TW200815474A

TW200815474A - Antibodies alphaVbeta6 and uses thereof

Info

Publication number: TW200815474A
Application number: TW096128378A
Authority: TW
Inventors: Ian Foltz; Julie Rinkenberger; Avril Alfred; Simon Thomas Barry; Vahe Bedian
Original assignee: Astrazeneca Ab
Priority date: 2006-08-03
Filing date: 2007-08-02
Publication date: 2008-04-01
Also published as: RU2009107277A; EP2064244A2; CN101553505A; US20080057063A1; AU2007348941B2; CA2658612A1; US20100330103A1; UY30524A1; NO20090877L; AU2007348941A1; CA2658612C; WO2008112004A2; KR20090039739A; JP5362563B2; CN103524619A; JP2013256504A; EP2064244B1; US20150166663A1; IL196848A0; CN103524619B

Description

200815474 九、發明說明： C 日月】此專利申請案申稱擁有2006年8月3曰提出之美國專利時申請序號6〇/835,559的優先權，將其完整併入於此以供 5 全面性的參考。發明領域本發明係關於對抗α V /3 6整合素(integrin)的單株抗體以及此類抗體的用途。在一些具體實施例中，本發明係關於與aV/5 6有關的純人類單株抗體。所述抗體可用於診斷 1〇及治療與aV/36活性及/或過量生產有關的疾病。 t先前技術1 發明背景整合素大家族包括由利用18個α*8個石鏈之異源雙體(heterodimers)所構成的至少24種家族成員（Hynes，（2002) 15 Ce// 110 : 673〜87)。此受體家族係表現於細胞表面及仲介調節細胞存活、增生、移行和分化以及腫瘤侵入和轉移之細胞-細胞及細胞-細胞外基質的相互作用（ffrench-Constant 和Colognato,（2004) 7>別心 Ce//5z.0/· 14 : 678〜86)。整合素與具有特定蛋白重疊結合特異性的許多家族成員結合至其 20他細胞受體、生長因子和細胞外基質蛋白。此冗餘在無特定整合素下可確保重要功能的持續（K〇ivisto等人，（2000) CW/7^· 255 : 10〜17)。然而，亦曾報告個別整合素在類似專一性表現上的時間和空間限制以及可能改變細胞對配體結合的反應(Yokosaki等人，（1996)/·价W· CAem. 271 ·· 5 200815474 24144〜50 ; Kemperman等人，（1997)五;φ· CW/ 及队 234 : 156〜64 ; Thomas等人，（2006) ·/. Ora/ Pwb/. M^/· 35 : 1〜10) 〇

根據異源雙體之配體特異性該整合素可被細分成數種 5 次家族。一種次家族係由可辨識和結合RGD三肽的全部整合素所構成。這些受體包括allb//5 3和全部的aV異源雙體 (Thomas等人，（2006) 乂〇“/ 尸如/^/· A/W· 35 : 1 〜10)。該 aV鏈雖然可與5個未知的0鏈配對，但是許多的這些万鏈僅能與aV配對。選擇/3 6鏈與aV進行異源雙體化並且此 10 配對會以高或低親和力結合至細胞外基質和細胞活素蛋白。a V0 6結合至TGF/3 1LAP和TGF/3 3LAP潛伏複合體上的RGD基序並將其活化（Munger等人，（1999) CW/ 96 : 319〜328 ; Annes等人，（2002) 凡511 : 65〜68)。然而，其無法結合至或活化不具有三肽的TGF yS 2LAP 15 (Ludbrook等人，（2003) /· 369 : 311〜18)。α V /5 6- 介導TGF点之活化需要黏附潛伏TGF石複合體至細胞外基質的潛伏TGF/3結合蛋白1 (LTBP1)。已認為活化係導因於分別被α V卢6和LTBP1固定在細胞和基質間之TGF /3 LAP 的構形變化(Keski-Oja等人，（2004)介⑼心Ce// 5/(9/. 14 : 20 657〜659 ; Annes等人，（2004) J· Ce//及W· 165 : 723〜34)。 a V/5 6對TGF0LAP複合體的皮莫耳結合親和力對任何已知配體而言係最高者。其他對aV/3 6的配體包括纖連蛋白 (fibronectin)、肌腱蛋白（tenascin)、玻連蛋白（vitronectin)和骨橋蛋白（osteopontin)(Busk等人，（1992) /· 5z〇/· C/iem. 200815474 267 : 5790〜6 ; Prieto等人，（1993)户編5 90 : 10154〜8 ; Huang 等人，（1998) /· CW/ 5W· 111(第 15章）：2189〜95 ; Yokosaki 等人，（2005)从如厂以价6>/.24:418〜27)。〇:\^/3 6對這些細胞外基質蛋白的結合親和力為在奈莫耳範圍内的低親和力。 5 α V万6整合素的表現被限制在成人活化組織重塑的區域，特別被限制在癒合傷口的表皮上及入侵腫瘤的邊緣 (Breuss等人，（1995) J· CW/ 如·· 1〇8 : 2241 〜51)。傷口邊緣的角質細胞在其移行進入傷口時上調a V/3 6的表現，但是在傷口表皮邊緣已癒合之後仍維持高程度的表現(Breuss等 10 人，（1995) «/· CW/ 5W· 108 : 2241 〜51 ; Haapasalmi等人，（1996) 106 : 42〜48) 〇傷口的細胞外基質含有纖連蛋白、肌腱蛋白和玻連蛋白，其均為aV；S6的配體 (Busk等人，（1992) J·及·〇/· C/zem· 267 : 5790〜6 ; Koivisto等人，（1999) CWMi/Ad 7 : 245〜57 ; Hakkinen等人， 15 (2000) J. 48 : 985〜98)。此外，α V点 6 可上調基質金屬蛋白酶、ΜΜΡ-9的表現而裂解第IV型膠原蛋白及促進細胞的移動(Niu等人，（1998) 及队 Com. 249 : 287〜91 ; Agrez等人，（1999)/n，· J· Caw. 81 : 90〜97 ; Thomas等人，（2001) /此 Ca/icer 92 : 641 〜50 ; Gu 20 等人，（2002) 5r· (:⑽· 87 : 348〜51)。根據其在傷口内及體外試驗的表現模式，aV)56於傷口癒合及經由活化TGF/3 的溶解傷口期間在促進角質細胞的移行上可能具有雙重角色。TGF/3被a 6的活化歸因於經由再上皮化之調節的傷口溶解、發炎的抑制和促進結締組織再生及疤的形成 7 200815474 (Thomas等人，（2006) «/· 八⑽o/u 35 :卜⑼。利用 /5 6缺失小鼠的體内傷口試驗顯示癒合傷口的皮膚有明顯的炎症反應。由於其他整合素家族成員的表現，因此喪失 aV/3 6並未影響傷口的閉合及角質細胞的活性(Huang等人， 5 (1996) J· CW/伤〇/· 133 : 921〜8)。炎症浸潤入万6缺失小鼠的傷口與TFG卢1缺失小鼠的情形相類似，因此認為細胞活素無足夠抑制在無α V/5 6下之免疫反應的活性(shull等人， (1992) 講 359 : 693〜9 ; Thomas等人，（2006) ·/· Ora/

PaiAo/. MW. 35 : 1〜10)。 10 肺損傷和腎病模式中/5 6缺失小鼠的分析亦確認aV/36 在纖維化中扮冷的角色。在博萊彳鷇素(bleomycin)損傷模式中/3 6缺失小鼠的肺纖維化受到抑制（Mimger等人，（1999) Ο// 96 : 319〜328)。這些動物亦受到保護避免產生MMP12 依賴性類肺氣腫表現型（Morris等人，（2003) 422 : 15 169〜73)。兩種疾病表現型均依賴TGF /3的活化(Munger等人， (1999)(^/96:319〜328)。抑制〇：¥;3 6整合素介導丁0^ 活化作用亦被認為可加強早期肺氣腫對急性肺損傷的反應 (Pittet等人，（2001)/· /«vm· 1〇7 : 1537〜44)。/5 6缺失小鼠在腎病模式中亦可避免產生纖維化，其TGFyS的活化 2〇係形成腎小管間質纖維化病變的要素(Ma等人，（2003) Jm. J. Pathol. 63 · 1261-73) ° 其除了表現在傷口的癒合之外，整合素在許多人類腫瘤的邊緣被上調節。aVyS6的表現曾被報告於口腔癌（Breuss等人，（1995) J· Ce// 5W· 1〇8 : 2241 〜51 ; Jones等人， 200815474 (1997)/· Οα/Ραί/ιο/. 26: 63〜8; Hamidi 等人，（2000) Br. J. Cawcer 82 : 1433〜40 ; Regezi等人，（2002) CW 38 : 332〜6 ; Impola等人，（2004) J·尸fli/w/· 202 : 14〜22)和皮膚爲平細胞瘤，以及肺癌（Smythe等人，（1995) Mei· 5 14 : 229〜39)、乳癌（Arhiro等人，（2000) 7 : 19〜26)、胰臟癌（Sipos 等人，（2004) //⑹叹y 45 : 226〜36)、胃癌（Kawashima等人，（2003) ΡαίΑο/· ZVaci. 199 : 57〜64)、結腸癌（Bates等人，（2005) J· C7/w· /"ναί· 115 : 339〜47)、卵巢癌（Ahmed 等人，（2002) CVzrc/⑽ 10 23:237〜44;人111116(1等人，（2002)/.///5^(：/^所.〇^(：/^鼠 50 : 1371 〜79)及唾液腺癌（Westernoff等人，（2005) (9m/ (9wc6>/叹y 41 : 170〜74)。在許多這些報告中aV/36的表現與腫瘤分級惡化（Ahmed等人，(2QQ2) J. Histochem· Cy，6>c/^m· 50 : 1371 〜79 ; Arihiro等人，（2000)7 : 15 19〜26)、最後移行至淋巴結（1^\\^811丨11^等人，（2003)/^/^/· Λα. Praci· 199 : 57〜64 ; Bates等人，2005) /· C7/«. /wvai· 115: 339〜47)，或預後不良(Bates等人，（2005) J· C/h· /πναί· 115 : 339〜47)有關。研究最透徹的腫瘤類型為口腔扁平細胞瘤，研究人員亦曾檢查癌前病變的《V/3 6及其表現與癌 20 症惡化的相關性（Hamidi 等人，（2000) J· Cawcer 82 : 1433〜40)。亦曾調查結腸癌之aV/5 6表現與腫瘤惡化之間的關聯性，其出現整合素與體外模式中結腸細胞的上皮-間葉細胞轉變(EMT)有關（Brunton等人，（2001)論叩/似以3 : 215〜26 ; Bates等人，（2005) /· C//«· 115 : 339〜47)。 9 200815474 EMT為使上皮細胞離開其原生組織而移行至新區域的正常發展過程（Thiery和 Sleeman，（2006) TVai·及π Mo/· CW/ 所〇/· 7 : 131〜42)。其特徵為增加促使細胞移行和侵入的蛋白表現’例如基質蛋白酶、類細胞活素TFG /3和包括整合素的 5 各種黏附分子（Zavadil和 Bottinger，2005) 狀 24 : 5764〜5774)。亦在腫瘤中鑑定出emT標記的表現，其特別發生在嚴重侵犯和轉移性腫瘤。aV/5 6促進黏附至間質纖連蛋白、上調ΜΜΡ·9和其他基質蛋白酶的表現以及活化 TFG /5的能力顯示其有利於惡性細胞的emt和腫瘤惡化 10 (Bates和 Mercurio,（2〇〇5) α ά 77^r. 4 : 365〜70)。人類癌症的動物和體外模式已顯示aV点6在促進細胞增生和抑制細胞凋亡上介導信號的傳遞。在體外的膠原凝膠基質中已鑑定出促進^；轉染SW480結腸腫瘤細胞增生之/3 6鏈C端的殘基。與全長冷6轉染SW480細胞比較， 15該点6缺失突變體可明顯降低裸鼠之皮下生長的能力 (Agrez等人，（1994) 乂 Ce//杨/· 127 : 547〜56)。在一穩定表現aV/3 6的口腔癌細胞株中，結合至纖連蛋白導致Fyn激酶被該/5 6次單位所聚集和活化。下游信號的傳遞導致MMp_3 的產生、促進體外的細胞增生、原位模式中的腫瘤侵入， 20及尾靜脈注射模式中的轉移（Li等人，（2003) J.伤〇/. C7^m. 278 : 41646〜53)。如同細胞增生抑制細胞凋亡係另一種aV/5 6促進腫瘤生長的方式。正常複層鱗狀上皮可表現aV/56整合素但係為向下调節以及在轉化成腫瘤時則上調〇;¥万6的表現。利 200815474 用過度表現αν召6的腫瘤細胞株，^；¥/36的表現顯示可避免體外懸吊誘發的細胞死亡（失巢凋亡（an〇ikis))卩仙⑵和

Watt，（2004) J· Ce// 扣〇/ i66 : 419〜31)。已發現以順鉑 (cisplatin)治療之抑制體外卵巢癌細胞株的凋亡，其可代表 5這些腫瘤在體内對抗藥物的機制（Wu等人，（2004)

Zhonghua Fu Chan ICe Za Zhi 39 ·· ]Λ2〜14)。許多研究人員已發展出針對纖維化和癌症之aV沒6活性的治療劑。已顯示對^乂冷日、a；Vy5 3和aV/35整合素具有專一性的小鼠抗體在體外可避免HT29結腸癌細胞黏附 10至玻連蛋白和纖連蛋白（Lehmann等人，（1994) Can·及队 54 : 2102〜07)。已證明另一種人類a V/5 6蛋白專一性的小鼠抗體治療劑在小白鼠的經口異種移植腫瘤模式中可抑制 HSC_3 口腔癌細胞的侵襲性生長(Xue等人，（2001) 5/此/^所. 仿C⑽.288: 610〜18)。利用卢6缺失小鼠模式作 15為宿主可培養出一系列的人類a 6專一性抗體。這些抗體能夠阻斷體外結合至整合素的TFG召LAP和纖連蛋白 (Weinreb等人，（2〇〇4)乂 C/^m. 279 : 17875 〜87)。其在人類咽喉癌異種移植模式中亦顯示明顯抑制腫瘤的生長(Le〇ne 專人，（2003) Ρη (9/ 如 dm. Can. 44，摘要 20 #4069)。抗體除了阻斷功能之外亦報告可產生人類a V/3 6 整合素的擬肽抑制劑。此化合物顯示在2〇〇奈克分的IC50濃度可抑制UCLAP-3細胞結合至纖連蛋白並且分別在3〜20微克分子濃度下具有阻斷aVyS5和aV/33整合素-介導細胞結合至玻連蛋白的其他活性(Goodman等人，（2002) /. Med· 11 200815474 C/iem· 45 ·· 1045〜51)。近期aV/3 6被彼露的另一種角色係作為病毒性抗原的細胞受體。其在體外介導口蹄疫病毒和柯卩產奇病毒9之病毒外殼的結合而導致病毒的入侵(Miller等人，（2001) J· F/ro/· 5 75 : 4158〜64 ; Williams等人，（2004) J·阶〇/· 78 : 6967 〜73)。口蹄疫病毒和柯薩奇病毒9之外殼蛋白均含有可被多整合素家族成員辨識的RGD序列。兩種病原的病毒入侵均可被對aV/3 6整合素之抗體所阻斷（William等人，（2004) 乂巧>〇/· 78 : 6967〜73)。 10 【發明内容】發明概要本發明-般係關於結合至aV06雜向結合劑。本發明之具體實施例係關於特異性結合至a V06而因此可抑制配體結合至的純人_向結合劑。此Μ結合劑亦 15可抑制癌細胞的黏附作用。此外，脉向結合劑可用於減 ν腫瘤的生長。其作用機制不僅侷限於抑制配體至其受體 aV/S6的結合，亦可阻止與配體如的相互作用而降低aV/S6的有效濃度。在本毛月的具體實施例中，該靶向結合劑係結合 2〇至^ V^5 6及阻止aV点6結合至Q ¥06之配體的純人類抗體1V/5 6之配體的實例包括加石LAp、纖連蛋白、肌腱蛋白、玻連蛋白和骨橋蛋白。該抗體可在低於^奈克分子、25奈克分子、1〇奈克分子或60皮克分子的Kd下結合 a V /5 6 〇 12 200815474 又另一具體實施例中係一種結合至αν^6的純人類抗體，其在低至1微克/毫升或以下的抗體濃度可抑制大於 80%、85%、90%或99%之TFG/S-LAP結合至HT29細胞。又另一具體貫施例中係一種結合至a V /3 ό的純人類抗 5體’其在低於〇·〇7〇微克/毫升之IC5〇下可抑制-LAP黏附至HT29細胞。該乾向結合劑（即，抗體）包含列於表8或表29中其一序列之具有互補決定區（CDR)的一重鏈胺基酸序列。在一具體實施例中該乾向結合劑包含列於表8或表29中的其一 10 CDR1、CDR2或CDR3序列。在另一具體實施例中該靶向結合劑包含列於表8或表29中的其中任何二cdri、CDR2或 CDR3 序列（即 CDR1 和 CDR2、CDR1 和 CDR3 或 CDR2 和 CDR3)。在另一具體貫施例中該無向結合劑包含列於表$或表29中的CDIU、CDR2和CDR3序列。應瞭解熟習本技術| 15可輕易地判別該CDR決定區。請參考例如Kabat等人，重# 龙瘦蛋白的序歹y，第五版，NIH出版社91-3242，麻里蘭州

Bethesda市（1991)，第 1〜3冊。在另一具體貫施例中该乾向結合劑（即，抗體）包含列於表9或表30之CDR1、CDR2或CDR3序列中具有互補決定區 2〇 (CDR)的一輕鏈胺基酸序列。在另一具體實施例中該靶向結合劑包含列於表9或表30中的其中任何二CDR1、CDR2或 CDR3 序列（即 CDR1 和 CDR2、CDR1 和 CDR3 或 cdr2 和 CDR3)。在另一具體實施例中該靶向結合劑包含列於表$或表30中的CDIU、CDR2和CDR3序列。 13 200815474 本發明之靶向結合劑包含在非抗體分子内的一抗原結合位點，其通常由將進一步於下文中討論的一或多個cDR 如在一非抗體蛋白骨架内的一組CDR所提供。在另一具體實施例中該靶向結合劑包含純人類單株抗 5 體 sc264RAD、SC264RAD/ADY、scl88SDM、scl33、 scl33TMT、scl33WDS、scl33TMT/WDS、scl88、sc254、 sc264或sc298的任何一CDR1、CDR2或CDR3序列。在另一具體實施例中該靶向結合劑包含純人類單株抗體 sc264RAD、SC264RAD/ADY、scl88SDM、scl33、 10 scl33TMT、scl33WDS、scl33TMT/WDS、scl88、sc254、 sc264或sc298的其中任何二CDR1、CDR2或CDR3序列（即 CDR1 和CDR2、CDR1 和CDR3或CDR2和CDR3)。在另一具體實施例中該靶向結合劑包含純人類單株抗體 sc264RAD、sc264RAD/ADY、scl88SDM、scl33、 15 scl33TMT、scl33WDS、scl33TMT/WDS、scl88、sc254、 sc264或sc298的 CDR1、CDR2和CDR3序列。在本發明的一具體實施例中，該把向結合劑為一抗體。在本發明的一具體實施例中，該靶向結合劑為一單株抗體。在本發明的一具體實施例中，該靶向結合劑為一純 20 人類單株抗體。本發明的另一具體實施例包含一結合至aV/56的抗體以及包含列於表9或表30中任何一 CDR1、CDR2或CDR3序列的輕鏈胺基酸序列。本發明的另一具體實施例包含一結合至aV/36的抗體以及包含列於表9或表30中任何二 14 200815474 CDRl、CDR2或CDR3序列的輕鏈胺基酸序列（即CDRl和 CDR2、CDR1和CDR3或CDR2和CDR3)。本發明的另一具體實施例包含一結合至aV/3 6的抗體以及包含列於表9或表30中之CDIU、CDR2和CDR3序列的輕鏈胺基酸序歹ij 〇在 5 某些具體實施例中，該抗體為純人類單株抗體。本發明又另一具體實施例包含一結合至aV卢6的抗體以及包含列於表8或表29中任何一 CDRl、CDR2或CDR3序列的重鏈胺基酸序列。本發明的另一具體實施例包含一結合至aV/56的抗體以及包含列於表8或表29中任何二 10 CDR1、CDR2或CDR3序列的重鏈胺基酸序列（即CDR1和 CDR2、CDR1和CDR3或CDR2和CDR3)。本發明的另一具體實施例包含一結合至α V /3 6的抗體以及包含列於表8或表29中之CDIU、CDR2和CDR3序歹ij的重鏈胺基酸序列。在某些具體實施例中，該抗體為純人類單株抗體。 15 本發明的一具體實施例包含一或多種特異性地結合至 α V /3 6 的純人類單株抗體 SC264RAD、sc264RAD/ADY、 scl88SDM、scl33、scl33TMT、scl33WDS、scl33TMT/ WDS、scl88、sc254、sc264或sc298，其將詳述於下文。又另一具體實施例係一結合至6的抗體以及包含具有列 20於表9或表3〇中其一序列之CDR的輕鏈胺基酸序列。另一具體實施例係一結合至α V/3 6的抗體以及包含具有列於表8 或表29中其一序列之CDR的重鏈胺基酸序列。在某些具體實施例中，該抗體為純人類單株抗體。進一步的具體實施例係一結合至aVf 6的抗體以及包 15 200815474 表8或表29中其一咖序列的重鏈胺基酸序.列列糾。在芊此Γ表9或表30中其一CDR序列的輕鏈胺基酸序體實施射，該抗體為純人類單株抗體。 a 本發明進—步具體實施例係與本發明抗體競爭結人至 vy?6的無向結合劑（即，抗體）。在一具體實施例中\ 無向結合劑包含具有將表8或表29中至少―咖序列的重鏈胺基酸相以及具㈣於表9或表30巾至少_咖序列的輕鏈胺基酸序列。本發明進一步具體實施例係一結合至aV/3 6上與本發 1〇明抗體相同抗原決定區的乾向結合劑。在一具體實施^ 中，該靶向結合劑包含具有列於表8或表29中至少一cdr序列的重鏈胺基酸序列以及具有列於表9或表3〇中至少一 CDR序列的輕鏈胺基酸序列。在另具體實施例中該歡向結合劑包含具有列於表§ 15或表29中的任何一CDR卜CDR2或CDR3序列以及具有列於表9或表30中的任何一 CDR1、CDR2或CDR3序列。在另一具體實施例中該靶向結合劑包含具有列於表8或表29中的任何二CDR1、CDR2或CDR3序列以及具有列於表9或表30 中的任何二CDR1、CDR2或CDR3序列（即CDR1和CDR2、 2〇 CDR1和CDR3或CDR2和CDR3)。在另一具體實施例中該靶向結合劑包含列於表8或表29中的CDR1、CDR2和CDR3序列以及列於表9或表30中的CDR1、CDR2和CDR3序列。在一些具體實施例中，本發明之結合劑包含在非抗體分子内的一抗原結合位點，其通常由將進一步於下文中討 16 200815474 淪的一或多個CDR如在一非抗體蛋白骨架内的一組^戶提供。 5 10 15 20 仍進一步具體實施例係一結合至6的抗體以及包含具有-或多個矮正性突變的胺基酸序列，其抗體序列被犬k回其各自的胚系序列（germline代叩。例如，兮^ 體可具有列於表1〇〜13中的任一序列。 ^ 本發明進—步提供檢測病人或病人樣本内之aV/56、、曲度的方法’其包含使抗αν^6抗體接觸病人生物樣本以辰偵測樣本内該抗體與aV06的結合濃度。在更明確的夏= 實施例中，該生物樣本為錢或血漿。 … 、在本發明的其他具體實施例中提供包含㈣結合組成物，包括-抗體或其功能片斷以及醫藥上可接受栽劑、本發明仍進-步具體實施例包括有效治療羅患相關疾病或病症之動物的方法，其包括選擇需治療腫瘤腫瘤疾病的動物，以及投與有效劑量之專一性結合至a 3 的純人類單株抗體。 aVyS6 本發明之抗體可用於治療a V Θ 6相關疾病或病症。 a V/5 6的相關疾病或病症可為aV々6所引起之里A 或表現的任何病況。此類疾病的實例包括化異常相互作㈣改變細胞雜或細胞信號傳遞的二配體細胞黏附或細胞信號傳遞本質的改變將導致腫瘤疾二：生。其他αν万6相關疾病或病症包括炎症性疾病、、脑、、與纖維化有_疾病以及與GF_0 、，病、在' 周有關的任何疾病。在實例中，构6相關疾病係腫瘤疾病例如黑色 17 200815474 素瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膠質細胞瘤、肝細胞叫癌、甲狀腺瘤、胃腺（胃）癌、前列腺癌、乳癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、神經膠質母細胞瘤、子宮内膜癌、腎癌、結腸癌、胰腺癌、食道癌、頭頸部癌症、間皮細胞瘤、惡性 5肉瘤、膽癌（膽管癌）、小腸腺癌、小兒腫瘤和鱗狀上皮癌。在另-實例中，該α V⑽關疾病係炎症性疾病例如炎症性腸病；系統性紅斑狼瘡；風濕性關節炎；幼年型慢性關節炎；脊椎關節病變；全身性硬化症如硬皮病；特發性炎性肌病如皮肌炎、多發性肌炎；修格蘭氏⑸。gren，s) 10症候群；系統性血管炎；類肉瘤病（sarc〇id〇sis);甲狀腺炎如格雷夫氏症(Grave，s)、橋本氏(Hashim_，s)甲狀腺炎、幼年型淋巴細胞性曱狀腺炎、萎縮性曱狀腺炎；免疫介導性腎病如腎小球腎炎、腎小管間質腎炎；中樞和末猶神經系統的去神經Μ症如多發性硬化症、自發性多發神經疾 15病，肝膽道疾病例如傳染性肝炎如A、Β、C、D、Ε型肝炎和其他非嗜肝病毒感染；自體免疫慢性活動性肝炎；原發膽汁性肝硬化，肉芽腫性肝炎；以及硬化性膽道炎；炎症和纖維化肺病（如囊腫性纖維化）；麩質敏感性腸病；自體免疫或免疫介導皮膚病包括大皰性皮膚病、多形性紅斑和接 20觸性皮炎、牛皮癖；肺過敏性疾病如嗜伊紅性肺炎、原發性肺纖維化疾病、過敏性結膜炎和過敏性肺炎；移植相關疾病包括移植排斥作用和植體抗宿主疾病。在又另一實例中，該aV/?6相關疾病係纖維化症例如腎或肺纖維化症。 18 200815474 在又另-實例中，該相關疾病係與TGFj失調有關的疾病包括癌症和結締組織(纖維化)病。本發明的其他具體實施例包括抑制動物體心以6誘發之細胞黏附的方法。這些方法包括選擇需治療α V3 6誘發細胞黏附的動物，以及投與有效劑量之專—性杜人至νρ6 的純人類單株抗體。抗體製備用於治其中該單株抗體

