TW200836749A - Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof - Google Patents

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200836749 九、發明說明： 發明說明 本申睛案主張2〇〇7年1月9日申請之美國臨時專利申請 案第60/879,344號的權利，請臨時專利申請案在此併入本案 5 以為參考資料。 v

【潑^明所^屬控:掏域^】 發明領域 本申請案係有關於組合治療物，其包括曲西立濱及相 關化合物與硼替佐米及其衍生物類似物以及適於治療與預 10防腫瘤、癌、及與異常細胞增生有關之其它病症的具有減 少毒之組成物。 發明背景 癌為細胞之異常生長。儘管空間之限制、藉其它細胞 Μ而分享之營養物或身體發出中止再生之信號^細胞仍: 速再生。癌細胞之形狀通常不同於健康細胞，其功用並不 正常且可擴散入身體許多部位内。組織之異常生長，稱為 腫瘤，為可未受控地生長且分裂之細胞群。腫瘤可以^良 性(非癌性）或惡性(癌性）。良性腫瘤傾向緩慢生長且不會把 散。惡性腫瘤可快迷生長、可侵襲並破壞附近正常组^ 並可擴散遍及全身。 it ’ 癌之分類係根據其發源之流體或組織或 形成之身錄。❹卜—蝴咖。射 概括性種類：癌瘤、肉瘤、淋巴瘤、白丘病、及㈣瘤， 5 200836749 5 10 &些種類表tf销之組織及錢分類系統。癌瘤為在身㉒ 組織’亦即覆蓋器宫、腺或身體構造之表面或作為彼等: «的上歧財所發現之癌。例如胃餘之癌稱為癌 瘤。許多癌瘤會影響涉及分泌之器官或腺，諸如產生母乳 之乳腺。癌瘤為所有癌病例之細至9()%的主因。肉瘤為 自結缔組織，諸如軟骨、脂肪、肌肉、腱、及骨，生長之 惡性腫瘤。最常見之肉瘤，在骨上之腫瘤，通常存在^年 輕人。肉瘤之實例包括骨肉瘤（骨)及軟骨肉瘤（軟骨）。淋巴 瘤係指起源於淋巴細胞之結或腺（其功用為產生白灰球並 匕體流)或n官(諸如腦及乳房）的癌。淋巴瘤分成兩類： 萑。並氏淋巴瘤（Hodgkin’s lymph〇ma)及非霍吉金氏淋巴 瘤。白血病，亦稱為血癌，為會阻止骨髓產生正常紅血球 及白血球與血小板之骨髓癌。需要白血球以抵抗感染。需 要紅血球以預防貧血。血小板可防止身體輕易地瘀傷及出 血。白血病之實例包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白 血病、急性淋巴細胞白血病、及慢性淋巴細胞白血病。該 等名詞“骨髓性，，及“淋巴細胞的，，表示所涉及的細胞類型。 最後，骨髓瘤係生長在骨髓之漿細胞内。在某些情況下， 該等骨髓瘤細胞可聚集在一骨内並形成單一腫瘤，亦即装 細胞瘤。然而，在其它情況中，該等骨髓瘤細胞可聚集在 許多骨内，藉此形成骨腫瘤，亦稱為多發生骨髓瘤。 腫瘤誘發及演變通常為該腫瘤細胞基因組之積聚性變 化的結果。此等變化玎包括細胞生長抑制基因或腫瘤抑制 基因之失活，以及細胞生長促進基因或致癌基因之活化。 20 200836749 至今在動物模式中已確認許多經活化之細胞致癌基因，然 而，僅少數之這些基因已證明與人類癌症有關（Weinberg) 專 k，19系9 Oncogenes and the Molecular Origins of Cancer Cold Spring Harbor, NY? Stanbridge and Nowell 1990 Cell 63 5 867-874, Godwin等人，1992 Oncogenes and antioncogenes in gynecological malignancies. In WJ Hoskins, CA Perez and RC Young (eds)? Gynecological oncology '.principles and pp 87-116，Lippincott，Philadelphia)。致癌基因在 人類癌症中之活化可起因於，諸如增加的基因複製數或結 10 構變化等之因素。這些因素可導致許多細胞作用，例如其 可導致基因產物之過度表現。可經由基因過度表現而活化 涉及人類癌症之幾種致癌基因。 明顯可知癌細胞所具有之連續基因異常會導致管理正 常細胞增生、分化及按程序之細胞死亡的調節信號轉導電 15 路之缺損（Hanahan，D· and R.A. Weinberg, Cell, 2000. 100(1):ρ· 57-700)。其接著導致細胞生理學之基本缺損，這 等缺損會導致惡性腫瘤。這些缺損包括：a)生長信號之自 足（亦即生長因子受體酪胺酸激酸，諸如EGFR之過度表現 及下游信號轉導路徑，諸如Ras/Raf/Mek/Erk %及 20 Ras/PI3K/Akt之異常活化），b)對抗生長信號之抗性（亦即 TGFB及其受體之低表現性），c)逃避細胞凋亡（亦即原細胞 凋亡p53之損失；原存活Bcl-2之過度表現；存活路徑，諸如 藉P13K/Akt而媒介之存活路徑之高度活化，d)持續血管生 成（亦即VEGF之高分泌量）及f)組織侵入及轉移（亦即細胞 7 200836749 外蛋白酶及原轉移性整合素）(沿的1^11，0.&11(1以人 Weinberg，Cell，2000· 100(1):ρ· 57-700) 〇 受體酪胺酸激酶，諸如EGFR、ErbB2、VERFR及似胰 島素生長因子I受體(IGF-1R)、密切地涉及許多人類癌症， 5 其包括結腸直腸癌、胰臟癌、乳癌及卵巢癌之形成 (Khaleghpour 等人，2004，Carcinogenesis，25:241-8·， Sekharam等人，2003, Cancer Res，63:7708-16)。配位體，諸 如EGF、VEGF及IGF-1，結合至彼等之受體可促進内因性 酪胺酸激酶活性之刺激作用、特異性酪胺酸在該等受體之 10 胞體漿結構域内之自體磷酸化作用及可引發各種複雜信號 轉導路徑之傳訊蛋白質的募集（Olayioye等人，2000, Embo J 19:3159-3167, Porter等人，1998, Oncogene 17:1343-52)。其 接著會導致許多腫瘤存活性及致腫瘤性路徑，諸如該等 Ras/Raf/Mek/Erk %、JAK/STAT3 及 PI3K/Akt路徑，之活 15 性。雖然所有3種路徑業經涉及結腸、胰臟、乳房及卵巢之 腫瘤生成，但是藉Akt而媒介之此等路徑業經證明在惡性變 性，其包括細胞增生、抗細胞凋亡/存活、侵入及轉移與血 管生成之許多步驟中具重要性(Datta等人，1999, Genes Dev， 13:2905-2927)。 20 Akt為絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶(亦稱為PKB)，其具有 3個家族成員：AkU、Akt2及Akt3。以生長或存活因子刺激 細胞可募集脂質激酶，磷酸肌醇-3-OH-激酶(PI3K)，其可將 磷酸肌醇-4,5-二磷酸酯（PIP2)磷酸化以形成PIP3，其可幫細 胞膜補充Akt，於其中可藉在Thr3 0 8及S er47 3 (Akt 1)、Thr3 0 8 25 及Ser474(Akt2)及Thr308與Ser472(Akt3)進行之磷酸化反應 200836749 而活化Akt(Datta，S.R·等人 Genes Dev，1999，13(22):ρ· 2905-27)。因此，PI3K可藉將PIP2磷酸化並轉化成PIP3而活 化Akt。該磷酸酶，ΡΤΕΝ，可將ΡΙΡ3去磷酸化以形成ΡΙΡ2， 因此可防止Akt活化。 5 大多數人類癌症含有高度活化之Akt(Datta等人，1999,

Genes Dev 13:2905-2927; Bellacosa等人，1995· Int J Cancer， 64:280-2855; Sun等人，2001，Am J Pathol，159:431-437)。 更詳細地，分別在57%、32%、27%及36%之人類結腸直腸 癌、胰臟癌、乳癌及卵巢癌中，Akt具過度表現性及/或高 10 度活性（Roy 等人，2002，Carcinogenesis，23:201-205; Altomare等人，2003, J Cell Biochem，88:470·476; Sim等 人，2001，Cancer Res 61:5985-5991; Stal等人，2003, Breast Cancer 5:R37-R44; Cheng等人，1992, Proc Natl Acad Sci USA, 89:9267-9271; Yuan 等人，2000，Oncogene， 15 19:2324-2330)。Art之高度活化作用係起因於Akt本身之擴 增及/或過度表現以及Akt上游之基因改變，其包括受體酪 胺酸激酶及/或彼等之配位體的過度表現（Khaleghpour等 人，2004, Carcinogenesis，25:241-248; Sekharam等人，2003, Cancer Res，63:7708-7716; Cohen等人，1998，Biochem Soc 20 Symp，63:199-210; Muller等人，1998，Biochem Soc Symp， 63:149-157; Miller 等人，1995，J Virol，69:4390-4398; Slamon等人，1987，Science，235:177-182; Andmlis等人， 1998, J Clin Oncol，16:1340-1349)及該磷酸酶PTEN之刪 除。已藉證明Akt之異位表現性可誘發惡性變形並增進細胞 25 存活（Sun等人，2001，Am J Pathol，159:431-437; Cheng等 9 200836749 人，1997, Oncogene, 14:2793-2801)及Akt路徑之分裂可抑制 細胞生長並誘發細胞〉周亡（Jetzt等人，2003，Cancer Res， 63:6697-6706)而臨床前說明Akt涉及腫瘤形成之概念驗證。 癌及相關疾病之現行治療法的有效性有限且具有許多 5 嚴重的非預期副作用。儘管許多抗癌藥物已證明具臨床效 力，嚴重的全身性毒性通常會中止有成功希望之化療劑的 臨床研發。另外，受體酪胺酸激酶(諸如EGFR)及彼等之配 位體(諸如IGF-1)之過度表現、PTEN之Akt過度表現及/或損 失（其皆會導致Akt之高度活化)與癌患者之不良預後、對化 10 療之抗性及縮短之存活期有關。現行研究策略強調對具低 危險性之有效治療方法的探求。 因此，曲西立濱化合物或其衍生物及侧替佐米或其鹽 或衍生物可作為用於治療腫瘤、癌、及異常細胞增生之潛 在組合治療物。 15 明内:5§1】 發明概要 本發明提供治療患者之腫瘤或癌並可限制全身性毒性 之含曲西立濱、曲西立濱磷酸鹽及相關化合物與硼替佐米 及其衍生物的新穎治療方案。本發明係基材於以下發現： 20 可過度表現Akt激酶之腫瘤或癌對於TCN及相關化合物之 細胞毒殺性作用與使用硼替佐米鹽或其衍生物及其衍生物 之組合所產生之增效作用特別敏感。與先前技藝及經驗不 同’本發明者已確定成功使用曲西立濱與硼替佐米及其衍 生物以治療腫瘤及癌之方法，其係藉以下之一或彼等之組 10 200836749 合：⑴對曲西立濱與硼替佐米及其鹽或衍生物顯示增強的 敏感性之患者投予該等藥物；⑼使用可以使該等藥物之毒 性減至最小但仍能顯示功效的所述劑量；或⑽使用可以使 該等藥物之毒性減至最小的所述投藥方案。 在本發明-闡明實施例中，本發明涵蓋一組成物，其 包括： ⑴式I-IV化合物：

11 200836749 a中尺2、R3’及I’各獨立為氫、可選擇性經取代之磷 g夂二或鹽（其包括單·、二或三碟酸鹽或安定化攝酉复鹽 則樂酸基(其包括低碳酸基）；烧基(其包括低破烧基）；酿 胺' %_旨’其包括絲衫烧基；磺喊，其包括甲續 -盔土 ’基其中該苯基可選擇性經一或多種如，例如在 文中所予之芳基的定義中所述之取代基取代；可選擇性經 取代之芳續醯基；脂質，其包㈣脂；胺基酸，·碳水化合 物，月太，或膽固醇；或活體内可得到其中R2,、R3,及R5,獨

立為Η或單-十_ L 10 脫離基； 一或二-磷酸鹽之化合物的其它藥學上可接受 八中R及R獨立為氫、可選擇性經取代之磷酸鹽；醯 基包括低碳酸基）；_、烧基(其包括低破烧基）；芳香 &水氧化烯煙’諸如聚乙三醇、可選擇性經取代之芳石黃酿 基，知貝，其包括磷脂；胺基酸；碳水化合物；肽；或膽 15固醇，或其它藥學上可接受之脫離基。在一實施例中，該 化合物係以5’-磷酸醚脂質或5，_醚脂質投予；

Ri及R2各獨立為Η、可選擇性經取代之直鏈、分支鏈或 環系燒基(其包括低礙烷基）、烯基或炔基、c〇-烧基、c〇_ 烯基、CO-炔基、CO-芳基或雜芳基、co_烧氧烷基、c〇_ 20芳氧烷基、CO-取代之芳基、磺醯基、烷磺醯基、芳磺醯基、 芳烧續酿基； (ϋ)式V化合物.、： 12 200836749

其中 R1 ' R2、R3、R4、及尺5各獨立為Η、可選擇性鹵化、經 取代直鍵、分支鏈或環系烷基(其包括低碳烷基）、烷氧基、 5稀基或块基、芳基、CO·烧基、CO-烯基、CO-炔基、CO- 芳基或雜芳基、CO-烷氧烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代 之芳基、磺醯基、烷磺醯基、芳磺醯基、芳烷磺醯基； 及 (iii)藥學上可接受載劑。 10 在本發明另一闡明實施例中，本發明涵蓋一包括 TCN、TCN-P、TCN-PM或彼等之、组合及石朋替佐米或其鹽或 衍生物之組成物。 在另-闡明實施例中，本發明涵蓋治療哺乳動物之腫 瘤或癌的方法，其包括對該哺乳動物投予有效量之包含以 15 下化合物的組成物： ⑴式I-IV化合物·· 13 200836749

5 其中R2’、r3’及r5’各獨立為氫、可選擇性經取代之磷 酸鹽或膦酸鹽（其包括單-、二-或三磷酸鹽或安定化磷酸鹽 前藥）；醯基(其包括低碳醯基）；烷基(其包括低碳烷基）；醯 胺、續酸S旨’其包括烧基或芳烧基；績酿基’其包括甲績 醯基及苄基，其中該苯基可選擇性經一或多種如，例如在 10 文中所予之芳基的定義中所述之取代基取代；可選擇性經 取代之芳磺醯基；脂質，其包括磷脂；胺基酸；碳水化合 14 200836749 物，肤，或膽固醇，或活體内可得到其中厌2，、r3，及R5,獨 立為Η或單-、二-或三-麟酸鹽之化合物的其它藥學上可接受 脫離基； 其中R及Ry獨立為氫、可選擇性經取代之磷酸鹽丨醯 5基(其包括低碳醯基）；醯胺、烷基(其包括低碳烷基芳香 族聚氧化烯烴，諸如聚乙二醇、可選擇性經取代之芳石黃驢 基；脂質，其包括磷脂；胺基酸；碳水化合物；狀；或膽 固醇；或其它藥學上可接受之脫離基。在一實施例中，該 化合物係以5，-鱗酸醚脂質或5，_喊脂質投予； 1〇 Rl&R2各獨立W、可選擇性經取代之直鏈、分支鏈或 環系烷基(其包括低碳烷基）、烯基或炔基、c〇-烷基、c〇_ 烯基、CQ_炔基、CO.芳基或雜芳基、Cq_烧氧烧基、c〇_ f氧燒基、CO-取代之芳基、石_基、烧磺醯基、芳磺醯基、 芳燒續酸基； 15 及 (11)式\^化合物：

—N

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:棚 其中

Ri、I、r3、r4、及R5各獨立為Ή、可選擇性鹵化、經取代 15 200836749 直鏈、分支鏈或環系烧基(其包括低碳烧基）、烧氧基、烯基 或快基、芳基、CO-炫基、CO-烯基、CO-炔基、CO-芳基 或雜芳基、CO-烷氧烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代之芳 基、續醯基、院績SS基、芳磺醯基、芳烧磺醯基。 5 在另一闡明實施例中，本發明涵蓋一種治療哺乳動物 之腫瘤或癌的方法，其包括對該哺乳動物投予有效量之包 含TCN、TCN-P、TCN-PM或彼等之組合及硼替佐米或其鹽 或衍生物的組成物。 可用以治療腫瘤或癌之方法特別受TCN、TCN-P、 10 TCN-PM及/或相關化合物之毒性作用的影響。在另一實施 例中，係提供用於治療哺乳動物，特別為人類之腫瘤的方 法，其包括⑴自該腫瘤獲得生物學試樣；（ii)測定該腫瘤是 否過度表現Akt激酶，及(iii)使用如文中所述之曲西立濱、 曲西立濱磷酸鹽或相關化合物及硼替佐米或其鹽或衍生物 15 之組合以治療該過度表現Akt激酶之腫瘤。在另一實施例 中，可例如藉使用能檢測該磷酸化形式之抗體而檢定該腫 瘤或癌所含有之磷酸化A k t激酶以測定A k t激酶表現性之程 度。在另一實施例中，可藉檢定得自患者之腫瘤或癌細胞 並與對照組織之程度比較而測定A k t表現性的程度。在特定 20 實施例中，與該對照組織比較，該Akt在該癌試樣中之過声 表現性為至少2、2.5、3或5倍。在特定實施例中，該過^ 表現性Akt激酶可以是高度活性且磷酸化之Akt激酶。 在本發明之另一方面中，係提供可限制TCN及相關化 合物之毒性副作用的給藥方案。在另一實施例中，此等 16 200836749 藥方案可以使毒性副作用減至最低或將其去除，該等毒性 副作用包括，但不限於：肝細胞毒害性、血小板減少症、 高血糖症、腹瀉、胃炎及/或發熱。在另一實施例中，TCN、 TCN-P、TCN-PM或相關化合物之投藥在至少15、20或25% 5 患者中可得到至少一部份，諸如至少15、20或30%或完全之 活體内反應。 在另一實施例中，係提供一種藉根據給藥計劃而對業 經診斷患有腫瘤之患者投予有效量之TCN、TCN-P、 TCN-PM或相關化合物與硼替佐米及其衍生物以治療該患 10 者的方法，該給藥計劃包括約每週一次投予該等藥物，費 時約3週，繼而在一週期間内並未投予該等藥物。在另一實 施例中，係提供藉每週一次對患者各施行10毫克/米2或較少 之TCN、TCN-P、TCN-PM或相關化合物與替佐米及其衍生 物的給藥方案而治療該患者之腫瘤或癌的方法。在另一實 15 施例中，可以在短時間内，例如約5、10或15分鐘，以單一 大量劑量投予該曲西立濱化合物與硼替佐米及其衍生物。 在另外實施例中，係提供其中該曲西立濱化合物與硼替佐 米及其衍生物藉連續輸注而投予，費時至少24、48、72、 96或120小時的給藥計劃。在特定實施例中，該連續投藥可 20 重複至少每週一次、每兩週一次及/或每月一次。在其它實 施例中，可以至少每3週一次投予該曲西立濱化合物與硼替 佐米及其衍生物。在另外實施例中，可以至少每週一次投 予該等化合物，費時至少2、3、4或5天。 在另外實施例中，可對患者投予如文中揭示之曲西立 17 200836749 濱化合物與_佐米及其魅物，其奸量能有效導致腫 瘤消退。該曲西域化合物與硼替㈣及其衍生物之投藥 可以在至少15至30%該等患者中得到至少部份，諸如至少 15、20或30%或完全活體内反應。在特定實施例中，可對 5 10 15 患者投予至少2、5、1G、^，、如或如毫克/^之文中所 揭示的曲西立濱化合物與萄佐米及其衍生物。可根據文 中揭示之任何治療方案而進行該曲西立濱化合物_替佐 米及其衍生物之投藥。在特定實施例中，該給藥方案可包 括投予小於20毫克/米2之曲社濱與雨佐米及其衍生 物。在-實施例中，可每週一次投予小於1〇毫克/米2之曲西 立濱化合物與_佐米及其衍生物。在另外實施例中，可 對患者投㈣量小於2毫克/米2、5毫克/米2、崎克/米2、 及/或15宅克/米之曲西立濱化合物與硼替佐米及其衍生 物。在另-實施射’可藉連續輪注而對患者投予小於1〇 毫克/米2之劑量，費時至少5天。在特定實施例中，如文中 揭示之曲西立濱化合物與硼替佐米及其衍生物可用於治療胰 腺癌、攝護腺癌、結腸直腸癌及/或卵巢癌。 在另一實施例中’本發明之曲西立濱化合物與爛替佐 米及其衍生物及/或治療方案可用以預防及/或治療癌瘤、肉 20 瘤、淋巴瘤、白血病、及/或骨髓:瘤。在本發明其它實施例 中，可使用該曲西立濱化合物與硼替佐米及其衍生物以治 療固體腫瘤。在又另外實施例中，文中所揭示之曲西立濱 化合物與硼替佐米及其衍生物以及組成物可用於治療腫瘤 或癌，諸如但不限於以下器官或組織之癌：乳房、攝護腺、 18 200836749 11"ΓΓ腸(其包純祕於結腸纽）、泌尿“、膀胱、 甲：：金:淋巴瘤、黑色素瘤、腎臟、腎上腺、胰臟、咽、 二·^ %、及/或印巢。在-特定實施例中，該曲西 ^匕合物與硼替佐米及其衍生物可用於治療胰腺癌、乳 !所1腸直腸癌及/切巢癌。在本發明另外實施例中，文 =之曲西立濱化合物與辨佐米及其衍生物可用以

