TW200800275A - Compositions containing magnetic iron oxide particles, and use of said compositions in imaging methods - Google Patents

Description

200800275 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於含有在醫藥學上可接受之殼中之多晶磁性 鐵氧化物粒子的複合物，且係關於此等組合物在磁性粒子 照影师）中的料。特別較佳係關於制此等組合物在 檢查胃腸道、心及顱部分之血管系統中，在診斷動脈硬 化、梗塞及例如淋巴系統之腫瘤與轉移中的用途。 【先前技術】 在照影方法中，尤其在t療診斷部n中，與諸如χ光診 斷及核磁共振照影（MRI)之習知照影方法相比，造影劑引 起相當大的改良。可用於MRI之造影劑可根據其作用機理 (正性放大或影響縱向弛豫或負性放大或影響橫向弛豫）加 以區分。此效應表示為^及^弛豫性，單位。 R!與R2定義為曲線l/Tl與1/丁2相對造影劑濃度上升之陡 度。RVR!比率確定造影劑是否主要具有1減少（Ri顯著高 於 R2)或 T2減少效應（Krombach 等人（2002) R5fo 174: 819-829)。正性造影劑（亦稱弛豫性增加或乃增加造影劑）增加 灌注區域之信號強度。負性造影劑（亦稱易感性增加或I 增加造影劑）減少T2加權序列中灌注區域信號強度。 適合之MRI造影劑已在先前技術中描述。例如，ερ 〇 525 199描述备有與多醣複合之磁性鐵氧化物粒子的醫藥 製劑以及其作為造影劑在MRI中之用途。在一較佳實施例 中’超順磁性鐵氧化物核心具有2 nm至3 0 nm之尺寸。在 適合之製劑中複合物（核心加多醣殼）之尺寸為1〇 nm至500 112634.doc 200800275 nm。然而，一特殊揭示内容僅擴展為具有直徑為i〇i 之鐵氧化物核心的複合物。EP 〇 543 〇2〇揭示極類似之粒 子。然而，在此情況下，該等超順磁性鐵氧化物粒子與羧 基多醣複合。亦描述此等複合物作為造影劑在MRi中之用 途。使用羧基葡聚糖作為殼材料改良製劑之藥理學性質。 r 在一較佳實施例中，鐵氧化物核心之尺寸為2〇 11111至3〇 nm。 然而’特別揭示之複合物僅含有直徑至多》8.8賊的鐵氧 # 化物核心。US 5,492’814描述單晶鐵氧化物粒子以及其藉 由MRI檢查生物組織之用途。！ 1^至1〇 nm之範圍指定^ 冑氧化物核心之較佳尺寸；，然而，該等實例僅特別地揭示 直徑為2.9+/.1.3 nm之鐵核心的粒子。為改良作為造影劑 在MRI中之適合性’所揭示之粒子較佳為單晶粒子，即全 部粒子之晶體結構為均一的且無任何破裂-單一晶體。 最近，描述一種用於内科部門照影之新穎方法。在此情 況下’量測在移動磁場中粒子之磁化的變化。此變化用

• 來確定磁性粒子在檢測區域中的空間分佈（例如參見DE ⑻51 778 AmDE 1〇2 38㈣A1)。此新賴技術稱為磁性 粒子照影(MPI)。由相同申請人申請之此等及其他申請案 提及用於刪方法之粒子必須具有之許多性質。例如，該 等粒子可係鐵磁性及亞鐵磁性之粒子’且因而類似於自 顧方法已知之粒子。然而’ Τι#τ2他豫性對待用於刪 之粒子之迠力無影響。由於在熥以與河贝方法中之照影使用 根本上不同之物理現象，故在先前技術中描述之作為應之 造影劑的粒子之適合性不能確定㈣粒子是否適合於廳。 112634.doc 200800275 ^外/揭示粒子必須足夠小以使得僅可於其中形成單一磁 可(單域)且不可產生外司(Weiss)區。據推測，取決於材 料’適合之單域粒子應具有在自2〇 nm至約_咖範圍之 理想尺寸。㉟鐵石（Fe3〇4)作為適合之單域粒子材料而提 及。 因為就裝置而言所要之費用較MRI低得多，所以汹朽為 在診斷應用方面特別受關注之極具前景的新穎方法。此係 因為與在MRI中不@，在刪中不需要很大之均勻磁場且 因此不需要使MRI診斷的變得昂貴且使其難以廣泛應用的 巨大超導磁鐵。然而，為使此新穎技術得以廣泛應用，必 須發展在量測期間容許高空間解析度、無風險施用且低磁 場強度的磁性粒子。因此存在提供適合ΜΜρι診斷之粒子 的需要。 【發明内容】

由於本文描述之特殊方法、協定及試劑可係變化的，故 在下文更詳細描述本發明之前應指出本發明不僅侷限於此 等本文描述之特殊方法、協定及試劑。本文使用之術語僅 用於描述特別較佳實施例之目的，且該等術語並非意欲限 制本發明之範疇，本發明之範疇僅由随附申請專利範圍來 限制。除非另外定義，本文使用之技術與科學術語均具有 A習此項技術者所指定之意義。較佳地，本文之術語以在 A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC

Recommendatians)"，Leuenberger，H.G.W，Nagel，B·與 Klbl， H·編（1995)，Helvetica Chimica Acta，CH-4010 Basel， 112634.doc 200800275

Switzerland)中定義之意義使用。 在本發明中引用許多文獻。本文引用之每一文獻（包括 所有專利 '專利申請案、科技出版物、操作說明書、廢商 推薦等）皆以引用之方式全部倂入本文中。然而，在任情 況下提及此等文獻之一者均不應視為意謂本發明可否定基 於5亥公開案之早期發明的權利。 本發明者驚訝地發覌包含多晶磁性鐵氧化物核心之粒子 尤其適合於ΜΡΙ。因此，本發明之第一主題為包含在醫藥 學上可接夂之殼中之直徑為2〇 nm至i μιη之多晶磁性鐵氧 化物核心的粒子。 已知對病患投與純鐵氧化物核心會引起嚴重的副作用。 已描述血小板聚集及血壓快速下降。為防止此等在某些情 況下可危及生命的副作用，根據本發明之粒子的鐵氧;"匕物 核心由醫藥學上可接受之殼圍繞。在本發明之上下文中之 "醫藥學上可接受之殼"為一層大體上完全包裹鐵氧化物核 心且以當投與至病患時不會出現已知危及生命之副作用的 方式屏蔽該鐵氧化物核心的物質或物質混合物。若該物質 或物質混合物為生物可降解者，即其可裂解為可由軀體利 用及/或可由腎臟移除之小單位則係較佳的。該等粒子較 佳係以水性膠體溶液或分散液形式投與至病患。因此需要 該物質或物質混合物為親水的且防止該等粒子沉殿且穩定 該膠體溶液。在先前技術中描述複數種此等物質（例如參 見 US 5,492,814)。 " 在-較佳實施例中，該醫藥學上可接受之殼包含合成聚 112634.doc 200800275 合物或共聚物、澱粉或其衍生物、葡聚糖或其衍生物、環 葡聚糠或其衍生物、脂肪酸、多醣、卵磷脂或單酸甘油 酯、二酸甘油酯或三酸甘油酯或其衍生物。亦包括上述之 較佳物質之混合物。 自此等寬泛物質類別中，特別較佳者為以下物質及其混 合物： (i) 對於聚合物或共聚物：聚氧化乙烯脫水山梨糖醇酯、 泰聚氧化乙烯及其衍生物、聚氧化丙烯及其衍生物、非 離子界面活性劑、硬脂酸聚烴氧酯（35_80)、聚乙烯 醇、聚合蔗糖、聚羥烧基甲基丙烯醯胺、乳酸與羥基 乙酸共聚物、聚原酸酯、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚乙 二醇、聚丙二醇、聚甘油、多羥基化聚乙烯基質、聚 羥乙基天冬醯胺、聚胺酸、苯乙烯與順丁烯二酸共聚 物、聚己酸内酯、羧基多醣及聚酐； (ii) 對於澱粉衍生物：澱粉2_羥甲基醚與羥乙基澱粉； • (iii)對於葡聚糖或其衍生物：半乳糖苷化葡聚糖、乳糖化 葡聚糖、胺化葡聚糖、含有SH基之葡聚糖、含有羧 •基之葡聚糖、含有醛基之葡聚糖、生物素化葡聚糖； (iV)對於環糊精：β-環糊精及羥基丙基環糊精； (ν)對於脂肪酸：十二烷基硫酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸、脫 水山梨糖醇單月桂酸酯、脫水山梨糖醇單油酸酯、脫水 山梨糖醇單棕櫚酸酯及脫水山梨糖醇酐單硬脂酸酯。 為形成醫藥學上可接受之殼，由於特別好之相容性，較 佳使用葡聚糖及聚乙二醇（PEG)及其衍生物且特別為㈣ 112634.doc 200800275 葡聚糖、低分子量PEG(較佳500至2000 g/m〇1)或高分子量 PEG(超過2000 g/mol至20,000 g/m〇1)。在一特別較佳實施 例中，該醫藥學上可接受之殼為生物可降解的。複數種上 文揭示之較佳物質及聚合物滿足此性質。 在先如技術中，已知複數種方法適合於生產具殼之鐵氧 化物核心。在某些方法中，鐵核心在第一方法步驟中形成 且殼在另外步驟中應用。然而，亦可能在一反應中或在 φ 一鍋反應"中形成鐵核心與殼。已知方法包括（但不限於） 氣務/蒸A熱解法、化學氣相沈積方法、溶膠-凝膠法及微 乳液方法。對於產生鐵氧化物核心之殼的特別較佳之方法 (例如）在 ΕΡ 0 543 020 Bl、ΕΡ 〇 186 616、Ερ 〇 525 199及 ΕΡ 0 656 368 中描述。 若磁性鐵氧化物核心包含磁鐵石或磁赤鐵礦或其混合物 則係較佳的。在某些實施例中，可能向鐵氧化物核心中添 加另外金屬氧化物，該等金屬氧化物較佳係選自鎂、鋅及 φ 鈷氧化物。此等另外金屬氧化物可係以總計高達20❹/0之比 例添加至鐵氧化物核心中。此外，對於錳、鎳、銅、鋇、 “、鉻、鑭、釓、銪、鏑、鈥、鏡及釤，亦可能以小於 5%、較佳小於ι〇/〇包含於其中。 並未期望給出任何關於根據本發明之粒子對於Μρι的所 觀察之適合性的說明，發明者推想鐵氧化物核心之多晶性 質為特別適合性的一個因子。至於本發明，術語"多晶磁 陵鐵氧化物粒子"係指由至少2個相干晶體、較佳3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 112634.doc 200800275 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、8〇、85

