TW200800158A - Methods for neuroprotection - Google Patents

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200800158 九、發明說明： 本發明之ϋ 【發明所屬之技術領域】 本發明之逢域 5 本發明一般係關於藥理學，神經病理學及精神病學之領 域及關於保護哺乳動物中樞神經系統之細胞免於傷害或損 傷的方法。更特別的，本發明係提供使用特定之胺基甲酸 Φ 酯化合物於神經保護的方法。 【先前技術】 10 相關技藝的說明 " 各種中樞神經系統(CNS)或末梢神經系統(PNS)之損傷 • 及外傷可產生深遠且長久的神經性及/或精神病性症狀及疾 病。一種可採用的型式為中樞神經系統(CNS)之神經元或其 他細胞之進行性死亡，亦即，神經變性或神經元變性。神 I5經元變性係為例如，阿茲海默氏症，多發性硬化，腦_血管 #意外(CVAs)中風，外傷性腦部損傷，脊椎索損傷，視神經 病變，例如，缺血性視神經病變或視網膜病變及其他中樞 神經系統疾病的結果，由於長·期後遺症之高發生率及高頻 率而為重大的醫藥及公共健康問題。動物研究及臨床實驗 20顯示胺基酸傳遞質（尤其是麵胺酸鹽），氧化的壓力及發炎 作用強烈地助長此等症狀中之細胞死亡。 當損傷或當缺血性傷害時，彳員傷的神經元釋放大量對周 圍的神、、.工元激發毒性之神經傳遞質麵胺酸鹽（柯義等， (間’神經元i : 6細；洛斯曼等，⑽4)，神經科學 6 200800158 期刊4 ·’柯義與洛斯曼，⑽· 年鑑⑴大衛等，⑽8)，眼睛研 口顧 657·662;迪戎等，⑽5)，神經科學期刊45:145_151。敍 胺酸鹽係為負電性的胺基酸，哺 麩 5 10 15 20 發毒性之突觸傳遞質。雖缺在神神經系統中激 可遠到百萬輩耳筋，端中麩胺酸鹽之濃度 了達到百萬4耳fc® ’其細料的濃度維持在 避免神經毒性◊業已注意到如果麩胺酸睡以古、農 對神經元具毒性。，，激發毒性”―詞業㈢ =胞及其他此等刺激性胺_可在= 生理性地過賴放，抑制吸收，或二者可達到 楚胺酸鹽。通常，低濃度細胞外的麵胺酸鹽係藉由神= 及星形細胞二者來維持。神經元將麩 始 ^大學報刊，測，173-181頁（SK沙滋曼，从發登編 輯）。星形細胞係藉著特定的運送器提取細胞外的_酸睡 且將麩胺酸鹽化成麩胺酸，然後釋放以供神經元提取。: 見，Μ·Β·羅賓森&LA.多德，先進藥理學，1997 ; 37 · 1^5、。於激發毒性之過程中，麵胺酸鹽係藉由神經元而以 仃-永存的方式釋放出來，導致麩胺酸鹽受體過量或長 活性。 ^ 此等過量麵胺酸鹽在能量-耗盡之神經元上刺激與神經 持性星形細胞的協調能力連結’以隔離細胞外導致神經 7 200800158 =經由壞死及細胞凋亡而死亡之麩胺酸鹽的毒性濃度。目 前進行檢驗各種介入以降低伴隨有中樞神經系統損傷及疾 病之神經元死亡。參見，克默等，細胞組織研究2⑽： 395 ’ 1999。此等治療法包括楚胺酸鹽釋放抑制劑，楚胺酸 5鹽文體拮抗劑，Ca2+通道阻斷劑，GABA受體激動劑，神 經結醣酯，神經營養因子，卡潘蛋白酶(ealpain)抑制劑，卡 司帕西酶(caspase)抑制劑，自由基淨化劑，免疫-及細胞代 g 謝調節劑。 例如’許多研究業已顯示麩胺酸鹽涉及病理生理學中： 川1)予丁頓氏舞蹈病（HD)(柯義爾及史瓦滋，（1976)，自然 263 : 244-246 ; 2)阿茲海默氏症馬直古斯等， 、（1987) ’ TINS 10 : 65·68 ; 3)癲癇症（納德勒等，（1978)，自 然271 : 676-677) ; 4)山黧豆素中毒（史賓塞等，（1986)， 蘭塞特239 : 1066-1067 ; 5)肌萎縮性侧索硬化(ALS)及關 15島帕金森氏癡呆（凱恩等，（1986)，蘭塞特2 ·· 1067-1070)以 鲁及於伴卩現者中風’局部缺jk及再灌注之神經病理學（參見， 戴肯等，（1987)，神經化學期刊49 : 1222-1228)。 因此’神經元之損傷可能係由刺激性胺基酸包括麩胺酸 鹽及門冬胺酸鹽過度刺激受體所引起（參見，里普頓等 2〇 (1994)新英格蘭醫學期刊33〇 ·· 613 621)。確實，麩胺酸鹽 受體之N_甲基門冬胺酸鹽(NMDA)亞型被聯想到在正常 腦功能中具有許多重要的任務，包括突觸的傳輸，學習及 記憶，及神經元發展（參見，里普頓等（丨994)如前；美爾壯 等（1990)醫藥科學趨勢u : 379_387)。然而，過度刺激麩胺 8 200800158 酸鹽文體之NMDA亞型導致自由基生成及神經元細胞死亡 增加，其可藉由抗氧化劑來調節（參見，賀鈴等(2〇〇1)神經 化學期刊78 : 1307-1314 ;羅薩妥等（2002)神經科學文獻 318 : 137-140)。 5 此外，於許多慢性神經變性症狀中，發炎及氧化的壓力 為病理學的主要要素《此等症狀包括阿茲海默氏症(ad)。 阿茲海默氏症（AD)之特徵在於神經微纖維糾結與老人斑之 φ 蓄積，及腦中神經元之廣泛性，進行性變性❶老人斑富含 位在染色體21上之APP基因所編碼的澱粉樣蛋白前^蛋 10白質（APP)。在AD之發病原理下一般可接受的假說係App •之不正常解朊性裂解導致β-澱粉樣蛋白（Αβ)胜肽之過量細 '胞外的蓄積，其業已顯示對神經元具毒性（參見，薛柯也 等，（1996)，生物化學期刊271 : 487·498 ;奎恩等’ (2001) ’神經學實驗168 : 203·212 ;馬特森等，（19二)·，阿 I5兹海默氏症回顧12 : 1-14 ;博山等，（1994)，腦部研办 ⑩ 667 : 269-272)。 ° 九 帕金森氏症(PD)係為具有運動機能障礙特徵之進行性神 經變性疾病，其包括運動不能，僵硬，震顫及姿勢異常。 該疾疾病狀業已伴隨著黑·，紋狀體的源自多巴胺之神2元的 20完整性及官能性之損失，係藉由物質黑質部分緻密層（sNpc) 中源自多巴胺神經元之實質損失而證實（參見，巴肯柏等 (1991)神經學神經手術精神病學54 : 30-33)，及多巴胺於紋 狀體中含量減少’突觸及痕疹性運送器（參見，例如，古德 曼等（1997)神經學 48 : 1578-1583)。 ' 9 200800158 外傷，許多種類損傷，局部缺血，代謝混亂，例如，糖 尿病’組織缺血，毒素或手術參與引起急性及慢性二者及 進打性功能損失及能力喪失的結果使得哺乳動物包括人類 之中樞(CNS)或末梢_)神經系统中神經元及支持細胞之 5死亡因此，⑥要發展㈣保護哺乳動物神經系統免於該 變性，亦即具神經保護之方法及化合物。 【發明内容】 》 本發明之摘要 本發明通常係關於神經保護的方法且更特別係關於預防 10由外傷’手術或急性m域過簡造成哺乳動物中梅 及末梢神經系統細胞損傷的方法及化合物。 本發明部份係根據—或多員胺基甲酸醋化合物單獨或虚 :種或多種其他神經保護醫藥品合併，投藥至哺乳動㈣ 經系統上而挺供神經保護效應之發現。 15 本發明所提供之神經保護係包括保護由神_傷或傷室 .及由包括激發毒性之神經毒性所產生的傷害。因此，本ς 明所提供之神經保護係有用於治療涉及激發毒性，例如， 麩胺酸鹽激發毒性，包括中風/局部缺血滿手術外傷，外 性腦部損傷（ΤΒΙ) ’鈍性，閉鎖性或穿透性頭部外傷，癲 2〇癇，亨丁頓氏舞蹈病，肌萎縮性侧索硬化(ALS)，糖尿病性 神經病理學及低血糖性腦病之急性及慢性神經變性疾病。 本發明所提供之神經保護可為損傷性或疾病性組織所造 成者或預计導致神經抽傷事件中或前之預防性方式者。 本發明係提供神經保護的方法，其係於需要其之個體中 200800158 藉著將有效量之本發明化合物，或其製藥上可接受的鹽或 酯，單獨或與另一醫藥品以及製藥上可接受的賦形劑一起 給藥至個體，用於抑制細胞變性或細胞死亡；用於治療或 預防神經變性疾病；或用於改善化合物之細胞毒性效應（例 5 如，刺激性胺基酸例如麩胺酸鹽；毒性；或細胞毒性副作 用之預防性或治療性化合物）。於各種具體例中，本發明的 方法包括保護以對抗激發毒性，例如，麩胺酸鹽激發毒 性。 於各種具體例中，個體，例如，人類可為罹患神經傷害 10 或損傷者；或可為罹患選自濫用藥物，外傷，中風，局部 缺血，亨丁頓氏舞蹈病，阿兹海默氏症，帕金森氏症，傳 染性蛋白質疾病，變化性克-埃二氏病，肌萎縮性或低血糖 性腦病之症狀者；或可為進行手術或其他參與者。具有預 先存在症狀的患者可藉由神經保護而獲益或者患者可經治 15 療以降低同時或隨即，例如於手術或其他參與時發生之神 > 經損傷的毒害產生效應。 因此，本發明係提供用於提供神經保護的方法，其包括 將治療有效量之包括至少一種具式1或式2之化合物的組 合物給藥至需要其之個體中： 20 Xj OH Ri K2

200800158 5 式2 其中，Ri，R2，R3，及R4獨立為氫或CVQ烷基；且 X!，X2，X3，X4及X5獨立為氫，氟，氯，溴或碘。式1 10 或式2之該CrC4烷基基團可經取代或未經取代。本發明 之一觀點中，CrC4烷基基團可被苯基所取代。苯基可為 未經取代或經取代。於某些具體例中，苯基係未經取代或 經鹵素，Ci_C4烷基，CrC4烷氧基，胺基，硝基，或氰基 所取代。 15 於本發明中，X!，X2，X3，X4，及X5可為氳，氟， 氯，溴或碘。於特定具體例中，Xl，X2，X3，X4，及X5 獨立為氩或氯。於本發明較佳具體例中，Xl為氟，氯，溴 或碘。於一方面中，Xi為氯且x2，x3，x4，及x5獨立為 氩。於另一較佳具體例中，Rl，R2，R3，及R4獨立為 20 氫。 本發明係提供式1或式2之對映體於個體中以提供神經 保護。於特定具體例中，式1或式2之化合物係以其單一 對映體的型式。於其他具體例中，式1或式2之化合物係 以對映體混合物的型式，其中之一對映體係較另一對映體 12 200800158 顯著。於一方面中，該對映體係顯著至90%或更大的程度 或至98%或更大的程度。 本發明亦提供方法，其包括給藥至個體以神經保護量的 組成物，其係包括至少一種具式1或式2之化合物，其 5中’ R1，心，R3，及R4獨立為氫或CVCU烷基；且X! ’ X2 ’ X3 ’ X4，及X5獨立為氫，氟，氯，溴或碘。於一具 體例中，組成物投藥至個體之前，予以轉定個體是否罹患 φ 某種型式之急性或慢性神經變性或神經系統損傷。 本發明亦提供方法，其包括確認患者係處於發展急性或 10慢性神經變性或神經系統損傷或需要用如下列所定義之神 - 經保護藥物(NpD)治療之風險中，且將包含至少一種具有式 ， 1或式2化合物的組成物給藥至個體。 於本發明之特定具體例中，用於提供神經保護治療有效 量之具式1或式2的化合物為由於〇·〇ι毫克/公斤/劑量至 I5於150毫克/公斤/劑量。 φ 於特定具體例中，係將可提供神經保護治療有效量之包 括一種或多種本發明的對映體或其製藥上可接受的鹽或酯 及製藥上可接受的載體或赋形劑之製藥組成物給藥至需要 用神經保護藥物或NPD處理的個體或病患。 20 包括至少一種具式1或式2化合物之製藥組成物係給藥 至需要其之個體中。於特定具體例中，需要用神經保護藥 物或NPD處理之個體或病患可為經歷某種型式之中樞及末 梢神經系統細胞急性外傷或損傷者或其具有某種型式之急 性或慢性神經變性疾病奢。於一方面中，個體或病患係在 13 200800158 給藥時被決定係在發展急性或慢性神_性 亦即，需要用神經保護藥物處理之病患， 中，需要其之個體係為给荜時竟黧 八/、體例 急性損傷或外傷者為、等之神經系統的細胞具有 5 本發明之詳纟 本發明之胺基甲酸酯化合物 一本發曰月係:提供使用2_笨基_u_乙二醇一胺基甲酸醋及 -胺土曱至需要其之病患中以提供神經保護的方法。 使用於本發明方法中之合成及純化包括胺基甲酸醋對映 10體之胺基甲酸酯化合物的適當方法係此方面技藝中之人士 所熟知者。例如，2_苯基-U_乙二醇一胺基f酸酯及二胺 基甲酸酯之純對映型式及對映體混合物係說明於美國專利 案第5,854,283 ’ 5,698,588及6，103,759號中，其所揭示内 容完全合併於本文中作為參考。 15 根據本發明之代表性胺基甲酸酯化合物係包括彼等具有 式1或式2者： 20 式1

X】 OH Χ3

Xs

r2 ο Χ4 14 200800158 5 式2

Q

X4 10 15 其中，Rl ’R2’ R3及尺4獨立為氧或Ci_c X2，XS，X4,及X5獨立為氫，氟，氯，填或峨土 15 本文中所狀'cvc4嫁基，，一詞係指含有^^ 碳原子之經取代或未經取代的脂族烴類。 ^ 将別包含於 基夕之定義内者為彼等任意地經取代之脂族烴類。於= 明較佳具體例中’ CpQ炫基為未經取代或經苯基 代。 本文中所用之 '苯基〜詞，不管是單獨使用或 一基團之一部份係定義為含有6個碳原子之經取代或 取代之芳族烴環基團。特別包含於、、笨基〃之定義内者為 彼等任意地經取代之笨基基團。例如，於本發明較佳且; 例中，m團係未經取代或㈣素，CK：4燒&體 C1-C4烷氧基，胺基，硝基，或氰基所取代。 疋土， 於本發明較佳具體财，Xl 切且χ， Χ3，Χ4，及 χ5 為氫。 2 於本發明另—較佳具體例中，X1，χ2，Χ3 獨立為氯或氫。 A Χ5 皆為 於本發明另一較佳具體例中，R!，R2，Rs，及r4 20 200800158 氫。 應瞭解妁是在本發明化合物上之取代基及取代型式可由 精於此方面技藝之人士選擇以提供化學性穩定且其可藉著 已知於此方面技藝中之技術以及本文中所提供的方法而容 5易地合成的化合物。 代表性2-苯基-1，2-乙二醇一胺基甲酸酯及二胺基甲酸 酯包括，例如，下列之化合物：