本發明進一步具體實施例包括使用_ 療動物之α V冷6相關疾病或病症的藥物，可專一性地結合至ύ： V /5 6。 10 纟仍進—步具體實關中’此處所糾向結合劑可用於製備有效治療動物體内aV36誘發細胞黏附的藥L，其中該單株抗體可專一性地結合至α V/56。、 ' 此處所述之本發明具體實施例係關於可結合及影響α V p 6功能的單株抗體。其他具體實施例係關於純 15人類抗-α V々6抗體及從治療觀點製備具有所需性質的抗_ aV/S6抗體，包括具有高αν/36結合親和力、體外和體内中和αν沒6的能力以及抑誘發細胞黏附和腫瘤生長的能力。在一具體實施例中，本發明包括具有以極高親和力 20 (KD)結合至α V /5 6的抗體。例如能以Kd小於但不侷限於約 ια_5 ' 1(r7' 1(r8' 1()_9、1(^或約 1(rll克分子，或其中任何範圍或值之Kd結合6的人類、兔、小白鼠、嵌合或人化抗體。可藉由此處所述之KinExA®及/或BIACORE® 測定其親和力及/或親抗原性。 19 200815474 本發明的一具體實施例，包括分離可結合至aV/3 6的抗體或該抗體之片斷。如技術中所習知，該抗體可為例如多株、募株、單株、嵌合，及/或純人類抗體。此處所述本發明之具體實施例亦提供用於製造這些抗體的細胞。 5 將瞭解本發明之具體實施例並不僅侷限於任何特定形式的抗體或繁殖和製造方法。例如，該抗_aV冷6抗體可為一全長抗體（例如，具有一完整的人類Fc區）或一抗體片斷 (例如，一Fab、Fab，或1；(北，)2、1^或1)油(1)沾8為人類抗體的最小功能性結合單位)）。此外，該抗體可被製造自分泌該抗 10體的雜交瘤（hybridoma)，或來自已被基因或編碼該抗體之基因轉形或轉染的重組產生細胞。本發明的其他具體實施例包括分離編碼此處所述抗體的核酸分子、具有編碼抗-aV石6抗體之被分離核酸分子的載體或以任何此類核酸分子轉形的宿主細胞。此外，本發明 15的一具體實施例係藉由培養宿主細胞使其產生抗-α V /5 6 抗體的方法’其條件為核酸分子在收獲抗體之後可產生該抗體。應瞭解本發明之具體實施例亦包括編碼本發明之抗體或抗體片斷的任何核酸分子，其包括當轉染入宿主細胞進行抗體繁殖時適合用於增加抗體或其片斷產量的核酸序 20 列。進一步的具體實施例包括藉由接種人類aV沒6或其片斷’及一或多個直系同源序列（orthologous sequences)或其片斷至一哺乳動物以產生對aV/5 6具有高親和力抗體的方法0 20 200815474 f ，其他的具體實施例為產生和鑑定專一性地結合至的被分離抗體。抑制a Vy5 6的生物活性可阻止α v点的細胞黏附及其他所欲效應。本發明的另一具體實施例包括診斷疾病法，其利用此處所製備之抗體偵測病人樣本内的αν^ 度。在一具體實施例中，該病人樣本係血液或血清一步具體實施例中，提供用於鑑定危險因子、 α V々6 6誘發的方 6濃在進診斷疾病和疾病分期的方法，其包括利用抗-aV石6抗體鑣定的過度表現。 1〇本發明另一具體實施例包括藉由血清或細胞和抗 6抗體的接觸及其後偵測a VyS 6的存在以診斷細於與aVyS 6表現有關之疾病的方法。首選的病況包括^ Ο 相關的疾病或病症其包括，但不侷限於腫瘤疾病例如專色素瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膠質細胞瘤、肝細胞(肝） 15癌、神經膠質母細胞瘤，以及甲狀腺、胃、前列腺、乳房、 \ / 卵巢、膀胱、肺、子宮、腎、結腸和胰臟、唾液腺和結腸直腸的腫瘤。在另一具體實施例中，本發明包括一種用於债測哺乳動物組織、細胞或體液内之aV万6以篩檢aV点6相關疾病 20 的檢測套組。該套組包括結合至6的抗體及若有時用於指示抗體與6之反應的工具。在一具體實施例中，該抗體係一單株抗體。在另一具體實施例中，標示該結合 aV/36的抗體。在仍另一具體實施例該抗體為未標示初級抗體及該套組進一步包括用於偵測該初級抗體的工具。4 21 200815474 一具體, ’、$施例中，該用於偵測的工具包括一種抗免疫球蛋白的標禾馀第二抗體。該標示抗體的標記(marker)係選自由螢半斗酵素、放射性核素(radionuclide)和不透射線材料所構成之群t。 5 本發明之其他具體實施例包括混合醫藥上可接受載劑或稀釋劑之有效量抗-aV/5 6抗體的醫藥組成物。在又其他具體實施例中，該抗6抗體或其片斷係共軛至一治療劑。該治療劑可為例如一毒素或放射性同位素。又另一具體實施例包括藉由投與有效量的抗万6 10抗體以治療病人體内與αν/3 6表現有關之疾病或病症的方法。該抗-aV/3 6抗體可單獨被投與，或其投與時可結合其他抗體或化療劑或放療法。例如，阻止細胞黏附的aV^6 單株、募株或多株抗體混合物的投與可結合具有直接抑制腫瘤細胞增生的藥物。此方法可在體内進行及該病人較佳 15為人類。在一較佳具體實施例中，該方法所治療的aV/?6 相關疾病或病症包括，但不侷限於腫瘤疾病例如黑色素瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膠質細胞瘤、肝細胞(肝) 癌、神經膠質母細胞瘤，以及甲狀腺、胃、前列腺、乳房、卵巢、膀胱、肺、子宮、腎、結腸和胰臟、唾液腺和結腸 20 直腸的腫瘤。在另一具體實施例中，本發明提供包括一容器的製品。該容器包括含有抗_aVy36抗體的組成物，以及指示如何使用組成物治療a V/3 6過度表現之aV/5 6相關疾病或病症的包裝附頁或標籤。 22 200815474 在些具體實施例中，該抗_αλ^6抗體係被投與至一病人接著藉由投與清除劑以從血液中移除過量的循環抗體。、又另—具體實施例為使用iaV/5 6抗體製造用於治療Θ 6相關疾病或病症如腫瘤疾病、炎症性疾病、纖維化症肺病或TFGj失調有關疾病的藥物。在一具體實施例中。亥腫瘤疾病包括癌症例如乳房、印巢、胃、子宮内膜、:液腺、肺、腎、結腸、結直腸、食道、甲狀腺、胰臟相腺和膀胱癌。在另一具體實施例中，該相 10關疾病或病症包括，但不侷限於腫瘤疾病例如黑色素瘤、小、、、田胞肺癌、非小細胞肺癌、膠質細胞瘤、肝細胞(肝)癌、惡性肉瘤、頭頸部癌症、間皮細胞瘤、膽癌（膽管癌）、小腸腺癌、小兒腫瘤和神經膠質母細胞瘤。本發明又另一具體實施例係使用抗V0 6抗體於製 15造用於治療炎症性或咼度增生性疾病包括但不侷限於關節炎、動脈粥樣硬化症、過敏性結膜炎的藥物。圖式簡單說明第1圖為純單株抗體結合至α V々6及阻止其結合至 GST-LAP狀之能力的曲線圖。 20 第2Α和2Β圖為幾何平均螢光(GMF)之分子mAb濃度函數所繪製的曲線圖，其用於測定其一抗體對穩定表現人類〇:\^/5 6抗原之1^562細胞的結合親和力。第2八圖為111八|3188 的親和力數據。第2B圖為mAb264 RAD的親和力數據。第3A〜3E圖為純單株抗體於穩定表現αν厶6整合素之 23 200815474 293細胞内介導補體依賴性細胞毒性效應之能力的柱狀圖。第4圖為利用Detroit-562鼻咽細胞株之264RAD、133和 188SDM抗體抑制腫瘤生長能力的柱狀圖。第5圖為264 RAD264與RAD/ADY之活性比較的柱狀 5 圖。

C實施方式;J 較佳實施例之詳細說明本發明之具體實施例係關於結合至α V /5 6整合素 (aV万6)的靶向結合劑。在一些具體實施例中，該結合劑 10可結合点6並抑制配體與aV/36的結合。在一具體實施例中，該乾向結合劑為單株抗體或其結合片斷。在另一具體實施例中，該抗體僅結合至々6鏈但仍能抑制配體與 a V/36的結合。本發明之其他具體實施例包括純人類抗_α ¥石6抗 15體’以及製備具有治療效益的抗體。在_具體實施例中，該製備的抗_〇:¥/3 6抗體具有所欲的治療價值，包括對qv冷6 的高結合親和力以及體外抑制TGF壯Αρ介導之細胞黏附的能力。加/本發明的具體實施例亦包括抗-αν/3 6抗體的純人類〇分離結合片斷。在一具體實施例中該結合片斷係源自於純人類抗-aV/3 6抗體。舉例性片斷包括詳述如下之&、或其他已知的抗體片斷。本發明之具體實施例亦包括表3現對抗之純人類抗體的細胞。該細胞的實例包括雜交瘤或重組產生細胞例如中國倉鼠卵巢(CH〇)細胞、細 24 200815474 胞變異株(例如DG44)以及產生對抗αν^62抗體的NS〇細胞。有關CHO細胞變異株的其他資料請參考Andersen* Reilly (2004) Current Opinion in Biotechnology 15 ： 456〜462，將其完整併入於此以供參照。 5 此外，本發明之具體實施例包括利用這些抗體於治療 ανβ 6相關疾病或病症的方法。6相關疾病或病症可為起因於aV/5 6異常活化或表現的任何病況。此類疾病的貝例包括α V/3 6與其配體異常相互作用而改變細胞黏附或細胞信號傳遞的疾病。此細胞黏附或細胞信號傳遞性質的 1〇改變將導致腫瘤疾病。其他aV/36相關疾病或病症包括炎症性疾病、肺病、與纖維化有關的疾病以及與冷失調有關的任何疾病。在一實例中，該aV/3 6相關疾病係腫瘤疾病例如黑色素瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膠質細胞瘤、肝細胞(肝） 15癌、甲狀腺瘤、胃腺（胃）癌、前列腺癌、乳癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、神經膠質母細胞瘤、子宮内膜癌、腎癌、結腸癌、胰腺癌、食道癌、頭頸部癌症、間皮細胞瘤、惡性肉瘤、膽癌（膽管癌）、小腸腺癌、小兒腫瘤和鱗狀上皮癌。在另一實例中，該aV/5 6相關疾病係炎症性疾病例如 20炎症性腸病；系統性紅斑狼瘡；風濕性關節炎；幼年型慢性關節炎；脊椎關節病變；全身性硬化症如硬皮病；特發性炎性肌病如皮肌炎、多發性肌炎；修格蘭氏症候群；系統性血管炎；類肉瘤病；甲狀腺炎如格雷夫氏症、橋本氏甲狀腺炎、幼年型淋巴細胞性甲狀腺炎、萎縮性甲狀腺炎； 25 200815474 免疫介導性腎病如腎小球腎炎、腎小管間質腎炎；中樞和末稍神經系統的去神經髓鞘症如多發性硬化症、自發性多發神經疾病；肝膽道疾病例如傳染性肝炎如a、b、c、d、 E型肝炎和其他非嗜肝病毒感染；自體免疫慢性活動性肝 5炎；原發膽汁性肝硬化；肉芽腫性肝炎；以及硬化性膽道炎；炎症和纖維化肺病（如囊腫性纖維化）；麩質敏感性腸病；自體免疫或免疫介導皮膚病包括大皰性皮膚病、多形性紅斑和接觸性皮炎、牛皮癖；肺過敏性疾病如嗜伊紅性肺炎、原發性肺纖維化疾病、過敏性結膜炎和過敏性肺炎； 10 移植相關疾病包括移植排斥作用和植體抗宿主疾病。在又另一實例中，該aV/3 6相關疾病係纖維化症例如腎或肺纖維化症。在又另一實例中，該α V /3 6相關疾病係與TGF-沒失調有關的疾病包括癌症和結締組織(纖維化)病。 15 本發明其他具體實施例包括特異性地測定生物樣本内之aV/3 6數量的診斷檢測法。該檢測套組包括抗-aV冷6 抗體及偵測該抗體的所需標記。這些診斷檢測法可用於篩檢j V相關疾病或召6病症包括’但不侷限於腫瘤疾病例如專、色素瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膠質細胞瘤、肝 20細胞(肝)癌、神經膠質母細胞瘤，以及甲狀腺、胃、前列腺、乳房、卵巢、膀胱、肺、子宮、腎、結腸和胰臟、唾液腺和結腸直腸的腫瘤。本發明的另一態樣為具有01^召6生物活性的拮抗劑，其中該拮抗劑可結合至6。在一具體實施例中，該拮 26 200815474 抗劑為例如一抗體的靶向結合劑。該拮抗劑可結合至： ⑴單獨的/3 6; (ii) a V；S6 ;或 (iii) 該a Vy5 6/配體複合物， 5 或其組合。在一具體實施例中該抗體在體外和體内可對抗aV/3 6的生物活性。該抗體可選自純人類單株抗體例如 sc 264RAD、sc264RAD/ADY、scl88SDM、scl33、 scl33TMT、scl33WDS、scl33TMT/WDS、scl88、sc254、 sc264或sc298，或其變異株。 10 在一具體實施例中該aV/3 6生物活性拮抗劑可結合至 aV/3 6因而可阻止TFG/3 LAP介導的細胞黏附作用。一具體實施例係可如純人類單株抗體sc264RAD、sc 264RAD/ADY、scl88SDM、scl33、scl33TMT、scl33WDS、 scl33TMT/WDS、scl88、sc254、sc264或sc298結合至相同 15 抗原決定區的抗體。在一具體實施例中，該靶向結合劑以低於1〇〇奈莫耳 (11乂)的1^下結合a V/3 6。該靶向結合劑以低於約35奈莫耳 (11厘)的1^下結合。該靶向結合劑以低於約25奈莫耳(ηΜ)的 Kd下結合。該乾向結合劑以低於約1〇奈莫耳化^^的心下結 20 合。在另一具體實施例中，該乾向結合劑以低於約60皮莫耳(pM)的Kd下結合。一具體實施例為可製造如前述抗體之輕鏈及/或重鏈的抗體分泌漿細胞。在一具體實施例中該漿細胞係製造純人類單株抗體的輕鏈及/或重鏈。在另一具體實施例中該漿 27 200815474 細胞係製造純人類單株抗體sc264RAD、sc264RAD/ADY、 scl88SDM、scl33、scl33TMT、scl33 WDS、scl33TMT/ WDS、scl88、sc254、sc264或sc298的輕鏈及/或重鏈。另類的漿細胞可製造如純人類單株抗體sc264RAD、sc264 5 RAD/ADY、scl88SDM、scl33、scl33TMT、scl33WDS、 scl33TMT/WDS、scl88、sc254、sc264或sc298結合至相同抗原決定區的抗體。另一具體實施例為編碼如上述抗體之輕鏈或重鏈的核酸分子。在一具體實施例中該核酸分子係編碼一純人類單 10 株抗體的輕鏈或重鏈。仍另一具體實施例係編碼選自抗體 sc264RAD、sc264RAD/ADY、scl88SDM、scl33、scl33 TMT、scl33WDS、scl33TMT/WDS、scl88、sc254、sc264 或sc298之純人類單株抗體之輕鏈或重鏈的核酸分子。本發明另一具體實施例係包含上述核酸分子的一載 15 體，其中該載體編碼上述抗體的輕鏈及/或重鏈。本發明又另一具體實施例係包含上述載體的一宿主細胞。另類的宿主細胞可包含多於一個載體。此外，本發明一具體實施例係藉由在核酸分子可產生該抗體的條件下培養宿主細胞接著收獲抗體以製造該抗體 20 的方法。本發明的一具體實施例包括製造一抗體的方法，其係藉由編碼上述抗體之至少一核酸分子轉染至少一宿主細胞、在該宿主細胞内表現該核酸分子以及分離該抗體。根據另一態樣，本發明包括對抗aV/3 6之生物活性的 28 200815474 方法，其包含投與此處所述的拮抗劑。該方法包括選擇需治療aV/3 6相關疾病或病症的動物，以及將治療有效量之 aV/56生物活性拮抗劑投與至該動物。本發明另-態樣包括對抗aV/36之生物活性的方法， 5其包含投與上述的抗體。該方法包括選擇需治療^万6相關疾病或病症的動物，以及將治療有效量之對抗aV/S6生物活性的抗體投與至該動物。根據另-態樣提供-種治療魏動物之α V 0 6相關疾病或病症的方法，其包含投與絲有效量的aV/S6生物活川性拮抗劑。該方法包括選擇需治療αν/3_關疾病或病症的動物，以及將治療有效量的生物活性拮抗劑投與至該動物。根據另一態樣提供一種治療哺乳動物之aV々6相關疾病或病症的方法，其包含投與治療有效量之對抗αν召6生 15物活性的抗體。該方法包括選擇需治療aV/3 6相關疾病或病症的動物，以及將治療有效量之對抗aV/S6生物活性的抗體投與至該動物。該抗體可被單獨投與，或結合其他抗體或化療劑或放線療法之下被投與。根據另一悲樣提供治療浦乳動物之癌症的方法，其包 20含投與治療有效量的〇：乂万6生物活性拮抗劑。該方法包括選擇需治療癌症的動物，以及將治療有效量的aV/36生物活性拮抗劑投與至該動物。該拮抗劑可被單獨投與，或結合其他抗體或化療劑或放線療法之下被投與。根據另一態樣提供治療哺乳動物之癌症的方法，其包含 29 200815474 投與治療有效量之對抗aV/3 6生物活性的抗體。該方法包括選擇需治療癌症的動物，以及將治療有效量之對抗aV/56 生物活性的抗體投與至該動物。該抗體可被單獨投與，或結合其他抗體或化療劑或放線療法之下被投與。根據本發明的另一態樣運用aV/56生物活性拮抗劑製造用於治療α V /3 6相關疾病或病症的藥物。根據本發明的另一態樣運用對抗α ν点6生物活性的抗 5 15 20 體製造用於治療aV/3 6相關疾病或病症的藥物。在-較佳具體實施例中本發明特別適合在單獨或部分依賴aV/36整合素的腫瘤病患體内用於對抗αγ^6。本發明的另-具體實施例包括用於偵測哺乳動物組織、細胞或體液内之αν細篩檢aV/56相關疾病或病症的檢測套組。該綠包括結合至av “的域及衫時用於指不抗體hv/56之反應以具。該抗體可為—單株抗體。在-具體實施财，標示該結合av㈣抗體。在另 -具體貫施例中該抗體為未標示初級抗體及該套组進一步 =用於偵測該初級抗體的工具。在—具體實施例中，該外-、i則Γ具包括—種抗免疫球蛋白的榡示第二抗體。 :=的標記係選自由榮光染料、酵素、放射性核素矛不透射線材料所構成之群組。施例、特性等將於有關抗-a V点6抗體的進一步具體實下文中詳述。序列▲

1的專一性抗-a V 本發明的具體實施例包括列於下表 30 200815474 /3 6抗體。此表列舉各抗-aV；S 6抗體的辨識編號以及對應重鏈和輕鏈基因之可變區的序列辨識編號(SEQ ID NO)。各抗體已給予一個包括繼之以數目之字母” sc”的辨識編號。 mAb辨識編號序列序列辨識編號 sc 49 編碼重鏈可變區的核苷酸序列 1 編碼重鏈可變區的胺基酸序列 2 編碼輕鏈可變區的核苷酸序列 3 編碼輕鏈可變區的胺基酸序列 4 sc 58 編碼重鏈可變區的核苷酸序列 5 編碼重鏈可變區的胺基酸序列 6 編碼輕鏈可變區的核苷酸序列 7 編碼輕鏈可變區的胺基酸序列 8 sc 97 編碼重鏈可變區的核苷酸序列 9 編碼重鏈可變區的胺基酸序列 10 編碼輕鏈可變區的核苷酸序列 11 編碼輕鏈可變區的胺基酸序列 12 sc 133 編碼重鏈可變區的核苷酸序列 13 編碼重鏈可變區的胺基酸序列 14 編碼輕鏈可變區的核苷酸序列 15 編碼輕鏈可變區的胺基酸序列 16 sc 161 編碼重鏈可變區的核苷酸序列 17 編碼重鏈可變區的胺基酸序列 18 編碼輕鏈可變區的核苷酸序列 19 編碼輕鏈可變區的胺基酸序列 20 sc 188 編碼重鏈可變區的核苷酸序列 21 編碼重鏈可變區的胺基酸序列 22 編碼輕鏈可變區的核苷酸序列 23 編碼輕鏈可變區的胺基酸序列 24 31 200815474 sc 254 .編碼重鏈可變區的核苷酸序列 25 編碼重鏈可變區的胺基酸序列 26 編碼輕鏈可變區的核苷酸序列 27 編碼輕鏈可變區的胺基酸序列 28 sc 264 編碼重鏈可變區的核苷酸序列 29 編碼重鏈可變區的胺基酸序列 30 編碼輕鏈可變區的核苷酸序列 31 編碼輕鏈可變區的胺基酸序列 32 sc 277 編碼重鏈可變區的核苷酸序列 33 編碼重鏈可變區的胺基酸序列 34 編碼輕鏈可變區的核苷酸序列 35 編碼輕鏈可變區的胺基酸序列 36 sc 298 編碼重鏈可變區的核苷酸序列 37 編碼重鏈可變區的胺基酸序列 38 編碼輕鏈可變區的核苷酸序列 39 編碼輕鏈可變區的胺基酸序列 40 sc 320 編碼重鏈可變區的核苷酸序列 41 編碼重鏈可變區的胺基酸序列 42 編碼輕鏈可變區的核苷酸序列 43 編碼輕鏈可變區的胺基酸序列 44 sc 374 編碼重鏈可變區的核苷酸序列 45 編碼重鏈可變區的胺基酸序列 46 編碼輕鏈可變區的核苷酸序列 47 編碼輕鏈可變區的胺基酸序列 48 sc 188 SDM 編碼重鏈可變區的核苷酸序列 70 編碼重鏈可變區的胺基酸序列 71 編碼輕鏈可變區的核苷酸序列 72 編碼輕鏈可變區的胺基酸序列 73 32 200815474 /編碼重鏈可變區的核苷酸序列 74 sc 264 編碼重鏈可變區的胺基酸序列 75 RAD 編碼輕鏈可變區的核苷酸序列 76 編碼輕鏈可變區的胺基酸序列 77 編碼重鏈可變區的核苷酸序列 78 sc 133 編碼重鏈可變區的胺基酸序列 79 TMT 編碼輕鏈可變區的核苷酸序列 80 編碼輕鏈可變區的胺基酸序列 81 編碼重鏈可變區的核苷酸序列 82 sc 133 編碼重鏈可變區的胺基酸序列 83 WDS 編碼輕鏈可變區的核苷酸序列 84 編碼輕鏈可變區的胺基酸序列 85 編碼重鏈可變區的核苷酸序列 86 sc 133 TMT/ WDS 編碼重鏈可變區的胺基酸序列 87 編碼輕鏈可變區的核苷酸序列 88 編碼輕鏈可變區的胺基酸序列 89 編碼重鏈可變區的核苷酸序列 90 sc 264 編碼重鏈可變區的胺基酸序列 91 ADY 編碼輕鏈可變區的核苷酸序列 92 編碼輕鏈可變區的胺基酸序列 93 編碼重鏈可變區的核苷酸序列 94 sc 264 RAD/ ADY 編碼重鏈可變區的胺基酸序列 95 編碼輕鏈可變區的核苷酸序列 96 編碼輕鏈可變區的胺基酸序列 97 定義除非另有說明，否則此處使用的科學和技術名詞與熟習本領域之技術者通常所瞭解的意義相同。再者，除非就 5 内文之需要，否則單數名詞應包括複數的涵意以及複數名 33 200815474 詞應包括單數的涵意。通常，此處所述與細胞和組織培養、分子生物，及蛋白質和寡或多核苷酸化學以及此處所述的雜交反應之技術有關的命名均為技術中所習知及常用者。標準技術被用於重組DNA、寡核普酸合成，以及組織 5培養和轉化(例如，電穿透法、微脂粒轉染法）。根據製造商的說明書或一般技術或此處所述方法進行酵素反應和純化技術。根據技術中已知的一般方法以及本專利說明中所引述和討論的各種一般和更專業參考書籍進行上述的技術和程序。請看例如Sambrook等人，分子選虔··紫發室手#(第 10 三版，冷泉港實驗室出版，紐約冷泉港市（2001))，將其併入於此以供參照。與此處所述分析化學、合成有機化學及醫藥和製藥化學有關之實驗室方法和技術的命名已為技術中所習知和常用者。標準技術係被用於化學合成、化學分析、藥劑製備、配製物及病人的投藥和治療。 15 根據本發明披露的應用，下列名詞除非另有說明否則具有如下的意義· 此處使用的名詞“及/或”被視為具有或不具有另一者的各該兩種特定性質或成分的明確揭示。例如“A及/或B”各分別獨立被視為（i) A、（ii) B和（iii) A和B的明確揭示。 20 一拮抗劑可為一多核苷酸、核酸、碳水化合物、脂質、小分子量化合物、一寡核苷酸、一寡肽、干擾RNA(RNAi)、反義核酸、一重組蛋白、一抗體，或其共輛或融合蛋白。 RNAi 的綜述請參考 Milhavet 0，Gary DS，Mattson MP. CP/iarmaco/· 2003年 12月；55(4) : 629〜48綜述）以及反 34 200815474 義核酸請參考Opalinska JB，Gewirtz AM.(5W· 2003 年10月 28日；2003 (206) : pe47)。疾病相關的異常活化或“ α V万6”表現可為任何的異常、不良或病理性細胞黏附，例如腫瘤相關細胞勒附。細 5 胞黏附相關疾病包括，但不侷限於非實體腫瘤例如白血病、多發性骨髓瘤或淋巴瘤，以及亦包括實體腫瘤例如黑色素瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膠質細胞瘤、肝細胞(肝)癌、神經膠質母細胞瘤，以及甲狀腺、膽道、骨於、胃、腦/CNS、頭和頸、肝細胞系、胃底、前列腺、乳房、 10腎細胞、睪丸、卵巢、皮膚、子宮頸、肺、肌肉、神爽元食道、膀胱、肺、子宮、外陰、子宮内膜、腎、結直腸胰臟、胸膜/腹膜、唾液腺和表皮的腫瘤。小分子量化合物意指分子量小於約2〇〇〇道耳頓的任何化合物。万6鏈構成的異源雙 15 —司指由一 qV鍵和一體整合素分子。

