TW200427463A - Compositions and methods for the detection and treatment of methylthioadenosine phosphorylase deficient cancers - Google Patents

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200427463 玖、發明說明： 【相關申請案的前後參照】 本申w案主張美國專利申請案第6〇/46〇,7丨5號（2〇〇4年4 月4曰申請）和60/447,888號（2〇〇3年2月14曰申請）的益處，兩 者包括圖示，全部以引用的方式併入本文中。 【發明所屬之技術領域】 本务明包括對抗人類甲硫基腺苷磷酸化酶（MTAp)蛋白 貝之結合劑，以及使用其來判定在包埋試樣中MIA?蛋白質 的存在或缺乏，與刪除編碼MTAp蛋白質之基因有關之癌症 的預後，以及治療這類癌症的方法。 【先前技術】 下列的討論描述某些技藝，不承認其中任何一個是在本 文中描述之發明的先前技藝。 甲&基腺菩鱗酸化酶（MTAp)是在所有正常組織中發現 的酵素，其催化甲硫基腺苷（MTA)轉變為腺嘌呤和5_曱硫基 t糖1 -碟酸。之後’回收利用腺嘌呤以產製腺苷單磷酸， 並將5 ·甲硫基核糖—丨_磷酸轉變為曱硫胺酸和甲酸鹽。因為 。亥回收利用的路徑，如重新嘌呤合成被阻斷，mTA可擔任 另種嘌呤來源，例如利用抗代謝產物，如亞硝基羥基 丙胺酸。 夺多人類和老鼠的惡性細胞缺乏MTAP活性。不只是在組 織培養細胞中發現MTAP缺陷，亦在原發性白血病、神經膠 、瘤黑色素瘤、胰臟癌、非-小細胞肺癌（NSLC)、膀胱癌、 生狀細胞瘤、骨肉瘤、頭和頸的癌症、黏液軟骨肉瘤、卵 91202.doc 200427463 巢癌、子宮内膜癌、乳癌、軟組織肉瘤、非-霍奇金氏淋巴 瘤和間皮瘤中出現缺陷（Kamatani 等人（1981)Proc.Natl· Acad. Sci USA 78:1219-1223 ； Toohey(1977) Biochem. Biophys. Res. Commun· 78:1273-1280 ; Fitchen等人（1986) Cancer Res. 46:5409-5412 ; Nobori 等人（1991) Cancer Res. 51:3193-3197 ; Nobori 等人（1993) Cancer Res. 53:1098-1 101 ; Christopher 等人（2002) Cancer Res. 62:6639-6644 ;以及 Garcia-Castellano 等人（2002) Clin. Cancer. Res. 8:782-787)。同種接合子的刪除，通常是編碼MTAP之基因失活的 機制（Christopher 等人（2002) Cancer Res· 62: 6639-6644)。 然而，已經報告了其他MTAP缺陷的機制（Harasawa等人 (2002) Leukemia 16: 1799-1807)。 編碼人類MTAP之基因，作圖譜在人類染色體9p的9p21 區。該區亦含有腫瘤抑制基因P16INK4A(亦稱為CDKN2A)和 P1 5 。此寻基因分別編碼ρ 1 6和ρ 1 5，其為環素D -依賴性

激酶 cdk4和 cdk6的抑制劑（Efferth等人（2002) Blood，Cells， Molec·，and Dis. 28: 47-56 ; Kamp 等人（1994) Science 264: 436-440; Hannon等人（1994)，Nature 371: 257-261)。pi 6INK4A 轉錄本可另行接合到編碼pl4ARF的轉錄本内。…斗八^與 MDM2結合，並預防p53的降解（Pomerantz等人（1998) Cell 92: 713-723) 〇 9P21染色體區是令人感興趣的，因為它在各種癌症中經 常以同種接合子之方式刪除，包括白血病、NSLC、胰臟癌、 神經膠質瘤、黑色素瘤和間皮瘤。該刪除通常使一個以上 200427463 的基因失活。例如，Cairns等人（（1 995) Nat ⑴ 210-212)，報告在研究5〇〇個原發性腫瘤之後，幾乎所有在 這類腫瘤中確認的刪除，均涉及含有MTAp、pi4ARF和 6 的170 kb區。Carson等人（w〇99/67634)報告了在腫 瘤發月階段和喪失編碼MTAP之基因與編碼p丨6之基因的同 種接合性之間存有關聯。例如報告了 MTAp基因，但沒有 P16INK4A的刪除，表示癌症在發育的早期，然而，報告編碼 ρ16和MTAP之基因的刪除，代表癌症在較前進的腫瘤發育 階段。Garda-Castellano等人報告在一些骨肉瘤患者中，在 診斷時存有MTAP基因，但在較晚的時間點被刪除（Garcia_ Castellano等人，在前）。 pl6的參考蛋白質序列和另一種轉錄本，包括？14，以下 列的登錄編號 NP—000068 ; NP—478 1 02· 1 ; NP 478 1 03 1 和 NP—478104.1，存放在GenBank中。pi 6的參考mRNA序列和 另一種轉錄本，包括P14，以登錄編號NM—〇〇〇〇77 2 ; NM—058 195.1 ; NM一058196.1 和 NM一058197.1，存放在

GenBank中。pH的參考蛋白質序列，以GenBank登錄編號 NP—004927.2 和 NP—5 1 1042.1，存放在 GenBank 中。P15 的參 考 mRNA序列，以登錄編號 NM—004936.2 和 NM—078487.1， 存放在GenBank中。 已經描述了在腫瘤細胞中判定MTAP狀態的方法。述說美 國專利第5,942,393號揭示了經由使用寡核苷酸探針，檢測 MTAP編碼核酸的方法。Norbori 等人（（1 99 1) Cancer Res. 5 1 · 3193_3197 ;和（1993) Cancer Res. 53: 1098-1 101)報告了對 91202.doc 200427463 牛MTAP使用多株抗體，在免疫墨點分析中檢測分離自腫瘤 細胞株或原始腫瘤試樣的MTAP蛋白質。Garcia-Castellano 等人（2002，在前）報告了使用抗人類MTAP雞抗體，篩選包 埋在OCT冷凍塊中的骨肉瘤腫瘤試樣。 因為許多腫瘤細胞是MTAP缺陷的，並因此為了生長及/ 或存活依賴重新的嘌呤合成，MTAP回收利用的路徑可提供 每·擇1兒過正常組織之腫瘤療法的機會。到最後，以利用干 擾嘌呤利用之化學治療攝生法來治療MTAP缺陷癌症為基 礎之療法的發展，目前正開始。因此，對於確認MTAp缺陷 腫瘤的組合物及方法存有需求。 特定而言，對於在生物試樣中確認MTAP缺陷腫瘤（腫瘤 細胞不產生或產生低量的MTAP蛋白質）的組合物及方法存 有需求， 特別是經常在醫學環境中使用的那些生物試樣，