16 0200800158 式5 Χι r3 R4

Ri X2 R2 5 x5 式6

式7 〇 •nh2

本發明係包括單離之式1或式2對映體的用途。於一較 20 佳具體例中，包含單離之式1之S-對映體的製藥組成物係 用於患者中以提供神經保護。於另一較佳具體例中，包含 單離之式2之R-對映體的製藥組成物係用於患者中以提供 神經保護。於另一具體例中，包含單離之式1之S_對映體 及單離之式2之R·對映體的製藥組成物可用於患者中以提 17 200800158

式8 本發明係提供使用式1及式2所代表之化合物的對映體 及對映體混合物的方法。式1或式2之胺基甲酸酯對映體 15在苄基位置上含有不對稱掌性碳，其係鄰接於苯基環之脂 族碳。 > 經單離的對映體為實質上不含相關對映體者。因此， 經單離的對映體係指經由分離技術分離或經製備不含相關 對映體之化合物。本文中所用之a實質上不含〃一詞係指 2〇 化合物係由一種明顯較大比例之對映體所組成。於較佳具 體例中，化合物包括至少約90重量％較佳的對映體。於本 發明之其他具體例中，化合物包括至少約99重量％較佳的 對映體。較佳的對映體可藉由任何精於此方面技藝之人士 所熟知的任何方法，包括高效液體色層分析法(HPLC)及 19 200800158 供神經保護。 本發明亦包括式1或式2之對映體混合物的用途。於本 發明之一方面中，一種對映體j占優勢。混合物中佔優勢之 對映體係為以大於任何其他存在於混合物中之對映體之數 5 量，例如，以大於50%之量存在於混合物中者。於一方 面，一種對映體係顯著至90%的程度或至91%，92%， 93%，94%，95%，96%，97%或98%或更大的程度。於一 較佳具體例中，於包含式1化合物之組成物中佔優勢的對 映體係為式1之s_對映體。於另一較佳具體例_，於包含 10 式2化合物之組成物中佔優勢的對映體係為式2的R-對映 於本發明較佳具體例中，本發明之組成物中以單獨的對 15 映體或以顯著的對映體存在之對映體係以式3或式5代 表，其中，Xi，X2，X3，X4，X5，Ri，R2，R3，及 R4 係 定義如前，或以式7或式8代表。

20 式3

200800158 對掌鹽之形成與結晶作用’從外消旋混合物中單離出來， 或較佳的對映體可藉著本文中所說明的方法製備。 製備較佳之對映體的方法應為精於此方面技藝之人士 所已知且說明於，例如，佳克等，對映體，外消旋物及離 5析作用（威萊科學間，紐約，1981) ; S.H·威蘭等，四面體 33 : 2725(1977) ; E丄·艾里爾，碳化合物之立體化學（馬克 葛羅-丘地，NY，1962);及S.H·烕蘭，溶解劑及光分辨能 • 力之表列，第268頁（E.L·艾里爾編撰；聖母院出版大學， 聖母院，IN 1972)中。 10 此外，本發明之化合物可如說明於美國專利案第 3,265,728 (其所揭示内容完全合併於本文中作為參考且用 於所有的目的上），3,313,692 (其所揭示内容完全合併於本 文中作為參考且用於所有的目的上）號及前文所參考之美國 專利案第5,854,283，5,698,588，及6，103,759 (其所揭示内 15容完全合併於本文中作為參考且用於所有的目的上)號中者 • 製備。 神經保護之本質 具有任何類型中樞（CNS)或末梢（pNs)神經系統之損傷 或傷害包括視網膜之病患可從此等神經保護方法中獲益。 該神經系統損傷可以為突然傷害或急性損傷神經系統之型 式如，例如，於包括，但不侷限於急性神經變性疾病中 者，急性損傷，組織缺氧-局部缺企或其組合導致神經元細 胞死亡或受到連累。急性損傷包括，但不侷限於，外傷性 腦部損傷(TBI)包括，閉鎖性，鈍性或穿透性頭部外傷，局 20 200800158 部腦部外傷，擴散性腦部傷害，脊 的病灶(包括，但不侷限於，挫傷，；诱上傷，顱内或椎間 索之壓傷或穿傷& α 、 穿透傷，剪切傷，脊椎 此外Υ傷或搖慑嬰兒之頸部扭傷症候群。 5 10 20 ，軋或血供應喪失通常可引起，如於缸鑣缺翁芬/ ί局部缺▲中之急性損傷，包括，但不侷限於\腦血^ =全’腦局部缺血或腦梗塞(包括，但不侷二 栓塞性閉塞及血拾之腦局部缺血 (糖尿病性或其他)，青光眼，視網 出生$血性簡經錢，急性局部缺蚊後的再灌注， 顱内Γ:二織，二損2任何類型之心臟停滞或 膜下或腦_^^ 的，硬膜下的，给蛛 神經系統組織之外傷或損傷亦可以更慢性之 15 之 之進行性神經變性疾病，包括，但不侷限於，阿茲海默氏 症’帕金森氏症，擴散性里維氏體疾病，進行性核上的癱 疾（史爾-里察森二氏症候群(SteeiHehardson syndrome)， 多發性系統變性（塞·德拉格氏症候群），伴隨著神經變性之 慢性癲癇性疾病，運動性神經元疾病（肌萎縮性侧索硬 化）’多發性硬化，變性運動失調，皮質基底變性，關島 ALS•帕金森氏症-癡呆症複徵，亞急性硬化性全腦炎，亨丁 頓氏舞蹈病’帕金森氏症，synucleinopathies (包括多發性 系統萎縮症），原發性進行性失語症，紋狀黑質的變性， 馬·約一氏疾病（Machado-Joseph disease)或第三型脊聽與小 21 200800158 腦的失調症及撖欖體橋腦小腦萎縮變性，延髓及假性延髓 的癍瘓’脊椎及脊髓與延髓之肌肉萎縮症（甘迺迪氏症）， 原發性侧索硬化，家族性痙攣性下身麻痒，沃-赫二氏病 (Werdnig-Hoffmaim disease)，庫-魏二氏病（Kugelbery-5 Welander disease)，泰赛二氏病（Tay-Sachs disease)，家族 性痙攣疾病’渥《•庫·魏三氏病（Wohlfart-Kugelbery-Welander disease)，痙攣性下身輕癱，進行性多病灶性腦白質病，家 φ 族性自主神經機能障礙（李-德二氏症候群（Riley-Day syndrome))或傳染性蛋白質病（包括，但不侷限於，克·埃二 10 氏病（Creutzfeld麵Jakob disease)，格-史·舒三氏病 (Gerstmann-Strussler-Scheinker disease)，庫魯病（Kuru disease)或致命性家族失眠症）。 此外，神經系統之外傷及進行性損傷可在各種精神病性 疾病中發生’包括，但不侷限於，進行性，退化性型式之 1S兩極性疾病或精神錯亂及失常障礙或精神分裂症，神經衝 Φ 動控制疾病，強迫觀念-強迫行為疾病（OCD)，顳頁癲癇症 中之行為改變及人格障礙。 於較佳具體例中，本發明之化合物係用於各種精神病性 疾病中涉及神經系統的外傷及進行性損傷之疾病提供神經 2〇保護。此等疾病係選自下列的群組，包括：精神錯亂及失 常的障礙，精神分裂症’神經衝動控制疾病， A % 迫行為疾病(OCD)及人格障礙。 m 此外，外傷及損傷可為伴隨著明顯及廣泛記憶喪失之疾 病的型式，其包括，但不侷限於，伴隨著與年齡相關之癌 22 200800158 呆的神經變性疾病，血管性癡呆，擴散性 句〇物質疾病（比 瓦格氏病（Binswanger’s disease))，内分泌或、 癡呆，頭部外傷及擴散性腦部傷害的癡呆，' 源的 t 、’錢呆性拳墼车 或前葉癡呆，其包括，但不侷限於，紅肢病。 5 10 15 20 伴隨著神經元傷害之其他疾病包括’值不侷限於 著包括視網膜之神經系統之化學性，毒杻，# & ^ " 注感染性及放射 性損傷之疾病，胎兒發展期之損傷，出生時早產， 那 局部缺血，來自於肝，血糖，尿毒，電觫哲 、軋眭· ,^ 鮮質及内分泌來源 之損傷，精神病來源之損傷（包括，但不俩_ '、 |柯喂於，精神供 亂，抑鬱，焦慮），來自於神經末梢疾病及神經叢失曰 括神經叢癱瘓）之損傷或來自於神經病變之損傷（包括 多病灶’感覺，運動，感覺-運動’自主性， 歡-目主性 或髓鞘脫失神經病變之神經病變（包括，但不偈限於，格 巴二氏症候群(Guillain-Barre syndrome)或慢性發炎性趙勒 脫失多神經根神經病）或彼等源自於感染，發炎，免疫疾 病，藥物濫用，藥理治療，毒物，外傷之神經病變（包括;，、 但不侷限於，壓傷，擠傷，裂傷或節裂外傷），代謝性疾病 (包括，但不侷限於，内分泌或贅瘤旁的），夏-馬二氏牙歯 疾病（Cliarcot-Marie-Tooth disease)(包括，但不侷限於，經 la ’ lb，2，4a 或 1-X 型連接），弗利希氏病（Friedreich，s ataxia) ’異染性的腦質障礙症，雷素姆氏病（Refsum，s disease)，腎上腺髒質神經性病變，失調症毛細管擴張，迪 戎·索塔二氏症(Djerine_s〇ttas)(包括，但不侷限於，A或B 型）’朗柏-伊頓二氏症候群(Lambert-Eaton syndrome)或頭蓋 23 200800158 骨的神經）。 因此，本文中所用之、、神經保護"一詞應指抑制，避 5

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免，改善或降低哺乳類包括人類中樞或末梢神經系統中之 機成障礙的嚴重性，神經細胞之變性或死亡，體抽或其等 之支持細胞。此包括於需要其之病患中治療或預防神經變 性疾病；保護對抗化合物之激發毒性或改善細胞毒害效應 (例如，刺激性的胺基酸例如，麩胺酸鹽；毒素；或預防性 或治療性化合物其可發揮立即或延遲的細胞毒性副作用包 括但不侷限於立即或延遲誘發細胞凋亡）。 因此，本文中所用之、、需要用神經保護藥物(NPD)處理 之病患〃一詞係指任何病患其目前具有或可發展任何上述 症候群或疾病，或任何疾病其中病患出現臨床症狀或預後 者可從提供神經保護中獲益以預防發展，擴展，惡化或抗 性增加以治療任何神經性或精神病悸疾病。 、抗癲癇藥物# (AED)—詞係與、、抗痙攣試劑夕一詞交 替使用且如本文中所用者，二詞均係指當將試劑給藥至個 體或病患時，具有能夠抑制（例如，避免減緩，停止，'壶 轉)癲癇發作或腦病產生(ictogenesis)之活性的試劑。3 20 經 可 例如 藥效原子夕一詞係已知於此方面之技藝中，且 中所用者，係指能夠發揮選擇性生物化學效應，例如文 制酵素，連接至受體，離子之螯合作用等之分子基圈’抑 選擇的藥效原子可具有超過一種生物化學效應 土 為一種酵素之抑制劑及第二種酵素之激動劑。治療劑口 括一種4多種藥效原子，其可具有相同或不同的生物 24 200800158 活性。 本文中所用之a處理中〃或、、處理夕一詞係指任何成功 地預防或改善損傷，病變或症狀的指標，其包括任何目標 或主體參數例如症狀之減輕；緩解；縮減或使損傷，病 5變’或症狀對病患更耐受；緩慢變性或衰退之速率；使變 性之最終點稍削弱；或改進患者之身體或精神愉悦。症狀 之處理或改善可根據目標或主體參數；包括身體檢驗的結 _ 果，神經病學檢驗，及/或精神病學評估。因此，、處理 中或處理〃一詞包括投服本發明之化合物或試劑以提 ίο供神經保護。於某些範例中，用本發明之化合物處理係與 其他神經保護化合物或AED'S合併以預防，抑制，或停滯 - 神經元死亡或傷害或腦機能障礙或腦過度興奮 (hyperexcitability)之進展 〇 本文中所用之、、治療效應〃一詞係指神經保護效庳之有 I5效的準備以避免或減小病患之中樞及末梢神經系統:細胞 ^ 之死亡或傷害或機能障礙。 、 本文中所狀、治療有效F -詞係指於需要此等神經 保護處理之病患中以產生如前文中所定義之治療效應之一 種或多種本發明化合物的足夠量。 ' · 2〇 本文中交替使用及本文中所用之、、個體〃或 '病串/一 兩係指可投服本發明化合物之任何哺乳類，意勺括，但不 侷限於，人類個體或病患。哺乳類一詞包括人^病患及非_ 人類靈長類，以及實驗動物例如兔子，大老氣，1小老 鼠，及其他動物。 25 200800158 5 10 15 20 於某呰具體例中，本發明的方法可有利地用於治療病患 其並未罹患或已知罹患此方面技藝中已知之可用胺基甲酸 酯化合物或目前已知神經保護化合物或AED，s有效處理之 疾病。於此等情況中，使用本發明之方法及化合物係根據 病患是否為如定義如前之，，需要用神經保護藥物(NPD)處理 之病患”一詞所做的確認而決定。 於某些具體例中，本發明係提供神經保護的方法。於特 疋具體例中，此等方法係包括將治療有效量之本發明的胺 基曱酸酯化合物給藥至病患，其係尚未發展出對神經系統 細胞顯明，臨床的損傷或傷害之徵兆或症候群，但由於神 經系統損傷或外傷或由於某些已知生物化學或基因性素質 或發現此等障礙之-種❹種經證實的生物標記而可能為 發展神經元損傷之高風險群。 此M 些具體例中，本發明之方法及組成物係對於 直接趨風ΪΓΓ未發展出臨床證據之患 可藉由確認主家;病=單:在，，較咖 ：-1： ^ :風險〃之確認可用來 合物處理㈣例巾’可從本發狀方法及化 元傷害之風二用：受的掃描方法測定神經 i實。此等掃描方法包括，例如，習 26 200800158 用作業以測定風險因子，其包括但不侷限於，例如，閉鎖 性或穿透性之頭部外傷，CNS感染，細菌性或病毒性腦灰 管疾病包括但不偈限於中風，腦腫瘤，腦水腫，囊尾幼蟲 病，吡咯紫質沉著病，藥物戒除包括但不侷限於鎮靜性_安 5眠藥或酒精戒斷，不正常之出生前後的歷史包括出生時之 缺氧症或任何類型之出生損傷’大腦癱瘓，學習不良，過 度反應，孩童熱病性痙攣史，癲癇性重積狀態史，癲痛< φ 任何與癲癇發作相關疾病之家族史，腦發炎性疾病包括， 狼瘡，直接或藉由胎盤傳送之藥物中毒，包括但不偈限於 10古柯鹼毒藥，父母親的血緣，及用對於神經系統毒害（包括 ^ 影響精神之醫藥品）之醫藥品的處理。 ▲ 可根據各種A代用品標記或、生物標記來決定不具 臨床徵兆或症狀用NPD處理而獲益之病患。 ^ 本文中所用之、、代用品標記〃及、、生物標記〃一詞係交 I5替使用且係指任何解剖學，生物化學，結構，電性，基因 籲或化學指示或標記，其可碟實地與目前存在或未來發$之 神經元傷害相吻合者。於某些範例中，腦-顯影技術，例 如，電腦斷層攝影法(CT)，磁共振顯影(MRI)或正電子發射 斷層攝影法(PET)，可用於決定個體是否冒著神經元傷害之 20 風險。 本發明方法之適當生物標記包括但不侷限於：藉由 MRI ’ CT或其他顯影技術駭海馬巾之硬化，萎縮症或體 積流失或顯明的中線顳硬化(MTS)或類似相關解剖學的病 理學，檢測病患之血液中，分子類之血清或組織，例如蛋 27 200800158 白質或其他生物化學的生物標記，例如，睫狀體神經營養 因子（CNTF)提升的程度或神經元降解產物提昇的血清濃 度；或其他來自於需要用神經保護藥物處理之病患之代用 品標記或生物標記的證明。 5 期望的是將來能發展出更多此等使用各種偵測技術之生 物標記。應想要任何此等現存的或可能未來發展之神經元 傷害的標記或指示，如本文中所用之後面的名稱，可用於 φ 本發明之方法中以決定用本發明之化合物及方法處理之需 要性。 10 個體具有，或可能冒著發展神經元傷害之風險之確認亦 將包括，例如，醫藥評估其包括完整的病史，身體檢查， . 及一系列相關的血液試驗。其亦可包括腦電波(EEG)， CT，MRI或PET掃描。發展神經元傷害或損傷增加的風險 亦可藉助於基因試驗，包括基因表現態樣或含基因組之蛋 15 白質技術(proteomic techniques)而讀認（參見，D·炎密特， ⑩ Μ·Α·洛佳維斯基，癲癇症研究50 ; 71-78 (2002)，及w•洛 史，D.史密特，癲癇症研究50 ; 3-16(2002))。 至於可以藉由神經保護藥物穩定或改善之精神性疾病， 例如，兩極性障礙，精神錯亂及失常的障礙，精神分裂 2〇症，神經衝動控制障礙等，上述試驗亦可包括目前狀•離、檢 驗及病患症狀過程之詳細史，例如於一段期間之情緒障礙 症狀及精神病性症狀及相關於病患已接受一段期間之其他 處理，例如，生命圖。此等及其他特定及慣常的方法使得 臨床師可使用本發明的方法及調配物來選擇需要治療之病 28 200800158 患0 於本發明某些具體例中，適當使用於本發明操作中之胺 基甲酸酯化合物係單一地或與至少一種或多種其他化合物 或治療劑’例如，與其他神經保護藥物或抗癲癇藥物，抗 5痙攣藥物相容性地一起給藥。於此等具體例中，本發明係 於病患中提供治療或預防神經元損傷的方法。該方法包括 給樂至需要處理之病患的步驟，有效量之本文中所揭示的 參胺基甲酸酯之一種與有效量之一種或多種其他化合物或治 療劑其具有提供神經保護的能力或治療或預防癲癇發作或 10癲癇產生的能力或增進本發明化合物之神經保護效應的能 力0 15