90、9S、100或更多個晶體組成之磁性鐵氧化物粒子◊可 包含於一本發明之鐵氧化物粒子中之最大晶體數量僅受粒 子之尺寸限制。在較大粒子中較在較小粒子中可包含更多 晶體。包含於多晶磁性鐵氧化物粒子之晶體較佳具有在較 佳方向上之1_100 nm、較佳3 11〇1至5〇 nm的長度。磁鐵石 結晶（Fe3〇4)之一晶胞具有約i nm之邊緣長度。因此，包含 於多晶磁性鐵氧化物粒子中之晶體沿較佳方向較佳具有至 少3個晶胞，甚至更佳為4、5、ό、7、8、9、J❹、i i、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24 、 25 、 26 、 27 、 28 、 29 、 30 、 31 ' 32 、 33 、 34 、 35 、 、70 、 75 、 晶鐵氧化物 36 、 37 、 38 、 39 、 40 、 45 、 50 、 55 、 60 、 65 80、85、90、95、1〇〇個或更多個晶胞。在多 杉^中在或夕個晶體之間之接觸面處可形成具無序非 晶形結構之非晶區域，即多晶磁性鐵氧化物核心較佳由 5〇%、更佳 55。/。、60%、65%、7〇%、75%、8〇%、85%、 9〇/〇、95%或更多之多晶區域組成且其餘鐵氧化物粒子由 無序之非晶區域組成。包含於鐵氧化物核心中之個別晶體 可具有相同或不同之長度。包含於多晶磁性鐵氧化物粒子 中之最大微晶（即個別晶體）較佳應具有小於7〇%、甚至更 佳小於65%、小於6〇%、小於55%、小於5〇%、小於45%之 根據本發明之粒子總體積的體積。在本發明之一實施例 中’在多晶鐵氧化物核心中並非長程有序而僅為短程有 112634.doc -12· 200800275 序。此意謂該等粒子呈具有結 +开”。户士找 曰曰包/函體之大體上非晶形粒 子以。在本發明之上下文I"多晶”涵蓋具有長程有序 之鐵巩化物粒子及彼等具有短程有序之 ^ 佳為具有長程有序之晶體。边子。較 =多晶鐵氧化物核心亦可形成單域且未必將引起形 寸為關㈣就形成外司區之能力而言’鐵氧化物核心之尺 :為關鍵因子。在—特別較佳實施例中，鐵氧化物核心含 個鐵氧化物單晶。包含於粒子中之晶體的數量及 =猎由複數種不同的方法來债測，其包括(但不限於) 透射電子顯微術(TEM)、電子段層攝影及X光繞射。較佳 地藉由TEM來測定尺寸。 根據本發明之粒子的總直徑取決於鐵氧化物核心之直_ 及圍繞鐵氧化物核心之醫藥學上可接受之殼的厚度，以及 任何附著於殼表面之分子。總直徑之上限藉由以下限制條 件所定義：繼施用於病患身體之後粒子必須能夠穿過毛細 血管。最小直徑之毛細血管通常位於肺部。此等毛細血管 仍可使總直徑為2 μιη的粒子穿過^輯本發明之粒子較佳 為球狀。然而，本發明亦涵蓋長形或稜形或大體上任何形 狀之粒子’其限制條件為鐵核心之表面大體上藉由醫藥學 上可接受之殼圍繞。因而，在球狀粒子的情況下，粒子之 總直徑為2r，且在不規則形狀之粒子的情況下，粒子之總 直徑藉由在粒子表面上彼此最遠離之二點之間之距離加上 水合殼之厚度來定義。在此定義之總直徑必須區別於根據 本發明之粒子之的二次平均總直徑（mean 〇v咖^ 112634.doc -13- 200800275 diameter)，該二次平均總直徑定義為在粒子表面上所有點 自粒子重心的平均距離加上水合殼之厚度。二次平均總直 徑又區別於粒子之平均總直徑⑽⑽細 diameter)，其係指-群粒子且作為所有包含於該群中之粒 ，子加上水化殼之二次平均粒徑的平均值獲得者。總直徑之 ，下限由多晶鐵氧化物核心之直徑的下限確定，在方法 中其引起照影之改良。因此，在一較佳實施例中，總粒徑 # 在自約3〇 nm至約2 μιη範圍内變化。然而，更佳者為使用 總直徑在自約4〇nm至約500 nm範圍内、更佳在自約45nm 至約300 nm範圍内、甚至更佳在自約5〇 nm至約2〇〇 nms 圍内的粒子。根據本發明之粒子之總直徑可藉由許多在此 項技術中已知之直接及間接方法來測定，其包括（例如）電 子顯微術及動悲光散射。較佳地，藉由動態光散射來測定 總直徑。 在可用之先前技術中，且尤其在上述文獻De 1〇ι 51 778 φ A1與DE 102 38 853 A1中，申請人假定所描述之粒子適於 MPI。該先前技術僅揭示具有直徑為2〇 11111至8〇〇 nm之磁 性核心的粒子為適合的，且事實上適合之磁性核心直徑取 決於各自選擇的磁性材料。未教示所揭示具有直徑為2〇 nm 至1 μιη直徑之多晶鐵氧化物核心的粒子的用途。因此，本 發明係基於具有由多晶鐵氧化物組成之磁性核心的粒子隨 其尺寸增加更適於ΜΡΙ的發現。因而，較佳鐵氧化物核心 之直徑下限為 21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30 、 31 、 32 、 33 、 34 、 35 、 36 、 37 、 38 、 39 、 40 、 41 、 112634.doc -14· 200800275 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、 54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66 ' 67、68、69、70 ' 71、72、73、74、75、76、77、 78、79、80、85、90、95、100 nm。較佳直徑之上限為 500 、 490 、 480 、 470 、 460 、 450 、 440 ' 430 、 420 、 410 、 400 、 390 、 380 、 370 、 360 、 350 、 340 、 330 、 320 、 310 、 300 、 290 、 280 、 270 ' 26Q 、 250 ' 240 、 230 、 220 、 210 、 200 、 190 、 180 、 170 、 160 、 150 、 140 、 130 、 120 、 110 、 100、95、90、85及80 rim。為定義粒子尺寸之較佳範圍， 所有上述上限與下限之組合皆係可能的，其限制條件為上 限值大於下限值，例如40 nm至400 nm、50 nm至200 nm 等。根據本發明之較佳粒子具有在自約25 nm至約500 nm 範圍内之鐵氧化物核心直徑。甚至更佳地，鐵氧化物核心 之直徑在自約30 nm至約200 nm範圍内，再佳地在自約35 nm至約80 nm範圍内。核心之直徑可再一次藉由此項技術 中已知之方法來測定，其包括（但不限於所提及之方法）X-光結構分析及電子顯微術。由於鐵氧化物核心在任何情況 下皆不具有球形形狀，故鐵氧化物核心之直徑為在鐵氧化 物核心表面上彼此間相距最遠的點之間的距離。此直徑必 須區別於鐵氧化物核心之二次平均直徑，該二次平均直徑 定義為在鐵氧化物核心表面上之所有點距鐵氧化物核心之 重心的平均距離。鐵氧化物核心之二次平均直徑又區別於 鐵氧化物核心之平均直徑，該平均直徑係指一群粒子且作 為所有包含於該群中之鐵氧化物核心之二次平均直徑的平 112634.doc •15- 200800275 均值而獲得者。 已驚許地發現’具有圍繞鐵氧化物核心之醫藥學上可接 受之物質之薄殼的粒子較具有較厚殼且具有相同鐵氧化物 核心直徑的粒子更適於MPI。因此，在一較佳實施例中， 根據本發明之粒子特徵在於總粒徑與鐵氧化物核心直徑之 比率小於6。甚至更佳地，此比率小於55、5〇、4.5、 4·〇、3·5、3·0、2·9、2.8、2.7、2·6、2.5、2.4、2 3、 2·2、2.1、2.0、1.95、1.90、1·85、1·80、1.75、1·60、 1 ·55或小於1 ·5。至於上述之總粒徑及鐵氧化物核心直徑， 特別較佳之粒子具有直徑在自約3〇至約2〇〇 nm範圍内的鐵 氧化物核心，且甚至更佳在自約35 nm至約8〇 圍内， 總粒徑與鐵氧化物核心直徑之比率小於3.0、2.9、2.8、 2.7、2.6、2·5、2·4、2·3、2·2、2.1、2.0、1.95、1.9〇、 1·85、1·8〇、l75、上 6〇、i 55 或小於 15。 MPI係基於偵測磁性粒子之位置。在目的僅為顯示流體 流過之區域之内部結構，諸如顯示胃腸道或顯示冠狀動脈 的#斷方法中，（例如）藉由注射粒子分散液或藉由吞咽適 合之粒子溶液或分散液即可足以提供病患充足量之粒子。 接著，在大體上不與所檢查區域中之結構相結合的該等粒 子流過該檢查區域時可被觀察到。然而，對於許多診斷應 用而a ’需要該等粒子顯示對於所檢查區域之表面結構之 特異11親和力。因此’在—較佳實施例中，根據本發明之 粒子在其表面上包含一或多個相同或不同配位體。該等配 位體可係共價地或非共價地結合於表面。在本發明之上下 112634.doc -16 - 200800275 文内，，，配位體，，為以下列…⑼結合於給定物質的物質··小 於10 μΜ、較佳小於！ μΜ、小於9〇〇應、小於謂遲、小 於700 nM、小於_ nM、小於5〇〇 nM、小於彻碰、小 於300 nM、小於200 nM、小於1〇0 nM、小於9〇 nM、小於 • 80 nM、小於70福、小於50 nM、小於40 nM、小於3〇 響 nM々、於20 nM。在先前技術令，已知複數種測定配位體 對給定物質之結合親和力（jew或其他參數）的方法。此等 φ 方法包括（但不限於）EUSA、表面電漿共振及放射性配體 結合檢定法，如（例如）在Gazal s，等人（2〇〇2) 了· Med. chem. 45: 1665-1671 中所描述。 在某些情況下，可能需要固定兩個或兩個以上不同配位 體於根據本發明之粒子表面上。當顆粒特異性結合至該表 面時，可能（例如）存在兩種彼此接近排列之此表面的結構 特徵。此情形可能為（例如）在某些腫瘤細胞中由於突變， 欠體之二組份永久地彼此結合在一起。接著，使用各針對 • 兩結構之一者的兩配位體引起親和力或特異性相當程度地 增加。在此根據本發明之粒子之較佳實施例中，額外地將 一或多個配位體固定於殼之表面上，該殼由醫藥學上可接 受之物質組成。取決於組成醫藥學上可接受之殼之個別物 質或物質混合物，殼自身對於給定物質可具有親和力。例 如，許多多醣具有某種細胞特異性。由於此親和力亦可由 醫藥學上可接受之殼產生，因此（例如）細胞特異性粒子之 產生在任何情況下皆不需要固定配位體。 可固定於表面上之配位體之最大數量藉由表面之尺寸及 112634.doc -17- 200800275