礎之程序，如南方墨點法，可以其自 低以正常細胞污染腫瘤細胞的機會。 結合人類甲硫基腺苷磷酸化酶（Mta〇蛋

在本文中描述MTAP 【發明内容】 根據一項觀點， •結合劑，其專一地 I白質，及其使用方

本發明係針對結合劑，其在包埋 TAP，包括包埋在蠟、硝基纖維 9l202.doc 200427463 素、聚乙二醇或塑料，但不是OCT化合物中的生物試樣。 較佳的是MTAP-結合劑，其在包埋在石蠟中之生物試樣中 結合人類MTAP蛋白質。更佳的是MTAP-結合劑，其在包埋 在石蠟中已經固定之生物試樣中結合人類MTAP。較佳的固 定劑是福馬林。較佳的MTAP-結合劑是專一地結合人類 MTAP的抗體，包括多株和單株抗體。特佳的是抗-MTAP單 株抗體。抗體最好是以超過1〇5 ΜΓ1之親和力與人類MTAP 蛋白質結合，更佳的是以超過107M_1之親和力。 在另一個具體實施例中，本發明係針對由融合瘤細胞株 ATCC PTA-5 001產生的抗-MTAP單株抗體，及其用途。在 另一項觀點中，本發明係針對結合與由融合瘤細胞株ATCC PTA-5 001產生之單株抗體相同的抗原決定位的單株抗體。 在另一項觀點中，本發明係針對融合瘤細胞株，其產生抗 -MTAP單株抗體。 在另一個具體實施例中，本發明係針對製造經過分離之 融合瘤的方法，該融合瘤產生可用來評估包埋之生物試樣 是否包括含有人類MTAP蛋白質之細胞的抗體。該方法包括 下列的步驟：（1)使用包括人類MTAP多肽之組合物免疫哺 乳動物；（2)從免疫過的哺乳動物中分離脾臟細胞，並將已 經分離的脾臟細胞與永存不死的細胞融合，形成融合瘤； 並（3)對於那些產生與在包埋之生物試樣中的人類MTAP蛋 白質專一地結合的抗體，篩選融合瘤。 在另一個具體實施例中，本發明係針對在包埋之生物試 樣中，檢測人類MTAP蛋白質之存在或缺乏的方法，包括包 91202.doc -10- 200427463 埋在呶、硝基纖維素、PEG或塑料中的試樣。一種揭示方 V及下列步驟：（1)使包埋之生物試樣與MTAP-結合叫接 * ^人X員mtap蛋白質出現在該試樣中，便與其形成纟士人 複合物；並（2)使用在本文中描述的方法，檢測所形成之結 合複合物的含量。檢測到很少至無結合複合物，表示在哼 ^物試樣中有很少或沒有人類MTAp蛋白f。賴樣最好被 包埋在石蠟中。更佳的是，固定該試樣。固定劑最好是福 :林松測結合複合物的方法包括以可檢測標記標示該結 =劑。在其他的觀點中，可藉著使用以可檢測方式標示的 第二個製劑，其與結合劑結合，來檢測在結合複合：中所 含有的結合劑。在另一項觀點中，可藉著使用未標示的第 個衣d 4與結合劑結合，來檢測在結合複合物中所含 有的結合劑。然後可使用以可檢測方式標示的第三個製 劑，其與第二個製劑結合，來檢測第二個製劑。 在本文中揭示之在福馬林固定、Μ包埋的生物試樣中 檢測人類ΜΤΑΡ蛋白f之存在或缺乏的其他方法，包括下列 步驟：⑴加熱試樣至融化石虫鼠；⑺將試樣脫石壞；⑺在試 樣中誘導抗原決定位恢復，⑷將試樣與ΜτΑρ_結合劑一起 培養，其專-地與人類ΜΤΑρ蛋白質結合，形成二 物；並_所形成的結合複合物。檢測到很少：二： =合物’表示在該生物試樣中有很少或沒有人類Μ·蛋白 貝。誘導抗原決定位恢復的較佳方法是經由使用加熱。其 他使抗原決定位恢復的較佳方法是加熱，接著以蛋白水解 酵素處理。較佳的蛋自水解料是胰蛋白酶。 9l202.doc -11 - 200427463 在另一個具體實施例中，本 ^ ^ 丁、針對在試樣中檢測人 :=Γ 或缺之的方法，包括下列步驟··⑴使 2與專—地結合人類心？蛋白質之單株抗體接觸，形成 結合複合物，·並（2)判定在試樣中处人 Τ、σ σ设合物的存在或缺 乏，結合複合物的出現代表人類Μ 不八頌MlΑΡ蛋白質存在於在試樣 中。較佳的單株抗體是由融合瘤細胞株八取pi侧產 生的單株抗體。較佳的免疫測 Α測定。 収方法疋西方墨點法或 在另一個具體實施例中， 上的抗-人類ΜΤΑΡ單株抗體 本發明係針對固定在固體表面 在更進-步的具體實施例中，本發明係針對μταρ_結合 劑’其係專—地結合出現在包埋之生物試樣中的人類題ρ 蛋白質，並產生以染色強度為基礎的統計分數，其容許確 認包埋的試樣包含以同種接合子之方式刪除編碼人類 ΜΤΑΡ蛋白質之基因的細胞。包埋的試樣最好是包埋在壞、 石肖基纖維素、削或Μ中。該方法較佳的Μ··結合劑包 括抗虹。δ亥方法更佳的ΜΤΑρ'结合劑是單株抗體。特佳的 是由融合瘤細胞株ATCCPTA-5001產生的單株抗體。 在本文中揭示之方法，可用在得自罹患癌症之患者的包 埋生物试樣。根據一項觀點，包埋的試樣是得自癌症，其 係選自非-霍奇金氏淋巴瘤、間皮瘤、原發性腦惡性（如神經 膠質母細胞瘤、神經膠質瘤和星狀細胞瘤）、非-小細胞肺 癌、白血病（如急性淋巴細胞性白血病、急性骨髓性白血 病f艾性淋巴細胞性白血病和慢性骨髓性白血病）、膀胱 9I202.doc -12- 200427463 癌：胰臟癌、軟組織肉瘤、骨肉瘤或頭和頸的癌症所組成 之群。最好是將試樣固定並包埋在石壤中。 在本文中描述之方法中使用的較佳mtap_結合劑是專— 地結合人類MTAP的抗體。較佳的是專—地結合人類mtap 的多株或單株抗體。較佳的是以超過1〇5νγ1之親和力，且 更佳的是以超過l〇7 之親和力與人_TAp蛋白質結合 二抗體。在本文中揭示之方法中使用的較佳抗-人類ΜΤ:Ρ 單株抗體是由融合瘤細胞株ATCC ΡΤΑ_5001產生的單株抗 體，或結合與由融合瘤細胞株ATCC ΡΤΑ_5001產生的單株 抗體相同之抗原決定位的單株抗體。 在另一個具體實施例中，本發明係針對為了以針對ΜΤΑΡ 夬疡症之/σ療攝生法治療ΜΤΑρ缺陷癌症，來選擇患者的 方法。較佳的方法包括下列步驟：（1)提供得自該患者之癌 症的包埋生物試樣；（2)使該試樣與ΜΤΑΡ-結合劑接觸，其 與出現在該試樣中之人類ΜΤΑΡ蛋白質專一地形成結合複 合物，並（3)按照在本文中的描述，檢測結合複合物的含量。 使用該方法，具有低或不可檢測之結合複合物的癌症，表 示。亥癌症了接受針對μταΡ-缺陷癌症的治療。較佳的治療 攝生法包括抑制重新嘌呤合成的藥物。較佳的重新嘌呤合 成抑制；=1彳包括L -亞石肖基經基丙胺酸、1 〇 _块丙基_ 1 〇 _脫氮雜 (deaza)胺基蝶呤（PDX)、Ν-(4-(((2,4-二胺基-6-喋啶基）甲基） 甲胺基）苯曱醯基）-L-穀胺酸）（胺甲碟呤）、AG2037 (Agour〇n/pflzer)、4_胺基喋醯基穀胺酸（胺基蝶 呤）、2,‘二胺基甲基-6_[[(3,4,弘三甲氧苯基）胺基]甲基] 9i202.doc -13 - 200427463 4 唑啉（三甲曲沙（tnmetrexate))、派瑞曲辛（pyritrexim)、10_ 乙基-脫氮雜-胺基蝶吟（依達曲沙（ecjatrexate))、4，_亞甲基〇_ 脫氮雜胺基蝶呤（MDAM)、10-炔丙基_5,8_二脫氮雜葉酸 (PDDF)、N-〇[N-(3,4-二氫-2-甲基-4-氧基喹唑啉冬基甲 · 基）-Ν-曱胺基]-2-噻吩甲醯基_L-穀胺酸（雷替曲賽 (raltitrexed)，ZD1694，拓優得（丁omudex))、n-[4-[2-(2-胺 基-3,4-二氫-4-氧基-7H-吡咯并[2,3-d]-嘧啶-5-基）乙基]-苯 甲驢基]-L-穀胺酸（LY231514 ; Lilly)、6-(2，-甲醯基-2，-莕基- φ 乙基）-2-胺基-4(311)-氧基4哇淋（1^95 5 09)、（611，3)-5，10-二 脫氮雜四氫葉酸（DDATHF)、4-[2-(2-胺基-4-氧基-4,6,7,8-四氫-311-嘧啶并[5,456][1，4]-噻畊-6-基）-(3)-乙基]-2,5-嘍吩 甲醯基胺基-L-穀胺酸（AG2034)和Ν-[5-(2-[(2,6-二胺 基-4(3Η)-氧基嘧啶-5-基）硫基]乙基）嘧吩甲醯_2-基]穀 胺酸（AG2009)、6R2，，5卩塞吩基5，10-二脫氮雜四氫葉酸 (LY309887)、（S)-2-[4-[N-[(3,4-二氫-2,7-二曱基-4-氧基-6-喹唑啉基）甲基]丙-2-炔基胺基]-2-氟苯甲醯胺 ® 基]-4-(1Η_1，2,3,4-四唑-5-基）丁酸（ZD9331)、N-[4-[N-[(3,4-二氫-2,7-二甲基-4-氧基-6-喹唑啉基）曱基]-N-丙-2-炔基胺 基]-2-氟苯曱醯胺基]-L-穀胺酸（ZM214888) 、 v ^(〇〇-[4-[5-(2,4-二胺基泰雷淀-6-基（丨€!*丨(1丨]1-6-；71))戊-1-炔-4-基]笨曱醯基]-Ν(δ)-半鄰苯二甲醯基-L-鳥胺酸或N(o〇-(4-胺 基-4-脫氧喋醯基）-Ν(δ)-半鄰苯二曱醯基-L-鳥胺酸 (ΡΤ5 23)。適合根據這些方法篩選的患者，包括罹患非-霍奇 金氏淋巴瘤、間皮瘤、原發性腦惡性，如神經膠質母細胞 91202.doc -14- 200427463 瘤、神經膠質瘤和星狀細胞瘤、非-小細胞肺癌、白血病， 如ALL、AML、CLL和CML、膀胱癌、胰臟癌、軟組織肉 瘤、骨肉瘤或頭和頸之癌症的患者。 在另一個具體實施例中，本發明係針對判定包埋之生物 試樣是否含有人類MTAP蛋白質的套組。較佳的套組包括 MTAP-結合劑，其專一地與人類MTAP蛋白質結合，形成結 合複合物，以及能夠發送形成該結合複合物之信號的指示 劑。在該套組中所包含的較佳MTAP-結合劑是抗體，最好 是專一地與人類MTAP起反應的多株或單株抗體。更佳的 MTAP-結合劑是由融合瘤細胞株ATCC PTA-5001產生的抗 -MTAP單株抗體，或認出與由融合瘤細胞株ATCC PTA-5001 產生的抗-MTAP單株抗體相同之抗原決定位的單株抗體。 在本文中亦揭示在生物試樣中判定MTAP基因複合物之 同種接合子刪除的方法，包括下列步驟：（1)使該試樣與專 一地結合人類MTAP蛋白質的結合劑接觸，形成結合複合 物；並（2)按照在本文中的描述，判定在試樣中之結合複合 物的含量。檢測到很少至無的結合複合物，代表MTAP基因 複合物的同種接合子刪除。 在另一個具體實施例中，本發明係針對以在治療上有效 之劑量的針對MTAP缺陷癌症的治療攝生法，治療癌症患者 的方法，包括下列步驟：（1)提供得自該患者之包埋的生物 試樣；（2)使該包埋的生物試樣與結合劑接觸，其與在該包 埋試樣中之人類MTAP蛋白質形成結合複合物；（3)檢測在 該試樣中之結合複合物的含量，對人類MTAP蛋白質具有低 91202.doc -15 - 200427463 或不可檢測之結合複合物的癌症，代表可接受治療的ΜτΑρ 缺陷癌症；並（4)投與在治療上有效之含量的針對ΜτΑρ缺 陷癌症的治療攝生法。較佳的治療攝生法包括抑制重新嘌 呤合成的藥物。較佳的重新嘌呤合成抑制劑包括L_亞硝基 羥基丙胺酸、10-炔丙基1…脫氮雜胺基蝶呤（pDx)、 ^(4(((2,4-一胺基-6-喋啶基）甲基）甲胺基）苯甲醯基）_1^穀 胺酸）（胺甲碟呤）、AG2037(Ag〇ur〇n/pfizer)、仁胺基喋醯基 榖胺酸（胺基蝶呤）、2,4-二胺基_5_甲基-卜[[(3,4,5-三甲氧苯 基）胺基]甲基]哇唑啉（三甲曲沙）、派瑞曲辛、1〇_乙基-脫氮 雜-胺基蝶呤（依達曲沙）、4，_亞甲基_丨…脫氮雜胺基蝶呤 (MDAM)、10-炔丙基-5,8-二脫氮雜葉酸（pDDF)、 N-[5-[N-(3,4-二氫-2-曱基_4_氧基喹唑啉-6-基甲基）-N-曱胺 基]-2-嘧吩甲醯基縠胺酸（雷替曲賽；zD1694，拓優 付）、N-[4-[2-(2-胺基、4_ 二氫—4_ 氧基-7H-吡咯并[2,3_d]_ 噹°疋-5-基）乙基]-笨甲醯基]_L_穀胺酸（LY2315i4 ; LiUy)、 6-(2 -曱基-2’-莕基-乙基胺基-4(3h>氧基喹唑啉 (1^95 5 09)、（611，8)-551〇-二脫氮雜四氫葉酸（1)1)八7财卜 4-[2-(2-胺基-4-氧基-4,6,7,8_ 四氫-3H_嘧啶并[5,4,6][1，仆 ^塞喷-6-基）-(S)-乙基>2,弘噻吩曱醯基胺基_L_穀胺酸 (AG2034)和 N-[5-(2-[(2,6-二胺基 _4(3H)-氧基嘧啶-5-基）硫 基]乙基）4吩曱酿-2·基]_L-穀胺酸（Ag2〇〇9)、6R2，，5,噻吩基 5，10-一脫氮雜四氫葉酸（1^3〇9887)、〇2_[4_[仏[(3,4_二氫 -2,7- 一曱基氧基·6、喳唑啉基）甲基]丙炔基胺 基]-2- I苯甲酿胺基]斗（ιη·ι，2,3,4_四唑基）丁酸 9l202.doc -16- 200427463 (ZD933 1)、N-[4-[N-[(3,4-二氫-2,7·二甲基-4-氧基-6-4 唑啉 基）曱基]-Ν-丙-2-炔基胺基]_2-氟苯曱醯胺基]穀胺酸 (ZM2148 8 8)、叫〇〇-[4-[5-(2,4-二胺基泰雷啶_6_基）戊_1-炔 -4-基]苯曱醯基]-Ν(δ)-半鄰笨二曱醯基-L_鳥胺酸或 N(〇〇-(4-胺基-4-脫氧喋醯基）#〇>半鄰苯二甲醯基丄_鳥胺 酸（PT523)。可供治療的較佳癌症，包括罹患非_霍奇金氏淋 巴瘤、間皮瘤、神經膠質母細胞瘤、神經膠質瘤、星狀細 胞瘤、非-小細胞肺癌、白血病、膀胱癌、胰臟癌、軟組織 肉瘤、星狀細胞瘤、骨肉瘤、頭和頸的癌症，或黏液軟骨 肉瘤。 【實施方式】 當在本文中以及在附錄之申請專利範圍中使用時，除非 前後文明確地另行指定，單數形式，，一個，，、，，一個，，和，，這個，， 包括複數關係。因此，例如，提到，，宿主細胞，，時包括這類 但主細胞的複數，提到”抗體，，則意指一或多個抗體，及其 热諳此藝者已知的相等物等等。 工·定義 MTAP-結合組合物”或”MTAp_結合劑，，一詞意指與人類 MTAP蛋白貝或其片段以專一性結合的分子。該分子可以是 κ 口物化學5式劑、如同在本文中定義的抗體，以及其他 Μ T A P -結合蛋白質。 ★ 2在本文中使用，，結合劑：MTAP蛋白質複合物”和”結合 複口-物δ司恰，意指MTAp-結合劑與人類MTAP蛋白質的 複σ物。結合劑之專一結合作用，意指該結合劑具有專一 91202.doc -17- 200427463 的結合位置，其認得在人類MTAP蛋白質上的位置。例如， 對人類ΜΤΑΡ蛋白質升高，並認得在人類ΜΤΑΡ蛋白質上之 抗原決定位的抗體，能夠藉著專一結合作用而形成結合 劑：ΜΤΑΡ蛋白質複合物。通常，結合劑：ΜΤΑΡ蛋白質複 合物的形成，容許在其他蛋白質和生物製劑的混合物中檢 測ΜΤΑΡ蛋白質。 ’’抗體·· ΜΤΑΡ蛋白質複合物”一詞，意指ΜΤΑΡ-結合劑： ΜΤΑΡ蛋白質複合物，其中該ΜΤΑΡ-結合劑為抗體。該抗體 可以是單株、多株的，或甚至是抗體的抗原結合片段。 當在本文中使用”抗原性決定位”或”抗原決定位”一詞 時，意指抗原中與抗體結合的特定部分。 當在本文中使用”免疫原性之抗原決定位”時，將其定義 為蛋白質中，在動物中誘發抗體反應的部分，其可藉著此 項技藝中已知的任何方法來判定，例如藉著產生抗體的方 法（參見，例如Geysen 等人（1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002) ° 當在本文中使用"專一結合作用”或”專一地結合”一詞 時，意指ΜΤΑΡ-結合劑，如抗體、蛋白質或肽的交互作用， 表示該交互作用依賴在蛋白質上出現特殊的結構（即抗原 性決定位或抗原決定位）；換句話說，與其說抗體認出並結 合蛋白質，毋寧說是特定的蛋白質結構。例如，若抗體對 抗原決定位ΠΑ”是專一的，則可藉著使用已標示和未標示之 抗原決定位Α的競爭性測定來證實專一性。未標示之抗原決 定位A將降低已標示之抗原決定位A與抗體結合的量。對特 91202.doc -18 - 200427463 殊人類ΜΊΓΑΡ抗原決定位專一的抗體，可認出高度類似 ΜΤΑΡ蛋白質的蛋白質。 片語”專一地結合抗體"或”專一地與之產生免疫反應，，，當 言及蛋白質或肽時，意指結合反應，其在蛋白質之不均一 知群及其他生物學組份的存在下，確定蛋白質的存在。因 此’在經過設計的免疫測定條件下，專一結合劑，例如抗 體，與特殊的蛋白質結合，而不明顯地結合出現在試樣中 的其他蛋白質。在這類條件下與抗體的專一結合作用，可 月匕而要針對其對特殊蛋白質之專一性而被選出的抗體。例 如，可選擇對人類ΜΤΑΡ蛋白質免疫原升高，具有在序列第 1唬中敘述之胺基酸序列的抗體，獲得與ΜΤΑρ蛋白質專一 地產生免疫反應，而不與其他蛋白質產生免疫反應的抗 體。這些抗體可認出與人類ΜΤΑΡ蛋白質高度類似的蛋白 質。 當在本文中使用”抗體"一詞時，意指完整的分子及其片 士 Fab F(ab )2和Fv，其能夠結合抗原性決定位。因此， 了解在本說明書中使用，，抗體,。詞時，包括整個抗體和抗 體有用的片&。可使用完整多肽或含有感興趣之小肤的片 段做為免疫的抗原，來製備結合人類财㈣白質的抗體。 用來免疫動物的多肽或肽，可衍生自RNA的轉譯作用，或 以化干方式合成’若需要還可與載劑蛋白質共耗。以化學 式”肽偶％的、用載劑，包括牛血清白蛋白和甲狀腺球 蛋白。然後使用已經偶聯的肽來免疫動物（例如老鼠、大鼠 或兔子）。 91202.doc -19- 200427463 所當j本文中使用”人類MTAP蛋白質”一詞時，當用在蛋白 貝之刖後文中時，意指具有如同在序列第i號中所示之胺基 I序歹】的蛋白質，或可用在本發明觀點中的這類蛋白質之 片段，日例如用來升高對人類MTAP蛋白質專一的抗體，用來 仗為陽丨生對如、組，以便證貫MTAp_結合劑與人類蛋白 質的結合，以及其他用途。因此，了解在本說明書中使用 ff人類ΜΤΑΡ蛋白質”或”ΜΤΑΡ蛋白質”一詞時，包括全長的 ΜΤΑΡ蛋白貝，包括二聚體和二聚體的形式，以及人類μταρ 蛋白質的有用片段。人類ΜΤΑΡ蛋白質亦可以是衍生的。人 類ΜΤΑΡ蛋白質可與ΜΤΑΡ_結合劑（如同在本文中定義的）產 生交互作用。這些ΜΤΑΡ-結合劑，例如抗體，通常以高親 和力與ΜΤΑΡ蛋白質結合，例如至少大約1〇〇111^，通常比大 約3 0 ηΜ更佳，較佳的是比大約1 〇 ηΜ更佳，且更佳的是比 大約3 ηΜ更佳。 當在本文中使用π多肽’’ 一詞時，包括人類ΜΤΑΡ蛋白質的 片段或斷片，並包括一股至少大約8個胺基酸的胺基酸殘 基’通常是至少10個胺基酸，更常見的是至少12個胺基酸， 經常是至少14個胺基酸，更經常的是至少16個胺基酸，代 表性的是至少1 8個胺基酸，更具代表性的是至少2〇個胺基 酸，通常是至少22個胺基酸，更常見的是至少24個胺基酸， 較佳的是至少26個胺基酸，更佳的是至少28個胺基酸，且 在特佳的具體實施例中，至少大約3 0個或更多的胺基酸。 人類ΜΤΑΡ之多肽可包括在序列第1號中陳述的所有胺基 酸。 91202.doc -20- 200427463 當在本文中使用”單株抗 仇一詞時，意指獲自實質上均 之抗體族群的技辦，# p知君f所包含的個別抗體是相同 的，除了可能以最低令景ψ 取低3里出現的可能天然存在之突變。單 株抗體是專一的，係針對單_ j平 的抗原位置。此外，與包括 當在本文中使用’'生物試樣，，一詞時，是以其最廣泛的音 義。懷疑含有人類MTAP^f s戈編碼人類MTAI^白質之 基因的生物試樣’可包括一或多個細胞，得自細胞、血液、 組織的萃取物，及其類似物。 對杬不同決定位(抗原決定位)之不同抗體的多株抗體製備 物顯然有別’單株抗體分別針對在抗原上的單一決定位。 當在本文中使用"固定，，一詞時，意指處理生物試樣，其 結果保存了組織學的細部。這類處理可使在樣本中的蛋白 貝％疋，防止試樣因為諸如發黴、細菌及/或中止連續的酵 素代謝過程（自溶）之類的事件而改變。固定亦可使細胞内的 可溶性物質變成不可溶的物質，並保護樣本免於脫水劑及 後續處理步驟的變性影響。 πμταρ基因複合物”一詞是pl4—pl6_MTAp基因斷片。該區 包括在染色體9p2 1 - 22上大約200 kb之區域。 當在本文中使用”免疫測定，，一詞時，為使用專一地與分 析物（例如人類MTAP蛋白質）結合之抗體的測定。因此，免 疫測定之特徵在於檢測人類MTAP蛋白質或其片段與抗體 的專一結合作用，即檢測抗體：MTAP蛋白質複合物。因此， 免疫測定使用抗體做為MTAP-結合劑，相對於使用其他的 物理或化學特性來分離、瞄準和定量分析物，檢測人類 91202.doc >21 - 200427463 MTAP蛋白質。 π免疫組織化學法π —詞意指用來檢測出現在組織學試樣 中之抗原的技術。 當在本文中使用π滲漏” 一詞時，意指流體在體腔中的異 常集合。 當在本文中使用”檢測其之含量”片語時，包括結果產生 欲檢測之實體（例如人類ΜΤΑΡ蛋白質或ΜΤΑΡ-結合複合物） 的客觀含量，以及主觀含量（例如染色強度）的檢測方法。客 觀含量的實例包括檢測實體的公克或毫克量。主觀含量的 實例包括檢測實體的存在或缺乏，或實體的相對存在或缺 乏。這類主觀含量可包括使用刻度，例如0至4個正號，0代 表缺乏該實體，而4 +則代表檢測到大量的實體。 在本申請案中交替使用”核酸分子”和”多核苷酸’’ 一詞。這 些名詞意指任何的多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，其 可以是未經修改的RNA或DNA，或經過修改的RNA或 DNA。這些名詞意圖包括DNA分子（例如cDNA)和RNA分子 (例如mRNA)，以及使用核苷酸類似物產生之DNA或RNA的 類似物。 套組是任何包括至少一種用來專一地檢測人類MTAP之 試劑，例如MTAP-結合劑的製品（例如包裝或容器）。該製品 最好是以執行本發明方法之單位推廣、供銷或販售。 當在本文中使用π在治療上有效之含量f’和π在治療上有 效之劑量” 一詞時，意指所投與之化合物的量將減輕待治療 之病症的一或多個症狀至某種程度。關於癌症的治療，在 9I202.doc -22- 200427463 治療上有效之含量意指具有下列影響的量：⑴降低腫瘤之 寸（2)抑制（即減丨艾至某種程度，最好是中止）腫瘤轉移； (3)抑制（即減慢至某種程度，最好是中止）腫瘤生長至某種 又並/或（4)減輕至某種程度（或最好是排除）一或多個與 癌症有關的症狀。 當在本文中使用”針對MTAp缺陷癌症的治療攝生法，，一 司守心私使用藥物、藥物的組合，或藥物與其他癌症治 療測里的組合，如輻射療法，已經設計將其用在沒有或有 很少MTAP蛋白質的癌症細胞上。 Π.核酸 編碼ΜΊΓΑΡ蛋白質之基因的核酸操縱技術，例如將編碼多 肽之核酸序列繼代選殖到表現載體内、標示探針、DNA雜 父及其類似者，晋遍在例如Sambrook等人，Molecular