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成相關疾病。在狀實施例中，係提供經由連 、·貝輸注曲西立濱化合物_替佐米及其衍生物，費時至少 Γ，4„8 7-2或9^小時而治療白企病之方法。在其它實施例 可重複連績輸注，例如每2、3或4週至少一次。 Γ特定實施财，健㈣於轉魅之顧，癌、 U細胞增生相關之其它病症的方法，該方法包括對該 宿域予有效量之可選擇性㈣藥學上可接受載劑的曲西 立濱化合物與硼替佐米及其衍生物。 在本U方面中，遠曲西立濱化合物與石朋替佐米及 其衍生物錢組成物可以—起料且可形成該相同組成物 之一部份，或以適於在相同時_不同_下進行投藥之 不同組成物形式提供。 在其它實施例中，文令揭示之曲西立濱化合物無替 20佐米及其衍生物可用以治療對—或多種已知抗癌藥物具抗 藥性之腫瘤或癌，其包括文中揭示之侧或癌及化合物的 實施例。在-實施例中，文中揭示之曲西立濱化合物與删 替佐米及其衍生物的投予量能有效治療患者抗藥性腫瘤或 癌之患者’該抗藥性腫瘤或癌為，例如多藥抗藥性腫瘤或 19 200836749 癌，其包括，但不限於：僅抗紫杉紛、抗雷帕徽素、抗泰 莫西芬（tamoxifen)、抗順鉑、及/或抗吉非替尼 (gefitinib)(iressa)之腫瘤或癌。 在特定實施例中，係提供一種方法，其包括對需要治 5療之但主投予有效量之文中揭示的曲西立濱化合物與侧替 佐米及其素衍生物、或包括其含量能有效治療宿主之腫 瘤、癌、及異常細胞增生相關之其它病症的曲西立濱化合 物及硼替佐米及其衍生物之藥學組成物。 口 在另一實施例中，係提供一種用於治療腫瘤或癌之方 10法，其包括對需要治療之個體投予有效量之文中揭示的化 合物或其鹽、異構物、前藥或酯，其中該癌為，例如癌瘤、 肉瘤、淋巴癌、白血病或骨髓瘤。該化合物或其鹽、異構 物、前藥或酯可選擇性以包含合適載劑(諸如水)之藥學上可 接受組成物提供，該組成物經調製適於以所欲投藥方°、 15需要其治療之個體投予。該化合物可選擇性與至少〜予 外 治療劑一起或輪流投予以治療腫瘤或癌。 本發明之範圍亦包括可選擇性在藥學上可接受栽劑 之文中揭示的化合物或其鹽、前藥或酿在治療腫瘤或=中 用途，及可選擇性在藥學上可接受載劑中之文中揭示的之 20西立濱化合物與硼替佐米及其衍生物或其鹽、前藥或 、自崔 製備用於治療癌或腫瘤之藥物的用途。 圖式簡單說明 第1圖係說明API-2(曲西立濱）作為得自NCI多樣化、 子庫(Diversity Set)之Akt抑制劑的適合物之鑑定。第1八刀 20 200836749 係闡明API-2(曲西立濱）之化學結構。第⑴圖係說明Αρμ2 抑制ΑΚΤ2在經ΑΚΤ2轉形之ΝΙΗ3Τ3細胞中的磷酸化程 序。以ΑΡΙ-2(1μΜ)處理經野生型ΑΚΤ2轉形之νιη3Τ^ 胞，費時指定時間，並使用抗磷酸化Akt_T3〇8及·S473抗體 5 (最上面的一組及中間組）進行免疫墨點分析。最下面的一組 頒示總AKT2之表現性。在第ic圖中，顯示api-2可抑制Akt 之3種變異體。使HEK293細胞經HA-Aktl、-AKT2及-AKT3 轉移感染並在EGF刺激前經apl2(1 μΜ)或渥曼青黴素 (wortm腿in)(15—)處理，使該等細胞經溶解並經抗ΗΑ抗 1〇體免疫沈澱。使免疫沈澱物進行活體外激酶檢定（上)並使用 抗磷酸化Akt-T308(下)抗體進行免疫墨點分析。中間的一組 顯示經轉移感染之Aktl，AKT2及AKT3的表現性。第Π)圖 係闡明API-2並不能活體外抑制Akt。進行原構性活性AKT2 重組型蛋白夤在含ΙμΜ AH-2(第3道)之激酶緩衝劑中的活 15 體外激酶檢定。 第2圖係說明API-2並不能抑制PI3K、PDK丨及緊密相關 之AGC激酶族成員。第2A圖係說明活體外PI3K激酶檢定。 使ΗΕΚ293細胞之血清不足並在EGF刺激前經Αρι_2(丨 或渥曼青黴素（15μΜ)處理，費時30分鐘。使用ρι_4_ρ作為 20基質使該等免疫沈澱物進行活體外激酶檢定。第2B圖係闇 明API-2對活體外PDK1活化作用（最上面的一組)之影響，實 心圓表示藉API-2而進行之抑制作用。空心圓表示藉正對照 物星形孢菌素(stamOsporine)，其係為有效的PDK1抑制劑 (IC50=5nM)，而進行之抑制作用。最下面的一組為妒 21 200836749

Myc_PDK4轉移感染並在EGF刺激前經渥曼青黴素或API-2 處理之HEK293細胞的免疫墨點分析。以指定抗體檢測該等 免疫墨點法。第2C圖係闡明在經API-2或非選擇性PKC抑制 劑Ro31 - 8220處理後使用抗磷酸化PKC α T638(上）及總成 5 PKCa (下）抗體進行PKCa之磷酸化程度的免疫墨點分 析。第2D圖表示活體外SGK激酶檢定。使HEK293細胞經 HA-SGK轉移感染並在EGF刺激前經API-2或渥曼青黴素處 理。使用MBP作為基質（上）以HA_SGK免疫沈澱物進行活體 外激酶檢定。最下面的一組表示經轉移感染之HA-SGK的表 10 現性。第2E圖係闡明PKA激酶檢定之結果。在含指定抑制 劑(API-2或AKAI)及基質，肯普肽(Kemptide)之ADB緩衝劑 (Upstate Biotechnology Inc)中培育經免疫純化之PKA。將該 激酶活性定量。第2F圖係表示西方墨點法。以API-2處理 OVCAR3細胞，費時指定時間。以指定之抗磷酸抗體（第1 15 至4組)及抗肌動蛋白抗體（下）進行細胞溶解物之免疫墨點。 第3圖係說明API-2可抑制Akt活性及細胞生長且可誘 發具有高Akt之人類癌細胞的細胞凋亡。第3A圖為西方墨點 法，在經API-2處理後，在指定之人類癌細胞株内以抗磷酸 化Akt-T308抗體檢測Akt之磷酸化程度。再以抗-總Akt抗體 20 (最下面的一組)探測該等墨點法。第3B圖係表示細胞增生 檢定。以不同劑量之API-2處理圖中所示之細胞株，費時24 時及48小時，然後經CellTiter 96細胞增生檢定套組 (Promega)分析。第3C圖提供細胞凋亡分析。以API-2處理 細胞並經膜聯蛋白（annexin)V及PI染色，然後經FACScan分析。 22 200836749 第4圖表示API-2可抑制Akt之下游目標並在小鼠異種 移殖物中之具高Akt之癌細胞株内顯示抗腫瘤活體。第4A 圖係說明API-2可抑制馬铃薯球蛋白（tuberin)、Bad、AFX及 GSK-3/5之Akt磷酸化反應。在經API-2處理後，溶解OVAR3 5 細胞並經指定之抗體免疫墨點。第4B圖表示API-2可抑制腫 瘤生長。將腫瘤細胞皮下注射入左側具低Akt細胞含量而右 側具高Akt細胞含量之裸鼠體内。當腫瘤達約100至150毫米 3之平均大小時，以媒劑或1毫克/公斤/天之API-2處理這些 動物。各測定值代表10個腫瘤之平均值。第4C圖係闡明經 10 API·2或媒劑（對照物）處理之具OVCAR3 (右）及OVCAR5(左) 異種移殖物的小鼠之圖解。第4D圖表示於實驗結束時之腫 瘤大小（下）及重量（上)。在第4E圖中，在經處理(T3及T4)及 未經處理（T1及T2)之OVCAR-3-衍生之腫瘤内使用抗磷酸 化Akt_S473(上）及抗AKT2(下）抗體進行腫瘤溶解產物的免 15 疫墨點分析。 第5圖表示API-2(曲西立濱）可抑制活體外激酶活性。在 含磷脂醯肌醇-3,4,5-P3(PIP3)、API-2及組織蛋白作為基質 之激酶緩衝劑中以PDK1及Akt之重組型進行活體外激酶檢 定。30分鐘培育後，藉SDS-PAGE而分離該等分應物並曝露 20 在薄膜中。 第6a至c圖提供人類Aktl之mRNA及胺基酸序列，亦記 錄限制酶位置。 第7a至d圖提供人類Akt2之mRNA及胺基酸序列，亦記 錄限制酶位置。 23 200836749 第8a至C圖提供人類Akt3之mRNA及胺基酸序列，亦記 錄限制酶位置。 第9圖係表示硼替佐米可協同性增強API-2(TCN)對該 等存活骨髓瘤細胞之影響。使H929細胞(所衍生之多發性骨 5 髓瘤）僅或在ΙΟμΜ ADI-2存在下經0、2.5、5、10、20或40nM 硼替佐米處理或僅經0、2.5、5、10、20或4(^1\/[八01-2處理。 校準並圖解細胞存活率（第9A圖）。使U266細胞(所衍生之多 發性骨髓瘤）僅或在ΙΟηΜ API-2存在下經0、2.5、5、10、20 或40μΜ ADI-2處理或僅經〇、2.5、5、10、20或40nM硼替 10 佐米處理。校準並圖解細胞存活率（第9B圖）。 第10圖係表示硼替佐米及API-2(TCN)對包膜細胞淋巴 瘤細胞之協同性影響。使Jeko-Ι細胞（所衍生之包膜細胞淋 巴瘤）僅或在5μΜ API-2存在下經〇、2.5、5、1〇、20、40或 801^硼替佐米處理或經0、1.25、2.5、5、10、20或4(^]^1八？1_2 15 處理。校準並圖解細胞存活率。 【實施方式3 較佳實施例之詳細說明 與先前技藝及經驗不同，本發明者已確定成功使用曲 西立濱化合物與硼替佐米及其衍生物之組合以治療腫瘤及 2〇癌的方法，其係藉以下之一或彼等之組合：⑴僅對根據下 述診斷性試驗之曲西立濱化合物及/或硼替佐米及其衍生 物呈現增強敏感性的患者投予曲西立濱與硼替佐米及其衍 生物；（ii)使用可以使該曲西立濱化合物及/或硼替佐米及其 衍生物之毒性減至最低但仍具有功效之所述劑量；或(m) 24 200836749 使用可以使該曲西立濱化合物及/或硼替佐米及其衍生物 之毒性減至最低的所述給藥方案。 定義 如文中使用，該名詞“本發明化合物”係指式ι-ν化合物 - 5 及彼等之組合。 如文中使用，該名詞“癌”及“癌性的”係指或描述典型 上患有未經控制之細胞生長（亦即增生性病症）特性之哺乳 動物的生理狀況。此等增生性病症之實例包括癌，諸如癌 ^ 瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤、及白血病；以及文中所述 10 之其它癌。此等癌之更特定實例包括乳癌、攝護腺癌、結 腸癌、鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、 胰臟癌、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌（例如肝癌瘤）、膀胱癌、 結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臟癌、及甲狀腺癌。 癌之其它非限制性實例為基底細胞癌瘤；膽道癌；骨 15 癌；腦及CNS癌；賊毛膜癌；結締組織癌；食道癌；眼癌； ^ ^ 頭及頸之癌；胃因性癌；上皮内贅瘤；喉癌；淋巴瘤，其 包括霍吉金氏及非霍吉金氏淋巴瘤；黑色素瘤；骨髓瘤； 神經胚細胞瘤；口腔癌（例如唇、舌、口、及咽）；胰臟癌； 視網膜胚細胞瘤；橫紋肌肉瘤；直腸癌；呼吸系統之癌； 20 肉瘤；皮膚癌；胃癌、睪丸癌；子宮癌；泌尿系統之癌； 以及其它癌瘤與肉瘤。 如文中使用，該名詞“腫瘤”係指所有贅生性細胞生長 及增生（不論惡性或良性）、及所有癌前及癌性的細胞與組 織。例如一特定癌之特徵可以是固體團塊瘤。若存在時， 25 200836749 該固體腫瘤團塊可以是原發性腫瘤團塊。原發性腫瘤團塊 係指起因於組織之正常細胞的轉形之在該組織内癌細胞的 生長。在大錄情況下’可藉囊腫之存在(其可經由目視或 觸診方法而發現）或藉該組織之形狀不規則性、結構或重量 5而鐘定該原發性腫瘤團塊。然而，某些原發性腫瘤並未能 觸知且僅可經由醫學影像技術，諸如χ射線(例如乳房放射 線攝影術），或藉針抽吸法而檢測。在早期檢測中較常使用 這些技術。在組織内進行癌細胞之分子性及表型分析通常 可證實該癌是否為該組織之内源性癌或該病灶是否起因於 10 自另一部位之轉移。 除非另有指定，如文中使用，該名詞“烧基，，包括具有， 例如(^至。24之飽和直鏈、分支鏈或環系、第一、第二或第 二烴且更明確地，包括甲基、三氟甲基、乙基、丙基、異 丙基、環丙基、丁基、異丁基、第三-丁基、戊基、環戊基、 15異戊基、新戊基、己基、異己基、環己基、環己基甲基、 3-甲基戊基、2,2_二甲基丁基、及2,3-二甲基丁基。該烷基 可選擇性經，例如以下之取代基取代：諸如鹵素(F、cl、 Br 或 1)(例如 Cf3、2_Br_乙基、ch2F、CH2Q、CH2CF3 或 CF2CF3)、羥基（例如ch2OH)、胺基（例如CH2NH2、 20 CH2NHCH3或CH2N(CH3)2、烧胺基、芳胺基、烧氧基、芳 氧基 '硝基、疊氮基(例如CH2N3)、氰基(例如ch2cn)、磺 酸、硫酸根、膦酸、磷酸根或膦酸根，且若必要，如熟悉 本項技藝者所知，例如如Greene箄人在Protective Groups in Organic Svnthegig| John Wiley and Sons第2版（1991)中所教 26 200836749 示’该專基團可未經保瘦或經保護，該文獻在此併入本案 以為參考資料。 除非另有指定，如文中使用，該名詞“低碳烷基，，係指 (^至匕飽和直鏈、分支鏈或若合適，環系烷基（例如環丙 5 基），其兼包括經取代及未經取代形式。 該名詞“烷胺基”或’’芳胺基，，包括分別具有一或兩烷基 或芳基取代基之胺基。 10 15 20 八奶座生及合成的α、冷、7或 ㈣基酸且包括，但錢於：在蛋* f⑽發現之胺基酸， 亦即甘胺酸、丙胺酸，胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫 胺酸、苯基丙«、色_、脯贿、絲賊、蘇胺酸、 半胱胺酸、酪《、林_酸、_賴、^胺酸醋、 娜《、賴胺酸、精胺酸、及組胺酸。在—較佳實施例 中，該胺基_呈。或者，軸基酸可以是以下之 衍生物：丙胺醯基、_酿基、白胺醯基、異㈣_、 脯胺醯基、苯基丙㈣基、色胺醯基、甲硫㈣基=胺 醯基、絲胺醯基、蘇胺隨基、半胱胺醯基、路胺醉芙天 冬醯胺醯基、麩醯胺醯基、天冬胺酿基、賴胺酿基二胺 酿基、組胺醯基、基、μ㈣基、 基、/3·異白胺醯基、^異脯胺醯基、$ •苯基兩胺酿基、 /3-色胺醯基+甲硫_基、^甘胺醯基、^絲舰土基、 ^蘇胺醯基^钱_基、W胺醯基、^天冬酿胺 0天冬胺酏基、万-賴胺醯基、 精胺酿基、或/3-組胺酸基。當使用該名詞“胺基酸，，時，其 27 200836749 被視為呈D及L·構型之各天然或合成胺基酸酯之特定及獨 立揭示，該等胺基酸包括，但不限於：α、/3、τ或6甘 胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、 苯基丙胺酸、色胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺 5 酸、酪胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、天冬胺酸酯、麩胺 酸酯、賴胺酸、精胺酸及組胺酸。 除非另有定義，如文中使用之該名詞“經保護”包括欲 添加至氧、氮、硫或磷原子以防止其進一步反應或用於其 它用途之基團。多種氧及氮保護基團為熟悉有機合成技藝 10 者所知（見Greene and Wuts，Protective Groups in OrgamV g^nthesis、第 3 版，John Wiley & Sons，Inc.，New York， NY.1991) 〇 除非另有指定，如文中使用之該名詞“芳基，，包括苯 基、聯苯基或萘基，且較佳為苯基。該芳基可選擇性經以 15下之分子團取代：例如i素、胺基、烧胺基、芳胺基、烧 氧基、^•氧基、硝基、氰基、磺酸、硫酸根'膦酸、罐酸 根或膦酸根，且若必要，如熟悉本項技藝者所知，例如如 Greene等人在Protective Groups in Orphic Svnth^ic Tnhn

Wiley and Sons，第3版（1999)中所教示，該等分子團可未經 20 保護或經保護。 該名詞“烷芳基，，或“烷基芳基，，包括具有芳基取代基之 烷基。該名詞“芳烷基”或“芳基烷基，，包括具有烷基取代基 之芳基。 & 如文中使用之該名詞“齒素，，包括氯、溴、碘、及氟。 28 200836749 δ亥名詞“醯基”包括羧酸酯，其中該酯基之非幾基分子 團係選自直鏈、分支鏈或環系烷基或低碳烷基；烷氧烷基， 其包括甲氣甲基；芳烷基，其包括节基；芳氧烷基，諸如 苯氧曱基；芳基，其包括可選擇性經鹵素、（^至匕烷基或 5 Cl至C4燒氣基取代之苯基；磺酸酯，諸如烷基或芳烷基磺 酿基’其包括甲磺醯基、單、二或三磷酸酯、三苯甲基或 單甲氧三笨甲基、經取代节基、三烷基甲矽烷基(例如二甲 基-第三-丁基甲矽烷基）或二苯基甲基曱矽烷基。該等酯内 之芳基最好包含苯基。該名詞“低碳醯基”係指其中非羰基 10分子團為低碳烷基之醯基。 如文中使用，就鏡像異構性純度而言，“實質上不含” 或“實質上缺乏，，係指包括至少85或9〇重量❻/。、較佳95至98 重ΐ%且又更佳99至1〇〇重量％指定鏡像異構物之組成物。 在一較佳實施例中，在本發明該等方法及化合物中，該等 15化合物貫質上不含其它鏡像異構物。 類似地，該名詞“經離析，，係指包括至少85或9〇重量％、 較佳95至98重量。/◦且又更佳99至100重量％該化合物及含其 匕化學種類或鏡像異構物之化合物組成物。 文中使用之該名詞“獨立，，係用以表示該變數，其係獨 20立施用，隨各應用而獨立不同。因此，在一化合物（諸如 R”XYR”）中，其中R”“獨立為碳或氮，，，兩R”皆可以是碳， 兩R”可以是氮，或一R”可以是碳而另一R，，為氮。 本專利說明書從頭至尾使用之該名詞“藥學上可接受 鹽或前藥”係描述一旦對患者投予時可得到化合物之該化 29 200836749 5 10 15 美團之⑴接受形式(編旨、義旨、s|或相關 學μ接受私括衍生自轉上可接受無機 :有機鹼及酸之鹽。合適的鹽包括衍生自以下之鹽:在藥 予技藝已為吾人所熟知之許多其它酸的驗金屬，諸如卸及 ，’驗土金屬，諸如缺鎮。藥學上可接受前藥係指可在 宿^體内_ ’例如水解或氧化，以形成本發明化合物之 化合物。前藥之典型實例包括在該活性化合物之官能性分 子團上具有生物學不穩定保護基團之化合物。前藥包括可 氧化、還原、、胺化、去胺化、經基化、去經基化、水解、 去水解、烷化、去烷化、醯化、去醯化、磷酸化、去磷酸 化以產生該活性化合物之化合物。 除非另有指定，如文中使用之該名詞“藥學上可接受 酯’’包括在正常醫療判斷之範圍内適用於接觸宿主之組織 且不會有不當毒性、刺激性、過敏反應等之與合理的效益 性/危險性比相稱且能有效用於彼等之目的用途的一或多 種化合物之酯。 如文中使用之該名詞“患者，，係指動物、較佳為哺乳動 物、最佳為人類。哺乳動物可包括非人類之哺乳動物，其 包括，但不限於：豬、山羊、綿羊、牛（牛類動物）、鹿、騾、 20 馬、猴；及其它非人類之靈長目動物，例如狗、貓、大鼠、 小鼠、兔或任何其它已知或文中所揭示之動物。 支發明化合物 本發明提供TCN、TCN-P、TCN-ΡΜ及相關化合物與硼 替佐米及其衍生物之組合適用於治療增生性病症之特殊治 25 療方案的用途。 30 200836749 除非另有指定，如文中使用之該名詞“曲西立濱化合 物”與“曲西立濱及相關化合物”係指具有以下結構之化合物：

5 其中R2,、R3,及R5,各獨立為氫、可選擇性經取代之磷 酸鹽或膦酸鹽（其包括單-、二-或三磷酸鹽或安定化磷酸鹽 前藥）；醯基(其包括低碳醯基）；烧基(其包括低竣烧基）；醯 胺、續酸i旨，其包括烧基或芳烧基；績醯基，其包括甲績 醯基及节基，其中該苯基可選擇性經如，例如在文中所予 10 之芳基的定義中所述之取代基取代；可選擇性經取代之芳 磺醯基；脂質，其包括磷脂；胺基酸；碳水化合物；肽； 31 200836749 或膽固醇」或活體内可得到其中I，％，及R5,獨立為η或單 =一’或二顿鹽之化合物的其它藥學上可接受脫離基； 八中R及R獨立為氫、可選擇性經取代之磷酸鹽；酿复 匕括低石厌^&基）；醯胺、烧基(其包括低碳烧基）；芳香族取 5 諸如聚乙二醇、可選擇性經取代之芳續酿二 月曰貝，其包括碟脂；胺基酸；碳水化合物；肽；或膽固醇； 或其它藥學上可接受之脫離基。在一實施例中，該化合物 係以5’_磷酸醚脂質或5，-醚脂質投予。

Ri及R2各獨立為Η、可選擇性經取代之直鏈、分支鏈或 0 ^系燒基(其包括低碳烷基）、烯基或炔基、c〇_烧基、c〇-烯基、CO-炔基、CO-芳基或雜芳基、c〇-烷氧烷基、CO-芳氧烷基、CO-取代之芳基、磺醯基、烷磺醯基、芳磺醯基、 芳烷磺醯基； 在一實施例中，R2,及r3,為氫。在另一實施例中，r2, 及I’為氫。在又另一實施例中，r2,、r3，及r5，為氫。在又 另—實施例中，R2,、R3,、r5,、心及化為氫。 在另一實施例中，該曲西立濱化合物具有以下結構： 32 200836749

其中R3為H、可選擇性經取代之直鏈、分支鏈或環系烷 基(其包括低碳烷基）、烯基或炔基、NH2、NHR4、N(R4)2、 芳基、烷氧烷基、芳氧烷基或經取代之芳基；且 5 各R4獨立為Η ;醯基，其包括低碳醯基；烷基，其包括 低碳烷基，諸如但不限於：甲基、乙基、丙基及環丙基； 烯基；炔基；環烷基；烷氧基；烷氧烷基；羥烷基或芳基。 在一亞實施例中，R3為直鏈C1至C11烷基、異丙基、第三-丁基或苯基。 10 在一實施例中，文中提供之該等曲西立濱化合物具有 以下結構： 33 200836749

在另一實施例中，文中提供之該等曲西立濱化合物具 有以下結構：

5 在另一實施例中，文中提供之該等曲西立濱化合物具 有以下結構： 34 200836749

其中R6為Η、烷基(其包括低碳烷基）、烯基、炔基、烷 氧烷基、羥烷基、芳烷基、環烷基、NH2、NHR4、NR4R4、 CF3、CH2OH、CH2F、CH2C卜 CH2CF3、C(Y3)3、C(Y3)2C(Y3)3、 5 C(=0)0H、C(=0)0R4、c(=0)-烷基、C(=0)-芳基、C(=0)- 烷氧烷基、C(=0)NH2、C(=0)NHR4、C(=0)N(R4)2，其中各 Y3獨立為H或鹵素；且 各R4獨立為Η ;醯基，其包括低碳醯基；烷基，其包括 低碳烷基，諸如但不限於：甲基、乙基、丙基及環丙基； 1〇 烯基；炔基；環烷基；烷氧基；烷氧烷基；羥烷基或芳基。 在一亞實施例中，R6為乙基、CH2CH2OH或CH2-苯基。 在另一實施例中，文中提供之該等曲西立濱化合物具 有以下結構： 35 200836749