20 化合物，治療劑或已知的藥物與本發明之化合物之*共 伴給藥〃或、、合併給藥〃一詞係指藥物與一種或多種化合 物給藥，於此時已知的藥物及化合物二者將具有治療的效 應某些情況中，該治療效應係協乘的。此等共伴給藥可 涉^並行（亦即，同時）’於前’或之後的藥物給藥與有關 本發明化合物之給藥。-般精於此方面技藝之人士於決定 特別的藥物及本發明化合物之給_適#時間，次序及劑 量上沒有困難。 搞4 μ種他化合物或治療劑可選自具有一種或多 ,、陡之化口 ·抗氧化劑活性；NMDA受體拮抗劑 活性’内因性GABA柄备丨％也 π滅·她^人& *仰制作用之增進；NO合成酶抑制劑 ^. π 鐵螯合劑；鈣結合能力，例 如’鈣（II)螯合劑，鋅结入心 ° σ能力，例如，鋅(II)螯合劑；於 29 200800158 病患CNS中有效阻斷鈉或鈣離子通道’或開放鉀或氣離子 通道的能力。 於某些較佳具體例中，一種或多種其他化合物或治療劑 係藉著連接到NMDA受體而拮抗NMDA受體(例如，藉著 5連結至NMDA受體之甘胺酸連接位置)及/或該試劑係^著 減低神經膠質GABA之提取而增進GABA抑制性。 此外，該一種或多種其他化合物或治療劑可為任何已知 φ 於壓抑癲癇發作活性之試劑，甚至該化合物並非係已知於 提供神經保護者。通常，此等試劑係包括但不侷限於任何 10已知於精於此方面技藝之人士或未來所發現之有效的 AED，例如，適當的試劑，包括但不侷限於胺甲醯氮箪， 克洛巴沙（clobazam)，氯硝西泮，乙琥胺，費巴美 (felbamate)，加巴潘亭（gabapentin)，拉莫提珍 (lamotigine)，里維提拉西π旦（ievetiracetain)，氧卡巴氮雜 15 箪（oxcarbazepine)，苯巴比妥，雙苯丙脲，普利加巴林 φ (Pregabalin)，去氧苯比妥，雷替加品（retigabine)，他嵐潘 尼（talampanel)，提加品（tiagabine)，托吡拉酸鹽，丙戊酸 鹽’維加巴新(vigabatrin)，桑尼沙米（zonisamide)，苯並二 氮雜箪，巴比妥鹽及鎮靜性安眠藥。 20 此外，於某些具體例中，本發明之化合物可單獨使用或 彼此合併或與一種或多種如前文所說明之其他治療醫藥 品’或其等之鹽類或酯類合併，以製造用來提供神經保護 至需要其之病患或個體中為目的之醫藥品。 作為醫藥品之胺基甲酸酯化合物 30 200800158 本發明係提供式1及/或式2之對映體混合物及單離的 對映體作為醫藥品。胺基甲酸酯化合物係調配成醫藥品以 於患者中提供神經保護。 通常，本發明之胺基甲酸酯化合物可作為製藥組成物藉 5 由任何已知於此方面技藝中用於投服治療藥物的方法，包 括口部，口腔，局部，全身性（例如，經皮，鼻内，或藉由 栓劑），或非經腸胃（例如，肌肉内，皮下，或靜脈注射）給 _ 藥。將化合物直接給藥至神經系統可包括，例如，給藥至 大腦内，心室内，腦室内，椎管内，腦池内的，脊髓内或 10脊椎周圍藉著經由顱内或椎間針或導管含或不含泵裝置之 ' 給藥途徑而傳送。 Λ 此外’於眼之疾病或症狀包括，但不侷限於；視網膜局 部缺血（糖尿病性或其他），青光眼，視網膜變性，黃斑部 退化，多發性硬化，毒性及缺血性視神經病變之情況中， 15本發明之化合物包括化合物之組合物可藉著外用直接給藥 φ 至眼睛，亦即，至鞏膜或其他，例如，眼滴劑或藉著限部 植入或其他缓慢的傳送裝置包括中心體包括直接注射於破 璃體液等中。 組成物可採用錠劑，藥片，膠囊，半固體，粉末，持續 性釋放調配物，溶液，懸浮液，乳濁液，糖漿，酏劑，氣 溶膠，或任何其他適當組成物的型式；且包括至少一種本 發明之化合物與至少一種製藥上可接受的賦形劑合併。適 當的賦形劑係一般精於此方面技藝之人士所熟知者，且彼 等，及調配組成物的方法可於此等標準參考，如阿風索 31 200800158 AR:畫第17版，馬克印刷公司，伊斯 頓PA，1985中發現，其所揭示内容完全合併於本文中作 為參考且用於所有目的上。適當的液態麵，尤其是注射 用溶液，包括水，食鹽水溶液，葡萄糖水溶液，及乙二 胺基甲酸自旨化合物可财漏浮崎I本發明之 懸洋液可含有絲㈣g|化合物錢 之 10 15 20 Ϊ基甲基纖維素納1基纖維素，羥基丙基甲基纖維素， :广酸鈉、’聚乙烯基鱗朗，西黃蓍膠及金合歡膠:、及 ，散劑，崎劑例如天然生成之翻(例如，㈣脂 ::::::之濃縮產物(例如，聚氧化乙烯硬脂酸醋)， m鏈脂族醇之濃縮產物(例如，十七烷基伸乙基 份i的ΐΞϊΐ!軋化乙烯與從脂肪酸與己糖醇所導生之部 氡二聚氧化乙烯山梨糖醇單-油酸醋)，或 物(例如，聚己糖騎所導生之部份醋的濃縮產 聚虱化乙烯山梨糖醇酐單-油酸酯）。 正液亦可切—種或多種防腐_如，乙n 或糖精。調配物可調例如，讀，天門冬胺 化合物懸浮於植二中：性二藉著將胺基甲酸醋 或椰子油中，或於礦物油例如液。;=之= 32 200800158 5 調配。油性懸洋液可含有增稠劑，例如’蜂壤，硬石 壤或十六醇。可加入甜化劑以提供可口的口服製劑，例 如’甘油’山梨糖醇或蔗糖。此等調配物可藉著添加抗氧 ，劑例如抗壞血酸而保存。注射用油性載體之例，參見敏 妥醫藥實驗理論期刊281 : 93-102，1997。本發明之醫藥 調配物亦可為，，水包油，，乳濁液型式。油相可為植物油或礦 物油，如上所說明者，或此等之混合物。