Cloning: A Laboratory Manual，第 3版（2001) Cold Spring

Harbor Press，Cold Spnng Harbor，Ν·Υ·; Glover編輯，DNA Cloning·· A Practical Approach，第 I和 II冊，第 2版（1995)中 描述，兩者皆以引用的方式併入本文中。亦參見c〇ligan等 人（1 987和定期附錄）Current Protocols in Molecular Biology Greene/Wiley，New York，NY;亦以引用的方式併入本文中。 有各種分離編碼MTAP蛋白質之DNA序列的方法。參見， 例如 Norbori 等人（1996)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 6203-6208 ; Ragione 等人（1996) Biochem. Biophys. Res· Comm. 223: 5 14-5 1 9 ; Olopade 等人（1995) Proc. Natl. Acad

Sci. USA 92·· 648 9-6493 ;全部以引用的方式併入本文中。 9l202.doc -23 - 200427463 例如，可使用經過標示，具有與在本文中揭示之序列相同 或互補之序列的寡核苷酸探針，從基因組或cDNA庫中分離 DNA。可使用全長的探針，或可藉著比較所揭示之序列與 其他蛋白質，並選擇特定之引子而產生的寡核苷酸探針。 可在雜交測定中直接使用這類探針，分離編碼MTAP蛋白質 的DNA，或可為了分離編碼MTAP蛋白質之DNA，設計可用 在諸如PCR之類擴大技術中的探針。 欲製備cDNA庫，從表現MTAP蛋白質之細胞中分離 mRNA。從mRNA中製備cDNA，並連接到重組的載體内。 將載體移至用來繁殖、篩選和選殖的重組宿主内。製造和 篩選cDNA庫的方法是已熟知的。參見，Gubler等人（1 983) Gene 25: 263-269 ; Sambro ok 等人，在前；或 Coligan 等人， 在前。 至於基因組庫，可從組織中萃取DNA，並以機械方式剪 斷或以酵素消化，產生大約12-20 kb的片段。然後藉著梯度 離心分開片段，並在噬菌體入載體中選殖。按照在例如 Sambrook等人，在前或Coligan等人，在前中的描述，在活 體外包裝這些載體和噬菌體。按照在Benton等人（1977) Science 196: 180-1 82中的描述，藉著溶菌斑雜交分析重組 的嗟菌體。按照普遍在例如Grunstein 等人（1975)Proc.Natl· Acad. Sci. USA 72: 3 961 -3 965中的描述，進行菌落雜交作 用。 可藉著其與在本文中描述之核酸探針，例如在菌落或溶 菌斑雜交實驗中雜交的能力，在cDNA或基因組庫中確認編 9l202.doc -24 - 200427463 碼MTAP蛋白質的DNA。藉著熟諳此藝者已知的標準方法， 分離一致的DNA區。參見Sambr〇〇k等人，在前。 亦可使用各種擴大標靶序列的方法，如聚合酶連鎖反 應，製備編碼MTAP蛋白質的DNA。使用聚合酶連鎖反應 (PCR)技術，直接&mRNA、從cDNA並從基因組庫或cDna 庫中擴大這類核酸序列。亦可使用已經分離之編碼ΜτΑρ 蛋白質的序列，做為PCR擴大作用的模板。 在PCR技術中，合成與在待擴大之DNA序列兩個5，區互補 的寡核#酸！|子。然後使用這兩则子進行聚合酶連鎖反 應。參見Inms 等人（編輯）（199〇) pCR pr〇t〇c〇ls: A g 祝心

Methods and AppHcadons Acadennc Press, San Dlego5 Cahf。可選擇引子，擴大編碼選出之全長MTAP蛋白質的整 個區域，或擴大想要的較小DNA斷片。一旦以咖擴大這 類區域，便可將它們定序，並可使用標準技術從所獲得的 序列中製備寡核：y：酸探針。已經以登錄編號U22233將人類 MTAP之CDNA的核答酸序列（序列第2號）存放在G論nk 中〇 可根據首先由 Beaucage 等人（1983) Tetrahedron Lett 22(20): 1859-1862插述的固相鱗醒胺酸（ph〇spW謹id⑽ 三酯法，或按照在 Needham-VanDevanter 等人 〇 984) Nucleic AcndsHes· 12: 6159-6168中描述的，使用自動合成器，以化 卞方式口成用來做為探針的寡核苷酸。可藉著例如天然丙 ，酿胺凝膠電泳，或藉著陰離子-交換HPLC，按照在Pearson 等人0983) Chr()m 255·· 137_149巾的描述，進行寡核芬 9l202.doc -25- 200427463 酸的純化。可使用在Grossman和Moldave(編輯）（1 980) Methods in Enzymology 65: 499-560 Academic Press, New York中的Maxam和Gilbert化學降解方法，證實合成寡核苷 酸的序列。 III.蛋白質 A.產製人類MTAP多肽或多肽片段 可藉著化學合成、篩選cDNA庫，或藉著篩選由各式各樣 細胞株或組織試樣製備之基因組庫，獲得編碼人 蛋白質或其片段的DNAs。 為了合成全長的蛋白質或片段，其可例如用來產製多株 或單株抗體；為了結合研究；為了建構並表現經過修改的 分子；以及為了結構/功能研究，可在各式各樣的宿主細胞 中表現這些DNAs。這些人類MTAP多肽均可在利用適當表 現載體轉化或轉移感染的宿主細胞中表現。多肽可以與其 他蛋白質融合的形式表現。 表現載體通常是自我-複製的DNA或RNA構築體，含有想 要的MTAP基因或其片段，通常以可操作之方式與適當的遺 傳控制元件連接’其可在適當的宿主細胞中被認出。這些 控：元件能夠影響在適當宿主内的表;見。影響表現所需： ^定類型的控制元件’將視最後所使用的宿主細胞而定。 -般而言’遺傳控制元件可包括原核生物啟動基因系統或 真核生物啟動基因表現控制系統’且通常包括轉錄啟動基 :二制轉錄開始的任意操縱基因、升高哟八表現程度二 轉錄促進子、編碼適當的核糖體'结合位置之序列，以及中 91202.doc -26 - 200427463 止轉錄和轉譯的序列。表現載體通常亦含有複製起點，其 容許載體不依賴宿主細胞獨立地複製。 在本文中描述的載體含有DNAs，其編碼人類ΜΤΑρ蛋白 貝或其片段，通常編碼例如生物活性之多肽戋蛋白”卞 DNA可在病毒啟動基因的控制之下，並可編碼選擇標記。 本發明包括使用這類表現載體，其能夠在原核生物^真核 生物宿主中表現編碼人類MTAP之真核生物cDNA ,其中該 載體可與宿主相容，且其中將編碼該蛋白f之真核_α插 入載體内，使得含有表現正在討論中之cDNA之載體的宿主 生長。通常設計表現載體，使其在其宿主細胞中穩定地複 製，或擴大至大大地增加每個細胞想要基因的副本總數。 並非總是需要在宿主細胞中複製的表現載體，例如，使用 不δ 了被侣主細胞纟忍出之複製起點的載體，可能影燮蛋白 貝或其片段在各種宿主中的暫時表現。亦可能使用藉著重 組作用導致將ΜΤΑΡ基因或其片段整合到宿主DNA内，或整 合控制内源基因表現之啟動基因的載體。 當在本文中使用時，載體包括質體、病毒、噬菌體、可 整合的DNA片段，以及其他能夠將DNA片段整合到宿主之 基因組内的媒介。表現載體是特化的載體，其含有影響以 可操作之方式連接之基因表現的遺傳控制元件。質體是載 體最常使用的形式，但提供相等功能的所有其他形式之載 體亦適用於此。參見，例如pouwels等人（1 985及附錄）

Cloning Vectors: A Laboratory Manual Elsevier, N.Y.;以及 Rodriquez 寺人（編輯）（1988) Vectors: A Survey of Molecular 9l202.doc -27- 200427463 C1r-Sjr〇rS USGS BUUerSW〇rth^ Boston, Mass〇 等^广主細胞包括原核生物、低等的真核生物以及高 物、;生物。原核生物包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽性生 ^例如大腸桿8和枯草桿菌。低等的真核生物包括酵母 ^例如酒酵母菌。高等的真核生物包括得自動物細胞， 非-哺乳動物來源’例如昆蟲和鳥類，以及哺乳動物來源， 例如人類、靈長類和舊齒類兩者的已經確立之組織培養細 胞株。 原核生物宿主-載體系統包括許多不同物種的各種載 體。當在本文中使用時，通常將使用大腸桿菌及其載體， 包括在其他原核生物中使用的相等載體。用來擴大dna的 代表性載體是PBR322或其衍生物。可用來表現人類MTAp 蛋白吳或其片段的載體包括，但不限於含有lac啟動基因 (pUC-系列），trp啟動基因（pBR322-trp) ; Ipp啟動基因（pIN-系列）；λ-pp或PR啟動基因（p0TS);或雜種啟動基因，如 ptac(pDR540)的那些載體。參見Brosius等人（1988)，，使用 λ-、trp-、lac^Ipp_衍生之啟動基因的表現載體（Expressi〇n Vectors Employing Lambda-, trp-? lac-5 and Ipp-derived

Promoters)f’A在 Rodriguez 等人（編輯）Vectors: A Survey of

Molecular Cloning Vectors and Their Uses 10： 205-236 Buttersworth，Boston，Mass 中。 可利用含有MTAP基因序列的載體轉化低等的真核生 物，例如酵母菌和黏菌（Dictyostelium)。酵母菌載體通常由 複製起點（除非為整合形式）、選擇基因、啟動基因、編碼想 9l202.doc -28- 200427463 要蛋白質或其片段的DNA，以及轉譯中取 付子甲止、聚腺苷酸化作 用和轉錄中止之序列所組成。適合酵 、 可囷之表現載體包括 組成上的啟動基因，如3_磷酸甘油酸激酶，以及各種其他 的糖原酵解酵素基因啟動基因，或是可料之_基因， 如乙醇脫氫酶2啟動基因或金屬硫肽啟動基因。適當1載體 包括下列類型的衍生物：自我_複製的低副本數目(如丫二 系列)：自我-複製的高副本數目(如YEP_系列);整合類型(如 Yip-系列），或迷你-染色體（如YC卜系列）。 可使用冑等的真核生物組織培養細胞做為表現人類 賜P蛋白質的宿主細胞。特定而言，可使用幾乎任何的高 等真核生物組織細胞株，例如昆蟲桿狀病毒表現系統，盔 論是得自無脊椎或脊椎動物來源的。然而，哺乳動物細胞 最好是以共同轉譯和轉譯後兩種方式，完成適當的處理。 這類細胞的轉化或轉移感染，以及繁殖，是此項技藝中例 行的#用的、”田胞株包括HeLa細胞、中國倉鼠_巢（CH〇) 細胞株、幼大鼠腎臟（B R K)細胞株、昆蟲細胞株、鳥細胞株 和猴子（COS)細胞株。這類細胞株之表現載體通常包括複製 起點、啟動基因、轉錄開始位置、狀錢合位置（例如若使 用基因組DNA)、聚腺:y：酸作用位置和轉錄中止位置。這些 載體亦可含有選擇基因或擴大基因。適當的表現載體可以 是質體、病毒或逆轉錄病毒，攜帶衍生自例如像是得自腺 病毒、SV40、微小病毒、疫苗病毒或細胞巨大病毒之來源 的啟動基因。適當表現載體之代表性實例包括pCDNA^ ; pCD ’ 蒼見 〇kayama 等人（198〇 m〇1 cell Biol. 5: 9l202.doc -29- 200427463

1136-1142 ; PMClneoP〇ly-A，參見丁h〇mas 等人（1987)CeU 5 1. 503-5 12，以及桿狀病毒載體，如pAC 3 73或p Ac 6丨〇。 在某些例子中，不必將ΜΤΑΡ多肽或其片段糖基化，在某 些測定中誘發生物學反應。然而，可能想要在提供特定或 限疋糖基化作用模式的系統中，表現人類ΜΤΑρ多肽。在該 案例中，常見的模式將是由表現系統自然提供的。然而， 將可藉著使多肽，例如以未經糖基化之形式暴露在導入異 種表現系統内的適當之糖基化蛋白質下，而修改模式。例 如，可共同-轉化人類ΜΤΑΡ基因和一或多個編碼哺乳動物 或其他糖基化酵素的基因。 可使用合成肽的傳統方法，來製備人類ΜΤΑρ蛋白質、片 段或衍生物。這些包括像是在stewan等人（1984) s〇nd

Phase Peptide Synthesis Pierce Chemical Co., Rockford, 111.; Bodanszky 等人（1984) The practlce 〇f 卜扣心 Synthesi:

Sprmger-Vedag，New York，N.Y.;以及Bodanszky(1984) The

Principles of Peptide Synthesis Springer-Verlag5 New York, N.Y.中描述的過程。亦參見Merrifield(1986) 34：U347 ;以及 Dawson等人（1994) Science 266: 776-779。例 如，可使用豐氮化物程序、醯基氯程序、酸酐程序、混合 酐程序、活性酯程序（例如對-硝苯基酯、N_羥基琥轴醯亞 胺酯或氰甲基酯）、碳化二咪唑程序、氧化-還原程序或二環 己基炭化一 S&亞胺（DCCD)/添加物程序。固相和液相合成兩 者皆可應用在前述的程序中。 可藉著肽分離，例如藉著萃取、沉澱、電泳和各種形式 9I202.doc -30- 200427463 的層析’及其類似物’從反應混合物中分離並純化製備好 的蛋白質及其片段。可藉著使用已知的蛋白質純化技術， 或藉著使用在本文中描述的抗體或結合夥伴，例如在免疫 吸附親和力層析中’完成純化作用。藉著首先連接抗體與 固體支樓物，並使已經連接的抗體與適當來源細胞之經過 促溶的溶胞產物、表現該蛋白f之其他細胞的溶胞產物或 由於DNA技術結果產生該蛋白f之細胞的溶胞產物或上清 液接觸，進行免疫吸附親和力層析，參見下文。 可針對與其他細胞相比較，以降低或升高之程度來表現 適當蛋白質者，篩選多個細胞株。可從天然來源，或藉著 從使用適當表現載體轉化之細胞中表；見，分離人類Μ· 蛋白質。藉著標準程序，或可與經過設計，以高效率從細 胞之溶胞產物或上清液中有效純化的方法混合，完成表現 蛋白負的純化。為了這類純化特徵，可使用FLAG或^ 標籤斷片。 在序列第1號中提供了人類MTAp蛋白質的胺基酸序列。 該序列容許製備肽，產生認得這類斷片的抗體。此外，親 和力試劑容許檢測並純化更多的蛋白質，包括全長或重組 的形式。 可藉著核苷酸取代、核苷酸刪除、核苷酸插入和核苷酸 延伸的反轉，迅速地修改已經分離之MTAp基因的dna。這 些修改結不產生新穎的DNA序列，其編碼MTAp蛋白質或其 片段，具有與野外型MTAP蛋白質高度類似的生理學、免疫 原或抗原活性。可使用經過修改的序列，產製突變種抗原 91202.doc -31 - ZUU4Z/463