其中R7為Η、鹵素、烷基(其包括低碳烷基）、烯基、炔 基、烷氧基、烷氧烷基、羥烷基、環烷基、硝基、氰基、 OH、OR4、NH2、NHR4、NR4R4、SH、SR4、CF3、CH2OH、 5 CH2F、CH2Cn、CH2CF3、C(Y3)3、C(Y3)2C(Y3)3、C(=0)0H、 C(=0)0R4、C(=0)_烷基、C(=0)_芳基、C(=0)·烷氧烷基、 C(=0)NH2、C(=0)NHR4、C(=0)N(R4)2或N3，其中各Y3獨 立為H或鹵素；且 各R4獨立為Η ;醯基，其包括低碳醯基；烷基，其包括 10 低碳烷基，諸如但不限於：甲基、乙基、丙基及環丙基； 烯基；炔基；環烷基；烷氧基；烷氧烷基；羥烷基。 在一亞實施例中，r7為甲基、乙基、苯基、氯或νη2。 在另一實施例中，文中提供之該等曲西立濱化合物具 有以下結構： 36 200836749

CH

在另一實施例中，文中提供之該等曲西立濱化合物具 有以下結構：

如文中使用且除非另有指定，該名詞“硼替佐米及其衍 生物”係指式V化合物： 37 200836749

其中

Ri、R!、R3、R4及R5各獨立為Η、可選擇性經鹵化、經 取代直鏈、分支鏈或環系烷基(其包括低碳烷基）、烷氧基、 烯基或炔基、芳基、CO-烷基、CO-烯基、CO-炔基、c〇-芳基或雜芳基、CO-烷氧烷基、CO-芳氧烷基、CO-取代之 芳基、磺醯基、烷磺醯基、芳磺醯基、芳烷磺醯基。 在另一實施例中，該硼替佐米及其衍生物具有以下式 VI結構：

10

Ri、Ri、R3、R4及R5各獨立為Η、可選擇性經鹵化、經 取代直鏈、分支鏈或環系烷基(其包括低碳烷基）、烷氧基、 烯基或炔基、芳基、CO-烷基、CO-烯基、CO-炔基、CO- 38 200836749 芳基或雜芳基、CO-烷氧烷基、CO-芳氧烷基、CO-取代之 芳基、續驢基、烧磺酿基、芳續si基、芳烧磺醯基。 在另一實施例中，該硼替佐米及其衍生物具有以下式 VI結構：

應瞭解文中揭示之化合物可含有對掌性中心。此等對 掌性中心可具有（R)或（S)構型或可以是彼等之混合物。因 此，文中提供之化合物可具鏡像異構純性或可以是立體異 構性或非對映異構性混合物。應瞭解文中化合物之揭示内 10 容涵蓋外消旋、旋光性、多晶形或立體異構性形式或彼等 之混合物，該化合物較佳具有文中所述之有用性質，製備 旋光性形式之方法及使用文中所述之標準試驗或使用本項 技藝中已為吾人所熟知之其它類似試驗以測定活性的方法 在本項技藝中已為吾人所熟知。可用以獲得該等化合物之 15 光學異構物的方法實例包括下述： i) 晶體之物理分離法：一種以手工方式分離個別鏡像異構物 之肉眼可見的晶體的技術。若個別鏡像異構物之晶體存 在’亦即該物質為晶團且該等晶體在視覺感受上不同， ii) 同時結晶法：僅在消旋物之溶液為呈固態之晶團時，可 20 分別自該溶液晶化個別鏡像異構物的技術； 39 200836749 m)酶催拆分法··藉使用酶進行該等鏡像異構物之反應的不 同速率而部份或完全分離消旋物之技術。 叫酶催不對稱合成法··該合成法之至少一步驟係使用酶催 反應以獲得所欲鏡像異構物之鏡像異構性純或富集的合 5 成别驅體之合成技術； v)化學不_合成法在該產油產生不對稱性（亦 即對掌性)之條件τ，自非對掌性前驅體合成所欲鏡像異 構物之合成技術，其可使用對掌性觸媒或對掌性辅助劑 進行； ⑺顺料㈣物分離法，使外消旋化合物與鏡像異構性純 減劑(該對掌性伽劑)反應以使個別鏡像異構物轉化成 非對應異構物之技術。然制彼等之現在更顯著的結構 是異而利用層析法或結晶作用以分離所形成非對映異構 物，亚稍後移除該對掌性輔助劑以獲得所欲鏡像里構物· 15 V11)第及第二·序不對稱性轉形法：一種使得自消旋物之 非對映異構物平衡以在得自所欲鏡像異構物之該等非 對映異構物溶液中佔多數或自所欲鏡像異構物之該非 子映一構物的優先結晶反應會擾亂該平衡以致使最後 原則上所有該物質自所欲鏡像異構物轉化成結晶狀非 20冑映異構物。然後自該非對映異構物釋放所欲鏡像 物的技術； … ㈣動力學拆分法：本技術係指在動力學條件下藉該等鏡 異構物與對掌性、非外賴賴或觸媒之觸反應逮 而進行消旋物之部份或完全拆分或進一步拆分已部份 40 200836749 經拆分的化合物； ix)自非外消旋前驅體進行鏡像專一性合成法：自非對掌性 起始物質獲得所欲鏡像異構物之合成技術，且在合成過 程中其立體化學完整性並未受損或受損程度極微； - 5 x)對掌性液體層析法：藉鏡像異構物與靜止相之不同交互 • 作用而在液體流動相中分離消旋物之該等鏡像異構物的 技術。該靜止相可以由對掌性物質製成或該流動相可含 有能導致不同交互作用之另一對掌性物質； xi) 對掌性氣體層法·使消旋物揮發並藉鏡像異構物在氣態 10 流動相中與含有固定非外消旋對掌性吸收劑相之柱的不 同交互作用而分離該等鏡像異構物之技術； xii) 使用對掌性溶劑萃取之方法，藉使一鏡像異構物優先溶 解在特定對掌性溶劑中而分離該等鏡像異構物之技術； xiii) 經由對掌性薄膜而運載之方法，使消旋物與薄膜障壁接 15 觸之技術。該障壁典型上可分離兩混溶性流體（其中之 ^ 一含有該消旋物），且驅動力，諸如濃度或壓差，可以 導致經由該薄膜障壁而優先運載。 在某些貫施例中’係提供曲西立濱、曲西立濱鱗酸鹽 (TCN-P)、曲西立濱5，-磷酸鹽（TCN_P)、曲西立濱5，_磷酸 20鹽單水合物（TCN_PM)或曲西立濱之DMF加成^ (TCM-DMF)。可藉熟悉本項技藝者已知之任何技術，例如 如 Tetrahedron Letters”49:4757-4760(197i)中所述之方法 合成TCN。可藉熟悉本項技藝者已知之任何技術，例如， 如美國專利第4，123,524號中所述之方法而製備TcN_p。兮 41 200836749 TCN-DMF之合成法係描述在，例如INSERM， vol.81:37-82(1978)中。可根據例如以下資料中所揭示之方 法而合成與如文中所述之TCN相關的其它化合物： Gudmundsson 等人，2001，Nucleosides Nucleotides Nucleic 5 Acids 20:1823-1830; Porcari 等人，2000，J Med Chem 43:2457-2463; Porcari 等人，1999, Nucleosides Nucleotides， 18:2475-2497; Porcari 等人，2000，J Med Chem， 43:2438-2448; Porcari 等人，2003, Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids，22:2171-2193; Porcari 等人，2004, 10 Nucleosides Nucleotides Nucleic， Acids， 23:31-39; Schweinsberg 等人，1981，Biochem Pharmacol 30:2521-2526; Smith 等人，2004，Bioorg Med Chem Lett 14:3517-3520; Townsend 等人，1986, Nucleic Acids Symp Ser 1986:41-44 ; 及/或 Wotring 等人，1986, Cancer Treat Rep 70:491-7。 15 藥學上可接受鹽及前藥 就化合物之驗性或酸性足以形成安定非毒性酸或驗鹽 之情況而言，該化合物最好以藥學上可接受鹽投予。藥學 上可接受鹽包括衍生自藥學上可接受無機或有機鹼及酸之 鹽。合適的鹽包括衍生自該藥學技藝中已為吾人所熟知之 20 許多酸的驗金屬，諸如钟及鈉；及驗土金屬，諸如舞及鎮。 更詳細地，藥學上可接受鹽之實例為使用酸所形成之有機 酸加成鹽，其可形成生理上可接受之陰離子，例如甲笨石备 酸根、甲磺酸根、乙酸根、檸檬酸根、丙二酸根、酒石酸 根、琥珀酸根、苯甲酸根、抗壞血酸根、α-酮基戊二酸根、 42 200836749 及α-甘油破酸根。亦可形成合適的無機鹽，其包括硫酸 鹽、石肖酸鹽、碳酸氫鹽、及碳酸鹽。 可使用本項技藝中已為吾人所熟知之標準程序以獲得 某车上可接叉鹽’例如使充份驗性之化合物，諸如胺，與 5 口適的酸反應以得到生理上可接受之陰離子。亦可製成羧 酸之驗金屬（例如鈉、鉀或鋰）或鹼土金屬（例如鈣）。 任何文中所述之核苔酸可以以核苔酸前藥投予以增加 该核苔酸之活性、生物可利用率、安定性或改變其性質。 許多核苷酸前藥取配位體係已知。一般而言，該核苷酸之 10單、二或三磷酸鹽的烷化反應、醯化反應或其它親脂性修 飾作用可增加該核；酸之安定性。可取代該磷酸鹽分子團 上之一或多個氫之取代基實例為烷基、芳基、類固醇、碳 水化合物（其包括糖）、二醯基甘油及醇。許多此等取代 基係描述在 R· jones and ν· Bischofberger，Antiviral 15 Research，27(1995)1-17中。其中任一種可併用所揭示核苷 酸以獲得所欲作用。 在一實施例中，該曲西立濱或相關化合物係以5，-羥基 親脂性前藥提供。揭示可共價性併入該核苷酸内，較佳於 該核苷酸或親脂性製劑之5，-0H位置處之合適親脂性取代 20 基的美國專利之非限制性實例包括美國專利第5，149,794號 (1992年9月 22 日頒予Yatvin等人）；5，194,654號（1993年3月 16 日頒予Hostetler等人）；第5,223,263號（1993年6月29日頒予 Hostetler 等人）；第 5,256,641 號（1993 年 10 月 26 曰頒予 Yatvin 等人）；第5,411,947號（1995年5月2曰頒予Hostetler等人）； 43 200836749 第5,463,092號（1995年10月31曰頒予Hostetler等人）；第 5,543,389號（1996年8 月 6 日頒予 Yatvin等人）；第 5,543,390號 (1996年8月6曰頒予Yatvin等人）；第5,543,391號（1996年8月6 曰頒予Yatvin等人）；及第5,554,728號（1996年9月1〇日頒予 5 Basava等人），該等專利全部皆併入本案以為參考資料。 揭示可連接至本發明之曲西立濱或相關化合物的親脂 性取代基或親脂性製劑之外國專利申請案包括w〇 89/02733、WO 90/00555、WO 91/16920、WO 91/18914、 WO 93/00910、WO 94/26273、WO/15132、EPO 350 287、 10 EP 93917054.4、及 WO 91/19721。 曲西立濱或相關化合物之衍生物的另外非限制性實例為含 有如以下出版物中所述之取代基的衍生物。這些經衍生之 曲西立濱或相關化合物可用於本文中所述之病徵或作為抗 病毒藥劑，其包括抗HIV或抗HBV藥劑。該等出版物如下： 15 Ho, 1973, Cancer Res. 33, 2816-2820; Holy，1993 Isopolar phosphorous-modified nucleotide analogues, in: De Clercq (ed.)? Advances in Antiviral Drug Design, Vol. I5 JAI Press, pp. 179-231; Hong et al·，1976, Blochem Biophys Rs Commun 88:1223-1229; Hong et al5 1980? J Med Chem 20 28:171-177; Hostetler et al.? 1990, Biol Chem 266:11714 -11717, Hostetler et al·，1994, Antiviral Res 24:59-67; Hostetler et al·，1994, Antimicrobial Agents Chemother 38:2792-2797; Hunston et al·，1984, J Med Chem 27:440-444; Ji et al·，1990, J Med Chem 33:2264-2270; Jones et al.5 1984, J Chem Soc Perkin 44 200836749

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Abstr· 72, 212); Robins，1984, Robins, 1984, Pharm Res 11-18; Rosowsky et al.，1982，J Med Chem 25:171-178; Ross，1961，Biochem Pharm 8:235-240; Ryu et al·，1982, J Med Chem 25:1322-1329; Safthill et al·，1986, 15 Chem Biol Interact 57:347-355; Saneyoshi et al.，1980, Chem Pharm Bull 28:2915-2923; Sastry et al·，1992，Mol Pharmacol 41:441-445; Shaw et al.? 1994, 9th Annual AAPS Meeting，San Diego，CA(Abstract); Shuto et al·，1987, Tetrahedron Lett 28:199-202; Shuto et al.5 1988，Chem 2〇 Phann Bull 36:209-217。一較佳磷酸鹽前藥基團為S-醯基 -2-硫乙基，其亦稱為“SATE”。 可使用之前藥的另外實例以下專利及專利申請案中所 述之前藥：美國專利第5,614,548號、第5,512,671號、第 5,770,584 號、第 5,962,437 號、第 5,223,263 號、第 5,817,638 46 200836749 號、第 6,252,060 號、第 6,448,392 號、第 5,411，947 號、第 5,744,592 號、第 5,484,809 號、第 5,827,831 號、第 5,696,277 號、第 6,022,029 號、第 5,780,617 號、第 5，194,654 號、第 5,463,092 號、第 5,744,461 號、第 4,444,766 號、第 4,562，179 5 號、第 5,599,205 號、第 4,493,832 號、第 4,221，732 號、第 5，116,992 號、第 6,429,227 號、第 5，149,794 號、第 5,703,063 號、第 5,888,990 號、第 4,810,697 號、第 5,512,671 號、第 6,030,960 號、第 2004/0259845 號、第 6,670,341 號、第 2004/0161398 號、第 2002/082242 號、第 5,512,671 號、第 10 2002/0082242 號、及或 PCT 公開案第 WO 90/11079 號、第 WO 96/39197 號、及/或第 WO 93/08807 號。 活體内功效/給藥方案 在本發明另一方面中，係提供可限制TCN及相關化合 物之毒性副作用的給藥方案。在一實施例中，此等給藥方 15案可以使以下毒性副作用減至最低，該等副作用包括，但 不限於：肝細胞毒害性、血小板減少症、高血糖症、嘔吐、 低鈣血症、貧血、低白蛋白血症、胃髓活性受抑制、高三 酸甘油酯血症、高澱粉酶白症、腹瀉、骨炎及/或發熱。 在另一實施例中，TCN、TCN-P或相關化合物與硼替 20 佐米及其衍生物之投藥可以在至少15至20%之患者中得到 至少部份或完全活體内反應，在特定實施例中，部份反應 可以是該腫瘤至少 15、20、25、30、35、40、50、55、60、 65、70、75、80或85%消退。在其它實施例中，在至少15、 20、25、30、35、40、50、55、60、65、7〇、75、80、85 47 200836749 或90%經該治療物治療之患者中可發現本反應。在另外實 施例中’可藉文中揭示之任何治療方案而獲得此等反應率。 在其它實施例中，係提供治療業經診斷為患有癌之病 患的方法，其係藉根據給藥計劃而對該患者投予有效量之 5 TCN、TCN-P或相關化合物與辦佐米及其衍生物，該給 藥計劃包括每週-次投予該曲西立濱化合物及/或爛替佐 米或其鹽或衍生物，費時3週，繼而在一週時期内未投予該 藥物（亦即經由28天周期）。在其它實施例中，可重複此種28 天周期，至少2、3、4或5次或直到明顯可發現該腫瘤消退 10 為止。 在另外實施例中，係提供42天周期，其中文中揭示之 化合物可每週投予一次，費時4週，繼而在2週期間内未投 予該曲西立濱化合物及/或蝴替佐米及其衍生物。在其它實 施例中，可重複此種42天周期，至少2、3、4或5次或直到 15 明顯發現該腫瘤消退為止。在一特定實施例中，可根據42 天周期而投予小於50、小於25或小於10毫克/米2之TCN、 TCN-P、TCN-PM或相關化合物。在其它特定實施例中，可 根據42天周期而投予2、3、4、5、6、7、8、9、1〇或11毫 克/米2之TCN、TCN-P、TCN-PM或相關化合物。在另一特 20 定實施例中，係投予約〇_1毫克/米2至約50毫克/米2之硼替佐 米或其衍生物。在一特定實施例中，可根據42天周期而投 予0.1、0.5、1、5、1〇、15、20、25、30、35或40毫米/米2 之棚替佐米或其鹽。 在另一實施例中，係提供治療患者之癌的方法，其係 48 200836749 藉每週一次對該患者投予10毫克/米2或更少之TCN、 TCN-P、TCN-PM或相關化合物及小於約30毫克棚替佐米及 其衍生物的給藥方案。在特定實施例中，可每週一次投予 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、 5 7.5、8、8.5、9、9.5或10毫克/米2之如文中揭示的TCN、 TCN-P、TCN-PM或相關化合物。在另一特定實施例中，可 每週一次投予0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35 或40毫克/米2之硼替佐米或其衍生物。 在本發明之實施例中，可以在短時期内，例如約5、10、 10 15、20、30或60分鐘，以單一大劑量同時投予文中揭示之 化合物。在另外實施例中，係提供其中該等化合物藉連續 輸注，費時至少24、48、72、96或120小時而同時投予之給 藥計劃。在特定實施例中，可以以如下述之特定頻率重複 藉連續或大量注射而進行該曲西立濱化合物及/或硼替佐 15 米及其衍生物之投藥：每週至少一次、每兩週至少一次、 每3週至少一次、每月至少一次、每5週至少一次、每6週至 少一次、每8週至少一次、每10週至少一次及/或每12週至 少一次。可以使用文中揭示之任何方式合併投藥之類型及 頻率以創造給藥周期。可藉特定給藥周期而重複投予該曲 20 西立濱化合物及/或硼替佐米及其衍生物，例如每兩週一次 以大量注射之方式投藥，費時3週。可投予該給藥周期，費 時至少：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或 24個月。或者可對患者投予至少2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、15或20次給藥周期。可根據文中揭示之任何 49 200836749 組合而投予該曲西立濱化合物及/或爛替佐米及其衍生 物’例如可母週一次、每3週—次投予該曲西立濱化合物及/ 或侧替佐米及其衍生物，共3周期。 在另外實施例中，可每天-次分別投予該等化合物， f時至少2、3、4、5、6、7、8、9或10天。在此種投藥後， 在相同的_内並未投倾曲西域化合物及/或删替佐 米及其衍生物。 了對患者才又予如文中揭示之TCN、TCN-P、TCN-PM及 相關化合物其及衍生物，其投予量能有效導致腫瘤消退。 10該TCN、TCN-P、TCN-PM或相關化合物與硼替佐米及其衍 生物之投藥可以在至少15至20%該等患者中得到至少部 份，諸如至少15、20或30%或完全之活體内反應。在特定 實施例中，可對患者投予至少2、5、10、15、2〇、3〇或5〇 宅克/米之文中揭示的曲西立濱化合物。在特定實施例中， 15 可對患者投予至少約〇·5、;1、15、2、2 5、3、3 5、4、4·5、 5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8·5、9、9·5、10、12、15、 !7、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、 80、85、90、95、100、150、165、175、200、250、300或 35〇毫克/米2之文中揭示的TCN、TCN-P、TCN-PM或相關化 20 合物。在特定實施例中，可對患者投予卜5、10、15、20、 25、30、35或40毫克/米2之硼替佐米。 可根據文中揭示之治療方案而進行該化合物之投藥。 在特定實施例中，該給藥方案包括同時、連續或在一段時 間内投予小於約20毫克/米2之TCN及相關化合物與小於約 50 200836749 30毫克之硼替佐米。在一實施例中，可每週一次同時投予 小於20毫克/米2之tcn或相關化合物及小於約1〇毫克/米2石朋 替佐米。在另一實施例中，可每週一次投予小於2〇毫克/米2 之TCN或相關化合物並可在下一週投子小於約3〇毫克蝴替 5 佐米。 在另外實施例中，可對患者投予2毫克/米2、5毫克/米2、 10¾克/米2、及/或15毫克/米2之TCN或相關化合物及小於約 30 ' 25、20、15、10、5、；1、〇·5或〇·1毫克/米2之硼替佐米或 其鹽或衍生物。在另一實施例中，可經由連續輸注而對患者 10投予小於10耄克/米2之曲西立濱化合物及小於約30毫克/米2 之硼替佐米，費時至少5天。本發明提供文中揭示之給藥類 型、頻率、周期數及劑量的任何組合。 I者群體之篩檢 在本發明之另一方面中係提供鑑定易受曲西立濱 15 (TCN)及相關化合物之毒性作用影響的癌或腫瘤之方法。在 -實施例中，係提供治療哺乳動物之癌3戈腫瘤之方法，其 係藉⑴自該腫瘤獲得生物試樣；⑼測定該癌或腫瘤是否過 度表現Akt激酶或高活化且碟酸化之施激崎；及㈣使用如 文中所述之曲西立濱或相關化合物治療該癌或腫瘤。在— 實施例中，該生物試樣可以是一種活體切片。在盆它實施 例中，該生物試樣可以是得自該腫瘤或癌之流體、細胞及/ 或抽吸物。 可根據熟悉本項技藝者p 4夕乂 ^ β言已知之任何技術而獲得該生物 試樣。在一實施例中，可進彳 + 延仃活體切片以獲得該生物試樣。 51 200836749 5 10 20 活體切片為自身體移除組織或細胞以進行檢驗的程序。某 些活體切>{可以在醫師的珍所内進行，而其它活體切片需 要在西境中完成。此外，某些活體切片需要使用麻醉 藥以麻痺該區a，而其它活體切片並不需要任何鎮靜作 用。在特定實施例中’可進行内視鏡活體切片。此種活體 切片係經由光纖内視鏡（在—端具有最近對焦之眼鏡之適 於檢視的長、細管)通過天然體孔（亦即直腸）或小切口（亦即 關節鏡才欢查）而進行。使用該内視鏡以檢視所述器官之異常 或可疑區域以獲得適於研究之少量組織。内視鏡檢查程序 係用於欲顯影及/或治療之器官或身體區域。醫師可將該内 視鏡插入月腸迢（消化道内视鏡檢查）、膀胱(膀胱鏡檢查）、 腹腔(腹魏檢查）、_腔_檢查）、狀巾f«位(縱腸 鏡k查)或^及支氣官系統(喉鏡檢查及支氣管鏡檢查)内。 另K也例中，可進行骨髓活體切片。可自胸骨 :_m)或纖骨(在下背區域上之骨盆任一 頭區域）進行此種活體切 麻痒該區域。將長硬針插人;Γ 並提供局部麻醉藥以 本步驟偶爾令人不舒服/内，餘餘胞料行研究； 切片（自_瓣㈠雜衫騎可崎核心活體 性活體二“::中，可對該哺乳動物進行切除性或切開 ==:::要更寬度或較深之皮膚部位時，通常此 一步檢查，並縫合_=*刀)移除全厚之皮膚以進行進 瘤時，盆被稱為切〜 *用線縫合)傷口。當移除整個腫 其被私為切除性活體切片技術。若僅移除該腫瘤之 52 200836749 一部份時，其被稱為切開性活體切片技術。例如當疑有黑 色素瘤（一種皮膚癌）時，切除性活體切片通常為經常較佳使 用之方法。 在又另外實施例中，可使用細針抽吸(FNA)活體切片 * 5 法。此種活體切片法包括使用細針以自腫瘤移除很小片。 有時使用局部麻醉劑以麻痒該區域，但是該試驗很少導致 不舒服且不留下疤。FNA不適用，例如可疑色素痣之診斷， 儀| 位是可用以，例如活體檢查接近黑色素瘤之大淋巴結以瞭 解該黑色素瘤是否已轉移(擴散)。可使用電腦斷層攝影術掃 °描(CT或CAT掃描）以將針導入内部器官（諸如肺或肝臟）内 之腫瘤中。 在其它實施例中，可進行鑽取、剃除及/或皮膚活體切 片。鑽取式活體切片包括使用可移除組織之短圓柱體或“蘋 ' 果核心”之活體切片儀器取出較深的皮膚試樣。投予局部麻 15醉劑後，使該儀器在皮膚之表面上轉動，直到穿過所有層 _ (其包括真皮、表皮、及皮下組織（脂肪）之最表面部位）為 止。剃除式活體切片包括藉剃掉皮膚之最上層而移除該 層。亦使用局部麻醉劑進行剃除式活體切片。皮膚活體切 片包括移除皮膚試樣以在顯微鏡下進行檢查以測定，例如 20 黑色素瘤是否存在。該活體切片法係在局部麻醉下進行。 在特定實施例中，係提供方法以測定該腫瘤是否過度 表現Akt激酶。Akt激酶過度表現性可表示該激晦之構酸化 狀態。可根據文中所述之方法以檢測Akt之高度磷酸化反 應。在一實施例中，可以比較腫瘤活體切片及對照組織。 53 200836749 該對照組織可以是得自獲得該活體切片之哺乳動物的正常 組織或得自健康的哺乳動物之正常組織。可測定Akt激嗨過 度表現性或高度碳酸化以瞭解該腫瘤活體切片之Akt激崎 之含量及/或Akt激酶填酸化是否高於該對照組織，諸如Akt 5 激酶之含量比該對照組織中之Akt激酶含量高至少約1.5、 2、2·25、2.5、2.75、3、3.25、3.5、3.75、4、4.25、4.5、 4.75、5、5.5、6、7、8、9或 10倍。 在一實施例中，本發明提供一種檢測患者或得自該患 者之生物試樣中之異常Akt激酶表現性的方法，其係藉使用 10 對Akt激酶或其抗原性部份具專一性之免疫相互作用性分 子接觸得自該等患者之細胞、細胞萃取物、血清或其它試 樣或生物試樣並篩檢免疫相互作用性分子-A k t激酶複合物 形成量，其中相對於正常細胞之該複合物的高存在量表示 可表現或過度表現Akt之異常細胞。在一實施例中，可以免 15 疫性篩檢細胞或細胞萃取物之高Akt激酶存在量。 在另一實施例中，係藉篩檢可將Akt激酶編碼之基因的 表現程度而以基因層次檢測Akt在細胞内之異常表現性，其 中與正常細胞比較之轉錄表現產物（亦即mRNA)的高含量 表示異常細胞。在特定實施例中，可使用實時PCR以及其 20 它pCR程序以測定轉錄活性。在一實施例中，mRNA可得自 患者之細胞或得自患者之生物試樣且可選擇性產生 cDNA。然後可以使mRNA或cDNA與能夠雜交及/或擴增所 有或部份可將Akt激酶編碼之核苷酸序列或其互補核苷酸 序列之基因探針接觸，然後可檢測mRNA或cDNA之含量， 54 200836749 其中可評估與正常對照組比較之高含量mRNA或cDNA的 存在。 本發明之又另一實施例涵蓋在定量或半定量診斷套組 中使用Akt激酶之抗體（單株或多株）以測定患者之可疑癌細 5 胞中的Akt激酶之相對含量，該套組可包括進行該檢定之所 需之所有試劑。在一實施例中，係提供使用進行ELISA檢 定所需之試劑及材料的套組。試劑可包括，例如清洗用緩 衝劑、抗體稀釋緩衝劑、阻斷用緩衝劑、細胞染色溶液、 顯像液、終止溶液、抗礙酸蛋白質專一性抗體、抗Pan蛋白 10 質專一性抗體、二次抗體、及蒸餾水。該套組亦可包括使 用說明且可選擇性自動化或半自動化或呈可以與自動化機 械或軟體相容之形式。在一實施例中，可以使用能檢測活 化形式之AKT(於絲胺酸474經磷酸化之Akt)的磷-絲胺酸 -473Akt抗體作為診斷套組中之抗體。見，例如Yuan等人 15 (2000)uFrequent Activation of AKT2 and induction of apoptosis by inhibition of phosphinositide-3-OH kinase/Akt pathway in human ovarian cancer，’’ Oncogene 19:2324-2330 o