個別配位體需要之空間來確定。通常，配位體以單分子層 結合於粒子之表面，取決於配位體之尺寸，其可引起直徑 顯著增加。因此，當選擇適合之配位體時、且特別當使用 大抗體配位體時’必須謹慎以保證所得配位體·塗覆粒子 之總直徑不會引起使粒子不再能夠穿過毛細血管的情況。 因此，配位體-塗覆粒子之直徑較佳小於2 μιη，且甚至更 佳對於如上述之未塗覆粒子之較佳總粒徑所述的直徑。在 此情況下，醫藥學上可接受之殼之厚度及/或鐵氧化物核 心之直徑必須相應地減小。在先前技術中，揭示複數種附 著配位體之方法。特別較佳之方法在（例如）us 6,〇48,515 中揭示。取決於個別醫藥學上可接受之殼，在附著配位體 之前可能需要交聯該殼。例如，Weipieder等人已描述此等 方法。 配位體之選擇應取決於待由MPI診斷之疾病或病症。較 佳地，位於粒子上之配位體所結合之結構包含於例如血液 或淋巴液之體液流過之區域中或包含㈣液内。因此配位 體較佳能夠特異性結合於細胞（真核或原核）、細胞外或病 毒之表面結構4先前技術中，已知複數種結構傾向於在 疾病組織或細胞中或在此等組織或細胞附近表現，且因此 其可充當個別疾病的指徵。例如，在成人身體中新形成之 血管（血管生成）係限制於與月經或懷孕有關之子宮内膜及 限制於繼a管創傷後的癒合過程。然而，眾所周知亦在複 數種増生疾病中形成新*管，且料新血f未在身體内任 何未受增生疾病影響的其他點發,見。因此，與血管生成有 112634.doc 18 200800275 關而產生的細胞結構且特別係僅在腫瘤内皮上發現之結構 (諸如纖維結合蛋白之ED-B域（ED-BF))對於可固定於根據 本發明之粒子之表面上的配位體係優良的靶向。在先前技 術中已知之針對此等與疾病有關之結構的所有配位體皆可 與本發明之粒子結合使用。然而，特別較佳之配位體為能 夠特異性結合於以下結構之一者的配位體：纖維結合蛋白 之ED-B域（ED-BF)、内皮因子、血管内皮生長因子受體 (VEGFR)、VEGF 家族之成員、NRP-1、Angl、Thie2、 PDGF-BB 及受體、TGF-βΙ、TGF-β 受體、FGF、HGF、 MCP-1、整合素（ανβ3、ανβ5、ο^β〗）、VE-鈣黏素、 PECAM(CD31)、ephrins、纖溶酶原活化因子、MMPs、 PAI-1、NOS、C0X_2、AC133、趨化性激動素、Idl/Id3、 VEGFR-1、Ang2、TSP-1、TSP-2、血管抑制素及相關之血 纖維蛋白溶酶原半光胺酸捲曲區、内皮抑制素（膠原XVII 片段）、血管新生抑制素、血小板因子4(PF4)、TIMPs、 MMP抑制劑、PEX、Meth-1、Meth-2、IFN-α、IFN-β、 IFN-γ、IL-10、IL-4、IL-12、IL-18、催乳激素（Μ， 16K)、VEGI、SPARC 之片段、骨橋蛋白（osteopontin)片段 或馬絲平（maspin)、CollXVIII、CM201、抑制素（特別係L-抑制素）、CD105、ICAM1、生長抑素（亞類1、2、3、4或 5)或生長抑素受體（亞類1、2、3、4、5或6)。 在先前技術中已知複數種物質對於細胞（真核或原核）、 細胞外或病毒之表面結構具有較佳親和力。較佳地，固定 在根據本發明之粒子上的配位體係選自多肽、募聚核苷 112634.doc • 19· 200800275 酸、多醣及脂質。 已知具有特異性親和力之多肽且可藉由包括”噬菌體顯 示”及免疫法之方法來鑒別。就此而論，若根據本發明可 用作配位體之蛋白質係選自由以下各物組成之群則係較佳 的：抗體，包含人類、人化及嵌合抗體及抗體片段；片 段，包含抗體結合域，例如Fv、Fab、FaV、F(ab，）2、 Fabc、Facb ;單鏈抗體，例如單鏈Fvs(scFvs)及雙功能抗 體；及細胞、細胞外或病毒受體或其片段的配位體。適合 之配位體例如為血管内皮生長因子（VEGF)、表皮生長因子 (EGF)、趨化性激動素或細胞活素。 核酸與（例如）轉錄因子或組蛋白特異性結合的能力係眾 所周知的。玎作為配位體固定於根據本發明之粒子上的較 佳寡聚核苷酸包括DNA、RNA、PNA及適體。由於pna對 通常在病患體内發現核酸酶具有較高耐受性且因而具有比 較久之生物半衰期，故特別較佳者為PNA。識別特異性結 合核酸之方法在先前技術中已知且在（例如）w〇 93/24508 Al、WO 94/08050 A1、WO 95/07364 A1、WO 96/27605 A1 及 WO 96/34875 A1 中描述。 在某些情況下，例如由於空間或化學不相容性之原因， 配位體不可能直接結合於粒子之表面。在此等情況下，配 位體可經由連接劑結合於粒子之表面。就此而論’術語 "連接劑"表示較佳具有一個或兩個各自容許一方面共價或 非共價偶合粒子表面且另一方面偶合配位體之化學反應性 基團的分子。在此等偶合基團之間通常存在線性、環狀或 112634.doc -20· 200800275 分支區域，其允許（例如）在配位體與粒子之間有更大的空 間隔離及配位體之更大的可動性。此線性區域可（例如）係 經取代或未經取代、分支或未分支、飽和或不飽和的烧基 鏈（C2至Cso)，其可由一或多個〇、N及/或S原子打斷；或 多肽或多核苷酸。可用於此等連接劑之化學反應性基團之 實例包括（例如）胺基、羥基、硫醇基或硫醇反應性基團、 魏基、竣基及環氧基。硫醇反應性基團包括（例如）順丁稀 二醯亞胺（馬來醯亞胺）、氯乙醢基、溴乙醯基、礙乙醯 基、氯乙醯胺基、漠乙醯胺基、蛾乙醢胺基、氣烧基、漠 烷基、碘烷基、二硫化吡啶基及乙烯基磺醯胺基。在w〇 98/47541中揭示複數種偶合試劑、偶合基團及連接劑，對 於此等揭示内容在此對其進行特別參考。 已發現固定於醫藥活化劑之表面上的聚乙二醇殘基 (PEG)及/或聚丙二醇殘基（PPG)引起生物半衰期相當程度 的延長。此之實例為PEG基化脂質體或peg基化蛋白，諸 如PEG基化EPO。表面PEG基化之方法在此項技術中係眾 所周知的。取決於使用之個別醫藥學上可接受之殼材料， PEG殘基或PPG殘基可共價或非共價地直接或經由連接劑 固定於表面上。較佳地，聚乙二醇及/或聚丙二醇殘基係 非共價地結合於粒子之表面。 本發明之另一主題為生產包含在醫藥學上可接受之殼中 之直徑為20 nm至1 μπι之多晶磁性鐵氧化物核心的粒子的 方法5該方法包含以下步驟： ⑴將含有鐵（II)鹽及鐵（III)鹽之混合鐵鹽水溶液與鹼在 112634.doc -21 - 200800275 合成聚合物或共聚物、澱粉或其衍生物、葡聚糖或其 衍生物、環葡聚糖或其衍生物、脂肪酸、多醣、即磷 脂或單酸甘油酯、二酸甘油酯或三酸甘油酯或其衍生 物或其混合物存在下相混合，直至形成粒子之膠體溶 液； (U)使該含有粒子溶液穿過磁性梯度場， (iii)移除該磁性梯度場； (IV)且回收在該梯度場中所留之粒子。 根據本發明之方法的步驟⑴通常不會產生均一之粒子 群，而產生關於鐵氧化物核心之直徑且關於總粒徑在某頻 寬内變化的粒子群。該群之平均鐵氧化物核心直徑係作為 I έ於《亥群中之所有二次平均鐵氧化物核心直徑的平均值 而獲得。在步驟（ii)中應用磁性梯度場產生對具有較平均 鐵氧化物核心直徑大之鐵氧化物核心之粒子的選擇。例 如，有可能藉由選擇磁性梯度場強度且可能在增加梯度場 之強度時藉由重複根據本發明之方法的步驟（丨丨）至（丨^) 一 次、兩次或兩次以上來自異質粒子群選擇一群具有較平均 鐵氧化物核心直徑大之平均鐵氧化物核心直徑及醫藥學上 可接文之材料之薄殼的粒子。通常，在步驟（ϋ)至（b)之最 後亦獲得具有較小核心直徑散佈之粒子群。 為自此粒子之子群中選擇具有至少預先確定之總粒徑的 粒子’可藉由在先前技術中已知的方法來選擇，諸如過 慮、沉搬、向流離心作用（淘洗）等。 用於根據本發明之方法中之鐵（II)鹽與鐵（ϊπ)鹽在水溶 112634.doc -22- 200800275 液中較佳以0·1 Μ至2 Μ之濃度。二價及三價鐵離子之混合 比率較佳為1:3至2:1。適合之鐵鹽陰離子係源於有機酸， 諸如衿棣酸、乳酸、乙酸、順丁烯二酸等；或源於無機 酉夂諸如 HC1、H2S04、H2S03、HBr、HI、ΗΝ〇3 或 ΗΝ〇2 〇 驗較佳係選自無機鹼，諸如Na0H、κ〇η、Li〇H或 Α1(〇Η)3及有機鹼。鹼可作為固體或溶液、較佳作為水溶 液添加至反應水溶液中。此添加較佳進行至溶液？11達1〇、 較佳11或更高。此鹼化步驟較佳繼之以藉由酸（較佳HC1) 中和pH至約7±0.5。 作為另外步驟，可繼步驟⑴之後直接或中和之後進行熱 處理。在此’將該溶液加熱至至少50°C、較佳60°C、 65 C、70 C、75°C、80°C、90°C 或 95°C。若尚未進行中 和，則可在加熱後藉由添加酸來中和，且接著可冷卻或進 一步加熱。若進一步加熱溶液，則較佳加熱至5〇〇c、更佳 60C、65°C、70°C、75°C、80°C、85°C、90°C、95°C、 100 C或回流。此加熱較佳進行1〇 min至i〇 h。 在步驟（i)之後直接或繼如上所述之各另外步驟（即中和 及/或加熱步驟）之後可進行一或多個洗滌及/或滲析步驟。 此外’若在步驟（iv)之後獲得之粒子經歷一或多個洗滌及 滲析步驟則係較佳的。此步驟（或此等步驟）之目的較佳為 自該等粒子分離任何自生產過程留下之潛在破壞性雜質， 及調適含有該等粒子之溶液的pI1及/或鹽含量。 使用磁性梯度來選擇特別適於方法之粒子。可用於 112634.doc -23- 200800275 根據本發明之方法的磁性梯度場可係廣泛變化的且可由熟 習此項技術者根據多種測試設備之參數而設定。用於分離 目的之梯度場必須顯著大於地場（terrestrial fieid)之梯度。 在分離室中之磁性梯度場可藉由永磁材料或藉由電流流過 之導體來產生。至於本發明，由於後者之實施例易於藉由 斷電來移除梯度場，故其係較佳的。在第一種情況下，磁 性梯度場係藉由移除永磁材料來移除。梯度場一般在自 1 mT/m至5000 T/m範圍内。若（例如）待保持核心直徑大於 100 nm之粒子，且若步驟（ii)係在具有低通過速率之設備 上進行，則較佳使用1-10 mT/m之梯度強度。然而，若待 保持具有例如約20 nm之較小核心直徑的粒子，且若以高 通過速率進行該方法，則較佳使用大於1〇〇〇以瓜之梯度強 度。應用梯度場之目的在於濃縮彼等具有相對大之鐵氧化 物核心直徑及/或具有較佳（即低）總直徑/核心比例之粒 子。根據在此提供之教示且取決於平均直徑，藉由根據本 發明之方法生產之粒子及使用之流動速率，熟習此項技術 者可確定使選擇此等粒子成為可能之適合的梯度場強度。 配備梯度場之適合的分離設備在（例如）實例lb)& lc)中及 在EP 0 915 738 B1中描述。該等裝置在梯度場之附近可含 有其他順磁性材料以在必要時增加梯度場。 為回收在梯度場中所留之粒子，在移除梯度場之後，較 佳以適合之溶液、較佳醫藥學上可接受之水性溶液徹底清 ί尤分離设備，其中該等粒子較佳係機械地自分離設備釋 放0 112634.doc -24 - 200800275

