TW200844236A - Multivalent avian influenza vaccines and methods - Google Patents

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200844236 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於禽類疫苗領域。更特定言之，本發明係關 於多價禽流感疫苗領域。 【先前技術】 流感病毒通常係根據病毒所表現之血球凝集素（HA)及神 經胺酸酶（NA)亞型分類。（關於流感病毒之更詳細背景， 參見美國專利申請公開案第2006/0204976號，其揭示内容 係以引用的方式全部併入本文中）。迄今已鑑別出15種不 同血球凝集素亞型（稱作H1至H15)及9種不同神經胺酸酶亞 型（稱作N1至N9)。因此流感病毒可根據血球凝集素及神經 胺酸酶亞型來分類，其係表示為諸如HxNy，其中i至 15之數且y為1至9之數。 HA為包含約560個胺基酸之病毒表面醣蛋白。其主要負 責病毒粒子與宿主細胞之黏附且負責感染之早期階段的細 胞穿透。在流感疫苗中，HA亞型在形成抗病毒感染之免 疫力中最重要。舉例而言，包含（例如）具有H5血球凝集素 亞t之滅活或減毋丨’1L感病毒之疫苗組合物應誘導對抗呈有 H5血球凝集素亞型之傳染性流感病毒之免疫力。 相比之下，NA亞型在形成免疫力方面起較小關鍵作 用。然而，已發現NA亞型之特性可適用於區分經疫苗接 種動物與受感染動物。區分經疫苗接種動物與受感染動物 之能力係重要的，因為許多國家不允許進口在血清學上與 文感染動物不可區分之經疫苗接種動物。各種方法（共同 129209.doc 200844236 稱作”DIVA")允許區分受感染動物與經疫苗接種動物。一 此DIVA策略依賴疫苗株之NA亞型之特性來區分經疫苗接 種動物與受感染動物。（關於DIVA方法之描述參見國際專 利申請公開案第WO03/086453號)。詳言之，可製備具有與 循環感染流感病毒之HA亞型相同之HA亞型及與循環感染 病毒之NA亞型不同之NA亞型的疫苗病毒（例如，滅活、減 毒等）。一方面，此型疫苗將由於其HA亞型而誘導抗傳染 性病毒之保護性免疫力，而另一方面，基於獨特NA亞型 使得工作人員能區分受感染動物與經疫苗接種動物。重要 的係DIVA策略迄今已使用且主要論述於單價流感疫苗之 文章中。 組合或多價（例如，二價）疫苗提供多種優於單價疫苗之 優點。多價疫苗之一優點在於需要較少次疫苗接種。單一 製劑可於一次接種中投與且其可有效抵抗若干疾病或單一 疾病之病毒株。當疫苗經組合時所需之接種次數降低將使 得對疫苗接種時程之順應性增加。此又將可能使得疫苗覆 蓋率因而增大，最終產生更佳之疾病控制。 二價禽流感疫苗係描述於美國專利申請公開案第 2006/0204976號（"’976公開案”）中。舉例而言，W76公開案 尤其提供H5N9+H7N1二價禽流感疫苗之實例。然而，此 例示性二價疫苗不允許將經疫苗接種動物與感染（例如）流 行性H5N1病毒或致病性H7N1病毒株之動物區分，因為經 疫苗接種動物與受感染動物兩者均具有N1神經胺酸酶亞 型。尤其關注禽流感之H5N1病毒株，因為此病毒株顯然 129209.doc 200844236 可自家禽傳播至人類且已造成若干人類死亡事故。（例如 ^^Beigelf A ^ N. Engl j. Med 353；1374.1385 (2005)) 〇 口此此項技術中需要二價禽流感疫苗，其提供對抗Η5& H7傳染性流感病毒之保護且亦提供區分受感染動物(尤其 感染H5N1及/或H7N1之動物）與經疫苗接種動物之簡單及 便利方法。 