Akt激酶

Akt，亦稱為PKB3 ’代表絲胺酸/蘇胺酸激酶之亞族。 20 在本亞族中已確認3個成員，AKT1、AKT2、及AKT3。在 PI3K依存性方式中，Akt係藉細胞外的刺激物而活化(Datta， S.R·，等人Genes Dev· 13:2905-2927, 1999)。Akt之完全活化 需要Thr·在該活化環中之磷酸化反應及Ser473在C末端活 化結構域中之鱗酸化反應。Akt係藉PTEN腫瘤抑制劑而不 55 200836749

利地調節。在各種腫瘤内已確認PTEN内之突變，其可導致 Akt路徑之活化(Datta，S.R·，等人Genes Dev· /3:2905-2927, 1999)。此外，在許多人類惡性腫瘤内已檢測出Akt之擴增、 過度表現及/或活化（Datta，S.R·，等人Genes Dev· 5 /3:2905-2927，1999，Cheng，J· Q·，and Nicosia，S. V. AKT signal transduction pathway in oncogenesis. In Schwab D, editor. Encyclopedic Reference of Cancer. Berlin Heidelberg and New York:Springer; 2001. pp35_7)。Akt，特別為原構活 性Akt之異位表現性可誘發細胞存活及惡性轉形，然而Akt 10 活性之抑制作用可刺激一系列哺乳動物細胞之細胞凋亡 (Datta，S.R·，等人Genes Dev· /3:2905-2927, 1999, Cheng，J. Q.? and Nicosia, S. V. AKT signal transduction pathway in oncogenesis. In Schwab D? editor. Encyclopedic Reference of Cancer. Berlin Heidelberg and New York: Springer; 2001. 15 PP35-7，Sun，M·，等人 Am· J· Path·，159:431-437，2001，

Cheng，J.Q·，等人Oncogene, 14:2793-2801，1997)。而且，Akt 之活化作用業經證明與腫瘤侵入性及化學抵抗力有關 (West，K.A·，等人Drug Resist· Updat·，5:234-248, 2002)。 該Akt路徑之活化在惡性轉形及化學抵抗力方面扮演 20關鍵角色’其係藉誘發細胞殘活、生長、遊走、及血管生 成。本發明提供測定Akt激酶過度表現性及/或高度活化及 碟酸化Akt激酶之含量的方法。 該Akt激酶可以是任何已知Akt族激酶或其相關激酶， 其包括，但不限於Aktl、Akt2、Akt3。人類Aktl、Akt2、 56 200836749 及Akt3之mRNA及胺基酸序列係分別闡明在第6a_c、> 7a-d、及弟8a-c圖中。 謗斷檢定 免疫學檢定 5 在一實施例中，係提供一種用於檢測Akt激_在喷乳動 物之細胞或在得自該哺乳動物之生物試樣中的異常表^見十生 之方法，其係藉使用對Akt激酶或其抗原部份具專一性之免 疫相互作用性分子接觸得自該哺乳動物之細胞、細胞萃取 物或血清或其它試樣或生物試樣，並篩檢免疫相互作用性 10 分子-Akt激酶複合物形成之程度，然後測定相對於正常細 胞之該複合物是否大量存在。 該免疫相互作用性分子可以是對Akt激酶或其抗原部 份或共其同源物或其衍生物具有專一性及結合親和力之分 子。在一實施例中，該免疫相互作用性分子可以是免疫球 15蛋白分子。在其它實施例中，該等免疫球蛋白分子可以是 抗體片段、單鏈抗體、及/或去免疫化分子，其包括人源化 抗體及T細胞關聯性抗原結合性分子(TABM)。在一特定實 施例中，該抗體可以是單株抗體。在另一特定實施例中， 該抗體可以是多株抗體。該免疫相互作用性分子對Akt激酶 20或更特定地，Akt激酶上之抗原決定體或表抗原具有專一 性。Akt激酶上之抗原決定體或表抗原包括免疫反應所引導 之该分子的一部份。該抗原決定體或表抗原可以是B細胞表 抗原或若合適，其係為T細胞表抗原。在_實施例中，今抗 體為麟-絲胺酸473 Akt抗體。 57 200836749 兔明之-實施例提供_種用於診斷哺乳動物之 在或似癌生長，其巾係存在異常伽雑的方法，歸 用A kt激峰結合性有效量之對該A k t激酶或其上之、盾" 體或表抗原具有專一性之抗體接觸得自該哺定 胞萃取物或得自該患者之生物試樣，然後定量或定^定田 施激酶-抗體複合物之含量，其中係測定與正常細胞= 之该南含量複合物的存在。 乂 10 可藉熟悉本項技藝者已知之許多方法中任 抗體。例如就人類Akt激酶之檢測而言，抗體通常伸未= 二自：人:動物，諸如靈長目動物、家畜動物(例如綿 平牛、猪、山平、馬）、實驗室試驗動物(例如小鼠 天竺鼠、兔子)及/或伴倍動物(例如狗，。抗體亦可:在 原核性或真核性宿主細胞内經重組性製 丄 又而吕，可 在細胞或組織生物切片上活體外進行以抗體為主 Μ然而，若抗體經合適去免疫化或就人類用途而言，= 化，則該抗體可經，例如核標籤標記，對患者投予 射賊而狀核標記蓄積之位置。該鳩_抗體可以衫 20 f票劑。因此’本發明另-實施例提供適用於人類或非I 類患者體内之癌影像化的該等去免疫化形式之^體 就抗體產生歳激酶而言，若該等抗體係射組方法而 附必需自得自動物(其包括人體組織)或得自細胞 Μ 5式樣卒取该酶。可藉任何合適方法而自該生物 私分離Akt激酶。例如該分離方法可利用以下該Akt激酶 之性質中的任一或多種：表面電荷性質、大小、密度、生 58 200836749 物活性及其對另一實體（例如其所結合或締合之另一蛋白 貝或化學化合物）之親和力。因此，例如可藉以下任一或多 種方法而自該生物流體分離Akt激酶：超離心法、離子交換 層析法(例如陰離子交換層析法、陽離子交換層析法）、電泳 5法(例如聚丙烯醯胺凝膠電泳法、等電點聚焦法）、尺寸分離 法(例如凝膠過濾法、超過濾法）及親和力媒介分離法（例如 免疫親和力分離法，其包括，但不限於··磁珠分離法（諸如 Dynabead(商標）分離法、免疫層析法、免疫沈澱法）。自該 生物流體分離Akt激酶之方法可維持存在於該激酶上之構 10 型表抗原且，因此，最好避免使用可導致該酶之變性的技 術。在另一實施例中，可使用親和力分離法、凝膠過濾法 及/或超過濾法中之任一或多種自該生物流體分離激酶。 可使用本項技藝中已知之標準程序，例如藉Kohler及 Milstein(Kohler and Milstein, Nature 256: 495-499, 1975; 15 Kohler and Milstein，Eur· J. Immunol. 6(7):511-519, 1976)、 Coligan等人（“Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，Inc” 1991-1997)或 Toyama 等人（Monoclonal Antibody，Experiment Manual”，published by Kodansha Scientific, 1987)所述之程序，進行免疫化反應及後續單株 20 抗體之製備。基本上，動物係藉標準方法而經含Akt激酶之 生物流體或其部份或重組型之Akt激酶免疫化以產生能製 造抗體之細胞，特別為能製造抗體之體細胞（例如B淋巴細 胞）。然後可以自該經免疫化之動物移除這些細胞以使細胞 永生。在特定貫施例中，可使用Akt激酶之片段以產生抗 59 200836749 體。該片段可以與載體締合。該載體可以是非-或低免疫原 物質（例如半抗原）所天然或人工方式連接以增強其免疫原 性之典型上具高分子量的任何物質。 可使用本項技藝中已為吾人所熟知之方法進行能產生 5 抗體之細胞的永生反應。例如可藉轉形方法使用 Epstein-Barr病毒(EB V)進行該細胞永生反應（Kozbor等人， Methods in Enzymology 121:140, 1986)。在另一實施例中， 係使用廣泛用於製造單株抗體之細胞融合方法（描述在上 文Coligan等人，1991-1997中）以使產生抗體之細胞永生。 10 在本方法中，具有可產生抗體之潛力的產生抗體之體細 胞，特別為B細胞，係經骨髓瘤細胞株融合。這些體細胞可 衍生自已接觸抗原之動物，較佳為嚅齒動物（諸如小鼠及大 鼠）的淋巴結、脾臟及周邊血液。在一特定實施例中，可使 用小鼠脾臟細胞。在其它實施例中，亦可使用大鼠、免子、 15 綿羊或山羊細胞。已自適用於產生雜交瘤之融合程序 (Kohler and Milstein，1976, supra; Shulman等人，Nature 276: 269-270, 1978; Volk等人，J· Virol. 42(1): 220-227, 1982)之 淋巴細胞腫瘤研製專一性骨髓瘤細胞株。許多骨髓瘤細胞 株亦可用於製造融合細胞雜化物，其包括，例如P3乘以 20 63-Ag8、P3 乘以 63-AG8.653、P3/NSl-Ag4-l(CN-l)、

Sp2/0-Agl4 及 S194/5.XXO.BU.1 。業經 Kohler 及

Milstein(1976，上述）、Shulman等人（1978，上述)描述之該 等P3乘以63-Ag8及NS-1細胞株可形成該Sp2/0-Agl4骨髓瘤 細胞株。該S194/5.XXO.BU.1細胞株係經由Trowbridge報告 60 200836749 (J· Exp· Med· 148(1):313-323, 1978)。用於產生能產生抗體 之脾臟或淋巴結細胞與骨髓瘤細胞之雜化物的方法通常包 括在可促進細胞膜融合之一藥劑或藥劑群(化學、病毒或電 性）存在下’分別以10 : 1比例（雖然該比例可以自約2〇 : j 5至約1 : 1不等）混合體細胞及骨髓瘤細胞。融合方法業經描 述(Kohler and Milstein，1975, supra; Kohler and Milstein， 1976，supra;Gefter等人，Somatic Cell Genet· 3·· 231-236, 1977; Volk等人，1982, supra)。彼等研究者使用之融合促進 劑為Sendai病毒及聚乙二醇(PEG)。在特定實施例中，係提 10供自其餘未經融合細胞，特別為未經融合之骨髓瘤細胞， 選擇經融合之細胞雜化物的方法。一般而言，可藉在能維 持雜種瘤生長但可防止該等未經融合之骨髓瘤細胞（其通 常可無限地持續分裂）生長的培養基内培養該等細胞而進 行經融合細胞雜化物的選擇。在活體外培養物中用於融合 15 之該等體細胞並不能維持長期生存力。需要數週才能選擇 性培養該等經融合之細胞雜化物。在該期間之初期，需要 鑑定可產生所欲抗體之此等雜化物，藉此該等雜化物可接 著經選殖並增殖。一般而言，約10%所獲得之雜化物可產 生所欲抗體，但是自約1至約30%之範圍並不罕見。可藉幾 20 種標準檢定方法中任一種而檢測能產生抗體之雜化物，該 等方法包括如，例如Kennet等人在（Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, pp 376-384, Plenum Press, New Yark，1980)中所述之酶聯免 疫檢定及放射免疫檢定技術及藉FACS分析（0，Reilly等 61 200836749 人，Biotechniques 25:824-830, 1998)。 一旦所欲經融合細胞雜化物業經選擇並在個別能產生 抗體之細胞株内選殖時，各細胞株可經兩種標準方法中之 任一種增殖。可將該等雜種瘤細胞之懸浮液注射入組織相 5 容性的動物内。然後經注射之動物可形成能分泌藉該融合 細胞雜化物而產生之專一性單株抗體的腫瘤。可放出該動 物之體液，諸如血清或腹水流體，以提供高濃度之單株抗 體。或者，各該細胞株可在實驗室培養容器内進行活體外 增殖。可藉傾析、過濾或遠心法而採集含高濃度單一專一 10 性早株抗體’並接著純化。 然後可藉任何合適免疫檢測方法而測試該等細胞株之 才欢測相關Akt激酶的專一性。例如可將細胞株分成數等份裝 入許多井内並進行培育，然後藉酶聯免疫吸附檢定 (ELISA)、間接螢光抗體技術等而分析得自各井之上澄清 15液。可鑑定產生能辨識目標LIM激酶但是不能辨識非目標 表抗原之單株抗體的該細胞株(群），然後直接活體外培養或 注射入組織相容性動物體内以形成腫瘤並產生、採集且純 化必要之抗體。 因此，本發明提供一種在試樣内檢測Akt激酶或其片 20段、變異體或衍生物之方法，其包括以抗體或其片段或衍 生物接觸該試樣並與正常對照組（其中高含量之Akt激酶經 測定）比較，檢測含該抗體及Akt激酶或其片段、變異體或 衍生物之複合物含量，可使用任何能測定該複合物形成之 方法。例如具有相關之報告基團之分子的本發明抗體可用 62 200836749 於免疫檢定法巾。此等免疫檢定法包括，但*限於：放射 免疫檢定法(RIA)、酶聯免疫吸附檢定法(EUSa)、免疫層 析技術(）I西方墨點法為熟悉本項技藝者所熟知。免 疫檢疋法亦可包括競爭性檢定法。本發明涵蓋定性及定量 5 免疫檢定法。 合適的免疫檢定技術係描述在，例如美國專利第 4,016,043號、第4,424,297號、及第4,018,653號中。這些檢 定技術兼包括非競爭性類型之單部位及雙部位檢定以及傳 統競爭結合性檢定。這些檢定亦包括標記抗原結合性分子 10直接結合至目標抗原。 本發明進一步提供用於定量得自動物，諸如人類癌症 病患或疑有癌之個體的細胞或組織試樣中的Akt蛋白質表 現性或活化程度之方法。在一實施例中，本發明提供使用 影像化系統定量性定量Akt蛋白質表現性或活化程度之方 15 法。可使用該影像化系統以接收、增強、及處理業經Akt 蛋白負專一性染色劑染色之細胞或組織試樣的影像以測定 在得自此種動物之細胞或組織試樣中表現的AKT蛋白質含 量或活化程度。在本發明該等方法之實施例中，可產生至 少兩種表現不同AKT蛋白質含量之細胞株的AKT1及AKT2 20蛋白質表現性的校準曲線。然後可使用該校準曲線以定量 性測定表現在細胞或組織試樣内之AKT蛋白質含量。可使 用對該等活化特性具專一性之試劑製成適於活化AKT蛋白 質之類似校準曲線。其亦可用以測定臨床性癌治療前及後 之AKT含量及活化狀態的變化。 25 在本發明該等方法之一特定實施例中’可使用酶聯免 63 200836749 疫吸附檢定法(ELISA)定量細胞或組織試樣内之AKT蛋白 質表現性以測定ΑΚΤ蛋白質在試樣内之含量。此等方法描 述在，例如美國專利公開案2002/0015974號中。 在其它實施例中，可使用酶免疫檢定法以檢測該Akt 5 激酶。在此等檢定中，通常藉戊二醛或過碘酸鹽而使酶結 合至第二抗體。通常選擇一旦藉對應酶而水解時可產生能 檢測之顏色變化的可併用該等專一性酶之基質。亦可使用 能產生螢光之基質，其可產生螢光產物而不是色原基質。 可添加該酶標記之抗體至第一抗體_抗原複合物，使其黏 10 合，然後洗掉過量試劑。然後可添加含該合適基質之溶液 至該抗體-抗原-抗體複合物。該基質可以與連接至該第二抗 體之酶反應以產生定性可見信號，其通常可進一步經光譜 測疋法疋夏以表不存在於該試樣内之抗原含量。或者，榮 光化合物，諸如螢光素、玫瑰紅(rhodamine)及鑭系元素(銪 15 (EU))，可化學性偶合至抗體，且不會改變彼等之結合能 力。當藉特定波長之光照明而活化時，該經螢光染料標記 之抗體可吸收光能量，在該分子内誘發可激發性狀態，繼 而以可經光學顯微鏡目視檢測之特徵顏色發光。使該經螢 光標記之抗體結合至第一抗體-抗原複合物。將未結合試劑 20洗掉後，接著使剩下的三級複合物曝露於合適波長之光線 下。所觀測之螢光表示相關抗原之存在。免疫螢光測定檢 定法(IFMA)在本項技藝中係已被充份確認且特別適用於本 方法。然而，亦可使用其它報告基團分子，諸如放射性同 位素、化學發光或生物發光分子。 64 200836749 在特定實施例中，亦可使用Akt激酶之抗體以進行血清 或其它循環流體中之Akt激酶的ELISA媒介檢測法。其進行 步驟為使抗Akt激酶抗體固定至固體載體並經生物萃取 物，諸如血清、血液、淋巴或其它體液、細胞萃取物或細 5胞切片接觸。然後可使用經標記之抗Akt激酶抗體以檢測固 定之Akt激酶。本檢定法可許多方式中不同且所有變異皆涵 盍於本發明内並為熟悉本項技藝者所知。本方法可使用， 例如以血清為主之檢定以快速檢測並定量Akt激酶含量。 在一實施例中，Akt Elisa檢定套組可用於本發明。例 10 如得自 SuperArray Bi〇science 之用於 Akt S473 的 Cellular Activation of Signaling ELISA可用於本發明。在一實施例 中，該抗體可以是能辨識AktS473之抗pan抗體。EHsa檢定 套組含有抗Akt抗體及額外試劑，其包括，但不限於：清洗 緩衝劑、抗體稀釋緩衝劑、阻斷緩衝劑、細胞染色液、顯 15像液、中止液、第二抗體、及蒸餾水。 核苷酸檢測 在另一實施例中，係提供一種藉檢測可將Akt激酶編碼 之多核苔酸在細胞中之表現性程度而檢測Akt激酶的方 法。可使用熟悉本項技藝者已知之任何合適技術以測定該 2〇多核«之表現性。在一實施例中，可使用可將Akt激啤鵠 碼之5己多核苔酸作為得自該細胞之RNA萃取物之北方 墨點中的探測物。在其它實施例中，在核酸擴增反應(諸如 RTPCR)中’付自動物之核酸萃取物可併用相對於將該教啤 編碼之多核苔酸的訊息及反訊息序列或其側接序列的募核 65 200836749 苷酸引子。熟悉本項技藝者可使用各種自動化固相檢測技 術，例如如Fodor等人（Science 251:767-777，1991)及Kazal 等人(Nature Medicine 2:753-759, 1996)所述之檢測技術。 在其它實施例中，係提供檢測能將RNA轉錄本編碼 5 Akt激酶的方法。可自疑有Akt激酶RNA之細胞試驗離析 RNA，例如自人類癌組織離析總RNA。可藉本項技藝中已 知之方法，例如使用TRIZOL試劑（GIBCO-BRL/Life Technologies，Gaithersburg，Md)，而離析 RNA。可使用 Oligo-dT或無規序列寡核苷酸以及序列專一性寡核苷酸作 10 為逆轉錄酶反應中之引子以自該經離析RNA製備第一股 cDNAs。然後在PCR反應中所形成第一股cDNAs可經序列專 一性寡核苔酸酸擴增以產生經擴增產物。 聚合酶連鎖反應或“PCR”係指一種程序或技術，其中大 量預選定之核酸、RNA及/或DNA片段如，例如美國專利第 15 4,683，195號所述經擴增。一般而言，係使用得自相關區域

