TW200806689A - Polynucleotides of haemophilus parasuis and its use - Google Patents
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Description
200806689 九、發明說明= 【發明所屬之技術領域】 本發明為發展抗副豬嗜血桿菌(//從所印如·^ 疫苗的領域，該疫苗包含有利用重組技術所製造出的多胜 肽。 5 【先前技術】 副豬嗜血桿菌細菌是引發格拉瑟氏症（Glasser，s disease)，意即豬的多發性漿膜炎與關節炎（p〇rdne polyserositis-arthritis)之主因，此病造成豬畜牧業上重大的 10 經濟影響。 使小豬提前斷奶，會增加格拉瑟氏症病發的頻率，也 會增加疫苗的使用量。據此推測由初乳所提供的母體免疫 是預防此疾病的決定性因素。 副猪嗜ik桿菌是一種存在於上呼吸道的共生細菌，只 15有當其菌落拓殖至下呼吸道時才會引發疾病，特別是當菌 落拓殖至肺部時會導致肺炎。 特定高毒性的菌株會穿過肺屏障並拓殖到金清組織， 導致衆膜炎、々包膜炎、關節炎等疾病，在某些情況下會 引电細膜k。因此’相對於存在上呼吸道的無毒性菌株， 2〇特定的副豬嗜血桿菌菌株具有拓殖及侵入多數組織的能 力。 副緒嗜企桿菌的一項基本特性是其抗原的變異性，該 特徵大大地降低了疫苗的效力。 μ 至y有十五種菌株的血清型無法被分類，且對豬隻進 5 200806689 行貫驗性的感染時，其毒性的程度依菌株而有所不同。 Kielstein等人在臨床微生物期刊(J CHn 862 (1992))中闡述’血清型與菌株的毒性程度有關，血清: 1 5、10和12菌株為尚毒性，而血清型2、4和u菌株 5中毒性，以及血清型3、6、7、9和11菌株為無毒性。然
而此種金清學上的分類並非絕對的，在實際狀況中還觀*察 到許多例外。 T 目前商業上並沒有可將副豬嗜血桿菌菌株分類為是否 具有毒性的診斷方法，因此，非常的需要具有一個不須等 10到疾病的症狀明顯就能夠及早判別副豬嗜血桿菌菌株是否 有热毋性的方法，並且此夠及早給予適當的治療。 含有非活化細菌（菌苗）的疫苗被用來保護豬隻預防 副豬嗜ik桿菌’此類疫苗因為會引發本質上用以對抗可能 會由一囷株改變成另一菌株之脂多聽(lip〇P〇lysaccharideS) 15的體液性免疫反應，使得此疫苗的效能有限。 專利申請案第WO-A-00/01408號，揭露了一種使用細 菌細胞萃取物的抗副豬嗜血桿菌感染之疫苗，該萃取物施 用於豬隻腹膜内時會有毒性反應，但是當存在有佐劑的情 況下，施用於肌肉内時則具有保護作用。 20 目前，負責引發免疫反應及保護作用之抗原的分子性 質尚未被清楚描述，只知道該細胞萃取物的有毒活性是存 在於一高分子量的蛋白質片段中。 這種情況也在另一形式的案例中被發現，如流感嗜血 桿菌，Hendrixson 等人在分子細胞 6 200806689 期刊(Mol· Cell· 2: 841 (1998))中闡述，負責組織之拓殖與侵 入的分子為具有自動傳送性質的膜糖蛋白（membrane glycoproteins)，稱為黏附素(adhesins)、侵染素(invasins)或 企球凝集素(hemaglutinins)。 5 關於上述之流感嗜血桿菌，專利申請案第 WO-A-96/30519號揭露用以預防該細菌所造成之感染，包 含有利用重組技術製成之黏附蛋白的疫苗。 然而’發展賦予良好免疫保護之疫苗的主要缺點，在 於缺乏對該副豬嗜血桿菌基因組的瞭解，特別是缺乏對作 1〇為副豬嗜企桿菌之黏附素、侵染素或血球凝集素遺傳密碼 之多核普酸的瞭解。 因此，對於能有效對抗副豬嗜血桿菌之疫苗，仍有迫 切的需求。 藉此，本案發明人研發出用以預防副豬嗜血桿菌感染 I5之疫苗’該疫苗包含有以重組技術生產的多胜肽。… 【發明内容】 本發明之主要目的在於提供副豬嗜灰桿菌多核皆酸。 20 第二方面，本發明之目的在於藉由本發明之多核㈣ 所表現的多胜肽。 第三方面，本發明之另一目的在於提供一種表現載體 (expression vector)，該表現載體包含至少一段本發明之副豬 嗜血桿菌多核發酸。 第四方面，本發明之另-目的為—由至少包含有一段 7 200806689 的表現载體所轉殖之宿主 的在於副豬嗜血桿菌之重 本發明之副豬嗜血桿菌多核普酸 細胞。 第五方面，本發明之另一目 組多胜肽的製備程序。 第二f面本發明之另一目的在於利用本發明之該多 胜肽來製備疫苗且/或免疫原性組合物（i_ composition)之用途。 的為一種預防副豬嗜血桿 第七方面，本發明之另一目 菌感染的疫苗。 10帛八方面’本發明之另一目的在於利用該多核魏來 測定，緒喷血桿菌菌株為毒性或無毒性之用途。 ft方面，本發明之另—目的在於—用以測定副豬嗜 血桿菌菌株為毒性或無毒性的工具組(kit)。 15【圖式簡單說明】 第一圖 第一圖係為達成基因與蛋白質定序(sequendn幻與註解 (Annotation)之不同技術階段的流程圖，該基因與蛋白質係 視為副豬嗜血桿菌之自動傳送者蛋白(aut〇transp〇_)、黏 2〇附素（adhesins)、侵染素（invasins)或血球凝集素 (hemaglutinins)的多胜肽的編碼。 第二圖 第二圖係顯示為副豬嗜血桿菌多胜肽編碼之多核苷酸 的3’端部份的多重排列比對。該等多核苷酸可以依結構分 8 200806689 為二個群組，分別為第一組、第二組及第三組。第一組包 含核苷酸 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 7、 SEQIDNO: 9、SEQIDN0: 19、SEQIDN0: 21、SEQIDNO: 23以及SEQ ID NO: 25;第二組包含核苷酸SEQ ID NO: 5 5以及SEQ ID N0: H ;第三組包含核苷酸SEQ ID NO: 13 以及SEQ ID NO: 17。以序列SEQ ID NO: 15所定義的多 核苷酸被認為應歸為第一組，但是因為該多核苷酸缺乏3, 端部份，因此無法被導入於在所有的多核苷酸的多重排列 比對中。該多重排列比對是以Thompson等人在核酸研究期 1〇 刊(ucleic Acids Res· 25: 4876 (1997))中發表之 CLUSTALX 程式來完成。 第三圖 第三圖係顯示為該副豬嗜血桿菌多胜肽之5，端部份 的多核苷酸編碼之多重排列比對。在206個核苷酸中可觀 15 察到高度保留性，且前36個核苷酸完全相同。 第四圖 第四圖係顯示該副豬嗜血桿菌多胜肽之胺基酸的多重 排列比對，該等多胜肽可依結構分為三個群組，分別為第 一組、第二組及第三組。第一組包含多胜肽SEQ ID NO: 2、 20 SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24 以及 SEQ ID NO: 26;第二組包含多胜肽SEQ Π) NO: 6以及SEQ ID NO: 12 ; 第三組包含多胜肽SEQ ID NO: 14以及SEQ ID NO: 18。 第五圖 9 200806689 第五圖係顯示本發明之數種副豬嗜血桿菌毒性及無毒 性菌株之多核苷酸增殖產物(amplification products)的洋菜 膠體電泳圖。 第五圖A中顯示出對應於第一組多核苷酸的增殖產 5 物。該第一組多核苷酸係以序列SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3、SEQIDN0.7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:19、 SEQ ID NO: 2卜 SEQ ID NO: 23 以及 SEQ ID NO: 25 所定 義。 第五圖B中顯示出對應於第二組多核苷酸的增殖產 ίο 物。該第二組多核苷酸係以序列SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 11所定義。 第五圖C中顯示出對應於第三組多核苷酸的增殖產 物。該第三組多核苷酸係以序列SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 17所定義。 15 列 M 顯示 Ikb ladder(New England Biolabs)，係用以標 不分子量。 列a顯示對應於該副豬嗜血桿菌菌株的增殖 產物，該囷株為血清型5的高毒性參考菌株，根據實驗會 重現格拉瑟氏症。 20 列1顯示對應於沒有顯現出任何格拉瑟氏症症狀或 損傷，且/或在農場中沒有病歷的豬隻，由其鼻腔所分離出 之囷株的增殖產物。 列f-k顯示對應於取自確定感染格拉瑟氏症豬隻體内 不同器官中分離出的菌株增殖產物。 200806689 第五圖B中，以箭頭指出的j列區帶為毒性菌株 HP2269菌株的聚合酶鏈鎖反應(PCR)產物。該菌株以引子 pADH-F (SEQ ID NO: 27)定序，且表現出一稱為 HP2269-2+1的多胜肽。此命名法用以識別該菌株為 5 HP2269，屬於第二組，且電泳泳道為j，以及從最低分子量 鼻起的第1區帶位置。 第六圖 第六圖顯示了對應於多胜肽HP2269-2-j-l之胺基酸序 列的比較結果。該多胜肽是由隸屬HP2269菌株之第二組的 1〇較低分子量的多核苷酸（圖5箭頭標示的區帶）之PCR產 物所表現。以引子pADH-F (SEQ ID NO: 27)產生之該多核 苦酸序列係被電腦模擬轉譯，且所得到之多胜肽序列再以 blastX程式與本發明之多胜肽序列比較。 第六圖A中顯示HP2269-2-j-l與隸屬於第一組的多胜 I5狀SEQ ID N〇:i6進行排列比對；第六圖b中顯示 HP2269-2+1與隸屬於第二組的多胜肽SEqIDN〇:12進行 排列比對。兩次比對結果，該多胜肽HP2269-2-j-l的胺基 西夂序列具有59%的一致性(identity)。 2〇【實施方式】 多核苷酸的鑑定 本發明所提供之多核苷酸經副豬嗜血桿菌g株 (㈣二ki)的—基因組序列定序後，確認為血清型5之高毒性 ί考囷株貫1¾上會造成格拉瑟氏症(Takahashi et al·，獸醫 π 200806689 醫學科學期刊(j· Vet· Med Sci.) 63: 487 (2001))。 本發明之該等多核苷酸具有的共同情形為，該等多核 苷酸表現出的多胜肽與自動傳送者蛋白、黏附素、侵染素、 血球凝集素、以及存在於原生細菌中的外膜蛋白具有顯著 5的同源性。換言之，這些多核苷酸表現出暴露於細菌表面 的多胜肽，會被宿主免疫系統的抗體所辨認，所以適合被 用以製備預防由副豬嗜血桿菌所造成之感染的疫苗。