【發明内容】 本I明藉由提供包含至少兩種禽流感病毒株之疫苗組合 物來解決此項技術中之前述需要’其中該等病毒株之一者 ，、有H5血球/旋集素亞型且另一病毒株具有血球凝集素 亞型，且其中該等病毒株之至少一者具有N4神經胺酸酶亞 型且沒有病毒株具有N1亞型。本發明亦提供利用本發明之 新穎疫苗組合物之疫苗接種方法。 【實施方式】 本發明提#包含至少第一禽流感病毒株及第^禽流感病 毒株之疫苗組合物，其中該第一病毒株具有H5血球凝集素 亞型且該第二病毒株具有H7A球凝集素亞型，且其中至少 第一病f株或第二病毒株具有N4神經胺酸酶亞型，且第一 病毒株及第二病毒株均不具有川神經胺酸酶亞型。疫苗組 合物之兩種病毒株中不存在N1亞型及在該等病毒株之至少 一者中存在N4亞型使得工作人員能將經疫苗接種動物與已 經具有N1神經胺酸酶亞型之傳染性病毒（例如出川或 H7N1)感染之動物區分。 如本文中所用，表達，，流感病毒株”意欲意謂一或多種具 129209.doc 200844236 有特定血球凝集素類型（例如H5、H7等）及特定神經胺酸酶 類型（例如 N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9)之流感病 毒或次單位病毒。如本文中所用，流感病毒株係使用慣例 "HxNy"在其血球凝集素與其神經胺酸酶亞型兩方面進行描 述，其中X為1至15之任何整數，且y為1至9之任何整數。

本發明之疫苗組合物為多價，例如二價、三價、四價 等。如本文中所用，術語"多價"意欲意謂疫苗組合物含有 至少兩種流感病毒株，其係基於表徵各病毒株之特定 HxNy配對來彼此區分。本發明所涵蓋之例示性二價疫苗 組合物係列於表1中： 表1 :例示性二價疫苗組合物 二價疫苗組合物編號 第一病毒株 第二病毒株 1 H5N2 H7N4 2 H5N3 H7N4 3 H5N4 H7N4 4 H5N5 H7N4 5 H5N6 H7N4 6 H5N7 H7N4 7 H5N8 H7N4 8 H5N9 H7N4 9 H5N4 H7N2 10 H5N4 H7N3 11 H5N4 H7N5 12 H5N4 H7N6 13 H5N4 H7N7 14 H5N4 H7N8 15 H5N4 H7N9 在某些實施例中，表1中所示之例示性二價疫苗組合物 可僅含有其中所列出之兩種流感病毒株且不含其他免疫原 性組份。舉例而言，表1中所述之二價組合物之任一者（標 記為1至1 5)可含有兩種所列流感病毒株且不含其他流感病 129209.doc -9- 200844236 毒株。然而，在某些其他實施例中，可添加其他免疫原性 組份，諸如其他流感病毒株及/或對其他禽類疾病具有特 異性之抗原。舉例而言，除兩種〜 種特疋流感病毒株之外，本 發明之疫苗組合物可包括抗（ 、】如）馬立克病（Marek’s disease)、雞祕病毒、雞貧A病毒、新城疫病毒（Newcastle D職sev㈣、傳染性支氣管炎、傳染性華氏囊病毒 (infectious bursal disease virus、、也姐产土 US)、呼腸病毒等之疫苗抗 原。如本文中他處所說明，若本發明之疫苗組合物中包括 兩種或兩種以上流感病毒株’則較佳該等病毒株之至少一 者具有N4神經胺酸酶亞型且坊堃 H该專病毒株中無一者具有N1 神經胺酸酶亞型。在草此眚給：丨& 牡呆二只轭例中，流感病毒株之至少一 者具有H5血球凝集素亞型且湳片 土且/爪感病毒株之至少一者具有 H7血球凝集素亞型。 ’ 本發明之疫苗組合物中所句杠 汁匕括之 感病毒株較佳經滅 活。出於本發明之目的，丨丨、试 减活病毋”尤其涵蓋殺死的（例 如’非傳染性）流感病毒及減表古 、、 ，久减t流感病毒。