“中和”一詞當用於一靶向結合劑如抗體時，係护二向結合劑、;肖除或明顯降低妹原活性的能力。因此'，、—4 抗-aV厶6抗體能消除或明顯降低“乂厶6的活性。一中矛 20 V卢6抗體可例如藉由阻斷TGF々 LAP結合至整合素而發揮其作用。藉由限斷此結合，可明顯或完全消除V/36 介導的細胞黏附作用。理想上，-對抗αν心的= V/36 可抑制細胞的黏附作用。㈣中和抗體此處为離多核替酸，，—詞應指已被分離自其天然環境 35 200815474 的多核苷酸。此類多核苷酸可為基因組、CDNA，或合成物。分離多核苷酸較佳為與天然無關的全部或一部分多核苷酸。該分離多核苷酸可被連接至非天然的另一多核苷酸。此外’分離多核苷酸較佳為非來自天然之較大序列的一部 5 分。此處“分離蛋白，，一詞指已被分離自其天然環境的蛋白質。此類蛋白質可源自基因組DNA、cDNA、重組DNA、重組RNA ’或源自合成或其一些組合，其借助於其原始或衍生來源該“分離蛋白”（1)與天然發現的蛋白無關；（2)無來自 10相同來源的其他蛋白，例如無鼠蛋白；（3)被表現於另一不同品種的細胞；或(4)天然中無法產生。此處“多肽，，一詞為指多肽序列之原始蛋白、片斷或類似物的通用名詞。因此，原始蛋白、片斷和類似物為多肽類中的一種。根據本發明較佳的多肽包含人類重鏈免疫球 15 蛋白分子和人類/c輕鏈免疫球蛋白分子，以及重鏈免疫球蛋白为子與輕鍵免疫球蛋白分子如π或A輕鍵免疫球蛋白分子之組合及反之亦然所形成的抗體分子，以及其片斷和類似物。根據本發明較佳的多肽亦包含完全的人類重鏈免疫球蛋白分子或其片斷。 20 此處“自然發生，，應用於一物質指天然中被發現的物質。例如’可分離自天然存在於有機體（包括病毒）内的多肽或多核苷酸序列，其非經人類刻意在實驗室内被修飾者。此處“可操作地被連接，，一詞指可將所述成分依照所欲方式安排於能使其發揮功能的關係位置。例如，一控制序 36 200815474 列“可操作地連接，，至一編碼序列係在控制序列的條件下表現該編碼序列。此處“多核苷酸”一詞指長度至少為1〇個鹼基對的聚合型核苷酸，其可為核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或各類核 5 苷酸的修飾型，或RNA-DNA異源雙鏈。此名詞包括單和雙股型DNA。此處“募核苦酸”一詞指藉由天然或非天然鍵結相連接的天然和修飾核苷酸。寡核苷酸為多核苦酸的子群通常包含200個鹼基對或更少的長度。寡核苷酸的長度較佳為1〇至 10 60個驗基對以及最佳長度為12、13、14、15、16、17、18、 19或20至40個驗基對。寡核苷酸通常為單股例如用於探針；但寡核苷酸亦可為雙股例如用於構建一突變基因。寡核苷酸可為正義或反義寡核苷酸。此處“天然核苷酸”一詞包括去氧核糖核苷酸和核糖核 15 苷酸。此處“修飾核苷酸”一詞包括具有修飾或經置換糖基等的核苷酸。此處“募核苷酸鍵結”一詞包括例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、磷醯胺酸酯等的募核苷酸鍵結。請參考LaPlanche等人 ’ M/c/· 心 7?队 14 : 9081 (1986); 2〇 Stec等人，/. dm· C7^m·心c. 106 : 6077 (1984) ; Stein等人， AW/·如油及以· 16 : 3209 (1988) ; Zon等人，如 6 : 539 (1991) ; Zon等人，⑽⑽d 乂似/ogww ·· / ’ 第 87〜108 頁（F· Eckstein 編輯，夺津乂學於展，英國牛津（1991)) ; Stec等人，美國 37 200815474 專利案 5，151，51〇 ; Uhlmann和 Peyman，c/^mica/ 90 : 543 (1990)，將其併入於此以供參照。需要時可枳示一寡核苷酸以供偵測。此處“選擇性雜交，，一詞指可偵測及專一性地結合。多 5核苷酸、寡核苷酸及其片斷在可減少大量結合至非特異性核酸的雜交和洗滌條件下選擇性地雜合至核酸鏈。可使用高嚴格度作為技術中所習知及此處所述的選擇性雜交條件。通常，多核苷酸、寡核苷酸或抗體片斷和目標核酸序列之間的核酸序列同源度將至少為80%，以及更佳為至少 10 85%、90%、95%、99%和 100%的同源度。 “CDR區”或“CDR”一詞意指免疫球蛋白之重和輕鏈的高變異區其述於Kabat等人，1991(Kabat，Ε·Α.等人（1991)沒 #龙瘦蛋泠的序歹y第五版，美國衛生與公眾服務部，Nm 華盛頓）及其後版本。一抗體一般含有3個重鏈cdr和3個輕 15鏈CDR。根據此處所述的CDR—詞係指這些區的其一或數個或甚至全部區域含有以抗體親和力結合至抗原或其可辨識抗原決定區的主要胺基酸殘基。在六個CDR序列中重鏈的第三個CDR(HCDR3)具有較大的尺寸差異性（多變異性主要由於基因排列的機制所造成）。其可短至2個胺基酸但已 2〇知最長可達26個。根據適合特定基礎骨架的長度亦可有各種不同長度的CDR。在功能上，HCDR3扮演決定抗體特異性的角色（Segal等人，iWAS，71 : 4298〜4302, 1974 ; Amit等人，233 : 747〜753, 1986 ; Chothia等人，J.偷/.及W. 196 : 901〜917，1987 ; Chothia等人，施加％ 342 : 877〜883, 38 200815474 1989 ; Caton等人，/. /mmtmo/.，144 : 4863〜4869, 1990 ; Kabat 等人，/./mmw ⑽/·，147: 1709〜1719，1991)。此處“一組CDRs”包括CDR1、CDR2和CDR3。因此，一組 HCDRs 指 HCDR1、HCDR2 和 HCDR3(HCDR指可變重 5 鏈 CDR)，以及一組 LCDRs 指 LCDR1、LCDR2 和 LCDR3 (LCDR指可變輕鏈CDR)。除非另有明述，否則“一組CDRs” 包括 HCDRs和 LCDRs。兩個胺基酸序列若其序列間具有部分或全部一致性時稱為“同源性”。例如，85%的同源性指當配對兩個胺基酸序 10列時其具有85%的序列一致性。在最大符合度中可容許存在空隙（在兩個可匹配的序列中）；空隙長度較佳為5或更少，其以小於2更佳。如此處使用的名詞或者和較佳為利用具有突變數據矩陣和6或更大之空隙扣分的ALIGN軟體若其比對分數高於5(標準偏差單位）時兩個蛋白質序列（或源 15自其長度至少約3 〇個胺基酸的多肽序列）視為具有同源性。請參考Dayhoff，Μ·0·於蛋白f序％和禮道屬摩，第 1〇1〜110頁（第5卷，爵縻至#譬學砰芜差金#(1972))以及此卷的補充文件2第1〜10頁。當利用ALIGN軟體最佳化比對時若其胺基酸的一致性大於或等於5〇%時該兩個序列或其部 2〇分具有更佳的同源性。應瞭解在兩個直系同源序列内可具有不同區域的同源性。例如，小白鼠和人類同源基因的功月b性位置與非功能區比較具有較高程度的同源性。此處“相當於”一詞指一多核苷酸序列與全部或部分來考多核苷酸序列具有同源性，或一多肽序列與一參考多肽 39 200815474 序列具有一致性。啊一，指其互補序列與全部或部分參考多核絲序列具有同源性。舉例而言核㈣序列“TATAC”相當於—參考序列“TATAC”以及與參考序列 “GTATA”相互補。此處序列—致性指在比.較* 口的兩個多㈣酸或胺基酸序列為相同（即，在核芽酸對核魏或殘基對殘基的基礎上）序列一致性百分比，，一詞的計算為藉由在比對窗口比較兩個最適合的比對序列以測定發生在二者序列所產生 10相符位置之具有相同核酸鹼基(例如，A、T、c、G、或胺基酸殘基的數目，接著將相符位置的數目除以比對窗口内（即，視窗大小）位置的總數然後將結果乘以1〇〇而獲得该序列一致性百分比。此處“實質上相同，，一詞表示一多核苷酸或胺基酸序列的特徵，其中該多核苷酸或胺基酸當在 15至少18個核苷酸(6個胺基酸)位置的比較窗口内，經常在至少24〜48個核苷酸(8〜16個胺基酸）位置相比較時包含至少 85%序列一致性的序列，較佳為至少9〇至95%的序列—致性，更佳為至少99%的序列一致性，其中該序列一致性百分比的計算係藉由參考序列與比較窗口内包含刪除或添力口 2〇總數為參考序列的20%或或更少之序列的比較。該參考序列可為一較大序列的子群。此處該2 0種習知胺基酸及其簡稱係根據習知的用法。請參考龙疫爹一合ϋ(第二版’ E.S· Golub和D.R. Gren編輯，&>2(2⑽r滋#，麻州Sunderland市（1991))，將其併入於 200815474 此以供參照。此20種習知胺基酸的立體異構物（例如，右旋胺基酸）、非天然胺基酸例如α -、α-雙取代胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸，以及其他非習知胺基酸亦適合作為本發明的多肽。非習知胺基酸的實例包括：4-羥基脯胺酸、7-5 羧基麩胺酸、ε-Ν，Ν，Ν-三甲基離胺酸、ε-Ν_乙醯基離胺酸、〇-磷酸絲胺酸、Ν-乙醯基絲胺酸、Ν-甲醯基甲硫胺酸、 3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、σ-Ν-甲基精胺酸，以及其他類似的胺基酸(例如，4-羥基脯胺酸）。在此處使用的多肽記法中’根據標準和習慣用法左手邊為胺基端方向及右手 10 邊為魏基端方向。同樣，除非另有明述，否則單股多肽序列的左手端為5, 端；雙股多肽序列的左手邊稱為5,端方向。加入新生RNA 轉錄本的5’至3’方向稱為轉錄方向；DNA鏈上具有和RNA 相同序列及其為RNA轉錄本之5,至5,端的序列區稱為“上游 15序列” ；DNA鏈上具有和RNA相同序列及其為RNA轉錄本之 3’至3’端的序列區稱為“下游序列”。當應用至多肽時，“實質上相同，，一詞指當例如藉由利用預設空隙權重（gap weights)的GAP或BESTFIT軟體最佳化比對兩種肽序列時可共享至少80%的序列一致性，較佳 20為至少9〇°/❾的序列一致性，更佳為至少95%的序列一致性，以及最佳為至少99%的序列一致性。未具有一致性的殘基位置板仏為置換以保留（c〇nservative)胺基酸作為區分。保遠基自文置換指具有類似侧鏈的可互換殘基。例如，具有脂族側鍵的〜群胺基酸為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺 200815474 酸和異白胺酸；具有脂族羥基側鏈的一群胺基酸為絲胺酸和蘇胺酸；具有含醯胺側鏈的一群胺基酸為天冬胺酸鹽和麩醯胺酸鹽；具有芳族侧鏈的一群胺基酸為苯丙胺酸、酪胺酸和色胺酸；具有鹼基側鏈的一群胺基酸為離胺酸、精 5 胺酸和組胺酸；具有含硫側鏈的一群胺基酸為半胱胺酸和甲硫胺酸。較佳的保留胺基酸取代基為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸_酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天冬胺酸，以及天冬胺酸鹽·麩醯胺酸鹽。如上所述，本發明涵蓋較小差異之胺基酸序列的抗體 10或免疫球蛋白分子，其意指與此處所述抗體或免疫球蛋白比幸父该胺基酸序列内的差異應維持在至少約75%，更佳為至少80%、90%、95%，以及最佳為約99%的序列一致性。明碟而言，保留胺基酸的置換極為重要。保留性置換係發生在具有相關側鏈的胺基酸家族内。基因編碼胺基酸通常 15被分成下列家族：⑴酸性=天冬胺酸鹽、楚胺酸鹽；⑺驗性=離胺酸、精胺酸、組胺酸；（3)非極性=丙胺酸、織胺酸二白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、笨丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸；以及(4)不帶電荷極性=甘胺酸、天冬醯胺酸、細胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、路胺酸。更佳為：脂族以 2。《的絲胺酸和蘇胺酸;含醯胺家族的天冬醢胺酸胺酸；脂族家族的丙胺酸、續胺酸、白胺酸和異白胺酸；以及芳族家族的苯丙胺酸、色胺酸和路胺酸。例如，可合理地期待以異白胺酸或線胺酸分離性置換白胺酸；以楚= 酸鹽置換天冬胺酸鹽；以絲胺酸置換蘇胺酸；或以構造相 42 200815474 關的胺基酸進行一胺基酸的類似置換作用將對獲得的分子不造成結合功能或性質上的影響，特別是該置換作用不涉及在骨架位置内的胺基酸時。可藉由檢測該多肽衍生物的特異活性而輕易地測定功 5能肽内的變化結果。在此處詳述其檢測方法。熟練本領域之技術者可輕易地製造該抗體或免疫球蛋白分子的片斷或類似物。片斷或類似物的較佳胺基-和鲮基-端位於靠近功能區的邊界。藉由核苷酸及/或胺基酸序列資料與公共或專屬序列資料庫的比較可鑑定其構造和功能區。較佳為利用電 10 腦化比較法鑑定存在於其他已知構造及/或功能之蛋白質的序列基序或預測蛋白質的構造功能區。已習知梦定被折疊成一已知立體構造之蛋白質序列的方法。B〇wie等人， (1991) 253 : 164。因此，熟習本技術者可按上述的說明實例辨識可被用於定義根據此處所述抗體之構造和功 15 能區的序列基序和構造構形。本發明進一步的態樣為包含與列於表1、序列表附錄、此處所述抗體中任何抗體，或與列於表8或表29中之hcdr (例如，HCDR卜HCDR2或HCDR3)的VH功能區具有至少約 60、70、80、85、90、95、98或約99%胺基酸序列一致性 20之VH功能區的一靶向結合劑或一抗體分子。該靶向結合劑或抗體分子亦可選擇性地包含與列於表1、序列表附錄、此處所述抗體中任何抗體，或與列於表9或表3〇中之LCDR (例如，LCDR卜LCDR2或LCDR3)的VL功能區具有至少約6〇、 70、80、85、90、95、98或約99%胺基酸序列一致性的vl 43 200815474 功能區。可用於計算兩種胺基酸序列之％一致性的演算法包含例如BLAST (Altschul等人（1990) ’ 协/· 5b/· 215 : 405〜410)、FASTA (Pearson和 Lipman (1988) iW必美國 85 : 2444〜2448)，或例如運用預設參數的Smith-Waterman演算法 5 (Smith和 Waterman (1981) Mo/· 147 : 195〜197)。在一些具體實施例中，共享上述胺基酸序列一致性的該靶向結合劑或抗體呈現實質上與參考抗體相同的活性。例如，該實質上相同活性包含與參考抗體的活性比較至少一活性的差異不超過約50%、40%、30%、20%、10%、5%、2%、 10 1 %或更低。

通常藉由具有由六個表面多肽環所形成稱為互補決定區（CDRs)之抗原結合介面的可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL) 免疫球蛋白功能區形成一抗原結合位置。在各VH (HCDIU、HCDR2、HCDR3)内和在各VL(LCDRJ、LCDR2、 15 LCDR3)内具有三個CDRs，以及骨架區（FRs)。通常’一 VH功能區與一 VL功能區配對以產生一抗體抗原結合位置，但是單獨的VH或LV可用於結合抗原。該Vh 功能區（例如，來自表1)可與VL功能區（例如，來自表1}配對，因而所形成的一抗體抗原結合位置包含VH*VL功能 20區。提供此處揭示之其他VH和VL功能區的類似具體實施例。在其他具體實施例中，表8或表29中的鏈被與一異源性VL功能區配對。本技術中已建立完善的輕鏈混雜。再一次，本發明提供此處揭示之其他VH和VL#能區的類似具體實施例。因此，親代或表9或表3〇之任何抗體鏈的乂11可 44 200815474 14親代或表1或其他抗體之任何抗體的配對。抗原結合位置可包含親代抗體或表1中任何抗體的一組膨或L CDRs，其在披露的-組Η及/或L CDRS内可進仃為數20、16、1〇、9或更少例如卜2、3、邮的胺基酸 5 H、、力置換冊彳除及/或插人。或者，—抗原結合位置可包含親代抗體或表1中任何抗體的-組Η及/或LCDRs，其在彼露的一組Η及/或LCDRs内可進行為數2〇、16、1〇、9或更少例如1、2、3、4或5的胺基酸置換。此類修飾可進行於該組 CDRs内的任何殘基。 10 可進行置換的較佳胺基酸為··（1)降低對蛋白質水解的敏感性；（2)降低對氧化作用的敏感性；（3)改變形成蛋白複合物的結合親和力；（4)改變結合親和力；以及(5)賦予或修飾此類類似物的其他物理化學或功能性質。類似物可包括除了天然肽序列之外的各種突變蛋白（muteins)序列。例 15如，可在天然序列内（較佳為在形成分子間接觸之多肽功能區外的部分）進行單一或多重胺基酸置換（較佳為保留胺基酸置換）。一保留胺基酸置換必需在實質上不改變其親代序列的構造上特徵(例如，一置換胺基酸必需不斷裂發生於親代序列的螺旋，或分裂定性親代序列之其他類型的次級構 20 造）。技術可辨識多肽之次級和三級構造的實例述於蛋白質、構造和分子原則（Creighton編輯，W.H· Freeman和 Company，紐約（1984));蛋白質構造簡介(C. Branden和J· Tooze編輯，Garland出版社，紐約紐約市（1991));以及 Thornton等人，354 ·· 1〇5 (1991)，將其併入於此以 45 200815474 供參照。本發明進一步的悲樣為包含與列於表1、序列表附錄或此處所述任何抗體，或與列於表8或表29中之HCDR(例如， HCDR1、HCDR2或HCDR3)的VH功能區具有至少約60、

5 70、80、85、90、95、98或約99%胺基酸序列一致性之VH 功能區的一抗體分子。

該抗體分子亦可選擇性地包含與列於表丨、序列表附錄或此處所述任何抗體，或與列於表9或表30中之LCDR(例如，LCDR1、LCDR2或LCDR3)的VL功能區具有至少約60、 10 70、80、85、90、95、98或約99%胺基酸序列一致性的VL 功能區。可用於計算兩種胺基酸序列之％一致性的演算法包含例如BLAST (Altschul等人（1990) 乂 Mo/·及W. 215 : 405〜410)、FASTA (Pearson和Lipman (1988)户遍5美國 85 ·· 2444〜2448)，或例如運用預設參數的Smith-Waterman演算法 15 (Smith和 Waterman (1981) J. Mo/.价ο/· 147 : 195〜197)。可藉由序列變化或突變以及篩選標示所欲特性之抗原的方法獲得本發明之VH和VL功能區以及CDRs，其包括說明於此處之胺基酸序列以及其可被運用於靶向劑和針對α V/3 6之抗體者。所欲特性的實例包括，但不侷限於：相對 20 已知的抗原專一性抗體增加對抗原的結合親和力；相對已知的抗原專一性抗體若已知其活性時增加對抗原活性的中和作用；在一特定莫耳比與對該抗原的一已知抗體或配體具有特異性的競爭能力；免疫沈澱複合物的能力；結合至一特異性抗原決定區的能力；利用此處所述肽結合掃描鑑 46 200815474 定線性抗原決定區如肽序列，例如利用肽在線性及/或受約束構形内進行篩檢；藉由非連續殘基形成構形抗原決定區；調節aV/5 6或下游分子之新生物活性的能力。此處亦提供此類的方法。 5 可製造此處揭示的抗體分子變異株以及將其用於本發明。接著在計量化學的引導下運用多元數據分析技術於構造/性質-活性關係(Wold等人，允學的多元歲#分务，允學的允學診量學-歲#和·絲妒學(B_ Kowalski編輯)D· Reidel出版公司，荷蘭Dordrecht市，1984)以利用習知數學技術如統計 10 迴歸、樣式辨認和分類（Norman等人，應用迴歸分析，奶/吁-/价;第三版（1998年4月）；Kandel，Abraham & Backer，Eric.桌舞分#尹的雹廢#妨#理法，Prentice Hall PTR，（1995年5 月 11 日）；Krzanowski，Wojtek，多變量分务的及理··熒居者麴，點(牛津統計科學系列22號(文件)，牛津大學 15 出版(2000年 12月）；Witten，Ian H. & Frank，Eibe 資存探# ·· 以Java截的實席满減學絜工具和技身，Morgan Kaufmann (1999年10月 11 曰）；Denison David G.T·(編輯)，Christopher C· Holmes，Bani Κ· Mallick，Adrian F.M. Smith·#·续餒分癖和遊舉的身絲#/*法(Wiley系列的或然率和統計）John Wiley 20 & Sons (2002 年 7 月）；Ghose，Arup K. & Viswanadhan，

VeWMkdiAN·組合庫設計和評估原理、軟體、工具和於新藥爾#的篇苈）定量抗體活性-性質之間的關係。該抗體的性質可衍自抗體序列、功能性和立體構造的經驗和理論模式（例如，分析可能接觸的殘基或計算其物理化學性質）以及這些 47 200815474 性質可被視為单一和組合。由一 VH功能區和一 VL功能區構成的抗體抗原結合位置一般係由六環多肽所形成：三個來自輕鏈可變功能區(VL) 及三個來自重鏈可變功能區（VH)。已知原子構造的抗體分 5析可說明抗體結合位置之序列和立體構造間的關係。這些關係思味者除了 VH功能區内的第三區（環)之外結合部位環具有小數目的主鏈構形：標準結構。該形成於一特定環内的標準結構已顯示被決定於其大小及在二者環内和在骨架區内之關鍵位置出現的某些殘基。 10 此序列-構造關係的研究可被用於預測在一已知序列之抗體内的這些殘基而非一未知的立體構造，其在使CDR 環維持立體構造而因此維持其結合專一性上極為重要。這些預測可藉由將預測與來自先導最佳化試驗的輸出資料相比較而獲得支援。在一構造性方法中，利用任何免費取得 15 或市售軟體如WAM創造該抗體分子的模型。然後利用蛋白質具象化和分析套裝軟體例如Insight II (Accelrys公司）或 Deep View以評估在CDR内各位置可能的置換。然後利用此資訊尋找對活性最小影響或最佳效應的可能置換。此技術需在胺基酸序列内進行置換，抗體VH或Vl功能 20區及/或結合劑通常可獲得自本領域。利用可或無法預測對活性具有最小影響或最佳效應的取代作用製造變異序列，以及測定結合及/或中和及/或任何其他所欲性質的活性。其序列被特別揭示於此處之任何VH和VL功能區的可變區胺基酸序列變異株可依所述被應用於本發明。 48 200815474 此處“多肽片斷”一詞指具有刪除胺基端及/或羧基端但其餘胺基酸序列與演譯自例如全長cDNA序列之天然序列内對應位置相同的一多肽。片斷通常具有至少約5、6、8或 10個胺基酸長度，較佳為至少約14個胺基酸長度，更佳為 5至少約20個胺基酸長度，其通常為至少約50個胺基酸長度’以及又更佳為具有至少約70個胺基酸長度。此處“類似物”一詞指包含至少約25個胺基酸之片斷的多肽，其與演譯胺基酸序列的一部分實質上相同以及具有至少一種下列的性質：（1)在適當的結合條件下可特異性地結合至aV卢6 ; 10 (2)阻止適當配體/a V/5 6結合的能力；或(3)抑制α VyS6活性的能力。通常，多肽類似物對天然序列而言包含一保留胺基酸置換（或添加或刪除）。類似物一般為至少2〇個胺基酸長度，較佳為至少50個胺基酸長度或更長，以及經常可長至如一全長天然多肽。 15 肽類似物通常被用於製藥工業作為具有類似模板肽 (template peptide)性質的非肽藥物。這些類型的非肽化合物被稱為擬肽或肽模擬分子”。Fauchere，义乃哪心二 15 · 29 (1986) ; Veber和 Freidinger，TmS第 392 頁（1985);以及Evans專人，J. A/W. CTzem. 30 : 1229 (1987)，將其併入於 20此以供參照。此類化合物的呈現通常借助於電腦化分子模型。構造上類似治療用肽的擬肽可被用於產生等效的治療或預防效應。通常，肽模擬分子在構造上類似一範例多肽 (即，具有生化性質或藥理活性的多肽)例如人類抗體，但具有選擇性地被選自下列群組構成之鍵藉由技術中習知方法 49 200815474 所取代的一或多個肽鍵：_CH2NH-、-CH2S…_CH2-CH2-、 -CH=CH_(順和反式）、_c〇CH2、CH(〇H)CH2 和 _CH2s〇。以相同類型的D-胺基酸(例如，D_離胺酸代替L_離胺酸）系統性地置換共有序列的一或多個胺基酸可被用於產生更穩定 5的胜肽。此外，藉由技術上習知的方法可產生包含一共有序列的X、、々束狀或貫質上相同共有序列的變異株(Riz〇和 Gierasch，d⑽队61 : 387 (1992)，併入於此以供參照）；例如，藉由加入内部半胱胺酸殘基能形成環化該多肽的分子内雙硫鍵(disulfide bridges)。 10 此處“抗體”一詞指由立體結合空間之折疊多肽鏈的至少一結合功能區所組成的一多肽或一群多肽，其形成自具有内表面形狀及與一抗原之抗原決定部位特性互補的電荷分佈。一抗體一般具有四聚體構造其包含兩對相同之各對具有一“輕”和一“重，，鏈的多肽鏈。各輕/重鏈對的可變區形 15 成一抗體結合位點。此處“靶向結合劑，，係一優先地結合至一標的位點的藥物例如抗體，或其結合片斷。在一具體實施例中，該靶向結合劑僅對一標的位點具有專一性。在其他具體實施例中，該把向結合劑對多於一個以上的標的位點具有專一 20性。在一具體實施例中，該靶向結合劑可為一單株抗體及 δ亥才示的位點可為一抗原決定部位。如下所述，一乾向纟士人劑可包含至少一抗體的抗原結合區，其中該功能區係被融合或含於一異源蛋白質内。藉由重組DNA技術或藉由完整抗體的酵素或化學切割 50 200815474 製造一抗體的“結合片斷，，。結合片斷包括Fab、Fab，、 F(ab’)2、Fv和單鏈抗體。一抗體除了“雙特異性”或“雙功能性”抗體之外各具有其相同的結合位點。當過量抗體降低結合至反受體之受體的數目至少約20%、40%、60%或80%及 5 通常大於約85%(在體外競爭性結合試驗中測定）時一抗體可實質上抑制受體至反受體(counter receptor)的黏附。一抗體可為募株抗體、多株抗體、單株抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、催化性抗體、嵌合抗體、人化抗體、純人類抗體、抗遺傳屬性 10 抗體（anti-idiotypic antibody)和可被標示於可溶或結合型的抗體以及其片斷、變異株或衍生物，其可單獨或藉由已知技術結合其他胺基酸序列。一抗體可源自任何的品種。抗體一詞亦包括本發明抗體的結合片斷；舉例性的片斷包括 Fv、Fab、Fab’、單股抗體(svFC)、二聚體化可變區（雙聯體) 15 以及雙硫鍵穩定可變區（dsFv)。已顯示全抗體的片斷可執行結合抗原的功能。結合片斷的實例為⑴由VL、VH和CH1功能區所組成的Fab片斷 (Ward，E.S·等人（1989) 341 : 544〜546) ; (ii)由 VH和 CH1功能區所組成的Fd片斷(McCafferty等人（1990) Λ^ίι/re， 20 348: 552〜554); (iii)由單一抗體之VL和VH功能區所組成的

Fv 片斷（Holt 等人（2003) 21 : 484〜490) ; (iv)由VH或VL功能區所組成的dAb片斷(Ward， E.S·等人，TVa/wre，341 : 544〜546(1989) ; McCafferty 等人 (1990) TVaiwre 348 : 552〜554 ; Holt 等人（2003) 7>別办 /w 51 200815474 21 : 484〜490) ; (v)分離的CDR區；（vi) F(ab’)2 片斷，包含兩個鏈接Fab片斷的雙價片斷；（vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH和VL功能區為藉由肽連接子相連接而容許該兩個功能區聯合形成一抗原結合位點（Bird等人（1988) 5 242 : 423〜426 ; Huston等人（1988) /WdS美國 85 : 5879〜5883) ; (viii)雙特異性單鏈 Fv 雙體（PCT/US92/ 09965);以及(ix)由基因融合所構建的“雙聯體”、多價或多特異性片斷（WO94/13804 ; Holliger，P· (1993)等人，尸π 7VW/· dcW· 美國90 6444〜6448)。可藉由併入連接VH和 10 VL功能區的雙硫鍵而穩定化Fv、scFv或雙聯體分子(Reiter， Υ·等人，施14 : 1239〜1245 (1996))。亦可製造微型抗體(minibodies)其包含連接至CH3功能區的scFv (Hu， S·等人（1996) Cawcer 56 : 3055〜3061)。結合片斷的其他實例為Fab’，其不同於Fab片斷在於在重鏈CH1功能區的 15羧基端加入少數殘基，包括來自抗體絞鏈區的一或多個半胱胺酸；以及Fab’-SH，其為恒定區的半胱胺酸殘基具有一游離硫醇基的Fab’片斷。 “抗原決定部位（epitope)”一詞包括能特異性地結合至 -免疫球蛋白或τ·細胞受體的任何蛋白f決定族。抗原決 2〇疋族通常由分子的化學活性表面簇所組成例如胺基酸或糖側鏈及可但非經常具有專-性立體構造特性以及專一性電荷特性。當一抗體的解離常數y微克分子時視為可特異性地結合-抗原，較佳為$100奈克分以及最佳為奈克分0 52 200815474 此處某h彳一㈣指一化合物、化合物的混合物、生物學巨分子，或從生物材料萃取的物質。有關α V石6異源雙體多肽的“活性，，或“活性度，，指一部分的α V沒6異源雙體多狀具有原始ανβ6多肽的生物或免 5疫活性。此處當使用“生物學上，，一詞時指導因於原始Μ点6 夕狀之活性的生物學功能。較佳的石6生物學活性包括例如α V石6誘發的細胞黏附。此處哺礼動物”指任何可被視為哺乳類的動物。較佳的哺乳動物為人類。 10 15