本發明係有關於一種副豬嗜血桿菌多核苷酸，該多核 苷酸具有選自下列所構成之族群的一段序列：SEQ ID ίο NO:卜 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: U、SEQ ID NO·· 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23 以及 SEQ IDNO:25。 如第一圖的流程圖所示，用來鑑定該多核苷酸的程序 15 包含了重組技術與電腦處理的結合。 用於本發明之多核苷酸鑑定程序的實驗方法，組合了 此技術領域中具有通常知識者所熟知的技術，且這些技術 都已有完善的描述，例如在Sambrook等人所著的書籍中。 熟悉該技術者也擁有一些補充的資訊，這些資訊通常 2〇 伴隨生化產品和設備的說明文件而來，而這些說明文件中 則會有製造商對於產品和設備的建議使用程序。 根據第一圖之流程圖，鑑定本發明之多核苷酸的實驗 流程包含有下列幾個階段： 1·培養一株毒性副猪嗜血桿菌菌株· 12 200806689 為了純化基因體DNA與獲得基因庫，使用由澳洲昆士 蘭動物研究所的Pat Blackall博士所提供的副豬嗜血桿菌 Nagasaki菌株，該菌株為血清型5的毒性菌株。 該菌株被培養在6個直徑為90 mm的培養皿中，且接 5種於飽和巧克力瓊脂（由Bio M6rieux公司生產），並存放 於37°〇5%二氧化碳的培養箱中48小時。有3父1〇10菌落 形成單位(CFUs)的菌量產生。
2·純化副豬嗜血桿菌的基因體DNA 藉由在磷酸鹽緩衝溶液（Amresco公司所製造）中再懸 ίο浮，並以3000 g的轉速離心使其沉澱，以自該培養基中重 新收集細菌。除去離心後之上清液，將該沉澱的細菌再懸 浮於溶液中。之後以Genomic-tip 100/G實驗套組（Qiagen 么司出產）純化該基因體DNA。純化結束後，以缓脂膠體 電泳來檢查該DNA的完整性，產生一分子量超過3〇,〇〇〇 I5 鹼基對的一個區帶。 3·1·利用酶切割進行該基因體DNA的片段化 以3」/和沿/ (New England Biolabs)兩種限制酶 配合廠商所提供之適當的反應緩衝溶液和牛血清蛋白，來 切軎彳副豬嗜血桿菌的基因體DNA。以該限制酶^w 34/切 20割該基因體DNA，會在副豬嗜血桿菌DNA中產生黏性片 段；而以該限制酶及似/切割該基因體dNA，會產生平整 末端片段。這兩種限制酶的切割都會產生大小介於 300-l，200bp的片段，使其適合被選殖在質體中。 3·2·利用超音波震盪進行該基因體dna的片段化 13 200806689 以超音波隨意的震碎基因體DNA。副豬嗜血桿菌之 DNA溶液的超音波震盪是在B· Braun Labsonic U超音波震 盪器中完成。根據熟悉該技術領域中具有通常知識者常用 的方法，在不同的時間下給予不同的強度來完成超音波的 5震盪週期。 超音波震碎的DNA的片段大小介於100到l，500 bp， 其中大多數介於400到900 bp，之後以T4聚合酶酵素(New England Biolabs)將該等片段變為帶有平整末端的片段。 4·以瓊脂膠體純化經酶切割或超音波震碎之DNA片段 1〇 酶切割或超音波震碎的副豬嗜血桿菌基因體DNA片 段係於瓊脂膠體中進行純化。 經由限制酶Saw 3ΑΓ切割之DNA，純化後所回收之片 段為300到600 bp ;經由限制酶及似/切割之DNA，純化 後所回收之片段為400到800 bp ;以及用超音波震碎之 15 DNA，純化後所回收之片段為400到1500 bp。 以 QIAquick 膠體萃取套組（QIAquick Gel Extraction kit，由Qiagen公司所生產）或MinElute膠體萃取套組 (MinElute Gel Extraction kit，由 Qiagen 公司所生產），從 膠體中萃取出DNA片段。 20 該等純化之DNA片段的定量，係以等量樣本(aliquot) 和一已定量化之 DNA 標準（New England Biolabs 的 pUC 19 ) 同時在瓊脂膠體中進行遷移(migration)而定量。 5· DNA片段選殖於質體PUC19中 質體 pUC19 (New England Biolabs)是一個在 β-半乳糖 14 200806689 苷酶基因内具有多重選殖點之高複製數的質體
，可使DNA 片段的插入具有高效力。 為了使經由酶切割以及超音波震碎所產生的DNA片 段能夠插入，該質體係以使該質體可與DNA片段之黏性末 5端或平整末端相容之型態而製備。 該質體的製備在於用可適當製造出黏性末端或平整末 端的酶予以切割，並且利用磷酸酶將該質體的末端去磷酸 化，以避免切割後的質體接回環狀。 為了製備以插入由限制酶3//產生之副豬嗜血桿 1〇菌基因體DNA片段為目的之該質體pUC19,必須進行兩個 循環’每一個循環包含有··以限制酶及^ Engianc[
Biolabs)切割；以MinElute反應清潔套組(Qiagen)進行純 化，以小牛小腸填酸酶 CIP(calf intestinal phosphatase, New England Biolabs)進行去磷酸化；以及最後再以MinElute反 I5 應清潔套組(Qiagen)進行純化。 為了將以限制酶凡切割產生之副豬嗜血桿菌的基因 體DNA片段插入該質體pUC19，會使用限制酶Smiz /(New England Biolabs)，在該切割產物未預先純化的條件下，以 細菌鹼性磷酸酶BAP(Invitrogen)進行pUC19的去填酸化。 2〇該去磷酸化後的質體在經過瓊脂膠體中的遷移後，以 MinElute膠體萃取套組(Qiagen)進行純化。 以超音波震碎產生之副豬嗜血桿菌的基因體DNA片 段插入方面’是以限制酶*Sma /(New England Biolabs)來切 割質體pUC19，於此例中，以三種不同的方式進行去磷酸 15 200806689 化來提高質體的插入能力： a) 利用小牛小腸填酸酶CIP(New England Biolabs)， b) 利用細菌鹼性碌酸酶BAP (Invitrogen)，以及 c) 先以MinElute膠體萃取套組(Qiagen))在瓊脂膠體 5 中進行純化，然後由小牛小腸磷酸酶CIP(New England
Biolabs)完成去磷酸化。 最後，經瓊脂膠體遷移後，以MinElute膠體萃取套組 (Qiagen)純化該去磷酸化後的質體，以等量樣本(aiiqUOt)和 一已定量化之 DNA 標準（New England Biolabs 的 pUC 19 ) 10同時在瓊脂膠體中進行遷移，來定量該純化後的質體。 雖然基因庫是以上述之所有製備方法來建立和使用 的，但製備方法C)最為有效。 以T4接合酶(T4 ligase)(快速接合套組Quick Ligation Kit ’ New England Biolabs製造），完成去磷酸化片段内的 I5副豬嗜血桿菌（Nagasaki)之DNA片段的插入。然後以 MinElute反應清潔套組(Qiagen)純化該反應產物，並以超純 水(MilliQ water)沖提(elution)。 轉殖時使用電穿孔法勝任細胞大腸桿菌五·⑺"DH5a或 DH10B ’它們在β-半乳糖苷酶的/flcZ基因裡是有缺陷的， 2〇亚且對胺苄青徽素抗生素(ampiciUin)很敏感。藉由電穿孔法 轉殖該純化的接合產物至該等大腸桿菌。 士此來便可產生重組細菌；多數之該重組細菌都包 含有質體PUC19與副豬嗜轉_ DNA片段插入。 6·重組複製體(ci〇nes)的篩選 16 200806689 混合有pUC19與副豬嗜血桿菌的DNA插入之該細菌 菌落為白色，而藍色的大腸桿菌則是含有質體PUC19，但 不含副豬嗜血桿菌的DNA片段插入。如此一來，可篩選出 適當的複製體。 5 每個基因庫中通常含有數萬個重組體。以方法c)利用 去磷酸化的/來切割質體pUC19並純化，可產生最佳 的結果。 7·重組質體的純化 為純化重組質體，可使用下列的套組： ίο R.E.A丄Prep 96 BioRobot(Qiagen)和具有自動控制裝置 (BioRobot 3000, Qiagen)的 NucleoSpin 96 Flash(Macherey-Nagel) ，或者 若此過程是以手動完成者，則使用NucleoSpin 96 Flash(Macherey-Nagel)。 15 這些套組是利用細菌的驗分解原理，之後進行中和反 應、裂解液(lysate)的澄清化以及藉由異丙醇的添加使質體 沉澱。 一般而言’質體的濃度約在50到150 ng/pL之間。 8·複製在質體内之副豬嗜血桿菌DNA片段的定序 20 大多數純化的質體，在PUC19的選殖點中插入有副豬 嗜血桿菌(Nagasaki)的DNA片段。 利用位於該選殖點兩端之一條或另外兩條通用的引子 (primer)來定序該插入的DNA片段，於存在有 dNTPs(dATP、dGTP、dCTP 以及 dTTP 核苷酸)和 ddNTPs 17 200806689 的條件下，藉由聚合酶(polymerase)加以擴大，其中 ddNTPs係以不同的螢光染料標示。 所使用之該通用引子，皆來自Eurogentec生物科技公 司，其序列如下： 5 5 ’ -GTA AAACG ACGGCC AGT-3， 5 ’-AACAGCTATGACCATG-3， 以 BigDye Terminator ν3·1 套組(Applied Biosystems)在 96 孔盤（Applied Biosystems 或 Axygen)裡完成 23,676 個定 序’該96孔盤必須能適應應用生物系統(Applied Biosystems) 10 薇商所提供之溫度循環控制儀(thermocyclers)和定序機 (sequencers) ° 藉由將所有用以在電腦檔案中建構電泳圖的必要參數 輸入’使该等序列的讀取可自動地執行。 9·該等序列的彙編(asseinbling) 15 本發明使用 Phred 鍵程式(Phred chain of programs)(由
Ewing 和 Green 在基因體研究期刊（Genome research)，8: 175, 186(1998)中所發表），和 phrap and Consed(由 Gordon 等人 在基因體研究期刊(Genome Research), 8: 195(1998)中所發 表)來彙編第8項所述之23,676個多核苷酸。 20 一個重疊群(contig)是數個多核苷酸序列的集合，該重 疊群具有明顯程度的重疊。 共得到721個重疊群和94個孤兒序列（orphan sequences)(未編入重疊群的序列）。將所有的重疊群和孤 兒序列的多核苷酸數量加起來，可產生2，139,〇54個鹼基 18 200806689 對右我們考慮翻豬嗜血桿菌(N啊㈣的預估大小約為 2,500,000鹼基對，我們可以認定此舉已經涵蓋超過_的 副豬嗜血桿菌基因體，因此，具有良好的定序品質。 10· ^叠群的註解和副豬嗜血桿菌多胜狀的鑑定 苐9項所產生之该多核苷酸（重疊群）的註解，是利 用blastX序列比較程式，以及可在國家生物技術資訊中心 網站(^^iiM^^SgfcLaim.nih.gov/BLASTO 上所找到的 GenBank資料庫來完成。 該程式在電腦中將該多核苷酸轉譯成多胜肽 ，並且那 10些具有較大的可能性是與其他微生物之黏附素、侵染素、 血球凝集素以及自動傳送者蛋白之形式的多胜肽序列為同 源性的多胜肽的排列比對被挑選出來。前述之黏附素、侵 染素、血球凝集素和自動傳送者蛋白等蛋白質，被認為是 拓殖和入侵多數微生物體内組織(tissue)的來源。 15 本案之發明人已經確認出13種多核苷酸重疊群重要的 序列，這些序列被稱為SEQIDNO: 1，SEQIDNO:3，SEQ ID NO: 5，SEQ ID NO: 7，SEQ ID NO: 9，SEQ ID NO: 11， SEQ ID NO: 13，SEQ ID NO: 15，SEQ ID NO: 17，SEQ ID NO: 19，SEQ ID NO: 21，SEQ ID NO: 23 和 SEQ ID NO: 25。 