTGTCGGCTTAAGTGCCATAACGAGCGCAACCCTTATCTTTAGTTAGTAA CAGTTTTGCTGAGGACTCTAAAGAGACTGCCGTCGTAAGATGCGAGGAAGGTG GGGATGACGTCAAATCAGCACGGCCCTTACGTCCGGGGCTACACACGTGtTAC AATGGGGAGCACAGCAGGTTGCTACACGGCGACGTGATGCCAATCCGTAAAAC TCCTCTCAGTTCGGATCGAAGTCTGCAACCCGACTTCGTGAAGCTGGATTCGCT AGTAATCGCGCATCAGCCACGGCGCGGTGAATA 13 □牙擬桿菌.. (B473) 16S rRNA 聚核苷酸序列 ; CACAGTAAACGATGAATACTCGCTGTTTGCGATACACGGTAAGCGGCCAAGCG AAAGCGHAAGTATTCCACCTGGGGAGTACGCCGGpAACGGTGAAACTCAAAG GAATTGACGGGGGGCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAATTCGATGATA CGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTAAATTGCGCTGGCTTTTACCGGAAACGGTA TTTTCTTCGGACCAGCGTGAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGT GAGGTGTCGGCTTAAGTQCCATAACGAGCGCAACCCTTATCTTTAGTTACTAAC AGTTTTGCTGAGGACTCTAAAGAGACTGCCGTCGTAAGATGCGAGGAAGGTGG GGATGACGTCAAATCAGCACGGCCCTTACGTCCGGGGCTACACACGTGTTACA ATGGGGAGCACAGCAGGHGCTACACGGCGACGTGATGCCAATCCGTAAAACT CCTCTCAGTTCGGATCGAAGTCTGCAACCCGACTTCGTGAAGCTGGATTCGCT AGTMTCQCGCATCAGCCACGGCGCGGTGAATAC 14 □牙擬桿菌 (B474) 16S rRNA 聚核苷酸序列 ACAGTAAACQATGAATACTCGCTGnTGCGATACACGGTAAGCGGCCAAGCGA AAGCGTTAAGTATTCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAAGGGTGAAACTCAAAGG AAnGACGGGGQCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTQGTrTAATTCGATGATAC GCGAGGAACCTTACCCGGGCTTAAATTGCGCTGGCTTTTAOCGGAAACGGTAT TrTCTTCGGACCAGCGTGAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTG -42- 200848508