人以酵素、木瓜酵素消化抗體可產生兩種相同的抗原結 ::斷，亦稱為“Fab”片斷；以及一“Fc”片斷為不具有抗原、:口石活性但具有結晶的能力。以酵素、胃蛋白酶消化抗體 σ產生F(ab )2片斷，其抗體分子的雙臂仍相連接及包含兩個抗原結合位置。該F(ab，)2片斷具有交聯抗原的能力。此處“Fv”指抗體的最小片斷，其保留抗原辨識和抗原結合位置。此處Fab”指包含輕鏈之恒定區及重鏈之CH1功能區的一抗體片斷。 “mAb”一詞指單株抗體。此處“脂質體，，指可被用於輸送藥物的一小囊胞，其包括本發明的aV/56多肽或針對一哺乳動物之aV/96多肽的抗體。此處“標記，，或“標示，，指將可偵測基團加至一多肽，例如放射性標記、螢光標記、酵素性標記、化學發光標示或 53 200815474 生物素標記。放射性同位素或'放射性核素包括3H、l4e、15N、 4、％、，、％、％、％;螢光標記包括羅丹明 (rhodamine)、鑭系磷或F1TC ;以及酵素性標記包括辣根過氧化酶、万-半乳糖苦酶、螢光素酶(luciferase)、驗性碟酉免 5 酶。藉由說明其他標記包括，但不侷限於：酵素例如葡萄糖-6-磷酸去氫酶(G6PDH)、a-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖殿粉酶、碳酸酐酶、乙醯膽鹼酯酶、溶菌酶、蘋果酸酯脫氫酶和過氧化酶；染料；其他螢光標記或榮光 10 劑包括例如勞光素（fluorescein)和其衍生物、螢光染料、 GFP(GFP指”綠色螢光蛋白質”）、丹石黃醯(danSyi)、傘形花内酉旨（umbelliferone)、藻紅蛋白（phycoerythrin)、藻藍素 (phycocyanin)、別藻藍素(allophycocyanin)、鄰酞盤和螢胺 (fluorescamine);螢光體（fluorophores)例如鑭系穴合物和螯 15 合物例如銪（Europium)等（perkin Elmer 和 Cis Biointernational);化學發光標記或化學發光劑例如異魯米諾（isoluminol)、魯米諾（luminol)和二氧烷酮（dioxetanes); 敏化劑；輔酶；酶作用物；顆粒如乳膠或碳粒；金屬溶膠；微晶（crystallite);脂質體；細胞等；其可為進一步標示染 20料、催化劑或其他可偵測基團；分子例如生物素、毛地黃配體(digoxygenin)或5漠化去氧尿核；毒素基團舉例如選自一群假單胞菌外毒素(綠膿桿菌外毒素(PE)或細胞毒素片斷或其突變株）、白喉毒素或細胞毒素片斷或其突變株、肉毒才干卤毋素A、B、C、D、E或F、崑麻毒素(ricin)或其細胞毒 54 200815474 素片斷例如蓖麻毒素A、相思豆毒素(abrin)或其細胞毒素片斷、皂草毒素（saporin)或其細胞毒素片斷、美洲商陸 (pokeweed)抗病毒毒素或其細胞毒素片斷以及瀉根毒素 l(bryodinl)或其細胞毒素片斷的毒素基團。 5 此處“藥劑或藥物”一詞指當適當投與至一病人時可誘發一所欲治療效應的一化合物或組成物。此處使用的其他化學名詞係根據技術中習知的用法，其說明於McGraw-Hill 化學名詞字典（Parker，S.編輯，McGraw-Hill,舊金山 (1985)，將其併入於此以供參照）。 10 此處“實質純”指標的物種係存在的優勢品種（即，在莫耳基礎上較組成物内任何其他個別品種更豐富），以及實質上純化比例較佳為其標的物種包含全部存在巨分子品種之至少約50 />(在莫耳基礎上）的組成物。通常，實質上純組成物將包含多於約80%之組成物内的全部巨分子品種，更佳 15為多於約85%、90%和。該標的物種最佳為被純化至基本上均質的程度（藉由習知的偵測方法無法偵測出在組成物内污染的品種），其中該組成物基本上由單一巨分子品種所構成。 “病人”一詞包括人類和獸醫生物體。 20 人類抗艎及抗髏的人化人類抗體可避免與具有小白鼠或大鼠可變及/或恒定區之抗體有關的一些問題。出現此類小白鼠或大鼠衍生蛋白將導致該抗體迅速被清除或導致病人對抗該抗體所產生的免疫反應。為避免使用小白鼠或大鼠衍生抗體，可藉由 55 200815474 引入功能性人類抗體基因座至一嚙齒動物、其他哺乳類或動物而使該嚙齒動物、其他哺乳類或動物產生純人類抗體。一種產生純人類抗體的方法為利用基因工程所產生的小白鼠XenoMouse®株，其含有高至但小於lOOOkb大小之人 5 類重鏈基因座和kappa輕鏈基因座的種系配置片斷。請參考

Mendez等人，Nature Genetics, 15 : 146〜156 (1997)及Green 和 Jakobovits，J·五冲· 188 : 483〜495 (1998)。該

XenoMouse®株可獲得自Amgen公司（加州Fremont市）。小白鼠XenoMouse®株的製造進一步討論和說明於 10 1990年1月12日提出的美國專利序號〇7/466,008、1990年11 月8日提出的07/610,515、1992年7月24日提出的 07/919,297、1992年7月 30 日提出的07/922,649、1993年3月 15日提出的08/031,801、1993年8月27日提出的08/ 112,848、1994年4月 28 日提出的08/234,145、1995年 1 月 20 15 日提出的08/376,279、1995年4月 27 日提出的08/ 430,938、 1995年6月5日提出的08/464,584、1995年6月5日提出的 08/464,582、1995年6月 5 日提出的08/ 463，19卜 1995年6月 5 日提出的08/462,837、1995年6月 5 日提出的08/486,853、1995 年6月5曰提出的08/ 486,857、1995年6月5曰提出的 20 08/486,859、1995年6月 5 日提出的08/462,513、1996年 10月 2 日提出的08/724,752、1996年12月3日提出的08/759,620、 2001年11月30日提出的美國專利公開案2003/0093820和美國專利案 6，162,963、6，150,584、6，114,598、6,075，181 和 5,939,598以及日本專利案3 068 180 B2、3 068 506 B2和3 56 200815474 068 507 B2。亦請參考公告於1996年6月12日的歐洲專利案 EP 0 463 151 B1、公告於1994年2月3日的國際專利申請案 WO 94/02602、公告於1996年10月31日的國際專利申請案 WO 96/34096、公告於 1998年6月 11 日的WO 98/24893、公 5告於2000年12月21日的w〇 00/76310。在此將上述分別彼露的專利、申請案和參考資料併入於此以供參照。在其他的另類方法中，包括GenPharm國際公司所運用的“微小基因座”技術。在微小基因座技術中，透過包合來自該Ig基因座的片段(個別基因）模擬一外源性Ig基因座。因 10 此，在插入動物的構體内可形成一或多個vH基因、一或多個DH基因、一或多個JH基因、一mu恒定區，以及第二恒定區（較佳為一 T恒定區）。此方法述於授予Surani等人的美國專利案5,545,807，以及美國專利案5,545,806、5,625,825、 5,625，126、5,633,425、5,661，016、5,770,429、5,789,650、 15 5,814,318、5,877,397、5,874,299 以及分別授予 Lonberg 和 Kay 的6,255,458、授予Krimpenfort和Berns的美國專利案 5,591，669和6,023,010、授予Berns等人的美國專利案 5,612,205、5,721，367和5,789,215 ’ 以及授予Choi和Dunn的美國專利案5,643,763，以及1990年8月29日提出的 2〇 GenPharm國際美國專利申請序號07/574,748、1990年8月31 日提出的07/575,962、1991年12月17日提出的07/810,279、 1992年3月18日提出的07/853,408、1992年6月23日提出的 07/904,068、1992年 12月 16 日提出的〇7/990,860、1993年4 月26日提出的08/053,131、1993年7月22日提出的 57 200815474 08/096,762、1993年 11 月 18 日提出的08/155,301、1993年 12 月3曰提出的〇8/161，739、1993年12月10曰提出的 08/165,699、1994年3月9日提出的08/209,741，將其併入於此以供參照。亦請參考歐洲專利案0 546 073 B卜國際專利 5 申請案WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、 WO 96/14436、WO 97/13852，及WO 98/24884和美國專利案5,981，175，將其完整併入於此以供參照。進一步請參考 Taylor等人，1992、Chen等人，1993、Tuaillon等人，1993、 10 Choi等人，1993、Lonberg等人，1994、Taylor等人，1994和 Tuaillon等人，1995、Fishwild等人，1996，將其揭示完整併入於此以供參照。

Kirin亦已證明可從小白鼠產生人類抗體其係經由已被引入之大片段染色體或全部染色體的微細胞融合法。請參 15 考歐洲專利申請案773 288和843 961，將其併入於此以供參照。此外，已可產生1^1*丨11’8 1^小白鼠與]\/^(13代\’8微小基因座(Humab)小白鼠雜交育種的KMTM-小白鼠。這些小白鼠具有Kirin小白鼠的人類IgH轉殖染色體以及Genpharm小白鼠的kappa鏈轉殖基因（Ishida等人，CVo/nVzgASVem CW/s，（2002) 20 4 : 91〜102)。藉由體外的方法亦可產生人類抗體。適當的實例包括但不侷限於嗤菌體展示技術（CAT、Morphosys、Dyax、 Biosite/Medarex、Xoma、Symphogen、Alexion(先前稱為 Proliferon)、Affimed);核糖體展示技術（CAT);酵母展示 58 200815474 技術等。抗醴的製備透過利用下述XenoMouse®技術製造下列所述的抗體。然後此類小白鼠能產生人類免疫球蛋白分子和抗體以 5 及不產生鼠免疫球蛋白分子和抗體。其所使用的技術披露於此處發明之背景内所述的專利、申請案和參考文獻中。然而，更明確而言，製造小白鼠轉殖基因及抗體的較佳具體實施例係揭示於1996年12月3日提出的美國專利申請序號08/759,620和公告於1998年6月11日的國際專利申請案 10 WO 98/24893以及公告於2000年12月21日的WO 00/76310，將其揭示併入於此以供參照。亦請參考Mendez 等人，Gw扣·α，15 : 146〜156 (1997)，將其揭示併入於此以供參照。經由利用此類的技術，可製造出對抗各種抗原的純人 15 類單株抗體。基本上，從高度免疫小白鼠收集接種標的抗原（例如’ α V冷6)、淋巴細胞（例如Β-細胞）之小白鼠的 XenoMouse®株，以及將該收獲的淋巴細胞與骨髓樣細胞株相融合以製造永生化雜交瘤細胞株。篩檢和選取這些雜交瘤細胞株以鑑定可產生標的抗原專一性抗體的雜交瘤細胞 20 株。此處所提供用於產生多重雜交瘤細胞株的方法可製造 aV/S6專一性抗體。再者，此處提供定性該細胞株所產生之抗體的方法，其包括此類抗體之重鏈和輕鏈的核苷酸及胺基酸序列分析。或者，可直接檢測B細胞以代替融合至骨髓瘤細胞所產生的雜交瘤。例如，可從高度免疫心⑽ 59 200815474

Mouse⑧小白鼠分離CD 19+B細胞然後使其增生和分化成抗體分泌漿細胞。藉由ELISA篩檢來自細胞上清液之抗體對抗該ανθ 6免疫原的活性。亦可利用上清液篩檢對抗αν冷6 片斷的免疫活性以進一步映射該不同抗體結合至aV/3 6上 5的標的功能區。該抗體亦可針對其他相關人類整合素及對抗大鼠、小白鼠和非人類靈長類如Cynomolgus猴、直系同源α V A 6進行篩檢’最後測定品種的交叉反應性。來自含標的抗體之孔的B細胞可藉由各種方法被永生化，包括從個別或混合孔融合製造雜交瘤，或藉由EBV的感染或藉由已 10 知永生化基因的轉染然後植入適當的培養基内。或者，利用aV/3 6-特異性溶血斑試驗分離具有所欲專一性的單一漿細胞分泌抗體(請參考例如Babcook等人，Ρη Λ^ί/. &/·美鐵93 ·· 7843〜48 (1996))。以溶血為目標的細胞較佳為包覆a V/S6抗原的羊紅血球細胞（srbCs)。 15 存在B-細胞的含漿細胞培養基分泌目標免疫球蛋白和補體，所形成溶血斑表示目標漿細胞周圍之羊紅血球細胞的特異性aV万6-介導性溶血。從該單一漿細胞分離溶血斑中央的單一特異性漿細胞。利用PCR之後的反轉錄作用 (RT-PCR)，可選殖出編碼抗體之重鏈和輕鏈可變區的 20 DNA。此類選殖DNA可然後被進一步插入一適當的表現載體’較佳為一載體盒(vect〇r cassette)例如一pcDNA，更佳為例如含有免疫球蛋白重鏈和輕鏈之恒定區的pcDNA載體。然後可將該產生的載體導入宿主細胞例如HEK293細胞、CHO細胞然後培養於經適當修飾的習知營養培養基内 200815474 ㈣發轉錄作用、選擇轉形株或擴增該編碼所欲序列的基通4，藉由該融合雜交瘤所製造的抗體為具有純人; kappa^ambda輕鏈的人類收2重鏈。此處所述抗體具有類 5類1扣4重鏈以及1仰重鏈。抗體亦可為其他的人類同^ 型，包括_。該抗體具有高親和力，當藉由固相和液相技術測定時一般具有從約1〇.6至約10-12克分子

Kd。抑制aVM活性的抗體較佳為具有至少1〇•"克分的 Kd。 ^ 1〇冑如所瞭解，抗體可被表現於除了雜交瘤細胞株之外的細胞株。編碼特定抗體的序列可被用於轉化一適合哺乳類宿主細胞。轉化作用可藉由將多核苷酸導入一宿主細胞的任何習知方法包括例如將該多核苷酸包裹於一病毒内 (或病毒載體内）及以該病毒（或載體）轉導一宿主細胞或藉 15由技術中已知的轉染方法，其舉例說明於美國專利案號 4,399,216、4,912,040、4,740,461 和4,959,455(將這些專利併入於此以供參照）。所使用的轉形方法視該被轉形的宿主而疋。將異源性多核苷酸導入哺乳動物細胞的方法已為技術中所習知以及包括葡聚醣介導轉染法、磷酸鈣沈澱法、聚 20凝胺介導轉染法、原生質體融合技術、電穿孔法、將多核苷酸包裹於脂質體内，以及將DNA直接微注射入細胞核内。可用於表現作為宿主的哺乳類細胞株已為技術中所習知以及包括許多供應自美國標準菌種中心(ATCC)的永生化細胞株，其包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、幼 200815474 倉鼠腎(ΒΗκ)細胞、猴腎細胞(COS)、人類肝細胞癌知跑(例如，Hep G2)、人類上皮腎293細胞，以及其他許多的細跑株。經由測定何者為具固有aV々6結合性質之鬲度表j見細胞株選擇特定的參考細胞株。 5 根據mAbs明顯中和aV冷6活性的能力（說明於下塊實例）這些抗體將具有治療導因於α V万6表現之症狀和病症的效應。在特定的具體實施例中，此處所述的抗體和方法係關於治療導因ο: V /5 6誘發細胞黏附或因"ί§號誘導avb6鱼其配體相互作用所造成的症狀。 10 根據本發明的另一態樣提供一種包含具有a V/5 6生物活性拮抗劑及醫藥上可接受載體的醫藥組成物。在一具體實施例中該拮抗劑包含一抗體。根據本發明的另一態樣提供一種包含具有aV;36生物活性拮抗劑及醫藥上可接受載體的醫藥組成物。在一具體實施例中該拮抗劑包含一抗體。 15 抗抗體可被用於偵測病人樣本内的aVyj6，因此可被用於診斷此處所述的疾病狀態。此外，根據其明顯抑制aV/S6活性的能力（說明於下述實例），抗_^乂06抗體具有治療導因於aVy56表現之症狀和病症的效應。在特定的具體實施例中，此處所述的抗體和方法係關於治療導 2〇因於aVM誘發細胞黏附的症狀。進一步具體實施例為利用此處所述抗體和方法於治療病或病症包括腫瘤疾病如黑色素瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膠質細胞瘤、肝細胞(肝)癌、甲狀腺瘤、胃腺（胃）癌、前列腺癌、乳癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、神經膠質母細胞瘤、子宮 62 200815474 内膜癌、腎癌、結腸癌，及姨腺癌。治療性給藥及配方

本發明之具體實施例包括有效用於治療疾病之抗抗體的滅菌醫藥配方。此類配方可抑制配體結合至aV^6 5整合素，因而可有效治療例如組織aV/36異常升高的病理狀態。抗-a V石6抗體較佳為具有抑制aVyS 6活性的適當親和力，以及較佳為對人類具有適當的作用期間而不需進行經常性的給藥。較長的作用時間將可減少給藥頻率以及可藉由改變成腸道外如皮下或肌肉注射途徑而可更方便於給 10 藥。、口 15 20 在冷来乾燥之前及抗體重構之後可藉由例如通過滅菌遽膜的過雜造其朗配方。該抗體_般以冷錢燥或溶液的形式_存。絲性抗肢成物財被置於具^滅：存取口的例如具有可取得該配方之銜接頭如二穿刺皮下注射針頭之塞子的靜脈注射溶液袋或玻璃瓶。抗體的投與途徑係根據已知的方法，例如藉由靜脈、主射或輸注、腹腔内、腦池内、肌肉内、眼内、動脈内、椎鞘内、吸人或航内的途徑、直接注人腫瘤部位下述的緩釋系統。該抗體較佳 /曰性地給藥。為精由輸錢_注射持續用於治療之抗體的有效量視例如治療目標、給藥途徑和病人的狀況而定。因此，户 ’、’、：調整其給藥途徑以達到最二二為滴定和視需要將投與抗體直至達到可產生所欲效應的劑量時為止床= 63 200815474 習知或此處所述的檢測法可輕易地監控治療的進展。可製備與醫藥上可接受載劑之混合物的此處所述抗體。此治療組成物可經由靜脈或鼻内或肺内被投與，其較佳為被製成液體或粉末噴霧劑（冷凍乾燥）。該組成物需要時 5亦可經由腸道外或皮下被給藥。當用於全身性給藥時，該治療組成物必需經過滅菌、無熱原化及置於適當？11、等張和具有穩定性的腸道外可接受溶液内。簡言之，藉由混合醫藥可接受載劑、賦形劑或穩定劑之具有所欲純度的化合物製備此處所述用於儲存或給藥的化合物劑量配方。此類 10材料在使用劑量和濃度之下對接受者不具有毒性，以及包括緩衝液如TRIS鹽酸鹽、磷酸鹽、草酸鹽、醋酸鹽及其他有機酸鹽；抗氧化劑如抗壞血酸；低分子量（低於約1〇個殘基)肽如聚精胺酸；蛋白質如血清白蛋白、凝膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸如甘胺酸、 15麩胺酸、天冬胺酸或精胺酸；單糖、雙糖和其他碳水化合物包括纖維素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA ;糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；反離子如鈉及/ 或非離子表面活性劑如TWEEN、PLURONICS或聚乙二醇。可根據習知的藥學實務配製用於注射的滅菌組成物如 20述於雷明登：藥理科學和實務（第2〇版，Lippinc〇tt糧丨咖 & Wikens出版社(2〇〇3))。例如，將活性化合物溶解或懸浮於邊藥可接文載劑内較佳為例如水或天然植物油如芝麻油、花生油或棉籽油或合成脂肪載劑如油酸乙酯或其他類似物。根據可接受的藥學實務可併入緩衝劑、防腐劑、抗 64 200815474 氧化劑等。緩釋製劑的適當實例包括含該多肽之固態疏水性聚合物的半透性基質，該基質被製成形成物件、薄膜或微膠囊。緩釋基質的實例包括聚酯；水凝膠(例如，聚(2-羥乙基丙烯 5 酸甲 S旨）如述於Langer等人，(1981) • 15 : 167〜277和 Langer，CAem· (1982) 12 : 98〜105，或聚（乙烯醇)）；聚丙交酯（美國專利案3,773,919、EP 58,481); L-麩胺酸和r -L-麩胺酸乙酯的共聚物（Sidman等人， f 奶，（1983) 22 : 547〜556);不可崩解乙稀醋酸乙 10 烯(Langer等人，如上述）；可崩解乳酸-乙醇酸共聚物例如 LUPRON Depot™(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林所組成的可注射微球）’以及聚-D-(-)-3 -羥基丁酸（EP 133,988) 〇例如乙烯-S皆酸乙烯和乳酸-乙醇酸之聚合物雖然緩釋 15出分子的時間可達100天，但是某些水凝膠亦可在較短時間 _ 釋出蛋白質。當包囊蛋白質長期停留於體内時，其在暴露於潮濕的37〇c下會變質或凝聚而喪失生物活性及可能改變其免疫原性。視其涉及的作用機制可擬訂出穩定蛋白質的合理策略。例如，若該凝集機制係形成經由雙硫鍵互換的 20分子間s_s鍵時，則藉由修飾氫硫鍵殘基、冷凍乾燥自酸性

溶液、控制濕度、利用適當的添加劑，以及形成特殊聚合物基質組成物可達到穩定化的目的。 D 本發明之抗體亦涵蓋在哺乳動物較佳為人類體内大於未修飾抗體之具有半衰期(例如，金清半衰期）的抗體。在二 65 200815474 具體實施例中，該抗體的半衰期係大於15天、大於20天、大於25天、大於30天、大於35天、大於40天、大於45天、大於2個月、大於3個月、大於4個月，或大於5個月。延長本發明抗體或其片斷在哺乳動物較佳為人類體内的半衰期 5可使該抗體或抗體片斷在哺乳動物體内產生較高的血清力價而因此減少該抗體或抗體片斷的投藥頻率及/或降低準備給藥之抗體或抗體片斷的濃度。可增加抗體或其片斷在體内半衰期的方法已為熟習本技術之人士所習知。例如，藉由修飾（例如，取代、刪除或添加）與!^功能區和17(^11受 1〇體間相互作用的胺基酸殘基可延長抗體或其片斷在體内的半衰期（請看例如國際專利公開案WO 97/34631和WO 02/060919，將其併入於此以供參照藉由將該抗體或抗體片斷附著至聚合物分子如高分子量聚乙烯醇(pEG)可延長抗體或其片斷在體内的半衰期。透過位置的特異性或經由 15存在於離胺酸殘基上的卜胺基可將pEG共拖至該抗體或抗體片斷的N-或C-端而可將PEG附著至有或無多功能鍵的抗體或抗體片斷。利用可導致生物活性最少損失的直鍵或支鍵聚合物衍生技術。II由⑽心卿口質譜④監控其共概的程度以確保PEG分子與抗體之間達到適當的共輛度。藉由 2〇例如體積排阻色譜法或離子交換色譜法可從抗體_peg共辆物中分離出未反應的PEG。緩釋組成物亦包括懸浮於適當配方内能維持結晶懸浮液之抗體的結晶製劑。這些製劑在皮下或腹腔内注射之後可產生緩釋的效果。其他的組成物亦包括脂質體包覆抗 66 200815474 體。藉由已知的方法製備含有此類抗體的脂質體：美國專利案 DE 3,218，121，Epstein等人，/Voc· jcad *SW.與琢 (1985) 82 : 3688〜3692 ; Hwang等人，/Voc· AW/· 5W· 4 鏢（1980) 77 : 4030〜4034 ; EP 52,322 ; EP 36,676 ; EP 5 88,046 ; EP 143,949 ; 142,641 ;日本專利中請案83-118008 ; 美國專利案4,485,045和4,544,545 ;以及EP 102,324。用於一已知病人的抗體劑量將決定於醫生對各種因素的考慮而定’其包括疾病的嚴重度和類型、體重、性別、飲食、時間和給藥途徑、其他藥物及其他相關的臨床因素。 10 治療有效劑量的測定可藉由體外或體内的方法。此處所述用於治療之抗體的有效劑量將視例如治療目標、給樂迷径和病人的狀況而定。因此，治療學家較佳為滴定和視需要調整其給藥途徑以達到最佳的治療效果。一典型的每日劑量視上述的因素可從約〇〇〇1毫克/公斤高至 15 毫克/公斤或以上。通常，臨床醫生將投與該治療性抗體直至達到所欲效果的劑量為止。藉由習知的檢測法或此處所述方法可輕易地監控此治療的進展。應瞭解根據本發明之治療方法投與的組成物和方法將共同投與適當的載劑、賦形劑及其他可併入配方内以改善 20傳遞、輸送、耐受性等的物質。這些配方包括例如粉末、藥膏、軟膏、凝膠、蠟、油、脂質、含脂質（陽離子或陰離子）的載劑（例如Lip〇fectinTM)、DNA共軛物、無水吸附藥膏、水包油和油包水乳劑、乳化硬脂酸(各種分子量的聚乙二醇）、半固體凝膠，以及含硬脂酸的半固體混合物。若該 67 200815474 配方内的活性成分不被配方不活化以及該配方在生理上具有相容性和可忍受該給藥途徑時，任何上述的混合物均適合用於處理及根據本發明的治療。亦請參考Baidrick P. “醫藥賦形劑的發展：臨床前指導的需要性”，•⑺，. 5 尸Aar麗co/_ 32(2)·· 210〜8(2000); Wang W· “固體蛋白藥劑的冷凍乾燥和發展”，/价j. Phw 203(1〜2) : 1〜60(2000); Charman WN，“脂質、親脂藥物和口服藥物的輸送—一些浮現的觀念”，/· P/mrm· 5W. 89(8) : 967〜78(2000) ; Powell等人，“非經口配方的賦形劑綱要”，乂尸幼隱似 10 ⑽/· 52 : 238〜311(1998)及其所引述藥物化學家已知之有關配方、賦形劑和載劑的資料。其他治療劑的設計和基砝根據本發明及對於αν^56所製造和定性的抗體活性，可輕易地設計出除抗體基團之外的治療方式。此類模式包 15括，但不侷限於進階抗體療法例如雙特異性抗體、免疫毒素和放射線標示療法、單功能區抗體、產生胜肽療法、新月架内的α V /3 6結合功能區、基因療法、細胞内抗體、反義核酸療法，及小分子。關於以補體結合為預期屬性的進階抗體療法，其可藉 20由使用雙特異性抗體、免疫毒素或放射線標示物而不需依賴補體殺死細胞。可產生雙特異性抗體其包含：⑴其一對^；^^万6及另一對相共軛的第二分子具有專一性的兩種抗體；（ii)其一鏈對 aV/3 6具有專一性及第二鏈對第二分子具有專一性的單一 200815474 抗體；或(iii)對α V冷6及另一分子具有專一性的單鏈抗體。可利用習知的技術產生此類雙特異性抗體；例如關於 ⑴和（ii)請看例如Fanger等人，/仍所w⑽/·心，4 : 72〜81 (1994)和Wright和Harris，如上述，以及關於（iii)請看例如 5 Traunecker等人，/狀 /· Cancer (補充文件）7 : 51〜52 (1992)。在各例中，該第二專一性可被製成重鏈活化受體包括，但不偈限於CD16或CD64 (請看例如Deo等人，/mmw加/. 7b(^y， 18 : 127 (1997))或CD89 (請看例如Valerius等人，5/〇〇ί/，90 : 4485〜4492 (1997))。 10 關於免疫毒素，可利用習知的技術可將抗體修飾成具有免疫毒素的作用。請參考例如Vitetta，/mmw⑽/. 7^#， 14 : 252 (1993)。亦請參考美國專利案5，194,594。關於製備放射線標示抗體，利用習知的技術亦可輕易地製備此類經修飾的抗體。請參考例如Junghans等人，癌症必療和兰#療 15 法，655〜686 (第二版，Chafner和 Longo編輯， (1996)) ◦亦請參考美國專利案4,681，58卜4,735,210、 5，101，827、5，102,990 (RE 35,500)、5,648,471 和5,697,902。藉由非抗體蛋白骨架上如纖連蛋白或細胞色素B等之 CDRs的配置可產生一抗原結合位置(Haan & Maggos (2004) 20 12(5) : A1 〜A6 ; Koide等人，（1998) J⑽rwa/ 〇/ 叹y，284 : 1141 〜1151 ; Nygren等人（1997)褚祷兰#學的麂疗彦名，7 : 463〜469)或藉由在一蛋白骨架内一環的隨機或突變胺基酸殘基授予一所欲標的的結合專一性。蛋白質内新穎結合位置之基因工程的骨架詳述於 69 200815474