20 該等多胜肽的序列與本發明中以電腦程式所轉譯的多 核苷酸相對應，因此以序列SEQ ID NO: 2所定義的多胜肽 即為以序列SEQ ID NO: 1所定義之多核苷酸的電腦程式轉 譯結果，以下編碼皆依照此原則，直到以序列SEQ ID NO: 26所定義之多胜肽，該多胜肽是以序列SEQ ID NO: 25所 200806689 定義之多核苦酸的電腦程式轉譯結果。 當該等序列與存在於GenBank資料庫中的序列，以 blastN程式比對後，並沒有其他生物的dna序列被確钟、為 與本發明之多核苷酸序列具顯著的同源性。 5 因此，本發明的多核苷酸序列為新潁的。且這些多核 苷酸之間具有高度的同源性，此點可於本發明中所有多核 苷酸5’末端的多重排列比對結果（第三圖）得到證實。該 多重排列比對在前206個核苷酸中顯示出良好的保存性， 且前36個核苷酸完全相同。 1〇 如第二圖中所顯示之副豬嗜血桿菌多核苷酸的末端 3’部份的多重排列比對，該等多核苷酸可被分為三個結構 群組，分別為第一組、第二組以及第三組。第一組包含有 核苷酸 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23 15以及SEQ ID NO: 25 ;第二組包含有核苷酸SEq ID no: 5 以及SEQ ID NO: 11 ;第三組包含有核苷酸SEQ ID NO: 13 以及SEQ ID NO: 17。由於多核苷酸SEQ ID NO: 15在末端 3’部份缺失了至少一個片段，所以並無法正式的被分類至任 一群組之中。即便如此，SEQ ID NO: 15的最後198個核 2〇苷酸與第一組的所有序列具有98%到99%的相似度，因此 SEQ ID NO: 15被認為是屬於第一組。 本發明之多核苷酸的製備程序 從第三圖所顯示之SEQIDNO: 1、SEQIDNO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、 20 200806689 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQIDNO:2卜 SEQIDNO:23 以及 SEQIDNO: 25等多核苷酸之5,部份的多重排列比對，可衍生一寡核苷 酸’其與該等多胜肽的起始密碼子之後的前27個核苷酸雜 5 交。 该养核苦酸’也可稱為引子(primer)，具有如下之序列： pADH-F: 5’-ATGAATAAAATATTTAGAGTTATTTGG-3，(SEQ ID NO: 27) i〇 本說明中所指出之該寡核苷酸已經由Eurogentec公司 依照所提出之該序列以商業規格所製備。 以相同的方法，從第二圖多核苷酸的3，末端的多重排 列比對，可衍生三個寡核苷酸，該等寡核苷酸會與以該最 後胺基酸的密碼子為結束的該等多胜肽基因的最後24或 15 25個核苷酸雜交。 該等募核苷酸(Eurogentec)之序列如下： pADH-Rl : 5、CCACACAAAACCTACCCCTCCTCC-3，(SEQ ID NO: 28) pADH_R2 : 5，-CCACTGATAACCTACCCCCACAGAG-3’ 20 (SEQ ID NO: 29) pADH-R3 ·· 5，CCACTGTAATGCAATACCTGCACC-3，(SEQ ID NO: 30) 該寡核苷酸pADH-Rl可與第一組之該等多核苷酸 (SEQ ID NO]、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 21 200806689 9、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 2卜 SEQ ID NO: 23 以及 3£(31〇]^0:25)雜交；同樣的，寡核苷酸？八011-112可與第 二組之該等多核苷酸(SEQ ID NO: 5以及SEQ ID NO: 11)雜 交；以及寡核苷酸pADH-R3可與第三組之該等多核苷酸 5 (SEQIDNO: 13 以及 SEQIDNO: 17)雜交。 此處所提到之寡核發酸可被當成引子藉由使用例如 AccuPrime™ Taq的DNA聚合酶高保真度系統（DNA Polymerase High Fidelity system，由 Invitrogen 公司出產）來 增殖在副豬嗜血桿菌菌株(Nagasaki)内之本發明的多核苷 10 酸0 增殖作用的結果在0·8%瓊脂膠體中進行的電泳法來分 析，並以SybrGold染料（Molecular Probes公司生產）加以 染色。 第五圖之電泳列a顯示增殖後的產物，該產物係對應 15於該副豬嗜血桿菌菌株(Nagasaki)。 第五圖之電泳列Μ顯示1 kb ladder(New England Biolabs)，係用來當作分子量的標示。 該等增殖後的產物對應於第一組（第五圖A，a列）之 SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 2〇 9、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 2卜 SEQ ID NO: 23 以及 SEQ IDNO: 25，第二組（第五圖B, a列）的SEq仍說5 和SEQIDNO: 11 ;以及第三組（第五圖〇，&列）的SEQm NO: 和SEQ ID N0: 17，並以符號〈來表示該等增殖產 物，且其相對應的數字能夠被區分。 22 200806689 該多核苷酸SEQ ID NO: 15是在以序列SEQ ID NO: 3 與SEQ ID NO: 23所定義之多核苷酸的區域中被發現。 以該等序列之鹼基對所表示的大小與在膠體中指出之 增殖產物所顯現的分子量之間，已被證實存在有良好的關 5聯性，其中，上述之該等序列為：3£(^10：^0:1、3£(310>^0: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: H、SEQ ID NO]3、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO·· 19、 SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23 以及 SEQ ID NO: 25。 每個多核苷酸的區帶被萃取，且之後可遵照本說明中 先前所提及之習用技術予以增殖，因此本發明之各個多核 苷酸之皆予以增殖生產。 在該等具有相似分子量且在電泳膠體上顯現混清的多 核苦酸例子中，可電泳法在能夠使鱗多核苷酸分 15 20 =條件下使其分開，此係為該技術領域中具有通常知 例如：增加膠體長度且/或延長電泳的發 或者是選殖於各種質體載體。 確認副豬嗜血桿@ _為毒性或無毒性之程序 如先前所指出，副豬嗜血桿菌 其抗原變異性，且當對動物進;中-個基本特徵為 程度會隨著菌株而改變。因此極* =的感染時’其毒性 血桿菌菌株被分類為毒性或無毒“，鑑定該副緒嗜 本發明之其-目的為使明 副豬嗜血桿_株轉性或鱗^之夕核絲來測定- 23 200806689 目前已發現，該等毒性菌株具對應於本發明之一個或 多個多核皆酸之基因體增殖產物，而該等無毒性菌株則不 具有該增殖產物。 用以測疋一田彳豬嗜血桿菌菌株為毒性或無毒性之程 5序，大體上是遵照前項所述之多核苷酸的基因體增殖的實 驗協定（本發明之多核苷酸的製備程序）。 在此案例中，一株其毒性基因型需要被測定之菌株的 DNA已被檢測，且其可用來檢測用來作為對照組之該副豬 嗜血菌株(Nagasaki)的DNA。 ίο 该程序利用引子PADH_F，同時使用前述之該等引子 pADH_Rl、pADH-R2以及pADH_R3中的其中一個，選擇 性的分別增殖放大第一組、第二組以及第三組中的多核苷 酸。 谷亥增殖作用能夠以例如·· AccuprimeTM 丁叫的DNA聚 15 Polymerase High Fidelity system,
Invitrogen)來完成。 所得之結果是在〇·8%的瓊脂膠體中所進行的電泳法來 分析，該瓊脂膠體係以SybrG〇ld染料(M〇lecular Pr〇bes)加 以染色。 弟五圖顯示對應於該副豬嗜企桿菌菌株(Nagasaki)之 增殖產物（電泳列a)，以及對應於數種被測試菌株之增殖 產物’該等測試菌株會在範例中看見，係對應於不同的血 清型： 電泳列b-e顯示對應於取自沒有格拉瑟氏症症狀或器 24 200806689 官損傷特徵’且/或在沒有格拉瑟氏症病史之農場中的豬隻 鼻腔内之分離菌株的增殖放大產物。 電泳列f-k顯示對應於確定感染格拉瑟氏症的豬隻，其 體内不同器官中之分離菌株的增殖放大產物。 八 5 可觀察到該無毒性菌株並未顯示出與對應於本發明之 多核苷酸的增殖產物，而具有毒性之菌株則具有一個或多 個對應於本發明之多核苷酸的增殖產物。 因此本發明之多核苷酸的使用已被證實能夠在樣品中 檢測一副豬嗜血桿菌菌株為毒性或無毒性，不管該微生物 10具有怎樣的抗原變異性。 本發明之另一目的為提供一套組來測定一副豬嗜血桿 菌菌株為毒性或無毒性，該套組的特徵在於包含有： a) 多核苷酸序列為 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、 15 SEQ ID NO: 13 > SEQ ID NO: 15 ^ SEQ ID NO: 17 > SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23 以及 SEQ ID NO: 25的增殖產物； b) 寡核苷酸 pADH-F(SEQ ID NO: 27); c) 寡核苷酸 pADH_Rl (SEQ ID NO: 28)、pADH-R2 2〇 ( SEQ ID NO: 29)與 pADH-R3 (SEQ ID NO: 30);以及 d) 使用聚合酶鏈鎖反應(PCR)技術來進行增殖反應 (amplfication reaction)所需的試劑。 本發明之多核苷酸的放大產物被用來當作模板，並置 於分子量之模板階梯(ladder)旁邊，亦即1 kb ladder(New 25 200806689