SEQ ID NO. 名稱 DNA序列 AGGTGTCGGCTTAAGTGCCATAACGAGCGCAACCCTTATCTTTAGTTACTAACA GTTTTGCTGAGGACTCTAAAGAGACTGCCGTCGTAAGATGCGAGGAAGGTGGG GATGACGTCAAATCAGCACGGCCCTTACGTCCGGGGCTACACACGTGTTACM TGGGGAGCACAGCAGGTTGCTACACGGCGACGTGATGCCAATCCGTAAAACTC CTCTCAGTTCGGATCGAAGTCTGCAACCCGACTTCGTGAAGCTGGATTCGCTA GTAATCGCGCATCAGCCACGGCGCGGTGAATAC 15 □牙擬桿菌 (B476) 16S rRNA 聚核苷酸序列. CACAGTAAACGATGAATACTCGCTGTTTGCGATACACGGTAAGCGGCC AAGCGAAAGCGTTAAGTATTCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAACGGTGAAACT CMAGGAAfTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAATTCGA TGATAGGCGAGGAACCTTACCCGGGCHTAAATTGCGiCTGGCTTTTACCGGAAA CJ3GTATTTTCTTCGGACCAGCGTGAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGT GCCGTGAGGTGTCGGCTTAAGTGCCATAACGAGCGCAACCCTTATCTTTAG'TTA CTAACAGTTTTGCTGAGGACTCTAAAGAGACTGCCGTCGTAAGATGCGAGGAA GGTGGGGATGAGGTCAAATCAGCACGGCCCTI'ACGTCCGGGGCTACACACGT GTTACAATGGGGAGCACAGCAGGTTGCTACACGGCGACGTGATGCCAATCCGT AAAACTCCTCTCAGTTCGGATCGAAGTCTGCMCCCGACTTCGTGAAGCTGGAT TCGCTAGTAATCGCGGATCAGCCACGGCGCGGTGAATAC 結果發現來自口牙擬桿菌 Bacteroides denticanoris Β78τ之10個分離株的部份16S rRNA序列被歸類爲4個 序列群組（B78、B80、B83、B342、B458; B241 ; B242;B473、B474、B476)。在一群組中所有分離株都 在約5 60-bp的區域有相同的16S rRNA序列。圖4所顯示 爲口牙擬桿菌 Bacteroides denticanoris分離株部份 16S rRNA 序列的親緣分析結果。在所有口牙擬桿菌 Bacteroides denticanoris 分離株約 560-bp 的區域皆有 9 9.5 %相似度的DNA序列。基於這些觀察，我們可以下結 論：所有這些分離株都是同種間的不同品系。此外還發 現，這些種的品系間存在地理位置的區隔（賓州與加 州）。所有分離株的完整名單及其個別特徵顯示於圖1， 分離株的分佈顯示於表4。 -43- 200848508 表4與潛伏細菌種類相I的H數量摘要表 分離株 犬分離株數 犬隻數 陽性反應 百分比％ Bacteroides 10 5 10 denticanoris Porphyromonas 3 2 4 levii Tannerella 5 4 8 forsythensis 上表指出分離株的數量、分離出所指細菌種類的犬隻 數目以及百分比。 以下三種寵物牙周病的分離株寄存於美國菌種中心 (ATCC ) ， 1 0 8 0 1 University B1 vd., Manassas, VA,201 1 0，US A，Bacteroides denticanoris ( B78; ( PTA-5 8 8 1 ) ) ， Porphyromonas levii ( B 2 2 2; ( P T A - 5 8 8 2 ) ) 5 Tannerella forsythensis ( B3 43 -24; ( PTA- 6063 ))。 細菌品種的培養條件 由於許多厭氧細菌的標準生長培養基（Brain Heart Infusin 「 BHI 」 及 Chopped Meat Carbohydrate 「CMC」）含有動物成份，不容易用來生產疫苗，所以必 須尋找不含這些成份的生長培養基。以許多加或不加氧化 血紅素及維生素K的培養基成份來測試其維持生長的能 力，並與BHI、CMC培養基比較。pyG完全培養基及 SSYG 培養基足以維持 Bacteroides denticanoris、 -44- 200848508 845825-3 序列表 <110> Hardham, John Morgan Dreier, Kimberly Jean Krishnan, Rajendra McGavin, David Ross <12〇>牙周病用疫苗 <130> PC25634 <160> 17 <170> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213>人造 <220> <223>定序引子 <400> 1 ggattagata ccctggtagt c 21 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> 定序引子 <400> 2 cccgggaacg tattcaccg <210> 3 <211> 550 <212> DNA <213> 牙周擬桿菌 <400> 3 gcacagtaaa cgatgaatac tcgctgtttg cgatacactg taagcggcca agcgaaagcg 60 ttaagtattc cacctgggga gtacgccggc aacggtgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 120 cccgcacaag cggaggaaca tgtggtttaa ttcgatgata cgcgaggaac cttacccggg 180 cttaaattgc gctggctttt accggaaacg gtattttctt cggaccagcg tgaaggtgct 240 gcatggttgt cgtcagctcg tgccgtgagg tgtcggctta agtgccataa cgagcgcaac 300 ccttatcttt agttactaac agttttgctg aggactctaa agagactgcc gtcgtaagat 360 gcgaggaagg tggggatgac gtcaaatcag cacggccctt acgtccgggg ctacacacgt 420 gttacaatgg ggagcacagc aggttgctac acggcgacgt gatgccaatc cgtaaaactc 460 540 200848508 ctctcagttc ggatcgaagt ctgcaacccg acttcgtgaa gctggattcg ctagtaatcg cgcatcagcc <210> 4 <211> 560