或促進表現。促進表現可能涉及基因擴大，增加轉錄、增 加轉譯，以θ甘^ M /、他機制。這類突變的MTAP蛋白質衍生物包 括個別备^J f 文曰貝或其片段的預定或指定位置之突變作用。 大又的MTAP蛋白質，’包括無論是藉著刪除、取代或插 入’具、有與在自然界發現之人類MTAP蛋白質不同之胺基酸 ^列的多肽。一般而言，變體將與野外型人類MTAP共享許 夕物化和生物活性，例如抗原或免疫原活性，並含有大多 數或全部已經揭示的序列。 本發明亦包括重組的蛋白質，例如使用得自這些蛋白質 之斷片的異種融合蛋白冑。異種融合蛋白質是蛋白質或斷 片的毗合，其以相同的方式，天然但非正常地融合。因此， 免疫球蛋白與個別MTAp多肽的融合產物是連續的蛋白質 分子，具有以典型肽鍵結融合的序列，通常成為單一轉譯 產物，並顯不出衍生自每個來源肽的特性。類似的概念亦 適用於異種核酸序列。 這些MTAP抗原的”衍生物”包括胺基酸序列突變種、糖基 化作用變體，以及帶有其他化學部分的共價或凝集共軛 物。可藉著官能度與在MTAP蛋白質胺基酸側鏈或在^^或匕 終端中找到之基團的鍵結，藉著此項技藝中已熟知的方 法，製備共價衍生物。這些衍生物可包括，但不限於羧基 終知’或含有羧基側鏈之殘基的脂肪族酯或醯胺，含有羥 基基團之殘基的〇-醯基衍生物，以及胺基終端胺基酸或含 有胺基基團之殘基，例如離胺酸或精胺酸的N-醯基衍生 物。fc基基團係選自含有c 3至C 1 8正常；!：完基的烧基部份之 9l202.doc -32- 200427463 藉此形成鏈烧醯細基物種。當免疫原部分是附著 素奸，與載體蛋白質共價附接可能是重要的。 特定而言，糖基化仙改變包括，例如藉 及加工期間，或在更進一步的加工牛 夕太。成 , 步騄中，修改其糖基化 作用板式。達成的特佳方法， 古 肽暴路在衍生自正常提 仏XI頒加工之細胞的糖基化酵 #^ 。ϋ π 、 ” 例如哺乳動物糖基化 Β , 7輯素。亦採用相同的初級 月女基s文序列的版本，直呈有 心“ 取小的修改，包括磷酸化 s, ^夂殘基’例如鱗酸路胺酸、碟酸絲胺酸或磷酸蘇胺 ：；二、他部分’包括核酸基基圓或交聯試劑。再者，亦 包含包括取代的蛋白質，並膏 …上應保留免疫原性，產生 于序列弟1號之蛋白質的抗體。或者，開始和結束在.構 功能部位的蛋白質通常將保留抗原性和交又免疫原性。。 二生：的主要組別是MTAP蛋白質或其片段與其他蛋白 貝或夕肽的共價共軛物。可在 』在重組培養物中合成這些衍生 的…或c'終端的融合，或藉著使用在此項技藝中已知 可用於經由反應側基圏交聯蛋白質令的製劑。盘交聯 ,“ '何生位置疋自由的胺基基團、碳水化合物 和+胱胺酸殘基。 這類多肽亦可且右脸I缺&甘 用, /、有女基馱夂基，其已經藉著磷酸化作

用、石頁化作用、生物素其I ”土 用，或添加或移除其他部分， 乂化學方式修改，特別县且古 那些。在―此且體’… ~酸基團之分子形狀的 偏一、…财，該修改將是有用的標示試劑， 或做為純化標乾，例如親和力標記。 91202.doc -33 - 200427463 人犬員MTAP的其他衍生物可涉及與化學部分的共價或凝 集結合。這些衍生物通常落在下列的三類内：（1)鹽類，（2) 側鏈和終ir而殘基共價修改，以及吸附複合物，例如與細 胞膜。這類共價或凝集衍生物可用來做為免疫原，做為免 疫測疋中或在純化方法中的試劑，像是配體或其他結合配 體的親和力純化作用。例如，可藉著共價結合將人類ΜτΑρ 蛋白質抗原固定在固相支撐物上，如溴化氰-激活之瓊脂 糖，藉著此項技蟄中已熟知的方法，或吸附在聚烯烴表面， 有或無戊二醛交聯，以便用在抗-ΜΤΑρ蛋白質抗體之測定 或純化上。亦可利用可檢測基團標示Μ丁Αρ蛋白質或其片 段，例如藉著氯胺τ程序以放射性碘標記，與希土螯合劑共 價結合，或與其他用於診斷測定中的螢光部分結合。可藉 著已經固定的抗體完成人類ΜΤΑΡ或其片段的純化。 可使用各種免疫測定進行篩選，確認具有想要之專一性 的抗體。許多競爭性結合或免疫放射測定的草案，使用此 項技#中已热知，具有已確立之專一性的多株或單株抗 to。這類免疫測定通常涉及測量在人類ΜΤΑρ及其專一性抗 體之間形成的複合物。兩個-位置、以單株為基礎的免疫測 疋疋較彳土的，其利用單株抗體與兩個不_干擾的人類ΜΤΑρ 抗原決定位產生反應，但亦可使用競爭性結合測定（Madd〇x (1983) J· Exp· Med. 158·· 1211-1216)。 可藉著任何傳統的方法，產製具有抗原決定位之功能的 片段（參見，例如H〇Ughten(1985) Proc· Natl. Acad. Sen. USA 82: 5 13 1-5 135，在美國專利第4,631，211號中進一步描述）。 9l202.doc -34- 200427463 在本發明中，抗原之抗原決定位最好含有至少4至7個， 更仏的疋至少8至40個，而最佳的是在大約1 5到大約3 0個之 間胺基酸的序列。包括人類MTAP之免疫原性或抗原性抗原 決定位的較佳多肽，長度高達至少4、1〇、15、20、25、30、 35 、 40 、 45 、 50 、 55 、 60 、 65 、 70 、 75 、 80 、 85 、 90 、 95 或100個胺基酸殘基，並包括蛋白質的完整胺基酸序列。在 本文中描述了獲得這些多肽的方法。使用許多在蛋白質生 物化學和免疫學中的傳統技術。這類技術是已熟知的，並 在Mayer等人（1987)在細胞和分子生物學中的免疫化學法 (Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology) Academic Press，London ; Scopes(1987)蛋白質純化：原理 和貫施（Protein Purification: Principles and Practice)，第 2 版（Springer-Verlag，N.Y·)，Weir 等人（1986)實驗免疫學手 冊（Handbook of Experimental Immunology)第 4 版 Blackwell Scientific Publications，以及 Deutscher(編 輯）（1990)蛋白質純化的指導原則（Guide to Protein Purification), Meth. Enzymol. 1 82: 529-539 Acad. Press, San Diego中說明。 可用來產製MTAP-專一性抗體的抗原性多肽或肽之非限 制實例，包括：包括或另行由人類MTAP胺基酸殘基（參見 序列第1號），從大約胺基酸殘基18-28、75-85、93-103、 143- 1 50、1 70-1 80或220-248所組成的多肽。關於此點， π大約’’意指特別提及的範圍，以及在胺基-和羧基-終端之任 一或兩者處，更大或更小數個、少數、10、5、4、3、2或1 91202.doc -35 - 200427463 個胺基馱残基的範圍。已經藉著H〇pp等人（19^) pr〇c. Natl. ad· Sci· USA 86’ 152-156的抗原性分析，判定這些多肽片 段攜帶人類MTAP多肽的抗原性抗原決定位。 其他非-獨佔之較佳的抗原性抗原決定位，包括在本文中 揭示的抗原性抗原決定位，以及其部分。較佳的抗原性抗 原決定位包括在本文中揭示的抗原性抗原決定位，以及 二、三、四、五或更多個這些抗原性抗原決定位的任何組 口可使用抗原性抗原決定位做為免疫測定中的標靶分 子。（參見，例如 Wilson 等人（1984) CeU 37_ 767_778 ; Sutchffe 等人（1983) Science 219: 66〇_666; Bittie 等人（1985) J· Gen. Virol. 66: 2347-2354)。 可使用本發明之攜帶抗原決定位的多肽，根據在此項技 藝中已熟知的方法，誘導抗體’包括但不限於在活體内的 免疫作用、在活體外的免疫作用，以及嗟菌體展示法。參 見’例如SutcHffe等人，在前；議等人，在前，以及Bmie 等人，在前。若使用在活體内的免疫作用，可利用自由的 肽免疫動物；然而’亦可藉著將肽與大分子載劑偶聯，如 鎖孔蜮血藍蛋白（KLH)、白蛋白或破傷風類毒素，補強抗_ 肽的抗體力價。例如’可使用交聯劑，如順丁稀二酿亞胺 苯甲醯基_Ni基破㈣亞胺g旨（MBS)，將含有半胱胺酸殘 基的肽與載劑偶聯，而其他的肽則使用較普通的交聯劑， 如戊二醛，與載劑偶聯。若多肽具有足夠的長度（至少大約 25個胺基酸)’則多肽可沒有載劑而存在。然而，已經顯示 含有8至1〇個胺基酸那麼少的免疫原性抗原決定位，足以使 91202.doc -36- 200427463 最低限度能夠與在變性多肽巾之直線抗原決定位結合的抗 體升高（例如在西方墨點法中）。 以自由或與載劑-偶聯之肽免疫動物，如兔子、大鼠和老 乳，例如藉著腹腔内及/或皮内注射含有大約i 〇〇微克肽或 載劑蛋白質，以及福瑞德氏佐劑，或任何其他已知用來刺 放免疫反應之佐劑的乳劑。可能需要數次補強注射，例如 以大約2週的間隔，提供抗-肽抗體的有用力價，其可藉著 例如EUSA測定，使用吸附在固體表面的自由肽來檢測。 可藉著遥擇抗-肽抗體，例如藉著將肽吸附在固體支樓物 上並根據在此項技藝中已熟知的方法洗脫所選出的抗 體，增加在得自免疫動物之血清中抗_肽抗體的力價。 字匕括免☆原或抗原性抗原決定位的人類Μ丁Ap多月太 或其片段與其他的多肽序列融合。例如，可將ΜΤΑΡ多肽或 其片段與免疫球蛋白之恆定功能部位（IgA，IgE，IgG，IgM) 或其部分（CHI，CH2, CH3或其任何組合，及其部分）融合， 、…果產生肷合型多肽。這類融合蛋白質可有助於純化作 用’並可增加在活體内的半衰期。這已經顯示由人類CD4-夕肽的4兩個功能部位，與哺乳動物免疫球蛋白之重或輕 鍵怪定區的可變功能部位所組成的嵌合型蛋白質。參見， 例如區人，州專利第394,827號；Traunecker等人（1988) Nature， 33 1. 84-86。促進抗原跨越上皮障礙遞送至免疫系統，已經 也貫抗原（例如胰島素）與FcRn結合夥伴共軛，如igG或Fc片 段（參見，例如PCT公開案WO 96/22024和W〇99/048 13)。IgG 融3蛋白質具有二硫-連接的二聚體結構，歸因於已經發現 9l202.doc -37- 200427463

IgG 4 77的一&鍵結，在結合及中和其他分子時，比單體之 多肽或其片段單獨時更有效。參見，例如F_t〇uiakis等人 (1995) J· Biochem.，270: 3958-3964。 亦可將編碼上文之抗原決定位的核酸與做為抗原決定位 標藏的感興趣基因（例如血球凝集素（”HA”）標鐵、6xHis標籤 或flag標籤）重組，幫助檢測及純化所表現之多肽。例如， Janknecht 等人（（1991)，Pr〇c NaU Acad. ^ usa ⑽ 8972-8976)描述了容許迅速純化在人類細胞株令表現之非-變性融合蛋白質的系統。在該系統中，將感興趣的基因繼 代選殖到疫苗病毒重組質體内，使得該基因的開放編閱架 構以轉譯之方式融合由六個組胺酸殘基所組成的胺基 '終 端標籤。該標籤可用來做為融合蛋白質的基質結合功能部 :二將得自以重組疫苗病毒感染之細胞的萃取物裝入Nl〜 氮土乙S文瓊月曰糖官柱，並利用含有咪唑的緩衝溶液選擇 性地洗脫附貼有組胺酸標籤的蛋白質。 IV·抗體 /同在本文中討論的，可對人類ΜτΑρ蛋白質升高的抗體 (多株或單株)，包括個別的、多形的、對偶基因的、品系或 體’及其m其μ存在（全長）之形式和以其重 組之形式兩者。亦可使用抗_遺傳性型之抗體。 亦可產製含有人類ΜΤΑΡ之專—結合位置的抗體片段。例 這類片段包括，但不限於F(ab，）2片段，其可藉著抗體 刀子的胃蛋白酶消化作用來產製，以及Fab片段，其可藉著 减少FUb’)2片段的二硫橋來產製。或者，可建構—：現 01202.doc -38- 200427463 庫，容許迅速並谷易地確認具有想要專一性的單株Fab片段 (Huse 等人（1989) Science 254: 1275-1281)。 對人類MTAP或其片段專一的抗體，包括抗原結合片段， 可用在診斷應用中，檢測人類MTAP及/或其片段的存在或 缺乏。這類診斷測定可使用溶胞產物、活細胞、固定的細 胞、細胞培養物、細胞萃取物、體液，且更進一步可涉及 檢測血清中的抗原’或其類似物。現存各種市售的測定， 如放射免疫測定（RIA)、酵素-連結之免疫吸附測定 (ELISA)、酵素免疫測定（EIA)、酵素-多重免疫測定技術 (EMIT)、受質-標示之螢光免疫測定（SLFIA)及其類似者。 例如，如同在本文中描述的，藉著使用第二個抗體，其經 過標示並認得對抗人類MTAP蛋白質，或其特定片段之抗 體’可使用未標示之抗體。參見，例如Harlow和Lane(1988) 抗體：實驗室手冊（Antibodies: A Laboratory Manual)，在 前；Chan(編輯）（1987)免疫測定：實行之指導原則 (Immunoassay: A Practical Guide)，在前 Academic Press， Orlando，FI ; Price和Newman(編輯）（1991)免疫測定的原理 和實施（Principles and Practice of Immunoassay) Stockton Press，NY ;以及Ngo(編輯）（1988)非同位素的免疫測定 (Nonisotopic Immunoassay) Plenum Press，NY。特定而言， 可使用試劑在生物試樣中檢測MTAP存在或缺乏。測定可針 對生檢的組織學分析，或評估在血液或組織試樣中的 MTAP 〇 A.抗體產生 91202.doc -39- 200427463 如：在本文中討論的’可使用許多免疫原來產生專一地 ’、人頒MTAP反應的抗體。為了產生單株或多株抗體，重植 J白質是較佳的免疫原。亦可使用純的或不純形式… 蛋白f。亦可使㈣用在本文中描述之人類MTAP 白貝序列製造的合成肽，做為免疫原，產生對抗人類 MTAP蛋白質之抗體。可按照在本文十的描述，在真核生物 :戈原核生物細胞中表現重組的蛋白質。然後將產物注射到 能夠產生抗體的動物内。A τ你病 為了後績使用在測量蛋白質的免 疫測定中，可產製單株或多株抗體。 產生多株抗體的方法是熟諳此藝者已知的。簡言之，將 免疫原，最好是經過純化的蛋白#，與佐劑混合，並以該 混合物免疫動物。藉著採血測試，並判定對感興趣蛋白質 之反應性的力價，例如使用EUSAM，監視動物對免疫 原製備物的免疫反應。當對免疫原獲得適當高的抗體力價 時，從動物中收集血液，並製備抗血清。如果想要，可進 行抗血清的進一步分級分離，增強對蛋白質有反應的抗 體。參見，例如Harlow等人（1988)抗體：實驗室手冊 (Antibodies: A Laboratory Manual) CSH Press。 可藉著熟諳此藝者已熟悉的各種技術，獲得單株抗體。 簡。之，使得自以想要抗原免疫之動物的脾臟細胞永存不 死，通常是藉著與骨髓瘤細胞融合。參見，例如K〇hler和 MUstem(l976) Eur. j· Immun〇1 & 川-川，以引用的方式 併入本文中。另一種永存不死的方法包括以愛氏頓病毒、 致癌基因或逆轉錄病毒轉化，或其他此項技藝中已知的其 91202.doc -40- 200427463 他方法。針對產生對抗原具 、α心罟寻一性和親和力的 體，篩選起因於單一 ,、 、 死、、、田胞的菌落，並可藉著各種 技術提高由這類細胞產生之罩曰 〆、 早株抗肢的產置，包括注射到 脊椎動物宿主的腹腔内。或者，可根據由Η·等人’在前 概述的共同草案’藉著篩選得自人㈣細胞的魏庫，分離 編碼單株抗體或其結合片段的1)1^八序列。 對抗人類MTAP之預定片段的抗體，包括結合片段和單鍵 版本，可藉著以該片段與按照上述之載劑蛋白質的共軛物 免疫動物而使其升高。從分泌想要抗體之細胞來製備單株 抗體。可針對與正常或突變種MTAp蛋白質的結合作用，或 激動或拮抗劑活性，來篩選這些抗體。這些單株抗體通常 將以至少大約低於 5x10 4 Μ、5x1 CT5 Μ、1(Γ5 Μ、5x1 (Γ6 Μ、 10 6 Μ、5xl0·7 Μ、ΙΟ·7 Μ、5χ1(Γ8 Μ、ΙΟ·8 Μ、5xlCT9 Μ、 10 Μ、5x10 10Μ、1(Γ10Μ、5χ1〇-11Μ、1CTUM、5xl〇-uM、 10 Μ、5x10 13 Μ、ΙΟ-13 Μ、5χΗΓ14 Μ、ΙΟ-14 Μ的 KD結合。 在 Heyningen(1986) Methods in Enzymology 121:472和 Qiu 等人（1996) J· of Immunol.，15 6:3 350 (1996)中報告 了判定 抗體結合親和力的方法；全部以引用的方式併入本文中。 可從各種哺乳動物宿主，如老鼠、嚷齒動物、靈長類、 人類等等，製備單株抗體。可在例如Stites等人（編輯）基礎 和臨床免疫學（Basic and Clinical Immunology)(第 4 版）Lange Medical Publications，Los Altos，Calif.，以及其中 提及的參考文獻；Harlow (1986)單株抗體：原理和實施 (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice)(第二版） 9l202.doc -41 - 200427463