之末端或其外之序列訊息以設計募核苷酸引子。這些引子 之序列與欲擴增之模板的反向股相同或類似。可使用PCR 以擴增自總細胞RNA轉錄之專一性RNA序列及cDNA。一般 而言，見Mullis等人（Quant. Biol. 51:263, 1987; Erlich，eds.， 20 PCR Technology，Stockton Press，NY，1989)。因此，藉PCR 而進行之專一性核酸序列之擴增係依賴具有保留性核苷酸 序列之寡核苷酸或“引子”，其中該等保留性序列係追溯自 相關基因或蛋白質序列之排列，例如哺乳動物之Akt激酶基 因的序列比較。例如製備經預計可黏接至該反訊息股之引 25 子並製備經預計可黏接至可將Akt激酶編碼之cDNA分子的 66 200836749 訊息股之另一引子。為了檢測經擴增之產物，典型上使該 反應混合物進行瓊脂糖(agarose)凝膠電泳或其它合適分雜 技術並檢測該Akt之激酶專一性擴增之DNA的相對存在。例 如可使用專一性寡核苷酸探針進行南方雜化反應或比較其 5電泳遷移率與已知分子量之DNA標準遷移率而檢測Akt激酶 擴增之DNA。該經擴增Akt激酶DNA之離析、純化及特性分 析的進行步驟為自凝膠切除或溶析片段（例如見參考文 獻，Lawn等人，Nucleic Acids Res. 2:6103, 1981; Goeddel 等人，Nucleic Acids Res· 8:4057-1980)，在合適載體，諸如 10 pCRII載體(Invitrogen)之選殖部位内選殖該經擴增產物，進 行該經選殖插入物之序列分析並比較該D N A序列與LIΜ激 酶之已知序列。接著可測定LIM激酶mRNA及cDNA之相對 含量。 在一實施例中，可使用費時PCR以測定Akt核苷酸之轉 15 錄程序。轉錄活性之測定亦包括測定以可獲得mRNA轉錄 本為主之潛在轉錄活性。實時PCR以及其它PCR程序使用可 用於檢測PCR產物之許多化學方法，其包括DNA結合性螢 光團（5’核酸内切酶）、鄰近襯裡及髮夾式募核苷酸探針與自 發螢光之擴增子的組合。這些化學方法及實時PCR通時在 20 以下資料文獻中有討論：例如Mackay等人，Nucleic Acids Res 30(6): 1292-1305, 2002; Walker, J. Biochem. Mol. Toxicology 15(3): 121-127，2001; Lewis等人，J· Pathol. 195:66-71，20(H。 在另一實施例中，Akt之異常表現性的鑑定步驟為以具 67 200836749 σ互補廷自第6a_e、7a-d或8a_c圖之核㈣序列或彼等之 ♦片段的^序列之序列的寡核㈣探針接觸自生物試樣所 離析之核甘自夂序列，然後藉雜化用於該序列之探針而檢測 該序列並比較其結果與正常試樣。可藉使用任何可檢測藥 5劑觀該探針而檢測用於該生物試樣之探針的雜化作用。 /¼針可以^ ’例如放射性同位素、生物素、螢光染料、 包子致松劑、酶、半抗原或可利用抗體之蛋白質標記。可 藉任何所奴方式’其包括光譜測定法、光化學法、生化法、 免疫化學法、放射性同位素法或化學方法，而評估可檢測 10私度。亦可使用下述技術以檢測該探針：諸如寡聚物限制 技術、點墨檢定法、逆點墨檢定法、多酶針檢定法、及5, 核魷酶檢定法。或者可使用任一種廣泛適用之DNA陣列技 術，其包括巨陣列、微陣列及DNA微晶片技術，以檢測該 探針。该养核％酸探針典型上包括可以對選自第6a_c、 15 7a_d、及8a_c圖之核苷酸或彼等之片段雜交之約至少14、 15 ' 16、18、20、25或28個核苔酸。通常較佳不使用長度 大於約25或28個核苷酸之探針。該寡核苷酸探針係用來鑑 定Akt核苷酸序列。 激酶檢定 20 可使用本項技藝已知之任何合適激酶檢定法以測定該 等Akt激酶之活性。例如可使用Hogg等人（〇nc〇gene 1994 9:98-96)、Mills等人(J. Biol. Chem. 1992 267:16000-006)及

Tomizawa等人2001(FEBS Lett· 2001 492:221-7)、Schmandt 等人(J. Immunol. 1994，152:96-105)中所述之方法，但不限 200836749 於此。此外，絲胺酸、蘇胺酸及酪胺酸激酶檢定法係描述 在 Ausubel 等人（Short Protocols in Molecular Biology，1999 unit 17-6)中。

Akt激酶檢定法通常可使用Akt多肽、經標記供體基 5質、及對Akt具專一性或非專一性之受體基質。在此等测定 法中，Akt可自該供體基質將經標記分子團轉移至受體基 質，且藉自該供體基質轉移至受體基質的經標記分子團之 數量而測定激酶活性。可使用各種表現系統以製成Akt多 肽’其可自細胞純化，可以呈經分裂或未經分裂之重組型 10 融合蛋白質之形式及/或可具有非Akt多肽序列，例如於其 N-或〇末端具有His標記或/3-半乳糖苷酶。若癌性細胞株 作為欲檢定之Akt來源，則可在該等癌性細胞株内檢定Akt 活性。適於Akt檢定之供體基質包括容易藉Akt而進行去磷 酸化反應之任何分子，諸如7 _標記之ATP及ATP類似物， 15其中該標記為33p、32p、35s或任何其它放射性同位素或合適 螢光標記。適於Akt檢定之受體基質包括容易藉Akt而進行 石粦酸化反應之任何多肽或其它分子。受體基質可衍生自Akt 之活體内標把的片段。受體基質片段之長度可以是8至5〇個 胺基酸、通常為10至30個胺基酸且較佳具有約1〇、12、15、 20 18、20及25個胺基酸。可根據故驗而使用一系列不同之多 肽或其它分子以測定另外受體基質。一旦反應業經進行 時，適於TTK之受體基質的標靶可自該反應之其它組份純 化。通常藉分子相互作用而完成該純化反應，其中該受體 基質係經生物素化反應並藉其與鏈黴菌卵蛋白（streptavidin) 69 200836749 或可用以專一性辨識該等受體基質之專一性抗體的相互作 用而純化。可以在各種條件下，諸如在固體載體上、在凝 膠中、在溶液内或在活細胞内，進行該反應。檢測方法之 選擇取決於用於該供體分子之標記類型且可包括，例如藉 5 放射自顯影術、閃爍、掃描或螢光X射線照相術而進行已併 入輻射或螢光的測定。 治療方法 文中提供之該等化合物及藥學組成物可用以治療病 症，其包括腫瘤、癌、及與異常細胞增生有關之其它病症。 10 在一實施例中，本發明該等化合物可用以治療癌瘤、肉瘤、 淋巴瘤、白色病、及/或骨髓瘤。在本發明之其它實施例中， 文中揭示之該等化合物可用以治療固體腫瘤。 本發明該等化合物可用於治療癌，諸如但不限於以下 器官或組織之癌：乳房、攝護腺、肺、支氣管、結腸、泌 15 尿系統、膀胱、非霍吉金氏淋巴瘤、黑色素瘤、腎瘤、腎 臟系統、胰臟、咽、甲狀腺、胃、腦、多發性骨髓瘤、食 道、肝、肝内膽道、頸、喉、急性髓性白血病、慢性淋巴 性白血病、軟組織(諸如心臟）、霍吉金氏淋巴瘤、睪丸、小 腸、慢性髓性白血病、急性淋巴性白血病、肛門、肛管、 20 肛門與直腸的系統、甲狀腺、女陰、膽囊、胸膜、眼、鼻、 鼻腔、中耳、鼻咽、輸尿管、腹膜、網膜、腸繫膜、及胃 腸道、高程度神經膠質瘤、神經膠質母細胞瘤、結腸、直 腸、胰腺、胃癌、肝細胞癌瘤；頭及頸癌、癌瘤；腎細胞 癌瘤；腺癌；肉瘤；血管内皮瘤；淋巴瘤；白血病、蕈狀 70 200836749 肉牙腫。在另外實施例中，本發明該等化合物可用以治療 皮膚病，其包括但不限於以下惡性疾病：血管肉瘤、血 苢内皮瘤基底細胞癌瘤、鱗狀細胞癌瘤、惡性黑色素 瘤及卡波西氏肉瘤；及非惡性疾病或病症，諸如牛皮癖、 5淋巴管增生、兒童血管瘤、史德奇_韋伯伽取展㈣ 症候群、尋常疲、纖維神經瘤病、結節狀硬化、腹性肉芽 腫、隱性營養不良性大泡性表皮鬆懈 '靜脈潰瘍、座瘡、 /酉赤曰鼻、濕疹、傳染性軟疣、皮脂漏性角化病、及光化性 角化病。 可使用包括本發明該等化合物之組成物以治療自該癌 之發現至晚期的任何階段之這些癌及其它癌。此外，包括 本發明化合物之組成物可用以治療原發性癌及其轉移。 在本發明其它實施例中，文中所述之該等化合物可用 於治療癌’其包括但不限於下表1中所揭示之癌。 □表1 :癌 一- □成人急性淋巴母細胞 白血病 兒童急性淋巴母細胞 白血病 成人急性趟性白血病 兒童急性髓性白血病 腎上腺皮質癌 兒童腎上腺皮質癌 AIDS關聯性癌 AIDS關聯性淋巴癌 肛門癌 兒童小腦性星形細胞瘤 兒童大腦性星形細胞瘤 □基底細胞癌 □毛細胞白血病 頭及頸癌 成人肝細胞(肝臟)癌（原發性） 兒童肝細胞(肝臟)癌(原發性） 成人霍吉金氏淋巴瘤 兒童霍吉金氏淋巴瘤 懷孕期之霍吉金氏淋巴瘤 下咽癌 兒童下丘腦及視覺神經束 神經膠質瘤 □眼内黑色素瘤 騰島細胞癌（内分泌胰腺） 波西氏肉瘤(Kaposi’s Sarcoma；) 腎細胞)癌 ---~~-- 71 200836749 肝外的膽道癌 膀胱癌 兒童膀胱癌 骨癌 骨肉瘤/惡性纖維狀 組織細胞瘤 兒童腦幹神經膠質瘤 成人腦腫瘤 兒童腦腫瘤，腦幹 神經膠質瘤 小腦性腦腫瘤 兒童星形細胞瘤 大腦性腦腫瘤 兒童星形細胞瘤/惡性 神經膠質瘤 兒童腦腫瘤，室管 膜瘤 兒童腦腫瘤，神經管 胚細胞瘤 幕上的腦腫瘤 兒童原始型神經外胚層的腫瘤 兒童腦腫瘤，視覺神經束及 下丘腦的神經膠質瘤 兒童腦腫瘤 乳癌 兒童乳癌 男性乳癌 兒童支氣管腺瘤/ 類癌 伯基特氏淋巴瘤 (Burkitfs Lymphoma) □兒童類癌瘤 胃腸類癌瘤 未知型原發性中樞神 經系統之癌瘤 兒童小腦性星形細胞瘤 兒童大腦性星形細胞瘤/ 惡性神經膠質瘤 兒童神經膠質瘤 兒童腎臟癌 □喉癌 兒童喉癌 成人急性淋巴母細胞 白血病 急性淋巴母細胞白血病 兒童原發性淋巴瘤 成人急性骨髓性白血病 兒童急性骨體性白血病 慢性淋巴細胞性白血病 慢性髒性白血病 B細胞白血病 唇及口腔癌 成人肝癌（原發性） 兒童肝癌（原發性） 非小細胞肺癌 小細胞肺癌 AIDS關聯性淋巴瘤 伯基特氏淋巴瘤 皮膚T細胞淋巴瘤，見 簟狀肉芽腫及西澤萊 (SSzary)症候群 成人霍吉金氏淋巴瘤 兒童霍吉金氏淋巴瘤 懷孕期之霍吉金氏淋巴瘤 成人非霍吉金氏淋巴瘤 兒童非霍吉金氏淋巴瘤 懷孕期之非霍吉金氏 淋巴瘤 原發性中樞神經系統 淋巴瘤 □大球蛋白血症，骨之華登特倫氏 (Waldenstrdm’s)惡性纖維性組織 細胞瘤/骨肉瘤 兒童神經管胚細胞瘤 黑色素瘤 眼内（眼)黑色素瘤 莫凱(Merkel)細胞癌瘤 成人惡性間皮瘤 72 200836749 子宮頸癌 兒童間皮瘤 兒童癌症 隱性原發性轉移性鱗 慢性淋巴細胞的白血病 狀頸癌 慢性脊髓增生 兒童多發性内分泌贅瘤形成 病症 症候群 大腸癌 多發性骨髓瘤/漿細胞贅瘤 兒童結腸直腸癌 簟狀肉芽腫 皮膚T細胞淋巴瘤，見 骨髓增生異常症候群 簟狀肉芽腫及西澤萊症候群 骨髓增生異常性/骨髓增生性 □子宮内膜癌 疾病 兒童室管膜瘤 慢性髓性白血病 食道癌 成人急性骨鏞性白血病 兒童食道癌 兒童急性骨髓性白血病 尤恩氏家族(Ewing’s family)腫瘤 多發性骨髓瘤 兒童性腺外胚細胞腫瘤 慢性骨髓增生病症 性腺外胚細胞腫瘤 □鼻腔及副鼻竇癌 肝外的膽道癌 鼻咽癌 眼癌，眼内黑色素瘤 兒童鼻咽癌 眼癌，視網膜母細胞瘤 神經母細胞瘤 □膽囊癌 成人非霍吉金氏淋巴瘤 胃癌 兒童非霍吉金氏淋巴瘤 兒童胃癌 懷孕期之非霍吉金氏 胃腸類癌瘤 淋巴瘤 顧外胚細胞腫瘤 非小細胞肺癌 兒童性腺外胚細胞 □兒童口癌 腫瘤 口腔癌，唇及口咽癌 印巢胚細胞腫瘤 骨肉瘤/骨之惡性纖維性組織 姓娠滋養細胞腫瘤 細胞瘤 成人神經膠質瘤 兒童卵巢癌 兒童腦幹神經膠質瘤 卵巢上皮癌 兒童大腦性神經膠質瘤 卵巢胚細胞腫瘤 星形細胞瘤 卵巢低惡性潛在腫瘤 兒童視覺神經束及下丘腦的 □胰臟癌 神經膠質瘤 兒童膜臟癌 □皮膚癌（黑色素瘤） 胰島細胞胰臟癌 莫克細胞皮膚癌瘤 副鼻竇及鼻腔癌 小細胞肺癌 甲狀旁腺癌 小腸癌 陰莖癌 成人軟組織肉瘤 嗜鉻細胞瘤 73 200836749 松果腺胚細胞瘤及幕上 ϋ 4tU< trfr .rfe

鱗狀細胞癌瘤，見皮膚痒 (非黑色素瘤） A 穩性原發性轉移性鱗狀 頸癌 胃癌 兒童胃癌 兒童幕上原始型 神經外胚層腫瘤 □T細胞淋巴瘤，見 蕈狀肉芽腫及西澤萊 症候群 睪丸癌 兒童胸腺瘤 胸腺瘤及胸腺癌瘤 甲狀腺癌 兒童曱狀腺癌 月盂及輸尿管之移行細胞癌 姓娠的滋養層腫瘤 □成人之未知型原發14部位的癌瘤 兒童之未知型原發性部位的癌瘤 兒童輸尿管及腎盂 之不尋常癌 移行細胞癌 尿道癌 子宮内膜的子宮癌 子宮肉瘤 □陰道癌 兒童視覺神經束及下丘腦的 神經膠質瘤 女陰癌 □華登特倫氏/大球蛋白血症 威爾斯氏腫瘤(Wilm’s Tumor) 原始型神經外胚層腫瘤 垂體腫瘤 水細胞贅瘤/多發性骨髓瘤 胸膜與肺的胚細胞瘤 巧孕期乳癌 十褒孕期霍吉金氏淋巴瘤 懷孕期非霍吉金氏淋巴瘤 原發性中樞神經系統 淋巴瘤 攝護腺癌 腎細胞（腎臟)癌 ^童腎細胞（腎臟)癌 月盂及輸尿管移行細胞癌 視網膜母細胞瘤 兒童 橫紋肌肉瘤 唾液腺癌 兒童唾液腺癌 肉瘤，尤思氏家族型腫瘤 肉瘤， 卡波西氏肉瘤 成人柔軟組織肉瘤 子宮肉瘤 西澤萊症候群 皮膚癌（非黑色素瘤） 兒童皮膚癌 在本發明另外實施例中，文中揭示之該等化合物可用 以治療血管生成關聯性疾病。 血管生成性小分子包括沙利竇邁(thalidomide)，其係部 74 200836749 份藉抑制NFkB而作用；2-甲氧基雌二醇，其可影響微管活 化作用及缺氧誘發因子（HIF la)活化作用；環-氧合酶 2(COX2)抑制劑；及低劑量之習知化療劑，其包括環磷醯 胺、蔥環素類似物、及長春花生物鹼（長春花新鹼 5 (vincristine)、長春花驗（vinblastine)(D’Amato，R.J.等人 (1994)Proc. Natl. Acad· Sci. U.S.A91，3964-3968, D，Amato, R.J.等人（1994)Proc· Natl· Acad. Sci. U.S.A91，4082-4085)。 此外，特定酪胺酸激酶抑制劑可藉降低由腫瘤及基質細胞 所產生之VEGF及其它前血管生成因子而間接減少血管生 10 成。這些藥物包括贺癌平(Herceptin)、依瑪替尼(imatinib)、 (Glivec)、及艾瑞莎（lressa)(Bergers，G·等人(2003) J⑽r⑽/ 〇/ ⑽ 111，1287-1295，Ciardiello，F.等人 (2001) Clinical Cancer Research 7? 1459-1465, Plum, S.M. 等人（2003) C/Wca/ 9, 4619-4626) o 15 最近’血管生成抑制劑已自動物模式發展至人類患 者。血管生成抑制劑代表有希望成功之用於各種癌的治療 法。最近，阿伐司汀，其係為抗血管内皮生長因子(VEGF)， 業經證明可在晚期腎細胞癌瘤中作為單一藥劑以延長生命 並在晚期結腸癌中併用化療以延長生命(Yang，J C·等人 20 (2003) New England Journal of Medicine 349, 427-434,

Kabbinavat，F·等人(2003) J0urnai of Clinical 〇nc〇1〇gy 21， 60_65)。 血官生成關聯性疾病包括，但不限於：炎症、自體免 疫病、及感染病；血管生成依存性癌包括，例如固體腫瘤、 75 200836749 血行性腫瘤（諸如白血病）、及腫瘤轉移；良好腫瘤，例如血 官瘤、聽覺神經瘤、神經纖維瘤、砂眼、及膿性肉芽腫； 類風濕性關節炎；牛皮癬；濕療；眼血管生成性疾病，例 如糖尿病性視網膜病變、早產之視網膜病變、黃斑變性、 5角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶狀體後纖維組織增 生、發紅，奥斯勒-韋伯（〇sler_Webber)症候群；心肌血管生 成，斑塊新血管生成；微血管擴張；血友病性關節；血管 纖維瘤，及傷口肉芽形成。此外，本發明組成物可用以治 療疾病，諸如但不限於：腸黏連、動脈粥瘤硬化、庞、及 10肥大性瘢痕（亦即瘢瘤）。本發明之組成物亦可用以治療由於 病原結果而具有血管生成之疾病，諸如貓抓病（R〇chde minalia quintosa)、潰瘍(Helobacter pylori)、結核病、及痲瘋。 抗藥性腫瘤或癌之治# 本舍明k供可用以治療抗樂性癌之化合物，其包括文 15中揭示之癌與曲西立濱化合物及/或硼替佐米及其衍生物。 多藥抗藥性(MDR)發生在人類癌症中且可以是化療成 功之重大障礙。多藥抗藥性為一種現象，其中業經接觸細 胞毒殺性藥劑之腫瘤細胞對一系列結構性及官能性不相關 的化合物形成交叉抗藥性。此外，MDR可内源性發生在先 2〇 前未接觸化療劑之某些癌中。因此，在一實施例中，本發 明提供用於治療患有抗樂性癌，例如多藥抗藥性癌之患者 的方法，其係藉投予如文中揭示之TCN、TCN-P、TCN-PM 或相關化合物與棚替佐米及其衍生物。在特定實施例中， TCN、TCN-P、TCN-PM與相關化合物及硼替佐米及其衍生 76 200836749 物可用以治療僅對紫杉酴(Taxol)、雷帕黴素(rapamycin)、 泰莫西芬、順-(dsplatin)、及/或吉非替尼（艾瑞莎)具抗性 之癌。 5 10 15 20