<212> DNA <213>利氏卟啉單胞菌 <400> 4 cgctgtaaac gatgattact cagagtatgc gatataatgt atgctctcaa gcgaaagcgt taagtaatcc acctggggag tacgtcggca acgatgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggaggaacat gtggtttaat tcgatgatac gcgaggaacc ttacctggga ttgaaatgta tatgccggta tcccgaaagg ggtgctattc acttcggtga cgtatatgta ggtgctgcat ggttgtcgtc agctcgtgcc gtgaggtgtc ggcttaagtg ccataacgag cgcaaccctt atcgtcagtt gctagcaggt aaagctgagg actctggcga gactgccgtc gtaaggcgag aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcagcac ggcccttata tccagggcga cacacgtgtt acaatggtga ggacaaaggg tcgctacccg gtgacgggat gccaatctcc aaacctcatc tcagttcgga tcggagtctg caactcgact ccgtgaagct ggattcgcta gtaatcgcgc atcagccatg <210> 5 <211> 520

<212> DNA <213>福氏擬桿菌 <400> 5 tactaggagt ttgcgatata cagtaagctc tacagcgaaa gcgttaagta atccacctgg ggagtacgcc ggcaacggtg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggagga acatgtggtt taattcgatg atacgcgagg aaccttaccc gggattgaaa tgtagacgac ggacagtgag agctgtcttc ccttcggggc gtctatgtag gtgctgcatg gttgtcgtca gctcgtgccg tgaggtgtcg gcttaagtgc cataacgagc gcaaccctga ctgtcagttg ctaacaggtt aagctgagga ctctggcggg actgccggcg taagctgtga ggaaggttgg gatgacgtca aatcagcacg gcccttacat ccggggcgac acacgtgtta caatggcagg gacaaagggc agctaccggg cgaccggatg ccaatctcca aaccctgtct cagttcggat cggagtctgc aactcgactc cgtgaagctg gattcgctag 6 1496

DNA 牙周擬桿菌 550 60 120 180 240 300 360 420 480 540 560 60 120 180 240 300 360 420 480 520 <210> <211> <212> <2i3> -2- 200848508 <400> 6 aggcttacac atgcaagtcg aggggcagca ttatcttagc ttgctaagat agatggcgac 60 cggcgcacgg gtgagtaaca cgtatccaac cttccggtta ctcggggata ggctttcgaa 120 agaaagatta atacccgatg ttgcgtatct ttctcctgaa agatacgcca aaggattccg 180 gtaaccgatg gggatgcgtt ccattaggca gttggcgggg taacggccca ccaaaccttc 240 gatggatagg ggttctgaga ggaaggtccc ccacattgga actgagacac ggtccaaact 300 cctacgggag gcagcagtga ggaatattgg tcaatggacg gaagtctgaa ccagccaagt 360 agcgtgaagg atgactgccc tctgggttgt aaacttcttt tatacgggaa taacatgagg 420 tacgcgtacc ttattgcatg taccgttatg aataagcatc ggctaactcc gtgccagcag 480 ccgcggtaat acggaggatg cgagcgttat ccggatttat tgggtttaaa gggagcgtag 540 gtgggatatt aagtcagctg tgaaagtttg gggctcaacc ttaaaattgc agttgatact 600 ggtttccttg agtacggtac aggtgggcgg aattcgtggt gtagcggtga aatgcttaga 660 tatcacgaag aactccgatc gcgaaggcag ctcaccgggc cggaactgac actgatgctc 720 gaaagtgcgg gtatcaaaca ggattagata ccctggtagt ccgcacagta aacgatgaat 780 actcgctgtt tgcgatacac tgtaagcggc caagcgaaag cgttaagtat tccacctggg 840 ,gagtacgccg gcaacggtga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggaggaa 900 .catgtggttt aattcgatga tacgcgagga accttacccg ggcttaaatt gcgctggctt 960 ttaccggaaa cggtattttc ttcggaccag cgtgaaggtg ctgcatggtt gtcgtcagct 1020 cgtgccgtga ggtgtcggct taagtgccat aacgagcgca acccttatct ttagttacta 1080 acagttttgc tgaggactct aaagagactg ccgtcgtaag atgcgaggaa ggtggggatg 1140 acgtcaaatc agcacggccc ttacgtccgg ggctacacac gtgttacaat 999gagcaca 1200 gcaggttgct acacggcgac gtgatgccaa tccgtaaaac tcctctcagt tcggatcgaa 1260 gtctgcaacc cgacttcgtg aagctggatt cgctagtaat cgcgcatcag ccacggcgcg 1320 gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaag ccatgaaagc cgggggtacc 1380 tgaagtacgt aaccgcgagg atcgtcctag ggtaaacctg gtgattgggg ctaagtcgta 1440 acaaggtagc cgtaccggaa ggtgcggctg gaacacctcc tttctggagc gatgcc 1496 <210> 7 <211> 563 <212> DNA <213>牙周擬桿菌 <400> Ί cagtaaacga tgaatactcg ctgtttgcga tacactgtaa gcggccaagc gaaagcgtta 60 -3- 120 200848508 agtattccac ctggggagta cgccggcaac ggtgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg aggaacatgt ggtttaattc gatgatacgc gaggaacctt acccgggctt aaattgcgct ggcttttacc ggaaacggta ttttcttcgg accagcgtga aggtgctgca tggttgtcgt cagctcgtgc cgtgaggtgt cggcttaagt gccataacga gcgcaaccct tatctttagt tactaacagt tttgctgagg actctaaaga gactgccgtc gtaagatgcg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcagcac ggcccttacg tccggggcta cacacgtgtt acaatgggga gcacagcagg ttgctacacg gcgacgtgat gccaatccgt aaaactcctc tcagttcgga tcgaagtctg caacccgact tcgtgaagct ggattcgcta gtaatcgcgc atcagccacg gcgcggtgaa tac <210> 8 <211> 563