England Biolabs) 〇 該套組所包含的該等募核苷酸，於使用該技術領域中 具有通常知識者所熟知的聚合酶鏈鎖反應(pCR)技術中，被 用來放大可能會出現在試驗菌株中之本發明的同源多核苷 5 酸(homologous polynucleotides)，且遵照本段已描述的方法 來測定該菌株為毒性或無毒性。 在一較佳實施例中，當本發明中的所有核苷酸在該套 組中被增殖，該套組可包含有該副豬嗜血桿菌菌株 (Nagasaki)作為對照組，。 10 同源性(Homology) 本發明中的兩個胺基酸序列之間的一致性(identity)百 分比，係指出兩個被比對序列之間的同源胺基酸的殘基百 分比(percentage of residue)，該殘基百分比是在達到最佳的 I5排列比對後所產生，並且該百分比純粹為統計結果，而且 該兩個序列之間的不同處是隨機的分散並遍及於該序列。 該最佳的排列比對與一致性百分比較高的排列比對有關。 兩個胺基酸序列之間的比較可以使用例如國家生物技術中 心（National Center for Biotechnology information)網站 20 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上可獲得的 blastP 電 腦程式來進行比對。 兩個胺基酸序列間的一致性百分比，是藉由首先比較 兩個序列的位置，該序列位置則是根據最佳的排列比對所 得，並計算一致性位置的數目而得，該位置係該等序列之 26 200806689 間胺基酸殘基是一致的。 兩比較序列之間的一致性百分比的計算，是以該一致 性位置的數目除以被比較位置的總數目，再將所得的值乘 100。 5 —多胜肽具有與另一多胜肽特定比例的一致性百分 比，則為一般所稱之同源多胜肽。 核苷酸序列間的一致性百分比，也能夠用胺基酸序列 間的一致性百分比計算的方式來計算。 同源多核苷酸之間的一致性程度是能以實驗來測定 10的，例如：利用在電泳泳道中所發現的對應於第五圖中的 毒性菌株之多核苷酸的序列來測定。 第五圖中的電泳分析圖顯示，在以引子pADH-F，以及 引子pADH-Rl、引子pADH-R2或引子pADH_R3來放大毒 性菌株的DNA時，除本發明之多核苷酸外，其他分子量並 15 未對應於本發明之多核苷酸的多核苷酸也被放大。 被設計用來放大本發明之多核苷酸的引子，也放大了 這些其他種類的多核苷酸，因而判斷該等多核苷酸與本發 明之多核苷酸具有同源性。 從對應於屬於第一組與第二組的電泳列g、j、i及k之 20菌株的電泳膠體中以及對應於屬於第二組之電泳列f與h 之菌株的多核苷酸萃取出同源性多核苷酸，且端視該等多 核苷酸屬係於第一組或第二組，它們的端點被直接以引子 pADH-F 和 pADH_Rl 或 P-ADH-R2 定序。 一旦選出最高品質的區域後，則以上述之blastX程 27 200806689 式夕將所產生之該等序列與本發明之多核苷酸進行比對。 由多核㈣序驗電難式轉譯所得的多胜肽 ，該等同源 多胜肽的序列亦由相同的方式進行比對。 對應於以引子pADH-Rl或p-ADH-R2完成之該等序列 5的末^ 3冑份，所產生之同源現象介於95%到·，且 不同群組間之同源體的附屬亦互相有關聯性。 在5末端所產生之該等序列具有的同源現象在％%到 94%之間變動。 第六圖中顯示胺基酸序列的比對結果，該等胺基酸序 10列係對應於名為ΗΡ2269_2+1的多胜肽。該多胜肽為位於 私冰列j (第五圖中以箭頭所指出的區帶）屬於Ηρ2269菌 株第二組最低分子量之多核苷酸的聚合酶鏈鎖反應產物的 密碼。以該引子PADH-F(SEQIDN0:27)所產生之多核苷 酸的序列係在電腦中轉譯，且將所得之多胜肽序列使用 I5 blastx程式與本發明之多胜肽序列進行比對。 第六圖A中顯示’以屬於第一組之該多胜肽seq id NO: 16所產生的排列比對，且在第六圖B中則為以屬於第 二組之多胜肽SEQ ID NO: 12所產生的排列比對。在這兩 種情況中，該多胜肽HP2269_2-j-l之胺基酸的序列有59〇/〇 20的一致性，並且該多胜肽是目前所能找到與本發明之多胜 肽具有最佳同源性者。 因此，一副豬嗜血桿菌多核苷酸，其所表現之多胜肽 與選自 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 28 200806689 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO·· 24 以及 SEQ ID NO: 26 所構成之 族群中的一序列所定義出之一多胜肽，具有至少60%的一 致性，亦構成本發明之部份。 該多胜肽胺基酸之序列的一致性最好為至少70%，較 佳者為至少80%，更佳者為至少90%，最佳者為至少95%。 核苷酸序列之間的一致性百分比也可由雜交研究來測 定0 本發明的多核苷酸在嚴格的條件下，最好具有一可與
自序列 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: Π、SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: I5、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO·· 2卜SEQ ID NO· 23以及SEQ m N〇· 25所構成之族群 中所選出之一序列進行雜交的序列。 15 20 在嚴格的條件下進行雜交作用的意思為，溫度和離子 強度的條件係選定為可使較作祕持在兩互補的
DNA =又之間。&些條件皆為本技_域巾具有通常知識者所 =知^且在如由Sambn)QU和RusseUR W所著之分子選 室ft手冊第三版中被描述，該書美國冷泉港實 2001年。例如，嚴格的條件包含但並不 ==Γ °c下以G.ixssc清洗，可達到只 有-致性為95%的多核菁酸是雜交的。 多胜肽 29 200806689 另一方面，本發明與一副豬嗜血桿菌多胜肽有關，該 多胜肽與選自 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、 5 SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24 以及 SEQ ID NO: 26 所構 成之族群中的一序列所定義出之一多胜肽之間，具有至少 60%的一致性。 該多胜肽之胺基酸序列間的一致性百分比亦由先前說 明的方法來測定。 10 該同源性多胜肽與本發明之多胜肽的胺基酸序列之間 的一致性最好為至少70%，較佳者為至少80%，更佳者為 至少90%，最佳者為至少95%。 該多胜肽所具有之一序列宜是選自SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 15 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24 以及SEQ ID NO: 26所構成之族群。 如前所述，以SEQ ID NO: 2所定義之多胜肽，是由以 SEQ ID NO: 1所定義之多核苷酸經電腦程式所轉譯出來 20的，其後的序列編碼皆遵循此原則。 ^這些多胜肽具有的共同結構特徵，使其被認定高度可 能為如黏附素、侵染素、血球凝集素或自動傳送者蛋白等 類型蛋白質的候選者。 如第四圖所不之副豬嗜血桿菌多胜肽3，末端的多重排 30 200806689 列比對，該等多胜肽可被分為三組，分別為：第一組、第 二組和第三組。
第一組包含該等多胜肽SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 20、SEQ ID 5 NO: 22、SEQIDNO: 24 以及 SEQIDNO: 26。第二組包含 該等多胜肽SEQ ID NO: 6以及SEQ ID NO: 12。第三組包 含該等多胜肽SEQIDNO: 14以及SEQIDNO: 18。以序列 SEQ ID NO: 16所定義之多胜肽無法正式地被分類為任何 一組，但與其衍生源序列SEQ ED NO: 15所定義之多核苦 ίο 酸一樣，被認為是屬於第一組的部份。 本發明之多胜肽的製備程序 本發明之另一方面係有關於利用重組技術製備本發明 之多胜肽的程序，包含有下列階段： 15 a)培養一個由含有一多核苷酸之表現載體所轉殖的宿 主細胞，該多核苷酸表現出一多胜肽與選自SEQIDNO·
2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO· 22、SEQ ID 2〇 NO: 24以及SEQ ID NO: 26所構成之族群中的一序列所定 義出之一多胜肽，具有至少60%的一致性； b)表現該多核苷酸以生產該多胜肽。 在a)階段中，該多核苦酸在嚴格條件下，最好具有— 能夠與從序列 SEQ ID NO:卜 SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 31 200806689 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23 以及 SEQ ID NO: 25 所構 成之族群所選出之一序列進行雜交作用的序列。 5 更佳者是，在a)階段之該多核苷酸為一具有選自下列
所構成之族群的序列：SEQIDNO: 1、SEQIDNO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23 以及 SEQ ID NO: ίο 25 o 為完成上述程序，以表現載體轉殖之宿主細胞，係選 擇在多胜肽中可允許本發明之副豬嗜血桿菌多核苷酸的表 現者。 就能夠被用以表現我們所找到之該等多核苷酸之宿主 15細胞而言，可為例如，任一大腸桿菌(五· CO")菌株、酵母菌 (yeasts)囷株以及咼等的真核細胞。最好，能使用具有高的 表現良率之大腸桿菌，例如，大腸桿菌BL21(ED3)菌株 (Novagen) 〇 本發明之另一方面為以一表現載體所轉殖之一宿主細 2〇胞’該表現載體具有至少一個多核苷酸，且該多核苷酸所 表現之一多胜肽係與選自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO·· 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24 以及 SEQ ID NO: 32 200806689 26所構成之族群中的一序列所定義出之一多胜肽，有至少 60%的"—致性。 该多核苦酸最好具有一在嚴格的條件下可與從序列 SEQ ID NO]、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO· 5 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: H、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO·· 23以及SEQ ID NO·· 25所構成之族群中所選出 之一序列雜交的序列。 該多核苷酸更佳為具有一序列係選自下列所構成之族
10 群：SEQ ID NO·· ；l、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ id NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: n、SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 2卜 SEQ ID NO: 23 以及 SEQ ID NO: 25。 本發明之另一方面為具有一多核苷酸之表現載體，該 15多核苷酸所表現之一多胜肽係與從序列SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO· 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO·· 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24 以及SEQ Π) NO: 26所構成之族群中所選出之一序列所定 20 義出之一多胜肽，有至少60%的一致性。 該多核皆酸最好具有一在嚴格的條件下可與從序列 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7 ' SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: n、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO]7、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、 33 200806689 SEQ ID NO·· 23以及SEq ID NO: 25所構成之族群中所撰φ 之一序列雜交的序列。 、 該多核苷酸更佳為具有一序列係選自下列所構成之族