在某些實施例 中，流感病毒株係使用可用方、、表 J用万法滅活，諸如使用化學滅活 劑（諸如二乙烯亞胺、β丙内 · -日 福馬林（formalin)、戊二 酸、十二烷基硫酸鈉或苴翻Z 4 凡八頦似物或其混合物，較佳福馬 林m行化學滅活。本發明之流感病毒亦可（例如）藉由執滅 活或在紫外光存在下藉由補骨脂素（ps⑽㈣滅活。或者， 本發明之文中所用之病喜嫉 株T經減f (例如，活減毒）。如 本文中所用，術語”減喜佐圭” 7么> 取毋病t係指已經修飾以便其在 個體中之病原性大體上降低 、’ -之任何病I。病毒較佳經減毒 129209.doc •10- 200844236 至自臨床觀點看其為非病原性之程度，例如，暴露於病毒 之動物相對於對照動物而言不顯示具有統計意義的病狀增 加程度。例示性活減毒流感病毒株包括（例如）冷適應重配 病毒（cold-adapted reassortment virus)。本發明之多價疫苗 組合物之病毒可在與彼此組合之前或之後經滅活。 可藉由此項技術中已知之技術來獲得本發明之疫苗組合 物中所包括之流感病毒株。舉例而言，病毒可自受感染動 物（諸如受感染之雞）分離，且隨後於組織培養物或其他適 合培養基中於胚卵上繼代以形成種原病毒（master seed virus) 〇 重組流感病毒株可包括於本發明之疫苗組合物中。重組 病毒可使用習知卵基方法獲得，其中兩種具有新疫苗之所 需特徵之流感病毒株（例如HA及/或NA亞型）經注射入其基 因天然重配之卵中。亦可藉由將多種（例如兩種）流感病毒 株引入允許發生天然重配之組織培養物中而獲得重組病 毒。或者，適用於本發明文中之流感病毒株可使用重組 DNA技術（其可涉及或不涉及使用輔助病毒）來建構。可用 於製造適用於本發明文中之流感病毒株之例示性質體基或 ’’反向遺傳學’’技術係描述於（例如）美國專利第6,649,372 號、第6,887,699號、第6,951，754號及美國專利申請公開案 第 2005/0003349號、第 2005/0037487號及第 2006/00571 16 號中。 本發明之疫苗組合物中所包括之流感病毒株可含有一或 多種使病毒減毒或滅活之基因突變（例如，點突變、缺 129209.doc 200844236 失、插入等）。病毒可（例如）包括NS 1基因之部分或完全缺 失。（例如參見美國專利第6,669,943號及第6,866,853號）。 本發明之範嗜内涵蓋任一流感病毒基因片段之突變，其包 括（例如）HA、NA、Ml、M2、NS1、PB1、PB2、PA及 / 或 NP基因中之一或多種突變。流感病毒株之基因組中所包括 之任何突變較佳不明顯降低疫苗病毒產生對抗含有同源血 球凝集素及/或神經胺酸酶亞型之致病性攻毒病毒株之保 護性免疫反應的能力。 可使用可利用技術、較佳用藥理學上可接受之載劑來調 配本發明之疫苗組合物。舉例而言，在某些實施例中，涵 盍水性調配物。此等調配物利用水、鹽水或填酸鹽或其他 適合緩衝液。在其他實施例中，疫苗組合物較佳為油包水 乳液或水包油乳液。亦涵蓋雙重乳液，通常表示為水/油/ 水乳液。油可有助於穩定調配物且進一步充當佐劑或增強 劑。適合油包括（但不限於）白油、公鴨油（Drake〇u)、角鯊 烷或角鯊烯，以及天然來源或合成來源之其他動物、植物 或礦物油。 另外，本發明之疫苗組合物可含有此項技術中可利用之 其他適合佐劑。該等佐劑可包括（例如）氫氧化鋁及磷酸鋁 以及其他金屬鹽。 其他賦形劑亦可包括於本發明之疫苗組合物中，其包括 :例如)界面活性劑或其他濕潤劑或調配助劑。界面活性劑 可包括脫水山梨糖醇單油酸酯（TWEEN®系列），以及氧= 乙埽/氧化丙稀喪段共聚物（pLUR〇Nlc⑧系列），以及此項 129209.doc -12- 200844236 ;二：利用之其他界面活性劑。