<212> DNA <213 >牙周擬桿菌 <400> 8 cagtaaacga tgaatactcg ctgtttgcga tacactgtaa gcggccaagc gaaagcgtta agtattccac ctggggagta cgccggcaac ggtgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg aggaacatgt ggtttaattc gatgatacgc gaggaacctt acccgggctt aaattgcgct ggcttttacc ggaaacggta ttttcttcgg accagcgtga aggtgctgca tggttgtcgt cagctcgtgc cgtgaggtgt cggcttaagt gccataacga gcgcaaccct tatctttagt tactaacagt tttgctgagg actctaaaga gactgccgtc gtaagatgcg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcagcac ggcccttacg tccggggcta cacacgtgtt acaatgggga gcacagcagg ttgctacacg gcgacgtgat gccaatccgt aaaactcctc tcagttcgga tcgaagtctg caacccgact tcgtgaagct ggattcgcta gtaatcgcgc atcagccacg gcgcggtgaa tac <210> 9 <211> 565

<212> DNA <213 >牙周擬桿菌 <400> 9 gcacagtaaa cgatgaatac tcgctgtttg cgatacactg taagcggcca agcgaaagcg ttaagtattc cacctgggga gtacgccggc aacggtgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggaggaaca tgtggtttaa ttcgatgata cgcgaggaac cttacccggg cttaaattgc gctggctttt accggaaacg gtattttctt cggaccagcg tgaaggtgct gcatggttgt cgtcagctcg tgccgtgagg tgtcggctta agtgccataa cgagcgcaac 180 240 300 360 420 480 540 563 60 120 180 240 300 360 420 480 540 563 60 120 180 240 300 -4- 200848508 ccttatcttt agttactaac agttttgctg aggactctaa agagactgcc gtcgtaagat 360 gcgaggaagg tggggatgac gtcaaatcag cacggccctt acgtccgggg ctacacacgt 420 gttacaatgg ggagcacagc aggttgctac acggcgacgt gatgccaatc cgtaaaactc 480 ctctcagttc ggatcgaagt ctgcaacccg acttcgtgaa gctggattcg ctagtaatcg 540 cgcatcaacc acggcgcggt gaata 565 <210> 10 <211> 564