根據本發明生產之粒子較佳具有至少ΗίΗιηΜιν1之丁2弛 豫性，甚至更佳至少約160、170、180、190、200、210、 220 ' 230 、 240 、 250 、 260 、 270 、 280 、 290 、 300 、 310 、 320 、 330 、 340 、 350 、 400 ' 450 ' 500 、 550 、 600 、 650 、 700、750、800、850、900、950 或 ΙΟΟίΚπιΜι)·1 的 T2 弛豫 性。粒子之Τ2弛豫性較佳在1特斯拉之磁場強度下在粒子 之水性膠體溶液中測定。熟習此項技術者已知適合之量測 方法且亦在（例如）隨附之實例中揭示。在根據本發明之方 法的一較佳實施例中，總直徑在自約30 nm至約2 μπι範園 内變化。然而，甚至更佳者為使用總直徑在自約40至約 500 nm範圍内、甚至更佳在自約45 nm至約300 nm範園 内、再佳在自約50 nm至約200 nm範圍内的粒子。如已提 及，根據本發明之粒子的總直徑可藉由許多在先前技術中 已知的直接與間接方法來測定，其包括（例如）電子顯微術 及動態光散射。包含於粒子内之鐵氧化物核心直徑的較值 下限為 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、 56、57、58、59、60、61 ' 62、63、64、65、66 Λ 67 ' 68 ' 69、70、71、72 ' 73、74、75、76、77、78、79 ' 80、85、90、95、100 nm。直徑之較佳上限為 500、490、 480 、 470 、 460 、 450 、 440 、 430 、 420 、 410 、 400 、 390 、 380 ' 370 、 360 、 350 、 340 、 330 、 320 、 310 、 300 、 290 、 280 、 270 〜260 ' 250 > 240 ' 230 ' 220 、 210 、 200 、 190 、 112634.doc -25- 200800275 180、170、160、150、140、130、120、110、100、95、 90、85及80 nm。為限定可由根據本發明之方法生產的顆 粒尺寸的較佳範圍，所有上述上限與下限的組合皆係可能 的，其限制條件為上限值大於下限值，例如40 nm至400 nm、 5 0 nm至200 nm等。根據本發明生產之較佳粒子具有在自 約25 nm至約500 nm範圍内鐵氧化物核心直徑。甚至更佳 地，鐵氧化物核心之直徑在自約30 nm至約200 nm範圍 内，再佳在自約35 nm至約80 nm範圍内。 本發明之另一主題包含可藉由根據本發明之方法來生產 的粒子。 本發明之另一主題包含一種組合物，其中至少2%之包 含於該組合物中的粒子為根據本發明之粒子或藉由根據本 發明之方法來生產的粒子，該等粒子含有在醫藥學上可接 受之殼中之多晶磁性鐵氧化物核心。在較佳實施例中，根 據本發明之粒子或根據本發明生產之粒子的比例更高且至 少為 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%或100%。根據本發明之組合物對於MPI方法之適合性 隨根據本發明之粒子或根據本發明生產之粒子比例的增加 而增加。 本發明之另一主題為一種組合物，其中根據本發明之粒 子或藉由根據本發明之方法來生產之粒子的粒徑（就至少 50%之粒子而言）係在平均粒徑10%浮動範圍内。較佳增加 112634.doc -26 - 200800275 尺寸刀佈之均一子生Η ΒΕΙ .7Γ. ^ “加糟由個別粒子產生之信號的 均一性。就此而論1至少55%、至少㈣、㈣、鳩、 75/〇 8G/。、9G%、95%之根據本發明之粒子或藉由根據本 發明之方法來生產的粒子具有在平均粒徑ι〇%浮動範圍内 的粒徑，則係特別較佳的。就此而論，平均粒徑具有上文 已經解釋之意義，亦即該粒徑為所有包含於組合物中之根 據本發明之粒子或根據本發明生產之粒子的平均直徑。 本毛明之另一主題為含有根據本發明之組合物的流體。 適合之流體為水溶液，其較佳緩衝至生理學，且其可能 含有鹽、糖等’特別係當其意欲用於非經腸應料。該等 流體可能含有諸如防腐劑、穩定劑、清潔劑、調味劑、賦 形劑等之添加劑。取決於應用路線可添加至診斷溶液中之 複數種物質對於熟習此項技術者係已知的。除非與根據本 發明之粒子不相容，否則此等添加劑皆可毫無例外地添加