Nygren等人(Nygren等人（1997)、结褚學的禮疗意名，7 : 463〜469)。擬抗體的蛋白質骨架彼露於w〇/〇〇34784，將其完整併入於此以供參照，發明者於其中描述含具有至少_ 隨機環之第III型纖黏蛋白功能區的蛋白質（擬抗體）。在—適 5 合骨架内免疫球蛋白基因超家族成員的任何功能區可進行一或多個CDRs如一組HCDRs的移植。該骨架可為人類或非人類蛋白。非抗體蛋白骨架的優點為在比至少一些抗體分子較小及/或較易製造的骨架分子内可提供一抗原的結合位置。小體積的結合劑可賦予有用的生理性質，例如進人 10 細胞的能力、穿透入深層組織或到達其他構造内的標的物，在標的抗原的蛋白穴内進行結合。使用抗原結合位置於非抗體蛋白骨架已詳述於Wess，2004 (Wess，L.於： BioBusiness中的Bernstein報告，12(42): A1 〜A7 2004)。具有穩定主鏈及一或多個可變環的蛋白質通常其環 15 的胺基酸序列可專一性地或隨機地突變成可結合該標的抗原的抗原結合位置。此類蛋白質包括蛋白A的IgG-結合功能區其來自金黃色葡萄球菌、運鐵蛋白、白蛋白、胞漿素原結合蛋白（tetranectin)、纖黏蛋白（第10纖黏蛋白第ΙΠ型功能區）、脂籠蛋白（lipocalins)以及7 -結晶和其他AffilinTM骨架 20 (Scil蛋白）。其他方法的實例包括合成以環狀多肽為基礎的微粒體(microbodies)—具有分子内雙硫鍵的小型蛋白質、微蛋白（microproteins) (Versabodies™，Amunix)以及錯蛋白重複序列蛋白（DARPins，Molecular Partners) 〇除了抗體序列及/或一抗原結合位置之外，根據本發明 70 200815474 的結合劑可包含形成肽或多肽的其他胺基酸例如_折疊功能區’或賦予該分子除了抗原結合能力之外的另_功能特性。本發明的結合劑可攜帶一可偵測標記，或可被共軛至毋素或一乾向基團或酵素(例如，經由肽基或鍵合物）。例 5如，—結合劑可包含一催化部位(例如，在一酵素功能區内）以及抗原結合位置，其中該抗原結合位置係結合至抗原而因此瞄準抗原的催化部位。該催化部位可藉由例如酵解而抑制該抗原的生物性功能。 10 此處定義之抗腫瘤療法可被用於單一治療法或除了本發明化合物之外配合習知的外科手術或放射線療法或化療法。此類化療法可包括一或多種下類的抗腫瘤劑： (1)其他用於腫瘤醫學的抗增生/抗腫瘤藥物及其組合例如烷化劑（例如順鉑、奥沙利鉑、卡鉑、環磷醯胺、氮 I5 介美法兩（melphalan)、本丁酸氮芬、白消安(busuiphan)、替莫唑胺(temozolamide)和亞硝基脲）；抗代謝劑（例如吉西他賓（gemdtabine)和抗葉酸鹽如氟嘧啶類如5_氟尿嘧啶和替加氟(tegafur)、雷替曲塞(raltitrexed)、甲胺蝶呤、阿糖胞 0密°定以及沒基脲）；抗腫瘤抗生素(例如，蒽環黴素類如小紅 2〇莓、博萊黴素、多柔比星、柔紅比星、表柔比星、伊達比星、絲裂黴素C、放線黴素和光輝黴素）；抗有絲分裂劑(例如，長春花生物驗如長春新鹼、長春花鹼、長春地辛 (vindesine)和長春瑞賓（vinorelbine)以及紫杉醇類化合物如紫杉醇和多西紫杉醇和P〇l〇kinase抑制劑）；以及拓樸異構酶 71 200815474 抑制劑（例如表鬼臼毒素類如依託泊苷（et〇p〇side)和替尼泊苷(teniposide)、胺吖啶、托普替康(t〇P〇tecan)和喜樹鹼）； (ii) 細胞抑制劑例如抗雌激素（例如，他莫昔芬 (tamoxifen)、法洛德（fulvestrant)、托瑞米芬（toremifene)、 5 雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬（droloxifene)和桃醯昔芬 (iodoxyfene));抗雄激素（例如，比卡魯胺(bicalutamide)、氟卡胺（flutamide)、尼魯米特（nilutamide)和醋酸環丙孕酮）；LHRH拮抗劑或LHRH激動劑（例如，戈舍瑞林 (goserelin)、亮丙瑞林(leuprorelin)和布舍瑞林(buserelin)); 10 黃體激素(例如，醋酸甲地孕酮）；芳香環轉化酶抑制劑（例如，阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(letrozole)、三唑化合物 (vorazole)和依西美坦(exemestane)以及5 α -還原酶抑制劑例如非那雄胺(finasteride); (iii) 抗侵入劑（例如，c-Src激酶家族類如4_(6-氯_2,3_ 15亞甲基二氧苯胺基)_742-(4_甲基哌啡_1-基）乙氧基]-5-四氫吼喃-4-基經喧唾琳（AZD0530 ;國際專利申請案w〇 01/94341)和翏(2-氯-6-甲苯基）_2·{6_[4_(2_羥乙基）哌畊-^ 基]-2-甲基嘧啶-4-基胺基}噻唑_5_甲醯胺（達沙替尼 (dasatinib), BMS-354825 ； J. Med. Chem., 2004, 47 : 2〇 6658〜6661))，及金屬蛋白酶抑制劑如馬立馬司他 (marimastat);尿_型纖溶酶紐受體功能或肝體的抑制劑）； ^ ^ (iV)生長因子抑制劑：舉例的抑制劑實例包括生長因子抗體和生長因子受體抗體（例如抗·她職體妥珠單抗 72 200815474 (tmstuzumab [Herceptin，' 抗 _EGFR 抗體帕尼單抗 (panitumumab)、抗-EGFR抑制劑貝伐單抗（bevadzumab) (Ava—™)、抗_erbBl抗體西妥昔單抗(cetuximab) 0225]和任何生長因子或生長因子受體抗體其揭示於 5等人，廑瘤學/j&;^學檢說截告，2005,第54卷第11〜29頁））；此類抑制劑亦包括酿胺酸激酶抑制劑例如上皮生長因子家族抑制劑(例如，EGFR家族絡胺酸激酶抑制劑如尽(3_氯冬氟本基）7 f氧基·6·(3-嗎4木丙氧基)嗅唾琳冰胺（吉非替尼 (gefidnib)，ZD1839)、乙炔基苯基)_6 7雙(2甲氧乙氧 10基）喧唑琳_4_胺（埃羅替尼㈣〇tinib)，〇81_774)和卜丙烯醯胺基-Λ43-氯-4-氟苯基)_7_(3_嗎啉丙氧基）喹唑啉_4_胺(ci 1033)) ; erbB2_酸激酶抑制劑例如拉帕替尼㈣此刪；肝細胞生長因子家族抑制劑；血小板衍化生長因子家族抑制劑例如伊馬替尼（imatinib);絲胺酸/蘇胺酸激酶抑制劑（例 15如，Ras/Raf信號抑制劑例如法尼基轉移酶抑製劑如索拉菲尼（sorafenib)(BAY 43-9006));經由 MEK及/或 AKT激酶的細胞信號抑制；肝細胞生長因子家族抑制劑；㈣抑制劑； abl激酶抑制劑；IGF受體(似胰島素生長因子）激酶抑制劑,· 極光激酶抑制劑（例如，AZD1152、PH739358、VX-680、 20 MLN8054、R763、MP235、MP529、VX-528和 AX39459) 以及週期素依賴激酶抑制劑例如CDK2& /或(：〇尺4抑制劑； (v)血管生長抑制劑例如可抑制血管内皮生長因子之效應者[例如抗血管内皮細胞生長因子抗體貝伐單抗 (Avastin™)];以及VE(JF受體酪胺酸激酶抑制劑例如冬(4_ 73 200815474 溴-2-氟苯胺)_6_甲氧基-7_(1-甲基哌啶-4-基甲氧基）喹唑啉 (ZD6474 ; WO 01/32651 内之實例2)、4-(4-氟-2-曱基吲哚-5-基氧基）-6-曱氧基-7-(3-吼咯烷-1-基丙氧基）喹唑啉(AZD 2171，WO 00/47212 内之實例 240)、維他拉尼（vatalanib) 5 (PTK787 ; WO 98/35985)和SU11248(舒尼替尼（sunitinib); WO 01/60814)、例如揭示於國際專利申請案w〇 97/22596、 WO 97/30035、WO 97/32856和WO 98/13354中的化合物以及具有其他作用機制的化合物（例如，三羧胺基喹啉 (linomide)、整合素α VyS3功能抑制劑和血管抑制素）； 10 (vi)血管破壞劑例如康布司他汀(combretastatin)A4和揭示於國際專利申請案WO 99/02166、WO 00/40529、WO 00/41669、WO 01/92224、WO 02/04434和 WO 02/08213 中的化合物； (vii) 反義療法，例如可被引導至上述所列標的者如 15 ISIS 2503，一種抗-ras反義核酸； (viii) 基因療法，包括例如取代如異常p53或異常 BRCA1或BRCA2之異常基因的方法；基因導向酶前藥療法 (GDEPT)例如利用胞嘧啶脫胺酶、胸腺嘧啶激酶或細菌性石肖基還原者以及增加病人對化療或放療耐受性的方法例 2〇如多藥物抗性基因療法；以及 (ix) 免疫療法，包括例如體外或體内增加病人對腫瘤細胞之免疫抗原性的方法，例如轉染細胞活素如白介素2、白介素4或顆粒球巨嗜細胞聚落刺激因子；降低τ•細胞活力的方法；利用轉染免疫細胞如細胞活素轉染樹突細胞的方 74 200815474 法；利用細胞活素轉染腫瘤細胞株的方法；以及利用抗特異性的抗體的方法。藉由同時、連續或分開進行個別的處理而可達到此類共同治療的目的。此類組合產品可使用在上述劑量範圍内 5的本發明化合物或其醫藥上可接受鹽類，以及在許可劑量 * 範圍内的其他醫藥活性劑。實例下列包括進行之試驗和其結果的實例僅供作為說明的用途而不得推論為本發明被限制於該範圍内。 10 實例1 免疫及滴定免疫刀別利用可溶性α V /3 6和細胞結合α V 6(表現於人類aV卢6細胞表面的CHO轉染子）進行免疫。為產生ch〇 15 轉染子，將人類全長α V冷6 cDNA插入pcDNA3表現載體。藉由電穿透法瞬時轉染CHO細胞。藉由螢光素活化細胞分選儀（FACS)分析確認細胞表面上表現的人類α v沒6已達到作為免疫原的濃度。使用活動1之10微克/小白鼠及活動2 之3χ 1 〇6個細胞/小白鼠的轉染CHO細胞進行XenoMouse™ 20 的初步免疫，其方法係揭示於1996年12月3日提出的美國專利申請序號08/759,620、公告於1998年6月11日的國際專利申請案WO 98/24893和公告於2000年12月21日的WO 00/76310，將其揭示併入於此以供參照。在初次免疫之後，接著第1和2組（可溶性抗原）投與5微克/小白鼠的後續13次 75 200815474 強化免疫，以及第3和4組（細胞結合抗原）投與ΐ5χ1〇6個細胞/小白鼠的後續9次強化免疫。其免疫計劃摘錄於表2。表2 :免疫計劃摘要活動組免疫原株數目免疫途徑 1 1 可溶性α V冷6 XMG2/k 10 IP，尾，BIP，兩次/週，x6週 1 2 可溶性aV冷6 XMGl/kl 10 IP，尾，BIP，兩次/週，χ6週 2 3 細胞結合a VyS 6(CHO轉染子） XMG2/k 10 ΙΡ，尾，ΒΙΡ，兩次/週，χ6週 2 4 細胞結合a V/5 6(CHO轉染子） XMGl/kl 10 IP，尾，ΒΙΡ，兩次/週，χ6週 5 選擇用於藉滴定收獲的動物以可溶性抗體免疫的小白鼠藉由ELISA檢測法測定對抗人類aV/3 6之抗體的力價。以原型（細胞結合)抗原免疫的小白鼠藉由FACS測定其抗體的力價。該ELISA和FACS 分析顯示一些小白鼠對aV卢6具有專一性。因此，在免疫 10 計劃結束時，選擇20隻小白鼠用於採集，以及如實例2所述從經免疫小白鼠的脾臟和淋巴結分離淋巴球。實例2 收獲淋巴球及分離B細胞藉由頸椎脫臼法犧牲經免疫小白鼠，以及採集各組的 15 淋巴結並將其匯集一處。藉由在DMEM内的研磨分解淋巴樣細胞以從組織釋出細胞並將細胞懸浮於DMEM内。藉由負向選取IgM及正向選取IgG加富B細胞。培養該細胞以擴充B細胞然後分化成抗體-分泌漿細胞。依照常規在選擇培養基内培養抗體-分泌漿細胞。傾倒 76 200815474 出收集自可能產生抗人類α νθ 6抗體之細胞的上清液並進行詳述於下列實例的篩檢。實例3 結合至細胞結合《V冷6 5 測定結合至α V yS 6的分泌抗體。如下述方法利用 FMAT高通量共聚焦掃描器測定至細胞結合α V /3 6的結合，以及藉由ELISA分析至可溶性aV^6的結合。測試收集自收獲細胞的上清液以測定分泌抗體至穩定過度表現α V召6之HEK 293的結合。使用親代293F細胞株作 10 為陰性對照。將Freestyle培養基(Invitrogen)内的細胞以50微升/孔的體積接種入384孔的FMAT平板内，其用於穩定轉染的密度為2500個細胞/孔及用於親代細胞的密度為22,500個細胞/孔，以及在37°C下將細胞培養隔夜。然後，加入1〇微升/孔的上清液，以及在4。(：下將平板培養約1小時，之後以 15 2.8微克/毫升(400奈克/毫升終濃度）的濃度加入10微升/孔的抗人類IgG-Cy5第二抗體。然後在4°C下將平板培養1小時，接著利用FMAT高通量共聚焦掃描器（Applied Biosystems) 讀取螢光強度。11種抗體的FMAT結果摘錄於表3。此外，藉由ELISA分析結合至α V/5 6的抗體。藉由以 2〇 TBS/1毫克分子MgCl2緩衝液之5微克/毫升濃度的aV召6在 4°C下培養隔夜的方法將Costar培養基96孔結合平板(Costar 目錄號3368)覆蓋50微升/孔的總體積。然後以TBS/1毫克分子MgCl2緩衝液清洗平板，然後在室溫下以250微升之IX PBS/1%牛奶阻斷30分鐘。然後將1〇微升的上清液加入40微 77 200815474 升的TBS/1毫克分子MgCl2/ 1 %牛奶内並在室溫下培養1小時。清洗平板然後與TBS/1毫克分子MgCl2/ 1%牛奶内的 0.400奈克/毫升山羊抗人類IgG Fc-過氧化酶共同培養，以及在室溫下培養1小時。清洗平板然後以1-步驟TMB基質使其 5 顯色。其一抗體的ELISA結果示於表3。表3 :上清液至細胞結合及可溶性的結合 mAb FMAT數據 ELISA 數據計數 FL1 FLlx計數 OD sc 049 185 4377.73 809880 ND sc 058 ND ND ND 1.79 sc 188 127 628.04 79761 ND sc 097 98 1237.18 121243 ND sc 277 28 382.31 10704 ND sc 133 82 709.82 58205 ND sc 161 23 725.21 16679 ND sc 254 174 9179.65 1597259 ND sc 264 63 734.29 46260 ND sc 298 102 2137.94 218069 ND sc 374 174 4549.65 791639 ND sc 320 141 3014.63 425062 ND 陰性對照(空白）： 0 0 0 0.21 陽性對照 (2077z-l微克/毫升）： 67 659.49 44185 6.00 實例4 細胞黏附的抑制為測定含不同抗體上清液的相對強度，測定該抗體對 10 抑制a Vy5 6-陽性HT29細胞之TGFySLAP-介導黏附作用的能力。以10微克/毫升TGF/3 LAP覆蓋隔夜，然後在檢測前 78 200815474 以3 /〇 BSA/PBS預阻斷！小時。細胞被粒化然後以ηββ§清洗兩次，之後將細胞再懸浮於適當濃度的HBSSr。存在適合抗體下將細胞於4°C的V底平板内培養3〇分鐘。移除抗原覆盍溶液然後平板在室溫下以1〇〇微升之3% BSA阻斷h】、 5日守。平板以洗兩次，然後將細胞-抗體混合物轉置於覆蓋平板及在37°c下將平板培養30分鐘。覆蓋平板上的細胞在溫熱HBSS内清洗四次，之後將細胞在_8〇它下冷凍1小時。在室溫下使細胞解凍丨小時，然後根據製造商的指示各孔内加入100微升的CyQuant染料/溶解緩衝液 10 (Molecular Probes)。在485奈米的激化波長及在53〇奈米的發射波長下讀取螢光。該12種抗體的結果摘錄於表4。相對平板上用於代表最高和最低黏附值的覆蓋和未覆蓋對照孔這些抗體顯示具有從62%至1〇〇%的抑制強度。表4 :黏附檢測值 __¥別抗體 1%抑制 2%抑制平均抑制。/。 sc 049 80% 98% 89% sc 058 77% 46% 62% ^ SC 097 96% 106% 101% scl33 99% 106% 103% sc 161 98% 106% 102% sc 188 99% 103% 101% sc 254 98% 106% 102% sc 264 98% 100% 99% SC 277 98% 101% 100% sc 298 厂 98% 102% 100% _ sc320 97% 97% 97% —sc374 118% 89% 104% 79 200815474 實例5 對恒河猴aVyS6和人類α V的交叉反應性利用FACS分析於瞬時轉染獼猴α V和獼猴冷6之 HEK-293細胞的上清液上測定含抗體上清液對恒河猴ο： V 5 6的交叉反應性。亦測定對人類aV的交叉反應性。進行此檢測時，利用 FACS分析表現a V/3 3和a V/3 5但非α V冷6的親代A375M 細胞上測定上清液的交叉反應性。此篩檢顯示該抗體可專一性地辨識々6鏈或與aV結合的点6鏈。在同時進行與恒河 10 猴a V)S6交叉反應篩檢相同的人類α v檢測。該篩檢的進行如下。藉由在離心管（falcon tube)内解離後粒化細胞（每孔相當於250,000至300,000個細胞）以CFSE 細胞内染料標示鋪滿約75%的A375M細胞，然後再懸浮於 FACS緩衝液之0 · 125微克分子CFSE内至每250,000個細胞 15 100微升的終體積，接著在37°C下培養5分鐘。然後將該細胞粒化，移除上清液，以及再懸浮於FACS緩衝液内和在37 。(：下培養30分鐘。細胞以FACS緩衝液清洗兩次然後再懸浮於每孔100微升終體積的FACS緩衝液内。以獼猴〇:¥和獼猴/3 6瞬時轉染11£1(：_293細胞。48小時 20 之後，收集該細胞然後再懸浮於FACS緩衝液内以達到1〇〇微升内約50,000個細胞的終濃度。如下各反應内係使用包含CFSE-標示A375M細胞和轉染293細胞之50 : 50混合的總數約100,000個細胞。將1〇〇微升CFSE-標示A375M細胞和100微升的293細胞置入V底平 80 200815474 板内。以1500 rpm離心3分鐘粒化平板内的細胞’然後再懸浮於100微升的FACS緩衝液内。重複該粒化步驟，及移除 FACS緩衝液的上清液。將收獲之含抗體上清液，或對照初級抗體加入50微升體積内然後再懸浮該細胞。初級抗體對 5 照為鼠a V/3 6(目錄號MAB2077z，Chemicon)及抗-α V重組抗體。將該平板在冰上培養45分鐘，之後加入1〇〇微升之 FACS緩衝液以稀釋該初級抗體。然後藉由1500 rpm離心3 分鐘粒化該細胞，以及移除該FACS緩衝液之上清液。接著將細胞再懸浮於含7AAD染料（10微克/毫升）的適當次級抗 10 體(5微克/毫升）内，以及在冰上染色7分鐘。然後加入150微升的FACS緩衝液以及在1500 rpm下3分鐘粒化該細胞，之後在100微升FACS緩衝液内清洗該細胞，粒化，然後再懸浮於250微升緩衝溶液内並將其置入FACS試管内。在高通量FACS機上分析樣本然後利用Cell Quest Pro軟體進行分 15 析。該12種抗體的結果摘錄於表5，該抗體顯示能專一性土也結合至恒河猴α V /5 6但無法非特異性地結合至在親代 Α375Μ細胞上的人類α ν。 81 200815474 表5.對恒河猴αν々6和人類αν的交叉反應性識別抗« Mac AVB6 細胞轉移。/〇 Mac AVB6 幾何平均 A375M 細胞轉移°/〇 A375M 幾何平均 sc 049 23% 30.19 20% 1.74 sc 058 25% 22.77 18% 1.78 sc 097 35% 37.04 24% 1.84 scl33 32% 35.22 24% 1.79 sc 161 14% 32.98 11% 16.68 sc 188 18% 23.9 13% 1.65 sc 254 59% 78.49 55% 2.31 sc 264 55% 66.38 46% 2.35 sc 277 35% 33.35 23% 1.86 sc 298 53% 63.08 45% 2.14 sc 320 19% 33.45 15% 23.18 sc374 51% 61.79 39% 2.14 人類IgG 同型對照 1% (第2天） 0% (第2天） 9.54(第 1 天） 7.39(第 2天） 5% (第1天） 1% (第2天） 1.66(第 1 天） 7.23 (第 2天）含鼠次級抗體的小鼠 IgG2 1% (第1天） 0% (第2天） 8.85(第 1 天） 11.21 (第 2天） 4% (第1天） 3% (第2天） I. 67(第 1 天） II. 16(第 2天）陽性對照 2077z (1微克/毫升） 42% (第1天） 11% (第2天） 55.52(第 1 天） 28.11 (第 2天） 30% (第1天） 5% (第2天） 2.03(第 1 天） 15.36(第 2天）實例6 a V/S6特異性溶血斑試驗 5 從各收獲中選擇抗體分泌漿細胞以供製造重組抗體。此處，利用螢光溶斑試驗鑑定表現對抗6之抗體的單一漿細胞。然後如實例7中所述，將該單一細胞進行反向轉錄及聚合酶鏈反應以救援及擴增編碼初步抗體專一性的可變重鏈和可變輕鏈。下列為進行α V万6-專一性溶血斑試驗 10 所需的一些特殊試劑和材料的製備。 82 200815474 差##允丰·红猃硪·知虑Θ兄。以25%儲備量將8^3〇儲存於RPMI培養液内。藉由等量分配L0毫升儲備液至15 毫升離心管内可獲得250微升之SRBC濃縮紅血球團粒，離心沈澱細胞然後移除上清液。將該細胞團粒再懸浮於50毫 5 升試管内pH 8.6的4.75毫升PBS内。在50毫升分離試管内，將2.5亳克之硫-NHS生物素加入在pH 8.6的45毫升PBS内。一旦該生物素被完全溶解，加入5毫升的SRBCs然後將該試管在室溫下旋轉1小時。該SRBCs在3000克下被離心5分鐘。除去上清液及加入pH 7.4的25毫升PBS作為洗務液。重 1〇複三次的清洗，然後將4.75毫升的免疫細胞培養液（含10% FCS的RPMI 1640)力π入250微升的生物素化-SRBC(B-SRBC) 團粒並溫和地再懸浮該B-SRBC(5%B-SRBC儲備液）。在使用前將該儲備液儲存於4°C。翁鐽黴巍合斧似；。將丨毫升的5% B_SRBC儲 15備液轉置入一乾淨微量離心管（eppendorf tube)内。在微量離心機内以8000 rpm(6800 rcf)脈衝轉速粒化該B_SRBC細胞。除去上清液然後將該團粒再懸浮於pH 74的1〇毫升 PBS内並重複離心。重複清洗兩次，然後將團粒再懸浮於pH 7.4的1.0毫升哪内而獲得5%(體積/體積）的終 2〇濃度。加入10微升之1〇毫克/毫升的鏈黴親合素 (Camiochem，加州San Dieg〇市）儲備溶液。混合該離心管並在至/皿下離^20分鐘。重複該清洗步驟然後將认-张队再懸洋於PH7.4的U毫升pBS(5%(體積/體積))内。认包叙勤⑽。使用可溶性抗原（缺少跨膜 83 200815474 功能區）包覆該SRBC。由於〇：ν々6為唯一存在於細胞表面上的雙體因此兩種鏈型均被使用。該SA-SRBC被包覆以50 微克/毫升的生物素化aV/36，混合及在室溫下離心2〇分鐘。如上述以pH 7.4的1.0毫升PBS將SRBC清洗兩次。將Ag-5 包覆SRBC再懸浮於RPMI(+l〇% FCS)至5%(體積/體積）的終濃度。藉由免疫螢光法(IF)測定aV/96-SRBC的數量。將\(y敫升的5% SA-SRBC和10微升的5% Ag_包覆SRBC分別加入含40微升PBS的1.5毫升乾淨微量離心管内。將5〇微克/毫升 10 的人類抗-a V/3 6抗體加入各SRBCs樣本。在室溫下將試管離心25分鐘，然後以100微升PBS將細胞清洗三次。將細胞再懸浮於50微升的PBS内並以2微克/毫升共扼至不感光螢光染料 Alexa488(Molecular Probes，奥勒岡州 Eugene市）的 Gt-抗人類lgG Fc抗體共同培養。離心管在室溫下旋轉25分 15 鐘，接著以100微升PBS清洗然後再懸浮於1〇微升的PBS 内。在覆蓋玻璃蓋玻片的乾淨玻璃顯微鏡載玻片上於螢光下觀察10微升的染色細胞，然後以0〜4任意標度計分以測定被分離細胞的品質。 #細應的裊#。收獲先前被鑑定用於中和aV/56活性 20 之單一B細胞培養孔的内容物（其含有分泌標的免疫球蛋白一的B細胞選殖株）。藉由加入RPMI+10% FCS在37°C下回收孔内的該B細胞培養液。藉由抽吸再懸浮該細胞然後轉置於一乾淨1.5毫升的微量離心管（終體積約500〜700微升）内。在微量離心機内於室溫下以1500 rpm(240 ref)離心該細胞，然 84 200815474 後將其旋轉180度並再一次以1500 rpm離心2分鐘。除去冰冷培養液及將免疫細胞再懸浮於1 〇〇微升的RPMI( 1 〇% pcS) 内，然後離心。重複aRPMI(l〇% FCS)的清洗然後將細胞再懸浮於60微升的rpmi(FCS)内，最後儲存於冰上直至供 5 使用為止。遠疗溶盖斑的檢蹲。將6〇微升之V/3 6包覆SRBC(5% 體積/體積儲備液）、製備於rPMI(FCS)内的4x天竺鼠補體 (Sigma，安大略省〇akviiie市)和4X強化血清儲備液（丨：9〇〇於RPMI(FCS)内）分別加入60微升的免疫細胞樣本。該混合 1〇物（3〜5微升）被中止於來自100毫米Falcon組織培養板的塑膠蓋上然後覆盍以未稀釋的石蝶油。將該玻片在下培養至少45分鐘。溶盖斑儉涿綹耒的分奔。可利用人類催化功能區成功地包覆羊紅血球細胞。然後利用這些Ag_包覆紅血 15球細胞鑑定來自各孔的抗原專一性漿細胞，其結果示於下表6。然後藉由顯微操作分離這些細胞。在顯微操作救援該抗原專一性漿細胞之後，藉由RT_PCR救援在單一漿細胞上編碼該可變區基因的基因，其進一步說明於實例7。 85 200815474 表6·溶血斑檢測結果識別母板溶血斑檢測平板列行檢測單一細胞 68 B 10 螢光 45 〜57 296 D 10 螢光 58 〜59 318 F 1 溶血 60 〜62 612 G 1 螢光 187〜189 752 D 12 螢光 95〜100 762 D 8 螢光 277〜286 766 B 5 螢光 132〜143 ， 147〜150 827 E 12 螢光 159〜170 659 F 11 螢光 252〜263 761 Η 3 螢光 264〜276 765 A 8 螢光 287〜298 652 D 2 螢光 374〜379 ， 392〜397 806 A 6 螢光 312〜321 實例7 重組蛋白的分離 5 在從實例4分離所欲單一漿細胞之後’及進行反轉錄酶PCR以產生被各細胞分泌之編碼可變區重鏈和輕鏈cDNA的抗體。以在PCR期間加入之限制酵素消化該人類可變區重鏈cDNA以及將此反應的產物選殖入具有用於選殖之相容突出末端的IgG2表現載體。藉由將人類IgG2之 10 恒定區選殖入pcDNA3·l+/Hygro(Invitrogen，加拿大安大略省Burlington市）的多選殖點可產生此載體。以在pCR反應期間加入之限制酵素消化該人類可變區輕鏈cDNA以及將此 86 200815474 反應的產物選殖入具有用於選殖之相容突出末端的 IgKappa或IgLamda表現載體。藉由將人類IgK或IgL之恒定區選殖入pcDNA3· 1 +/Neo(Invitrogen)的多選殖點可產生此載體。 5 然後將該重鏈和輕鏈表現載體利用脂質體轉染試劑 (lipofectamine)共同轉染入70%融合人類腎胚胎（HEK)293 細胞的60毫米平盤内。該轉染細胞可分泌具有如原始漿細胞相同專一性的重組抗體約達24至72小時。從HEK293細胞收獲其上清液(3毫升）以及藉由專用於偵測人類IgG的三明 10 治免疫酵素法（ELISA)可顯示其完整抗體之分泌。利用 ELISA經由重組抗體至aV卢6的結合可確認其專一性。可結合至標的抗原的該救援選殖株分泌抗體被摘錄於表7。表7·重組抗艟的分泌和結合數據識別母板平板列行識別抗髖 68 B 10 -----. 49 296 D 10 -—--- 58 612 G 1 Τδ8 ^ 752 D 12 97 762 D 8 277 766 B 5 133~^^ 827 E 12 659 F 11 254 ^ 761 Η 3 264 '^ 765 A 8 298^ 652 D 2 374 806 A 6 320 ^ 87 200815474 實例8 重組抗艘的純化為大規模製造抗6抗體，重和輕鏈表現載體(各鏈/盤為2.5微克）被微脂粒感染入1〇個70%融合HEK 293細 5 胞的1〇〇毫米平盤内。該轉染細胞在37°C下培養4天，收獲其上清液(6毫升）然後更換以6毫升的乾淨培養基。在第7天時，移除上清液然後與初收集物匯置一起（1〇個平盤總共 120毫升）。利用蛋白-A瓊脂糖凝膠(Amersham Biosciences，紐澤西州Piscataway市）親和層析法（1毫升)從上清液純化該 10 抗體。以500微升之pH 7.4的〇·1克分子甘胺酸從蛋白-A管柱洗脫該抗體。在pH 7.4的PBS内透析該洗脫物然後過濾滅菌。利用非還原SDS-PAGE分析該抗體以測定其純度和產量。藉由測定其在280奈米的光密度判定蛋白質的濃度。實例9 15 αν^96抗體的結構分析定序抗體之可變區重鏈和可變區輕鏈以測定其DNA的序列。該抗-aV万6抗體的全部序列資料提供於包括各和/c/λ鏈組合之核苷酸和胺基酸序列的序列表。分析該可變區重鏈序列以測定其VH家族、D_區序列和；_區序列。然 20後轉譯該序列以測定其原始胺基酸序列及與胚系VH、D和 J-區序列相比較以估計其體細胞超突變。表8為該抗體重鏈區與其同源胚系重鏈區的比較表。表 9為抗體之/c或λ輕鏈區與其同源胚系輕鏈區的比較表。免疫球蛋白鏈的可變(V)區被多重胚源DNA片斷所編碼，其在 200815474 B-細胞個體發生期間被接入功能性可變區（VHDJH或 VkJk)。詳細研究對α V /3 6之抗體反應的分子和遺傳多態性。這些檢測顯示對抗-aV/S 6抗體具有專一性的數個位置。 5 根據該定序資料，sc 298和sc 374的重鏈具有類似的一級構造，但非完全相同。sc 254在構造上與其他二者不同。亦應瞭解特定的抗體在胺基酸層次上有各自不同胚系序列，該抗體序列可被突變回其胚系序列。利用標準分子生物技術，此類矯正性突變可發生於1、2、3或多個位置，或 10 任何該突變位置的組合。藉由非限制性的實例，表9顯示sc 298(序列辨識編號：40)的輕鏈序列與對應胚系序列(序列辨識編號：68)的不同在於FR1區内的Val至Ala突變（突變1)、在CDR1區内的Leu至Ala突變（突變2)以及在FR3區内的Asn 至Ser突變。因此，該編碼sc 298之輕鏈的胺基酸或核苦酸 15 序列可被修飾以改變其突變1而產生在突變1位置的胚系序列。此外，該編碼mAb sc 298之輕鏈的胺基酸或核苷酸序列可被修飾以改變其突變2而產生在突變2位置的胚系序列。又再者，該編碼mAb sc 298之輕鏈的胺基酸或核苦酸序列可被修飾以改變其突變3而產生在突變3位置的胚系序 20 列。又再者，該編碼sc 298之輕鏈的胺基酸或核苷酸序列可被修飾以改變其突變1、突變2和突變3而產生在突變1、2和 3位置的胚系序列。又再者，該編碼sc 298之輕鏈的胺基酸或核苷酸序列可被修飾以改變任何組合的突變1、突變2和突變3。在另一實例中，sc 264(序列辨識編號：30)的重鏈 89 200815474 與其胚系（序列辨識編號：55)的不同在於位置61。因此編碼 SC 264之重鏈的胺基酸或核苷酸序列可從^^至丫被修飾而產生其胚系序列。下表10〜13說明來自胚系有關SC 133、SC 188 和sc 264之此類變異的位置。各列代表一胚系的獨特組合及 5 以粗體字表示在該位置的非胚系殘基。可被突變回其胚系序列之抗體序列的特定實例包括：sc 133，其在重鏈之胺基酸70的L可被突變回Μ的胚系胺基酸（此處稱為SC 133 ΤΜΤ) ; sc 133，其在輕鏈之胺基酸93的Ν可被突變回D的胚系胺基酸(此處稱為sc 133 WDS);以及sc 264，其在輕鏈之 10 胺基酸84的Α可被突變回D的胚系胺基酸（此處稱為sc 264 ADY)。在一具體實施例中，本發明的特徵在於修飾CDR區即 CDIU、CDR2及/或CDR3的一或多個胺基酸。在一實例中，此處所述抗體之重鏈的CDR3被修飾。通常，該胺基酸係被 I5 具有類似側鏈（一保留胺基酸置換作用）的一胺基酸所取代或可被任何適當胺基酸如丙胺酸或白胺酸所取代。在一具體實施例中，sc 264 CDR3，VATGRGDYHFYAMDV，的一或多個胺基酸可被修飾。申請人已證明CDR3區在對活性無不良影響之下被修飾；即請看SC 264 RAD，其在CDR3區内 20 的第二個G被A所取代。亦可推論及在CDR3區内的其他修飾作用。在另一具體實施例中，該sc 133 CDR3區，RLDV，的一或多個胺基酸可被修飾；其包括以A取代L及/或以A取代V。取代胺基酸的方法已為技術中所習知以及包括定點突變0 90 200815474 在另一具體實施例中，本發明包括置換序列内可能影響本發明抗體結合之異源性或專一性的任何結構。在一實例中，該抗體SC 264在CDR3區内具有可能導致交叉反應結合的一RGD序列。因此在該RGD内的甘胺酸殘基可被一丙 5 胺酸(sc 264 RAD)所取代。 /· 91 200815474 #φ壤鰂84 FR4 WGQGTT VTVSS WGQGTT VTVSS WGQGTT VTVSS WGQGTT VTVSS WGQGTT VTVSS WGQGTT VTVSS WGQGTT VTVSS WGQGTT ! 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26 28 29 32 47 G S V S L G S V S Ρ G S V R Ρ G S V R L G S V R L G S V S Ρ G S I R Ρ G S I R L G τ V R L 96 200815474