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20 適畲的乳化劑包栝天然生成之樹膠，例如金合歡膠及西 尹、着=，天然生成之磷酯，例如大豆即磷脂，從脂肪酸與 醇酐所導生的酯類或部份的酯，例如山梨糖醇酐單-油 1 ^此等部份的S旨與氧化乙烯之濃縮產物，例如，聚 ί咗^烯山梨糖醇酐單_油酸酯。乳濁液亦可含有甜化劑及 螇如挪，如於糖漿及酏劑之調配物。此等調配物亦可含有 緩和劑，防腐劑，或著色劑。 ’ 成氣所容選膠擇：化合物可單獨或與其他適當的組成份合併而製 物:亦即’彼等可經、霧化。經由吸入給 如，二」！1广膠凋配物置於經加壓之可接受的推進器，例 一氧二氟甲烷，丙烷，氮等中。 内，1腸胃給藥’例如’藉由關節間（關節中），靜脈 物可包括水Π，及皮下賴之本發明的調配 有抗氧化#卜^_」滲壓無菌水注射溶液，其可含 者之血液成：、緩衝劑，抑菌劑，及可使調配物與預定接受 可包括懸4等tn’且水性或非-水性無菌懸浮液 曰&阳增稠劑，穩定劑及防腐劑。可接 33 200800158 受的載體及溶劑之中可使用者為水及林格氏溶液’等滲壓 之氣化納。此外，無菌經固定的油類可習用地用作為溶劑 或懸浮介質。可使用於該目的之任何溫和經固定的油包括 合成的一-或二甘油酯。此外，脂肪酸例如油酸可同樣的用 5於注射用製劑中。此等溶液係無菌且通常不含不想要的物 質。 當化合物足夠可溶時，其等可直接溶解於含有或不含適 _ 當有機溶劑，例如丙二醇或聚乙二醇之生理食鹽水中。極 度分散之化合物的分散液可於水性澱粉或羧基甲基纖維素 10鈉溶液中，或於適當的油，例如落花生油中調製。此等調 配物可藉著習用熟知的殺菌技術而殺菌。調配物可含有所 需要近似生理條件之製藥上可接受的辅助物質，例如pH 調節及緩衝劑，毒性調節劑，例如，醋酸鈉，氯化鈉，氯 化鉀，氯化鈣，乳酸鈉等。 15 此等調配物中之胺基甲酸酯化合物的濃度可廣泛地變 丨化，且主要根據流體體積，黏度，體重等，根據經選擇之 特別的給藥模式及病患之需求而選擇。於IV給藥時，調配 物可為無菌注射製劑，例如，無菌注射用水性或油性懸浮 液。該懸浮液可根據已知的技藝使用彼等適當的分散劑或 2〇潤濕劑及懸浮劑而調配。無菌注射用製劑亦可為於無毒性 非經腸胃可接受之稀釋劑及溶劑，例如u_ 丁二醇之溶液 中之無菌注射溶液或懸浮液。所推薦的調配物可存在於單 位-劑量或多重-劑量密封的容器，例如，安瓿及小瓶中。 注射用溶液及懸浮液可從各類說明於前之無菌粉末，顆 34 200800158 粒，及錠劑中製備。 適用於本發明操作中之胺基甲酸酯化合物可以且適宜口 服給藥。本發明之化合物於組成物中之數量可依組成物型 式’單位劑量大小，賦形劑種類，及其他精於此方面技藝 5之人士所熟知之因素而廣泛地變化。通常，最終組合物可 包括’例如’由0.000001重量百分比（重量％)至10重量 % ’宜為0·⑼〇〇1重量％至1重量％之胺基甲酸酯化合物， Φ 其餘為賦形劑或賦形劑類。 口服給藥之醫藥調配物可使用熟知於此方面技藝之製藥 10上可接受的載體以適合口服給藥之劑量而調配。此等載體 能使醫藥調配物調配成適合病患消化之單位劑量型式，如 - 錠劑，藥片，粉末，藥丸，膠囊，液體，錠片，凝膠，糖 漿，生料，懸浮液等。 適合口服給藥之調配物可包括（a)液態溶液，例如有效 量之製藥配劑懸浮於稀釋劑，例如水，食鹽水或PEG4〇〇 φ 中；（b)膠囊，小袋或錠劑，各個含有預先決定量之活性 成份，如液體，固體，顆粒或凝膠；於適當液體中之 懸浮液；及(d)適當的乳濁液。 經口使用之醫藥製劑可透過本發明之化合物與固態賦形 2〇劑合併而獲得，如果想要，可任意研磨產生的混合物，及 處理顆粒的混合物，於添加適當的其他化合物後，而獲得 錠劑或藥丸核。適當的固態賦形劑為碳水化合物或蛋白質 填料且包括，但不侷限於糖類，包括乳糖，蔗糖，甘露糖 醇’或山梨糖醇；澱粉來自於玉米，小麥，稻米，馬鈴薯 35 200800158 或其他植物；纖維素例如甲基纖維素，羥基甲基纖維素， 羥基丙基甲基·纖維素或羧基甲基纖維素鈉；及樹膠包括阿 拉伯樹膠及西黃蓍膠；以及蛋白質例如凝膠及膠原。如果 想要，可加入崩解劑或增溶劑，例如交聯聚乙烯基吡咯烷 5酮，瓊脂，藻朊酸，或其鹽，例如藻朊酸鈉。鍵劑型式可 包括一種或多種乳糖，蔗糖，甘露糠醇，山梨糖醇，磷酸 鈣，玉米澱粉，馬鈴薯澱粉，微晶纖雉素，凝膠，膠質二 φ 氧化石夕，滑石，硬脂酸鎂，硬脂酸，及其他賦形劑，染 劑，填料，黏合劑，稀釋劑，缓衡劑，濕潤劑，防腐劑， 10香味劑，染料，崩解劑，及製藥上砰相容的載體。錠片型 、 式可包括含有活性成份於增香劑中，例如，蔗糖，以及糖 . 鍵包含活性成份於惰性基質中，例如’凝膠及甘油或薦糖 及金合歡乳濁劑，明膠等以及已知於此方面技藝中之活性 成份，載體。 15 本發明之化合物亦可以為栓劑型式給藥以供藥物之肛門 _ 給樂。此等調配物可藉著將藥物與適當的非-刺激性賦形 劑，其於一般溫度下為固態但於肛溫下為液態且因此於肛 門中熔融而釋放藥物，混合而製備。此等物質為椰子油及 聚乙二醇。 20 本發明之化合物亦可藉著鼻内，眼球内，陰道内，及肛 門内途徑給藥，包括拾劑，吹入劑，粉末及氣溶膠調配物 (例如，類固醇吸藥，參見洛哈塔吉，臨床藥理期刊35: 1187-1193 ’ 1995 ;提佳瓦，過敏性氣喘免疫學年鑪75 ·· 107-111 ， 1995)。 36 200800158 根據本發明之化合物可調配成敷藥棒，溶液，懸浮 乳” ’乳劑’軟膏，糊膏，膠凍，塗料，粉末： 及氣;谷膠而猎由局部的途徑經皮傳送。 、包膠物質亦可使用本發明之化合物且，，組成物，，一詞可 5括活性成份與包膠物質作為調配物，含或不含其他载 合併。例如’本發明之化合物亦可以中心體於身體中緩轉 釋放而傳送。於-具體烟中，中心體可經由皮内注射含: • 心體之藥物（例如，米非普利斯東(mifepristone)) ’其係於: 下缓緩地釋放（參見拉歐，j Bi〇mater Sci p〇lym第7版· 10 623-645，1995 ;作為生物降解用及注射用明膠調配物（參 見，例如，佳歐，醫藥研究12 : 857-863，1995);或从〇 、 服給藥之中心體（參見，例如，艾耳斯，醫藥藥理期刊49 · 669-674，1997)給藥。經皮及皮内二種途徑可提供數翅戈 數月恆定的傳送。扁囊劑亦可用於傳送本發明之化合物。_ 15 於另一具體例中，本發明之化合物可藉著使用與細跑螟 ⑩稠合或經細胞内攝之微脂粒而傳送，亦即，藉著使用連^ 至微脂粒之配位子，該微脂粒係附著至細胞之表面膜蛋白 質焚體而導致細胞内攝作用。藉由使用微脂粒，特別是卷 微脂粒表面攜帶標的細胞之特定配位子時，或者優先針^ 2〇特定器官’可將胺基甲酸醋化合物集中傳送至標的細胞中 (參見’例如，阿-穆罕默德，微包膠期刊13 : 293-306， 1996 ;鍾恩，現行生物技術主張6 : 698-708，1995 ;歐斯 楚，美國醫院醫藥期刊46 : 1576-1587，1989)。 本發明之醫藥調配物可以鹽提供且可用許多酸類成形， 37 200800158 該酸^括但不侷限於氫氣酸，硫酸，醋酸，乳酸，酒石 酸’頻果酸’琥轴酸等。鹽類趨向於更可溶於水性或其他 質子性洛劑中’其為對應的游離基型式。其他情況中，較 佳的製劑可為經冷凍乾燥的粉末，其可含有，例如，任何 5 1全部下列者·· 1 mM · 5〇 mM組胺酸，〇 1% · 2%蔗糖， 2% - 7%甘露糖醇，於4·5至5·5 pH範圍下，於使用前與 缓衝劑合併。 ⑩ 製。藥上可接受的鹽類及酯類係指製藥上可接受且具有想 要的藥理特性之鹽類及_。此等鹽類包括所形成的鹽類 1〇中其中化合物上之酸性質子能夠與無機或有機驗反應。適 當的無機鹽類包括彼等與驗金屬，例如，鋼及鉀，鎂，轉 、及銘所形成者。適當的有機鹽類包括彼等與有機驗類例如 胺驗，例如乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，胺基丁三醇， N-甲基還原葡糖胺等所形成者。製藥上可接受的鹽類亦可 包括從母化合物中之胺基圏與無酸酸(例如，氳氣酸及氮漠 •，）及有機酸(例如，醋酸，擰檬酸，順式丁烯二酸及炫·及 芳烯(arene-)石黃酸例如，甲燒確酸及苯石黃酸)進行反應所形成 之酸加成鹽類。製藥上可接受的_類包括從出現於化合物 中之叛基，確醯基氧基與膦酸基氧基所形成的醋。當出現 2〇兩種酸性基團時，製藥上可接受的鹽或醋可為單酸_單_鹽 或酯或二-鹽或酯；且同樣的當出現超過兩種酸性基團時， 某些或全部此等基團可被鹽化或_化。 本發明中所指名的化合物可以未_化絲賴化的型 式，或以㈣化及/或經酯化的型式出現，且縫名之此等 38 200800158 化合物將包括原化合物（未經籩化及未經酯化）及其製藥上 可接受的鹽類及酯類。本發明包括式丨或式2之製藥上可 接受的鹽及酯型式。超過一種式i或式2之對映體的結晶 型式可存在且因此亦包含於本發8月中。 5 本發明之製藥組成物，除了胺基甲酸醋化合物之外，可 任意含有至少一種有用於治療伴隨著提供神經保護之疾病 或症狀的其他治療劑。 調配製藥組成物的方法業已說明於許多公開案中，例 如，1_藥劑量型式：錠劑，第2版。修訂及擴充版。第1-1〇 3卷，由萊柏曼等編輯；H劑量型式：非經腸胃醫藥， 第1-2卷，由亞維斯等編輯；及醫華劑量型式：分散系 Ml，第1-2卷，由萊柏曼等編輯；由馬塞爾迪克公司印 製，其所揭示内容完全合併於本文中作為參考且用於所有 的目的上。 15 製藥組成物一般係調配成無菌’實質上等渗壓且完全符 合美國食物及藥物管理之所有良好製造作業（GMP)的規 範0 劑量攝取法 本發明係提供使用胺基甲酸酯化合物於哺乳類中而提供 2〇神經保護的方法。提供神經保護所需要之胺基甲酸醋化合 物的數量係定義為治療上或製藥上有效量之劑量。該使用 之有效劑量安排及數量，亦即，投藥或劑量攝取法係依各 種因素包括疾病階段，病患之身體狀況，年齡等而定。給 藥的模式亦列入考慮病患之計算劑量攝取中。 39 200800158 5 10 太;精於此方面技藝之人士能夠無需具有關於該技藝及 之賒其备之非书經驗，來決定本發明操作中特別經取代 醫藥二療有效量(參見，例如’萊柏曼， 夕祜蓺式第卷，1992);萊德’1999，醫藥化合物 術；及皮卡，1999 ,劑量計算）。治療有 抵床條件或有害的副作用比 的主讲 有利效應重要。應進一步注意各個特別 ，特定劑量攝取法應根據個別的需求及給藥或監叙 /物給藥人士之專業判斷，☆一段期間予以評话及調 _ 一w、了治療目的，可將本文中所揭示的組成物或化合物以 i徨巨丸傳送，經由一段延長的期間，或重複給藥流程連 ，傳送（例如，以小時，每日或每週，重複的給藥流程）给 藥至個體。本發明之醫藥調配物可以例如，每日一次戈$ I5次，每週3次，或每週給藥。於本發明之一具體例中，本 發明之醫藥調配物係每日一次或二次口服給藥。 使用本發明化合物之治療攝取法可於，例如，個體羅串 腦傷害損傷或其他初期傷害之後但於個體被診斷出具有痛 癇症或其他神經元損傷表現之前開始。於一具體例中，被 2〇 4認處於發展神經元傷害之高風險之個體或具有伴隨著發 展神經元傷害風險之疾病，例如，神經性組織缺氧之個 體’可用本發明之胺基甲酸酯化合物開始治療攝取。 於某些具體例中，可於腦傷害性損傷或初期傷害發生 後，將胺基甲酸酯每日給藥達一段時間（週，月，年）。列 40 200800158 ，醫生係以例如，病患之臨床檢驗，或藉由測量血液或腦 脊髓液中之藥物濃度而知道如何決定胺基甲酸酯化合物業 已達到治療有效濃度。 5 10 15 20 於本說明書中，生物性活性劑之治療有效劑量可包括延 時治療攝取法内之重複劑量，其在臨床上產生明顯的結果 而提供神經保護。本說明書中有效劑量之決定典型的係根 據動物模式研究接著藉由人類臨床試驗及藉由明顯降低患 者中標的曝露症狀或疾病之發生或嚴重性作為有效劑量及 給藥流程測定之指南。該相關之適㈣物包括，例如，鼠 科動物，老鼠，諸，㈣動物，非·人鍾長動物，及其他 =於財面技藝中可接受的動物模式。或者，有效劑量 試管内模一式來決定(例如，免疫學及病理組織學的分 …商i用此料式，典型的僅需要―般的計算及調節來測 如，鼻内有效，經皮有效，經 數量以引出想要的反應）。脈有效，或肌肉内有效的 於本發明範例具體例中，各人t 用於標準給藥攝取法。於此方:之單位劑麵式係製備 示下容易的分成較小_量。^中，組合物可在醫師的指 的=繼概=刪製成包裝 存在於此等組成物單位铜、劑I飞 病患之特別需要，以例如型式中之活性化合物可根據 量存在，而用於每曰單〜或夕；1〇毫克至於1克或更多之 每日劑量起始治療攝取法，、、口藥。藉由於一克之最低 槪基甲酸酯化合物之血液濃度 200800158 可用„為較大或較小劑量。 〇別心二基;2化合物之有效給藥可例如’以由於 腸胃劑量給華於150毫克/公斤/劑量之口服或非經 25毫克/八;者為’係由於0,1②克/公斤/劑量至於 曰+克a斤/蜊I，更佳為由於〇.2至於18毫克/公 量^藥°因此，具有例如平均重量為70公斤之患者每劑^ 所3有之活性成份的治療有效量，如本文中所說明者，可 為例如，由於1毫克/天至於7〇〇〇毫克/天。 10 15 20 本發明之方法亦提供用於提供神經保護的套組。於包括 一種或多種本發明之胺基曱酸酯化合物，可能添加一種戈 多種治療有利之其他化合物之醫藥品調配於適當的载體I 之後，可將其放置於適當的容器中且予以標記以提供神麫 保護。另外，可將另一包含至少一種有用於提供神經= 漠、ζσ療癲癇產生，癲癇症或另一伴隨著神經元傷金之^ 病或疾病之其他治療劑的醫藥品置於容器中且予以標記 供治療所指明之疾病。此等標記可包括，例如，關於^ 各醫藥品之數量，頻率及方法的指示。 、又 雖然，為了清楚了解的目的，本發明業已藉實例 一、 明於前’此方面技藝之人士應顯而易知，特定改 ：5兄 係包含於揭示内容内且可無需非常經驗而在用來 j 限制之後附申請專利範圍之料内操作。下列實例炎 明本發明特定的誠而提供且並_來限制。 ’、為闡 【實施方式】