群：SEQ N0: b SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO·· 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO·· U、SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO·· 19、SEQ lD NO: 2卜 SEQ ID NO: 23 以及 SEQ ID NO: 25。 該表現載體係為一用來將一多核苷酸導入一細胞中之 實體。一般而言，可使用質體和噬菌體使用。 >在所屬技術領域内有許多適當的表現載體是熟知的。 在11些載體之中，可提及的，例如pET㈣(Ngvagen)或 系列(Qiagen)等載體。 當使用pET系列的載體(N〇vagen)時，在控制T7.啟 動子以及-核糖體固定序列的條件下，該等載體容許方向 υ性地選殖基因在5,位置上。在載體卿24a(+)和載體 pET-24d(+)之多重選殖點# 3，部份，我們發現代表6個組胺 酸的編碼序列，可促進該重組多胜肽的純化。 /別存姐倾pET_24a(+)和碰pET_24d(+)中之限 制S# I和^Vc〇 I，為客舌、西 20 \⑺1在夕重選殖點的5,部份造成適合開 ▲之轉譯起始點之基因插人的切點。 來^ ί基因在其3,部份的選殖會盡可能的接近 ^。女i、尾端’适也是該處會存在有限制酶遍工位點的原
Ndel 通吊’料插人體並不會含有可健等限制酶 34 200806689 I和I辨識的序列。如果發生了這種狀況，則設計 具有可放大該等多胜肽的5,端及3’端能力的引子，但在該 等引子的末端具有合適的限制酶位點。 其他的限制扭會造成黏性末端，該等黏性末端與由該 5專限制酶顺β I、I和恐〇 I所造成的末端相容。這項特 質非常地有趣，當該等需要被選殖的基因具有限制酶位點 M/e I、TVc(9 I或；^〇 I，但並非是那些具有相容末端的其他 酶。在這種情況下，則設計具有特定限制酶位點的引子， 該限制酶位點係對應於那些可與I或ΧΛο I相容 ίο 之限制酶。 可以被使用之該等引子的序列如下： pADH-F-BspHI:
5 GACTGATCATGAATAAAATATTTAGAGTTATTTGG 3，(SEQIDNO: 31) 15 pADH-F-Ndel:
5 GACTGACATATGAATAAAATATTTAGAGTTATTTGG 3，(SEQIDNO: 32) pADH-Rl-XhoI:
5 TTACTCGAGCCACACAAAACCTACCCCTCCTCC 20 3，(SEQIDNO: 33) pADH-R2-SalI:
5TAGTTAGTCGACCCACTGATAACCTACCCCCACAG AG3，(SEQIDNO: 34) pADH-R3-XhoI: 35 200806689
5 TTA^3^AGCCACTGTAATGCAATACCTGCACC 35(SEQ ID NO: 35) 在下面劃線標示者為限制酶可辨識的序列，而表示多 胜肽的序舰_為粗財。在該等引子的5,部份所增加 之核普機的’但該等核皆酸卻是該等限制酶具有良 好作用性所必需的。 本發明用以製備該多胜肽之程序所使用之重組技術為 本技術領域巾具有通常知識者馳知，並在如Sambr00k等 人所著的書中已有描述。 完成該程序之補充資訊亦已由販賣該表現載體的公司 所和:供，且在如^^gmdbiosciences com夕網砝可找到。 例如，從中我們可指出： L該等載體的製備（質體pET_24a(+)和pET-24d(+)， Novagen) 〇 2·自以聚合酶鏈鎖反應所放大之該多核苷酸製備該 DNA 插入體(DNA inserts)。 3·以 T4 接合酶（Quick Ligation Kit, New England
Blolabs)所製備之質體pET_24⑴和pET-24d⑴内之該等插 入體的接合。 4·該接合產物轉殖於大腸桿菌Novablue(Novagen)内。 5·以定序來鑑定該重組質體，其係利用在選殖點末端 所發現之T7啟動子引子：5，TAATACGACTCACTATAGG3, 以及 T7 終止子：5，GCTAGTTATTGCTCAGCGG3,。 6·該重組質體轉殖於大腸桿菌BL21(ED3)(Novagen) 36 200806689 内0 7。大腸桿菌BL21(ED3)内之該副豬嗜血桿菌重組多胜 肽的生產與回收。 8·以 His Bind Resin Ni-charged 套組(Novagen)，自包 5 含小體(inclusion corpuscles)純化該重組多胜肽。 本發明之該多胜肽基本上皆係以極高的純度產出。 另一方面，本發明有關於使用本發明之多胜肽來製備 用以預防或治療動物體内，由副豬嗜血桿菌所造成之感染 的疫苗且/或免疫原性組合物。 10 本發明之用以預防由副豬嗜血桿菌所造成之感染的疫 苗’包含有一免疫學有效劑量(immun〇l〇gically effective quantity)的多胜肽和一助劑(auxiiiary agent)，其中，該多胜 15肽與選自下列族群之一序列的多胜肽，具有至少60%的一 致性’該矢群為· SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO·· 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO·· 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO·· 20、 SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24 以及 SEQ ID NO: 26。 20 該夕胜肽的胺基酸序列的一致性最好為至少7〇%，較 佳者為至少80°/。，更佳者為至少9〇%，最佳者為至少95%。 較佳者為，該疫苗包含有一免疫學有效劑量的多胜 肽’且該多胜肽具有選自下列所構成族群的一序列：seq①
NO· 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ Π3 NO: 8、SEQ 37 200806689
ID NO·· 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO·· 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO·· 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24 以及 SEQ ID NO: 26。 為了增加免疫反應’ a亥疫苗可包含數個本發明之多胜 5月太。 在此說明中，疫苗或免疫原性組合物被認為是在動物 體内能誘發出免疫反應的抗原或化合物。 免疫學有效劑量，係指對於副豬嗜血桿菌所造成之感 染’具有足以誘發或促使引起保護免疫反應（全部或部份） 10 的抗原量。 當病原體所造成之感染的速度的降低，且/或病原體微 生物所造成之感染的症狀或厭重性的降低，可證實且有保 護免疫反應。 該疫苗可預防性地施打於未接觸過抗原的動物，因 15此’可預防由副豬嗜血桿菌所造成之感染。又或者，該疫 苗可治療性地施打於先前已接觸或已經被副豬嗜血桿菌感 染的動物。雖然無法避免感染，但是由動物生物體所產生 的免疫反應，允許其免疫系統能更有效的作用以抵抗感 染’例如，使感染後的病症較為減緩。 2〇 包含有多胜肽的疫苗，在該技術領域中為普遍所知 的，例如，在專利案EP-B_0074248和EP-B-0155146中所 揭露者。 疫苗也可被發展成包含有一免疫學有效劑量之本發明 的副豬嗜血桿菌多核苷酸。 38 200806689 本發明之疫苗也可為組合式疫苗，以保護動物預防由 副豬嗜血桿菌或由一個或多個病原體引起的感染。該組合 疫苗之第二種成份，係以其對於一個病原體產生保護反應 的月b力，且/或以其改善動物的症狀或病理狀態的能力為基 5 礎加以選擇。 這些免疫原性組合物可包含，但並不侷限於，能保護 預防由副豬嗜血桿菌引起的感染，也可提供保護預防下列 病囷之成分·胸膜肺炎放線桿菌（」冰⑽ p/ewr叩、溶血性毒素豬放線桿菌(m·⑽&^·//⑽ 10似的、巴斯德桿菌(Pfl对mw/Mc/i/a)、豬霍亂沙門氏菌 [Salmonella cholerasuis)、魏遂珠議（Streptococcus suis)、红 微丹毒織狀溘（Erysipelothrix rhusiopathiae")、約端螺、旋儀 (Leptospira sp·)、豬葡萄球菌(Staphybcoccus hyicus)、博德 氏桿儀（Bordetella 、豬肺炎黴漿菌 15 (柳亡吵/似miz 、細胞内勞森氏菌 intraceUularis)、大腸桿靝(Escherichia coli)、緒支殖^ 反呼吸 症候群（PPRS)、緒流感（swine flu)、豬小病毒（porcine parvovirus)、冠狀病毒（coronavirus)以及環狀病毒 (circovirus) 〇 20 形成該疫苗第二種成份之部份的該抗原，可選擇性地 以共價鍵的形式與第一種成份結合’形成一嵌合分子 (chimeric molecule)。該第二種成份的抗原亦可與一半抗原 (hapten)結合。 包含有該組合式疫苗之第一及第二種成份的散合分 39 200806689 子，可利用清楚描述的技術來合成。例如：可利用 胜肽合成儀以及標準商業化程序（Merrifield發表於商 刊，Science, 232:341-347 (1985))來合成生產出該=== 子。或是，該抗原可先單獨合成，然後再以化學六 刀 5式共髓合。 干-聯的方 該疫苗可經由適當的途徑施用，例如，經由口腔、魯 内、肌肉、真皮、腹腔内、皮下、直腸或陰道，或同日'士， 用上述任何一種的途徑。 T采 本發明之疫苗的藥劑型態取決於施用的形式，例如· ^注射方式（溶液、懸浮液或乳液）、片劑、栓劑、膠囊、 效型釋放製劑或粉末。 乂 、長 疫苗内所含抗原的量取決於不同的因素，諸如待接種 動物之年齡、重量、健康和一般生理特性，以及待施用的 特定疫苗。關於每一個組成份的最佳疫苗劑量測定，可藉 15由常規的技術如血清轉換現象分析來評估。 一般來說，該疫苗包含有10_95%重量的本發明之多胜 肽，並且根據藥劑型態以及施用形式，一般都會添加辅助 物質。 