Acadermc Press，New Y〇rk，Ν γ·;中找到製備這類單株抗體 的技術說明，特別是在K〇hle和Milstein(1975) Nature 256: 495-497中，報告了一種產製單株抗體的方法。簡單地摘 述，該方法涉及以免疫原注射動物，發動體液免疫反應。 然後犧牲泫動物，並從其脾臟中取出細胞，然後將其與骨 m瘤細胞融合。結果產生能夠在活體外生殖的雜種細胞或 融合瘤。然後篩選融合瘤的族群，分離個別的純種系，其 中每個均對免疫原分泌單一的抗體物種。以此方式獲得的 個別抗體物種，是永存不死，並從反映在免疫原物質上被 認出之特定位置而產生的免疫動物中選殖之單一 B細胞的 產物。 其他適當的技術涉及在噬菌體或類似載體中選擇抗體 庫。筝見Huse等人，在前；以及ward等人（1989) Nature 341: 544-546。可使用本發明之多肽和抗體，有或沒有修改，包 括嵌合型和人類化的抗體。通常，將藉著共價或非―共價地 連接提供可檢測信號之物質，來標示多肽和抗體。各種標 5己和共軛技術是已知的，並廣泛地在科學和專利文獻中報 告。例如’可藉著含有放射性同位素之胺基酸的代謝合併， 以培養基之組份來提供，標示由融合瘤產生的抗體分子。 :見’例如 Galfre 等人（1 98 1) Meth· Enzymol· 73 : 3-46。經 由激活之官能基團的蛋白質共軛或偶聯技術是特別適合 的。麥見，例如 Avrameas 等人（1978) Scand. J· Immunol.， 第 8冊，附錄 7: 7-23; Rodwell等人（1984) Biotech· 3: 889-894 和美國專利第4,493,795號。適當的標記包括放射性核素、 9l202.doc -42- 200427463 酵素、受質、輔因子、抑制劑、螢光部分、化學發光部分、 磁性顆粒及其類似物。料使用這類標記的專利，包括美 國專利第 3,8 1 7,837號；3,85〇,752號，· 3,939,35q號,· 3，㈣ 號，4,277,437號；4,275，149號和 4,366,241 號。 在分離人類MTAP蛋白質時，親和力層析法亦可使用本發 明之抗體。可製備管柱，其中抗體與固體支樓物連接，例 如顆粒，像是瓊脂糖、交聯葡聚糖或其類似物，其中可使 細胞之溶胞產物通過該管柱，沖洗管柱，接著增加溫和變 I*生劑的/辰度，藉此將釋放經過純化的人類旭丁八^蛋白質。 亦可針對特定的表現產物，使用抗體來篩選表現庫。通 常在這類程序中使用的抗體，將利用容許藉著抗體結合而 容易檢測出抗原存在的部分標示。 可使用對抗人類MTAP蛋白質的抗體，進行表現個別蛋白 質之特定細胞族群組份的分析或確認。此外，亦可使用對 抗人顯MTAP的抗體來篩選生物試樣，如腫瘤樣本。較佳的 是’該生物試樣是經過包埋和固定的，例如包埋在石蠟中， 並以福馬林固定的腫瘤生檢。藉著測定表現或不表現人類 MTAP蛋白質之細胞的表現產物，有可能選擇患者，其可獲 值於設計利用表現低或無MTAP蛋白質含量之癌症細胞的 療法。此外，因為MTAP的刪除經常與在染色體9上其他基 因的刪除有關連，如p 1 6和p 14，所以判定不表現MTAP的腫 瘤細胞’可用來做為P16和pi 4刪除的代理標記。與MTAP 刪除聯合的p 1 6和p 14之刪除，與進行階段的腫瘤有關連。 此外’本發明包括能夠結合與按照在本文中的描述，由 91202.doc -43 - 200427463

或其片段 。這類抗體將在該抗原決定 PTA-5001產生之單株抗體，

位’與由融合瘤細胞株ATCC 競爭結合。這些包括具有與衍生自ATCC pTA_5〇〇l之單株 相同的抗原專一性，但在物種起源、同型^、結合親和力 或生物功能（例如細胞毒性）方面不同的抗體。例如，可使用 此項技藝中已知的重組類型-轉換及融合技術，建構本發明 之抗體的類型、同型物和其他變體，其具有從融合瘤^胞 株PTA-5001產生之抗體的抗原-結合區（參見，例如 Thammana 等人（1983) Eur· J lmmunol· 13:614;补咖等人 (1984) J_ Imnumol· Meth· 74: 307-15 ; Neuberger 等人（1984) Nature 312: 604-608 ;以及 〇1 等人（1986) Bl〇techniques， 4(3). 214-21)。因此，具有與由融合瘤細胞株atcc ρτΑ- 5001 產生之抗體 相同之 結合專一性的其他欲合型抗 體或其 他重組抗體（例如融合蛋白質，其中該抗體與第二個蛋白 質，如淋巴細胞活素或腫瘤抑制生長因子混合），均落在本 發明的範圍内。 B.免疫測定 可藉著各種免疫測定法，測量特定的蛋白質。關於普通 免疫學和免疫測定程序的回顧，參見Stites等人（編輯）（1991) 基礎和臨床免疫學（Basic and Clinical Immunology)(第 7 版）。此外，可以任何數種組態，進行本發明之免疫測定， 在 Maggio(編輯）（1980) Enzyme Immunoassay CRC Press， Boca Raton，Fla. ; Tijan( 1985)’'酵素免疫測定的實施與理論 9l202.doc • 44- 200427463 (Practice and Theory of Enzyme Immunoassays)"生 4匕矛口分子 生物學上的實驗室技術（Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology)，Elsevier Science Publishers B.V·， Amsterdam，以及H a r 1 o w和L a n e 抗體’貫驗室手冊 (Antibodies，A Laboratory Manual)，在前中廣泛地回顧，分 別以引用的方式併入本文中。亦參見Chan(編輯）（1987)免疫 測定：實施指導原則（Immunoassay: A Practical Guide) Academic Press，Orlando, Fla. ; Price 等人（編輯）（1 997)免疫 測定的原理與實施（Principles and Practice of Immunoassay) (第 2版），Groves Dictionaries，Inc. ; Boenisch(編輯）（200 1) 免疫化學染色法之手冊（Handbook Immunochemical

Staining Methods) DAKO Corp· Carpinteria，CA，USA ;以及

Ngo(編輯）（1988)非-同位素之免疫測定（N〇n-isotopic Immunoassays) Plenum Press，NY ;全部以引用的方式併入 本文中。 一般而言，免疫測定的設計考量包括製備對其抗原具有 足夠高之結合專一性的抗體（例如單株或多株），而得以確實 地區別專一結合的抗體-抗原複合物與非專一之交互作 用。抗體結合專一性越咼，便可檢測越低的抗原濃度。目 前較佳的結合專一性’使得結合蛋白質對標記蛋白質具有 超過大約1〇5 NT1的結合親和力，最好是超過大約1〇7 。 可藉著熟諸此藝者已知的各種方法，進行測量人類mtap 蛋白質的免疫測定（參見，例如美國專利第4,366 241號； 4,376,^0號；4,5 17,288號和4,837，168號）。關於普通免疫測 91202.doc -45 - 200427463 定的回顧，亦參見Asai(l 993)細胞生物學中的方法（Meth〇ds in Cell Biology)第37冊：細胞生物學中的抗體（Antib〇dies in Cell Biology)，Academic Press，Inc. New York ; Stites & Terr (1991)基礎和臨床免疫學（Basic and clinical Immun〇l〇gy) 第7版。 免疫學的結合測定（或免疫測定）通常利用專一地結合並 經常固定分析物（MTAP多肽）的"捕捉劑"。在較佳的具體實 施例中，MTAP-結合劑為抗體。 簡言之’測量蛋白質的免疫測定可以是競爭性或非競爭 f生的非X兄爭性的免疫測定是其中直接測量被捕捉之分析 物（在本案例中為MTAP)含量的測定。例如，在”三明治，，測 疋中’結合劑（例如抗體）直接或間接地與已經固定的固體受 質結合。這些已經固定的MTAP抗體捕捉出現在生物試樣 (例如血液試樣）中的MTAP蛋白質。然後藉著標示劑，如攜 帶標記的MTAP抗體，與如此而被固定的MTAp蛋白質結 。。或者’第二個抗體可缺乏標記，但它可轉而與已經標 不的第三個抗體結合，該第三個抗體對從其中衍生第二個 抗體之物種的抗體是專一的。沖洗掉自由的已標示之抗 體，並檢測剩下的已結合且已標示之抗體（例如，在標記為 放射性的之處，使用γ檢測器）。 在競爭性測定中，藉著測量添加之（外源的）分析物，被出 現在忒樣中之分析物移走（或競爭掉）捕捉劑（例如ΜΤΑρ抗 奴）的ΐ ’間接測置出現在試樣中之分析物（例如ΜΤΑρ)的 里。在-個競爭性測定中，在具有未定量之ΜΤΑρ多肤的試 91202.doc -46- 200427463 樣中，加入已知含量的MTAP多肽，並使該試樣與專一地結 合MTAP的捕捉劑，例如MTAP抗體接觸。所加入之％ 丁 多肽與ΜΤΑΡ抗體結合的量，與出現在受試試樣中之％ 丁 的濃度成反比。 或者’可進行均-的免疫測定，其中不需要分離步驟。 在這些測定中，藉著使蛋白質與其專一的結合劑結合，改 變在該蛋白質上的標記。在已標示之蛋白質上的改變，結 果降低或增加了由該標記發出的信號，使得在免疫測定結 束時測量標記，容許檢測或定量蛋白質。 可使用西方墨點分析，判定在試樣中人類^^丁八卩蛋白質的 存在或缺乏。進行電泳，例如在懷疑含有該蛋白質的組織 試樣上。纟電泳分離蛋白質之後，並將該蛋白質移至適當 的固體支樓物上’如絲纖維素濾紙上，將該固體支樓物 與會與變性蛋白質起反應的抗體—起培養。可標示該抗 體’或可另行藉著後續與第二個已標示之抗體，其結合初 級抗體一起培養，來檢測它。 為^判定在生物試樣中ΜΤΑΡ蛋白質的存在或缺乏，在本 文中=述的較佳方法是免疫組織化學法(mc)。免疫組織化 學法容許在組織和腫瘤中，評估顯微·解剖細節和異質性。 ，疫組織化學法是有利的，勝過其他的分析方法，因為它 是唯-可直接對個別的細胞類型，定位蛋白質的方法。可 檢測在正常和腫瘤組織之基因表現中的差異，㈣注意在 細胞數目和組成上的改變。相反的，諸如西方墨點法之類 的技術*要使用細胞卒取物；因此，可能存有不同細胞 91202.doc -47- 200427463 類型的汙染。 至於IHC，將認得人類MTAP蛋白所夕、μ Λ/Γη ” nr玄臼貝之初級ΜΤΑΡ-結合劑 導入生物樣本。初級ΜΤΑΡ-結合判ν、登ώ η ,老 、口 σ釗可選自，例如專一地钎 對初級抗體並以酵素標示的二級抗體，與生物樣本一起培 養。在培養期間，二級抗體將與初級抗體結合。或者，第 二個抗體可缺乏標記，但其可轉而與經過標示的第三個抗 體結合，該第三個抗體對從其中魅第二個抗體之物種的 抗體是專一的。 合人類ΜΤΑΡ的化學化合物、含有專—地與人類ΜτΑρ蛋白 質反應之多株抗體的抗血清、專一地結合人類ΜτΑρ蛋白質 之單株抗體，或專-地結合人_ΤΑρ蛋白質之單株或多株 抗體的抗原·結合片段所組成之群。在與初級抗體—起培養 之後可進行冲洗以便移除未結合的抗體。然後，可將針 在另-個具體實施例中，可利用酵素標示初、_ΤΑρ'结 合劑，因此排除了對第二個抗體的需求。或者，可利用生 物素而非酵素來標示已標示之ΜΤΑρ_結合劑。然後，在額 外的步私中，將酵素-標示之抗生物素蛋白或鏈黴菌抗生物 素蛋白導入試樣，並容許與生物素基化的抗體結合。 關於免疫組織化學法，組織試樣可以是新鮮的或冷凍 的，或可被包埋在例如石蠟或其他的蠟、硝基纖維素、聚 乙二醇（亦稱為水溶性聚乙二醇（參見Ga〇等人（Μ%)"聚乙 二醇做為可供顯微術和組織化學法使用的包埋材料 (Polyethylene Glycol as an Embedment f〇r Microscopy and

Histochemistry) ’ CRC press，Inc. Boca Raton，FI·)、塑料， 91202.doc -48- 200427463 包括樹脂，如丙烯和環氧樹脂，或〇CT包埋冷凍塊中。較 佳的是，將試樣包埋在石蠟或其他的蠟、硝基纖維素、聚 乙二醇或塑料中。可利用防腐劑固定試樣，例如福馬林。 本發明較佳的具體實施例是包埋在石壤中，以福馬林固定 的生物試樣。 在生物試樣中檢測人類MTAP蛋白質之存在或缺乏的較 佳MTAP-結合劑是專一結合人類MTAp蛋白質的單株抗體。 使用在本文中描述之抗體，判定MTAp之存在或缺乏的其 他較佳技術，是免疫細胞學。該技術可用來分析血液學的 癌症。 在本文中描述的MTAP-結合劑可用來判定獲自手術生 檢、細針頭生檢、細針頭抽吸之生檢、核心-針頭生檢、得 自腹腔的滲漏液，如體腔、胸腔和心包腔，以及收集自其 他體液，如血液和尿液的細胞，及其類似物之試樣的MTAp 狀態。獲得這類試樣之方法為此項技藝中已知的。例如， 可藉著以針頭穿刺胸壁或腹壁收集滲漏試樣，並排空液 體。得自細針頭抽吸、滲漏或其他體液的試樣，可使用傳 、'充的離心或 Cytospin® 裝置（Shandon，Runcorn，υ·Κ.)，在玻 片上旋轉’或塗抹在適當的玻片上，進行染色及/或固定。 亦可藉著、濃縮其中所含有的細胞，從這類試樣來製備細胞 鬼例如’可藉著例如離心濃縮細胞。在離心之後，可利 用適田的固定劑固定細胞，如福馬林或醇，然後包埋在石 氣或其他適當的材料中，按照在外科病理學中對組織進行 的處理。亦可使用例如Cytyc ThmPrep®處理器（Cytyc corp 9l202.doc -49- 200427463

Boxborough，ΜΑ)，為了 ThinPrep製備’處理已經濃縮的細 使用在本文中描述的抗體，判定細胞之MTAP狀態的另一 個較佳技術，是流動細胞計數分析（FACS)。在Ormerod(編 輯）流動細胞計數分析··實施方法（Flow Cytometry: A Practical Approach)(IRL Press，Oxford. 1994) ; Shapiro，實 際的流動細胞計數分析（Practical Flow Cytometry).第3 版；（Alan R Liss，Inc·)· Givan，流動細胞計數，首要原則 (Flow Cytometry. First Principle)(Wiley-Liss5 New York, 1992); Robinson(編輯）流動細胞計數法的手冊（Handb〇〇k 〇f