tM 42 200800158 列實用驗==呆=(1)及式⑼化合_ 概π例术斤估。於實例i及2 ?活:(例如’式7)於本文中稱為、驗化合:、TC;對: «隻及於老鼠中處理由鐘及毛果芸香驗 =癲癇產生的效應。此等實例係為閣明:= 種具體例但並非用任何方式來限制。 月之各 實例1 ίο 將老鼠中藉由伴隨著鋰(鋰例之 绣 模式複製多數臨床及人類顳葉癲癇之神經生理學特色誘 基等1989犬觸3 · 154-171 ;卡維海洛，1995 15 ^經科學期刊16 :33·37)。於成年鼠中，將毛果芸香驗全 身性給樂導致癲癇性重積狀態（SE)。第一天 3:5〇%。於存活的動物中，在海馬形成，梨狀及= $ ’丘腦’扁桃腺狀複體，新腦皮質及物質黑質内之神經 早π傷、害顯m_癇發作顧歸為平均持續14_25 天=★靜無-癲癇發作期，之後，所有的動物呈現每週 ^吊2至5次頻率之自發性再發性痙攣癲癇發作(杜司基 20專，1989，突觸3 : 154-171 ;卡維海洛，1995，義大 經科學期刊16:33-37;杜比等’2〇〇1，神經實驗167: 227-241) 〇 丝-毛果‘番鹼及用f惠致也合物离理 將詹維爾生殖中心（法國珍納I塞爾）所提供225^5〇 43 200800158 克重之雄性維斯塔(Wistar)老鼠於控制的標準條件下圈養 (循環光照/黑暗，早上7點至晚上7點開燈），可隨意取用 食物及水。所有的動物實驗係根據1986年u月24 =歐洲 交流協調會指令(86/609/EEC)及法國農業部（執照67-97號) 5之法規進行。為了植入電極，老鼠係經由腹腔注射25毫 克/公斤二氮平(DZP，二氮平製劑，羅氏公司，法國）及j 毫克/公斤氯胺酮氳氧化氯(伊馬劑1000(Imalgene)，法國隆 馨 美律公司）而麻醉。將四個單一-接觸記錄電極放置在頭蓋 骨之頂頁皮質上，每邊各二個。 10龜瘇土生重穑狀態諉導： ， 里莖慶ife金鱼處理及自發性爯發性癲癇發作（SRS)之路哇 所有的老鼠接受氯化鐘(3毫當量/公斤，經由腹腔，美 國密蘇里州聖路易市席格馬公司）；於2〇小時後，將動物 放進樹脂玻璃盒中，以便記錄皮質EEG的基線。將甲基東 15莨菪素溴化物（1毫克/公斤，s.c.，席格馬公司）給藥以限制 ⑩痙攣劑之末端效應。SE係在甲基-東莨菪素後30分鐘藉由 主射毛果芸香驗氫氯化物(25毫克/公斤，sc.，席格馬公司） 而誘發。記錄整個SE期間之左右兩侧EEG皮質活性註明 行為變化。 20 試驗化合物增加劑量的效應係在3組老鼠上研究。第一 組動物於SE發動後1小時，經由腹腔接受1〇毫克/公斤試 驗化合物(pilo-TCIO)，而第2及3組分別接受30及60毫 克/公斤試驗化合物(pil〇_TC30及pilo-TC60)。 44 200800158 ^後1 '丨'時叫2毫級斤二氣平 +内内注射）。此為標準處理以改進SEini1nD7m# 動物之存活率。控制組接受 t SE(p;_p)後 合物老H食水）。然後將SE存活之試驗化 之第下：由腹腔注射且保持用試驗化合 10 m】日r.DZP接受1毫克/公斤dzp第二次注 體積的及食齡·食财錢接辣日二次等 試驗化合物在EEG上及在發生SRS之潛伏期上的效應 '、精母日10小時之每日動物視訊記錄及每週二次8小時 電圖活性之記錄調查。 愈胞密彦之定晉 15 細胞密度之定量係在SE後第6天在8隻pil〇-DZP，8 ，隻 piloTCIO，7 隻 piI〇_TC30，7 隻 pil〇-TC60，及 6 隻食 鹽水-食鹽水老鼠上進行。於SE後第14天，將老鼠用1.8 克/公斤戊巴比妥予以味層麻醉(Dolethal®，Vetoquinol，盧 爾市，法國）。然後將腦移除且冰凍。於切片機中連續切下 2〇 20微米玻片切片’於硫堇染色前予以風乾數日。 細胞密度之定量係用10 x盒1厘米2顯微栅條在冠 狀切片上根據老鼠腦寰椎之趨實體性協調而進行（帕辛諾斯 及華森，1986，老廬中之趨膏體性協調，第2版，學院 報刊，聖地牙哥）。細胞計數係以盲法進行二次且為至少3 45 200800158 個得自於各個動物中2個相鄰切片之平均值的平均。計數 僅包括大於10微米的細胞，較小者視為神經膠質細胞。 Timm染今‘ 於自發性再發性癲癇發作發動2個月之後，在長期曝露 5於試驗化合物或DZP之老鼠上及3隻食鹽水·食鹽水之老鼠 中檢測苔狀纖維芽殖。將動物深層麻醉且用食鹽水接著用 含有100毫升1.15% (重量/體積)Nad於〇·1Μ磷酸鹽緩衝 • 液中，及含有刚毫升4% (體積/體積）曱醛於0·1Μ磷酸鹽 緩衝液中予以經心（transcardially)灌注。將腦從頭蓋骨中移 10除，於4%甲醛中予以後-固定3-5小時且在玻片冷凍切片 組織(vibratome)上切下40微米切片且覆在凝膠_包埋的破片 -上。 次曰，將切片於黑暗中於26°C含有50%(重量/體積）阿 拉伯膠（160毫升），檸檬酸鈉緩衝液(3〇毫升），5·7% (重量/ 15體積）氫醌(80毫升)及10%(重量/體積)硝酸銀(2·5毫升)之溶 • 液中變化4(Μ5分鐘。然後將切片於4()。⑽自來水沖洗至 少45分鐘，用蒸餾水迅速沖洗且予以乾燥。將其等於乙醇 中脫水且蓋上玻片。 >狀纖維芽㈣根據前文所朗之標準於背側的海馬中 評估（卡瓦索斯等，聰，神經科學期刊n : 2795侧）， 其係如下列者：G_DG之尖及脊間無顆粒；丨稀疏顆粒於 DG之尖及脊間不勻稱分佈中之上位粒狀的區域中；更多 顆粒=DG之尖及脊間連續分佈中之上位粒狀的區域中； 3_顯著的難於纽賴連續模式中，具有於尖及脊之間 46 200800158 偶而稀疏的融合顆粒；4-顯著的顆粒於尖及脊之間形成融 合密集薄片帶且 >顆粒之融和密集薄片帶延展至内分子層 中0 數攄分析 5 將非·配對學生之卜試驗用於進行SE於pilo·食鹽水及 pilo-試驗化合物動物中之特性比較。二組中所捉到之老鼠 數目之間的比較係用chi方塊試驗進行。於神經元傷害 時，各組間的統計分析係用AN0VA接著用費舍試驗之多 重比較使用統計軟體（費舍RA ，1946a，作者統計^ ίο Μ第十版)奥利弗&波意德，愛登堡；費舍RA，1946b，皇 驗設計（第四版）奥利弗&波意德，愛登堡）進行。 鋰-毛果芸香鹼癲癥性复積狀態之行為及ERG #μ 將250-330克重之史巴克·道利老鼠全數進行由Li_iip〇 所誘發的SE。SE的行為特徵係在pil〇_食鹽水及邱〜試驗 I5化合物兩組中確#忍。毛果芸香驗注射後5分鐘之内，老鼠 I逐漸產生腹瀉，豎毛及其他擬副交感神經刺激的徵兆。隨 後的15-20分鐘，老鼠呈現出把頭上下快速擺動，权抓， 咀嚼及探究的行為。再發性癲癇發作係在投服毛果芸香鹼 後15-20分鐘開始。此等伴隨著具有舉起及跌倒事件之頭 2〇及兩侧前肢的癲癇發作，於毛果芸香驗後約35_4〇分鐘進 展成SE，如前文中所說明者（特斯基等，測，行為腦 SE期間之EEG模& 於SE之第小時期間，由於沒有藥理處理，EEG之幅 47 200800158 降低。於毛果芸香驗注射後5分鐘内， 5 10 15 而;^海^ * EEG活性係用低電壓侠速活性替代， : = 顯示出θ節律(5_7Hz)。以⑽分鐘將高電壓 性疊置於海馬θ節律上，且單離的高電壓穿刺只在 海馬中兄錄，^而皮質之活性並未實質地改變。 由山毛果衣香驗」主射後35-4❻分鐘，動物之海馬及皮質二者 立"=產生具冋電壓快速活性之典型的電位圖癲癇發作， 二f先如於細發狀前㈣轉發且㈣連續_連串的 同電壓穿刺及乡刺，持續細投服Dzp或試驗化合物。於 SE約3-4小時之時，海馬EEG之特點為如i〇_Dzp中及 pilo-ΙΟ組中海馬及皮質二者之週期性放電圖（pEDs，於一 次/一秒）。EEG背景活性之幅度於pil〇-TC6〇動物中為低。 以SE之6-7小時計，穿刺活性仍出現於經DZp_及TC1〇-處理之老鼠的皮質及海馬中，而eeg之幅度減低且回復到 TC30老鼠之海馬基線水準及於經TC60處理之老鼠的二結 構中。TC10，TC30及TC60組之間沒有差別。以SE之9 小時計，單離的穿刺仍記錄於經試驗化合物處理之老鼠的 海馬中及偶而於皮質中。此時，二結構中之背景活性幅度 極低。 20 由SE讀發的死亡率 ,於SE後第一個48小時中，死亡率係類似於pilo_DZP 老鼠（23%，5/22)，pilo-TCIO 老鼠（26%，6/23)，及 pilo-TC30老鼠(20%，5/25)中者。pilo-TC60老鼠中之死亡率大 幅降低，其中，其只達到4%(1/23)。差異性於統計上係顯 48 200800158 著的(p<0.01)。 安靜期之eeg特徵及自發性再發性發作之發味 女靜期中之EEG模式係類似於pii〇-D2；p及ρη〇· TC10，30或60老鼠中者。SE後24及48小時，基線EEG 5仍具有於PEDs上發生大振動或穿刺重疊的特徵。試驗化合 物注射或載體注射後ί及8小時之間，pii〇-DZp或 TC10組中沒有變化。於TC30及TC60老鼠中，當注射10 • 分鐘後，且TC30組用大幅度之穿刺替代且TC6〇組以小幅 度之穿刺替代時，PEDs之頻率及幅度即降低。注射4小時 10後’後兩組中之EEG回復到基線水準。se後6天，EEG 之幅度仍比毛果芸香鹼注射前低且於多數組別中仍可偶而 於pilo-DZP，_TC10及-TC30老鼠中記錄到穿刺。於pil〇_ TC60老鼠中，大幅度穿刺之頻率比所有其他的組別者高。 於試驗化合物或載體-注射後，pil〇-DZp及pil〇-TC1〇組中 15之EEG記錄不受注射所影響。pil〇e/rc3〇老鼠中，注射誘 _ 發慢速波於海馬及皮質二者之EEG上發生且pil〇-TC60老 鼠中穿刺之頻率降低。 將所有的老鼠曝露於DZP，TC10及TC30中且研究直 2到長期發展出具有類似潛伏期之SRS。pilo-DZP老鼠中之 潛伏期為18.2 ± 6·9天(η = 9)，pilo-TCIO老鼠中者為15·4 〜·天(η = 7)，pilc^TC30 老鼠中者為 18.9 土 9.0 天(η = =)。於進行TC60之老鼠組中，老鼠之子群變成具有類似 、他組別潛伏期之癲癇，亦即，17.6 土 8·7天(η = 7)而另一 、組老鼠變成具有SE·後由1〇9至191天範圍（149.8 ± 36.0 49 200800158 天，η = 4)之較長延遲的癲癇性且一隻老鼠並未於SE-後9 個月延遲中變成癲癇。pilo-DZP，pil〇TC10，pilo-TC30及 pilo-TPM60老鼠之第一子群之間對srs之潛伏期的差異性 於統計上並不顯著。沒有任何食鹽水·食鹽水老鼠(n = 5)發 5 展出SRS。 為了計算經毛果芸香鹼-曝露之老鼠中的SRS頻率，將 癲癇發作嚴重性及特出之階段111(面部肌肉及前肢之陣攣性 ⑩發作）及階段癲癇發作（後腿直立起來及跌倒）列入考 慮。pilo-DZP及pilo-試驗化合物老鼠中，每週階段m SRS 10之頻率係在各組中變化。於pilo-DZP及pilo-TC60 (具有早 期SRS發動）組中於首先的3星期中係低，恆定的且於 Pll〇JDZP組中第4週時業已消失。階段in SRS之頻率比 pilo-TC10組中者高，其中於第3及4週時之增加明顯超過 pilo-DZP值。多數組中，更嚴重之階段以-vsRS的頻率於 I5第一週時為最高，除了具有晚期癲癇發作發動之pilo-TC3〇 ⑩ 及TC60之外，其中TC30組之SRS頻率於有個4週中皆 恆定且超過具晚期SRS發動之pil〇-TC60組最先的2週， 其中沒有階段IV_V癲癇發作，其中第2週後沒有癲癇發 作之記錄。相較於pil〇_DZp組(每週113 Srs)，第一週 2〇時’階段IV-V SRS之頻率於TC10，TC30及TC60 (具有 早期SRS發動）組(每週2·3-6，1 SRS)中明顯降低。於2-4v 週時所有組別之階段IV-V SRS的頻率皆降低相較於第一週 者達到每週2_6次癲癇發作之值，除了具有早期SRS發動 之pilo-TC60組外，其中癲癇發作之每週發作頻率較於 50 200800158 pilo-DZP組者明顯降低至0·6-0·9次癲癇發作，其中SRS之 頻率係在由3.3至5.8範圍。 逄過，丘腦及虔皙中之細胞密唐 5

10

20 與食鹽水-食鹽水老鼠比較，pilo_DPZ老鼠中海馬CA1 區中之細胞數大量減低(70%於錐體細胞層中脫落），而CAS 區之傷害較不嚴重（CA3a中細胞損失54%且CA3b中為 31%)。於鋸齒狀腦回中，pil〇_Dzp老鼠肺門中之細胞遭受 巨幅損失(73%)，然而粒細胞層並未顯示出看得到的損傷。 類似損傷可在腹面海馬中觀察到，但細胞計數並未在該區 中進行。外侧丘腦核中亦記錄巨量損傷（細胞損失91%)， 而中央脊侧丘腦核為中度損傷（56%)。梨狀皮質中，細胞損 &皆在III-IV層中，其不再看得到且於pii〇-DZP老鼠II層 =建到53%。背側鼻内皮質中，II及ni-IV層中遭受輕微 才貝傷（分別為9及15%)。腹面鼻内皮質之II層全部保存， 而ΪΙΙ-IV層遭受44%細胞損失。 PUo-試驗化合物動物之海馬中，細胞損失相較於pil〇-DZP老鼠CA1錐體層中者係降低，其中細胞損失於pil〇_ 中達75%且於pil〇-TC30或於pil〇-TC60動物中分別達 及16%。該差異性於二試驗化合物劑量上係統計上顯著 的。於CAS錐體層中，試驗化合物並未於CA3a區中提供 任何保護，而60毫克/公斤試驗化合物劑量於CA3b中具明 顯的神經保護性。於鋸齒狀腦回中，肺門中之細胞損失類 似Pilo-試驗化合物（69-72%)及pil〇-DZP動物（73%)中者。 〜丘腦核中’ 60亳克/公斤劑量於外側及中央背侧核中亦 51 200800158 分別降低65及42%神經元傷害而具保護性。於腦皮質中， ，，驗化合物處理所獲得之神經元保護相較於DZp者僅在 最鬲劑量60毫克/公斤。在二種最低劑量1〇及3〇毫克/公 斤時，梨狀皮質之ιπ·ιν層中所觀察到的細胞總損失及組 5織^解與pii〇_DZP老鼠及pil〇_試驗化合物老鼠中者相同且 不容許於任何組別中任何計數。於梨狀皮質之H及IIwv 層中，pilo-DZP老鼠中所記錄之TC6〇處理降低的神經元 ⑩細傷分別為41及44%。相較於pil〇-Dzp老鼠，腹面鼻内 皮質中之III-IV層中的神經保護係由投服TC6〇所誘發且達 10到31%。鼻内皮質中，pil〜TC10老鼠中之細胞損失與扣1〇_ ’ DZP老鼠之背侧鼻内皮質之III-IV層（損傷28%多）及腹面 鼻内皮質之III-IV(損傷35〇/〇多）比較呈現輕微的惡化。於試 驗化合物之其他劑量時，鼻内皮質中之細胞損失類似於 piloDZP老鼠中所記錄者。 15鱼5 t之苔狀纖錐穿殖 ⑩ 所有於Pil〇-DZP及Pilo_TpM組中呈現SRS的老鼠顯示 類似鋸齒狀腦回内分子層中Timm染色的強度(2_4級）。 Timm染色係在鋸齒狀腦回之上層及下層葉片上出現。上層 葉片中Timm級數的平均值於pii〇_Dzp老鼠中（n=9)達^ 20 土 0.8，於 pilo-TC10 老鼠中（n=7)達！ 5 ± 〇 6，於 pi心τ〇〇 老鼠中（n=10)達2.6 土 1·0，及於鼠之整個組中 (η-11)達1.5 ± 〇·7。當根據SRS之潛伏期而將6〇毫克/公斤 之pil〇-試驗化合物組細分時，具有早期SRS發生之子群顯 不出1·8 ± 〇·6 (η = 6)之Timm級數且具有晚期發生或無 52 200800158 SRS之老鼠子群具有j 2 ± 中 ___ _Te / 5)之Timm 級數。· (ρ= _6)或無癲癇發作的值係統計上顯著二 5 10 15 20 討論及結論^