伴隨本發明疫苗中之多胜肽的助劑係選自藥學上可接 20受之賦形劑，例如，在R.C.Rowe等人所著的書籍藥用賦形 劑手冊’弟四版’倫敦 ’ 2003 (Handbook of Pharmaceutical Excipients, Pharmaceutical Press, 4th Edition, London, 2003) (國際標準書號，ISBN: 0-85369-472-9)中所描述。 在液悲製劑中’該助劑可為：濕潤劑(wetting agent)、 200806689 乳化劑(emulsion agent)、酸鹼值控制之緩衝液、水、生理食 鹽水溶液、酒精、防腐劑、且/或油性溶劑。 在固悲製劑中’該助劑可為：黏著劑(binding agent)、 /閏滑劑(lubricating agent)、甜味劑(sweetening agent)、填料 5 (fiUer)或崩解劑(disintegrating agent)。 本發明之疫苗也可包含佐劑(adjuvant agents)以增加疫 苗之免疫原性及其效力。 佐劑可使用如下例子··磷酸I呂(aluminium ph〇Sphate)、 硫酸鋁（aluminium sulphate)、氫氧化鋁（aluminium i〇 hydroxide)、皂皮樹萃取物 saponaria extract， QS21)、純化皂素（Quii a)、免疫刺激劑複合物 (immunostimulant complexes，ISCOMs)、磷酸鈣（calcium phosphate)、氫氧化|弓(calcium hydroxide)、氫氧化鋅(zinc hydroxide)、水溶性高分子膠(CARBOPOL)、胞壁二胜肽 15 (muramyl dipeptide)且/或以上任一組合。 此外’該疫苗可包含任何免疫調節劑(immunom〇dulator agent)，例如，細胞激素(cytokines)。 该疫苗也可以具有抗原的釋放控制系統(controlled release system)的方式來配製，例如抗原與生物相容性高分 2〇 子結合者，如：聚乙酸(polyacetic acid)，聚乳酸-乙醇酸 (poly(lactic-glycolic) acid)、曱基纖維素(Methylcellulose)、 透明質酸(hyaluronic acid)或膠原蛋白(collagen)。或者，該 抗原能夠微膠囊化，以改善其服用且/或增加其功效。 在某些情況下，疫苗可以冷凍乾燥的形式存放，施用 41 200806689 前再以無菌稀釋劑恢復原狀。 本發明之疫苗在豬隻體内具有高度的效力，不論是在 預防或是治療已表現出副豬嗜血制感染症狀的動物。 ^ ^下舉例之範例是為了提供本技術領域中具有通常知 識者能夠充分地瞭解，並且完整的說明本發明，但這些範 例不應被認為是限制本發明之標的，或侷限於本文中&前 提及的部份。 範例 10範例1·本發明之副豬嗜血桿菌多核苷酸的製備 首先，使用一般的方法來分離和純化該副豬嗜血桿菌 (Nagasaki)DNA，如以 Sambrook 和 Russell 在分子選殖，實 驗室參考手冊，第三版，美國冷泉港實驗室出版，紐約， 2001 年(Molecular cloning, a laboratory manual，third edition， 15 CSHL press，Cold Spring Harbor，New York，2001)書中所述 之方法，或使用由Qiagen或Macherey-Nagel建議之基因體 DNA純化套組。 使用AccuPrime™ Taq的DNA聚合酶高保真度系統 (DNA Polymerase High Fidelity system, Invitrogen)的基因體 2〇 放大聚合酶鏈鎖反應技術，並依照製造商之指示來製備本 發明之多核苷酸。 使用三個200 pL的反應試管，且該反應試管能適應溫 度循環控制儀(thermocycler，Axygen)，該等試管内含有以超 純水(MilliQ H20)稀釋的副豬嗜血桿菌(Nagasaki)DNA，並 42 200806689 使用券核音酸來進行放大反應’並且該等試劑始終保持在 冰裡。 三支反應試管中都含有寡核苷酸pADH-F (SEQ IDNO: 27) (Eurogentec)，此外，各反應試管中分別含有用來放大 5第一組、第二組和第三組之多核苷酸的特定寡核苷酸。 為放大第一組多核苷酸，係使用寡核苷酸PADH-R1 (SEQ ID NO: 28) (Eurogentec);對第二組多核苷酸而言，使 用券核苦酸 pADH_R2 (SEQ ID NO: 29) (Eurogentec)來放 大；以及使用募核苷酸pADH_R3(SEQ ID NO: 30) 10 (Eurogentec)來放大第三組多核苷酸。 下表顯示各反應試管中所含之成份及體積 成份 體積 10x AccuPrime聚合酶鏈鎖反應緩衝液II 5 pL 募核苷酸 pADH-F (10 pmol/pL) 4 pL 寡核苷酸 pADH-Rl 或 pADH_R2 或 pADH-R3 (10 pmol/pL) 2μ\. 副豬嗜血桿菌(Nagasaki) DNA (50 ng/pL) 3 pL AccuPrime™ Taq 高保真度DNA聚合酶(5 υ/μί) 0·2 pL 超純水 35·8 μι 在應用生物系統(Applied Biosystems，Axygen)溫度循 環控制儀中，以下列參數編程執行該放大反應： 43 200806689 第一循環為94 °C，2分鐘，接著 94 °C，30秒；60 〇c，3〇秒以及68 〇C，15分鐘，重複 30次循環，以及 最後一循環為68 °C，15分鐘。 接著，在第一組之多核苷酸的增殖產物中加入〇·〇5 pL 的 AccuPrime™ Taq 高保真度 DNA 聚合酶(DNA Polymerase High Fidelity)，然後被培養於68 QC，1小時30分鐘的條件 下。 第二組及第三組之多核苷酸的放大產物則被培養於37 ίο GC，3小時的條件下。 利用聚合酶具有核酸外切酶（exonuclease)活性的事 實，上述的處理容許去除掉對應於不完全增殖產物的附屬 區帶（accessory bands)。 其結果係將10 μι之放大反應後的產物在〇·8 %以 15 SybrGold (Molecular Probes)染色的瓊脂膠體中遷移，以進 行電泳分析。 弟五圖顯不電泳分析法的結果。電泳列]V[顯示1 kb ladder (New England Biolabs)，可用來當作分子重量的標示。 電泳列a包含本發明之多核苷酸，該多核苷酸已被副 2〇 豬嗜血桿菌菌株(Nagasaki)放大。 由第五圖A中的電泳列a，我們能分辨出對應於第一 組之多核苷酸的放大產物。第一組之多核苷酸係以序列 SEQ ID NO·•卜 SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO·· 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23 以及 44 200806689 SEQ ID NO: 25 所定義。 由第五圖B中的電泳列a，我們能分辨出對應第二組 之多核苷酸的放大產物。第二組之多核苷酸係以序列SEQ ID NO: 5 及 SEQ ID NO: 11 所定義。 5 由第五圖C中的電泳列a，我們能分辨出對應第三組 之多核苷酸的放大產物。第三組之多核苷酸係以序列SEQ ID NO: 13 及 SEQ ID NO: 17 所定義。 該多核苷酸SEQ ID NO: 15是在以序列SEQ ID NO: 3 與SEQ ID NO: 23所定義之多核普酸的區域中被發現。 10 以該等序列之鹼基對所表示的大小與在膠體中指出之 增殖產物所顯現的分子量之間，已被證實存在有良好的關 聯性，其中，該等序列為·· SEq ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: U、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ 15 ID NO·· 21、SEQ ID NO: 23 以及 SEQ ID NO: 25。 每個多核普酸的區帶(banci)係被萃取，且之後可用先前 所提及之習用技術增殖，因此本發明之各該多核苦酸皆予 以增殖生產。 20 ^在具有相似分子量且在電泳膠體上顯現混亂的的多核 例子中’可_電泳法在能夠使該等多核魏分離 2件下使其分開，例如：增加雜長度且/或延長電泳的 二、日可間’或選殖於各種質體載體 ，此方法係為該技術領 域中具有通常知識者所熟知。 45 200806689 ^2· 桿菌菌株的分類 特性表格1示了分屬各料料清型之該糊試菌株的 表格一 Π '—— 電泳列⑴ ,M .— 菌株 器官 器官損害 ----------1 血清型 a Nagasaki 腦 — 敗血症 5 b *SW114(4) 鼻 無症狀 3 c F9(5) 鼻 無臨床症狀 UT (2) d *D74 (4) ND(3) ND(3) 9 e HP_3123 ⑹ 鼻 大腸桿菌腸炎 UT f HP_1205 ⑹ 心包膜 心包炎及肋膜炎 11 g HP-1302 (6) 腦 多發性漿膜炎 1 h HP-1319 (6) 腦 多發性漿膜炎 UT i HP-2163 (6) 關節 肺炎和關節炎 UT j HP-2269 (6) 關節 肺炎和關節炎 UT k HP-33 (6) 肺 肺炎 1 ⑴第五圖中顯示各菌株被之多核苷酸放大後的電泳列。 (2)UT :無法歸類的菌株。 ίο (3)ND :未說明。 (4)被標示*之囷株為無毒性參考菌株’該等菌株之無毒性已在 46 200806689 豬隻感染實驗中被測試。 (5)由巴塞隆那自治大學的獸醫系(veterinaiy facuky 〇f伽
Autonommis University of Barcelona)分離出之菌株。. ⑹由希普拉(HIPRA)實驗室分離出之菌株。Hp_3123菌株係 5 自無格拉瑟氏症病史的農場裡的豬隻所分離出。 電泳列b-e所對應之菌株，為取自沒有格拉瑟氏症症狀 或器官損傷特徵，且/或在沒有格拉瑟氏症病史之農場中的 豬隻鼻腔内之分離菌株，因此該等菌株可被認定為無毒性 菌株。 10 電泳列f_k所對應之菌株，為取自確定感染格拉瑟氏 症之豬隻體内的各器官的分離菌株，因此該等菌株為毒性 菌株。 毋性及無毋性la株之聚合酶鏈鎖反應的模板分析結果 顯示在第五圖。 15 可觀察到，從沒有任何格拉瑟氏症症狀或器官損傷特 徵的豬隻中所取得的菌株，SW114 (b)、F9 (c)、D74 (d)以 及HP3123 (e) ’並未顯示任何增殖產物在對應於本發明之 該多核苦酸的區域中。 相反地，所有取自確定感染格拉瑟氏症之豬隻器官中 20的菌株，具有至少一個增殖產物係對應於本發明之該多核 苷酸。在第五圖中可證實，該等毒性菌株Hpi2〇5 (f)、 HP1302 (g)、HP1319 (h)、HP2163 (i)、HP2269 ⑴和 HP33 (k)，具有數個增殖產物係對應於本發明之該多核苷酸。 因此，利用本發明之該多核苷酸能夠將該副豬嗜血桿 47 200806689 菌分類為毒性或無毒性，不管該微生物是具有如何的广原 變異性。 範例3·本發明之副豬嗜血桿菌多胜肽的製備 L製備載體 藉由將下列成份加入一 1.5 mL的無菌試管中，來切割 该質體pET-24a(+)(Novagen公司生產）·· pET-24a(+) (1 pg〜L) 5μ[ 牛血清蛋白10 X 5μL 10 X緩衝液 5 μL Nde I (20 υ/μ^ 1 μι Xho I (20 υ/μί) 2·5 pL 水 31·5 μι 藉由將下列成份加入一 1.5 mL的無菌試管中，來切割 該質體 pET_24d(+): pET-24d(+) (1 5 μι 牛血清蛋白10Χ 5 μι 10 X緩衝液 5 pL Xho I (20 υ/μί) 2·5 μί 48 200806689