視作穩定劑或防腐劑之 :5物亦可包括以發明之疫苗組合物中。該等化合 物包括（但不限於）諸如山梨糖醇、甘露糖醇、殿粉、斧 糖、糊精或葡萄糖及其類似物之碳水化合物，以及（例如） 防腐劑福馬林。 本發明之疫苗組合物亦可經調配為大體上不含外源水之 乾舞粉末形式’其隨後可在投與之前由最終使用者復水。 本表月亦包括對烏進行疫苗接種之方法。本發明之方法 包括向鳥投與本文中所述多價流感病毒疫苗組合物之任一 者（例如包括表1中列出之二價疫苗组合物之任_者）。在本 發明之某些實施例中’該鳥為雞、火雞、鵠子、焉它鳥、小 母雞、幼鴿、珠雞、雉雞、鵪鶉、鴨、鵝或鴯鷗。 投藥方法可由熟練技工選擇。舉例而言，可經由飲用 =、噴霧或滴眼劑將疫苗組合物投與畔化後之幼（幾天至 ^干週齡）鳥。本文中亦涵蓋印内（in叫投藥。舉例而 言’，常在約第18_19天對胚胎接種。其他方法亦在本發 明之乾臂内’其中本發明之疫苗組合物係根據可根據對引 起疾病之流感之載體的預期潛在暴露時間所測定之時程以 有效量非經腸、經皮下、經腹膜、經口 '經鼻内或由其他 可利用方式投與’較佳非經腸、更佳經肌肉内投與。 根據本發明所涵蓋之投藥方法，劑量通常在每隻動物約 0.25 mL至約2.〇mL、更佳每隻動物約〇 5 mL至約} 〇祉之 範圍内。因此，本文中涵蓋一種、兩種或兩種以上劑量。 在某些實施例中，本發明包括將本發明之多價疫苗組合物 129209.doc -13 200844236 在第一時間點投與動物（例如鳥）且隨後在第二後繼時間點 再次投與（例如加強疫苗接種）之疫苗接種方法。舉例而 =，該第一時間點可為動物之約第】至約第21天齡且第二 時間點可為動物之約第21至42天齡。 以下實例為說明性的，且並非限制本發明之方法及組合 物。熟習此項技術者鑒於本發明之揭示内容而明白的對分 子生物學及化學中通常遇到的多種條件及參數之其他適合 更改及改變係在本發明之精神及範疇内。 實例 實例1 可用於DIVA疫苗接種策略中之油佐劑滅活二價禽流感 疫苗之安全性及免疫原性 引言 A型禽流感（AI)病毒（特定言之帶有金球凝集素出及/或 Η7之禽流感病毒）在世界範圍内對於家禽養殖場及野生鳥 類係一重要威脅。由於高病原性H5m亞型之近期爆發， 所以權威人士推薦疫苗接種作為抗擊該疾病之手段，尤其 Μ疫田允許區为受感染動物與經疫苗接種動物時Α策 略）。 此實例證實含有低病原性H5N9及H7N4 AI病毒株之油佐 劑滅活二價疫苗組合物之安全性及免疫原性。此二價疫苗 組合物之主要優點之一為H5及H7血球凝集素亞型之存在 將提供對抗具有此等血球凝集素亞型之致病性病毒株之保 護。另外，N4神經胺酸酶亞型之存在（其在循環致病性病 129209.doc 14 200844236 毒株中具有低出現頻率）將促進使用（例如）DIVA策略對經 疫苗接種動物與受感染動物進行區分。 結果 此實例中所用的二價疫苗組合物含有病毒株H7N4(A/野 鴨 / 意大利/4810-79/04)及 H5N9(A/ck/意大利/22A/98)。該 等病毒株係根據標準調配技術於油乳液中調配。（例如參 見美國專利申請公開案第2006/0204976號）。 在單獨兩個時間點將二價疫苗組合物投與11隻不含特定 病原體（SPF)之白色來亨（leghorn)雞。第一疫苗接種發生在 第14天齡時，且第二疫苗接種發生在第35天齡（第一疫苗 接種後21天）時。在第35天齡時，自各雞取第一血樣。最 後，在第56天齡（第二疫苗接種後21天）時，自雞取出第二 血樣。此方案係概述於表2中。 表2 :實驗方案之概述 第14天齡 第35天齡 第56天齡 第一疫苗接種 第二疫苗接種 第一 jk樣 第二血樣 藉由血球凝集抑制（HI)技術來評估經疫苗接種動物之血 清學結果且將其概述於表3中。 