後果顯示用試驗化合物之7_日處理於犯發動 後1小時起始能夠保護某些腦部區，例如，於CA =3二ί之錐體細胞層，中央脊侧丘腦，梨狀皮質之11及 Ιΐ^ν層及腹面鼻时質之m_iv層中免於神經元傷宝，但 僅係在試驗化合物之最高劑量時，亦即，60毫克/公^。試 驗化合物之後劑量亦能夠延遲SRS發生，至少於 ^中變f具有比其他組動物之平均延遲於9·倍長的癲癇 卜且-，物於SE後延遲9個月中不會變成瘤痛性。 一此等結果顯示-具有多數抗癲癇·市售藥物典型特性之 抗發作特J·生的化合物亦能夠延遲瘤痛產&，亦#，為抗痛 癇產生者。本研究之數據亦顯示試驗化合物之處理，無論 所用之劑量為何’可降低癲癇症之嚴重性，因為其降低階 段IV-V癲癇發作的次數，以TC6〇處理觀察到主要係在第 週及4週整個期間發生。此外，於TC10組中，較不嚴 重之^^又ΠΙ癲癇發作產生增加的轉變，其係比pilo-DZP 組中之次數更多。 實例2 本计劃的目的係繼續前文實例1中試驗化合物(tc)於顳 頁癲癇之毛果芸香驗(Li_pil〇)模式中之潛能的神經保護 53 200800158 及抗癲癇產生特性研究的報導。該研究係接續實例1中所 說明的第一個者，其中顯示TC能夠保護海馬，梨狀及腹 面鼻内皮質之CA1及CA3區免於由Li-Pilo癲癇性重積狀 態（SE)所誘發的神經元傷害。此等神經保護特性多數係發 5生在最咼劑量6〇毫克/公斤下研究且處理能夠延遲36%老 鼠產生自發性癲癇發作（Π中之4)。本研究中，吾人主張 研究以TC之較高劑量處理神經元傷害及癲癇產生上的後 ，果。 顳頁癲癇症之鋰-毛果芸香驗模式 10 將老鼠中藉由伴隨著鋰之毛果芸香鹼(Li-Pilo)所誘發之 癲癇模式複製多數人類顳葉癲癇之臨床及神經生理特性(特 斯基等，1989 ;卡維海洛，1995)。於成年老鼠中，毛果芸 香鹼之全身性給藥導致SE，其可持續至多24小時。第: 天的致死率達30-50%。於存活的動物中，在海馬形成，梨 !5狀及鼻内皮質，丘腦，扁桃腺狀複體，新腦皮質及物質零 _質内之神經元傷害顯著。此急性癲癇發作期間接著為平均 持續14-25天之、、安靜”無-癲癇發作期，之後，所有的動 物呈現每週通常2至5次頻率之自發性再發性瘦擎痛瘤發 作（杜司基等，1989 ;卡維海洛，1995 ;杜比等，。 2〇目前的抗癲癇藥物不能預防癲癇產生且僅短暫地在於再 生癲癇發作上生效。 、 吾人之前文研究中，吾人研究於單一治療中所給定之 TC增加的劑量潛能的神經保護及抗癲癇產生效應且與多數 用於預防高死亡率所給定之吾等標準二氮平(Dzp)處理比 54 200800158 較。此等數據顯示SE發動後1小時用1〇，3〇或6〇毫克/ 公斤TC開始7-天處理能夠保護某些腦部區域免於神經元 傷害。該效應於CA1及CA3b區域之錐體細胞層，中央脊 侧丘腦，梨狀皮質之II及I1I-IV層及腹面鼻内皮質之ΗΙ· 5 IV層係統汁上顯著，但僅係在TC之最高劑量，亦即， 毫克/公斤時。再者，顯示的是TC之後劑量亦為唯一能夠 延遲SRS發生者，至少於變成具有比其他組動物平均於9_ φ 倍長延遲癲癇症之動物子群中，且一動物於SE後9個月之 延遲中不會變成癲癇。 10 本研究中’不同的TC劑量，亦即，30，60，90及120 毫克/公斤之效應係用如刖文研究中之相同設計來試驗◊處 理係在SE發動一小時後開始且將動物用相同劑量的藥物予 以弟二次注射。該早期的SE處理係接著6天的TC處理。 該報導係關於四種不同的TC劑量在神經元傷害上之效應 I5係於海馬，海馬旁皮質，丘腦及扁桃腺中於SE後14天及 φ 在自發性癲癇性癲癇發作之潛伏期及頻率上評估。 動物 將詹維爾生殖中心（法國珍納_聖·塞爾）所提供之成年雄 性史巴克-道利老鼠於控制，不擁擠的標準條件下於2〇_ 2〇 22t下（循環光照/黑暗，早上7點至晚上7點開燈）圈養， 可隨意取用食物及水。所有的動物實驗係根據1986年u 月24日歐洲交流協調會指令(86/6〇9/££(：)及法國農業部（執 照67·97號)之法規進行。 癲癇性重積狀態誘導，TC處理及SRS之發生 55 200800158 轰貧Λ ,樂以限制瘦攀劑之末端效應。SE係在甲基-3力素後30分鐘藉著注射毛果芸香驗氫氣化物(25毫克/

ίο “二Γ· ’席格馬公司）而誘導。增加tc劑量的效應係在 中研九。動物於SE發動後i小時，經由腹腔接受 2·5毫克/公斤DZP ’肌肉内注射，或3〇，6〇，9〇或12〇毫 克/么斤TC (TC30，TC60，TC90，TC120)。控制組接受载 體替代毛果芸香鹼及TC。然後將SE存活的老鼠注射， DZP組於第一次Tc注射後於1〇小時用125毫克/公斤 DZP進行第二次經由腹腔注射給或以相同之丁。劑量於早 晨且保持每日二次處理下用TC再處理6天，而DZP老鼠 接受载體注射。 15 及TC之4劑量在癲癇產生上的效應係藉由每天 I 10小時之每日動物視訊記錄調查。視訊記錄進行4週，其 整個期間看到第一次癲癇發作產生以及癲癇發作的總次 數。總計8週癲癇後，然後移去視訊記錄系統且將動物於 其等被殺死之前再保留於吾人之動物設施中4個星期。視 2〇訊記錄5個月後，將未出現癲癇發作的老鼠殺死。 細胞密度之定量 細胞密度之定量於SE後進行二次：第一組係在SE後 14天研究且包括7隻DZP，8隻TC30，11隻TC60，10 隻TC90，8隻TC120及8隻未進行SE之控制組老鼠。將 56 200800158 究對SRS之潛伏期之第二組在第一次srs後8週 =延遲中沒有看到SRS時第5個月殺死且其中包括14 f DZP，8 隻 TC3〇 , 1〇 隻 TC6〇，u 隻 tc9〇，9 隻代12〇 老，。此時’研究癲癇產生之第二組動物中的神經元計數 5 仃巾且長·期計數簡於研究這部份的數據將不包括 於本報告中。 神經計數時，動物係用1.8克/公斤戊巴比妥 # yolethai® ’ VetC)quin。卜盧爾市’法國）予以深層麻醉。然 後將腦移除且冰;東。於切片機中連續切下2()微米切片，於 1〇硫莖染色前予以風乾數日。細胞密度之定量係用1〇又1〇盒 1厘米2顯微柵條在冠狀切片上根據老鼠腦寰椎之趨實體性 h協調而進行（帕辛話斯及華森，1986)。將計數之糖條放在 感興趣的大腦結構界定區之孔洞上且用200•或400_倍顯微 放大於每個單-腦結構所界定者上進行計數。細胞計數係 I5藉由不了解動物處理之單一觀察者在各區三個相鄰切片之 •每邊上進行二次。將各腦結構中12個計數區中所獲得的細 胞數予以平均。該步驟係用於將可因重複計算而導致細胞 數超出估計之潛在錯誤降至最小。接觸柵條之下及右緣之 神經元不予計數。計數僅涉及細胞體大於10微米之神經 20元。具有小細胞體之細胞被視為神經膠體細胞且不予計 數。 數據分析 於神經元傷害及癲癇產生時，各組間的統計分析係藉助 於單-向變化分析接著藉由後·霍丹納或費舍試驗使用統計 57 200800158 軟體而進行。 結果 鋰_毛果芸香鹼癲癇性重積狀態之行為特徵 將總數—143隻重量25g_33G克之史巴克_制老氣進行 5由經-毛果芸香驗(u_lip〇)所誘發的SE。於該數目中1〇隻 沒有發展SE，而133隻老鼠發展出全部特徵的Li_pU〇 SE。於li-pUo-DZP及li-pil〇-TC組中二者之SE的行為特徵 ⑩相同。毛果云香鹼注射後5分鐘内，老鼠逐漸產生腹瀉， 登毛及其他擬副交感神經刺激的徵兆。於隨後的15_2〇分 10鐘期間’老鼠呈現出把頭上下快速擺動，扒抓，咀嚼及探 究的行為。再發性癲癇發作係在投藥毛果芸香鹼後約15_2〇 - 分鐘開始。此等伴隨著頭及兩側前肢具有舉起及跌倒事件 之癲癇發作，於毛果芸香鹼後約35-40分鐘進展成SE，如 前文中所說明者（特斯基等，1989，杜貝等，2001 ;安德雷 I5等，2003)。未遭受Se且接受鋰及食鹽水之控制組包括20 _ 隻老鼠。 於SE後14天時進行細胞計數之57隻動物組中，總數 13隻老鼠於SE後第一個48小時期間死亡。死亡率依處理 而不同：DZP 老鼠 36% (4/11)，TC30 老鼠 33% (4八2)， 20 TC60 老鼠 8% (1/12)，TC90 老鼠 0% (0/10)及 TC120 老鼠 33% (4/12)死亡。於DZP組中，4隻老鼠於SE後首先的 24小時死亡。TC30老鼠組中，一隻老鼠於SE之日死亡， 一隻老鼠於SE後24小時内且二隻老鼠於48小時内死亡。 於TC60老鼠組中，一隻老鼠於SE後48小時死亡。於 58 200800158 TC120老鼠組中，SE後二隻老鼠於24小時内且二隻於48 小時内死亡。 進行對SRS潛伏期及晚期細胞計數研究之55隻老鼠組 中’ SE後第一個48小時内之死亡率如下·· DZP老鼠70/〇 5 10 15 20 (1/14) ’ TC30 老鼠 27% (3/11)，TC60 老鼠 〇% (0/10)， TC90 老鼠 〇〇/〇 (o/u)及 TC12〇 老鼠 〇% (〇/9)死亡。DZp 老 鼠組中，一隻老鼠於SE後第一個24小時期間死亡。於 TC30組中，二隻老鼠於SE後24小時内且一隻於48小時 内死亡。 早期中海馬及皮質中之細胞密度（SE後14天） $控制組老鼠比較，DZP老鼠中海馬CA1區中之神經 元數量大幅降低(於錐體細胞層中下降85%)，而CA3區之 知傷量不太大(損失40%)(表1及圖1)。於鋸齒狀腦回中， DZP老鼠謂門中遭受大量神經域失(65%)，而粒細胞層 並未顯示顯明的傷害。相同的傷害分佈可在腹面海馬中觀 察到，但並未在該區中進行細胞計數。 於丘腦中，中央脊侧巾心、及外侧，背外鬚侧背及於中 ^❶内側核之神經元損失中等（分別下降U，％，及 中央脊側核中較顯著(49%)且主要係在背外侧核之 腹外侧部份(90%)(下表1及圖2)。

控制組 (n==10) 10.9 土 1,9** pilo- pilo- TC90 TC120 (n-10) (n=8) ...........—--- 47.7 士 65.5 土 6.6*° 2.9°° L 1 —— pilo-TC30 39 3 ± 4 4**°° 59 200800158

CA3·區 52.1 土 2.7 31.3 土 2.9** 35.7 土 1.8** 31·6 土 1.4** 35.1 土 2.9** 39,8 士 1.5" 肺門 96·4 土 3.5 33.5 土 3.0** 33.0 土 3.2** 32.8 土 3.3** 37.5 土 3.1** 44.8 士 2.9** 丘钃 中央脊侧 内侧 31·9 土 0.9 16.4 土 1.9** 11.5 土 2.5㈣ 19.1 土 2.6** 23.1 士 2.8°° 28.6 士 0.800 中央脊側 _心 31.9 土 1.2 26.3 土 1.8** 26·9 土 0.6* 24.1 土 27.4 土 1.5 29.9 土 1.7° 中央脊侧 外侧 25.9 土 0.6 19·6 土 0.8** 20.5 土 0.7** 18·9 士 0.6** 22 土 1.2*° 24.4 土 1.1°° 背外侧， 内侧，背侧 102.2 土 2.5 61 土 6.3" 64.2 土 77.5 土 79.4 士 3 1**00 89.8 士 3.7*。 背外侧， 腹面外侧 97.8 土 1.7 9.7 土 2.5** 8.8 土 2.8** 56·7 土 8.7** 71，8 土 5.3°°* 79.0 土 4.7°° 中心内側 113.1 土 5.9 74·2 土 7.4* 75.6 土 7.7* 83.7 士 9.6* 88.2 土 8.5 108.2 士 6.6° 扁桃腺 底及侧邊 46.7 士 1.2 12.8 士 5,3** 27.3 土 4 27.8 土 40.7 土 1.6°° 42.7 士 1.3°° 内侧，背侧 前 84.3 士 3.8 40.0 土 2.5** 46.8 士 5.0** 58.4 土 2.8**° 72.2 土 5.7°° 80·2 土 2.6°° 内侧，腹面 後 35.1 土 1.7 21.8士 2.4** 22.3 ± 1.8㈣ 26.2 ± 2.9** 30.7 士 3,7°° 34.7 土 1.7°° 腦皮質 梨狀，第 II層，背侧 36·6 士 0.8 12.6 土 4.2** 15·7 土 2.9** 27.5 士 2 g**〇〇 32.4 土 1.1°° 35.2 土 1.1°° 梨狀，第 II層，腹面 33.0 士 0.8 3.6 土 0.7** 7·2 土 3.8** 13.7 土 4.2** 18·4 土 4·000 30.5 土 L3°° 梨狀， 第III層 19.2 土 0.7 1.2 土 1.2** 1.8 土 1.8** 6.4 土 23" 9 土 3.000 15 士 2.2〇〇 鼻内，第 II層，背侧 29 土 0.6 23.5 土 0.7** 23.4 土 0.6** 23·9 土 0.5** 26·3 土 0.9** 27,3 士 0.500 鼻内，第 II層，腹面 26.8 土 0.7 21·7 土 1.3** 22.7 土 0.9 23.3 土 0.8** 25.4 土 1.1° 25.1 土 0.6 鼻内，III/IV 層，背侧 29.2 土 0.9 22.3 土 0.5** 22.3 土 0.5** 23.2 土 0.8** 26.7 土 0.8* 26.4 土 0.700 鼻内，III/IV 層，腹面 28.7 土 1.7 7.7 ± 2.3** 13.2 土 1.9** 16.5 土 22" 23·7 土 1.5°° 24·5 土 ΙΑ°° 表1 : TC增加的劑量於進行li-pilo SE老鼠之海馬，丘 60 . 200800158 腦，扁桃腺及腦皮質中之神經元細胞體數目上的效應 *ρ < 0·05，**ρ<0·(Η，pilo-TC與控制鋰·食鹽水老鼠間之 統計上的顯著差異性 °ρ < 0·05 ’ οορ<0·(Η ’ pilo-TC 與 pil〇_DZp 老鼠間之統計 5 上的顯著差異性