<212> DNA <213>牙周擬桿菌 <400> 10 acagtaaacg atgaaatact cgctgtttgc gatacactgt aagcggccaa gcgaaagcgt 60 taagtattcc acctggggag tacgccggca acggtgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 120 ccgcacaagc ggaggaacat gtggtttaat tcgatgatac gcgaggaacc ttacccgggc 180 ttaaattgcg ctggctttta ccggaaacgg tattttcttc ggaccagcgt gaaggtgctg 240 catggttgtc gtcagctcgt gccgtgaggt gtcggcttaa gtgccataac gagcgcaacc 300 cttatcttta gttactaaca gttttgctga ggactctaaa gagactgccg tcgtaagatg 360 cgaggaaggt ggggatgacg tcaaatcagc acggccctta cgtccggggc tacacacgtg 420 ttacaatggg gagcacagca ggttgctaca cggcgacgtg atgccaatcc gtaaaactcc 480 tctcagttcg gatcgaagtc tgcaacccga cttcgtgaag ctggattcgc tagtaatcgc 540 gcatcaacca cggcgcggtg aata 564 <210> 11 <211> 566 <212> DNA <213> 牙周擬桿菌 <220> <221> misc feature <222> (547) . . (547) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_ feature <222> (555丁 \ .(555) <223> n is a, c, g, or t <400> 11 cgcacagtaa acgatgaata ctcgctgttt gcgatacact gtaagcggcc aagcgaaagc 60 gttaagtatt ccacctgggg agtacgccgg caacggtgaa actcaaagga attgacgggg 120 gcccgcacaa gcggaggaac atgtggttta attcgatgat acgcgaggaa ccttacccgg 180 -5- 200848508 gcttaaattg cgctggcttt taccggaaac ggtattttct tcggaccagc gtgaaggtgc 240 tgcatggttg tcgtcagctc gtgccgtgag gtgtcggctt aagtgccata acgagcgcaa 300 cccttatctt tagttactaa cagttttgct gaggactcta aagagactgc cgtcgtaaga 360 tgcgaggaag gtggggatga cgtcaaatca gcacggccct tacgtccggg gctacacacg 420 tgttacaatg gggagcacag caggttgcta cacggcgacg tgatgccaat ccgtaaaact 480 cctctcagtt cggatcgaag tctgcaaccc gacttcgtga agctggattc gctagtaatc 540 566 cgatacactg taagcggcca agcgaaagcg 60 aacggtgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 120 ttcgatgata cgcgaggaac cttacccggg 180 gtattttctt cggaccagcg tgaaggtgct 240 tgtcggctta agtgccataa cgagcgcaac 300 aggactctaa agagactgcc gtcgtaagat 360 cacggccctt acgtccgggg ctacacacgt 420 acggcgacgt gatgccaatc cgtaaaactc 480 acttcgtgaa gctggattcg ctagtaatcg 540 565 gatacacggt aagcggccaa gcgaaagcgt 60 acggtgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 120 tcgatgatac gcgaggaacc ttacccgggc 180 tattttcttc ggaccagcgt gaaggtgctg 240 gtcggcttaa gtgccataac gagcgcaacc 300 ggactctaaa gagactgccg tcgtaagatg 360 gcgcatnacc acggngcggt gaatac <210> 12 <211> 565

<212> DNA <213>牙周擬桿菌 <400> 12 gcacagtaaa cgatgaatac tcgctgtttg ttaagtattc cacctgggga gtacgccggc cccgcacaag cggaggaaca tgtggtttaa cttaaattgc gctggctttt accggaaacg ..gcatggttgt cgtcagctcg tgccgtgagg ccttatcttt agttactaac agttttgctg gcgaggaagg tggggatgac gtcaaatcag gttacaatgg ggagcacagc aggttgctac ctctcagttc ggatcgaagt ctgcaacccg cgcatcagcc acggcgcggt gaata <210> 13 <211> 565

<212> DNA <213>牙周擬桿菌 <400> 13 cacagtaaac gatgaatact cgctgtttgc taagtattcc acctggggag tacgccggca ccgcacaagc ggaggaacat gtggtttaat ttaaattgcg ctggctttta ccggaaacgg catggttgtc gtcagctcgt gccgtgaggt cttatcttta gttactaaca gttttgctga -6 - 200848508 cgaggaaggt ggggatgacg tcaaatcagc acggccctta cgtccggggc tacacacgtg 420 ttacaatggg gagcacagca ggttgctaca cggcgacgtg atgccaatcc gtaaaactcc 480 tctcagttcg gatcgaagtc tgcaacccga cttcgtgaag ctggattcgc tagtaatcgc 540 gcatcagcca cggcgcggtg aatac 565 <210> 14 <211> 564