129209.doc 15- 200844236 表3 : HI抗體效價 第一疫苗接種後21天 第二疫苗接種後21天 血清編號 H5N9 H7N4 H5N9 H7N4 15 2 8 32 128 16 64 64 128 128 17 256 128 128 128 18 8 16 128 64 19 64 64 64 256 20 256 64 128 256 22 128 256 128 256 24 32 32 128 128 25 64 128 64 128 26 64 64 64 256 27 128 128 128 256 幾何平均值 52.98 60.09 93.41 164.69 概要及結論 此實例證實調配於含油佐劑中之例示性H5N9+H7N4滅 活二價禽流感疫苗之安全性及免疫原性。在第一疫苗接種 後三週時，對於H5N9而言，平均HI抗體效價為52.98，且 對於H7N4而言，平均HI抗體效價為60.09。在加強疫苗投 與後三週時，對於H5N9而言，平均HI抗體效價為93.41， 且對於H7N4而言，平均HI抗體效價為165。另外，在二價 疫苗組合物投與後，未觀測到顯著不良局部或全身反應， 且亦未不利影響體重。 由於存在可用於區分經疫苗接種動物與感染（例如）H5N1 之動物之N4神經胺酸酶亞型，因此此實例中所用之滅活二 價H5N9+H7N4疫苗組合物將適用於DIVA策略疫苗接種活 動中。 實例2 滅活二價H5N9+H7N4疫苗組合物之功效 129209.doc -16- 200844236 在此實例中，評估二價禽流感疫苗組合物保護雞免受 H5N1及/或H7N1感染之能力。 與實例1中所述之疫苗組合物類似，將滅活H5N9及H7N4 AI病毒株調配於含油佐劑中。在兩週齡時用單一劑量之二 價疫苗調配物經肌肉内對20隻SPF雞進行疫苗接種。三週 後當雞五週齡時，對雞投與第二劑量之疫苗。將一組20隻 SPF雞維持作為未經疫苗接種之對照組。 在第二疫苗接種後，將10隻來自疫苗接種組之雞及10隻 來自未經疫苗接種對照組之雞用致病性H5N1病毒攻毒。 將剩餘10隻來自疫苗接種組之雞及剩餘10隻來自未經疫苗 接種對照組之雞用致病性H7N1病毒攻毒。對所有雞每日 監控H5N1及H7N1感染之血清學及臨床徵象。有效二價疫 苗應可保護疫苗接種雞免於出現H5N1及H7N1感染之血清 學及臨床徵象，而未經疫苗接種之攻毒動物應顯示顯著感 染徵象。 實例3 區分受感染動物與經疫苗接種動物 在此實例中，將用二價H5N9+H7N4疫苗組合物接種之 雞與未經疫苗接種之雞及感染致病性H5N1 AI病毒株之雞 進行區分。 與實例1中所述之疫苗組合物類似，將滅活H5N9及H7N4 AI病毒株於含油佐劑中調配。將40隻SPF雞分為四組，每 組各1 0隻雞。第一組未經疫苗接種且未經攻毒。第二組未 經疫苗接種且用H5N1之致病性病毒株攻毒。第三組用二 129209.doc •17· 200844236 價H5N9+H7N4疫苗組合物進行疫苗接種且未經攻毒。第 四組用二價H5N9+H7N4疫苗組合物進行疫苗接種且用 H5N1之致病性病毒株攻毒。可使用H7NH$為攻毒病毒株 來進行類似實驗。