G T V S P G T V S L G T I R P G T I R L G T I S L S S V S P S S V R P S S V R L S S V R L S S V S P S S I R P S S I R L S T V R L S T V S P S T V S L S T I R P S T I R L S T I S L 表12 :在所示的殘基數舉例性突變sc 188重鏈(序列辨識編號：22) 至胚系(序列辨識編號：56)

33 37 45 60 78 83 85 G S K Y N K S G S K Y N K T G S K Y N N S G S K Y N N T G S K Y K N S G S K Y K N T G S K Y K K S G S K Y K K T 97 200815474

98 200815474

99 200815474

100 200815474

101 200815474 表13 :在所示的殘基數舉例性突轡sc264輕鏈(序列辨識編號：32) 至胚糸（序列辨識編號：

31 36 84 Y Η A Y Η D Y Q A S Η D S Q D S Q A 實例10 5 aV冷6抗®的效力測定為根據其阻止HT29細胞黏附至TFG万LAP的能力以區別抗體，進行下列的黏附檢測法。以50微升之10微克/毫升的TGF Betal LAP(TGF/3LAP) 將Nunc MaxiSoip(Nunc)平板覆蓋隔夜，以及在檢測前以3% 10 BSA/PBS預阻斷1小時。團粒化生長至最適密度的HT29細胞然後在HBBS(含1% BSA及無Μη2 )内清洗兩次，之後以每孔30,000個細胞將細胞再懸浮於HBSS内。從平板移除覆蓋液，然後在室溫下以100微升之3% BSA阻斷1小時之後以 PBS清洗兩次。在30微升終體積和兩倍終濃度的1 : 3系列稀 15釋下製備抗體滴定液。必需小心操作以確保對照孔内的PBS 濃度符合最大稀釋抗體孔内的PBS濃度。各孔加入30微升的細胞’及存在抗體的4 C下將細胞在V底平板内培養4〇分鐘。將細胞-抗體混合物轉置該覆蓋平板然後在下將平板培養40分鐘。在溫熱HBSS内將覆蓋平板上的細胞清洗四 102 200815474 次，之後在-80°C下將該細胞冷柬15分鐘。在室溫下解凍該細胞，然後根據製造商的指示各孔内加入100微升的 CyQuant染料/溶解緩衝液(Molecular Probes)。在485奈米的激化波長及在5 3 0奈米的發射波長下讀取榮光。如陽性和陰 5 性對照孔的測定，根據檢測内細胞可能黏附的最高和最低量計算各mAb的估測ICso值。該12種抗體的結果摘錄於表 14。表14.黏附檢測結果 η=1 (奈克/毫升） n=2 (奈克/毫升） π=3 (奈克/亳升） sc 049 >5000 >5000 >5000 sc 058 4065 2028 3259 sc 097 1006 281 536 scl33 25 16 30 sc 161 2408 137 ND sc 188 41 26 ND sc 254 63 37 37 sc 264 26 14 18 SC 277 1455 540 720 sc 298 29 25 33 sc320 648 381 415 sc374 1 277 300 549 陽性對照2077ζ 226 185 286 10 實例11 競爭性試驗為建立抗體能特異性地阻止aV点6整合素結合至可溶 103 200815474 性TFG^S LAP的能力，以純化抗體進行競爭性試驗以測定其結合至aV々6以及阻止其結合至GST-LAP肽的能力。以50微升/孔之PBS内的1〇微克/毫升GST-LAP及0.05% 的疊氮化鈉塗佈中結合力96孔平板(Costar，目錄號3368)， 5 然後在4°C下培養隔夜。利用300微升/孔的檢測稀釋液 (TBS(50毫克分子Tris、50毫克分子NaQ、1毫克分MgCljn 1毫克分子CaCl2, pH 6.9)内1%牛奶）將平板清洗三次，之後利用300微升/孔之TBS内的5%牛奶阻斷該平板，然後在室溫下培養30分鐘。使mAbs(從10微克/毫升至〇.〇1微克/毫升 1〇的1 : 3系列稀釋液内）與aV；S6(含0.05%疊氮化鈉的250奈克/毫升檢測稀釋液内）培養隔夜。在隔天，將50微升/孔的預培養初級抗體轉置GST-LAP肽-覆蓋平板然後在室溫丁培養1小時。然後利用300微升/孔的檢測稀釋液將孔清洗三次。接著，偵測aV/3 6結合至該平板的數量，以檢測稀釋 15 液（50微升/孔）内1微克/毫升的濃度加入mAb 2075 (Chemicon)然後在室溫下培養1小時。利用3〇〇微升/孔的檢測稀釋液將孔清洗三次，然後與檢測稀釋液(5〇微升/孔）内 400奈克/毫升的山羊抗-小白鼠IgG Fc-過氧化酶在室溫下共同培養1小時。利用300微升/孔的檢測稀釋液將該孔清洗 20三次，然後在50微升/孔總體積下以1-步驟TMB(Neogen)使其顯色。在15分鐘之後’以50微升/孔的1當量鹽酸冷卻該顯色反應。在450奈米下讀取該平板及將5種抗體的結果摘錄於第1圖，其顯示該抗體能抑制α V/3 6結合至GST-LAP。 104 200815474 實例12 對aV/S3或αν々3整合素的交又反應性為建立該抗體僅具有對抗a V/5 6整合素而非a V/3 3 或aV万5整合素的功能，進行下列的試驗以測定該抗體對 5 抑制A375M細胞黏附至骨橋蛋白的能力。以骨橋蛋白覆蓋檢測板。使用兩種片斷的骨橋蛋白： OPN 17-168 和 OPN 17_314。在試驗之前以 3%BSA/PBS 將檢測板預阻斷1小時。從培養燒瓶移除該A375M細胞，粒化然後以含1% BSA、1毫克分子ca2+和1毫克分子Mg2+的HBSS 10 清洗兩次。然後以每孔30,000個細胞的濃度將該細胞再懸浮於HBSS内。移除含骨橋蛋白片斷的覆蓋液體，在室溫下以100微升之3% BSA將該平板阻斷1小時。以含1% BSA的 HBSS將該覆蓋平板清洗兩次。在3〇微升終體積和兩倍終濃度的1 : 4系列稀釋下製備抗體滴定液。將再懸浮細胞加至v 15底平板含该滴定抗體的孔内，然後在4°C下將該細胞和抗體共同培養40分鐘。接著將該細胞_抗體混合物轉置於該覆蓋平板，之後在37C下培養40分鐘。接著將覆蓋平板上的細胞在溫熱HBSS内清洗四次，然後將平㈣的細胞在善c 下冷/東I5分鐘。在室溫下解;東該細胞，然後根據製造商的指示各孔加入100微升的CyQ刪染料/溶解緩衝液 (MW Pr〇bes)。在485奈米激發波長和別奈米發射波長下讀取螢光。該5種抗體的結果摘錄於表…使用市售π整合素專一性抗體作為此試驗的陽性對照，其呈現約90%的黏附抑 105 2〇〇815474 制作用。此試驗中使用市售aV/S6抗體作為黏附至aV0 3 或αν/3 5整合素的陰性對照。全部抗體的測試濃度為5微克 /宅升以及無一受測抗體可阻斷至a V/33或a Vy55整合素的勒附作用。 5 表15·對αν/33或aV/S5整合素的交又反應性識別抗饉抑制％ scl33 3 sc 188 -2 sc 254 -5 sc 264 3 sc 298 9 aV對照 89 a V冷6對照 11 人類IgG對照 3 小白鼠IgG對照 5 實例13 ~a4iSl整合素的交又反應性為建立該抗體僅具有對抗a VA 6整合素而非〇： 4万1整 1〇合素的功能，進行下列的試驗以測定該抗體對抑制j6.77細胞黏附至纖連蛋白之CS-1肽的能力。除了使用J6.77細胞於結合及使用纖連蛋白之CS-1肽覆蓋該檢測板之外，依照實例12中所述進行此試驗。該11種抗體的結果摘錄於表16。使用市售/3 1整合素專 15 一性抗體作為此試驗的陽性對照，其呈現約97°/。的黏附抑制作用。此試驗中使用市售a V/5 6專一性抗體作為黏附至 106 200815474 α 4/3 1的陰性對照。全部抗體的測試濃度為5微克/毫升以及無一受測抗體可阻斷至α4；51的黏附作用。表16·對a4ySl整合素的交叉反應性識別抗» 抑制°/。 sc 58 -14 sc 97 -7 sc 133 -15 scl61 12 sc 188 -10 sc 254 0 sc 264 -8 sc 277 -17 sc 298 -7 sc 320 -8 sc374 -8 人類IgGl -6 人類IgG2 -9 抗-ySl整合素抗體 97 抗-aV yS 6整合素抗體 -15 平板上無CS-1或抗體 12 無抗體之CS-1片斷覆蓋平板 10 5 實例14 對α 5沒1整合素的交又反應性為建立該抗體僅具有對抗aV石6整合素而非α 5/3 1整合素的功能，進行下列的試驗以測定該抗體對抑制Κ562細胞黏附至纖黏蛋白的能力。 107 200815474 以12.5微克/毫升濃度之纖黏蛋白的FN9〜10肽覆蓋檢測板。在試驗之前以3% BSA/PBS將檢測板預阻斷1小時。從培養燒瓶移除該K562細胞，粒化然後以含1% BSA和1毫克分子Mn2+的HBSS清洗兩次。然後以每孔30,000個細胞的 5 濃度將該細胞再懸浮於HBSS内。移除含骨橋蛋白片斷的覆蓋液體，在室溫下以100微升之3% BSA將該平板阻斷1小時。以含1% BSA的HBSS將該覆蓋平板清洗兩次。在30微升終體積和兩倍終濃度的1 : 4系列稀釋下製備抗體滴定液。將再懸浮細胞加至V底平板含該滴定抗體的孔内，然後 10在4°C下將該細胞和抗體共同培養6〇分鐘。接著將該細胞_ 抗體混合物轉置於該覆蓋平板，之後在37它下培養4〇分鐘。接著將覆蓋平板上的細胞在溫熱HBSS内清洗四次，然後將平板内的細胞在_8〇°c下冷凍15分鐘。在室温下解凍該細胞，然後根據製造商的指示各孔加入1〇〇微升的⑽細 15木料/，合解緩衝液(M〇lecular Pr〇b叫。在485奈米激發波長和 530奈米發射波長下讀取螢光。 A5種抗體的結果摘錄於表17。受測抗體與作為陽性對 …、的市。《531抗體以及作為陰性對照的a 專一性抗體才认Κ驗中在用於此試驗的5微克/毫升濃度之下 20無一受測抗體可阻斷其黏附作用。 108 200815474 表17·對整合素的交叉反應性識別抗艏抑制％ sc 133 -12 sc 188 5 sc 254 -9 sc 264 -4 sc 298 2 aVyS6對照 7 α 5/31對照 78 人類IgG對照 11 實例15 對鼠和獼猴ανβ 6整合素的交又反應性 5 為了測定該抗體是否具有小白鼠α V石6或獼猴α V/3 6 的交叉活性，進行下列的試驗。以獼猴和小白鼠《¥、/5 6或〇:¥/3 6瞬間轉染1^1^293 的細胞在純化mAbs抗體上利用FACS分析測定mAbs對獼猴和小白鼠a 6的交叉反應性。約在轉染48小時之後，收 10 集該細胞然後再懸浮FACS緩衝液内以達到100微升内約 50,000個細胞的終濃度。如下各反應中使用總數約1〇〇,〇〇〇個細胞。將200微升的293個細胞置入v底平板内。在15〇〇 rpm下將平板内的細胞粒化3分鐘，然後再懸浮於100微升的FACS緩衝液内。重 15複孩粒化步驟，然後移除FACS緩衝液的上清液。加入50 微升體積的純化mAbs或對照初級抗體，然後再懸浮該細胞。初級抗體對照為小白鼠α V召6 (目錄號MAB 2〇77z， 109 200815474

Chemicon)、、抗-A v和抗-万6重組體。在冰上將平板培養45 分鐘，之後加入稀釋該初級抗體的100微升从以緩衝液。藉由1500 rpm下3分鐘的離心粒化該細胞’然後將該團粒再懸浮於100微升的FACS緩衝液内。重複該粒化步驟’然後 5 移除FACS缓衝液的上清液。將細胞再懸浮於含7AAD染料 (10微克/毫升）的適當次級抗體(5微克/毫升）内’然後在冰上染色7分鐘。加入150微升的FACS緩衝液及在1500 rpm粒化 3分鐘，之後以1〇〇微升的FACS緩衝液清洗該細胞，粒化，然後再懸浮於250微升的緩衝液内並置入FACS試管内。在 10 高通量FACS儀上測定樣本以及利用Cell Quest Pro軟體分析0 其結果摘錄於表18，其證明mAb sc 133和mAb sc 188 明顯地與小白氣和獼狼α V /3 6和/3 6具有交叉反應。mAbs sc 254似乎與/3 6、Αν和a Vf 6具有交叉反應。mAbs sc 264 15 和298高度結合至親代細胞而使品種的交叉反應性不易辨別0 110 200815474 表18.與小白鼠和獼猴aVyS6的交叉反應性抗體親代小鼠 aV 小鼠 ^36 小鼠 α\β 6 彌猴 α\ 彌猴 yS6 彌猴 a\β 6 單獨細胞 0 0 0 0 1 0 0 Gt抗鼠 0 0 0 0 0 0 0 抗α V石6 0 1 11 45 0 5 20 抗a V 68 68 63 59 68 69 67 抗冷6 0 0 0 0 0 0 0 Gt抗人類 0 0 0 0 0 0 0 人類IgGl 0 1 0 1 1 1 0 sc 133 2 4 19 49 5 10 28 sc 188 1 3 29 51 2 17 27 sc 254 8 13 21 50 16 19 26 sc 264 74 71 68 63 70 75 54 sc 298 49 45 52 53 48 52 38 資料代表細胞移動的百分比實例16 5 内在化的檢測利用穩定表現人類α V/3 6的K562細胞株測試抗體的内在化。將該純化抗體的内化作用與不被此試驗所内化的市售a VyS6抗體相比較。其結果摘錄於表19。 111 200815474 表19.内在化檢測的摘要抗艘濃度(微克/毫升）内化百分比 scl33 10 28% sc 133 1 30% sc 188 10 38% sc 188 1 34% sc 254 10 49% sc 254 1 39% sc 264 10 76% sc 264 1 77% sc 298 10 28% sc 298 1 26% 實例17 高解析度Biacore分析 5 利用結合固定於C Μ 5晶片上抗體的可溶性α V ^ 6蛋白進行5種α V /5 6抗體的高解析度Biacore分析以測定其對可溶性抗原的親和力。依如下方法進行Biacore分析。利用例行胺偶聯法在兩個CM5 Biacore晶片上製造高密度山羊α人類IgG抗體表 10 面。各mAb被稀釋於含100微克/毫升BSA、1毫克分子MgCl2 和1毫克分子CaCl2至約1微克/毫升之濃度的脫氣HBS-P電泳緩衝液内。更精確而言，mAb sc 133被稀釋至0.98微克/ 毫升、mAb sc 188被稀釋至〇·96微克/毫升、mAb sc 264被稀釋至0.94微克/毫升、mAb sc 254.2被稀釋至0.87微克/毫 15 升及mAb sc 298被稀釋至ι·6微克/毫升。然後，在上述濃度 112 200815474 之分離流式處理槽上以10微升/分鐘的流速捕捉各mAb而發展出各mAb的捕捉度計劃。mAbs sc 133、sc 298和sc 254.2 被捕捉30秒，而mAbs sc 188和sc 264則被捕捉1分鐘。接著以50微升/分鐘的4-分鐘清洗步驟穩定化mAb基線。 5 注入4分鐘的可溶性α V/3 6其濃度範圍為mAbs sc 133、sc 188、sc 264和sc 298的 116〜3.6奈克分子，以及mAb sc 254.2的233〜3.6奈克分子，各濃度範圍進行2x系列稀釋。注入各抗原之後進行10分鐘的解離。在上述的流動HBS-P 内製備抗原樣本。以散置的數次mAb捕捉/緩衝液注入循環 10 隨機地重覆三次注入全部樣本以供雙重的參考。在100微升 /分鐘流速的各循環之後以146毫克分子磷酸(pH 1.5)的一 18-秒脈衝產生高密度山羊α小白鼠抗體表面。全部抗原注入循環使用50微升/分鐘的流速。此數據被適配至在包括利用CLAMP大量輸送之條件 15 的1 : 1互動模式。獲得的結合常數列於表20。該mAbs係從最高至最低親和力進行表列。表20.源自高解析度BiacoreTM之選殖和純化mAbs的親和力測定結果抗艘 Rmax kwV) KdCs1) K〇(nM) sc 264 96 5.85χ104 3.63 xlO"4 6.2 sc 298 77 5.65 xlO4 1.18 xlO-3 21.0 sc 188 76 4.52 xlO4 9.56 xlO"4 21.1 sc 133 96 5.73 xlO4 1.89 xlO-3 33.0 SC 254.2 53,45 5.73 xlO4 5.64X10-4 34.9 113 200815474 實例18 利用FACS的結合親和力分析除了 Biacore之外，亦可利用FACS分析測定其一抗體對穩定表現人類《V/36抗原之K562細胞的結合親和力。滴定 5 抗原的數量以產生結合曲線然後測定對該抗原的結合親和力。將表現α V石6的K562細胞再懸浮於含1毫克分子 MgCh和1毫克分子CaCl2至約6,000,000個細胞/毫升之濃度的過濾HBS缓衝液内。將該細胞保存於冰上。藉由96孔平 10板内HBS通過11孔之1 : 2因子系列稀釋純化的mAb sc 188。各列的第12個孔僅含有緩衝液。以三次重複完成滴定。將更多HBS和細胞加入各孔而使其終體積為3〇微升/孔及各孔含有約120,000個細胞。mAb sc 188的最終分子濃度為 4.9〜0.019奈克分子。將平板置入4°C的平板振盪機並振盪5 15小時，之後以HBS離心及清洗三次，接著將2〇〇微升之131 奈克分子Cy5山羊α -人類多株抗體（Jackson實驗室， #109-175-008)加入各孔内。然後在將平板振盪4〇分鐘，之後再以HBS離心和清洗三次。利用FACSCalibmv^記錄各 mAb濃度之20,000個”事件”的幾何平均螢光(GMF)，然後平 20均對應的三重複滴定點而獲得各mAb濃度的一GMF。以專用軟體非線性地配適下列方程式以繪製分子mAb濃度為函數的平均GMF圖：