10 15

20 扁桃腺中，内側腹面後核中的神經元損失為中等 (38%)且底及侧邊及内侧背前核中較顯著（分別下降73及 53°/〇)。中心核中沒有神經元損傷（表1及圖3)。 相較於控制經食鹽水-處理之老鼠，DZP老鼠中，梨 狀皮質中神經損失幾乎全部在第IH層（94%)中，其不再 真的可看得到且於背侧及腹面第H層中分別達到66及 89%。於背侧鼻内皮質中，第n及ΙΠ_ιν層中遭受輕微 損‘（分別為18及24%)且跋面第η及m/rv層中，傷害 分別達22及74% (表1及圖4)。 與DZP老鼠CA1錐體細胞層巾者比較，經tc-處迫 之動物的海馬中，細胞損失明顯減低。於TC30, 60 i 90老鼠中該減低顯著（細胞損失36_47%)且於TC12〇組_ 甚為明顯(細胞損失12%)。所有TC·之差異性係划 i的顯著(表1及圖υ °於％錐體層中，由RWJ所絮 發者僅於UG毫克/公㈣4時有輕_神經倾傾向 但DZP組之差異性不明_ , x 左…『王个/ί顯。相較於Dzp動物 =:，嫩腦回之肺門中的細胞損失類似於 m90組中者(下降6_)且於觀〇組中赛 降低損傷的傾向(神經元損失53%)。此等差里性沒肩 61 200800158 任何一個為統計上顯著。 於丘腦中，神經損失係類似於DZP及TC30及TC60 老鼠中者。TC於60毫克/公斤劑量時於背外側内侧背侧 核中及於90及120毫克/公斤二種最高劑量時於所有的 5丘腦核中具明顯地保護性，雖然於1(：9〇老鼠中之中央脊 侧中心及中心内侧核中差異性並未達到顯著。與Dzp老 鼠相比較，TC120老鼠中之神經元脫落相當減低。除了 ⑩ 背外侧内侧背侧核中者(表1及圖2)外，係在由4至19% 辄圍且神經元的數目不再與控制動物者明顯不同。於扁 10桃腺中，TC於30毫克/公斤時於底及側邊核中及於60 毫克劑量時亦於内侧背侧前核中具明顯保護性。於最高 劑量時，TC極具神經保護性；神經元的數目不再與控制 量者明顯不同且於所有扁桃腺核中之控制程度達到 99%(表1及圖3)。 15 與30毫克/公斤劑量之DZP處理比較，於腦皮質中， ⑩ 用TC處理之任何皮質區皆無明顯保護性。於6〇毫克/公 斤時，TC僅於背側梨狀皮質第η層中明顯降低神經損失 (與DZP組中之66%比較下降25%)。相較於Dzp處理， 於90及120毫克/公斤時，TC明顯保護所有三個區域之 20梨狀皮質且於TC最高劑量120毫克/公斤時，神經元的 密度達到控制量之78-96%，甚至於梨狀皮質中，背侧H 層及III層其中DZP組中之神經元總數幾乎全部耗盡。 於背侧及腹面鼻内質之所有層中，TC之二種最低劑量， 30及60毫克/公斤不能提供任何神經元保護。TC29〇_ 62 200800158 ί t曰月顯保護腹面鼻内皮質之π及m/iv層（相 β 而邱於之19及73%，背側部份之11及II/IV層中

4 ^ 17〇/^#) 〇 ^ TC 5 10 15 面置去昏庠$,u t斤時，鼻内皮質所有的部份，背侧及腹 控：組中：程ί2此等區域中之神經元數不再明顯與 ^同（相較於DZP組中之27-81%，85- 94%神經元存活）。 再發性癲癇發作之潛伏期及頻率 DZP組(U隻老鼠）巾自發性癲癇發作之潛伏期達到 15.5 ± 2·3天之平均值且類似於TC3Q⑽隻老鼠）中者 (11.6 ± 2.5天）。於Tc之較高濃度時，可將動物分成具 有短及長潛伏期的子群。短潛伏期被認為是se後任何期 間比40天短者。某些老鼠呈現第一次自發性_發 潛伏期類似於DZP及TC組中所記錄者，但老鼠的數目 呈現出該短潛伏期值隨TC濃度增加而逐漸減少。因此， 於3〇毫克/公斤時，7〇%的老鼠(7/10)具有短的療痛發作 潛伏期，而於90及12〇毫克/公斤時，該百分比分別 到 36% (4/11)互^〇/〇(1/9)(下表 2 及圖 5)

63 200800158 pilo-TC90 11 3組 短潛伏期（n=4) 長潛伏期 (n=2) 非癲癎性 (η=5) 14.8 土 5.7 52.0 ± 1.0*° 150**〇〇 3组 pilo- 9 短潛伏期（n=l) 長潛伏期 非癲癇性 TCI 20 (n-4) (η=4) —---- 13.0 84·5 ± 16.7"00 ------ 15〇**〇〇 表2 ·· TC增加的劑量於自發性癲癇發作之潛伏期上的效 應 **ρ < 0·01，*ρ<0·05，與pilo-DZP組比較之統計上的 顯著差異性 。、< 0·01，〇ρ<0·05，與短潛伏期組比較之統計上的 著差異性 ” 10 於TC60，90及120組中，具有長潛伏期老鼠的平均值 類係在由52至85天範圍。最後，於TC之二種最高 劑量¥，吾人能夠確認於SE_後15〇天期間沒有發展任 鼠的百分比。非’癇老鼠於TC二種劑量時 θ。此而g，9g*i2g組中較低 上的顯著性但於:週期間2:::之程度上並未達到統計 著性。 四__癇發作之_或平均數達到顯 64 15 200800158 癲癇發作的次數亦根據第一次自發性癲癇發作之潛伏 期期間而標繪。於四週之記錄中，具有短潛伏期的動物較 具有長潛伏期期間的老鼠顯示出有超過2-3倍癲癇發作的 傾向。由於ANOVA並未顯示出任何顯著性而沒有統計分 5析可以進行，極可能係由於TC12〇動物之短潛伏期子群中 僅有一隻動物之故（圖7)。然而，當將所有的潛伏期值對 癲癇發作次數標繪時，明顯的反向關係導致具有·〇4相 馨 係數之直線（圖8)。 · 吾等需要再進行二個測定以結束該分析。第一個是動 1〇物上的細胞計數，其係視訊所記錄者及接著於第一次自發 性癲癇發作後2個月或於第5個月後殺死時進行以研究腦 ，傷害之程度及位置及自發性癲癇發作之發生及/或潛伏^間 之潛在關係。第二個係於追蹤一-年發生癲貞發作之老 進行以研究吾人聲稱，，非癲癇性，，的動物是否於5個 15保持無癲癇發作。 、仍 •,本研究的結果顯示用TC處理於Li-pilo誘導之8£發 後1小時起動時於海馬之CA1錐體細胞層，及於腹面择 側梨狀及鼻内皮質中之所有層中具有神經保護的特性Γ 亦保濩丘腦及扁桃腺核。然而，除了於CA1，一個 20二個扁桃腺核中外，Tc於3〇毫克/公斤劑量時沒二 ’ °於60亳克/公斤之劑量時，背側梨狀皮質的π層及° 二個扁桃腺核亦被保護。於9〇及12〇毫克/公:= 數所研究之大腦區，除了海馬ca3及鉅齒狀腦回之 。後二個結構加上背外側腹面背侧丘腦核為唯一 65 200800158 5 10 15 20 區域其中神經元的數目保持與控制組之120亳克/公斤 劑量明顯不同。此等數據清楚地顯示TC之極有效的神經 保護特性。分子似乎可預防屬於由Li-pilo所誘發之緣痛痛 回路亦即海馬，丘腦，扁桃腺及副海馬皮質中多數區域中 之神經元死亡。此等為吾人業已於經鋰-pilo_處理之老鼠的 癲癇產生過程中偵測到MRI信號（羅氏等，2002a)之所有 區域。沒有被TC有效保護之僅有的二個區域為CA3錐體 細胞層及鉅齒狀腦回之肺門。後區域遭受快速及大量細胞 損傷（安德雷等，2001 ;羅氏等，2〇〇2a)且無任一前文研究 中所使用之神經保護能夠保護該結構。根據早期研究確^ 該結構業已確認為鋰_pil〇模式中癲癇發作之起始及維持的 •重要區（杜貝等，2000)。顯然的，本案數據顯示癲癇產生 可以預防，即便是該區中之傷.害仍相當明顯。視訊所記錄 之動物組上的長-期細胞計數能夠顯示是否該區中傷害的程 度對該模式中之癲癇產生係重要的。 ^ 於30毫克/公斤劑量時處理不會影響第一次自發性癲 癇發作的潛伏期。们倍高量時，動物發展癲癇症之百分 比係如DZP或TC3G老鼠般的快速，但該子群之相關重要 性與所用之TC劑量相反。另一子群，於藥物之二種最高 劑量時於4-6 之潛伏期後發展怪定數(每組2_4隻動物） 之癲癇’ 4_5隻老鼠於5個月後並未變成癲癇性， 短潛伏_間之於1G倍及長潛伏期者之2·3倍。 生之可能與動财基礎皮f中所賴 假設係根據吾人注音钊u t ^ 低儺口人汪忍到8£後14天進行短期神經元計數之 66 200800158 動物基礎皮質中神經保護程度中某些多相性的事實。然 而，此時，吾人尚未於用於研究癲癇產生之動物中進行神 經70計數且因此，基礎皮質中存活的神經元數與癲癇產生 之速率或甚至產生間之潛在關係上沒有獲得結論。

5 本研究中所獲得的數據與前文吾人團隊所報導之TC 60毫克/公斤劑量保護海馬及基礎皮質免於神經元傷害及 延遲再發性癲癇發作產生的研究一致（參見前文報導， ❿ 2002)。彼等確信基礎皮質之保護可為影響癲癇之鋰-毛果 云香驗模式中誘發疾病改善之主要因素。基礎皮質作為癲 1〇癇過程之啟動劑的主要任務係如前藉由吾等團隊於鋰_毛果 云香鹼模式中展示（安德雷等，2〇〇3 ;羅氏等，20〇2a， b) 〇 結論’該研究的結果顯示試驗化合物（TC)具有極顯著 的抗-癲癇產生效應。 15 复例2的參考 ⑩_安德雷V，馬雷斯考C，涅里格A，費里滋JM (2001) 有助於顯頁癲癇之鋰-毛果芸香鹼模式中發展自發性再 發性癲癇發作之海馬卡巴產生之(GABAergic)系統的替 代法。 20 海馬 11 : 452-468。 _安德雷V，里哥洛特MA，康寧E，費蘭敦A，涅里格 A (2003)普利加巴林(pregabalin)於老鼠之鐘毛果芸香 鹼模式中長期處理保護基礎皮質及延遲自發性癲癇發作 發生。癲癇症44 : 893-903。 67 200800158 卡維海洛EA (1995)癲癇之毛果芸香鹼模式，義大利 神經科學期刊16 : 33-37。 杜貝C，馬雷斯考c，涅里格A (2〇〇〇)代謝性及神經 病理性探討鋰-毛果芸香鹼所誘發的癲癇產生期間發生 於未成年及成年老鼠腦中成形變化之了解。癲癇症 (附錄 6) : S36-S43。 =c’波耶特s，馬雷斯考ce里格Α(2〇〇ι)於 未成年及成年老鼠中長期癲癇之鋰_毛果芸 神經元損失與發作中葡萄糖代謝之間的關 果^ 10 學167 : 227_241。 驗神經 帕辛諾斯G，華森c (1986)趨實體性協 腦，第2版，學院報刊，聖地牙哥。 $之老鼠 羅氏C，雷洛伊c，涅里格a，納默n q⑽ 15 振影像對成年老鼠顳頁癲癇之鋰·毛果芸香2a)#礤性共 的貢獻。癲癇症43 : 325-335。 驗挺式研究 _ 羅氏C ’雷洛伊C，涅里格A，納默IJ 口⑽ 天-大的老鼠中，皮質傷害於發展顳頁癲2b)於P2U 使用鋰-毛果芸香鹼模式之MRI探討。^的預言值： 1129-1136。 竭癇症 43 : 20 _特斯基L，艾肯諾米多C，特斯基Wa，、 ZA，卡維海》EA 〇989)回顧：擬副交感神私波多洛脫 癇產生。由毛果芸香鹼所誘發的癲癎發作：=機制及癲 之新穎實驗模式。突觸3 : 154_171。 手癲癇症 實例3 68 200800158 PC 12 i田胞血清斷隆掇式 血清斷除係為細胞毒性之環境激發免疫反應，其導致 培育的細胞系以及各種組織器官之主要細胞，包括神經細 胞中之細胞死亡。特別是，嗜鉻母細胞(PC) 12細胞業已 5廣泛使用為用於許多神經變性及細胞死亡相關的疾病之試 管内神經元細胞模式（慕里爾等，粒線體之游離鈣含量(羅 得-2螢光）及醯基鞘胺醇-依賴之細胞死亡時，神經元分化 之PC12細胞中之超結構替代法，綜合神經學期刊， 2000，426(2)，297-315 ;德米查基等，類鸦片短暫性避免 10細胞凋亡機制之活性作用接著短期間之血清斷除，神經化 學期刊，2000，74(3)，960-969 ;卡里雷等，神經生長因 子及jk清斷除後降低的細胞凋亡；四價甘油酸_3_填酸醋去 氩酶轉化成二聚體，分子藥理學，2000，57(1)，。 將PC12細胞培育於添加10%經熱-不活化的馬血清及5% 15胎牛血清(FBS)之無菌介質（RPMI 1640)中。培養介質亦含 有青黴素-鏈黴素_新黴素抗體（分別為50·微米·克，50·微米 克，100微米·克）。介質係每隔一天更換且將細胞變成對數 相接近細胞流動。 將控制細胞培育於一般介質中無需任何處理。將式7 20 或式8之對映體（lO.mu.M)充分混合於介質中且然後施用於 細胞。於2天之分析時，式7或式8 (lO.mu.M)之對映體僅 在血清斷除時施用一次到細胞上。於7天之分析時，將式 7或式8 (lO.mu.M)之對映體在血清斷除時且之後每48小 時當細胞用新鮮的新不含-jk清介質更換時施用於細胞上。 69 200800158 5 10 示 於血清斷除財，細胞係培育於 不“清的介質中。細 甲基噻唾·2·基)·5_(3·絲··曱氧基苯 抓四唾鑌内鹽(MTS)分析於灰清斷除後2或7天=定苯基） ^實驗終了時，將細胞用新鮮的介f清洗且用腿溶 液^含5% 〇)2經濕化之3n：培育器中培育15小時。於 培育期後’將細胞立即用Softmax程式（分子裝置）分析。 MTS分析為用於測定給定實驗裝置中存活之細胞數的量熱 法。該分析係根據四唑铕鹽，MTS之細胞轉化成可溶解於 ^織培養介質中之甲嘖且直接在490毫微米下於96-孔洞 刀析板中測定。吸光度係直接與培養基中存活細胞數成比 例。控制細胞中之任意吸光度讀數係以100%存活率表 表3所列舉之數據顯示口服給藥以式7及式$之對映 15體於PC12細胞血清斷除模式中細胞存活率上的效應。 I 表3 (細胞存活率％) ———— 2天 存活率(％) 7天 存活率(％) 控制組 100 100 不含-血清 49.6 ± 2·6 23·8 ±2.6 式7 69,4 + 1.71 79·9 ± 4.02 式8 66.4 ± 5.41 85.2 + 0.62 200800158 實例4 盤暫藤性局部缺血去g 式7之對_(試驗化合物)係在短暫腦 血 5