、 具她例中，如文中揭示之TCN、TCN-P、TCN-PM =目_合物與㈣佐米及其射物可驗 樂性癌： 項枯r 腎臟、腎上腺、胰臟、肝臟，及/或本 二Γ文一何其它癌。 米及其彳、、· t例巾’本發明該等曲西立濱化合物與獨替佐 —實施例$物可以與其它細胞毒殺性藥劑一起投予。在另 及彼等之έ中’、该等曲西立濱化合物與硼替佐米及其衍生物 射之情况:二：’當用於治療固體腫瘤時，可以在使用輕 化合物之另—實施例中，文中揭示之該等曲西立濱 化療劑。佐米及其御生物及組成物可併用至少一另外 流投予。兮^— 某背丨可以與文中揭示之化合物一起或輪 於在相市物可形成相同組成物之一部份或可以以適 或不同時間投予之個別組成物提供。 戰施例中，令& _ 替佐米及其扩 τ揭不之該等曲西立濱化合物與硼 力，或可併用可併用抗血管生成藥劑以增強彼等之效 劑—起投予。一匕抗血管生成藥劑並與其它細胞毒殺性藥 該等曲西立…在其匕實施例中，當用以治療固體腫瘤時， 下之藥劑口物與哪替佐米及其衍生物可以與選自以 (才又予’該等藥劑不限於·· IL-12、視黃酸類 77 200836749 (retinoids)、干擾素、血管司他汀(angiostatin)、内皮抑制素 (endostatin)、沙利竇邁、金小板反應素(thrombospondin)-l、 血小板反應素-2、卡托普利（captopryl)、抗贅瘤劑（諸如α干 擾素）、COMP(環磷醯胺、長春花新鹼、阿美蘇喋呤 5 (methotrexate)及潑尼松（prednisone))、鬼臼乙叉武 (etoposide)、mBACOD(阿美蘇喋呤、布里歐黴素 (bleomycin)、小紅莓、環磷醯胺、長春花新鹼及地塞米松 (dexamethasone)、PRO-MACE/MOPP(潑尼松、阿美蘇嗓鈴 (w/爾可福（leucovin)搶救劑）、小紅莓、環磷醯胺、鬼臼乙 10 叉甙/美加明（mechlorethamine)、長春花新驗、丙卡巴肼）、 長春花新鹼、長春花鹼、血管抑制素（angioinhibins)、 TNP-470、聚戊醣(pentosan)、多硫酸鹽、血小板因子4、血 管司他汀、LM-609、SU-1 (H、CM-101、特可能(Techgalan)、 沙利竇邁、SP-PG及輻射。在另外實施例中，文中揭示之該 15 等化合物及組成物可以與以下藥物一起或輪流投予：例如 具抗有絲分裂作用之藥物，諸如可將細胞骨架的元素定標 之藥物，其包括鬼臼素(podophylotoxin)或長春花生物驗(長 春花新驗、長春花驗）；抗代謝產物藥物（諸如5-氟尿。密。定、 阿糖胞苷（cytarabine)、傑西塔賓（gemcitabine)、嗓吟類似 20 物，諸如喷司他汀(Pentostatin)、阿美蘇喋呤）；烷化劑或氮 芬（諸如亞硝基脲、環磷醯胺或艾福醯胺(if〇sphamide);可 將DNA訂標之藥物，諸如該等蒽環素藥物，艾黴素 (adriamycin)、小紅莓、泛艾黴素(pharmorubici…或表柔比 辛；可將拓樸異構酶訂標之藥物，諸如鬼臼乙冬武；激素 78 200836749 及激素促效劑或拮抗劑，諸如雌激素、抗雌激素(泰莫西芬 及相關化合物）及雄激素、氟他酷胺（flutamide)、柳培林 (leuprorelin)、戈舍瑞林(goserelin)、塞普川（cyprotrone)或奥 曲肽（octreotide);可將腫瘤細胞内之信號傳導訂標的藥 5物，其包括抗體衍生物，諸如霍塞挺；烷化藥物，諸如鉑 藥物（順翻、卡始（carboplatin)、奥沙利銘（oxaliplatin)、佳鈾 帝（paraplatin)或亞頌基脲；可潛在性影響腫瘤轉移之藥 物，諸如基質金屬蛋白酶抑制劑；基因治療劑及反訊息藥 劑；抗體治療藥劑；海洋來源之其它生物活性化合物，尤 10其滴澄寧（didemnin)，諸如阿波里啶(aplidine);類固醇類似 物，特別為地塞米松；抗催吐藥，其包括511孓3抑制劑（諸 如才口倫西牙（gramisetron)或翁登西川（ondasetron)、與類固醇 及彼等之衍生物，特別為地塞米松。在又另外實施例中， 該等化合物及組成物可以與下表2中所揭示之化療劑一起 或輪流使用。

表2 :化療劑 -13 -順式-視黃酸 -2-胺基-6-疏基嗓呤 -2-CdA

-2-氯去氧腺苔 -5-氣尿β密σ定 -5-FU -6-TG -6-硫島嗓呤 -6-魏基嗓呤 -6_ΜΡ -阿庫坦(Accutane) -放射菌素-D -艾徽素 環鱗酸胺(Neosar) 紐拉塔(Neulasta) 紐密伽(Neumega) 紐波傑（Neupogen) -尼南尊(Nilandron) -尼魯醯胺(Nilutamide) 氟芥 -諾瓦得士(Novaldex) -小藍莓（Novantrone) 奥曲肽 -奥曲肽乙酸鹽 -腫瘤死（Oncospar) 79 200836749 -阿卓西(Adrucil) -安閣靈(Agrylin) -阿拉可（Ala-Cort) •阿留浮(Aldesleukin) 阿能朱麻(Alemtuzumab) -順式視黃酸(Alitretinoin) -阿卡班（Alkaban)-AQ -威克瘤（Alkeran) 全反式視黃酸 -α干擾素 -六甲蜜胺（Altretamine) -甲胺σ票呤(Amethopterin) -胺碟、;丁（Amifostine) -胺基麩乙基醯亞胺 (Aminoglutethimide) -阿那格雷(Anagrelide) -阿南鑽(Anandron) •阿那斯唾(Anastrozole) "阿糖胞苔(Avabinosylcytosine) •阿拉(Ara)-C -阿倫斯波(Aranesp) •雷狄亞(Aredia) -阿里米德（Arimidex) -諾曼素(Aromasin)

-三氧化石申 _天冬醯胺酶 -ATRA -癌思停（Avastin)

-BCG

_BCNU -貝戈西朱麻(Bevacizumad) -貝莎羅亭（Bexarotene)

•必卡他胺(Bicalutamide) -BiCNU _布雷生（Blenoxane) -布里歐黴素(Bleomycin) -爛替佳密（Bortezomib) -白消胺（Busulfan) -白消非(Busulfex) -腫瘤平（Ontak) -腫瘤塌（Onxal) -腫瘤縮（Onxal) -歐普貝淨(Oprevelkin) -歐拉普霍(Orapred) -歐拉松（Orasone) -奥沙利鉑 -太平洋紫杉醇 -帕平膦酸鹽(Pamidronate) -盤雷、;丁(Panretin) -佳始帝 -佩帝普（Pediapred) -PEG干擾素 -培門冬酶(Pegaspargase) -培非司亭（Pegfilgrastin) -PEG插進子（Intron) •PEG-L-天冬酿胺酶 -苯基丙胺酸芥子 -順氣胺鉑（Platinol)

-順氣胺鉑-AQ -腎上腺皮質酮(Prednisolone) -潑尼松 -潑隆（Prelone) -丙卡巴肼 -普克萊特(PROCRIT) -普留淨(PiOleukin) -具有卡莫司汀植入物之普非斯本 (Prolifeprospan)20 -σ票呤素(Purinethol) -雷洛西芬(Raloxifene) 甲胺喋呤(Rheumatrex) -雷度珊(Rimixan) -雷突西麻(Rituximab) '羅貝南（Roveron)-A (a-2a干擾素） -魯貝斯(Rub ex) -紅比黴素(Rubidomycin)鹽酸鹽 -善得定（Sandostatin)

-善得定LAR 80 200836749

-C225 -爾可福!丐(Calcium Leucovorin) -坎伯斯（Campath) -抗癌妥(Camptosar) -坎普特賽辛(Camptothecin)-11 -截瘤達(Capecitabine) -卡拉克(Carac) -卡舶（Carboplatin) -卡莫司、;丁(Carmustine) -卡莫司汀晶片 -可蘇多（Casodex) -CCNU -CDDP -CeeNU -色比咬（Cerubidine) -塞突西麻(Cetuximab) •苯丁 酸氮芥(Chlorambucil) -川員翻（Cisplatin) •嗜橙菌（Citrovorum)因子 •克拉屈濱（Cladribine) -可體松(Cortisone) -可美淨(Cosmegen) -CPT-11 -環磷醯胺 -西他尊(Cytadren) •阿糖胞苷（Cytarabine) -阿糖胞誓微脂體 -賽德莎（Cytosar)-U -賽德勝(Cytoxan) -達卡巴仁（Daccarbazine) 放線菌素(Dactinomycin) -α 達貝汀（Darbepoetin alfa) -道諾黴素(Daunomycin) -道諾比辛（Daunorubicin) 道諾比辛 鹽酸鹽 •道諾比辛微脂體 -唐索（DaimoXome) -立可樂(Decadron) -沙格司亭（Sargramostim) -舒汝固體膚（Solu-Cortef) -舒汝美卓佑(Solu-Medrol) •STI-571 •鏈尿黴素（Streptozocin) -泰莫西芬(Tamoxifen) •塔格雷、汀（Targretin) -紫杉紛(Taxol) -勉癌易（Taxotere) -替莫達(Temodar) •帝盟多（Temozolomide) -替尼泊戒（Teniposide) -TESPA -沙利竇邁(Thalidomide) -沙利度胺(Thalomid) -泰拉西斯(TheraCys) -硫鳥 σ票呤（Thioguanine) -硫鳥嘌呤藥片 -硫磷醯胺 塞普雷斯(Thioplex) -塞替派(Thiotepa) -TICE •拓樸莎（Toposar) •拓樸替康（Topotecan) -托瑞米芬(Toremifene) -曲妥朱单抗 -維生素 A酸(Tretinoin) -摧索(Trexall) -三氧化二神（Trisenox) -TSAP -VCR •貝班（Velban) -貝卡德(Velcade) -滅必治（VePesid) -凡善能（Vesanoid) •拜德（Viadur) -長春花驗 -長春花驗硫醯鹽 -文卡莎（Vincasar)Pfs 81 200836749 -6 -固體層（Delta-Cortef) _德培松(Deltasone) -地尼白介素(Denileukin difitox) -地波賽特(DepoCyt) -地賽米松(Dexamethasone) -地賽米松乙酸鹽 •地賽米松填酸鈉 -得舒瑞(Dexasone) 右雷佐生（Dexrazoxane) -DHAD -DIC -敵德斯(Diodex) -多西紫杉醇(Docetaxel) -多西爾（Doxil) -小紅莓（Doxorubicin) -小紅每微脂體 -卓賽(Droxia) -DTIC -DTIC-半球形物 -杜拉隆（Duralone) -依夫德斯(Efudex) -依利格(Eligard) -依能斯（Ellence) •益樂顧（Eloxatin) -愛施巴(Elspar) -依立適通(Emcyt) -表柔比辛(Epinubicin) -ck 依優汀(Epoetin alfa) -爾必得舒(Erbitux) -伊歐文氏桿菌（Erwinia)L -天冬醯胺酶 -雌莫司汀（Estramustine) -乙西醇(Ethyol) -依托波松(Etopophos) -鬼臼乙叉式 -鬼臼乙叉甙磷酸鹽 -優里辛（Eulexin) -#5 穩(Evista) -長香新驗 -溫諾平（Vinorelbine) -溫諾平酒石酸鹽 -VLB -VP-16 -威猛(Vumon) -截瘤達(Xeloda) -忍諾莎（Zanosar) -澤伐靈(Zevalin) -吉卡(Zinecard) -佐拉德(Zoladex) 坐來磷酸(Zoledronic acid) -卓骨她(Zometa) -格來德晶片（Gliadel wafer) -基立克(Glivec) -CM-CSF -戈舍瑞林 -粒性細胞-菌落刺激因子 -粒性細胞巨噬細胞菌落刺激因子 -氟甲睪酮(Halotestin) -贺癌平 -六卓隆丁 (Hexadrol) •克瘤靈(Hexalen) -六甲蜜胺 -HMM -癌康定(Hycamtin) -雙治（Hydrea) -海卓可(Hydrocort)乙酸鹽 •氣皮質酮（Hydrocortisone) 皮質酮磷酸鈉 卞皮質酮琥珀酸鈉 '氫皮質酮磷酸鹽 -經基脲 -替伊莫（Ibritumomab) -替伊莫單抗(Ibritumomab Tiuxetan) •泛達黴素(Idamycin) ^乏達比辛(Idarubicin) 斯(Ifex) 82 200836749

-依西美坦(Exemestane) -弗瑞斯(Fareston) -就維司群(Faslodex) -弗隆(Femara) -惠爾 jk添(Filgrastin) -氟尿苷（Floxuridine) -福達樂(Fludara) -福達樂濱(Fludarabine) 氟普雷斯(Fhioroplex) -氟癌星（Fluorouracil) -氟癌星(乳劑） -氟美特隆(Fluoxymesterone) -氟他酿胺 -四氫葉酸(Folinic Acid) _FUDR -法洛德（Fulvestrant) -G-CSF -吉非替尼 -傑西塔濱 -傑朱麻歐札辛 (Gemtuzumab ozogamicin) -健擇(Gemzar) -基立克(Gleevec) -陸普隆(Lupron) -陸普隆迪波特(Lupron Depot) -甲苯肼(Matlane) •目滴舒(Maxidex) "美加明（Mechlorethamine) -美加明鹽酸鹽 -美卓隆(Medralone) -美卓佑(Medrol) -麥格斯(Megace) -甲地孕酮(Megestrol) •甲地孕酮乙酸鹽 -美發能(Melphalan) -疏基嘌呤 -美司納(Mesna) "美司内克斯(Mesnex) -阿美蘇喋呤 -a -IFN -愛斯達好克癌（Ifosfamide) -IL - 2 -IL-11 依瑪替尼(Imatinib)甲石黃酸鹽 -咪唑羧醯胺 β α干擾素 -a -2b干擾素(peg綴合物） -介百素-2 -介百素-11 -插入子(Introm)A( a -2b干擾素) -爾可福 -瘤克寧（Leukeran) •瘤克因（Leukine) -柳培林 -長春新驗(Leurocristine) -祿斯得停(Leustatin) -微脂體(Liposomal) Ara-C -液體普雷(Liquid Pred) 洛莫司汀(Lomustine) -L-DAM 沙可來斯（Sarcolysin) "美可添(Meticorten) -絲裂黴素 -絲裂徽素-C -米托蒽醌 M-普尼松（Prednisol) -MTC -MIX -氮芥(Mustargen) •芥斯汀(Mustine) -木他黴素(Mutamycin) -邁樂寧(Myleran)-艾瑞莎 -愛萊諾迪肯(Irinotecan) -異維 A酸(Isotretinoin) -吉道酶(Kidrolase) -拉那可特 -L-天冬醯胺酶 83 200836749 -阿美蘇嗓呤納 ^CR " -甲基腎上腺皮質酮 -麥洛西(Mylocel) -雷托 0坐（Letrozole) 在特定實施例中，干擾素(IFN)可以與本發明該等化合 物一起使用。合適的干擾素包括：a： _2a干擾素、a-2b干擾 素、聚乙二醇化α_干擾素(其包括0：_23干擾素&a-2b干擾 5素）、召干擾素、7干擾素、τ干擾素、ω干擾素、InterMune 製造之因弗傑（INFERGEN)(alphacon-l干擾素）、viragen製 造之歐尼弗隆(OMNIFERON)(天然干擾素）、Human Genome Science製造之俄佈弗隆(ALBUFERON)、Ares-SeiOno製造 之雷比夫(REBIF)(yS - la干擾素）、BioMedicine製造之ω干擾 10 素、Amarillo Biosciences製造之口服 α 干擾素、及InterMune 製造之7干擾素、τ干擾素、及/或τ -1 /3干擾素。 在一實施例中，如文中揭示之TCN、TCN-P、TCN-PM 或相關化合物及一或多種顧化合物可以與另外化療劑，諸 如文中或表2内所描述之化療劑，一起或輪流使用以治療抗 15 藥性癌，例如多藥抗藥性癌。抗藥性癌可包括結腸癌、骨 癌、腎臟癌、腎上腺癌、胰臟癌、肝癌及/或本項技藝申已 知或文中所述之任何其它癌。在一實施例中，該另外化療 劑可以是P-醣蛋白質抑制劑。在特定非限制性實施例中， 該P-醣蛋白質抑制劑可選自以下藥物··維拉帕米 20 (verapamil)、環孢黴素(諸如環孢黴素A)、泰莫西芬、鈣調 蛋白激酶（calmodulin)拮抗劑、德斯維拉帕米 (dexverapamil)、德斯尼地品（dexniguldipine)、貝斯波達 84 200836749 (^^18卩〇(1&〇(?80 833)、比可達(1^1^〇(131*)(^/又-710)、搭吉達 (tariquidar)(XR9576)、佐斯吉達（zosuquidar)(LY335979)、 能吉達(laniquidar)(Rl〇1933)、及/或ONT-093。 藥學組成物 5 該等包括曲西立濱化合物與硼替佐米及其衍生物之組 成物可選擇性與藥學載劑或賦形劑一起投予。適於文中提 供之化合物的投藥之藥學載劑包括熟悉本項技藝者已知適 於特定投藥模式之任何此等載劑。該等曲西立濱化合物與 硼替佐米及其衍生物可一起經調製成該組成物内之唯一藥 10學活性成份或可併用硼替佐米及其衍生物。 包括該等曲西立濱化合物與硼替佐米及其衍生物之組 成物可適於口服、直腸投藥、鼻投藥、局部投藥（其包括頰 及舌下投藥）、陰道投藥或非經腸（其包括皮下、肌内、靜脈、 皮内、眼内、氣管内、腦池内、腹膜内、及硬膜外)投藥。 15 該等組成物較佳經靜脈注射。 該等組成物最好可以呈單位劑型且可藉習知藥學技術 而製成。此等技術包括使-或多種本發明組成物與多 種藥學載劑或賦形劑締合。 ，可將該等曲西立濱化合物與侧替佐米及其街生物及彼 2〇等之組成物調製成適於口服之藥學製劑，諸如溶液、雜办 液、錠劑、可分散錠劑、丸劑、膠囊、散劑、持續釋： 方或醜劑，或難成適於_腸投藥之域溶液或 液、以及經皮貼劑與乾粉末吸入劑。在一實施例中，^ 用本項技藝已熟悉之技術及程序將上述曲西立濱化合物調 85 200836749 製成藥學組成物（見，例如Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第 4版，1985，126)。 在該等組成物中，可以使有效濃度之一或多種化合物 或其藥學上可接受衍生物與一或多種合適藥學載劑混合。 5在調製前可以將本發明該等化合物衍化成對應鹽、酯、烯 醇醚或酯、縮酿、縮酮、原酯、半縮醒：、半縮酮、酸、驗、 溶劑化物、水合物或前藥。一旦投藥時，組成物内之該等 化合物濃度能有效遞送可治療、預防或改善該標靶疾病或 病症之一或多種症狀的數量。在一實施例中，該等組成物 10經調製成適於單一劑量投藥。為了調製組成物，使該重量 分散之化合物溶解、懸浮、分散或混合在特定載劑中，其 濃度能有效緩解、預防所治療之病症或可改善一或多種症狀。 適於口服之組成物可以以下述形式提供：各別單元， 諸如但不限於各含預定數量之—❹種科組成物的鍵 劑、囊片、丸劑或糖衣藥丸、膠囊或扁囊劑；散劑或顆粒； 在水性液體或非水性液體中之溶液或懸浮液；或水包油液 體乳液或油包水乳液、或團狀物等。 可，例如藉在載劑，諸如水、鹽液、水性右旋糖、甘 油、乙二醇、乙醇等，内溶解、分散或混合曲西立濱及視 20需要選用之藥學佐劑以形成溶液或懸浮液而製成液態藥學 上可投予組成物。若必要，欲投予之該藥學組成物亦可含 有少量非毒性輔助物質，諸如潤濕劑、乳化劑、增溶劑、 PH緩衝劑、防腐劑、調味劑、及諸如此類，例如乙酸酸、 擦檬酸鈉、環糊精衍生物、山梨糖醇針單月桂酸醋、 86 200836749 醇胺乙酸鈉、三乙醇胺油酸酯、及其它此等藥劑。製備此 等劑型之方法係已知或為熟悉本項技藝者所知；例如見 Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company，Easton，Pa·，第 15版，1975 〇 5 適於口内局部投藥之本發明組成物包括，例如具有以 調味為基礎之成份，通常為蔗糖及金合歡膠或黃蓍膠的含 片；具有本發明之曲西立濱化合物與硼替佐米及其衍生物 在惰性成份，諸如明膠及甘油、或嚴糖及金合歡膠中之I定 劑；及具有以合適液體載體投予之本發明該等組成物的漱 10 口液。 該等錠劑、丸劑、膠囊、口含錠等可含有一或多種以 下成份或類似性質之化合物：結合劑、潤滑劑、稀釋劑、 助滑劑、分解劑、著色劑、甜化劑、調味劑、潤滑劑、催 吐包衣、及薄膜包衣。結合劑之實例包括微結晶狀纖維素、

15黃蓍膠、葡萄糖溶液、阿拉伯膠黏液、明膠溶液、糖蜜、 聚乙浠σ比洛咬、聚乙烯啦略酮(povidone)、交聯之聚乙婦外匕 咯_、蔗糖及澱粉糊狀物。潤滑劑包括滑石、澱粉、硬脂 20 酸鎂或硬脂酸鈣、石松子(lycopodium)及硬脂酸。稀釋劑包 括，例如乳糖、嚴糖、殿粉、高嶺土、鹽、甘露醇及= 二鈣。助滑劑包括，但不限於：膠態二氧化矽。分解劑包 括交聯之羧甲基纖維素鈉、澱粉乙醇酸鈉、也4 ^ ^ ，每澡酸、玉米 澱粉、馬鈴薯澱粉、膨潤土、甲基纖維辛、搶 、 夏脂及羧甲基 纖維素。著色劑包括，例如任何已許可合袼的水了、，性 及c染料、彼等之混合物；及懸浮在二氧化叙水人物1 权 87 200836749 不可浴性FD及C染料。甜化劑包括蔗糖、乳糖、甘露醇及 人造甜化劑’諸如糖精，及任何數量之喷露乾燥調味劑。 调味劑包括萃取自植物（諸如水果）之天然調味料及可產生 愉快感覺之合成化合物摻合物，諸如但不限於：薄荷及柳 5酸甲酯。潤濕劑包括丙二醇單硬脂酸酯、山梨糖醇酐單油 酸醋、二乙二醇單月酸酯及聚氧化乙烯月桂醚。催吐包衣 包括脂肪酸、脂肪、蠟、蟲膠、氨化蟲膠及乙酸纖維素酞 酸醋。薄膜包衣包括羥乙基纖維素、羧曱基纖維素鈉、聚 乙二醇4〇〇〇及乙酸纖維素酞酸酯。 ° 適於對皮膚局部投予之組成物可以以具有一或多種以 藥學上可接受載劑投予之組成物的軟膏、乳劑、凝膠、及 糊狀物提供。 適於直腸投藥之組成物可以以具有合適基劑，其包括 例如可可脂或柳酸g旨之栓劑提供。 5 當該載劑為固體時，適於鼻投藥之組成物包括以可用 鼻吸入之方式投予（亦即藉自緊密接近鼻子的含該散劑之 容1§而經由鼻道快速吸入）的粗散劑，其粒度在，例如2〇至 500微米之範圍内，一或多種該等組成物可在水性或油性溶 液内摻合並吸入或噴入該鼻道内。 適於陰道投藥之組成物可以以含有一或多種該等組成 物及合適載劑之陰道藥栓、填塞物、乳劑、凝膠、糊狀物、 泡沫或喷劑配提供。 適於非經腸投藥之組成物包括可含有抗氧化劑、緩衝 劑、制菌劑、及使該配方與預定受體之血液具等滲性的溶 88 200836749 貝之水性及非水性無菌注射液；及可包括懸浮劑及增稠劑 之水性及非水性無菌懸浮液。該等組成物可以以單位劑量 或多劑量容器（例如密封安瓶及小玻瓶)提供且可貯存在僅 而要於使用前不久添加液體載劑，例如注射用水之冷凍乾 A 東乾)條件下。可自先前所述之無菌散劑、顆粒及錠劑種 類製成隨時可用的注射液及懸浮液。