Flow Cytometry Methods).(Wiley-Liss，New York，1993)中 討論了流動細胞計數分析的理論。 固定 在免疫組織化學和免疫細胞化學測定中，固定是一個重 要的步驟。IU定使在樣本中之蛋白質穩定，並防止由諸如 發黴、細菌，以及連續的酵素代謝過程（自溶）之類事情引起 2改變。岐亦可使在細胞内之可溶性物質變成不溶的物 質。固定亦保護樣本免於脫水劑和後續處理步驟的變性影 可使用此項技蓺巾ρ Α ^ π中已知的技術，固定生物試樣。例如 風乾可保存血液試樣。可 了使用固疋劑，如但不限於高級 醇、無水丙酮或以福黾鉍 …林為基礎的固定劑，來固定抹片 風乾的製備物可能顯示出敕雕 於码认 貝丁出鲨體較低的ΜΤΑΡ抗原密度，起 於弱的免疫染色。因此， ^ U此，可旎需要延長ΜΤΑΡ-結合劑的 9l202.doc 200427463 養時間。 可在95%乙醇中固定，或以含有聚乙二醇之醇系流體噴 霧-固定細胞學的抹片。可使用固定劑，如丙綱、醇、福馬 林或仲甲醒’固定使用Wospin裝置製備的試樣。可使用固 定劑，如醇或丙s同，固定Cyt〇stat切片。 在包埋之前，可使用但不限於以甲醛為基礎之固定劑、 以氯化汞為基礎之固定劑、以鋅為基礎之固定劑、高碘酸_ 離胺酸-仲甲醛（PLP)、以乙二醛為基礎之固定劑、布英 (Bourn’s)防腐液（含有甲醛、含水飽和的苦味酸和冰醋酸）、 哈蘭德氏（Hollande’s)溶液（含有乙酸銅，其維持紅血球細胞 膜、嗜曙紅細胞和内分泌細胞的顆粒，並能夠使小片的骨 頭脫約）、乙醇或丙酮。 在固定之後，含有骨頭的樣本可能需要脫鈣。大多數的 脫鈣劑均含有酸。用來脫鈣的酸可以是無機酸（氫氯酸或硝 酸）或有機酸（甲酸和乙酸）。亦可使用螯合劑來脫鈣。例如 乙一胺四乙酸（EDTA)疋用來脫舞的較佳螯合劑。 抗原恢復 π抗原恢復π的一種術語學，包括”抗原決定位恢復”、”熱 誘導之抗原決定位恢復’’（HIER)、，，標靶恢復，，和，，標靶揭露 π。固定可引起許多抗原喪失免疫反應性。可使用此項技藝 中已知的技術，改善在細胞塊中經過固定之組織抗原和試 樣的免疫反應性。例如，在加入ΜΤΑΡ-結合劑之前，利用 蛋白水解酵素的蛋白水解消化作用，如但不限於騰蛋白 酶、鳳梨蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、無花果蛋白酶、胃蛋白 9l202.doc -51 - 200427463 酶或鏈黴蛋白酶，可改善免疫反應性。其他在包埋組織切 片或細胞塊中恢復抗原決定位的適當方法，向紅 ^拓加熱，如 但不限於利用微波爐、高壓滅菌器、蒸氣發生器、水、、又戋 壓力鍋。其他恢復免疫反應性的適當方法，包括混人酵素 消化’並在恢復溶液的存在下加熱，如但不限於檸檬酸緩 衝溶液（大約pH 6.0)、大約pH 8.0的EDTA溶液，或pH大約i 或大約10的0.01 MTRIS-HC1。抗原恢復的方法亦可用在一 些細胞學樣本上。 抗原恢復可用在細胞學玻片上，包括巴氏（Papanic〇la〇u)_ 染色的玻片。若需要，可使用按照在本文中描述的適當方 法’進行熱誘導的抗原恢復，如水浴、壓力鍋和微波爐， 及其類似物。 上述的免疫測定格式可使用經過標示的測定組份，如同 在本文中描述的。標記可以是各種形式的。可根據在此項 技藝中已熟知的方法，使標記直接或間接地偶聯想要的測 义、、且伤可使用各式各樣的標記。可藉著數種方法中的任 一種來標示組份。在傳統上使用併入3H、m][、35S、i4c或 3 2 p的放射性標記。非-放射性的標記包括配體，其與已標示 之抗體、螢光團、化學發光劑、酵素結合，以及可擔任已 才不不蛋白質之專一結合對之成員的抗體。標記的選擇依賴 例如所需的敏感性、與化合物結合的容易程度、穩定性需 求和可後得的儀器使用。關於可使用的各種標示及信號產 生系統的回顧’參見美國專利第4,391，904號，以引用的方 式併入本文中。 9l202.doc -52- 200427463 亦可藉著各種免疫測定法，如同在本文中討論的，測量 與特殊蛋白質起反應的抗體。關於適用於藉著免疫測定技 術測量抗體之免疫學和免疫測定程序的回顧，參見，例如 Stites和Ten*(編輯）基礎和臨床免疫學（Basic and CHnical Immunology)(第7版），在前；Maggio(編輯）酵素免疫測定 (Enzyme Immunoassay)，在前；以及Harl〇w 和 Lane抗體， 實驗室手冊（Antibodies，A Laboratory Manual)，在前。 亦可使用各種不同的免疫測定格式、分離技術和標記， 满似上述關於測量特定蛋白質的那些。此外，已知許多評 估對特定蛋白質或密切相關之蛋白質的結合選擇性的方 法。 C.結果 在本文中描述的是單株抗體，其專一地結合人類Mtap 蛋白負。XI些單株抗體可檢測在包埋在例如石蠟或其他適 當材料’如其他的蠟、硝基纖維素、PEG或塑料中之生物 试樣中，MTAP蛋白質的缺乏或存在。特定而言，該抗體可 在祸馬林固定，石蠟-包埋（FFPE)的組織中檢測人類 MTAP。使用在本文中描述的測定，該抗體可在正常組織中 k測MTAP ’同時不會在對照組細胞或缺乏mtap之腫瘤細 胞中誘發陽性的染色（參見表。該抗體亦可檢測與正常細 I相比車乂，產生低含量MTAp的細胞。該抗體亦在細胞核中 檢測人類MTAP。 右人發展使用本發明之抗體的免疫組織化學測定，對石蠟 切片進仃處理W的分析’判定適當的抗原恢復方法。發現 91202.doc -53- 200427463 熱-請導之抗原決定位恢復（H.m)，其使用题 土 鋼 (B〇RG-BioCare Medical) ’在大約120°C下大約3分鐘，接一 以胰蛋白酶處理大約丨分鐘，對於在本文中描述之免疫組織 化學測定，提供極佳的結果。再者，大約2〇微克/毫升的^ 株抗體力價，產生適當組合的染色強度和低背景染色，並 將其、/辰細以供在本文中描述之免疫組織化學篩選研究使 用。 至於在本文中描述的測定，藉著顯微檢查進行染色玻片 的說明。通常，在玻片上對組織的形態學觀察，判定是否 提供適量的組織，以及是否適當地提供指定的組織。從分 析中排除無法滿A以上標準的試#，若保留㉟當的組織便 再測試之。若無法獲得適當的、组織，便以隨機採樣取代組 織。 計分系統包括染色強度的分析。相對於含有以負對照組 抗體染色之相冑切片_照組玻片之強度，判斷受試物件 的染色強度。將利用負試劑對照組標示之切片 ”背景”。”。，，表示相對於背景沒有染一物 色。"2 + ”代表中等的染色，而，，3 + "代表強染色（參見，表1)。 使用標準病理學實習，以在所有組織元件中觀察到的最高 階級之強度來報告染色強度，除了其中報告延長計分計晝 的特殊組織元件之外。 使用Mlcrosoft Excel進行敘述統計。根據下列的公式計算 腫瘤和正常相鄰組織的H-分數： 91202.doc -54- 200427463 長Η-分數=(3xM胞染色3 +的％) + (2^細胞染色2 +的 細胞染色1 +的〇/0) 短H-分數==(所觀察到的最高染色強度X以該強度染色之 細胞的％)。 在選擇患者進行MTAP缺陷癌症之治療時，較佳的長 數為大約50,更佳的是大約2〇，而再更佳的是大約5或更低。 使用這些方法，使用由融合瘤細胞株ATCC 5〇〇ι產生的 抗-MTAP單株抗體6.9，測試42個已經固定的肺癌樣本。在 42個樣本中，7個顯示強（3+)染色，15個顯示中等的（2 + )染 色，且10個顯示弱（1+)染色。在1〇個肺癌樣本中，觀察到 贅生細胞沒有染色（表1)。 使用抗-MTAP單株抗體6·9，測試17個胰臟癌樣本。丨二個 樣本顯不中等至強的（2_3+)染色，而5個樣本顯示沒有贅生 細胞的染色（表1)。 8個受試的肉瘤，均對抗—ΜΤΑρ單株抗體為陽性染色。染 色強度的範圍是從弱（1+)至強（3 + )染色。5個平滑肌肉瘤均 為抗-MTAP單株6.9陽性染色的，強度範圍是從弱（1+)到強 (3 + )。測試2個脂肉瘤，都沒有顯示贅生細胞的染色。以抗 -MTAP單株抗體6.9測試一個骨骼外的骨肉瘤，並顯示贅生 細胞的弱（1+)染色。測試2個滑液肉瘤樣本；一個顯示贅生 細胞的中等（2+)染色，而另一個顯示贅生細胞的弱（丨+)染色 (表 1)。 在腦腫瘤中，利用抗-MTAP單株抗體6·9分析46個腫瘤試 樣，4個顯示強（3 + )染色，5個顯示贅生細胞的中等（2 + )染 91202.doc -55- 200427463 色，8個顯示贅生細胞的弱（1+)染色，而29個顯示沒有贅生 細胞的染色。 在每個染色實驗期間，均包括陽性和陰性對照組組織。 關於MTAP-陽性組織對照組，使用表現MTAP之細胞株A427 (ATCC)、正常胎盤组織，以及先前已確認其具有表現MTAP 之特徵的腫瘤試樣。在有可能時’亦對腫瘤細胞周圍的正 常細胞評定MTAP陽性的分數。 至於刪除MTAP的組織對照組，使用細胞株A549(以同種 接合子之方式刪除MTAP)(ATCC)，和先前已確認其具有刪 除MTAP之特徵的腫瘤塊。 在涉及包埋於OCT中之冷凍組織的測定中，單株抗體6.9 和雞抗-MTAP多株均無法完成工作。 總之，使用抗-MTAP單株抗體所獲得的資料，與先前在 相同的腫瘤類型中，使用以雜交為基礎之技術，在DNA或 RNA層面檢測MTAP基因的存在或缺乏時，所獲得的報告資 料一致。 表1 細胞染色％ H-分數 组織類型 3+ Sub. 2+ Sub. 1 + Sub. 0 L S 1 骨骼外骨肉瘤 0 0 20 C，N 80 20 20 2 神經膠質瘤 50 C，N 30 C，N 20 C,N 0 230 150 3 神經膠質瘤 0 0 0 100 0 0 4 神經膠質瘤 0 60 C，N 40 C，N 0 160 120 5 平滑肌肉瘤 5 C 45 C 40 C 10 145 15 6 平滑肌肉瘤 5 C，N 15 C,N 70 C 10 115 15 7 平滑肌肉瘤 0 0 10 C 90 10 10 8 平滑肌肉瘤 0 10 C 70 C 20 90 20 91202.doc -56- 200427463 9 組織類型 平滑肌肉瘤 3+ 80 Sub. C，N 知 2+ 20 ϊ胞染爸 Sub. C，N 1 + 0 Sub. 0 0 H- L 280 分數 s 240 10 月旨肉瘤 0 0 0 100 0 0 11 脂肉瘤 0 0 0 100 0 0 12 非-小細胞肺癌 0 60 C,N 40 C，N 0 160 120 13 非-小細胞肺癌 30 N，C 30 N，C 35 C，N 5 185 90 14 非-小細胞肺癌 70 N，C 20 N,C 0 5 250 210 15 非-小細胞肺癌 80 N，C 10 N,C 0 10 260 240 16 非-小細胞肺癌 0 0 0 100 0 0 17 非-小細胞肺癌 0 5 N,C 25 C，N 70 35 10 18 非-小細胞肺癌 40 N，C 30 N,C 30 C，N 0 210 120 19 非-小細胞肺癌 0 60 C,N 40 C，N 0 160 120 20 非-小細胞肺癌 0 0 0 100 0 0 21 非-小細胞肺癌 0 0 0 100 0 0 22 非-小細胞肺癌 0 0 0 100 0 0 23 非-小細胞肺癌 0 40 C,N 60 C,N 0 140 80 24 非-小細胞肺癌 0 0 0 100 0 0 25 非-小細胞肺癌 0 0 30 C,N 70 30 30 26 非-小細胞肺癌 40 C，N 30 C,N 30 C,N 0 210 120 27 非-小細胞肺癌 0 60 C,N 30 C,N 10 150 120 28 非-小細胞肺癌 0 0 0 100 0 0 29 非-小細胞肺癌 10 C，N 60 C,N 30 C,N 0 180 30 30 非-小細胞肺癌 0 60 C,N 40 C,N 0 160 120 31 非-小細胞肺癌 0 30 C,N 70 C，N 0 130 60 32 非-小細胞肺癌 0 0 0 100 0 0 33 非-小細胞肺癌 40 C，N 40 C,N 20 C,N 0 220 120 34 非-小細胞肺癌 0 30 C，N 50 C，N 20 110 60 35 非-小細胞肺癌 0 0 90 C，N 10 90 90 36 非-小細胞肺癌 0 0 0 100 0 0 37 非-小細胞肺癌 0 10 C，N 90 C,N 0 110 20 38 非-小細胞肺癌 0 0 100 C，N 0 100 100 39 非-小細胞肺癌 0 60 C,N 40 C，N 0 160 120 40 非-小細胞肺癌 0 75 C,N 15 C，N 10 165 150 41 非-小細胞肺癌 0 0 100 C 0 100 100 42 非-小細胞肺癌 0 40 C，N 50 C，N 10 130 80 43 非-小細胞肺癌 0 0 0 100 0 0 44 非-小細胞肺癌 0 0 80 C,N 20 80 80 45 非-小細胞肺癌 0 0 60 C,N 40 60 60 9l202.doc -57- 200427463 46 非-小細胞肺癌 0 0 20 N，C 80 20 20 47 非-小細胞肺癌 0 0 40 C，N 60 40 40 48 非-小細胞肺癌 0 10 C,N 70 C,N 20 90 20 49 非-小細胞肺癌 0 0 10 C，N 90 10 10 50 非-小細胞肺癌 0 0 60 N，C 40 60 60 51 非-小細胞肺癌 0 20 C,N 80 N，C 0 120 40 52 非-小細胞肺癌 0 0 0 100 0 0 53 非-小細胞肺癌 0 50 C,N 50 C，N 0 150 100 54 胰臟癌 70 C，N 30 C,N 0 0 270 210 55 胰臟癌 20 N，C 70 C,N 10 C,N 0 210 60 56 胰臟癌 0 0 0 100 0 0 57 胰臟癌 70 C，N 30 C,N 0 0 270 210 58 胰臟癌 0 70 C,N 30 C，N 0 170 140 59 月夷臟癌 0 10 C,N 90 C，N 0 110 20 60 胰臟癌 0 0 0 100 0 0 61 胰臟癌 70 C，N 30 C，N 0 0 270 210 62 胰臟癌 0 0 0 100 0 0 63 胰臟癌 20 C,N 30 C，N 50 C,N 0 170 60 64 胰臟癌 5 C,N 35 C，N 60 C，N 0 145 15 65 胰臟癌 0 10 C，N 90 C，N 0 110 20 66 胰臟癌 0 0 0 100 0 0 67 胰臟癌 50 C’N 40 C，N 10 C，N 0 240 150 68 胰臟癌 0 50 C，N 50 C，N 0 150 100 69 胰臟癌 0 0 0 100 0 0 70 胰臟癌 0 30 C,N 70 C,N 0 130 60 71 肉瘤 20 C 40 C 20 C 20 200 60 72 肉瘤 0 30 C 70 C,N 0 130 60 73 肉瘤 80 C 10 C 10 C 0 270 240 74 肉瘤 0 20 C 80 C,N 0 120 40 75 肉瘤 0 30 C 70 C,N 0 130 60 76 肉瘤 30 C 40 C,N 30 C,N 0 200 90 77 肉瘤 20 C,N 20 C 50 C 10 150 60 78 肉瘤 0 0 90 C,N 10 90 90 79 滑液肉瘤 0 0 70 C,N 30 70 70 80 滑液肉瘤 0 80 C 20 C,N 0 180 160 81 多形性神經膠質母細胞瘤 0 0 90 C1 10 90 90 82 多形性神經膠質母細胞瘤 0 70 C 15 C 15 155 140 83 多形性神經膠質母細胞瘤 0 0 0 100 0 0 84 神經膠質母細胞瘤 0 0 0 100 0 0 91202.doc -58- 200427463 85 多形性神經膠質母細胞瘤 0 0 0 100 0 0 86 多形性神經膠質母細胞瘤 0 0 0 100 0 0 87 多形性神經膠質母細胞瘤 0 0 10 C 90 10 10 88 多形性神經膠質母細胞瘤 5 N，C 5 N，C 85 C 5 110 15 89 多形性神經膠質母細胞瘤 0 0 0 100 0 0 90 多形性神經膠質母細胞瘤 0 0 85 C 15 85 85 91 多形性神經膠質母細胞瘤 0 20 C，N 70 N，C 10 110 40 92 多形性神經膠質母細胞瘤 0 0 0 100 0 0 93 多形性神經膠質母細胞瘤 0 0 0 100 0 0 94 多形性神經膠質母細胞瘤 60 N，C 20 N，C 20 N，C 0 240 180 95 多形性神經膠質母細胞瘤 40 N，C 30 N，C 15 C 15 195 120 96 星狀細胞瘤 0 0 70 C，N 30 70 70 97 星狀細胞瘤 20 N 20 N 30 N 30 130 60 98 退行發育的星狀細胞瘤 0 0 0 100 0 0 99 星狀細胞瘤 0 0 0 100 0 0 100 星狀細胞瘤 0 0 0 100 0 0 101 星狀細胞瘤 0 0 0 100 0 0 102 退行發育的星狀細胞瘤 0 0 0 100 0 0 103 星狀細胞瘤 0 0 5 N,C 95 5 5 104 多形性神經膠質母細胞瘤 0 0 0 100 0 0 105 星狀細胞瘤 0 0 0 100 0 0 106 多形性神經膠質母細胞瘤/ 脊髓細胞類型 0 0 15 N,C 85 15 15 107 退行發育的星狀細胞瘤 0 0 60 N 40 60 60 108 退行發育的星狀細胞瘤 0 0 0 100 0 0 109 星狀細胞瘤 0 0 0 100 0 0 110 退行發育的星狀細胞瘤 0 0 0 100 0 0 111 退行發育的星狀細胞瘤 0 0 50 N 50 50 50 112 退行發育的星狀細胞瘤 0 0 50 N 50 50 50 113 退行發育的星狀細胞瘤 0 0 0 100 0 0 114 退行發育的星狀細胞瘤 0 10 N 80 N 10 100 20 115 退行發育的星狀細胞瘤 0 0 0 100 0 0 116 退行發育的星狀細胞瘤 0 0 0 100 0 0 117 退行發育的星狀細胞瘤 0 0 0 100 0 0 118 退行發育的星狀細胞瘤 0 0 0 100 0 0 119 多形性神經膠質母細胞瘤 5 N 5 N 10 N 80 35 15 120 多形性神經膠質母細胞瘤 0 0 0 100 0 0 121 星狀細胞瘤 0 0 0 100 0 0 122 多形性神經膠質母細胞瘤 0 0 0 100 0 0