Nco I (10 υ/μί) 1 μ!^ 水 31.5 μί 该反應於37 °C的水浴中進行2小時。然後依本說明中 之剷述的習用技術，將切割後的質體以瓊脂膠體純化。 藉此，產生具有兩不相容端之線性質體。 2·插入體(insert)的製備 取1 ng依據範例1所製備之本發明的該等多核苷酸， 並以該範例所述之實驗流程分別放大增殖之，並使用下列 之寡核苷酸： 1〇 pADH-F-BsHI ： 59 G ACT G ATC ATGA ΑΤΑ A A ΑΤΑΤΤΤ Α Π A ΠΤΤ ATTT GG3，(SEQIDNO: 31); pADH-F-Ndel ： 5 9GACTGACATATGAATAAAATATTTAGAGTTATT 15 TGG3，(SEQIDNO: 32); pADH-Rl-XhoI : 5TTACTCGAGCCACACAAAACCTACCCCTCCTC C3，(SEQIDNO: 33); pADH-R2-SalI :
2〇 5TAGTTAGTCGACCCACTGATAACCTACCCCCAC AGAG3，(SEQ ID NO: 34);以及 49 200806689 pADH-R3-XhoI ：
5TTACTCGAGCCACTGTAATGCAATACCTGCAC C35(SEQ ID NO: 35) 〇 在下面劃線標示者為限制酶可辨識的序列’而表示多 胜肽侧為粗齡。在該^丨子的5,部份所增加 之核普酸疋隨機的，但兮望夕α 良好作用性所必需的厂㈣_是該等限制酶具有 22個==過程進行作用，但僅進行 應表二===該多核苷酸内存在或缺乏 相容赢）之限制酶二、=容/^以及如（與 對、以及其選殖载體。增殖^夕核苷酸的引子 50 200806689 表格二 SEQ ID NO: Ndel Ncol Bspm Xhol Sail 引子 載體 1 - - - - pADH-F-Ndel/ pADH-Rl-XhoI pET-24a(+) Nde/Xho 3 - - - pADH-F-Ndel/ pADH-Rl-XhoI pET-24a(+) Nde/Xho 5 + - - - - pADH-F-BspHI/ pADH-R2-SalI pET-24d(+) Nco/Xho 7 - - - - pADH-F-Ndel/ pADH-Rl-XhoI pET-24a(+) Nde/Xho 9 - - - - pADH-F-Ndel/ pADH-Rl-XhoI pET-24a(+) Nde/Xho 11 + - + - pADH-F-BspHI/ pADH-R2-SalI pET-24d(+) Nco/Xho 13 - pADH-F-Ndel/ pADH-R3-XhoI pET-24a(+) Nde/Xho 15 - - - pADH-F-Ndel pADH-Rl-XhoI pET-24a(+) Nde/Xho 17 _ _ pADH-F-Ndel/ pADH-R3-XhoI pET-24a(+) Nde/Xho 19 _ - + pADH-F-Ndel/ pADH-Rl-XhoI pET-24a(+) Nde/Xho 21 - - - - pADH-F-Ndel/ pADH-Rl-XhoI pET-24a(+) Nde/Xho 23 - pADH-F-Ndel/ pADH-Rl-XhoI pET-24a(+) Nde/Xho 25 - - - - pADH-F-Ndel/ pADH-Rl-XhoI pET-24a(+) Nde/Xho 在增殖後，以MinElute反應清潔套組(Qiagen)所生產 51 200806689 示純化，惟在沖提階段是以 係依據該多胜肽所屬之組別 的產物，係依照該製造商的指 40 pL的沖提緩衝液進行。 該增殖產物末端的切割， 來進行。 5 由 SEQ ID NO: 1，3, 7, 9, 13, 15, 17, 19, 21，23 以及 25 而來之增殖產物，下列等物質係加入15乱岐菌試管中： 增殖產物 38 μί 10 X緩衝液 5 μι I (20 U/uL) 1 pL Nde I (20 υ/μί) 1 μί 牛血清蛋白10χ 5 μ!^ ,由SEQ ID N〇: 5以及11而來之增殖產物，下列物質 係加入1.5 mL的無菌試管中：
------ 增殖產物 38 μί 10 χ緩衝液 5 pL BspUl (1〇υ/μί) 2 μΐ^ Sal I (20\]/μΙ) 2pL 牛血清蛋白10X 5 kL 該反應於37 °C的水浴中進行2小時。依在Minmute 52 200806689 反應清潔套組(Qiagen)中所描述的程序，在瓊脂膠體中進行 該雙重切割增殖產物之純化。 3e pET-24a(+)與pET_24d(+)内之插入體的接合 以T4接合酶（快速接合套組，Quick Ligation Kit，New England Biolabs)依照製造商的指示，進行接合作用。該等 質體的濃度和50 ng/pL的插入體，預先以超純水調整。將 下列物質加入1·5 mL的無菌試管： 超純水 6.5 \ih 切割後之DNA (50 ng/μί) 1·5 μ!^ pET-24a(+)或 pET-24d(+) (50 ng/pL) 1 μί 2X緩衝液 10 μί T4接合_：(製造商未詳載酵素濃度） 1 μΐ^ 將其在22 °C到25 〇C之間培養15分鐘。 4·轉殖接合產物於大腸桿菌]v〇vablue内 轉殖该勝任大腸桿菌Novablue (Novagen)細菌，並不需 要純化該接合產物。該大腸桿菌之菌株並不允許重組蛋白 15質的表現，且在轉殖該適當菌株之前，該大腸桿菌菌株會 使擴張該重組質體。 胃 53 200806689 將一個1.5 mL的無菌試管在冰中預冷，之後加入2〇吣 的勝任細胞和1 μί的接合產物。在冰中培養5分鐘後，將 3亥忒官置入42。(：的水浴中3〇秒。接著再次在冰中培養2 分鐘。在此熱衝擊後，加入8〇 的s〇c培養基(s〇c 5 medium, Novagen)，且該轉殖之細菌在37。c的環境中培 養，並以250 rpm的轉速攪拌。 於存在有30 卡那黴素(kanamycin)的LB瓊脂培 養基(LB_agar plate)上，進行該重組細菌的篩選與選殖。 ίο 5·重組質體之特性描述 該等重組的選殖在96孔盤中生長，該孔盤之容量為2 mL/well，且該質體以下列任一套組純化： R.E.A丄 Prep 96 BioRobot (Qiagen)和具有一自動控制 衣置（BioRobot 3000，Qiagen)的 NucleoSpin 96 15 Flash(Macherey_Nagel)，或者 如果是以手動完成此過程，則使用NucleoSpin 96 Flash (Macherey-Nagel) 〇 每一製備中可產生500毫微克的超螺旋質體 (supercoiled plasmid)。 20 以 BigDye Terminator ν3·1 (Applied Biosystems)終止子 套組’在適合於製造商Applied Biosystems的溫度循環控制 儀(thermocyclers)和定序機(sequencers)之 96 孔盤(AppHe(j Biosystems或Axygen)中進行定序，以描述各插入體的特 徵0 54 200806689 使用質體之側邊選殖點的該等引子，具有下列之序列： T7 啟動子：5，TAATACGACTCACTATAGG3， T7 終止子：5，GCTAGTTATTGCTCAGCGG3， 5 6·轉殖重組質體於大腸桿菌BL21(ED3)内 大腸桿菌BL21(ED3)菌株(Novagen)是為了在T7的控 制下，能夠表現出大量的重組蛋白質所特別設計的一種菌 株0 該等重組質體pET-24a(+)以及pET24d(+)之轉殖，是藉 ίο由在冰中冷卻後，將20 pL的勝任細菌以及1 μΕ的接合產 物加入一個1.5 mL的試管來完成。 在冰中培養5分鐘後，將該試管置於42 °C的水浴中 30秒。接著，將其再次置入冰中培養2分鐘。經此熱衝擊 後’加入 80 μί 的 SOC 培養液(SOC medium，Novagen)，且 I1 2 3 4該轉化之細菌在37 °C的環境中培養，並以250 rpm的轉速 祝摔。 於存在有30 pg/pL卡那黴素(kanamycin)的LB瓊脂培 養基(LB-agar plate)上，進行該重組細菌的篩選與選殖。 55 1 〇 7·大腸桿菌BL21(ED3)内的副豬嗜血桿菌之重組多胜肽的 2 製造 3 為生產各重組多胜肽，將一菌落接種於5〇 mL的LB 培養液(LB medium)，其中該培養液中具有3〇μ^μΙ^的卡那 4 黴素(kanamycin)。該細菌在37 °C的條件下於震盪機中成 200806689 長’需伴隨換氣，直到在光波長600 nm下得到一個數值為 〇·6 的光密度(optical density)。 加入異丙基硫代半乳糖苷（IPTG)至最終濃度為j mM ’並在37下繼續培養3個小時。接著，該細菌^冰 5中冷卻5分鐘，並以5000 g的轉速在4。(：下離心5分鐘。 該細菌沈殿物以12·5 mL，20 mM且pH值為8的A的
Tris-HCl進行再懸浮，之後以相同的條件再離心。 該等重組多胜肽皆以包含小體的形式存在於細菌細胞 質内，且利用Novagen所建議之方法來將該等重組多胜肽收 1〇集，該方法係將蛋白質抽提試劑(BugBuster)和非特異性核酸 酶(Benzonase)，以及溶菌酶(rLysozyme)產物（pET系統指南， 網站 www.emdbiosciences.com/html/NVG/User-protocols/litiTil、 加入蛋白酶抑制劑（protease inhibitor，pefabloc，Roche Diagnostic羅氏診斷）來處理。 15 該方法是由細菌的微溶(mild solubilization)、醋胜肽類 (glycopeptide)跟DNA的切割，以及隨後欲自該包含小體中 去除不純物的一系列離心作用所組成。 藉由聚丙烯醯胺膠體電泳（polyacrylamide gel electrophoresis)(【Laemmli，自然期刊(Nature)，227:680,685, 2〇 (1970))】，可觀察到重組多胜肽的存在與相對量。 一般來說，各重組多胜肽顯現出佔有總轉殖大腸桿菌 BL21-(ED3)的30到50%的轉化多胜肽，且該等多胜肽有 90%是在包含小體中發現。 56 200806689 8β取自包含小體之重組多胜肽的純化 依據製造商(Novagen)所記載之方法，將帶有鎳電荷的 His-蛋白質純化樹脂套組(His Bind Resin Ni_charged kit)於 變性環境(denatured condition)下使用。 首先，將包含小體(inclusion corpuscle)溶於含有 素的缓衝液中。將此溶液導入一管柱，該管柱含有2 尿 5