F = p，+ LT + η·Μ) - T^KD + LT + η·Μ)2 - 4tvM.LT "------+ Β 114 200815474 上述方程式中，F=幾何平均勞光；LT=總分子mAb濃度；P’=與結合mAb之任意螢光單位有關的比例常數；M= 克分子濃度的細胞濃度；n=每個細胞的受體數目；B=背景信號；以及KD=平衡解離常數。獲得用於測定mAb sc 188 5之Kd的p’、η、B和KD可在非線性分析中自由浮動。以其非線性適配(紅線)獲得的圖被示於第2圖。表12為該適配具有95%信心區間之爪八匕sc 188的KD。這些mAb sc 188的結果表示結合至一類型的受體。藉由FACS測定之sc 188的結合親和力明顯較Biacore所 10測定(實例17)更為嚴密。sc 188具有不同KD值至少有兩種可能的解釋。第一種理由為兩種檢測法使用不同用於測定的抗原一Biacore利用可溶性抗原而FACs分析則利用細胞結合型抗原。第二種理由為受測抗體係培養用於對抗細胞結合型抗原因此可能無法如其與細胞結合抗原以高親和力結 15 合至可溶性抗原。表21·利用FACS的結合親和力分析抗饉 KD (nM) 95%信心區間(皮克分子） sc 188 51.9 ±22.7 實例19 CDC檢測法上述實例的純化抗體為同種型坨〇1因此具有效應基因的功能。為了測定這些抗體對介導補體依賴細胞毒性作用 (CDC)，利用穩定表現〇： v卢6 (293-1〇aii)和親代293細胞 115 200815474 (293F)的293細胞進行下列的檢測。、、’田胞進行句黃綠素(calcein)染色時，分別將HT29、293-10A11和293F細胞約25xl〇e6的等分個別再懸浮於3毫升無血清RPMI培養液内。將45微升之1毫克分子約黃綠素加至 5各3毫升的細胞樣本，然後在37°C將該樣本培養45分鐘。在 1200x rpm將細胞離心3分鐘，捨棄上清液然後將細胞再懸浮於各自的細胞株培養液内。重複離心步驟然後再懸浮細胞而獲得50微升培養液内約1〇〇,〇〇〇個細胞的終濃度。在V底96孔平板内製備各抗體的1 : 2系列稀釋液，其在 10 50微升體積内的濃度為從2〇微克/毫升至〇·625微克/毫升。然後，將如上述製備之50微升内的100,000個細胞加入含抗體平板内，然後將獲得的混合物在冰上培養2小時。在培養之後，粒化該細胞及捨棄其上清液。將細胞再懸浮於1〇〇微升之含10%人類血清(ΑΒΙ供體#27)的各自培養液内，然後在 37°C下培養30分鐘。接著離心細胞，然後將80微升的上清液轉置於FMAT平板。利用485奈米的激化波長及53〇奈米的發射波長在Tecan判讀機上讀取該平板。獲得的結果摘錄於第3A〜3E圖，其證明各受測的純化抗體可介導穩定表現aV/3 6整合素之293細胞的cdc。 20 實例20 定點突變製備自該免疫（實例1)的其一抗體(sc 264)顯示在TGF 冷LAP結合抑制試驗中可阻斷其活體外的功能活性(請看實例4)，但是呈現結合至表現細胞株之非-aV点6的交又反靡 116 200815474 (請看實例15)此sc 264抗體在CDR3區内具有一RGD序列，其被認為負責交叉反應的結合。因此，定點突變被用於以丙胺酸(sc 264 RAD)取代RGD内的甘胺酸殘基。次級抗體（sc 188)具有FR3區内的糖基化位點。此位置 5 經由從NLT至KLT(sc 188 SDM)取代作用的定點突變被消除。然後如實例7和8所述表現和純化此兩種抗體的突變株，以及如下列實例所述分析該純化抗體。實例21 測定突變抗體之交叉反應性結合的結合試驗 10 進行一結合試驗以測定是否由於SC 264的定點突變而減少如實例15中所觀察到的交叉反應性結合。在293T和 2 9 3 F細胞株上分析抗體的結合以測定從s c 264移除該R G D 位點與原始抗體比較是否導致其結合的減少。收集後離心293T和293F細胞及再懸浮於含1% BSA、1 15毫克分子CaCl2和1毫克分子MgCl2的HBSS(洗滌緩衝液) 内，因而各反應中使用至少150,000個細胞。細胞在V底96 孔平板(Sarstedt)内的反應中被分開，然後在15〇〇 rpm將平板内細胞粒化3分鐘，之後移除其HBSS上清液。以表19中所示的濃度加入體積50微升的初級抗體，及再懸浮該細胞 20 之後在冰上培養60分鐘。培養後，在1500 rpm離心下將該細胞粒化3分鐘，再懸浮於1〇〇微升的洗滌緩衝液内，然後再次粒化。然後再懸浮細胞於2微克/毫升含1〇微克/毫升 7AAD的適當次級抗體内，及在冰上染色7分鐘，之後加入 150微升的洗滌缓衝液，並在15〇〇 rpm下將細胞粒化3分鐘 117 200815474 然後再懸浮於100微升含1%BSA的HBSS内◦在配置HTS的 FACS儀上判讀樣本及利用Cell Quest Pro軟體分析數據。其結果摘錄於表22,以及資料以任意單位的幾何平均偏移值表示。這些數據顯示與原始mAb sc 264比較sc 264 RAD的 5 全部受測濃度與親代293T細胞的結合明顯較少。表22.突變抗醴對親代細胞的交叉反應性抗髏濃度(微克/毫升） 293T細胞 293T_aViS6 細胞無無 3 2 小白鼠IgG2a 20 27 8 人類IgGl 20 4 4 抗-aVb6 20 4 5 sc 264 20 433 6673 sc 264 RAD 20 44 7241 sc 188 20 27 6167 sc 188 SDM 20 25 6758 sc 264 5 88 6418 sc 264 RAD 5 13 6840 sc 188 5 9 5822 sc 188 SDM 5 9 6822 sc 264 1.25 24 6230 sc 264 RAD 1.25 7 4890 sc 188 1.25 6 6395 sc 188 SDM 1.25 5 4532 實例22 突變抗艎的效力分析下列試驗係為測定抑制TGF /3 LAP-介導HT-29細胞黏 118 10 200815474 附作用所需突變a V；56抗體的濃度(ic50)。以50微升之10微克/毫升的TGF Betal LAP(TGFySLAP) 將Nunc MaxiSorp(Nunc)平板覆蓋隔夜，然後在試驗前以3% BSA/PBS預阻斷1小時。然後粒化生長至最適密度的HT29 5 細胞及在HBBS(含1% BSA、1毫克分子Ca2+和1毫克分子 Mg2+的）清洗兩次，之後以每孔30,000個細胞將細胞再懸浮於HBSS内。從平板移除該覆蓋液體，然後在室溫下以1〇〇微升之3%BSA阻斷1小時之後以PBS清洗兩次。在30微升終體積和兩倍終濃度的1 : 4系列稀釋液内製 10備抗體滴定液。必需小心操作以確保對照孔内的p b S濃度符合袁大稀釋抗體孔内的PBS濃度。各孔加入30微升的細胞，及存在抗體的4。(：下將細胞在V底平板内培養40分鐘。將細胞-抗體混合物轉置該覆蓋平板然後在37°c下將平板培養 40分鐘。在溫熱HBSS内將覆蓋平板上的細胞清洗四次，之 15後在-8()C下將該細胞冷凍15分鐘。在室溫下解凍該細胞，然後根據製造商的指示各孔内加入1〇〇微升的CyQuant染料 /溶解緩衝液(Molecular Probes)。在485奈米的激化波長及在 530奈米的發射波長下讀取螢光。該12種抗體的結果摘錄於表23,以及其證明突變抗體的^%始終低於其各原始抗體。 20 119 200815474 表23·抑制TGF/SLAP·介導HT29細胞黏附作用所需突變抗體的濃度(IC50) n=l(奈克/毫升） n=2(奈克/毫升） n=3(奈克/毫升） sc 264 113 96 55 sc 264 RAD 13 13 39 sc 264 57 89 46 sc 188 125 157 64 scl88SDM 22 24 67 實例23 5突變抗體對α 4点1整合素的交叉反應性為建立該突變抗體僅具有對抗aV/36整合素而非α4 冷1整合素的功能，進行下列試驗以測定該抗體對抑制1677 細胞黏附至纖連蛋白之CS-1肽的能力。依照下述方法進行此試驗。 10 以纖連蛋白之CS-1肽覆蓋檢測板。試驗之前以3〇/〇 BSA/PBS將檢測板預阻斷丨小時。使該j6.77細胞生長至飽滿的程度，然後從培養瓶中取出、粒化及以HBSS清洗三次。然後以每孔30,000個細胞的濃度將該細胞再懸浮於hbss 内。取出含有該纖連蛋白片斷的覆蓋液，然後在室溫下以 15 1〇〇微升之3%BSA阻斷丨小時。在30微升終體積和兩倍終濃度的1 : 4系列稀釋液内製備抗體滴定液。在v底平板内將該再懸浮細胞加入含滴定抗體的孔内，然後在下將細胞和抗體共同培養40分鐘。將細胞_抗體混合物轉置於覆蓋平板及在37°C下將其培養40分鐘。接著將覆蓋平板上的細胞在 120 200815474 溫熱HBSS内清洗四次，以及平板内的細胞在_g〇c>c下冷涞 15分鐘。在室溫下解凍該細胞，然後根據製造商的指示各孔内加入100微升的CyQuant染料/溶解緩衝液（Μ〇丨ecular Probes)。在485奈米的激化波長及在530奈米的發射波長下 5 讀取螢光。兩種突變抗體及其非突變副本的結果摘錄於表24。使用市售卢1整合素專一性抗體作為此試驗中的陽性對照，其呈現95%的黏附抑制作用。使用市售v卢6專一性抗體作為此試驗中黏附至α 4点1的陰性對照。全部抗體係使用$微 10 克/毫升以及無任何受測抗體可阻斷至α4/31的黏附作用。表24·對〇：4石1整合素的交又反應性 5微克/毫升之抗體抑制百分比 sc 188 2 scl88SDM -6 sc 264 -30 sc 264 RAD -2 人類IgGl 26 人類IgG2 13 ' 人類IgG4 15 ' 抗冷1整合素 95 實例24 突變抗艎對α 5石1整合素的交叉反應性 15 為建立該突變抗體僅具有對抗ανθ6整合素而非整合素的功能’進行下列試驗以測定該抗體對抑制&562細 121 200815474 胞黏附至纖連蛋白的能力如實例14所述進行此試驗。其結果摘錄於表25，及其證明無任何受測抗體可阻斷至a 5/S 1的黏附作用。表25.對a5y51整合素的交又反應性 5微克/毫升之抗艘抑制百分比 sc 188 -5 scl88SDM -8 sc 264 3 sc 264 RAD 6 a V；S6對照 -16 α 5/31對照 78 人類IgG對照 -12 sc 188 -5 實例25 突變抗醴對小白鼠和彌猴aV/S 6整合素的交又反應性為了測定突變a V/36-專一性抗體對小白鼠a V06或彌猴aV卢6是否具有交叉反應性，進行下列的試驗。 1〇收集後離心可表現彌猴或小白鼠aV卢6的Κ562親代細胞或Κ562細胞，然後再懸浮於含1% BSA、1毫克分子 CaCl々l毫克分子MgCl2的HBSS(洗滌緩衝液）的HBSS内而使其在各反應中使用至少15〇,〇〇〇個細胞。細胞在V底96孔平板(Sarstedt)内的反應中被分開，然後在1500 rpm將平板 15内細胞粒化3分鐘，之後移除其HBSS上清液。加入體積5〇微升的初級抗體，及再懸浮該細胞之後在冰上培養60分 122 200815474 鐘。培養後，在1500 rpm離心下將該細胞粒化3分鐘，再懸浮於100微升的洗滌緩衝液内，然後再次粒化。然後再懸浮細胞於2微克/毫升之含10微克/毫升7AAD的適當次級抗體内，及在冰上染色7分鐘，之後加入150微升的洗滌缓衡液， 5 並在1500 rpm下將細胞粒化3分鐘然後再懸浮於1〇〇微升之含1% BSA的HBSS内。在配置HTS的FACS儀上判讀樣本及利用Cell Quest Pro軟體分析婁丈據。其結果摘錄於表26，以及資料以任意單位的幾何平均偏移值表示。這些數據證明在受測濃度時，sc 264 RAD和sc 188 SDM呈現對小白鼠和 10 彌猴α V/3 6的交叉反應性。表26·與小白鼠和摘猴aV彡6的交又反應性抗« 親代小鼠aV)86 mmavβ6 單獨細胞 3 3 3 Gt抗小白鼠 5 6 7 抗 α V 6 15 122 84 抗αν 109 144 163 抗冷6 26 43 37 小白鼠IgG2a 23 36 25 小白鼠IgGl 12 20 13 Gt抗人類 7 12 7 人類IgGl 46 108 54 sc 133 57 246 154 sc 188 55 227 139 sc 188 SDM 47 219 142 sc 254 98 260 190 sc 264 33 160 121 sc 264 RAD 48 196 139 sc 298 33 150 97 123 200815474 實例26 内在化的檢測利用穩定表現人類α V/3 6的K562細胞株測試突變抗體的内在化。如實例15所述進行此試驗。將該純化抗體的 5 内化作用與不被此試驗所内化的市售aV/3 6抗體相比較。其結果摘錄於表27，以及證明sc 264 RAD突變抗體的内化明顯低於非突變sc 264。表27.内在化檢測的摘要

抗《濃度(微克/毫升）内化百分比 sc 264 sc 264 sc 264 RAD sc 264 RAD sc 188 sc 188 scl88SDM scl88SDM 10 實例27 利用FACS之sc 264 RAD的結合親和力分析如實例18所述測定sc 264 RAD對aVyS6的結合親和力。此檢測的結果摘錄於表28，以及證明sc 264 RAD抗體的結合親和力<50皮克分子。 124 15 200815474 表28.利用FACS的結合親和力分析 mAb樣本 KD(pM) 95。/。信心區間(pM) sc 264 RAD 46.3 ±15.9 實例28 sc 264 RAD舆sc 264 RAD/ADY的結合親和力比較 5 利用Detroit-562黏附試驗比較sc 264 RAD抗體與sc 264 RAD之胚系序列（GL)(在輕鏈内含突變A84D)、sc 264 RAD/ADY的活性。在4°C下以0.5微克/毫升GST-TGF-b LAP融合蛋白將平板覆蓋隔夜以及隔日早晨洗滌，然後以3% BSA/PBS阻斷1 10小時。在含2毫克分子MgClM HBSS内使Detroit-562細胞(每孔25,000個細胞)黏附至平板45分鐘。在45分鐘之後於PBS 内將該平板清洗三次，然後於乙醇内固定。以Hoescht染色使細胞呈色’然後在CellomicsArrayscanll上以計算每孔細胞的結合數目進行定量。 15 此數據列於第5圖，其顯示sc 264 RAD和sc 264 RAD/ADY均具有類似的活性以及在修飾抗體内可維持阻斷aV/5 6功能的能力。實例29 生長試驗 20 其建立係在體内分別測定抗體264 RAD、133和188 SDM阻斷a V/S 6功能以抑制α VyS 6陽性腫瘤異種移植物的能力。Detroit-562鼻咽細胞株為此類模式中之一，其可表 125 200815474 現α V /5 6並且其生長亦如皮下腫瘤異種移植物。將Detroit-562細胞培養於含Earle’s BSS和2毫克分子 L-Glu+1.0毫克分子丙酮酸鈉、0.1毫克分子NEAA+1.5克/ 升重碳酸鈉+ 10%FBS的EMEM内。收獲細胞然後再懸浮於 5 50% PBS+50%基質凝膠内。接著以每隻小白鼠5χ1〇-6的〇1 毫升將該懸浮液植入右肋腹。動物為6〜8週齡的NCR雌裸鼠。當腫瘤達到0.1立方釐米時開始投與以及在試驗期間每週一次投與20毫克/公斤。全部三種抗體均可抑制腫瘤的生長(請看第4圖）。其中 10以264 RAD最為有效，其次為133和188。此數據清礎顯示抗體264 RAD、133和188在體内具有活性以及能減少依賴 aV/5 6信號之腫瘤的生長。依據參考文獻的引用此處引述的全部參考文件包括補、專财請案、^ 15 20 告、參考書等，及其所引述的參考文獻均儘量完整併入力此以供參照。等效物上述書面專利說明書被認為已足夠提供熟習本術者4 行本發明。發明者著重於上述的描述和詳述本發明某叫佳具體實施卿及料其最佳料的f例。“，應_ 不論上文中如何地詳盡說明，仇仍可利用許多不同的方法淨執行而必需推論本發明係根攄I査累〃專利申請範圍附件及其何的相等物。 126 200815474

FR4 WGQGTTVT V5S WGQGTTVT VS5 WGQGTTVT VSS WGQGTTVT VSS WGQGTTVT VSS WGQGTTVT 1 VSS CDR3 VATGRADYH FYAMDV VATGRADYH FYAMDV EGPLRGDVY YGLDV RLDV RLDV RLDV FR3 RVTISVDTSKNQFSLKLS SVTAADTAVYYCAR RVTISVDTSKNQFSLKLS SVTAADTAVYYCAR RVTISVDTSKKQFSLKLT SVTAADTAVYYCAR RVTMTRDTSTSTAYMELS RLRSDDTAVYVCAR RVTLTRDTSTSTAYMEL S RLRSDDTAVYYCAR RVTMTRDTSTSTAYMELS RLRSDDTAVYYCAR CDR2 YIYYSGRTYNNP SLKS YIYYSGRTYNNP SLKS VIYYSGSTSYNP SLKS WINPKSGDTNYA QKFQG WINPKSGDTNYA QKFQG WINPKSGDTNYA QKFQG FR2 WIRQHPGKGLEWIG WIRQHPGKGLEWIG WIRQHPGNGLEWIG WVRQAPGQGLEWMG WVRQAPGQGLEWMG WVRQAPGQGLEWMG CDR1 GGSISSG GYYWS GGSISSG GYYWS GGSISSG VYYWT GYTFTGY YMH GYTFTGY YMH GYTFTGY YMH FR1 QVQLQESGPGLVK PSQTLSLTCTVS QVQLQESGPGLVK PSQTLSLTCTVS QVQLQESGPGLVK 1 PSQTLSLTCTVS QVQLVQSGAEVKK PGASVKVSCKAS QVQLVQSGAEVKK PGASVKVSCKAS QVQLVQSGAEVKK PGASVKVSCKAS m LA in jH σι m 〇 00 sc 264 RAD j sc 264 RAD/ADY sc 188 SDM sc 133 TMT m CQ sc 133 TMT/WDS

FR4 FGGGTKLT VL FGGGTKLT VL FGQGTKVE IK FGTGTKVT VL FGTGTKVT VL FGTGTKVT VL CDR3 YSAADNNLV ! YSAADNNLV QQYGSSPRT 1 GTWNSSLSA GW GTWDSSLSA GW GTWDSSLSA GW FR3 GIPERFSGSSSGTTVTLT ISGAQVEDEAAYYC | GIPERFSGSSSGTTVTLT ISGAQVEDEADYYC GIPDRFSGSGSGTDFTLT ISRLEPEDFAVYVC GIPDRFSGSKSGTSATLG ITGLQTGDEADVYC GIPDRFSGSKSGTSATLG ITGLQTGDEADYYC GIPDRFSGSKSGTSATLG ITGLQTGDEADYYC CDR2 KDSERPS KDSERPS GASSRAT DNNKRPS !- DNNKRPS DNNKRPS FR2 WFHQKPGQAPVLVI Y WFHQKPGQAPVLVI Y WYQQKPGQAPRPLI Y WYQQLPGTAPKLLI Y WYQQLPGTAPKLLI Y WYQQLPGTAPKLLI Y CDR1 , _. I SGDVLAK KSAR SGDVLAK KSAR RAGQTIS SRYLA SGSSSNI GNNWS ! SGSSSNI GNNYVS 1_ SGSSSNI GNNWS FR1 j SYELTQPSSVSV5 PGQTARITC SYELTQPSSVSVS PGQTARITC EIVLTQSPGTLSL SPGERATLSC I QSVLTQPPSVSAA PGQKVTISC QSVLTQPPSVSAA PGQKVTISC QSVLTQPPSVSAA PGQKVTISC ill 5； H CO m 00 ov 00 sc 264 RAD sc 264 RAD/ADY sc 188 SDM sc 133 TMT sc 133 WDS sc 133 TMT/WDS 127 200815474 【圖式簡單說明3 第1圖為純單株抗體結合至〇； V 0 6及阻止其結合至 GST-LAP肽之能力的曲線圖。第2A和2B圖為幾何平均螢光(GMf)之分子mAb濃度函 5 數所繪製的曲線圖，其用於測定其一抗體對穩定表現人類 aVyS6抗原之K562細胞的結合親和力。第2A圖為mAb 188 的親和力數據。第2B圖為mAb264 RAD的親和力數據。第3A〜3E圖為純單株抗體於穩定表現αν/3 6整合素之 293細胞内介導補體依賴性細胞毒性效應之能力的柱狀圖。 10 第4圖為利用Detroit·%2鼻咽細胞株之264RAD、133和 188SDM抗體抑制腫瘤生長能力的柱狀圖。第5圖為264 RAD264與RAD/ADY之活性比較的柱狀圖。【主要元件符號說明】 (無） 128 200815474 序列表

<110> AstraZeneca AB

Rinkenberger， Julie Foltz, Ian Alfred, Avril Barry, Simon Bedian， Vahe <120>關於aV)86整合素的抗體及其用途 <130> ASTR-012/01Paris Convention <150> US 60/835,559 <151> 2006-08-03 <160〉 97 <170〉 Patentln 3.4 版

> > > > 11 1x 2 2 2 2 < < V V 人6 A代 36DN現 <400〉 1 caggtgcagc acctgcactg cagcacccag tacaacccgt tccctgaagc ggagctatta tgcaggagtc tcgctggtgg ggaagggcct ccctcaagag tgacctctgt cgatttttgg gggcccagga ctccatcaga ggagtggatt tcgaattacc gactgccgcg agtgtttgac ctggtgaagc agtggtgatt gggaacatct atttcagtag gacacggccg tactggggcc cttcacagac actactggag attacagtgg ccacgtctag tgtattactg agggaaccct cctgtccctc ctggatccgc gagcacctac gaaccagttc tgcgagaggg ggtcaccgtc tcctca <2l0> 2 <2ll> 122 <2l2> PRT <2l3> 現代人 <400〉 2 60 120 180 240 300 360 366

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ala Gly Gly Ser He Arg Ser Gly 20 25 30 129 200815474

Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp He Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp lie Gly Asn He Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg lie Thr He Ser Val Ala Thr Ser Arg Asn Gin Phe 65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Gly Gly Ala lie Thr lie Phe Gly Val Phe Asp Tyr Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 3 <211> 324 <212> DNA <213>現代人 <400〉 3 60 120 180 240 300 324 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgtg cagttttggc caggggacca agctggagat caaa <210〉 4 <211> 108 <212〉 PRT <213>現代人 <400〉 4

Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15 130 200815474

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

He Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly He Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95

Cys Ser Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 5 <211> 366 <212〉 DNA <213>現代人 <400〉 5 60 120 180 240 300 360 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgtca tgagctgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggtgtg gatacagcta tggttaccta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctca <210〉 6 <211> 122 <212〉 PRT <213>現代人 <400〉 6 131 366 200815474

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala He Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Gly Val Asp Thr Ala Met Val Thr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 7 <211〉 324 <212〉 DNA <213〉現代人 <400〉 7 60 120 180 240 300 tcctatgagc tgacacagcc accctcggtg tcagtgtccc caggacaaac ggccaggatc acctgctctg gagatgcatt gccaaaaaaa tatgcttatt ggtaccagca gaagtcaggc caggcccctg tgctggtcat ctatgacgac agcaaacgac cctccgggat ccctgagaga ttctctggct ccagctcagg gacaatggcc accttgacta tcagtggggc ccaggtggag gatgaagctg actactactg ttactcaaca gacagcagtg gtaatcatag ggtgttcggc ggagggacca agctgaccgt ccta <210〉 8 <211> 108 132 324 200815474 <212〉 PRT <213〉現代人 <400> 8

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg He Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala 20 25 30

Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Gin Ala Pro Val Leu Val He Tyr 35 40 45

Asp Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly He Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Ala Gin Val Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ser Ser Gly Asn His 85 90 95

Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210〉 9 <211〉 369 <212〉 DNA <213>現代人 <220〉 <221>各種特徵 <222> (369)..(369) <223〉 n is a, c, g，或 t <400> 9 60 120 180 240 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac agcccgtcct tccaaggcca ggtcatcctc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagacatgat 133 300 360 200815474 369 gaaagtagtg gttattacta tgtttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc tcttcagcn <210〉 10 <211〉 123 <212> PRT <213〉現代人 <400〉 10

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15

Ser Leu Lys He Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp lie Gly Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly lie He Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60

Gin Gly Gin Val He Leu Ser Ala Asp Lys Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg His Asp Glu Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Val Phe Asp He Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210〉 11 <211〉 327 <212> DNA <213>現代人 <220〉 <221>各種特徵 <222〉（300)..(300) 134 60 200815474 <223〉 n is c 或 t <400〉 11 120 180 240 300 327 tcctatgagc tgacacaacc accctcggtg tcagtgtccc caggacaaac ggccaggatc acctgctctg gagatgcatt gccaaaaaaa tatgcttatt ggtaccagca gaagtcaggc caggcccctg ttctggtcat ctatgatgac atcaaacgac cctccgggat ccctgagaga ttctctggct ccagctcagg gacaatggcc accttgacta tcagtggggc ccaggtggag gatgaagctg actactactg ttactcaaca gacagcagtg gtaatcattg ggttttcttn ggcggaggga ccaagctgac cgtccta <210> 12 <211〉 109 <212> PRT <213>現代人 <400〉 12

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg lie Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala 20 25 30

Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Gin Ala Pro Val Leu Val He Tyr 35 40 45

Glu Asp He Lys Arg Pro Ser Gly He Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr He Ser Gly Ala Gin Val Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ser Ser Gly Asn His 85 90 95

Trp Val Phe Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105

<210〉 13 <211〉 339 <212> DNA 135 60 200815474 <213>現代人 <400〉 13 120 180 240 300 339 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacccta aaagtggtga cacaaactat gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccctg accagggaca cgtccaccag cacagcctac atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagaaggttg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc gtctcctca <210〉 14 <211> 113 <212〉 PRT <213〉現代人 <400〉 14

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp He Asn Pro Lys Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Arg Leu Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser 136 60 200815474 <210> 15 <211〉 330 <212> DNA <213>現代人 <400〉 15 120 180 240 300 330 cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aataattatg tatcctggta ccagcagctc ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc aggaattcct gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatggaata gcagcctgag tgctggttat gtcttcggaa ctgggaccaa ggtcaccgtc <210〉 16 <211> 110 <212〉 PRT <213〉現代人 <400〉 16

Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Lys Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Asn Asn 20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45

He Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly He Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asn Ser Ser Leu 85 90 95

Ser Ala Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val 100 105 110 137 200815474 <210> 17 <211> 375 <212> DNA <213〉現代人 <220> <221>各種特徵 <222〉（375)..(375) <223〉 n is a， c， g，或 t <400〉 17 60 120 180 240 300 360 375 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatat agtccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagacatggt atagcagcag ctggtttcta ctactactat atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc accgtctcct cagcn <210〉 18 <211> 125 <212〉 PRT <213〉現代人 <400> 18

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15

Ser Leu Lys He Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp lie Gly Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly He He Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60

Gin Gly Gin Val Thr He Ser Ala Asp Lys Ser He Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 138 200815474

Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg His Gly He Ala Ala Ala Gly Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp 100 105 110

Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 125 <210〉 19 <211> 327 <212〉 DNA <213〉現代人 <220〉 <221>各種特徵 <222〉（325)..(325) <223〉 n is a 或 c <220> <221>各種特徵 <222〉（327)..(327) <223〉 n is a, c， g，或 t <400〉 19 60 120 180 240 300 327 gaaattgtgt tgacgcagtc cccagacacc ctgtctttgt ctccagggga aagagcctcc ctctcctgca gggccagtca gaatgttaac aggaactact tagtctggta ccagcagaaa cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtacatcca acagggccac tggcatccca gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcag cagtgtggta gtttaccatt cactttcggc cctgggacca aagtggatat caaangn <210〉 20 <211〉 109 <212> PRT <213>現代人 <400〉 20

Glu He Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asn Val Asn Arg Asn 139 200815474 20 25 30

Tyr Leu Val Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Cys Gly Ser Leu Pro 85 90 95

Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp lie Lys Arg 100 105 人 2 A代 2137DN現 <210〉 <211〉 <212> <213〉 <400〉 21 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtgttt actactggac ctggatccgc 120 cagcacccag ggaacggcct ggagtggatt ggctacatct attacagtgg gagcacctcc 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaacagttc 240 tccctgaacc tgacctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagaa 300 ggaccactac ggggggacta ctactacggt ctggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360 accgtctcct ca 372 <210〉 22 <211> 124 <212〉 PRT <213〉現代人 <400〉 22

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15 140 200815474

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser He Ser Ser Gly 20 25 30

Val Tyr Tyr Trp Thr Trp He Arg Gin His Pro Gly Asn Gly Leu Glu 35 40 45

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Leu Lys Ser Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gin Phe 65 70 75 80

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Cys Ala Arg Glu Gly Pro Leu Arg Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp 100 105 110

Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 23 <211〉 324 <212〉 DNA <213〉現代人 <400〉 23 60 120 180 240 300 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gggccggtca gactattagc agtcgctact tagcctggta ccagcagaaa cctggccagg ctcccaggcc cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcg gacgttcggc caagggacca aggtggaaat caaa <210〉 24 <211〉 108 <212> PRT <213〉現代人 <400〉 24 141 324 200815474

Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Gin Thr He Ser Ser Arg 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Pro Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95

Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105 <210> 25 <211> 384 <212> DNA <213〉現代人 <400〉 25 60 120 180 240 300 360 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggcca tgtattactg tgcgagatat cgaggaccag cggctgggcg gggagacttc tactacttcg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctca <210〉 26 <211〉 128 <212〉 PRT <213>現代人 142 384 200815474 <400> 26

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lie Ser Ser Gly 20 25 30

Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp lie Gly Tyr lie Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Tyr Arg Gly Pro Ala Ala Gly Arg Gly Asp Phe Tyr Tyr 100 105 110

Phe Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210〉 27 <211〉 339 <212〉 DNA <213>現代人 <220〉 <221>各種特徵 <222〉（312)..(312) <223〉 n is c 或 t <400〉 27 60 120 180 gatattgtga tgacccagac tccactctct ctgtccgtca cccctggaca gccggcctcc atcttctgca agtctagtca gagcctcctg aacagtgatg gaaagaccta tttgtgttgg tacctgcaga agccaggcca gcctccacag ctcctgatct atgaagtttc caaccggttc tctggagtgc cagataggtt cagtggcagc gggtcaggga cagatttcac actgaaaatc 143 240 300 200815474 339 agccgggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaggtat acagcttccg tgggcgttct tnggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaa <210> 28 <211〉 113 <212> PRT <213〉現代人 <400〉 28

Asp He Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 15 10 15

Gin Pro Ala Ser lie Phe Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Cys Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Pro 35 40 45

Pro Gin Leu Leu He Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Gly 85 90 95 lie Gin Leu Pro Trp Ala Phe Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He 100 105 110

Lys <210〉 29 <211〉 383 <212〉 DNA <213>現代人 <400> 29 60 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 144 120 180 200815474 240 300 360 383 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagaacctac aacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc tccctgaagt tgagttctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagtg gctacgggga gaggggacta ccacttctac gctatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctcagcctc cac <210> 30 <211> 125 <212〉 PRT <213〉現代人 <400〉 30

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser He Ser Ser Gly 20 25 30

Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp He Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp He Gly Tyr He Tyr Tyr Ser Gly Arg Thr Tyr Asn Asn Pro Ser 50 55 60

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Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Val Ala Thr Gly Arg Gly Asp Tyr His Phe Tyr Ala Met 100 105 110

Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

<210〉 31 <211〉 318 <212〉 DNA 145 60 200815474 <213〉現代人 <400〉 31 120 180 240 300 318 tcctatgagc tgacacagcc atcctcagtg tcagtgtctc cgggacagac agccaggatc acctgctcag gagatgtact ggcaaaaaag tctgctcggt ggttccacca gaagccaggc caggcccctg tactggtgat ttataaagac agtgagcggc cctcagggat ccctgagcgc ttctccggct ccagctcagg gaccacagtc accttgacca tcagcggggc ccaggttgag gatgaggctg cctattactg ttactctgcg gctgacaaca atctggtatt cggcggaggg accaagctga ccgtccta <210〉 32 <211> 106 <212> PRT <213〉現代人 <400〉 32

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Ser Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg lie Thr Cys Ser Gly Asp Val Leu Ala Lys Lys Ser Ala 20 25 30

Arg Trp Phe His Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val He Tyr 35 40 45

Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly He Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr He Ser Gly Ala Gin Val Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Ala Tyr Tyr Cys Tyr Ser Ala Ala Asp Asn Asn Leu Val 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105

<210〉 33 <211> 354 <212〉 DNA 146 60 200815474 <213〉現代人 <400> 33 120 180 240 300 354 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc tcctgtaagg gttctggata cagctttccc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg cccgggaagg gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagctgaca agtccatcag caccgcctac ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagacaccct atggaggacg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctca <210〉 34 <211〉 118 <212〉 PRT <213〉現代人 <400> 34

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15

Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Ser Tyr 20 25 30

Trp He Gly Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly He lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60

Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser He Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg His Pro Met Glu Asp Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser 115 147 60 200815474 <210> 35 <211〉 321 <212> DNA <213>現代人 <400〉 35 120 180 240 300 321 tcctatgagc tgacacagcc accctcggtg tcagtgtccc caggacaaac ggccaggatc acctgctctg gagatgcttt gccaaaaaaa tatgcttttt ggtaccagca gaagtcaggc caggcccctg tgctggtcat ctatgacgac aacaaacgac cctccgggat ccctgagaga ttctctggct ccagctcagg gacaatggcc accttgacta tcactggggc ccaggtggag gatgaagctg actactactg ttactcaaca gacagcagtg gtcatcatgt attcggcgga gggaccaagc tgaccgtcct a <210> 36 <211〉 107 <212> PRT <213>現代人 <400〉 36

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg He Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala 20 25 30

Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Gin Ala Pro Val Leu Val He Tyr 35 40 45

Asp Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly He Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr He Thr Gly Ala Gin Val Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ser Ser Gly His His 85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 148 60 200815474 <210〉 37 <211> 375 <212〉 DNA <213>現代人 <400〉 37 f \ 120 180 240 300 360 375 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg gtggaagtaa taaatactat gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatctg gcagctcgtc ggggggacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctca <210〉 38 <211〉 125 <212〉 PRT <213>現代人 <400〉 38

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

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Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 149 200815474

Ala Arg Asp Leu Ala Ala Arg Arg Gly Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110

Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210〉 39 <211〉 321 <212〉 DNA <213〉現代人 <400〉 39 60 120 180 240 300 321 tcttctgagc tgactcagga ccctgttgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc acttgccaag gcgacagcct cagaagctat tatttaagct ggtaccagca gaagccagga caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccga ttctctggct ccaactcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa gatgaggctg actattactg taattcccgg gacagcagtg gtaaccatct gttcggcgga gggaccaagc tgaccgtcct a <210〉 40 <211> 107 <212〉 PRT <213>現代人 <400〉 40

Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Val Val Ser Val Ala Leu Gly Gin 15 10 15

Thr Val Arg lie Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Leu 20 25 30

Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr lie Thr Gly Ala Gin Ala Glu 65 70 75 80 150 200815474

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His 85 90 95

Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210〉 41 <211〉 375 <212〉 DNA <213〉現代人 <220> <221>各種特徵 <222> (81)..(81) <223〉 n is c 或 t <220〉 <221>各種特徵 <222> (90)..(90) <223〉 n is a， c， g，或 t <220〉 <221>各種特徵 <222> (105)..(105) <223〉 n is c 或 t <220〉 <221>各種特徵 <222> (300)..(300) <223> n is a， c， g，或 t <400〉 41 60 120 180 240 300 360 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggata naccttcacn aactatatca tgcantgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtatta gtagtagtta catatactac gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatccn gtaccactgg aacgacgcga ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctca <210〉 42 <211〉 125 <212> PRT <213> 現代人 151 375 200815474 <400〉 42 Glu Va: ί Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 He Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser lie Ser lie Ser Ser Ser Tyr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Val Pro Leu Glu Arg Arg Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Va: ί Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210〉 43 <211〉 330 <212> DNA <213〉現代人 <400〉 43 60 120 180 240 300 cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcaatg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aataattatg tatcctggta ccagcagctc ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgag cgctggggta ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 152 330 200815474 <210〉 44 <211〉 110 <212〉 PRT <213〉現代人 <400〉 44

Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Met Ser Ala Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Lys Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Asn Asn 20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly lie Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95

Ser Ala Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 45 <211> 375 <212〉 DNA <213〉現代人 <400> 45 60 120 180 240 300 360 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactac gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaacggag ggtatagcag ctcgtctcta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctca 153 375 200815474 <210〉 46 <211〉 125 <212〉 PRT <213>現代人 <400〉 46

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Val lie Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Thr Glu Gly lie Ala Ala Arg Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110

Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210〉 47 <211〉 324 <212〉 DNA <213>現代人 <400〉 47 60 120 180 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tgacatccca gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 154 240 300 200815474 324 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgtg gacgttcggc caagggacca aggtggaaat caaa <210> 48 <211> 108 <212> PRT <213>現代人 <400〉 48

Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Asp lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 49 <211> 111 <212> PRT <213〉現代人 <400〉 49

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 155 200815474

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Ala Arg Arg Leu Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 50 <211〉 123 <212〉 PRT <213>現代人 <400〉 50

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ser He Ser Ser Ser Ser Ser Tyr He Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Val Gin Leu Glu Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 156 200815474 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 51 <211> 121 <212〉 PRT <213〉現代人 <400〉 51

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

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Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Val Asp Thr Ala Met Val Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 52 <211〉 122 <212〉 PRT <213>現代人 <400〉 52

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 157 200815474 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

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Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg He Ala Ala Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 53 <211> 125 <212〉 PRT <213〉現代人 <400〉 53

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser He Ser Ser Gly 20 25 30

Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp He Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp lie Gly Tyr He Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 158 200815474

Leu Lys Ser Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Gly lie Ala Ala Ala Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110

Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210〉 54 <211> 119 <212〉 PRT <213>現代人 <400> 54

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lie Ser Ser Gly 20 25 30

Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp He Gly Tyr He Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr He Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg He Thr lie Phe Gly Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 159 200815474 <210〉 55 <211> 122 <212> PRT <213>現代人 <400〉 55

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lie Ser Ser Gly 20 25 30

Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp lie Gly Tyr lie Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Val Ala Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 56 <211> 121 <212〉 PRT <213>現代人 <400> 56

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lie Ser Ser Gly 20 25 30 160 200815474

Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp He Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp lie Gly Tyr lie Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Leu Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 57 <211> 120 <212〉 PRT <213>現代人 <400> 57

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15

Ser Leu Lys He Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr w 20 25 30

Trp lie Gly Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly He lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60

Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser He Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 161 200815474

Ala Arg Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Ala Phe Asp He Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 58 <211> 113 <212〉 PRT <213>現代人 <400> 58

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15

Ser Leu Lys He Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp lie Gly Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60

Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser He Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 100 105 110

Ser <210〉 59 <211〉 123 <212〉 PRT <213>現代人 <400〉 59 162 200815474

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15

Ser Leu Lys He Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp He Gly Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly lie He Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60

Gin Gly Gin Val Thr He Ser Ala Asp Lys Ser He Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly lie Ala Ala Ala Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110

Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210〉 60 <211〉 112 <212〉 PRT <213>現代人

<400> 60

Asp He Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 15 10 15

Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Pro 35 40 45

Pro Gin Leu Leu lie Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 163 200815474

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Ser 85 90 95 lie Gin Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110 <210〉 61 <211> 108 <212〉 PRT <213〉現代人 <400〉 61

Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

He Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly He Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105 <210〉 62 <211> 108 <212〉 PRT <213>現代人 <400> 62 164 200815474

Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

He Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly He Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210〉 63 <211〉 109 <212> PRT <213>現代人 <400〉 63

Glu He Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

He Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 165 200815474

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95

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Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Lys Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Asn Asn 20 25 30

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly He Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95

Ser Ala Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val 100 105 <210〉 65 <211〉 110 <212〉 PRT <213〉現代人 <400> 65

Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gin 15 10 15 166 200815474

Lys Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Asn Asn 20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly He Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly He Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95

Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210〉 66 <211> 108 <212> PRT <213>現代人 <400〉 66

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg He Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala 20 25 30

Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Gin Ala Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45

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Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210〉 67 <211> 108 <212> PRT <213>現代人 <400〉 67

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg He Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala 20 25 30

Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Gin Ala Pro Val Leu Val He Tyr 35 40 45

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Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Ala Gin Val Glu 65 70 75 80

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Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 68 <211〉 108 <212> PRT <213>現代人 <400> 68

Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gin 15 10 15

Thr Val Arg lie Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 168 200815474

Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly He Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr lie Thr Gly Ala Gin Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His 85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210〉 69 <211〉 106 <212> PRT <213〉現代人 <400> 69

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Ser Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg lie Thr Cys Ser Gly Asp Val Leu Ala Lys Lys Tyr Ala 20 25 30

Arg Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45

Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly He Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr lie Ser Gly Ala Gin Val Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Ala Ala Asp Asn Asn Val Val 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 169 60 200815474 <210〉 70 <211> 372 <212〉 DNA <213>現代人 <400〉 70 120 180 240 300 360 372 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtgttt actactggac ctggatccgc cagcacccag ggaacggcct ggagtggatt ggctacatct attacagtgg gagcacctcc tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaacagttc tccctgaagc tgacctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagaa ggaccactac ggggggacta ctactacggt ctggacgtct ggggccaagg gaccacggtc accgtctcct ca <210〉 71 <211> 124 <212〉 PRT <213〉現代人 <400> 71

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser He Ser Ser Gly 20 25 30

Val Tyr Tyr Trp Thr Trp lie Arg Gin His Pro Gly Asn Gly Leu Glu 35 40 45

Trp lie Gly Tyr He Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

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Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Glu Gly Pro Leu Arg Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp 170 200815474 100 105 110

Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 72 <211〉 324 <212〉 DNA <213〉現代人； <400〉 72 60 120 180 240 300 324 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc • ctctcctgca gggccggtca gactattagc agtcgctact tagcctggta ccagcagaaa cctggccagg ctcccaggcc cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcg gacgttcggc caagggacca aggtggaaat caaa <210〉 73 <211> 108 <212〉 PRT <213>現代人 <400> 73

Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Gin Thr He Ser Ser Arg 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Pro Leu 35 40 45

He Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 171 200815474 85 90 95

Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210〉 74 <211> 375 <212〉 DNA <213〉現代人 <400〉 74 60 120 180 240 300 360 375 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagaacctac aacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc tccctgaagt tgagttctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagtg gctacgggga gagcggacta ccacttctac gctatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctca <210> 75 <211> 125 <212> PRT <213>現代人 <400〉 75

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser He Ser Ser Gly 20 25 30

Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp He Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp lie Gly Tyr He Tyr Tyr Ser Gly Arg Thr Tyr Asn Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr He Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80 172 200815474

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Val Ala Thr Gly Arg Ala Asp Tyr His Phe Tyr Ala Met 100 105 110

Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210〉 76 <211> 318 <212> DNA <213>現代人 <400〉 76 60 120 180 240 300 318 tcctatgagc tgacacagcc atcctcagtg tcagtgtctc cgggacagac agccaggatc acctgctcag gagatgtact ggcaaaaaag tctgctcggt ggttccacca gaagccaggc caggcccctg tactggtgat ttataaagac agtgagcggc cctcagggat ccctgagcgc ttctccggct ccagctcagg gaccacagtc accttgacca tcagcggggc ccaggttgag gatgaggctg cctattactg ttactctgcg gctgacaaca atctggtatt cggcggaggg accaagctga ccgtccta <210〉 77 <211> 106 <212〉 PRT <213〉現代人 <400〉 77

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Ser Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg He Thr Cys Ser Gly Asp Val Leu Ala Lys Lys Ser Ala 20 25 30

Arg Trp Phe His Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val He Tyr 35 40 45

Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly He Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 173 200815474

Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr lie Ser Gly Ala Gin Val Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Ala Tyr Tyr Cys Tyr Ser Ala Ala Asp Asn Asn Leu Val 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 78 <211〉 339 <212〉 DNA <213〉現代人 <400> 78 60 120 180 240 300 339 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacccta aaagtggtga cacaaactat gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccaccag cacagcctac atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagaaggttg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc gtctcctca <210〉 79 <211〉 113 <212〉 PRT <213>現代人 <400〉 79

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp He Asn Pro Lys Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60 174 200815474

Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Arg Leu Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 100 105 110

Ser <210> 80 <211> 333 <212〉 DNA <213>現代人 <400〉 80 60 120 180 240 300 333 cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aataattatg tatcctggta ccagcagctc ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc aggaattcct gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatggaata gcagcctgag tgctggttat gtcttcggaa ctgggaccaa ggtcaccgtc eta <210> 81 <211> 111 <212〉 PRT <213>現代人 <400〉 81

Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Lys Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Asn Asn 20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 175 200815474 lie Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly lie Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asn Ser Ser Leu 85 90 95

Ser Ala Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 82 <211> 339 <212〉 DNA <213>現代人 <400> 82 60 120 180 240 300 339 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacccta aaagtggtga cacaaactat gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccctg accagggaca cgtccaccag cacagcctac atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagaaggttg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc gtctcctca <210> 83 <211〉 113 <212> PRT <213〉現代人 <400> 83

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 176 200815474

Gly Trp He Asn Pro Lys Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Arg Leu Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 100 105 110

Ser <210> 84 <211〉 333 <212> DNA <213>現代人 <400〉 84 60 120 180 240 300 333 cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aataattatg tatcctggta ccagcagctc ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc aggaattcct gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgag tgctggttat gtcttcggaa ctgggaccaa ggtcaccgtc eta <210> 85 <211〉 111 <212〉 PRT <213>現代人 <400> 85

Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Lys Val Thr He Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn He Gly Asn Asn 20 25 30 177 200815474

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly He Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95

Ser Ala Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 86 <211> 339 <212〉 DNA <213>現代人 <400> 86 60 120 180 240 300 339 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacccta aaagtggtga cacaaactat gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccaccag cacagcctac atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagaaggttg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc gtctcctca <210> 87 <211〉 113 <212〉 PRT <213>現代人 <400> 87

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 178 200815474

Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp lie Asn Pro Lys Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Arg Leu Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 100 105 110

Ser <210> 88 <211> 333 <212> DNA <213>現代人 <400〉 88 cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aataattatg tatcctggta ccagcagctc ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc aggaattcct

60 120 180 240 300 333 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgag tgctggttat gtcttcggaa ctgggaccaa ggtcaccgtc eta <210〉 89 <211> 111 <212〉 PRT <213>現代人 <400> 89

Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gin 15 10 15 179 200815474

Lys Val Thr He Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn He Gly Asn Asn 20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45

He Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly He Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95

Ser Ala Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210〉 90 <211〉 383 <212〉 DNA <213〉現代人 <400> 90 60 120 180 240 300 360 383 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagaacctac aacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc tccctgaagt tgagttctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagtg gctacgggga gaggggacta ccacttctac gctatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctcagcctc cac <210〉 91 <211〉 125 <212〉 PRT <213>現代人 <400〉 91

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15 180 200815474

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser He Ser Ser Gly 20 25 30

Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp He Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp He Gly Tyr lie Tyr Tyr Ser Gly Arg Thr Tyr Asn Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr He Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Val Ala Thr Gly Arg Gly Asp Tyr His Phe Tyr Ala Met 100 105 110

Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210〉 92 <211> 318 <212> DNA <213>現代人 <400〉 92 60 120 180 240 300 tcctatgagc tgacacagcc atcctcagtg tcagtgtctc cgggacagac agccaggatc acctgctcag gagatgtact ggcaaaaaag tctgctcggt ggttccacca gaagccaggc caggcccctg tactggtgat ttataaagac agtgagcggc cctcagggat ccctgagcgc ttctccggct ccagctcagg gaccacagtc accttgacca tcagcggggc ccaggttgag gatgaggctg actattactg ttactctgcg gctgacaaca atctggtatt cggcggaggg accaagctga ccgtccta <210〉 93 <211〉 106 <212〉 PRT <213>現代人 181 318 200815474 <400> 93

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Ser Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg He Thr Cys Ser Gly Asp Val Leu Ala Lys Lys Ser Ala 20 25 30

Arg Trp Phe His Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45

Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr lie Ser Gly Ala Gin Val Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Ala Ala Asp Asn Asn Leu Val 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210〉 94 <211> 375 <212〉 DNA <213>現代人 <400〉 94 60 120 180 240 300 360 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagaacctac aacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc tccctgaagt tgagttctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagtg gctacgggga gagcggacta ccacttctac gctatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctca

<210〉 95 <211> 125 <212〉 PRT 182 375 200815474 <213>現代人 <400〉 95

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser He Ser Ser Gly 20 25 30

Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp He Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp lie Gly Tyr lie Tyr Tyr Ser Gly Arg Thr Tyr Asn Asn Pro Ser 50 55 60 r \

Leu Lys Ser Arg Val Thr He Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Val Ala Thr Gly Arg Ala Asp Tyr His Phe Tyr Ala Met 100 105 110

Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 96 <211〉 318 <212> DNA <213>現代人 <400〉 96 60 120 180 240 300 tcctatgagc tgacacagcc atcctcagtg tcagtgtctc cgggacagac agccaggatc acctgctcag gagatgtact ggcaaaaaag tctgctcggt ggttccacca gaagccaggc caggcccctg tactggtgat ttataaagac agtgagcggc cctcagggat ccctgagcgc ttctccggct ccagctcagg gaccacagtc accttgacca tcagcggggc ccaggttgag gatgaggctg actattactg ttactctgcg gctgacaaca atctggtatt cggcggaggg accaagctga ccgtccta 183 318 200815474 <210〉 97 <211〉 106 <212〉 PRT <213>現代人 <400〉 97

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Ser Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg He Thr Cys Ser Gly Asp Val Leu Ala Lys Lys Ser Ala 20 25 30

Arg Trp Phe His Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val He Tyr 35 40 45

Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr lie Ser Gly Ala Gin Val Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Ala Ala Asp Asn Asn Leu Val 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 184

Claims

200815474 十、申請專利範圍： 1 · 一種專一性結合至α V /3 6及抑制配體結合至α V万6的乾*向結合劑。 2·如申請專利範圍第1項之靶向結合劑，其中該靶向結合 5 劑抑制大於99%之TGF /3 -LAP介導的ΗΤ29細胞黏附作用。 3·如申請專利範圍第1項之靶向結合劑，其中該靶向結合劑以低於0.070微克/毫升之IC5〇抑制HT29細胞之TGF冷 -LAP介導黏附作用。 10 4·如申請專利範圍第1項之靶向結合劑，其中該靶向結合劑以低於35奈克分子(nM)的Kd結合a V0 6。 5·如申請專利範圍第1項之靶向結合劑，其中該靶向結合劑以低於25奈克分子(ηΜ)的Kd結合α V万6。 6·如申請專利範圍第1項之靶向結合劑，其中該靶向結合 15 劑以低於10奈克分子(ηΜ)的Kd結合α V /5 6。 7·如申請專利範圍第1項之靶向結合劑，其中該靶向結合劑以低於6 0皮克分子(ρ Μ)的K d結合α V万6。 8·如申請專利範圍第1項之靶向結合劑，其中該靶向結合劑係一單株抗體。 9·如申請專利範圍第8項之靶向結合劑，其中該靶向結合劑係一純人類單株抗體。 10·如申請專利範圍第9項之靶向結合劑，其中該靶向結合劑係sc 264 RAD、sc 264 RAD/ADY、sc 188 SDM、sc 133、sc ΤΜΤ、sc 133 WDS、sc 133 TMT/WDS、sc 188、 185 200815474 sc 254、sc 264或sc 298。 11.如申請專利範圍第1項之靶向結合劑，其中該靶向結合劑至少包含具有序列辨識編號：14之胺基酸98〜102的 VH CDR3。 5 12.如申請專利範圍第1項之靶向結合劑，其中該靶向結合劑至少包含具有序列辨識編號：22之胺基酸99〜113的 VH CDR3。 13. 如申請專利範圍第1項之靶向結合劑，其中該靶向結合劑至少包含具有序列辨識編號：26之胺基酸99〜117的 10 VH CDR3。 14. 如申請專利範圍第1項之靶向結合劑，其中該靶向結合劑至少包含具有序列辨識編號：30之胺基酸99〜114的 VH CDR3。 15. 如申請專利範圍第1項之靶向結合劑，其中該靶向結合 15 劑至少包含具有序列辨識編號：38之胺基酸97〜113的 VH CDR3。 16. 如申請專利範圍第1項之靶向結合劑，其中該靶向結合劑包含具有序列辨識編號：14的重鏈多肽。 17. 如申請專利範圍第1項之靶向結合劑，其中該靶向結合 20 劑包含具有序列辨識編號：22的重鏈多肽。 18. 如申請專利範圍第1項之靶向結合劑，其中該靶向結合劑包含具有序列辨識編號：26的重鏈多肽。 19. 如申請專利範圍第1項之靶向結合劑，其中該靶向結合劑包含具有序列辨識編號：30的重鏈多肽。 186 200815474 20·如申請專利範圍第1項之靶向結合劑，其中該靶向結合劑包含具有序列辨識編號：38的重鏈多肽。 21.如申請專利範圍第1項之靶向結合劑，其中該靶向結合劑包含具有序列辨識編號：71的重鏈多肽。 5 22·如申請專利範圍第1項之靶向結合劑，其中該靶向結合劑包含具有序列辨識編號：75的重鏈多肽。 23· —種結合αν々6的分離人類單株抗體，其中該抗體包含：包含CDR1、CDR2和CDR3序列的一重鏈可變區； 10 及包含CDR1、CDR2和CDR3序列的一重鏈可變區；其中該重鏈可變區CDR3序列包含一選自由序列辨識編號：14、序列辨識編號：22、序列辨識編號：26、序列 15 辨識編號：30或序列辨識編號·· 38、序列辨識編號：71、序列辨識編號：76、序列辨識編號：79，和其保守序列修飾物所構成之群組的胺基酸序列；以及該輕鏈可變區CDR3序列包含一選自由序列辨識編 >〇號：16、序列辨識編號：24、序列辨識編號：28、序列 "〇賴編號：32或序列辨識編號：40、序列辨識編號：85、序列辨識編號：93，和其保守序列修飾物所構成之馳的胺基酸序列。 24.如申請專利範圍第旧之把向結合劑，其係併用一醫藥上可接受載劑。 μ 187 200815474 25. 如申請專利範圍第1項之靶向結合劑，其中該靶向結合劑係一抗-aV/3 6抗體的純人類分離結合片斷。 26. —種編碼如申請專利範圍第1項之該靶向結合劑的核酸分子。 5 27. —種包含如申請專利範圍第26項之核酸分子的載體。 28. —種包含如申請專利範圍第27項之載體的宿主細胞。 29. —種治療動物體内惡性腫瘤的方法，其包含將治療有效量之如申請專利範圍第1項的該靶向結合劑投與至該需治療的動物。 10 30.如申請專利範圍第29項之方法，其中該動物為人類。 31.如申請專利範圍第29項之方法，其中該靶向結合劑係sc 264 RAD、sc 264 RAD/ADY、sc 188 SDM、sc 133、sc ΤΜΤ、sc 133 WDS、sc 133 TMT/WDS、sc 188、sc 254、 SC 264或SC 298的單株抗體。 15 32.如申請專利範圍第29項之方法，其中該惡性腫瘤係選自由下列疾病所組成之組群：黑色素瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膠質細胞瘤、肝細胞(肝)癌、甲狀腺瘤、胃腺（胃）癌、前列腺癌、乳癌、印巢癌、膀胱癌、肺癌、神經膠質母細胞瘤、子宮内膜癌、腎癌、結腸癌、胰腺 20 癌、食道癌、頭頸部癌症、間皮細胞瘤、惡性肉瘤、膽癌（膽管癌）、小腸腺癌、小兒腫瘤和鱗狀上皮癌。 33. —種治療發炎的方法，包含對需要治療的動物投與有效劑量之如申請專利範圍第1項之靶向結合劑。 34. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該動物係為人類。 188 200815474 35. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該靶向結合劑係為一純人類單株抗體。 36. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該靶向結合劑係與 a V/5 6結合。 5 37. —種阻止aV/3 6與其之配體相互作用之方法，包含使α V/3 6與如申請專利範圍第1項之靶向結合劑相接觸。 189