9t202.doc -59- 200427463 123 神經膠質瘤 5 ν^γ Cn 非-小細胞肺癌 80 m.c.n Cn 細胞株A427 20 n,c,m Cn 非-小細胞肺癌 0 Cn 細胞株A549 0 JVIC,N 5 n,c,m

"l"表示長，"s"表示短，且”主 、

Cn代表對照組。為不 織元件提供從0到3 +的陽性染色細胞之百分比。 、·' D·針對MTAP缺陷癌症投與藥物

使用在本文中描述的測定，判定癌症的mAP狀雄，可利 用在治療上有效之劑量的藥物、藥物組合，或藥物及/或荜 物或其他判定可用來治療MTAP缺陷癌症的癌症療法（例如 輻射），治療受MTAP缺陷癌症所苦的哺乳動物宿主（例如人 類）。一類治療MTAP缺陷癌症的較佳藥物是抑制重新嘌呤 合成的藥物，包括IMPDH抑制劑。這類藥物的實例為，但 不限於L-亞硝基羥基丙胺酸、丨〇_炔丙基_丨…脫氮雜胺基蝶 呤（PDX)、N-(4-(((2,4-二胺基-6-嗓。定基）甲基）曱胺基）苯甲 驢基）-L-毅胺酸）（胺甲碟吟）、AG2037 (Agouron/Pfizer)、4~ 胺基喋醯基穀胺酸（胺基蝶呤）、2,4-二胺基-5-甲基 -6-[[(3,4,5-三曱氧苯基）胺基]甲基]17奎唾4木（三甲曲沙）、派瑞 曲辛、10-乙基-脫氮雜-胺基蝶呤（依達曲沙）、4’-亞曱基-ίο一 脫氮雜胺基蝶呤（MDAM)、10-炔丙基-5,8-二脫氮雜葉酸 (?00戸）、>^[5-[!^(3,4-二氫-2-曱基-4-氧基喳唑啉-6-基甲 基）-N-曱胺基]-2-噻吩甲醯基-L-穀胺酸（雷替曲賽； ZD1694，拓優得）、n-[4-[2-(2-胺基-3,4-二氫-4-氧基-7H- 9I202.doc -60- 200427463 吡咯并[2,3-d]-嘧啶-5-基）乙基]-苯甲醯基]-L-穀胺酸 (LY231514 ; Lilly)、6-(2、甲醯基-2'莕基-乙基）-2-胺基 -4(3H)-氧基喹唑啉（LL95509)、（6R，S)-5，10-二脫氮雜四氫 葉酸（DDATHF)、4-[2-(2-胺基-4-氧基-4,6,7,8-四氫-311-嘧啶 并[5,4,6][1，4]-噻畊-6-基HS)-乙基]-2,5-噻吩曱醯基胺基 榖胺酸（AG2034)和 N-[5-(2-[(2,6,二胺基-4(3H)_ 氧基嘧 啶-5-基）硫基]乙基）噻吩甲醯-2-基]-L-穀胺酸（AG2009)、 6R2’，5、塞吩基5，10-二脫氮雜四氫葉酸（LY309887)、 (8)-2-[4-[1^-[(3,4-二氩-2,7-二曱基-4-氧基-6-峻哇4木基）曱 基]丙-2-炔基胺基]-2-氟苯曱醯胺基]-4-(1Η-1，2,3,4-四 唑-5-基）丁酸（ZD933 1)、N-[4-[N-[(3,4-二氫-2,7-二甲基-4- 氧基-6-喹唑啉基）甲基]-N-丙_2_炔基胺基ρ孓氟苯甲醯胺 基]-L-穀胺酸（ZM214888)、N⑻-[4_[5_(2,4_二胺基泰雷啶 -6-基）戊-1-块-4-基]苯曱醯基]_Ν(δ)_半鄰苯二甲醯基鳥 胺酸或Ν(α〇-(4-胺基-4-脫氧喋醯基）_Ν(δ)_半鄰苯二甲醯基 -L-鳥胺酸（ΡΤ523)。 包括在本發明範圍内的較佳ΜΤΑρ治療攝生法，是使用，， 解救”劑與重新嗓呤合成抑制劑的組合。解救劑保護正常的 ΜΤΑΡ陽性細胞免於暴露在癌症藥物下，即為重新嘌呤合成 抑制劑。例如，可經由投與ΜΤΑ或在腺嘌呤合成中使用的 適當叉負類似物’保護非-惡性的ΜΤΑρ反應潛能細胞免於 暴路在重新％呤合成抑制劑下的任何影響。關於這一點， 適合使用的化合物包括“丁人、2，_5，_二脫氧腺苷、5，_脫氧腺 甘、2 -脫氧-5-脫氧_5,甲硫基腺苷。然而，將了解ΜΤΑρ反 91202.doc -61 - 200427463 應潛能細胞能夠從f硫基腺誓的代謝中產生腺嗓吟，補充 AMP細胞池，並因此將不會預期以像魏？缺陷細胞一樣的 程度耗盡AMP。 E.用途 本發明提供試劑，將發現在診斷應用上的用途，如同在 本文中另行描述的，或在下文關於診斷套組之說明中的。 可使用針對人類MTAP蛋白質之抗體或其他ΜΤΑρ_結合 劑’純化相對應的MTAP蛋白質。/亦可在言爹斷模式中使用抗 體和其他MTAP-結合劑，使用在本文中描述的方法，判定 =組織試樣或細胞族群中使是否存在或缺乏ΜτΑρ蛋白 質。再者，許多癌症與編碼ΜΤΑρ蛋白質之基因的刪除有關 連’且針對ΜΤΑΡ缺陷腫瘤細胞的療法目前正在發展中。因 此：ΜΤΑΡ_結合劑和在本文中描述的方法，可用來確認將 獲益於設相^ΤΑρ缺陷癌症之治療的患者。此外，因為 許多刪除編碼ΜΤΑΡ之基因的癌症，亦刪除編碼？14和ρΐ6 之基因，故可使用乂丁^^^缺陷細胞的確認，做為pH和 之刪除的代理標記。刪除編碼Pl4、Ρ16和ΜΤΑΡ之基因的腫 瘤’與進行階段的腫瘤有關連。此外，因為一些癌症最初 開始日寸是ΜΤΑΡ陽性的，但稍後變成ΜΤΑΡ陰性的，故在本 文中祂述的ΜΤΑΡ-結合劑具有監視腫瘤進行的用途。 F.套組 本發明亦包括在各種在生物試樣中檢測人類ΜτΑρ蛋白 、存在或缺乏的診斷套組和方法中，使用本發明之抗體。 在试樣中判定人類ΜΤΑΡ蛋白質之存在（高、正常或低表 91202.doc -62- 200427463 =缺乏的套組’通常將包括mtap'结合劑’例如抗體， 含=MTAP蛋白質具有已知的結合親和力。通常將提供 3有试劑之隔間，以及說明書。 =:中經常提供診斷敎的試劑’而得以充分運用測 的破感性。至於本發明，依據測定的性質、草案和標記， 可包括已標示或未標示之MTAP_結合劑。這通常連同不其他 的添加物’如緩衝溶液、穩定劑、信號產生所需的材料， 如酵素的受質，及其類似物。較佳的{，套組亦將含有正 確使用，以及在使用後處置内容物的說明書。套組通常具 有母個有用試劑的隔間。希望以脫水冷;東乾燥粉末 提供試劑’在那裏可利用含水介質重建試劑，提供適當： 度的試劑來進行測定。 許多上文提及之診斷測定的成分，可直接使用不需修 改，亦可以各種方式修改。例如，可藉著共價或非-共價地 連接直接或間接提供可檢測信號的部分，完成標示。在許 多的這些測定中，可直接或間接標示MTAP_結合劑，例如 抗體。直接標示的可能性包括標記基團，如放射性標記， 例如1251、酵素（美國專利第3,645,090號），如過氧化酶和鹼 性磷酸酶，以及能夠監視在螢光強度、波長轉變或螢光偏 振上之改^:的螢光標s己（美國專利第3,940,475號）。間接標 示的可能性包括一個成分的生物素基化作用，接著與偶聯 上文標記基團之一的抗生物素蛋白結合。 可將MTAP蛋白質固定在各種基質上，接著沖洗。適當的 基質包括塑料，如ELISA盤、濾器和小珠。將MTAp蛋白質 91202.doc -63 * 200427463 固定在基質上的方法包括，但不限於直接黏附在塑料上、 使用捕捉抗體、化學偶聯和生物素_抗生物素蛋白。在該方 法中的最後步驟 涉及藉著數種方法之一使蛋白質/抗體複 合物沉澱，包括使用例如有機溶劑，如聚乙二醇，或鹽， 如硫酸銨的那些。其他適當的分離技術包括，但不限於在 R—等人（1984) Clln. Chem· 3〇: 1457-1461 中描述的營光 素抗體可磁化顆粒法，以及在美國專利第七㈣挪號中描 述的雙重抗體磁性顆粒分離。 本^月的3 ^斷觀點，涉及使用本發明之MTap-結 合劑二連同以編碼人類MTAp蛋自f之多彳㈣酸的序列為基 礎之募核甘^或多核荅酸探針。可使用該探針，從懷疑患 有’、4病;兄f列如癌症之患者的試樣中，檢測編碼MTAp 蛋貝的夕核甘酉夂。已經在本文和文獻中討論了 和 DNAm序列兩者的製備、序列的標示，以及序列的較 佳=。募核答酸探針正常應具有至少大約i4個核：y：酸， d疋至V大約丨8個核H而多核#酸探針則可高達數 ^用來松測編碼MTAP蛋白質之多核苷酸的存在或 、車乂‘的养核#酸探針，包括檢測表現序列4、5或8的 探針，或所有三個的組合。 亦期待亦測試复#許 、他* C之定性或定量存在的診斷套組。 診斷或預後可視傲& 為§己之多種指標的組合而定。因此， a j忒^ 5己的組合，例如MTAP、p 1 6、p 14ARF。這類 〇S 〇式劑的組合，例如對MTAP、P16或pl4ARF專一 的結合劑，對絶 、、馬MTAP、pl6、p14am或所有上文提及之 91202.doc -64 - 200427463 組合的多核苷酸專一 MTAP 的 cDNA序歹ij。 的cDNA和蛋白質序歹

的养核七*酸探針。在序列第2號中出示 在序列第3至1〇號中出示pi6和pi4ARF 為了檢測人類MTAP的在λ十从< 们吞在或缺乏，可使用免疫組織化學 染色程序，其利用選擇性έ士人 伴注、，Ό 5人類ΜΤΑΡ的ΜΤΑΡ-結合劑。 可在使用套組的時間之前，先 尤肿奴師遥的试樣包埋在石壞 塊或類似的包埋材料中。士^ 此外’右该試樣不是組織而是血 液、血衆或淋巴液，目丨丨大 貝J 了在使用套組的時間之前，先將試 樣固疋在適當的表面，如玻璃。 雖然在本文中描述的本發明使用抗_人類ΜτΑρ單珠抗 體，熟諳此藝者應了解其亦適用於任何認得待檢測之標靶 分子的拮抗劑。可使用任何的拮抗劑，包括抗原、引子、 核I或其片段，其認得待檢測的特定蛋白質、標記、受體 或抗體，或其片段。因此，熟諳此藝者使用在本文中揭示 的技術可為了其他的ΜΤΑΡ-結合劑，如多株抗體，發展 在包埋組織中檢測人類ΜΤΑρ之存在或缺乏所需的條件。 存放 於2003年2月Π日將融合瘤細胞株6·9存放在美國典型择 養物收集中心（American Type Culture c〇iiectlon) (ATCC) 10 801 UniVersity B〇ulevard，Va· 2〇u〇_22〇9 u s A，並給予 ATCC專利存放指定編號PTA-5001。 申睛者的受託人，Salmedix，Inc•表示atcc是提供永久存 放的保官處’且若核准該專利，可公開迅速地進入。所有 對如此存放之公共材料利用性的限制，當核准該專利時， 91202.doc -65 - 200427463 將不可改變地移除。在審而未結該專利申請案的期間内， 將由賦與資格的處長依37 CFR §1.14和35 USC §122來判 定。將小心地維持所存放之材料，以便在最近要求供給存 放抗體之試樣之後的至少5年内，且無論如何，在存放曰期 之後至少30年的期間内，或專利的可執行壽命内，無論哪 一個期間較長，保持其存活且不受污染。申請者的受託人 承認其將存放物放回保管處的義務，因為存放的條件，不 能在要求時供給試樣。

實例1選殖人類MTAP eDNA 利用 RNA STAT-60™ (Tel-Test B，Inc.，Friendswood， TX)，從A427細胞（獲自美國典型培養物收集中心；Rocville， MD)中分離總RNA，並使用Superscript前擴大系統（Life Technologies)轉錄成cDNA。使用聚合酶連鎖反應（PCR)擴 大MTAP cDNA。用來擴大MTAP的引子為：有意義5’-CTC GCC CAC TGC AGA TTC CTT TCC CGT-3,（序歹U 第 11 號）； 反義：5，-GGC AGC CAT GCT ACT TTA ATG TCT TGG-3,（序 列第12號）。 在25微升含有1微克轉錄cDNA、lxPCR緩衝溶液[1〇 mM Tris-HCl (pH 8.0)，50 mM KC1，1·5 mM MgCl2和 0·0001〇/ο 明 膠]、脫氧核苷三磷酸各400 μΜ '有意義和反義引子各50 毫微克，和2·5單位Taq聚合酶（Stratagene，La Jolla，CA)的反 應混合物中進行PCR擴大作用。利用可程式化的循環反應 器（GeneAmp PCR 系統 9600 ; Perkin Elmer，Norwalk，CT)進 行30次循環。每個循環包括在94°C下變性1分鐘，在55°C下 91202.doc -66- 200427463 黏接1分鐘，並在72°C下延伸1分鐘。 將MTAP cDNA插入表現載體pQE-32(Qiagen)内。藉著以 Hindlll消化質體DNA判定插入物的方位。 實例2-表現並純化人類MTAP蛋白質 如下使用QIAexpress表現系統（Qiagen)純化蛋白質：以攜 帶人類MTAP cDNA的質體pQE-32轉化大腸桿菌品系M15 [pREP4] ’並在3公升含有100微克/毫升氨爷青黴素和25微 克/毫升康黴素之LB培養基中生長，加以震盪，直到達到 0.434之〇队⑽為止。然後，加入iptG(異丙基-/3-吡喃半乳糖 硫苷）至2 mM之終濃度，並使培養物在37°C下生長並震盪5 小時。藉著以4000 xg離心20分鐘，收穫細胞。將細菌細胞 小球再懸浮於30毫升超音波緩衝溶液[50 mM NaH2P〇4 pH 8.0,300 mMNaCl，10mM2-巯基乙醇和1 mM苯曱基磺醯氟 (PMSF)]中，並在冰上培養3〇分鐘。將懸浮液冷凍在液態^^ 中，並儲存在-8(TC下過夜。