mL 與鎳離子金屬(Ni2+ metal)辆合的樹脂 聚組胺酸(polyhistidine)與鎳金屬離子之間具有 親合力，因此該重組多胜肽會吸附於管柱。經過相卷、、、、的 洗後，該重組蛋白質以一含有6 Μ尿素(urea)*丨冲 (imidazole)之緩衝液沖提。 米°坐 之後依製造商的指示使用蛋白質活化套級 Refolding kit，Novagen)，藉由透析作用將該等蛋白 jein 原來的屬性。 是到 15 本發明之各該多胜肽的純度超過99%，因而讀等夕 狀適於被用來配製用以預防由副豬嗜血桿菌所引起之 的免疫原性組合物且/或疫苗。 ^染 57 200806689 【圖式簡單說明】 第一圖係為達成基因與蛋白質定序與註解之不同技術 階段的流程圖。 第二圖係顯示為副豬嗜血桿菌多胜肽編碼之多核苷酸 5的3’端部份的多重排列比對。 第三圖係顯示為副豬嗜血桿菌多胜肽之5，端部份的 多核普酸編碼之多重排列比對。 第四圖係顯示該副豬嗜血桿菌多胜肽之胺基酸的多重 排列比對。 10 第五圖係顯示本發明之數種副豬嗜血桿菌毒性及無毒 性菌株之多核苷酸增殖產物的洋菜膠體電泳圖；其中第五 圖A中顯示出對應於第一組多核苷酸的增殖產物；第五圖 B中顯示出對應於第二組多核苷酸的增殖產物；第五圖C 中顯示出對應於第三組多核苷酸的增殖產物。 15 第六圖顯示了對應於多胜肽HP2269-2+1之胺基酸序 列的比較結果；其中第六圖A中顯示HP2269-2+1與隸屬 於第一組的多胜肽SEQIDNO:16進行排列比對；第六圖B 中顯示HP2269-2-j-l與隸屬於第二組的多胜肽SEQ ID NO: 12進行排列比對。 58
Claims (1)
- 200806689 十"申請專利範圍： 1· 一種副豬嗜血桿菌多核苷酸，其特徵在於： 該副豬嗜企桿菌多核苦酸所表現之一多胜狀，與從 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ Π) NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14 ' SEQ 5 ID NO: 16、SEQ ID NO·· 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: * 22、SEQ ID NO: 24以及SEQ ID NO: 26構成之族群中所選 ， 出之一序列所定義出之一多胜肽，有至少60%的一致性。 2·如申請專利範圍第1項所述之多核普酸，其特徵在 於·該多核皆酸具有一在嚴格條件下可與該序列SEQ Π) ίο NO: 1雜交的序列。 3·如申請專利範圍第1項所述之多核苷酸，其特徵在 於·该多核苷酸具有一在嚴格條件下可與該序列Seq id NO: 3雜交的序列。 4·如申請專利範圍第1項所述之多核苷酸，其特徵在 I5於：該多核苷酸具有一在嚴格條件下可與該序列SEQ m NO: 5雜交的序列。 , 5·如申請專利範圍第1項所述之多核苷酸，其特徵在 於·該多核苷酸具有一在嚴格條件下可與該序列SEQ ι〇 NO: 7雜交的序列。 2〇 ^如申凊專利範圍第1項所述之多核苷酸，其特徵在 於口亥夕核苦g夂具有一在嚴格條件下可與該序列仍 NO: 9雜交的序列。 • 7·如申π專利範圍第1項所述之多核芽酸，其特徵在 於4夕核皆酉夂具有一在嚴格條件下可與該序列SEQ出 59 200806689 NO: ii雜交的序列。 • 8·如中請專利fen第1項所述之多核賊，其特徵在 於：該多核苦酸具有-在嚴格條件下可與該序列仍 NO: 13雜交的序列。 5 9.如申請專利範圍第i項所述之多核苷酸，其特徵在 於：該多核魏具有-在嚴格條件下可與該序列 出 NO: 15雜交的序列。 .ίο.如中請專利範圍第i項所述之多核苷酸，其特徵在 於.5亥多核普酸具有-在嚴格條件下可與該序列卿仍 1〇 NO·· 17雜交的序列。 如申請專利範圍帛i項所述之多核苦酸，其特徵在 於·遠多核皆酸具有一在嚴格條件下可與該序列seq出 NO: 19雜交的序列。 .u.如申請專利範圍«1項所述之多核普酸，其特徵在 15於·该多核皆酸具有一在嚴格條件下可與該序列聊仍 NO: 21雜交的序列。 • ▲士中μ專利範圍第1項所述之多核普酸，其特徵在 於·違多核普酸具有一在嚴格條件下可與該序列 SEQ ID NO: 23雜交的序列。 20 M•如申凊專利範圍第1項所述之多核苷酸，其特徵在 於· 口亥夕核苦酸具有一在嚴格條件下可與該序列 SEQ ID NO: 25雜交的序列。 15·如申清專利範圍第1項所述之多核苷酸，其特徵在 於：該多核倾財該相SEQIDNOH。 200806689 如申請專利範圍第1項所述之多核苷酸，其特徵在 ;β "亥多核苦酸具有該序列SEQIDNO: 3。 、·上·如申請專利範圍第1項所述之多核苷酸，其特徵在 5於。邊多核苷酸具有該序列SEQIDNO: 5。 、 如申叫專利範圍第1項所述之多核皆酸，其特徵在 於：該多核苦酸具有該序列 SEQ ID NO: 7。 、.^·如申請專利範圍第1項所述之多核苷酸，其特徵在 於·"亥多核苷酸具有該序列SEQ ID NO: 9。 1 〇·如申凊專利範圍第1項所述之多核苦酸，其特徵在 於·该多核苷酸具有該序列SEQ ID NO: 11。 21·如申請專利範圍第1項所述之多核苷酸，其特徵在 於·该多核苷酸具有該序列SEQ ID NO: 13。 22·如申請專利範圍第1項所述之多核苷酸，其特徵在 於·该多核苷酸具有該序列SEQ ID NO: 15。 5 23·如申請專利範圍第1項所述之多核苷酸，其特徵在 於·该多核苷酸具有該序列SEQ ID NO: 17。 24·如申請專利範圍第1項所述之多核苷酸，其特徵在 於·該多核苷酸具有該序列SEQ ID NO: 19。 25·如申請專利範圍第1項所述之多核苷酸，其特徵在 2〇於·該多核苷酸具有該序列SEQ ID NO: 21。 26·如申請專利範圍第1項所述之多核苷酸，其特徵在 於：該多核苷酸具有該序列SEQ ID NO: 23。 27·如申請專利範圍第1項所述之多核苷酸，其特徵在 於：該多核苷酸具有該序列SEQ ID NO·· 25。 61 200806689 28· —種副豬嗜血桿菌多胜肽，其特徵在於： 該副豬嗜血桿菌多胜肽，與從SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 5 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24 以及 SEQ ID NO: 26構成之族群中所選出之一序列所定義出之 一多胜肽，有至少60%的一致性。 29·如申請專利範圍第28項所述之多胜肽，其特徵在 於：該多胜肽具有該序列SEQIDNO: 2。 ίο 3〇·如申請專利範圍第28項所述之多胜肽，其特徵在 於：該多胜肽具有該序列SEQ ID NO: 4。 31·如申請專利範圍第28項所述之多胜肽，其特徵在 於··該多胜肽具有該序列SEQ ID NO: 6。 32·如申請專利範圍第28項所述之多胜肽，其特徵在 15 於··該多胜肽具有該序列SEQ ID NO: 8。 33·如申請專利範圍第28項所述之多胜肽，其特徵在 於：該多胜肽具有該序列SEQ ID NO·· 10。 34·如申請專利範圍第28項所述之多胜肽，其特徵在 於··該多胜肽具有該序列SEQ ID NO: 12。 20 35·如申請專利範圍第28項所述之多胜肽，其特徵在 於：該多胜肽具有該序列SEQ ID NO: 14。 36·如申請專利範圍第28項所述之多胜肽，其特徵在 於：該多胜肽具有該序列SEQIDNO: 16。 37·如申請專利範圍第28項所述之多胜肽，其特徵在 62 200806689 5 15 20 於：該多胜肽具有該序列SEQ ID NO: 18。 38·如申請專利範圍第28項所述之多胜肽，其特徵在 於：該多胜肽具有該序列SEQ ID NO: 20。 39·如申請專利範圍第28項所述之多胜肽 於：該多胜肽具有該序列SEQ ID NO: 22。 40·如申請專利範圍第28項所述之多胜肽，其特徵在 於：該多胜肽具有該序列SEQ ID NO: 24。 41·如申請專利範圍第28項所述之多胜肽 於：該多胜肽具有該序列SEQ ID NO: 26。 42· —種表現載體，其特徵在於： 该载體包含有如申請專利範圍第i至27項其中任一 項所述之多核苷酸。 =3.如申請專利範圍第42所述之載體，其特徵在於： 該載體包含有如申請專利範圍第2至14項其 三 所述之多核苷酸。 W、 貝 44二申請專利範圍第42項所述之載體，其特徵在於： h载體包合有如申請專利範圍第15至27 項所述之多核苷酸。 馭、中任- 種宿主細胞’係被—表現載體所轉殖， 體匕3有如申請專利範圍第i至之 ^载 核苷酸。 、/、甲任一項所述之多 46.如申請專利範圍第45項所述之宿主細胞， 其特徵在 其特徵在 在於 其特徵 该表現載體包含有如申請專利範圍第2幻4項其中任 63 200806689 一項所述之多核苷酸。 47·如申明專利範圍帛45項所述之宿主細胞，其特徵 在於： 該表現載體包含有如φ請專利範圍第15至27項其中 5任一項所述之多核苷酸。 、 48· —種製備如申請專利範圍第28至41項其中任一項 所述之多胜肽的程序，其特徵在於包含有下列階段： —a)培養一宿主細胞，該宿主細胞是以如申請專利範圍 第42項所述之表現載體所轉殖；以及 10 匕）表現該多核芽酸以製造該多胜肽。 49.如申請專利範圍第48項所述之程序，其特徵在於： 階段a)之該宿主細胞是以申請專利範圍第43項所述之 表現載體所轉殖。 50·如申請專利範圍第48項所述之程序，其特徵在於： 15 階段a)之該宿主細胞是以申請專利範圍第44項所述之 表現載體所轉殖。 51· —種如申請專利範圍第28至41項其中任一項所述 之多胜肽的用途，其係用以製備疫苗且/或免疫原性組合 物，該疫苗且/或該免疫原性組合物係用於預防或治療動物 20體内由副豬嗜血桿菌所造成的感染。 52· —種預防副豬嗜血桿菌之疫苗，其特徵在於： 該疫苗包含有一免疫學有效劑量的、如申請專利範圍 第28至41項其中任一項所述的多胜肽，以及一助劑。 53·如申請專利範圍第52項所述之疫苗，其特徵在於： 64 200806689 該疫苗包含有一免疫學有效劑量的、如申請專利範圍 第29至41項其中任一項所述的多胜肽。 54. —種利用如申請範圍第1至27項其中任一項所述 之多核苷酸來鑑定一副豬嗜血桿菌菌株是否有無毒性之用 5 途。 55· —種用以鑑定一副豬嗜血桿菌菌株是否有無毒性 之套組，其特徵在於該套組包含有： a)如申請範圍第15至27項其中任一項所述之多核苷 酸的增殖產物； 10 b)寡核苷酸 pADH_F (SEQ ID NO: 27); c) 寡核苷酸pADH-Rl (SEQ ID NO: 28)、寡核苷酸 pADH-R2 (SEQ ID NO 29)，以及寡核苷酸 pADH-R3 (SEQ ID NO: 30);以及 d) 使用聚合酶鏈鎖反應技術進行增殖作用所必需之 15 試劑。 65
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