至根據本發明之流體中。若流體呈穩定之膠體溶液形式則 係較佳的。 本發明之另一主題為利用根據本發明之組合物或根據本 發明之流體來生產用於磁性粒子照影（MPI)中供診斷疾病 用之診斷構件的用途。在此若該等疾病係選自由以下疾病 組成之群則係較佳的：增生疾病，特別係腫瘤及轉移·，炎 性疾病；自身免疫疾病；消化道疾病；動脈硬化；中風· 梗塞；血管系統、淋巴系統、胰腺、肝臟、腎臟、腦及膀 胱中之病變以及影響電刺激傳輸的疾病及神經退化性疾 病。在此使用之粒子較佳為上文揭示為較佳或特別較佳之 H2634.d( -27- 200800275 粒子。 本發明之另一主題為利用組合物來生產用於磁性粒子照 衫（MPI)中供診斷疾病用之診斷構件的用途，其中包含於 該組合物中之至少2%之粒子含有在醫藥學上可接受之殼 中之多晶磁性鐵氧化物核心。在此若該等疾病係選自由以 下疾病組成之群則係較佳的：增生疾病，特別係腫瘤及轉 移；炎性疾病；自身免疫疾病；消化道疾病；動脈硬化； 中風，梗塞；血管系統、淋巴系統、胰腺、肝臟、腎臟、 腦及膀胱中之病變以及影響電刺激傳輸的疾病及神經退化 性疾病。此等粒子之較佳鐵氧化物核心直徑為如上所述之 直徑’且亦包括具有至少5 nm、至少6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29及3 0 rnn之直徑的鐵氧化物 核心。可用於根據本發明之此用途的粒子可藉由如上所述 之方法來生產。 若該等粒子係藉由包含以下步驟之方法來偵測則係特別 較佳的： (i) 產生具磁場強度空間進程之磁場，其使得在檢測區中 獲得一具低磁場強度之第一局部區域及一具較高之磁 場強度的第二局部區域； (ii) 改變該等兩局部區域在該檢測區中之空間位置，使得 該等粒子之磁化局部地變化； (iii) 記錄取決於在受此等改變影響之檢測區中的磁化的信 万虎， 112634.doc -28- 200800275 (iv)評估該等信號以獲得關於磁性粒子在檢測區中之空間 分佈的資訊。 在此方法中及在此設備中，在檢測區中產生空間不均一 之磁場。在該第一局部區域中，磁場極弱，使得粒子之磁 化或多或少地不同於外部磁場，即未飽和。在該第二局部 區域中（即在檢測區第一部分外之其餘部分中），磁場係充 足強大的，以保持粒子處於飽和狀態。當幾乎所有粒子之 泰磁化皆以大致外部磁場方向定向時磁化係飽和的，使得隨 磁場任何進一步增加磁化作用增加之程度較在磁場中給定 相應增加之第一局部區域少得多。 第一局部區域較佳為空間連貫之區域；其可係點形區 域但亦可係線性或表面區。取決於組態，第一局部區域 在空間上由第二局部區域圍繞。 藉由改變兩局部區域在檢測區内之位置，在檢測區中之 (整體)磁化作用發生改變。局部區域之空間位置之變化可 _ 藉由（例如）暫時改變磁場而達成。若量測在檢測區中之磁 化作用或由此影響之物理參數，則可自其得出關於在檢測 區中磁性粒子之空間分佈之資訊。 '為此，接收且評估（例如）由於在檢測區中磁化作用暫時 變化而在至少一個線圈中感應之信號。若暫時改變磁場作 ;k測區上及在第一頻帶中粒子上，則在彼等由線圈收 到之“虎中’僅評估彼等含有-或多個較第-頻帶之彼等 頻率組份更高之頻率組份的信號。由於該等粒子之磁化特 卜通吊不以線性形式進行，故產生此等量測之信號。 112634.doc -29- 200800275 對於關於該方法及設備之進一步說明，參考de m 51 778。 由於該文獻詳細地描述該方法及設備，在此DE 1()1 51 778 之内容以引用之方式全部倂入本文中。 在較佳實施例中，本發明係關於根據本發明之组合物 或流體的錢，其中執行_之配置包含以下構件： a) 用於產生一具磁場強度空間進程之磁場的構件，其使 得在檢測區中獲得一具低磁場強度之第一局部區域及 一具車父南磁場強度之第二局部區域； b) 用於改變忒等兩局部區域在檢測區中之空間位置的構 件以使付粒子之磁化作用局部地發生改變； c) 記錄信號之構件，該等信號取決於在已受此空間位置 變化影響之檢測區中的磁化作用； d) 用於評估該等信號以獲得關於磁性粒子在檢測區中之 空間分佈之資訊的構件。 由於可根據本發明使用之粒子容許特別高的空間解析 度，故其可用於診斷增生疾病，且特別係在此等疾病之早 期階段使用。該增生疾病較佳係選自由腫瘤、癌症前期病 症、發育異常、子宮内膜異位及轉化組成之群。 可使用可根據本發明使用之粒子診斷的其他較佳疾病包 括自體免疫疾病，其係選自由下列各疾病組成之群：類風 濕關節炎、炎症性腸病、骨關節炎、神經性疼痛、斑形脫 髮、牛皮癖、牛皮癖關節炎、急性胰腺炎、同種異體移植 排斥反應、過敏、肺過敏性炎症、多發性硬化、阿茲海默 氏症（Alzheimer’s disease)、克羅恩氏病（Cr〇hn，s disease)及 112634.doc -30- 200800275 全身性紅斑狼瘡。 在本發明之另一實施例中，根據本發明之粒子及根據本 發明生產之粒子可用於使用磁性粒子局部加熱的方法，特 別較佳用來產生高溫。對於關於該方法及設備之進一步說 明，參考W02004/018039。由於該文獻詳細描述該方法及 設備，故W02004/018039之内容在此以引用之方式全部併 入本文中。