10 15

腦動脈閉塞(MCA〇)老鼠模式(如H.mK.小暮，中 風立1989 ’ 2〇，1037 ;及，E.席隆佳，P.R.溫斯汀，S.卡 ^及R•坎明’中風’ 1989 ’2〇, 84)中使用雄性維斯塔 老鼠以1〇及_毫克/公斤（靜脈注射）祖8〇1 (代嗤西平 (DiZrilPine)順式丁稀二酸鹽；CAS言主冊號石馬·6·22_ 1 Γ上可付到之神經保護化合物胸作為正性控制(3毫 克/公斤，經由腹腔）而調查。 將老鼠(n= 12)隨機編置於四實驗組之一組中且予以麻 醉。將從_動脈之動脈，前職脈及後腦動脈流入中腦 動脈的血賴步料錄I輯—小_，將動物用載 體(於-小時顧靜脈注射給藥)處理i小時，控制組(單一 劑量經由腹腔於〜】、時期間之起始時給藥）及二劑量式7之 對映體（於-小時期間靜脈注射給藥）。阻斷二小時後進行 再灌注。 將動物殺死且製備每個腦之2〇毫求·厚的冠狀切片。 將來自於前至枕骨皮質中之四十個切片（亦即每個8〇隨) 20中之-個用於定量大腦病灶的程度。玻片係使用經甲苯基 糸染色的切片(根據尼塞爾步驟)製備且在光顯微鏡下檢 根據出現形態改變的細胞來測定個別老鼠之冠狀切片 中之區域性局部缺iL的表面積。將神經元損傷或梗塞的面 200800158 積予以測量且然後相加。將每個動物之皮質及紋狀體體積 計算出來(局部缺血的總表面積乘以0.8毫米（厚度)）。 MCAO模式分析 將隨機分置到四個實驗組之各動物的平均體積G+-5 .SJE.M·)用單-向ANOVA(單向ANOVA為比較3種或多種 不相配之組別之統計方法），接著藉由霍丹納t-試驗（二方 法係併入美國加州卡拉巴沙市，巴林博公司之Statview (512+軟體）進行比較。 如下表4中所示者，當p值< 0.05時與載體組〇p< 10 0·01 ; 2p< 0.05)比較，其結果被認為係統計性顯著。 處理 N 平均梗塞體積（毫米3)土S.E.M. 皮質體積 紋狀體 總計 載體，10 12 275.5 土 79·4 土 354.9 土 毫升/公斤 27.1 3.6 29.9 MK801® 3 12 95.8 土 56·1 土 151.9 土 毫克/公斤 24.51 5.32 28.71 式 7 @ 10 12 201.0 土 75.9 土 276·9 土 毫克/公斤 23 ·9 2.6 25.4 式 8 @ 100 12 98·8 土 63·0 土 161.9 土 毫克/公斤 29,51 5.92 34.31 72 200800158 引證的If 作為全部内容係合併於本文中 5 10 15 20 專利案或專利申諳岽所有目財如同各個公開案或 為參考而用於所有的目的^且個職㈣全料人本文作 ri丨私參考w雜料纽的權力 例並非用來限制本申請案中所說明之特定的具體 菽’作為本發明烟觀點之單-_。精於此方:枯 *之人士應顯而易知本發明可在不苴精神卞鎔 做許多修正及變化。精於此方面技;範圍内逕 明及附鹛沾国,批 议衣之人士應可從上述說 法及裝置而易知本發明之範圍内功能上相等的方 於後附πμ文中所列舉者°此等修正及變化係涵蓋 2附申睛專利範圍之範疇内。本發明只被後附 ”的條款，以及此等申請專利範圍 二： 全部範圍所限制。 子寻内谷之 【圖式簡單說明】 ^圖1 :係顯示TC增加的劑量於u_pil〇 SE後第14天 ，算之海馬不同區域中許多神經元數目上的效應圖。數值 係以神經元細胞體於各有意義區域中之數目土s e m表示。 圖2:係顯示TC增加的劑量於ii_pil〇 SE後第14天所 桃腺不同财許多神經域目上的效應圖。數值 係以神經元細胞體於各有意義區域中之數s±sem表示。 73 200800158 圖3 ··係顯示TC增加的劑量於H-pil〇 SE後第14天所 計算之丘腦不同核中許多神經元上的效應圖。數值係以神 經元細胞體於各有意義區域中之數目土 sE.M·表示。 圖4:係顯示TC增加的劑量於丨丨-pilo SE後第14天所 5計算皮質不同核中許多神經元上的效應圖。數值係以神經 元細胞體於各有意義區域中之數目±S £.]Vl·表示。 圖5 :係顯示TC增加的劑量於第/次自發性癲癇發作 _ 之潛伏期上的效應圖。數值係以每組之平均潛伏天數 士 S.E.M·表示。 10 圖6 :係顯示TC增加的劑量於四週期間於視訊記錄之 自發性癲癇發作頻率上的效應圖。數值孫以癲癇發作之平 均數±S.E.M·表示。總數係代表4週期間視訊記錄所觀察到 之癲癇發作的總數且平均係代表每週癲癎發作的平均數。 平方總和試驗顯示出於癲癇發作的總數(ρ=〇·〇45)及每週癲 15癇發作平均數(ρ=0·045)上之處理效應。 着 圖7 :係顯示根據潛伏期至第一次自然癲癇發作所標繪 之視訊記錄四週期間之癲癇發作總數（SL =短潛伏期， LL=長潛伏期）。數值係以各子群癲癇發作的平均數 表示。平方總和試驗益未顯示任何明顯的處理效 2〇 應。 圖8 :係顯示潛伏期至第一次自然癲癇發作間之相關性 及於接著四週期間所觀察到之癲癇發作的總數。 74

Claims (1)

1. 200800158 十、申請專利範圍·· 1· 一種提供神經保護的方法，其包括將治療有效量之選 自包括式⑴及式（II)之基團的化合物，或其製藥上可接 受的鹽或酯，給藥至需要用神經保護性藥物(NPD)處理 5 之病患·

   10 式m 式(π) 其中， 苯基係在X上被一個至五個選自包括氟，氣，溴及碘之基 15 團的鹵素原子所取代；且， Rl ’ R2，R3，R4，R5及尺6係獨立選自包括鼠及C1-C4烧 基之基團；其中，Ci-C4烷基係任意的被苯基（其中， 苯基係任意的被獨立選自包括鹵素，Cl_C4烷基，Ci· C4烷氧基，胺基，硝基及氰基之基團的取代基所取代) 20 所取代。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中，X為氯。 3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中，X係在苯環之 鄰位上被取代。 4·如申請專利範圍第1項之方法，其中，Ri，R2，R3， 75 200800158 R4，R5及R6係選自氩。 5 -種提之m包括將治療有效量之 自包括式(I)及式(II)之基團的對映體，或其製藥上可招 受的鹽或酯，或對映混合物（其中，選自包括咸⑴及式 (II)基團之對映體中之一種佔優勢）給藥至需要用神經保 護性藥物(NPD)處理之病患·· ' ’

   式(i) 式(π) 其中， 15苯基係在X上被一^固至五個選自包括氣’氣，演及峨之基 團的齒素原子所取代；且’ I Rl，R2，R3，R4，R5及R6係獨立選自包括氫及C1-C4烧 基之基團；其中，Cl-C4烷基係任意的被笨基（其中， 苯基係任意的被獨立選自包括鹵素’ Cl -C4烧基，C1 · 20 C4烧氧基，胺基，硝基及氰基之基團的取代基所取代) 所取代。 6·如申請專利範圍第5項之方法，其中，X為氯。 7·如申請專利範園第5項之方法，其中，X係在苯環之 鄰位上被取代。 76 200800158 8.如申請專利範圍第5項之方法，其中，R4，R2，R3， R4，R5及化6係選自氫。 9·如申請專利範圍第5項之方法，其中，選自包括式⑴ 及式(Π)基團之對映體中之一種係顯著至約90%或更大 5 的程度。 10. 如申請專利範圍第5項之方法，其中，選自包括式(I) 及式（II)基團之對映體中之一種係顯著至約98%或更大 的程度。 11. 如申請專利範圍第5項之方法，其中，選自包括式⑴ 10 及式（II)基團之對映體係選自包括式(la)及式（Ila)基團 之對映體：

   式(la) 式(Ila) 其中， 苯基係在X上被一個至五個選自包括氟，氯，溴及碘之基 20 團的鹵素原子所取代；且， Ri，R2，R3，R4，R5及R6係獨立選自包括氫及CrC4烷 基之基團；其中，CrC4烷基係任意的被苯基(其中，苯基 係任意的被獨立選自包括鹵素，CrC4烷基，烷氧 基，胺基，硝基及氰基之基團的取代基所取代)所取代。 77 200800158 12. 如申請專利範圍第11項之方法，其中，X為氯。 13. 如申請專利範圍第11項之方法，其中，X係在苯環之 鄰位上被取代。 14·如申請專利範圍第11項之方法，其中，R4，R2，R3， 5 R4，R5及R6係選自氫。 15.如申請專利範圍第11項之方法，其中，選自包括式(la) 及式（Ila)基團中之一種對映體係顯著至約90%或更大 的程度。 16-如申請專利範圍第11項之方法，其中，選自包括式(la) 10 及式（Ila)基團中之一種對映體係顯著至約98%或更大 的程度。 17.如申請專利範圍第5項之方法，其中，選自包括式⑴ 及式（II)基團之對映體係為選自包括式（lb)及式(lib)之 基團的對映體： 15 Ο

   式(lb) 式(lib) 18. 如申請專利範圍第17項之方法，其中，選自包括式(lb) 及式（lib)基團之一種對映體係顯著至約90%或更大的 程度。 19. 如申請專利範圍第17項之方法，其中，選自包括式(lb) 78 200800158 及式（lib)基團之一種對映體係顯著至約98%或更λ的 程度。 20·如申請專利範圍第1或5項中之方法，其中，使病患 成為需要神嫌保護之可能的神經傷害原因係選自包括 5 下列之群組.：外傷性腦部損傷（ΤΒΙ) ’包括純性及穿透 性頭部外傷之對CNS或PNS之任何類型的損傷或外 傷；CNS感染；缺氧症；中風(CVAs);影響CNS之自 體免疫疾病，例如’狼瘡；出生損傷，例如’出生前 後的窒息；心臟停滯；治療性或診斷性血管手術過 !〇 程，例如，頭動脈之動脈内膜切除術或腦血管X光顯 影；脊椎索外傷；低血壓；由栓塞，高或低灌注對 CNS之損傷；代謝性疾病，例如，糖尿病，組鐵缺 氧；已知對NPDs反應之疾病之已知的發生誘因；CNS 之腫瘤；腦腫瘤，例如，神經膠母細胞瘤；CNS中或 15 周圍流企或出血，例如，大腦内流血或硬膜下赢朦； > 腦水腫；熱病性痙攣；發熱；濫用藥物，外傷，中 風，局部缺jk，亨丁頓氏舞蹈病，阿茲海默氏症，帕 金森氏症，傳染性蛋白質病變化性-埃二氏病（prion disease variant Creutzfeld —Jakob disease)，肌萎縮性侧 20 索硬化(ALS)，糖尿病性神經病變，撖欖體橋腦小腦萎 縮，癲癇症，發作，低血糖，手術或其他參與，祝網 膜局部缺血（糖尿病性或者其他），青光眼，視網膜變 性，多發性硬化，毒性及缺血性視神經病變，黃班部 退化，CNS或PNS曝露於毒性或有毒試劑；藥物中毒 79 200800158 或戒斷，例如，古柯鹼或酒精；神經變性疾病或相關 疾病之家族史，癲癇性重積狀態史；病患需要用神經 保護藥物(NPD)治療之代用品標記或生物標記的證據， 例如顯示結構或官能性病理學之MRI掃描，神經元降 解產物之企清濃度的提升，睫狀體神經營養因子 (CNTF)提升的程度。 21·如申請專利範圍第2〇項之方法，其中，使病患成為需 要神經保護之誘病因素係選自包括下列之群組：^卜傷 性腦部損傷（TBI)，鈍性，閉鎖性及穿透性頭部外傷· 手術’中風或其他腦-金管意外(CVA);癲癇性重積狀 態及CNS之腫瘤。 22.如申請專利範圍第21項之方法，其中，該誘病因素係 包括鈍性，閉鎖性或穿透性頭部外傷及手術參與之夕卜 傷性腦部損傷(TBI)。 15

   23·如申請專利範圍第21項之方法，其中，該誘病因素為 中風或其他腦-ik管意外(CVA) 〇 24·如申請專利範圍第23項之方法，其中，該誘病因素 神經變性疾病。 ” 一 25·如申請專利範圍第1或5項中之方法，其中，談化人 20 物（或對映體）或其製藥上可接受的鹽或醋係與一^或; 種其他化合物或治療劑合併給藥而投藥。 26·如申請專利範圍第25項之方法，其中'，該一種或多種 其他化合物或治療劑係選自包括具有一種或多種下列 特性之化合物群組：抗氧化劑活性；NMDA受體枰抗 80 200800158 性’内因性GABA抑制作用之增進；N〇合成酶抑制 劑活性；鐵結合能力，例如，鐵螯合劑；鈣結合能 力，例如，鈣(II)螯合劑；鋅結合能力，例如，鋅(π) 整合劑；阻斷納或_離子通道之能力；開放鉀或氯離 5 子通道之能力；以便將神經保護效應提供至病患。 27.如申請專利範圍第26項之方法，其中，該一種或多種 化合物可另外選自包括抗_癲癇藥物(AEDs)之群組。 • 28·如申請專利範圍第27項之方法，其中，該抗〜癲癇藥 物(AED)係選自包括下列的群組··胺曱醯氮蕈，克洛巴 10 沙（clobazam) ’氣硝西泮，乙琥胺，費巴美 (felbamate)，加巴潘亭（gabapentin)，拉莫提珍 * (lam〇tigine)，里維 &拉西 π且（levetiracetam),氧卡巴氮 雜箪（oxcarbazepine)，苯巴比妥，雙苯丙脲，普利加巴 林(pregabalin)，去氧笨比妥，雷替加品（retigabine)， 15 他嵐潘尼（talamPanel)，提加品（tiagabine)，托吡拉酸 φ 鹽，丙戊酸鹽，維加巴新（vigabatrin)，桑尼沙米 (zonisamide)，苯並二氮雜箪，巴比妥鹽或鎮靜性安眠 29· —種知：供神經保遵之製樂組合物，其包括製藥上有效 20 量之對映體，或其製藥上可接受的鹽或酯，其係選自 包括式(I)及式(II)之群組或對映體混合物，其中選自包 括式⑴及式(II)群組中之一種對映體係佔優勢： 81 200800158

   10 15

   20 O 产Ν' ? R4 /R5 式(I) 式(II) 其中， 苯基係在X上被一個至五個選自包括氟，氣，溴及蛾之基 團的鹵素原子所取代；且， R4，R2，R3，R4，R5及R6係獨立選自包括氫及Crc4烷 基之基團；其中，crc4烷基係任意的被苯基（其中， 苯基係任意的被獨立選自包括鹵素，Ci-Q烷基，cp c4烷氧基，胺基，硝基及氰基之基團的取代基所取代） 所取代及製藥上可接受的載體或賦形劑。 30· —種套組，其包括如申請專利範圍第29項中之製藥組 成物的治療有效劑量型式於適當的包裝或容器中連同 其等適當用法之資料或說明以對於需要其之病患提供 神經保護。 31. 如申請專利範圍第1或5項中之方法，其中，治療有 效量係由約0.01毫克/公斤/劑量至約100毫克/公斤/劑 量。 32. 如申請專利範圍第1或5項中之方法，其中，該病患 於該給藥之時尚未發展出神經損傷或障礙之臨床徵兆 或徵侯群。

   82 200800158 1/8

   海馬

   a Control opilo-DZP apiIo-TC30 a pilo-TC60 o pilo-TC90 Qpilo-TC120

   °ρ<0·05, ·ρ < 0.01，pil〇-TC及控制組鋰-食鹽水老鼠間之 統計顯著差異性 200800158 33·如申請專利範圍第1或5項中之方法，其中，該病患 於該給藥之時係處於發展出神經損傷或障礙之風險 上。 34.如申請專利範圍第1或5項中之方法，其中，該病患 5 於該給藥之時業已發展出神經變性疾病或神經損傷之 臨床證據。

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