1〇 15

2〇 』使用適於經腸或非經腸投藥之藥學有機或無機固體 ^體載劑介質以製備該等組成物。明膠、乳糖、殿粉、 二=酸鎮、滑石、蔬菜及動物脂肪與油、樹膠、聚伸烧基 醇、水或其它已知载劑全部皆適於作為載體介質。 包括曲西立濱化合物與萄佐米及其衍生物之 用从併用藥學上可接受載劑介質及/或賦形劑。如文 、〜α之載劑、浴劑、稀釋劑或其它液體媒劑、 =佐劑、表面活性劑、等滲劑、增_或乳化劑、=或懸 體結合劑、潤滑劑、佐劑、媒劑 ：劑、 吸收劑、表面活化劑、著色劑、調味劑或甜^等刀解劑、 另外’該等包括曲西立濱化合物與㈣佐 ^紐成物可併用藥學上可接受賦形劑及視需要、诉生 :擇放基質’諸如可生物降解 成=之持 :。“藥學上可接受_劑’，包括非毒性固體成::性組成 體填料、稀釋劑、包ρ 口體或液 梦… 材科或任何類型之配方佐劑。 …、而，應瞭解該等組成物之洎每 生根據合理的醫學判斷而決定。就任何特定==責二 200836749 定治療上有效劑量可取決於各種因素，其包括，例如欲治 療之病症及該病症之嚴重程度；所使用特定組成物之活 性；患者所使用之特定組成物、年齡、體重、一般健康狀 况、性別及日常飲食；投藥的時間；投藥方式；所使用特 5疋化合物之排液速率；治療的持續時間；與所使用特定組 成物一起或同時使用之該曲西立濱化合物及/或删替佐米 及其衍生物；及醫學技藝中已為吾人所熟知之類似因素。 例如在本項技藝之技術範圍内最好先投予其劑量低於獲得 所欲療效所需之劑量的該組成物，然後逐漸增加劑量，直 10到獲得所欲療效為止。 為了方便投藥及劑量之均勻性，較佳以劑量單位形式 。周製包括曲西立濱化合物與硼替佐米及其衍生物之組成 物如文中使用’“劑量單位形式，，係指適於欲治療之宿主 的触成物之實際上各別單位。各劑量應該含有本身或與 μ特定藥學载劑介質締合經預計可產生所欲療效之數量的組 早父1至單位劑 t Β句母曰劑1或單位、每 亞劑量或其合適分數之經投予成份。例如每天m至50毫声 文中揭示之化合物可降低小鼠體内之固體腫瘤的體積。 该劑量可取从宿主因素，諸如財、年齡、表 新陳代謝仙、組織分佈、吸收速率及㈣速率。在— :中二天可對人類投予約。.5至7克之文中揭示： 減合物。每天可選擇性地對人類投予約！至 立 物。在特定實施财，每天對人類料咖至=合 20 200836749 • 5 合物。治療上有效劑量可取決於許多如上述之因素。此外， 在本項技藝之範圍内最好先使用相當低劑量之該組成物， 然後增加劑，直到獲得所欲療效為止。 包括曲西立濱化合物與硼替佐米及其衍生物之組成物 可以併用持續釋放基質，該基質可以由通常為聚合物之材 料製成，且其可藉酶催或以酸為主之水解作用或藉溶解作 用而降解。一旦進入體内時，該基質係藉酶及體液而作用。 例如持續釋放基質係選自生物可相容物質，諸如脂質體、 聚乳交酯（聚乳酸）、聚乙交酯（乙醇酸之聚合物）、聚乳交酯 10 共-乙交酯（乳酸及乙醇酸之共聚物）、聚酸酐、聚（原)酯、多 肽、透明質酸、膠原、硫酸軟骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、 多醣、核酸、聚胺基酸、胺基酸(諸如苯基丙胺酸、絡胺酸、 異白胺酸）、聚核苷酸、聚乙烯基丙烯、聚乙烯吡咯啶酮及 聚矽氧。較佳之生物可降解基質為聚乳交酯、聚乙交酯或 15 • 聚乳交酯共-乙交酯（乳酸及乙醇酸之共聚物）中之任一種的 基質。 該等曲西立濱化合物及與硼替佐米及其衍生物亦可以 以微脂體之形式投予。如本項技藝中所知，微脂體通常衍 生自磷脂或其它脂質。微脂體係藉分散在水性介質内之單 20 一或多層狀水合液體結晶而形成。可使用能形成微脂體之 任何非毒性、生理上可接受且可代謝之脂質。除了本發明 之一或多種組成物外，該微脂體可含有安定劑、防腐劑、 賦形劑等。脂質之實例為天然及合成之磷脂與磷脂醯膽鹼 (卵磷脂）。形成微脂體之方法在本項技藝中係已知。 91 200836749 成適於ί曲2濱化合物與硼替佐米及其衍生物可經調製 之這此而_之氣溶膠。適於對呼吸道投予 或呈杯氣溶膠形式或個於霧化器之溶液形式 載劑，諸緻財形式，且可單㈣併用惰性 之顆粒^錢。在此種情況下，m射，該配方 之顆粒具有小於5〇微米之 者 直徑小於_米。 w ^财，其顆粒 10 包括該等曲西立濱化合物與硼#佐米及其魅物之組 可以^它組成物及/或程序—起使用以治療上述病 ’正、例如取好使用手術、輕射或化療及本發明之一或多種 組成物以治療腫瘤，然後可對該患者投予本發明之-或多 種組成物叫長彳轉移之不活動狀態並衫化、抑制或降 低任何殘留原發性腫瘤之生長。 另外實施例 15 可根據用於製備藥學上有用組成物之已知方法以調製 該等包括曲西立濱化合物與硼替佐米及其衍生物之藥學組 成物。配方係描述在許多已為吾人所熟知且容易由熟悉本 項技藝者取得之來源。例如Remington，s Pharmaceutical

Sciences (Martin EW[ 1995] Easton Pennsylvania，Mack 2〇 Publishing，Company，第19版)描述可以與本發明一起使用 之配方。適於投藥之配方包括，例如可含有抗氧化劑、緩 衝劑、制菌劑、及使該配方與預計受體之血液具等滲性的 溶質之水性無菌注射液；及可包括懸浮劑及增稠劑之水性 及非水性無菌懸浮液。該等配方可以以單位劑量或多劑量 92 200836749 ^ 5 容器（例如密封安瓶及小玻瓶)提供且可貯存在僅需於使用 前添加無菌液體載劑，例如注射用水之冷滚乾燥（涞乾)條件 下。可自無菌散劑、顆粒、錠劑等製備可隨時使用之注射 液及懸浮液。應瞭解除了上文特別揭示之成份外，本發明 該等配方可包括已考慮到所述配方類型之本項技藝中習知 之其它藥劑。 • 10 例如就抑制癌性細胞之生長而言，本發明該等方去最 好可併用至少一另外治療法，其包括但不限於：化療、放 射療法、可選擇性抑制Ras致癌性傳訊之治療法或孰朵声之 治療及管理的技藝者已知之任何其它治療法，諸如^产巧 之投藥。 15 • 可進行API-2(曲西立濱）鹽之投藥。藥學上可接受鹽之 實例為使用可形成生理上可接受陰離子之_形成之^機 酸加成鹽’例如甲苯磺酸鹽、曱磺酸鹽、乙酸鹽、摔樣酸 鹽、丙二酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、笨甲酸鹽、 酸鹽、α-酮基戊二酸鹽、及α_甘油磷酸鹽。亦可形成2適 的無機鹽，其包括鹽酸鹽、硫酸鹽、石肖^ 及碳酸鹽。 20 可使用本項技藝中已為吾人所熟知之標準程序獲得荜 學上可接受鹽，例如藉使充份祕之化合物，諸斑 可產生生理上可接受陰離子之合適 /、 心文久應。亦可製 之驗金屬（例如鈉、鉀_)或驗土金屬（例如和鹽。 可將該等曲西立濱化合物與爾佐米及其ς 成適於所選用之㈣方式，亦即口服或非經腸方式之= 93 200836749 内、肌内、局部或皮下投藥方式之各種形式的藥學組成物 並對患者(諸如人類或獸醫的患者)投予。 因此’本發明該等曲西立濱化合物與硼替佐米及其衍 生物可以與藥學上可接受媒劑（亦即載劑），諸如惰性稀釋劑 5或可及收的良用栽劑，一起系統性投予，例如口服。其可 包封在硬或軟毂明膠膠囊内，可壓擠入錠劑内或可直接與 患者之飲食併用。就治療性口服而言，該等化合物可併用 或夕種賦幵v劑且以下述形式使用：可攝食之錠劑、頰錠 劑、口含錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、薄片等。此等

劑之百分比當然可不同且最好可介於特定單位劑型重量之 約2至約60%之間。料治，療上有用組成物巾該活性化合物 之含量可獲得有效劑量。 該等錠劑、口含錠、丸劑、膠囊等亦可含有以下組份： 、阿拉伯膠、玉米澱粉或明膠；賦形

結合劑，諸如黃蓍勝 劑’諸如填酸二_ ; 6 海藻酸等；潤滑劑，言 果糖、乳糖或阿pi 94 200836749 5 參 10 15 20 酸甲酯及對經基苯甲酴而萨 曰、扣料及調味料，諸如櫻桃戋 柑橘調味料。當然，用於數 铋祧次 入旦Μ目1 、[備任何早位劑型之任何材料的 3里顧具樂學上可接受性且實質上無毒性。此外，本發 明斜化合物可併人持續釋放製劑及裝置内。 ^藉輸注或注射而進行該等曲西立濱化合物與_ 卡及其诉生物之靜脈或腹膜内投藥。可以在水中選擇性 地與非毒性表面活化劑混合以製成該等活化劑或彼等之趟 的溶液。亦可在甘油、液體聚乙二醇、三__ 及彼=之混合物中、及在油中製備分散液。在貯存及使用 之正㊉條件下’這些製劑含有可防止微生物生長之防腐劑。 ,適於注射或輸注之該等藥學劑型可包括含有適於隨時 製備無菌可注射或可輸注溶液或懸浮液且可選擇性包膜在 微脂體内之活性成份的錢水性溶液或分散液或無菌散 劑。就-切情況而言’於製造及貯存之條件下，該最终劑 型必需是無菌、流體且具安定性。該液體載劑或媒劑可以 是溶劑或液體分散液介質，其包括，例如水、乙醇、多元 醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等）、蔬菜油、非毒性 甘油醋、及彼等之合適混合物。可藉以下方式而維持合適 流動性，例如藉形成微脂體、藉維持所欲粒度(就分散液而 言）或藉使用表面活化劑。可藉各種抗細菌劑及抗真菌劑， 例如對經基苯甲酸醋、氯丁醇、盼、山梨酸、乙果硫柳酸 鈉(thimerosal)等，而防止微生物作用。就許多情況而言， 較佳可包括等滲劑’例如糖、緩衝劑或氣化納。可藉在該 等組成物内使用能延緩吸收作用之藥劑，例如單硬脂酸鋁 95 200836749 及明膠，而延長該等可注射組成物之吸收作用。 藉將必要數量之本發明化合物及各種上述其它成份併 入合適溶劑内，且若必要，繼而進行過濾滅菌而製成無菌 注射液。就用於製備無菌注射液之無菌散劑而言，較佳之 5製法為真空乾燥及冷凍乾燥技術，其可產生具有該活性成 份及存在於先前經過濾滅菌之溶液内的任何另外所欲成份 之散劑。 就局部投藥而言，該等曲西立濱化合物與硼替佐米及 其衍生物可以以純形式（亦即液體)施用。然而，彼等適量較 10佳以和皮膚上可接受之載劑（其可以是固體或液體）組八之 組成物或配方對皮膚投予。 有用的固體載劑包括微細緻固體，諸如滑石、黏土、 微晶狀纖維素、二氧化矽、二氧化鋁等。有用的液體載劑 包括水、醇或乙二醇或水-醇/乙二醇摻合物，其中可選擇性 15借助於非毒性表面活化劑使本發明該等化合物以有效量溶 解或分散。可添加佐劑，諸如香料及另外抗微生物劑，以 使特定用途之性質最佳化。可使用自吸水墊施用之所形成 液體組成物以浸潰繃帶及其它包敷料或使用泵型或氣溶劑 噴霧器將其喷在經感染區域上。 20 亦可連同液體載劑使用增稠劑，諸如合成聚合物、脂 肪酸、脂肪酸鹽及酯、脂肪醇、經改質纖維素或經改質礦 物質，以形成可直接施用至使用者之皮膚上的可塗開糊狀 物、凝膠、軟膏、肥皂等。可用以遞送本發明該等化合物 至皮膚上之有用的皮膚用組成物揭示在以下資料中· 96 200836749

Jacquet等人（美國專利第4,608,392號）、Geda(美國專利第 4,992,478號）、Smith等人（美國專利第4,559，157號）及

Woltzman(美國專利第4,820,508號）。 可藉在動物模式内比較本發明該等藥學組成物之活體 5 外活性及活體内活性而測定彼等之有用劑量。在小鼠、及 其它動物至人類中之有效劑量的外推法在本項技藝中係已 知，例如見美國專利第4,938,949號。 在一非限制性實施例中，活性劑在液體組成物（諸如乳 劑）中之濃度可以自約0.1至25重量％或自約〇.5至10重量 10 %。在一實施例中，其在半固體或固體組成物（諸如凝膠或 散劑）中之濃度可以是約0.1至5重量％、較佳約0.5至2 5重量 %。在一實施例中，就成人而言，適於注射、輸注或攝食 之單一劑量通常在5至15〇〇毫克之間不等且每天可投予工至 3次以產生約0.1至50毫克/公斤之劑量。在合適地判斷個體 15之體重下，本發明一非限制性口服劑量可以是每天介於7 5 至45毫克之間。 因此，本發明包括曲西立濱化合物與硼替佐米及其衍 生物或彼等之藥學上可接受鹽及藥學上可接受載劑的藥學 組成物。包括一數量之曲西立濱化合物及硼替佐米及其衍 20生物或彼等之藥學上可接受鹽的適於口服、局部或非經腸 投藥之藥學組成物構成本發明一較佳實施例。就本發明而 言，對患者，特別為人類，所投予之劑量應該在合理的時 間架構内足以影響該患者之治療反應。熟悉本項技蓺者暸 解該劑量可取決於各種因素，其包括該動物之健康狀況、 97 ‘哪36749 亥動物之體重以及癌之嚴重程度及癌期。 /合適劑量為可以使該等曲西立濱化合物與硼替佐米及 二订生物在已知腫瘤組織内的濃度可影響所欲反應的劑 ^ 較仏劑1為可導致癌細胞生長之最大抑制作用且不 、击士失控的副作用之劑量。如可藉一般技術者所決定，可 jN* 一 乂不同的間隔投予API-2(或其藥學上可接受鹽）。 乳，Z侍利於該等用於抑制癌細胞生長之所揭示方法的哺 猩雅種L括，但不限於：靈長目動物，諸如猿、黑猩猩、 從獲、人麵 ， 10 15 竺鼠八、狼子，馴養動物(例如寵物），諸如狗、貓、天 諸如牛^、越南大肚豬、兔子、及料農場動物， 上在動私牛野牛、馬、驢、豬、綿羊、及山羊；典型 4勿 士口 、獅子、老 斑馬、野蜂/可馬、、犀牛、長頸鹿、羚羊、樹懶、瞪羚、 書苗、鬣狗 j原犬私無尾熊、袋鼠、負鼠、浣熊、熊 及鯨^ i ▲海豹海獅、象海豹、水獺、鼠海豚、海豚、 意包括、此詞“病患，，及“患者，，在文中係交互使用且有 哺乳寺人類及非人類哺乳類物種。同樣，可以在此等 可勿種之細胞上進行本發明之活體外方法。 明兮職業者已知之標準技術鑑定需要使用本發 ™寺方法進行治療的患者。 提ί、以下貫例作為闡明用且不具限制性。 實例 實例1 :活體外篩檢

：所有細胞株可購自 ATCC 20 200836749 或如前述(Cheng，J· Q·，等人〇nc〇gene，14:2793-2801，1997, West, K.A.，等人 Drug Resist. Updat·，5:234-248，2002, Satyamoorthy，K·，等人Cancer Res· 61:7318-7324, 2001)。該 NCI結構分樣性分子庫為選自約140,000種化合物之NCI藥 5 物資料庫的1，992種化合物之保存所。有關這些多樣性分子 庫之化合物的選擇、結構、及活性之深入資料可在NCI Developmental Therapeutics Program之網址上找到。

Akt轉形之細胞生長的抑制作用之篩檢：將AKT2轉形 之NIH3T3細胞或LXSN媒劑轉移感染之NIH3T3對照細胞 10 (Cheng，J.Q·，等人Oncogene，14:2793-2801，1997)接種入96 井組織培養平皿内。經5μΜ之NCI多樣性分子庫化合物處理 後，可使用 CellTier 96 One Solution Cell Proliferation套組 (Promega)檢測細胞生長。可抑制AKT2轉形細胞而非LXSN 轉移感染之NIH3T3細胞的化合物被視為Akt抑制劑之適合 15 物並使其進行進一步分析。 活體外蛋白質激酶、細胞存活及細胞滴亡檢定:如前 述進行活體外激酶檢定（見，例如Jiang，K·，Coppola，等人 Mol. Cell· Biol·，20:139-148，2000)。細胞存活係經 MTS(Promega)檢定。細胞凋亡係經膜聯蛋白V檢測，其進 20 行方法如前述（Jiang, K·，Coppola，等人 Mol_ Cell· Biol·， 20:139-148，2000)。重組型 Akt 及 PDK1 係購自 Upstate Biotechnology Inc 〇 結論