在另一實施例中，根據本發明之新穎粒子及根據本發明 生產之粒子可用作在核磁共振照影（Mri)中之τ2增強造影 劑。該等粒子可用作MRI造影劑用來診斷選自由以下各疾 病組成之群的疾病及病變··增生疾病；炎性疾病；自體免 疫疾病；消化道疾病；動脈硬化；中風；梗塞；血管系統 及〜臟、淋巴系統、胰腺、肝臟、腎臟、腦及膀胱之病 變；以及影響電刺激傳輸之疾病及神經退化性疾病。特別 較佳者為該等粒子作為MRI造影劑來照影肝臟或脾及診斷 #器g之疾病的用途。该等粒子亦可用作血管造影術之 MRI造影劑。 ^以下實例解釋本發明而非將其限制於特別之實施例。熟 白此項技術者能發現對於實驗中指定之數量及溫度的複數 種變化’所有此等變化在如隨附申請專利範圍所定義之本 發明之範疇内。 【實施方式】 實例 實例1 ·產生磁性鐵氧化物粒子 112634.doc -31- 200800275 實例la)產生初始粒子分散液 將105 g具有0.050 dl/g之固有黏度的羧基葡聚糖（CDX) 溶解於350 ml水中。在氮供給下，向其中添加13·6 g四水 合氯化鐵（II)水溶液及140 ml 1 Μ氣化鐵（ιπ)(相當於37·8 g - 六水合氣化鐵（ΠΙ))。接著，在攪拌下經15 min向其中添加 • 242 ml 3 N NaOH溶液且將混合物加熱至8〇〇c。藉由添加6 N HC1來將pH調節至7.0。在回流下另外攪拌混合物i h。 馨 冷卻之後’離心樣品（2100 g/30 min)。以相當於78%沉 版物上；^液之體積的比例添加乙醇。再次離心樣品（2 1 〇〇 g/10 min)。將沉澱物溶解於水中且用水滲析（16 h)。藉由 NaOH將滲析液pH調節為7·2且在減壓下濃縮。通過膜濾器 (孔徑大小：0·2 μηι)過濾濃縮物以獲得186 mi羧基葡聚糖_ 穩定鐵氧化物粒子懸浮液。該生產方法相當於生產包含於 Resovist®中之粒子的方法。 鐵濃度·· 52 mg/ml(鐵含量：91%)，磁性鐵氧化物之粒 φ 徑：9 nm，總粒徑：61 nm，水溶性羧基多醣/鐵重量比 1·15，在1特斯拉下之磁化作用：％ emu/g鐵，T2弛豫性： 240(mM sec)·1 〇 ^ 實例lb)產生小粒子 w 磁性過濾器由一環形磁鐵（NE 1556，IBS Magnet

Berlin，外徑15 mm，内徑5 mm，高度6 mm)及一排列於環 形磁鐵之内部空間中的分離室組成。該分離室由用塑料製 成之壁組成，且填充有鐵粒（直徑約0.3 mm)。將0.8 mi鐵 含量為500 mmol/L及I弛豫性為約IWCmM.sec)-1的鐵氧化 112634.doc -32- 200800275 物粒子分散液（根據實例l a)藉由流體靜壓經磁性過濾器過 濾。如此獲得之濾液的丁2弛豫性為“（mM.sec)-1。 實例lc)產生新穎磁性鐵氧化物粒子 繼回收根據實例lb)過濾之鐵氧化物粒子之後，一旦切 斷磁鐵，則藉由清洗來獲得在磁性過濾器中之殘餘物。所 得粒子懸浮液（殘餘物1)具有293(11114.860)-1之τ2弛豫性且根 據實例2、3、4及5特徵化。 一旦根據實例1 b)第二次（但此次以較弱磁場）執行過濾， 則在關掉磁鐵之後獲得之殘餘物（殘餘物2)具有388 (mM-sec)·1 之 T2弛豫性。 實例2 :藉由動態光散射測定總粒子尺寸 使用獲自Malvern公司之粒子篩分機（ZetaSizet· 3000 Hs a)量測粒子的平均擴散係數（強度加權）且自其計算平均流 體動力學直控。此方法代表一用於測定平均總粒徑的可能 之方法。然而，在此情況下，測定鐵氧化物核心外加水合 殼之直徑。 結果在下表1中概括： 表1 平均總粒徑[nm] 實例la) 61 初始分散液 (用於Resovist®之粒子） 實例lb)濾液 18 實例lc) 殘餘物1 65 殘餘物2 71 112634.doc -33- 200800275 實例3 :藉由電子顯微術測定核心尺寸 使用透射電子顯微術（TEM)，由於富造影鐵氧化物核心 與殼比較具有較高電子密度，故此等富造影氧化物核心得 以擴大且攝影。量測以此方式照影之粒子的尺寸且由放大 , 係數計算實際核心尺寸。計數50至100個粒子且將結果在 直方圖中繪圖。亦計算平均核心直徑（數量加權）。將結果 在圖1中作為直方圖且在表2中以表格形式概述。 表2 平均核心直徑[rnn] 實例la) 9 初始分散液 (用於Resovist®之粒子） 實例lb)濾液 6 實例lc) 殘餘物1 35 殘餘物2 未測定 實例4 :測定總粒徑/核心比 ⑩ _^__ 該比值由根據實例2之直徑與根據實例3之核心尺寸形成 且在下表3中概括。 表3 平均總粒徑 [nm] 平均核心直徑 [nm] 總直徑/核心比 實例la)初始分散液 61 9 6.78 實例lb)濾液 18 6 3.00 實例lc) 殘餘物1 65 35 1.86 殘餘物2 71 未測定 — 實例5 :藉由電子顯微鏡與高解析度電子顯微鏡鑒別多晶性 粒子之多晶性藉由電子顯微鏡與高解析度電子顯微鏡根 II2634.doc -34- 200800275 據諸如透射電子顯微術（TEM)之標準方法在CM2000 FEG(Philips)顯微鏡上以200 kV(HRTEM)來測定。將樣品 放置於在銅網上之經穿孔碳膜上。殘餘物1之粒子以此方 式檢測。在圖2A與2B中顯示不同解析度之結果。 實例6 :使用磁性鐵氧化物粒子之MPI 實例6a)製備MPI實驗之樣品 於PVC板（厚1 mm，橫向尺寸約2x2 mm2)中鑽一直徑為 • 〇.5 mm之孔。一側以膠帶封閉。接著，使用一細銅絲（〇2 mm，經塗覆）將物質逐滴置於該孔内直至該孔完全充滿。 該物質以未稀釋之形式使用。以膠帶封閉孔之開口側且將 該載片膠於玻璃纖維加固之量桿上。接著在所有側上以丙 烯酸類黏合劑密封樣品。 如在DE 101 51 778 A1中所述將樣品安裝κΜρι掃描器 中且量測。不同於如在DE 101 51 788 A1中所述之照影生 成，僅就在不同頻率時量測之信號強度對樣品進行檢測。 φ 為此，在MPI掃描器中使甬磁性梯度場，如在DE 101 51 778 A1 之圖2中及相關之說明所描述。最大梯度場強度為3·4 T/m/μΟ。將如在DE 1〇1 51 778 A1之圖乜中表示為^^⑴的 父變磁場$加於此梯度場上。在梯度場之最大梯度方向上 交變場之振幅為10 mT/_，且頻率為25 25 kHz。在乂耵掃 描器中樣品可機械地轉移，使得可自不同量測點獲得資 料。2當前，記錄52X52個量測點，此等量測點分佈於1〇χ1〇 mm之表面積上。在每一點處之量測時間為〇·4 $。 在於52\52個置測點處記錄之信號中，測定具有最高及 112634.doc -35· 200800275 最低信號強度的信號值m线值為傅裏葉轉卢 因此為複合值。首先’形成最高與最低信號值之直；：八 之間的差及最高與最低信號值之虛擬部分之間的差： ===磁場之_率倍數(，橫軸);= 疋之差千方的和的平方根（y軸或縱軸）繪圖。