<212> DNA <213>牙周擬桿菌 <400> 14 acagtaaacg atgaatactc gctgtttgcg atacacggta agcggccaag cgaaagcgtt 60 aagtattcca cctggggagt acgccggcaa cggtgaaact caaaggaatt gacgggggcc 120 cgcacaagcg gaggaacatg tggtttaatt cgatgatacg cgaggaacct tacccgggct 180 taaattgcgc tggcttttac cggaaacggt attttcttcg gaccagcgtg aaggtgctgc 240 atggttgtcg tcagctcgtg ccgtgaggtg tcggcttaag tgccataacg agcgcaaccc 300 ttatctttag ttactaacag ttttgctgag gactctaaag agactgccgt cgtaagatgc 360 gaggaaggtg gggatgacgt caaatcagca cggcccttac gtccggggct acacacgtgt 420 tacaatgggg agcacagcag gttgctacac ggcgacgtga tgccaatccg taaaactcct 480 ctcagttcgg atcgaagtct gcaacccgac ttcgtgaagc tggattcgct agtaatcgcg 540 catcagccac ggcgcggtga atac 564 <210> 15 <211> 565

<212> DNA <213>牙周擬桿菌 <400> 15 cacagtaaac gatgaatact cgctgtttgc gatacacggt aagcggccaa gcgaaagcgt 60 taagtattcc acctggggag tacgccggca acggtgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 120 ccgcacaagc ggaggaacat gtggtttaat tcgatgatac gcgaggaacc ttacccgggc 180 ttaaattgcg ctggctttta ccggaaacgg tattttcttc ggaccagcgt gaaggtgctg 240 catggttgtc gtcagctcgt gccgtgaggt gtcggcttaa gtgccataac gagcgcaacc 300 cttatcttta gttactaaca gttttgctga ggactctaaa gagactgccg tcgtaagatg 360 cgaggaaggt ggggatgacg tcaaatcagc acggccctta cgtccggggc tacacacgtg 420 ttacaatggg gagcacagca ggttgctaca cggcgacgtg atgccaatcc gtaaaactcc 480 tctcagttcg gatcgaagtc tgcaacccga cttcgtgaag ctggattcgc tagtaatcgc 540 565 gcatcagcca cggcgcggtg aatac 200848508 <210> <211> <212> <213> 16 20 DNA 人造 <220> <223> 定序引子 <400> 16 gagtttgatc ctggctcagg 20 <210> <211> <212> <213> 17 19 DNA 人造 <220> <223> 定序引子 <400> 17 cccgggaacg tattcaccg 19 -8-

Claims (1)