自所有雞取血樣且藉由核酸雜交及/或PCR基技術（例 如’使用國際專利申請公開案第WO03/086453號中所揭示 之方法）來檢定N1編碼基因及N4編碼基因之存在。第一組 中之雞（未經疫苗接種且未經攻毒）應測試對兩種神經胺酸 酶亞型呈陰性。第二組中之雞（未經疫苗接種且經攻毒）應 測試對N1神經胺酸酶亞型呈陽性，但應測試對N4神經胺 酸酶亞型呈陰性。第三組中之雞（經疫苗接種且未經攻毒） 應測試對N4神經胺酸酶亞型呈陽性，但應測試對m神經 胺酸酶亞型呈陰性。最後，帛四組中之雞(經疫苗接種： 經攻毒）應測試對N1與N4神經胺酸酶亞型呈陽性。亦可進 行一組平行實驗，其中檢定（例如藉由核酸雜交或 編碼基因之存在以鑑別經疫苗接種動物。 因此’本發明之二價疫苗組合物應提供對抗致病性乂病 毒株（例如，Η5Ν1·7Ν1)之充分保護，而同時允許農民 府β員區为受感染動物與經疫苗接種動物。 二官出於清楚理解之目的已藉由說明及實例對前述發明 ^細描逑，但本發明並不限於所揭示之特定實_， 蓋在由隨附申請專利範圍所界定之本發明之精神 及祀寿内之所有改變及更改。 本說明書中所提及之所有公開案及專利指示熟習本發明 129209.doc 200844236 所屬領域之技術者之技能水平。所有公開案及專利係以引 用的方式併入本文中，該引用的程度就如同已特定及個別 地將各個別公開案或專利申請案以引用的方式併入一般。

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Claims (1)

1. 200844236 十、申請專利範圍： 1 · 一種疫苗組合物，其包含第一滅活禽流感病毒株及第二 滅活禽流感病毒株， 其中該第一病毒株具有H5血球凝集素亞型且該第二病 毒株具有H7jk球凝集素亞型；且 % 其中至少該第一病毒株或該第二病毒株具有N4神經胺 酸酶亞型，且其中該第一病毒株及該第二病毒株均不具 有N1神經胺酸酶亞型。 • 2·如請求項1之疫苗組合物，其中該第一病毒株具有N4神 經胺酸酶亞型。 3 ·如明求項1之疫苗組合物，其中該第二病毒株具有N4神 經胺酸酶亞型。 4·如叫求項1之疫苗組合物，其中該第一病毒株與該第二 病毒株均具有N4神經胺酸酶亞型。 5 ·如明求項1之疫苗組合物，其中該第一病毒株具有N9神 胺酸_亞型且該第二病毒株具有N4神經胺酸酶亞型。 _ 6.如明求項1之疫苗組合物，其中該第一病毒株具有N4神 經胺酸酶亞型且該第二病毒株具有N9神經胺酸酶亞型。 , 7·如請求項1至6中任一項之疫苗組合物，其進一步包含水 性載劑。 8 ·如明求項7之疫苗組合物，其中該水性載劑為水、鹽水 或磷酸鹽緩衝液。 9·如請求項〗至6中任一項之疫苗組合物，其進一步包含含 油乳液。 129209.doc 200844236 * 1 ο. 2明求項9之疫苗組合物，其中該含油乳液為水包油乳 η.:請求項9之疫苗組合物，其中該含油乳液為油包水乳 12· 一種對烏進行疫苗接種之μ，财法包 如請求们至u中任一項之疫苗組合物。 鳥心與 13.如明求項12之方法，其中該鳥為家禽動物。 1 4 ·如請求項} 3 $古 貝13之方法，其中該家禽動物為雞、 璃子、小母雞、幼鵠、珠雞、雉雞 一:: 或鴯鷗。 1 碼、鵝 15. 如。月求項12之方法，其中該家禽動物為雞。 16. -種對鳥進行疫苗接種之方法該方 點向該鳥投盥浐奸知入札把 3在弟—時間 盘〜 物，接著在第二時間點向〜. ^ 其中該疫田組合物係如請求⑹至" 中任一項所定義。 啰1主11 17·如請求項16之方法，其中該 21天齡，且1 士 捋間點為該鳥之第1至 " 其中該第二時間點為該鳥之楚^ s 18. 如請求項17之方法，其中該第 芯天齡。 齡。 夺間點為該鳥之第14天 19. 如請求項17之方法，其中誃 齡。 八" 守間點為該鳥之第35天 129209.doc 200844236 七、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：（無） (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無）

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