實例6b)使用Resovist⑧之MPI 根據實例6a)製備及量測Res〇vist、市售之

Resovist®中之鐵濃度為5〇() mm〇1 ° 品。在 '落果在圖3中Μ

括。觀察馬達約2 5 4立弓區翻i县斗§夕p L 咬口驅勢场頻之#噪比。此外， 驗中獲得可重複结果门錄又π d · ® 旻、〇果（3種不同ReSovlst®批料）。如此 明 Resovist 適合於 Μρι。 口 實例6C)使用根據實例lb)之製劑的ΜΡΙ mmol Fe/1 將根據實例lb)之懸浮液的鐵濃度調節至5〇〇 且接著根據實例6a)製備及量測該製劑。 結果連同比較樣品之結果及實例6d)之結果在圖种顯示。 栌據實例lb)之組合物（濾液）顯示較根據實例h)之 組合物（初始分散液）或Resovist⑧顯著更差之信噪比。 實例6d)使用根據實例u)之製劑的MPI … 將根據實例le)之料液（殘餘物1與殘餘物2)的鐵濃度調 :為：〇 〇mol _且接著根據實例㈣製備及量測該等製 一 果連同比較樣品之結果及實例6c)之結果在圖5中顯 示0 發^含有根據本發明之新穎粒子的組合物·根據實例1C) 之製d颂不較根據實例1a)之初始分散液（及市售之MR造 112634.doc -36- 200800275 影劑之比較樣品，Resovist®)及根據實例lb)之濾液更佳之 信噪比。 包含於根據實例lc)之製劑中的根據本發明之新穎粒子 相應地適合於改良之MPI。 實例6e)使用Resovist®之MPI照影 圖4在照影a中顯示使用根據de 1〇1 51 778之設備及方 法來產生照影之影像的照影。此影像含有複數個腔（在照 景> 中顯示為暗斑），其填充有Res〇vist®。圖4在照影b中顯 示此影像之MPI照影，其中該等以Res〇vist®填充之腔表現 為光區。 實例7·合成螯合劑鐵氧化物粒子及偶合多-組胺酸選擇 素（MECA79)作為活體内造影劑 下文描述將NTA(次氮基三乙酸衍生物；α_Ν_[雙-羧曱 基]離fe酸）偶合至根據實例1)生產之羧基葡聚糠—穩定磁性 鐵氧化物粒子。 為此目的’在黑暗中室溫（RT)下在攪拌下使羧基葡聚 糖-穩定磁性鐵氧化物粒子在水溶液中以3丨倍粒子過量之 南填酸納（以叛基葡聚糖計）氧化3 〇 min。接著經由凝膠過 濾定量分離高碘酸鈉。在磷酸鹽缓衝液中溶析葡聚糖磁鐵 (0·1 Μ磷酸鹽緩衝液pH 7.0)。接著向氧化之葡聚糖磁鐵中 添加NTA且將混合物在黑暗中在RT下以間或之搖動培育2 h。 在該過程中，可使過量之NTA偶合至葡聚糖磁鐵。接著添 加1/10體積之還原劑二甲硼烷（150 mM，在H2o中），且在 黑暗中在RT下在間或之搖動下另外培育2 h。重複上一步 112634.doc -37- 200800275 驟’繼之在4t：下培育隔夜。未結合之nta自結合於粒子 表面之NTA中的分離藉由凝膠過滤或超滤完成。在PBS或 0.1 M HEPES中（在所有情況下pH均為7〇·74)溶析粒子且 藉由添加5 mg/m丨羧基葡聚糖（最終濃度）來穩定。消 該等粒子’且添加最終濃度為〇]%之疊氮化鈉。接著敎 懸浮液之鐵含量及二次平均粒子尺寸。 為檢查NTA與粒子表面之偶合效率，首先在汉7下在間或 之搖動下以10 mM於PBS或(M M HEPES中之EDTA培育粒 子1 h。接著經由凝膠過濾或超濾移除EDTA，且以c〇2+、 Ni2+或由螯合劑錯合相當的二價離子培育樣品。 接著經由凝膠過濾或超濾自該等粒子分離過量的離子。 結合於粒子表面之NTA分子的數量可藉由結合之離子的 ICP量測減去結合於未改質之葡聚糖磁鐵的離子來測定。 實例8 :偶合多-組胺酸-L-選擇素至NTA葡聚糖磁鐵 首先以Ni2+離子（或類似離子）培育載有NTA之葡聚糖磁 鐵’且接著在RT下以處於PBS或0·1 M HEPES中之多組胺 酸標記之選擇素分子以〇β2%乳劑（以減少非特異性結合）培 育10 min。經由適合之超濾裝置或經由具施加之磁場的磁 性柱（Miltenyi Biotec)移除未結合之選擇素分子。活體外 檢查所得之造影劑構造的結合能力，例如在周圍小鼠淋巴 結冰凍切片中，且可接著用於活體内照影實驗。 實例9 :偶合抗生蛋白鏈菌素至根據實例1}之磁性鐵氧化 物粒子 藉由在超離心機中至少3倍沉降來純化根據實例1)之懸 I12634.doc -38- 200800275 孚液，且以0·02❹/〇 TritonXIOO醋酸鈉緩衝溶液（pH 4 5)等體 積提取。以1 ml 2%抗生蛋白鏈菌素溶液處理【ml純化之懸 浮液且在4 C下將其攪拌60分鐘。接著添加丨〇 mg EDC。在 此過程中監測pH值。在PH將要偏離4.5+/_〇·2時，必須使用 〇·〇1 N HC1或0·01 N NaOH再進行調節。 在4°C下攪拌下繼續培育約16小時，且接著以〗M乙醇胺 培月15分鐘來終止。藉由多重離心將結合抗生蛋白鏈菌素 之磁性鐵氧化物粒子自未結合之蛋白質及副產品分離。 藉由添加多重生物素改質之BSa通過聚集檢定來證明偶 合操作之成效。繼添加生物素-BSA_聚集之抗生蛋白鏈菌 素之後，功能化之鐵氧化物粒子產生明顯的聚集物，而另 一方面未處理之鐵氧化物粒子不顯示任何聚集作用且因此 在分散液中保持穩定。 關於偶合成效之定量結論可通過在固定之生物素BS a上 的表面等離子體諧振（Bi〇Core、BioCore2000)獲得。 實例10 ·結合MECA79抗體至根據實例9)之抗生蛋白鏈菌 素功能化之磁性鐵氧化物粒子。 藉由用Hepes緩衝液/TritonXIOO溶液〇·〇ΐ%兩倍離心來純 化根據貝例9)結合抗生蛋白鍵菌素之磁性鐵氧化物粒子， 將具緩衝且濃縮。以1 mg生物素化MECA79抗體培育純化 之微囊體（其現在結合生物素）！小時且接著洗滌。同樣地， 可使用生物素化同型IgM抗體（例如純系R4-22)來生產對照 粒子。 將使用之50%的抗體量結合於微囊體⑺化以代量測：具 112634.doc -39 - 200800275 抗IgM-FITC抗體之飽和柱）。MECA79抗體識別”外周結定 址素（peripheral node adressin)"-配位體基，其僅在外周及 腸系膜淋巴結之高内皮微靜脈上發現。 實例11 :偶合抗小鼠CD105抗體至磁性鐵氧化物粒子 以類似於實例10)之方式使生物素化抗，小鼠CD105抗體結 合於根據實例9)之抗生蛋白鏈菌素功能化的磁性鐵氧化物 粒子。CD 105抗體識別血管生成特異性受體且可用於腫瘤 之照影辅助診斷。

實例I2 :偶合抗小鼠ICAM-1抗艎至磁性鐵氧化物粒子 以類似於貫例10)之方式使生物素化抗小鼠ICAM-1抗體 結合於根據實例9)之抗生蛋白鏈菌素功能化的磁性鐵氧化 物粒子。ICAM-1抗體識別炎症中心體（centers 〇f mflammation)，例如在實驗性小鼠自體免疫腦脊髓炎 (EAE)模型中。對於多發性硬化，EAE模型用作活體内疾 病模型。 【圖式簡單說明】 圖1顯示生產之粒子核心之尺寸的頻率分佈，其中頻率 在〇與1之間（相當於〇%至100%)變化。 圖2枯尤為A之妝影顯不根據實例lc)之組合物（殘餘物” 的丽照影。可見幾個具約35腿之二次平均直徑的非球 狀的核^ ^ β己為B之照影顯示根據㈣殘餘物1)製備之大 核心的高解析度職。可見小單晶之累積，其聚集形成較 大之多晶體。 圖3使用三種不同市售 之Res〇vist<1^料之ΜΡΙ檢測的結 112634.doc 200800275 j °結果顯示在指定驅動場頻（x轴）倍數時獲得之信號的傅 晨葉振幅（y轴）。 圓4標記為A之照影顯示使用de ι〇1 51 778之設備與方 法產生照影之影像。此影像含有複數個腔（在照影中顯示 為暗斑），其填充有Res〇visf。照影B顯示此影像之照影， 其中該等以充之腔表現為光區。 圖s顯示使用根據實例lb)與lc)之製劑（兩平均總直徑不 鲁同）的測結果與市售Resovisf的結果的比較。結果顯 不在指定驅動場頻倍數（X軸）時獲得之信號的傅裏葉振幅以 軸）。