Akt傳訊路徑，ΑΠ-2之小分子抑制劑的鑑定:Akt在人 99 200836749 類癌内之經常變化業經檢測且Akt路徑之破壞可誘發細胞 凋亡並抑制腫瘤生長(Jetzt，A·，等人Cancer Res.，63:697-706, 2003)。因此，Akt被視為用於研發新穎癌治療法之有吸引 力的分子標靶。為了鑑定Akt之小分子抑制劑(群），評估得 5自該NCI(NCI多樣性分子庫）之1，992種化合物的化學資料 庫之適於能抑制AKT2轉形細胞生長而非排空媒劑LXSN轉 移感染之NIH3T3細胞的藥劑。重複的實驗證明32種化合物 僅可抑制AKT-2轉形細胞之生長。其中最有效的化合物， API-2(NCI識別號：NSC 154020)，可以於50nM之濃度下抑 10 制細胞生長。第1A圖表示API-2，其亦稱為曲西立濱之化學 結構（Schweinsberg，P. D·，等人 Biochem Pharmacol·， 30:2521-2526，1981) ’ API-2可選擇性優先抑制AKT-2轉形 細胞而非未轉形親代細胞之事實有助於我們決定API-2是 否為AKT2激酶之抑制劑。據此，使用得自經API-2處理後 15 之AKT-2轉形NIH3T3細胞的抗AKT2抗體免疫沈澱AKT2。 使AKT2免疫沈澱物經抗磷酸化Akt抗體免疫墨點。如第1B 圖所示，API-2可明顯地抑制AKT-2之完全活化所需之蘇胺 酸-309及絲胺酸-474的八07磷酸化反應（0&似，8.11.，等人 Genes Dev· 13:2905-2927, 1999)。由於Akt之3種變異體共同 20 具有高同源性及類似結構，所以可評估API-2對彼等之激酶 活性的影響。HEK293細胞係經HA-Aktl、HA-AKT2及 HA-AKT3轉移感染，使血清飢餓一夜並在EGF(50毫微克/ 毫升)刺激前經API-2處理，費時60分鐘。3次重複實驗顯示 API-2可抑制經EGF誘發之激酶活性及Aktl、AKT2及AKT3 100 200836749 之石粦酸化反應（第1C圖）。然而，在活體外激酶反應中，重 組型原構原性AKT2(Myr_ AKT2)之激酶活性並未經API-2抑 制（第1D圖）’其表示API-2並未直接抑制活體外之Akt且表 示API-2既不能作為ATP競爭物，也不能作為可結合至Akt 5 之活性部位的基質競爭物。 API-2不能抑制Akt之已知上游活化劍:已清楚地用文 件證明可經由P13K依存性方式，藉細胞外刺激物及細胞内 信號分子，諸如活性Ras及Src，而活化Akt。因此，Akt之 API-2抑制作用可起因於將Akt之上游分子（群）定標。由於 10 PI3K及PDK1為Akt之直接上游調節劑（Datta，S.R·，等人 Genes Dev. 13:2905-2927，1999)，所以可檢查API-2是否可 抑制PI3K及/或PDK1。使HEK293細胞之血清铳餓，然後在 EGF刺激前可經API-2或PI3K抑制劑，渥曼青黴素處理，費 時30分鐘。使PI3K經抗ρΙΙΟα抗體免疫沈澱。使用PI-4-P 15 作為基質，使該等免疫沈澱物進行活體外ΡΙ3Κ激酶檢定。 如第2Α圖所示，該經EGF誘發之ΡΙ3Κ活性係藉渥曼青黴素 而抑制，並非藉ΑΡΙ-2而抑制。為了評估ΑΡΙ-2對PDK1之影 響，在含磷脂醯肌醇之脂質體存在下使用其中重組型PDK1 可促進ΑΚΤ2肽之蘇胺酸-309磷酸化反應的檢定法。如第2Β 20 圖所示，該檢定係受對照物PDK1抑制劑，星形孢菌素(IC50 = 5ηΜ)，強勢地抑制。反之，於所測試之最高濃度(5·1μΜ) 下，API-2顯示該檢定之僅21%抑制作用。為了進一步評估 API-2對PDK1活化作用之影響，在以API_2處理HEK293細 胞後，檢查PDK1於絲胺酸-241，其係為本身經磷酸化且對 101 200836749 其活性具重要性之殘基的自體構酸化含量(Datta，S.R.，等人 Genes Dev· 13:2905-2927，1999)。三次重複的實驗證明 PDK1之磷酸化含量並未受API-2抑制（第2B圖）。然而，PI3K 抑制劑，渥曼青黴素，可抑制經EGF刺激之PDK1(第2B圖）。 5 API-2對Akt之選擇性比對PKC、PKA、SGK、STAT、 JNK、p38、及ERK傳訊路經之撰擇性高报多:Akt屬於 AGC(PKA/PKG/PKC)激酶族，其亦包括PKA、PKC、血清-及腎上腺促糖皮質激素-可誘發之激酶(SGK)、p90核糖體S6 激酶、p70S6K、有絲分裂因子(mitogen)·及應激性-活化蛋白 10 質激酶及PKC-相關激酶。在AGC激酶族中，PKA、PKC及 SGK之蛋白質結構比較接近Akt激酶而非其它成員。因此， 接下來檢視API-2對這3種激酶之酶催活性的影響。使 HEK393細胞經HA-標記之PKA、PKCa或SGK轉移感染。 活體外激酶檢定及免疫墨點分析證明PKA及PKC α之激酶 15 活性係分別經ΡΚΑΙ及R〇 31-8220(其係為PKC抑制劑）抑 制，然而API-2顯示對彼等之活性並無影響（第2C及2E圖）。 而且，血清誘發之SGK激酶活性係藉渥曼青黴素而減弱而 非藉API-2而減弱（第2D圖）。此外，已確知API-2是否對其 它致癌性存活路徑有影響。使用市售抗磷酸化抗體進行之 20 西方墨點分析顯示Stat3、JNK、p38及Erkl/2之構酸化含量 並未受API-2治療法之影響（第2F圖。這些資料表示ΑΠ-2可 特定地抑制Akt傳訊路徑。 API-2可抑制細胞生長並誘發Akt過廣表現性/活化人類 癌細胞株中之細胞凋亡：API-2可選擇性抑制該Akt路徑之 102 200836749 能力表示其應該可抑制增生及/或優先誘發Akt之異常表現 性/活化作用的此等腫瘤細胞中的細胞凋亡。由於Akt在通 常起因於Akt之過度表現性或PTEN突變的人類惡性腫瘤中 之活性，所以可使用API-2以治療以下細胞：能表現由AKT2 • 5 之過度表現性所產生之原構活性Akt的細胞（OVCAR3、 OVCAR8、PNNC1 及 AKT2-轉形之 NIH3T3)或由 PTEN 基因 之突變所產生之原構活性Akt的細胞（PC-3、LNCaP、 MDA-MB-468)、及對IGF-1之生長刺激無反應之細胞 馨 （OVCAR5、DU-145、T47D、C0L0357及 LXSN-NIH3T3) 10 以及藉用以活化Akt之IGF-1而活化但對IGF-1之生長刺激 無反應之黑色素瘤細胞（Satyamoorthy，K·，等人Cancer Res· 61:7318-7324, 2001)。免疫墨點分析顯示Akt之磷酸化含量 僅在能表現升高的Akt或對IGF-1刺激有反應之細胞内才會 受到API-2抑制（第3A圖）。因此，與具低Akt含量之細胞比 15 較，在Akt表現性/活化細胞内，API-2可很大程度地抑制細 • ” 胞生長。如第3Β圖所示，在Akt表現性/活化細胞株， LNCaP、PC-3、OVCAR3、OVCA8、PANC1、MDA-MB-468 及WM35中API-2治療法可抑制約50至60%之細胞增生，然 而在顯示A k t之含量低或對IG F -1之生長刺激並無反應的 20 DU145、OVCAR5、C0L0357、T47D及WM852細胞中僅抑 制約10至20%。而且，API-2分別可誘發8倍、6倍、6倍、及 3倍之以下細胞株的細胞凋亡：OVCAR3、OVCAR8、 PANC1、及 AKT2-NIH3T3。OVCAR5、C0L0357 及 LXSN_NIH3 T3細胞之API-2與媒劑(DMSO)處理並未發現細 103 200836749 胞凋亡有明顯的差異。因此，API-2可抑制細胞生長並可優 先誘發能表現異常Akt之細胞的細胞凋亡。 API-2可抑制Akt之下游標靶:業經證明經由許多蛋白 質之磷酸化反應，Akt可發揮其細胞作用（Datta, S.R.，等人 5 Genes Dev. 13:2905-2927, 1999)。超過20種蛋白質業經確認 為Akt基質，其包括Forkhead蛋白質族之成員（FKHR、AFX 及FKHRL1)、馬鈴薯球蛋白（tuberlin)/TSC2、p70S6K、GSK-3 /3、p21WAF1/Cipl、p27kipl、MDM2、Bad、ASK1 及ΙΚΚα 等0 接下來檢視API-2是否可抑制Akt之下游標乾。由於抗鱗酸 10 化馬钤薯球蛋白、_Bad、AFX、及-GSK-3a/yS抗體係市售， 因此，可測定API-2對彼等經由Akt而誘發之磷酸化反應的 影響。在經ΑΡΙ·2(1μΜ)處理後，使OVAR3細胞溶解並經各 別抗磷酸化抗體免疫墨點。第4Α圖表示ΑΡΙ-2可大程度地抑 制馬鈴薯球蛋白之碟酸化反應程度，因而可導致馬鈴薯球 15 蛋白之安定性及上調（Dan，H.C.，等人J. Biol. Chem·， 277:35364-35370, 2002)。Bad、GSK-3 /3、及AFX之磷酸化 程度藉API-2而部份減弱。這些資料表示API-2可誘發細胞 死亡並藉抑制其下游標靶之磷酸化反應而控制細胞生長。 Akt下游標乾之不同程度的ΑΠ-2抑制作用可能起因於這些 20標靶之磷酸化反應部位亦受其它激酶(群)控制的事實，例如 除了 Akt外，ΡΑΚΙ亦可將Bad絲胺酸-136磷酸化（Schurmann， A.，等人Mol· Cell. Biol” 20:453-461，2000)。 實例2 :裸鼠腫瘤異種移植物模式之抗腫瘤活性 如先前所報告，採取腫瘤細胞，使其懸浮在PBS中，並 104 200836749 皮下注射入8週大之雌裸鼠的右脇腹及左脇腹(2χΐ〇6個細胞 /脇腹）内（Sirn，J·，Blaskovic，等人Cancer Res·，59:4919-4926, 1999)。當腫瘤達約100至150毫米3時，將動物隨機取樣並每 日以腹膜内注射方式投予〇·2毫升該曲西立濱化合物及/或 5蔥環素類似物之媒劑。使對照動物接受DMSO(20%)媒劑， 然而經治療之動物可注射API-2(1毫克/公斤/天）在 20%DMSO中之溶液。 API_2可抑制能過唐表現Akt之禪鼠的腫瘤峰_县 已說明AKT1及AKT2在人類卵巢及胰腺癌中之經常過 10度表現性/活化作用及/或擴增作用（Cheng，J.Q.，and Nicosia， S.V· AKT signal transduction pathway in oncogenesis· In Schwab D? Editor, Encyclopedic Reference of Cancer. Berlin Heidelberg and New York: Springer; 2001· pp35-7)。藉 PI3K、HSP70、Src及法呢基轉移酶(farnesyltransferase)之抑 15 制劑而抑制Akt路徑可控制細胞生長並誘發細胞凋亡（s〇lit, D.B·，等人Cancer Res·，63:2139-2144，2003，Xu，W” 等人 Cancer Res·，63:7777-7784, 2003)。最近研究顯示亦可藉顯 性負Akt之腎上腺病毒的瘤内注射而顯者地抑制具高Akt之 異種移植物的腫瘤生長（Jetzt，A·,等人Cancer Res.， 20 63:697-706, 2003)。由於API-2僅在具高Akt含量之癌細胞内 才可抑制Akt傳訊並誘發細胞凋亡及細胞生長控制，所以在 裸亂中具南Akt含1之腫瘤生長比具低Akt含量之腫瘤生長 對API-2更具敏感性。據此，係將皮下注射之過度表現 性細胞（OVCAR3、OVCAR8及PANC-1)皮下植入小鼠之右 105 200836749 脇腹内並將此等表現低Akt含量之細胞株（OVCAR5及 C0L0357)植入左脇腹内。當腫瘤平均大小達約1〇〇至15〇毫米3 時，將該等動物隨機取樣並經媒劑或API-2(1毫克/公斤/天) 進行腹膜内治療。如第4B圖所闡明，在腫瘤植入後49天， 5 經媒劑治療之〇VCAR_5及C0L0357腫瘤可生長至約 800-1，000毫米3。在腫瘤植入後49天，經媒劑對照物治療之 OVCAR3、OVCAR8及PANClIt瘤可生長至約7.900毫米3。 API-2分別可抑制 90%之OVCAR3、88%之OVCAR8及80% 之PANC1的腫瘤生長。反之，API-2對裸鼠中之OVCAR5及 10 C0L0357細胞的生長之影響極微（第4B至4D圖且並未顯示 資料）。於1毫克/千克/天之劑量下，ΑΡΙ·2對小鼠之血液葡 萄糖含量、體重、活動性及食物攝取並無影響。在經治療 之腫瘤試樣中，Akt活性係藉ΑΡΙ-2而抑制且不會改變總Akt 含量（第4E圖）。總之，這些結果表示API-2可選擇性抑制具 15 高Akt含量之腫瘤的生長。 實例3 : TCN可直接抑制野生型Akt激酶活性 API-2(TCN)可直接抑制藉活體外PDK1而誘發之野生 型Akt激酶活性（第1圖）。本結果證實API-2為直接Akt抑制劑 且證實該基本機制可以是API-2結合至Akt之PH結構域及/ 20 或蘇胺酸_308。使用PDK1及Akt在含有填脂醯肌醇 •3,4,5-P3(PIP3)、API-2及作為基質之組織蛋白的激酶缓衝 劑中之重組體進行活體外激酶檢定。培育30分鐘後，藉 SDS-PAGE而分離該等反應物並曝露在薄膜内。 實例4 : TCN能有效地有於癌之抗藥性細胞 106 200836749 在順鉑、太平洋紫杉醇、及泰莫西芬抗藥性A27〇cp、 C-13、OVCAR433及MCF7/TAM細胞中測試tCN(API-2)之 效用。API_2可克服這些細胞之順鉑、太平洋紫杉醇、及泰 莫西芬抗藥性。 5 本發明已芩考其較佳實施而說明。熟悉本項技藝者自 本發明上文之洋細說明可知本發明之變異及修飾。這些變 異及修飾全部皆計劃涵蓋在本發明之範圍内。 【圖式簡單說明3 第1圖係說明ΑΡΙ-2(曲西立濱）作為得自NCI多樣化分 10 子庫（Diversity Set)之Akt抑制劑的適合物之鑑定。第认圖 係闡明API-2(曲西立濱）之化學結構。第1B圖係說明Αρμ2 抑制ΑΚΤ2在經ΑΚΤ2轉形之ΝΙΗ3Τ3細胞中的磷酸化程 序。以ΑΡΙ-2(1μΜ)處理經野生型ΑΚΤ2轉形之ΝΙΗ3Τ3細 胞’費時指定時間，並使用抗碟酸化Akt-T308及-S473抗體 15 (最上面的一組及中間組）進行免疫墨點分析。最下面的一組 顯示總AKT2之表現性。在第ic圖中，顯示API-2可抑制Akt 之3種變異體。使HEK293細胞經HA-Aktl、-AKT2及-AKT3 轉移感染並在EGF刺激前經ΑΡΙ-2(1μΜ)或渥曼青黴素 (wortmannin)(15pM)處理，使該等細胞經溶解並經抗ha抗 20 體免疫沈殺。使免疫沈澱物進行活體外激酶檢定（上)並使用 抗石粦酸化Akt-T308(下)抗體進行免疫墨點分析。中間的一組 顯示經轉移感染之Aktl，AKT2及AKT3的表現性。第1D圖 係闡明API-2並不能活體外抑制Akt。進行原構性活性八〖丁2 重組型蛋白質在含ΙμΜ ΑΠ-2(第3道)之激酶緩衝劑中的活 107 200836749 體外激酶檢定。 第2圖係說明API-2並不能抑制PI3K、PDK1及緊密相關 之AGC激酶族成員。第2A圖係說明活體外PI3K激酶檢定。 使HEK293細胞之血清不足並在EGF刺激前經ΑΠ-2( 1 μΜ) 5 或渥曼青黴素（15μΜ)處理，費時30分鐘。使用ΡΙ-4-Ρ作為 基質使該等免疫沈澱物進行活體外激酶檢定。第2Β圖係闡 明ΑΡΙ-2對活體外PDK1活化作用（最上面的一組)之影響，實 心圓表示藉ΑΡΙ_2而進行之抑制作用。空心圓表示藉正對照 物星形孢菌素(staurosporine)，其係為有效的PDK1抑制劑 10 (IC50=5nM)，而進行之抑制作用。最下面的一組為經

Myc-PDK4轉移感染並在EGF刺激前經渥曼青黴素或API-2 處理之HEK293細胞的免疫墨點分析。以指定抗體檢測該等 免疫墨點法。第2C圖係闡明在經API-2或非選擇性PKC抑制 劑Ro31 _8220處理後使用抗磷酸化PKC α T638(上）及總成 15 PKCa (下）抗體進行PKCa之磷酸化程度的免疫墨點分 析。第2D圖表示活體外SGK激酶檢定。使HEK293細胞經 HA-SGK轉移感染並在EGF刺激前經API-2或渥曼青黴素處 理。使用MBP作為基質（上）以HA-SGK免疫沈澱物進行活體 外激酶檢定。最下面的一組表示經轉移感染之HA-SGK的表 20 現性。第2E圖係闡明PKA激酶檢定之結果。在含指定抑制 劑(API-2或AKAI)及基質’肯普肽(Kemptide)之ADB缓衝劑 (Upstate Biotechnology Inc)中培育經免疫純化之PKA。將該 激酶活性定量。第2F圖係表示西方墨點法。以API-2處理 0VCAR3細胞，費時指定時間。以指定之抗磷酸抗體（第1 108 200836749 至4組)及抗肌動蛋白抗體（下）進行細胞溶解物之免疫墨點。 第3圖係說明API-2可抑制Akt活性及細胞生長且可誘 發具有高Akt之人類癌細胞的細胞凋亡。第3A圖為西方墨點 法，在經API-2處理後，在指定之人類癌細胞株内以抗磷酸 5 化Akt-T308抗體檢測Akt之磷酸化程度。再以抗-總Akt抗體 (最下面的一組)探測該等墨點法。第3B圖係表示細胞增生 檢定。以不同劑量之API-2處理圖中所示之細胞株，費時24 時及48小時，然後經CellTiter 96細胞增生檢定套組 (Promega)分析。第3C圖提供細胞凋亡分析。以API-2處理 10 細胞並經膜聯蛋白（annexin)V及PI染色，然後經FACScan分析。 第4圖表示API-2可抑制Akt之下游目標並在小鼠異種 移殖物中之具高Akt之癌細胞株内顯示抗腫瘤活體。第4A 圖係說明API-2可抑制馬鈴薯球蛋白（tuberin)、Bad、AFX及 GSK-3石之Akt磷酸化反應。在經API-2處理後，溶解OVAR3 15 細胞並經指定之抗體免疫墨點。第4B圖表示API-2可抑制腫 瘤生長。將腫瘤細胞皮下注射入左側具低Akt細胞含量而右 侧具高Akt細胞含量之裸鼠體内。當腫瘤達約1〇〇至150毫米 3之平均大小時，以媒劑或1毫克/公斤/天之API-2處理這些 動物。各測定值代表10個腫瘤之平均值。第4C圖係闡明經 20 API·2或媒劑（對照物）處理之具OVCAR3 (右）及OVCAR5(左） 異種移殖物的小鼠之圖解。第4D圖表示於實驗結束時之腫 瘤大小（下）及重量(上）。在第4E圖中，在經處理(T3及T4)及 未經處理（T1及T2)之OVCAR-3-衍生之腫瘤内使用抗磷酸 化Akt-S473(上）及抗AKT2(下）抗體進行腫瘤溶解產物的免 109 200836749 疫墨點分析。 第5圖表示ΑΠ-2(曲西立濱）可抑制活體外激酶活性。在 含磷脂酸肌醇-3,4,5-Ρ3(ΡΙΡ3)、ΑΡΙ-2及組織蛋白作為基質 之激酶緩衝劑中以PDK1及Akt之重組型進行活體外激酶檢 5定。30分鐘培育後，藉SDS-PAGE而分離該等分應物並曝露 在薄膜中。 第6a至c圖提供人類Aktl之mRNA及胺基酸序列，亦記 錄限制酶位置。 第7a至d圖提供人類Akt2之mRNA及胺基酸序列，亦記 1〇 錄限制酶位置。 第8a至c圖提供人類Akt3之mRNA及胺基酸序列，亦記 錄限制酶位置。 第9圖係表示硼替佐米可協同性增強API-2(TCN)對該 等存活骨髓瘤細胞之影響。使H929細胞(所衍生之多發性骨 15 髓瘤）僅或在ΙΟμΜ ADI-2存在下經0、2.5、5、10、20或40nM 硼替佐米處理或僅經〇、2.5、5、1〇、2〇或4〇0]^八〇1-2處理。 校準並圖解細胞存活率（第9A圖）。使U266細胞(所衍生之多 發性骨髓瘤）僅或在ΙΟηΜ API-2存在下經〇、2.5、5、10、20 或40μΜ ADI-2處理或僅經0、2.5、5、10、20或40nM硼替 20佐米處理。校準並圖解細胞存活率（第9B圖）。 第1 〇圖係表示硼替佐米及API-2(TCN)對包膜細胞淋巴 瘤細胞之協同性影響。使Jeko-Ι細胞（所衍生之包膜細胞淋 巴瘤）僅或在5μΜ API-2存在下經〇、2.5、5、10、20、40或 80ηΜ硼替佐米處理或經 〇、ΐ·25、2·5、5、1〇、2(^40μΜΑΡΙ-2 200836749 處理。校準並圖解細胞存活率。 【主要元件符號說明】 (無）

111

Claims (1)

1. 200836749 十、申請專利範圍： 1. 一種組成物，其包含： (i)式I-IV化合物： 5 Μ ΚΙ

   其中R2’、R3’及R5’各獨立為氫、可選擇性經取代之 磷酸鹽或膦酸鹽（其包括單-、二-或三磷酸鹽或安定化磷 10 酸鹽前藥）；醯基（其包括低碳醯基）；烷基（其包括低碳 烧基）；酸胺、續酸S旨，其包括烧基或芳烧基；續酷基， 112 200836749 其包括甲~酿基及f基，其中該苯基可選擇性經一或多 種如，例如在文中所予之芳基的定義中所述之取代基取 代；可選擇性經取代之料醯基；脂質，其包括麟脂； 胺基酸；碳水化合物；耿；或膽輯；或活體内可得到 其中R2、R3’及R5’獨立為H或單_、二-或三_鱗酸鹽之化 合物的其它藥學上可接受脫離基； 其中Rx及Ry獨立為氫、可選擇性經取代之磷酸鹽； 醯基(其包括低碳醯基）；醯胺、烷基(其包括低碳烷基）； 芳香族χΚ氧化烯垣，諸如聚乙二醇、可選擇性經取代之 芳磺酿基；脂質，其包括磷脂；胺基酸；碳水化合物； 肽，或膽固醇；或其它藥學上可接受之脫離基。在一實 施例中，該化合物係以5，_磷酸醚脂質或5，_醚脂質投予； Ri及R2各獨立為Η、可選擇性經取代之直鏈、分支 鏈或環系烷基（其包括低碳烷基）、烯基或炔基、CO-烷 基、co-烯基、co_炔基、co-芳基或雜芳基、c〇_烷氧 烷基、CO-芳氧烷基、co-取代之芳基、磺醯基、烷磺 醯基、芳磺醯基、芳烷磺醯基； (ii)式V化合物：

   113 200836749 其中 l、R2、R3、R4、及R5各獨立為Η、可選擇性鹵化、 經取代直鏈、分支鏈或環系烷基(其包括低碳烷基）、烷 氧基、烯基或炔基、芳基、CO-烷基、CO-烯基、CO-5 炔基、CO-芳基或雜芳基、CO-烷氧烷基、CO-芳氧基烷 基、CO-取代之芳基、續醯基、烧確醯基、芳續醯基、 芳烷磺醯基； 及 (iii)藥學上可接受載劑。 10 2.如申請專利範圍第1項之組成物，其中該式I化合物為曲 西立濱。 3. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該式I化合物為曲 西立濱磷酸鹽。 4. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該式I化合物為曲 15 西立濱膦酸鹽單水合物。 5. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該硼替佐米及其 衍生物具有下式： % β% …、、 ? Γ 9«

   Η Ο γ 其中rLr5中至少一個是-Η。 20 6.如申請專利範圍第1項之組成物，其中該硼替佐米及其 114 200836749 衍生物具下式：

   7.如申請專利範圍第1項之組成物，其中該式I化合物係以 至少10毫克/米2之劑量存在。 5 8.如申請專利範圍第1項之組成物，其中該式II化合物係以 至少10毫克/米2之劑量存在。 9. 如申請專利範圍第1項之組成物，其適於非經腸投藥。 10. 如申請專利範圍第9項之組成物，其中該非經腸投藥為 靜脈投藥。 10 11.如申請專利範圍第1項之組成物，其適於口服。 12.如申請專利範圍第1項之組成物，其適於局部投藥。 13 · —種治療哺乳動物之腫瘤或癌之方法，其包括對該哺乳 動物投予有效量之含以下化合物的組成物： ⑴式I-IV化合物·· 115 €1¾.200836749

   01-¾

   其中R2’、R3’及R5’各獨立為氫、可選擇性經取代之 磷酸鹽或膦酸鹽（其包括單-、二-或三磷酸鹽或安定化磷 酸鹽前藥）；醯基（其包括低碳醯基）；烷基（其包括低碳 烧基）；醯胺、磺酸S旨，其包括烧基或芳烧基；績醯基， 其包括甲磺醯基及苄基，其中該苯基可選擇性經一或多 種如，例如在文中所予之芳基的定義中所述之取代基取 代；可選擇性經取代之芳磺醯基；脂質，其包括磷脂； 116 10 200836749

   胺基酸；碳水化合物；肽；或膽固醇；或活體内可得到 其中R2’、R3’及R5’獨立為Η或單-、二-或三-磷酸鹽之化 合物的其它藥學上可接受脫離基； 其中Rx及Ry獨立為氫、可選擇性經取代之磷酸鹽； 醯基(其包括低碳醯基）；醯胺、烷基(其包括低碳烷基）； 芳香族聚氧化烯烴，諸如聚乙二醇、可選擇性經取代之 芳磺醯基；脂質，其包括磷脂；胺基酸；碳水化合物； 肽；或膽固醇；或其它藥學上可接受之脫離基。在一實 施例中，該化合物係以5’-磷酸醚脂質或5’-醚脂質投予； 心及仏各獨立為Η、可選擇性經取代之直鏈、分支 鏈或環系烷基（其包括低碳烷基）、烯基或炔基、CO-烷 基、CO-烯基、CO炔基、CO-芳基或雜芳基、CO-烷氧 烷基、CO_芳氧烷基、CO-取代之芳基、磺醯基、烷磺 醯基、芳磺醯基、芳烷磺醯基； 及 (ii)式V化合物：

   R!、R2、R3、R4、及R5各獨立為Η、可選擇性鹵化、 117 200836749 ««n Μ鏈或環㈣基(其包括低魏基）、烧 氧基、烯基或炔基、芳基、CO-烷基、CO-烯基、CO- 絲、CO-方基或雜芳基、c〇_烧氧烧基、c〇_芳氧基烧 基、CO-取代之芳基、磺醯基、烷磺醯基、芳磺醯基、 5 方烧續酿基。 14·如申明專利範圍第13項之方法，其中式I-IV化合物及式 V化合物係同時投予。 15·如申明專利範圍第13項之方法，其中係先投予式I-IV化 合物，接著才投予式V化合物。 10 16·如申明專利乾圍第13項之方法，其中係先投予式V化合 物，接著才投予MV化合物。 17·如申明專利範圍第13項之方法，其中該式I-IV化合物係 每週杈予一次，費時3週，繼而在一週期間内並未投予 該化合物。 15 18·如申叫專利範圍第13項之方法，其中該式ν化合物係每 週投予一次，費時3週，繼而在一週期間内並未投予該 化合物。 ΐ9·如申4專利範m第14項之方法，其中該給藥計劃係重複 至少兩次。 20 20.如申請專利範圍第_之方法，其中該給藥計劃係重複 至少4次。 21·如申請專利範圍第I3項之方法，其中該經治療之腫瘤為 礼房、胰腺、卵巢及結腸直腸腫瘤。 22·如申Μ專利範圍第13項之方法，其中係投予至少10毫克/米2 118 200836749 之該式Ι-IV化合物。 23. 如申請專利範圍第13項之方法，其中係投予10毫克/米2 或更少之該式I-IV化合物。 24. 如申請專利範圍第13項之方法，其中係投予至少10毫克 5 /米2之該式V化合物。 25. 如申請專利範圍第13項之方法，其中係投予10毫克/米2 或更少之該式V化合物。 26. 如申請專利範圍第13項之方法，其中係每週兩次以3至5 秒大量靜脈注射的方式投予10毫克/米2或更少之該式V 10 化合物，費時2週。 119