1. 200848508 十、申請專利範圍 1 .至少一種經分離的有色厭氧細菌，其包含一 1 6S rRNA DNA序歹[|，該序列與SEQ ID NO : 4的序列具有至 少95%的同源性，其中該細菌係直接引起或與其他致病劑 倂用引起寵物之牙周病。 2. 如申請專利範圍第1項之細菌，其包含一 1 6 S rRNA DNA序列，該序列與SEQ ID NO ·· 4的序列具有至 少99%的同源性。 3. 如申請專利範圍第1項之細菌，其包含一 1 6S rRNA DNA序列，該序列與SEQ ID NO : 4的序列具有至 少9 9.5 %的同源性。 4. 如申請專利範圍第1項之細菌，其包含一 16S rRNA DNA序歹ij，該序列爲SEQ ID NO : 4的序列。 5 ·如申請專利範圍第1項之細菌，其爲利氏卟啉單 胞菌(Porphyromonas levii)。 6·如申請專利範圍第5項之細菌，其爲ATCC PTA-5882或具有ATCC Ρ ΤΑ-5882之所有鑑定特徵之細菌。 7 ·如申請專利範圍第1項之細菌，其中該寵物爲貓 或狗。 8. —種致免疫組成物，其包含申請專利範圍第1-7 項中任一項之有色厭氧細菌。 9. 如申請專利範圍第8項之致免疫組成物，其中有 色厭氧細菌係已去活性。 10. 如申請專利範圍第8項之致免疫組成物，其進一 200848508 步包含藥學上可接受的載體。 1 1 . 一種治療或預防龍物牙周病之疫苗，其包含有效 免疫量的申請專利範圍第1 - 7項中任一項之細菌及藥學上 可接受的載體。 12.如申請專利範圍第1 1項之疫苗，其中該細菌係 已去活性。 1 3 .如申請專利範圍第1 1項之疫苗，其進一步包含 佐劑。 1 4 · 一種診斷寵物牙周病之方法，其係藉由分析寵物 口腔的檢體，其中該檢體中存有一或多種申請專利範圍第 1 -7項中任一項之有色厭氧細菌係該疾病的指標。 1 5 .如申請專利範圍第1 4項之方法，其中於該檢體 中存有包含一 16S rRNA DNA序列之多核苷酸（該DNA序 列與SEQ ID NO : 4之序列具有至少約95%的同源性）係 該疾病的指標。 1 6 .如申請專利範圍第1 5項之方法，其中於該檢體 中存有包含一 16S rRNA DNA序列之多核苷酸（該DNA序 列與SEQ ID NO : 4之序列具有至少約99%的同源性）係 該疾病的指標。 1 7 .如申請專利範圍第1 5項之方法，其中於該檢體 中存有包含一 16S rRNA DNA序列之多核苷酸（該DNA序 列與SEQ ID NO : 4之序列具有至少約99· 5 %的同源性）係 該疾病的指標。 1 8 .如申請專利範圍第1 5項之方法’其中於該檢體 -2- 200848508 中存有包含一 16S rRNA DNA序列之多核苷酸（該DNA序 列係S E Q ID Ν Ο : 4之序列）係該疾病的指標。 1 9 .如申請專利範圍第1 4項之方法，其中該分析步 驟包括分析檢體，其所利用的方法係選自P C R、雜交或抗 體偵測。 2 0. —種套組，其於至少一個容器中包含治療和預防 寵物牙周病的組成物，此組成物包含有效量的至少一種申 請專利範圍第1 -7項中任一項之活體或去活性的經分離之 有色厭氧細菌及藥學上可接受的載體；其中該套組進一步 包含一組印刷指示，其指明此套組係用於治療或預防寵物 牙周病。 2 1.如申請專利範圍第20項之套組，其中該套組進 一*步包含分散該組成物的裝置。 2 2 . —種套組，其於至少一個容器中包含經分離的 DNA分子，該DNA分子包含SEQ ID NO: 4的至少約15 個連續核苷酸之核苷酸序列’該核苷酸序列係在高度嚴格 條件下與S E Q I D Ν Ο : 4之核苷酸序列的互補序列雜交， 及第二種經分離的DNA分子，該DNA分子係於第2個容 器中包含經分離的DNA分子，該DNA分子包含至少約 1 5個連續核苷酸的核苷酸序列’該核苷酸序列係SEQ ID NO : 4的核苷酸序列的互補序列且在高度嚴格條件下與 SEQ ID NO: 4的核苷酸序列雜交，其中該套組進一步包 含一組印刷指示，其指明此套組係用於偵測卟啉單胞菌屬 (Porphyromonas)菌株。 200848508 23 · —種雜交套組，其於至少一個容器中包含經分離 的DNA分子，該DNA分子包含SEQ ID NO : 4之至少約 1 5個連續核苷酸的核苷酸序列或彼之互補序列，其中該 雜交係對卩卜啉單胞菌屬（Porphyromonas)菌株具專一 性；且其中該套組進一步包含一組印刷指示，其指明此套 組係用於偵測卟琳單胞菌屬（Porphyromonas )菌株。 2 4.如申請專利範圍第23項之套組，其中雜交是在 高度嚴格條件下進行。 25 . —種細菌之生物上純培養物，其中該細菌包含一 16S rRNA DNA序歹丨J，該DNA序列與SEQ ID NO: 4的序 列具有至少約9 9 %的同源性。 26.如申請專利範圍第25項的細菌之生物上純培養 物，其中該16S rRNA DNA序列與SEQ ID NO : 4的序列 具有至少約99.5%的同源性。 2 7 .如申請專利範圍第2 5項的細菌之生物上純培養 物，其中該16S rRNA DNA序列係SEQ ID NO: 4的序 列。 28.—種細菌之生物上純培養物，其係 ATCC PTA-5882或具有AT CCPTA-5882之所有鑑定特徵之培養物。