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Claims (1)

1. 200800275 十、申請專利範圍： 1. 一種包含一在一醫藥學上可接受之殼中之直徑為20nm 至1 μ ηι之多晶磁性鐵氧化物核心的粒子。 2·如請求項i之粒子，其特徵在於該醫藥學上可接受之殼 穩定膠體溶液。 3·如請求項1或2之粒子，其特徵在於該醫藥學上可接受之 殼包含合成聚合物或共聚物、澱粉或其衍生物、葡聚糖 或其衍生物、環葡聚糖或其衍生物、脂肪酸、多醣、卵 磷脂或單酸甘油酯、二酸甘油酯或三酸甘油酯或其衍生 物或其混合物。 4 ·如請求項3之粒子，其中 (i) 該合成聚合物或共聚物係選自由以下各物組成之 群·聚氧化乙烯脫水山梨糖醇醋、聚氧化乙稀及其 竹生物、聚氧化丙浠及其衍生物、非離子界面活性 劑、硬脂酸聚烴氧酯（35-80)、聚乙烯醇、聚合蔗 糖、聚經烧基甲基丙烯醯胺、乳酸與經基乙酸共聚 物、1原酸S旨、聚烧基鼠基丙婦酸醋、聚乙二醇、 聚丙二醇、聚甘油、多羥基化聚乙烯基質、聚羥乙 基天冬醯胺、聚胺酸、苯乙烯與順丁烯二酸共聚 物、聚己酸内酯、羧基多醣及聚酐； (ii) 該澱粉衍生物係選自由澱粉2_經甲基醚與經乙基殿 粉組成之群； (iii) 該葡聚糖或其衍生物係選自由以下各物組成之群： 半乳糖苷化葡聚糖、乳糖化葡聚糖、胺化葡聚糖、 112634.doc 200800275 含有SH基之葡聚糖、含錢基之葡聚糖、含有駿基 之葡聚糖、生物素化葡聚糖； ㈣該環糊精係選自由卜環糊精與羥基丙基環糊精组成 之群； (v):脂肪酸係選自由以下各物組成之群：十二烷基硫 酉文鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸、脫水山梨糖醇單月桂酸 酷、脫水山梨糖醇單油酸醋、脫水山梨糖醇單棕櫊 酸醋及脫水山梨糖醇單硬脂酸酯。 5·如請求項丨至4中任―項之粒子’其特徵在於該磁性鐵氧 化物核心包含磁鐵或磁赤鐵或其混合物。 6. 如請求項丨至5中任一項之粒子，其特徵在於該鐵氧化物 核心含有至少五個鐵氧化物單晶。 7. 如請求項⑴中任一項之粒子，其特徵在於該總粒徑為 30 nm至 2 μηι。 其特徵在於該鐵氧化物 其特徵在於該總粒徑/核 其特徵在於聚乙二醇及/ 8. 如請求項1至7中任一項之粒子 核心之直徑為30 nm至500 nm。 9 β如請求項1至8中任一項之粒子 心直徑比率小於6。 10 ·如請求項1至9中任一項之粒子 或t丙一醇殘基為共彳貝或非共價地結合於該粒子之表 •面。 U· —種生產包含一在一醫藥學上可接受之殼中之直徑為2〇 nm至1 μηι之多晶磁性鐵氧化物核心的粒子的方法，該方 法包含以下步驟·· 112634.doc 200800275 ⑴將含有鐵（II)鹽及鐵（III)鹽之混合鐵鹽水溶液與鹼性 水溶液在合成聚合物或共聚物、澱粉或其衍生物、 葡聚糖或其衍生物、環葡聚糖或其衍生物、脂肪 酸、多醣、卵填脂或單酸甘油酯、二酸甘油酯或三 酸甘油酯或其衍生物或其混合物存在下相混合，直 至形成該等粒子之膠體溶液； (h)使該含有粒子之溶液穿過一磁性梯度場； (iii) 移除該磁性梯度場； (iv) 且回收在該梯度場中所留之粒子。 1 2·如清求項11之方法，其特徵在於在另外步驟中選擇預先 確定總粒徑之粒子。 13 · —種可藉由如請求項丨丨或丨2之方法來生產的粒子。 14·種組合物’其特徵在於該等包含於該組合物中之至少 2 /〇粒子為如請求項i至i 〇中任一項之粒子或如請求項u 之粒子，此等粒子含有一在一醫藥學上可接受之殼中之 磁性鐵氧化物核心。 15·如請求項14之組合物，其特徵在於如請求項1至1〇中任 一項之粒子或如請求項13之粒子的粒徑就至少5〇%之該 等粒子而言係在平均粒徑約1〇%範圍内。 1 6. —種流體，其特徵在於其含有如請求項14或〗5之組合 物。 1 7·如凊求項16之流體，其特徵在於該流體呈穩定膠體溶液 形式。 18·種利用如請求項14或15之組合物或如請求項16或17之 112634.doc 200800275 流體用於生產診斷構件的用途，該診斷構件用於磁性粒 子照影（MPI)中以診斷選自由以下疾病組成之群的疾 病：增生疾病；炎性疾病；自體免疫疾病；消化道疾 病；動脈硬化；中風；梗塞；血管系統、淋巴系統、騰 腺、肝臟、腎臟、腦及膀胱病變以及影響電刺激傳輸之 疾病及神經退化性疾病。 19. 一種組合物之用途，其特徵在於該等包含於該組合物中 之至少2%的粒子為含有一多晶磁性鐵氧化物核心的粒子 以生產用於磁性粒子照影（MPI)中供診斷疾病用之診斷 構件，此等粒子含有一在一醫藥學上可接受之殼中之磁 性鐵氧化物核心，該疾病係選自由以下疾病組成之群·· 增生疾病；炎性疾病；自體免疫疾病；消化道疾病；動 脈硬化；中風；梗塞；血管系統、淋巴系統、胰腺、肝 臟、腎臟、腦及膀胱病變以及影響電刺激傳輸之疾病及 神經退化性疾病。 20·如請求項18或19之用途，其中該等粒子藉由包含以下步 驟之方法來偵測： (i) 產生一具有磁場強度空間進程之磁場，其使得在檢 測區中獲得一具低磁場強度之第一局部區域及一具 較高之磁場強度的 第二局部區域； (ii) 改I該專兩局部區域在該檢測區中之空間位置，使 得該等粒子之磁化局部地變化； (m)記錄取決於受此改變影響之在該檢測區中的磁化的 信號； 112634.doc 200800275 (iv)評估該等信號以獲得關於該等磁性粒子在該檢測區 中之空間分佈的資訊。 21·如凊求項20之用途’其特徵在於執行該㈣之配置包含 以下構件： a) 用於產生一具磁場強度空間進程之磁場的構件，其 使得在該檢測區中獲得一具低磁場強度之第一局部 區域及一具較高之磁場強度的第二局部區域； b) 用於改I v亥等兩局部區域在該檢測區中之空間位置 的構件’其使得該等粒子之磁化局部地變化； c) 記錄信號之構件，該等信號取決於已受此空間位置 之變化影響之該檢測區中的磁化作用； d) 用於評估該等信號以獲矸關於該等磁性粒子在該檢 測區中之空間分佈之資訊的構件。 22·如請求項18至21中任一項之用途，其特徵在於該增生疾 病係選自由腫瘤、癌症前期病症、發育異常、子宮内膜 異位及轉化組成之群。 23 ‘如請求項18至21中任一項之用途，其特徵在於該自身兔 疫病係選自由以下疾病組成之群：類風濕關節炎、炎症 性腸病、骨關節炎、神經性疼痛、斑形脫髮、牛皮癖、 牛皮癖關節炎、急性胰腺炎、同種異體移植排斥反應、 過敏、肺過敏性炎症、多發性硬化、阿茲海默氏症 (Alzheimer’s disease)、克羅恩氏病（Crohn，s disease)及全 身性紅斑狼瘡。 I12634.doc