在冰上將試樣融解，並使用Branson Sonifier 450超音波 儀’以50%脈衝超音波震盪2-5分鐘。然後以3〇,〇〇〇 g離心試 樣刀4里並收集上清液’以0.2微米遽紙（Corning)過遽。 在渡液中加入已經利用超音波緩衝溶液預先-平衡過的2〇 宅升ΝρΝΤΑ樹脂（Qiagen)。在4。〇下混合6〇分鐘，並裝入沁2 + 次氣基乙酸瓊脂糖管柱内。再度將流通裝載至管柱上。以 少於0·5毫升/分鐘之流速，利用1〇〇毫升超音波缓衝溶液沖 洗苔柱直到流通〇D28〇低於〇·〇 1毫升/分鐘為止。以1 60毫 升沖洗緩衝溶液[50 mM NaH2p〇4 pH 5.9, 1M NaCl，1 mM 91202.doc -67- 200427463 PMSF，10%甘油]沖洗管柱。以20毫升含有0·5 Μ咪唑的超 音波緩衝溶液洗脫已經結合的蛋白質。移除咪唑，並使用 Centriprep 10 (Amicon)濃縮蛋白質。 實例3-融合瘤和單株抗體純化 A.共同的方法和材料 材料· 細胞培養基 DME-HY ： DMEM帶有4.5克葡萄糖/公升（Sigma HybriMax®) 350毫升 胎牛血清（Hy cl one Characterized或更佳的） 100毫升 NCTC 109培養基（Sigma N-1140或相等物） 50毫升 100X OGI溶液： (3 mM草醯乙酸、鈉鹽[Sigma HybriMax®]、約6-7單位/毫 升牛騰島素[Sigma HybriMax®、9·2 μΜ 甘胺酸[Sigma G-7126] 5毫升 1 0OX L -榖胺酿胺溶液（20OmM，Sigma HybriMax®) 5 毫升 DME-HAT ： 10 毫升 50X HAT 補充物（Sigma HybriMax®)在 500 毫升 DME-HY 中 DME-HT ： 10 毫升 50X HT 補充物（Sigma HybriMax®)在 500 毫升 DME-HY 中 ELIS A試劑： 1.碳酸鹽-碳酸氫鹽塗料緩衝膠囊（Sigma)。 91202.doc -68- 200427463 2.親和力純化，AP共軛的山羊-抗-老鼠抗體（KPL， Gaithersburg, MD) 3·對-硝基酚磷酸鹽（pNPP)受質（Sigma，20毫克/錠） 4. Dynex Immulon-4培養盤：96-孑L培養盤或12-孔 removawell® 長條和架座之架構（Dynex，Chantilly，VA)。 5. 展開緩衝溶液：1 Μ二乙醇胺（Fisher)，0.5 mM MgCl2， pH 9·8 〇 6. 篩選ELIS Α培養盤製備物：將經過純化的重組ΜΤΑΡ蛋白 質（500毫微克/孔）吸附在微量滴定盤上，在4°C下在碳酸/ 碳酸氫鈉中過夜，然後利用含有1%牛血清白蛋白（BSA) 的磷酸-緩衝生理鹽水（PBS)緩衝溶液阻斷非專一性的結 合。在阻斷之後，將培養盤儲存在-20°C下直到使用為止。 方法：

ELISA 將稀釋的抗血清加至ELIS A培養盤上，並在室溫下培養1 小時。在培養之後，以PBS沖洗培養盤3次，移除任何未結 合的血清蛋白質。在培養盤中加入驗性-磷酸酶共|厄的抗-老鼠二級抗體，並在室溫下繼續培養。在二級抗體培養結 束時，以PBS沖洗3次，移除非-專一的二級抗體。然後，加 入比色受質（對-硝苯基磷酸酯，PNPP)，並在5-30分鐘之後 利用微量滴定盤讀取器分析該培養盤。 西方墨點法 藉著12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE)分級分離重組的MTAP蛋白質（如同在本文中討論 91202.doc -69- 200427463 的），並移至0.22微米-硝基纖維素膜上。在沾染之後，在室 溫下以Tns-緩衝之生理鹽水-吐溫20緩衝溶液（TBST)加5% 脫脂奶粉（TBST-M)阻斷該膜30分鐘。欲判定抗體專一性， 以TBST-Μ稀釋抗血清，並加至硝基纖維素膜。在室溫下培 養1小時之後，藉著以TBST沖洗3次移除未結合的抗體和血 清蛋白質。在膜中加入驗性-礙酸酶（AP)共耗之抗-老鼠二級 抗體，培養額外的1小時，並藉著加入AP受質BCIP/NBT使 蛋白質信號呈現。 B.融合瘤融合與分離 以上文產製的人類MTAP蛋白質（包括His標籤）免疫總共5 隻老鼠。一開始，藉著皮下注射，使每隻動物接受50微克 與完全弗瑞德氏佐劑（CFA)混合的經過純化之重組蛋白 質。後續的”補強”免疫，以2-週之間隔，使用在不完全弗瑞 德氏佐劑（IFA)中相同量的抗原，總共進行四次補強。在總 計5次注射之後，使用反應最好的老鼠（藉著按照下述之多 株抗血清的分析判定）進行單株抗體產製。 多株抗血清分析 在第二次補強注射和每次後續的注射之後5天，藉著割傷 眼睛後的靜脈，從每隻經過免疫的老鼠中收集血液。藉著 使用microtainer®旋轉管柱（Becton Dickinson)分離血液細 胞，製備多株抗血清。主要藉著按照上述經由酵素-連接之 免疫吸附測定（ELIS A)篩選抗血清，並藉著利用重組蛋白質 之西方墨點法判定抗血清的專一性，監視專一之多株抗體 的力價。 91202.doc -70- 200427463 給予反應最好的老鼠（以藉著ELIS A判定之抗-MTAP多株 抗血清力價為基礎）額外的免疫，不需佐劑，藉著尾靜脈注 射來遞送。在最後注射之後三天，犧牲老鼠並收集脾臟細 胞，按照在本文中的描述進行融合瘤融合。 融合瘤融合 藉著聚乙二醇（PEG)-調解的細胞融合方法，產製融合瘤 細胞。所有的溶液均在使用之前才預先-加溫至37°C。藉著 離心收集得自免疫老鼠的脾臟細胞和骨髓瘤NS 1細胞，並以 DMEM沖洗三次。在最後一次沖洗之後，在一個試管中混 合細胞，並藉著抽吸移除任何微量的DMEM，但不弄亂細 胞小球。在1分中間隔内以逐滴之方式，在細胞小球中加入 1毫升50% PEG溶液，並恆定地混合。在攪拌額外的1分鐘 之後，在2 -分鐘的期間内，在細胞混合物中逐漸加入2毫升 DMEM，並恆定地混合，然後在3分鐘内慢慢地加入7毫升 DME-HY使融合反應中止。藉著低-速離心收集融合的細 胞，然後再懸浮於DME-HAT中，以每孔200微升平舖在96-孔培養盤中。 單株抗體篩選 在HAT選擇12-14天之後，首先針對與先前已經塗覆重組 蛋白質之培養盤的反應性，按照上述藉著ELISA篩選所得 的融合瘤上清液。最初確認25個ELISA-陽性的純種系。使 這些純種系在DME-HT培養基中繁殖，並藉著ELIS A再度測 試，以便證實陽性結果，並從初步篩選中排除任何假-陽性 的純種系。在第二次篩選之後，總共確認16個ELISA-陽性 91202.doc -71 - 200427463 融合瘤。在DME-HY培養基中進一步擴展這些陽性融合瘤 純種系，並將細胞保存在液態氮中，未來可供進行單-細胞 選殖。從這些培養物中收集上清液，以便進一步篩選並按 照下述定出特徵。 欲檢查抗體的專一性，將得自MTAP·•表現細胞（白血病 M〇LT-4[ATCC]矛口肺癌A427[ATCC])萍口 MTAP-冊ij除細月包（白 血病JURKAT[ATCC]和肺癌A549[ATCC])的溶胞產物免疫 沾染在P VDF或墙基纖維素膜上。將該膜與得自融合瘤的上 清液（稀釋1:2和1:10) —起培養，並藉著化學發光，使用與 辣根過氧化酶（HRP)共軛的二級抗_老鼠抗體，接著與化學 發光受質一起培養，顯示反應譜帶。MTAP-專一性抗體， 僅在MOLT-4和A427跑道中，在30-35 kDa之約略分子量處 顯示MTAP譜帶，但在含有JURKAT或A549溶胞產物的跑道 中則無。使用完整的細胞溶胞產物確認MTAP-專一性抗 體，具有容許檢測可能與不相關之蛋白質產生交叉反應性 的優點。使用該篩選確認出的最佳上清液是純種系6。 單細胞選殖 選擇純種系6進行單-細胞選殖，產製抗-MTAP多株抗 體。使得自純種系6之親代融合瘤細胞從冷;東母液中生長， 並收集上清液，再度藉著ELISA測試。使用連續-稀釋法來 進行單-細胞選殖。簡言之，計算融合瘤細胞的數目，並以 每孔1、0.5和0.1個細胞的濃度，平舖在總共10個9 6 -孔培養 盤上。一開始再度針對經過純化的MTAP蛋白質，藉著 ELISA篩選從單細胞生長的純種系，然後藉著在MTAP-表現 91202.doc -72- 200427463 和MTAP-刪除細胞上的免疫墨點法，按照上述測試，確保 抗體之專一性和反應性就像在親代融合瘤中看到的。在藉 著西方墨點分析篩選之後，總共選出4個衍生自親代純種系 6的繼代-純種系（純種系6.9、6.11、6.22和6.23)(圖1)。分別 培養擴展這四個繼代純種系至較大的含量，然後在液態氮 中冷凍，保存產生抗體的細胞株。為了最後的測試收集組 織培養上清液，使用已經描述過的免疫墨點技術。確認純 種系6.9具有可接受的特性。其強有力地認出在預期分子量 處的MTAP譜帶，僅在MTAP_表現細胞m〇lT-4和A427中， 但在MTAP-刪除細胞JURKAT和A549中則否。其顯示高專一 性和低背景，並與非-專一性之譜帶有很少的交又-反應。 單株抗體純化 從純種系6.9中收集組織培養上清液，並藉著蛋白質匕親 和力層析法純化抗-MTAP單株抗體。簡言之，在裝入蛋白 貝-G官柱之前，藉著高速離心接著超-過濾（〇·22微米濾

紙），清除上清液中的細胞碎屑。在抗體結合之後，以pBS 冲洗g柱，移除任何出現在上清液中之非-專一性抗體和未 結合的蛋白質。藉著Oj M甘胺酸溶液（pH2 8)洗脫抗_ΜτΑρ 單株抗肢，並收集含有抗體的溶離份，在4艺下對ρΒ$廣泛 地透析。藉著UV(280毫微米）吸光度判定經過純化之抗體的 終濃度。 貫例4-免疫組織化學法 A.試劑 以3.3耄克/耄升之母液濃度，將人類IgG!同型物的老鼠單 91202.doc -73 - 200427463 株抗-MTAP抗體，純種系6.9儲存在下。將一等份單株 抗體儲存在2-8°C下最多4週。 老鼠單株抗-MTAP抗體的陰性對照組是老鼠 (Sigma-Aldnch)。收到在乾冰上的抗體，母液濃度為i毫克k /¾升，並等分成數份儲存在-2〇它下。將4〇微升之等份儲存 在-20°C下。當融解時，將其儲存在2_Γ(：最多1週。 因為MTAP出現在所有正常的組織中，理想的對照組織將 是其中已經刪除該基因者。研究暗示非_小細胞肺癌的案例 中有相當大的百分比具有刪除的M TA p基因，並因此將預期 在MTAP免疫組織化學測定中是陰性的。選擇兩個非-小細 胞肺癌做為對照組：-個的細胞中出現^^，並可經由免 疫組織化學法檢測；而另—個已經從細胞中刪除祕卜且 經由免疫組織化學法沒有檢測到。額外的陽性對照组包括 包埋綱塊中的表現MTAp之人類非_小細胞輪427 (ATCC)。亦使用石蠟包埋、MTAp_刪除之人類非-小細胞肺 癌A549(ATCC)做為另一個陰性組織對照組。 陰性試劑對照組是物種-和同型物_相配的抗體，在與初級 抗體相同的組織上’以相同的濃度執行。 測試系統 使用獲自手術或屍體解剖之經過固定、石壤_包埋的人類 組織樣本。將樣本切成5微米，放在帶正電荷的玻片 SCientlflG)上，風乾並鍺存在室溫下，直到需要為止。受檢 查的樣本為：42個非-小細胞肺癌、17個胰臟癌、8個肉瘤、 5個平滑肌肉瘤、2個脂肉瘤、1個骨肉瘤、2個滑液肉瘤、3 9I202.doc -74- 200427463 個神經膠質瘤、2〇個神經膠質母細胞瘤和22個星狀細胞瘤。 前處理 使用做為組織對照組的非-小細胞肺癌，以及陽性和陰性 '、、、、且、、、田胞株，進行前處理分析。在該分析中，使用1 〇微 克7毫升的老鼠單株MTAP抗體測試下列的前處理： 1.未處理 2·皂角菩（Sigma)3.H.I.E.R·(熱-誘導之抗原決定位恢復；壓力鍋，kveal) l2〇C，3分鐘，接著以胰蛋白酶（sigma)處理5分鐘 4.H.I.E.R·(壓力锅，BORG) 120°c，3分 白酶處理5分鐘 5. H.I.E.R.(壓力鍋 白酶處理5分鐘 6· H.I.E.R.(壓力鍋 白酶處理5分鐘 7· H.I.E.R.(壓力锅 白酶處理1分鐘 8· H.I.E.R.(壓力鍋 白酶處理1分鐘 接著以胰蛋

Reveal) 951，60分鐘，接著以胰蛋 B〇RG)95t ’60分鐘’接著以胰蛋

BORG) 120°C 3 0分鐘Ab培養 BORG) 120°C 1小時Ab培養 9. H.I.E.R.(壓力锅，Reveai) i2〇°C 白酶處理1分鐘，2小時Ab培養 由於前處理分析的結果，選擇H.i.e.r·(壓力 1 20 C下3分鐘，接著以胰蛋白酶處理1分鐘 理，並在其餘的研究中使用。 3分鐘，接著以胰蛋 3分鐘，接著以胰蛋 3刀在里，接著以胰蛋 鍋’ b〇rg)在做為標準前處 9l202.doc -75 - 200427463 滴定 為了檢測抗原的過度表現，選擇MTAP結合劑力價做為最 低的濃度，其產生染色強度和陽性染色細胞之百分比的最 南組合，同時使背景染色減至最低。因為該測定的目的是 檢測起因於基因刪除的蛋白質缺乏，故選擇較高力價的 ΜΤΑΡ-結合劑，使可能的彳段陰性減至最彳&。選擇適合該測 σ式的力價’做為抗原結合劑的最南濃度，其產生最強的染 色’同時使同型物和基質背景染色減至最低。 利用在固定、石蠟-包埋之樣本上的老鼠抗—MTAP單株抗 體’進行滴定分析。一開始，在陽性和陰性細胞株對照組， 以及組織對照組（胎盤）上，測試五個-連續稀釋（2〇微克/毫 升、10微克/毫升、5微克/毫升、2.5微克/毫升、丨.25微克/ 毫升）。使用刪除ΜΤΑΡ的非-小細胞癌細胞株，使用五個_ 連續稀釋（80微克/毫升、40微克/毫升、20微克/毫升、1〇微 克/毫升和5微克/毫升），進行滴定分析。以這些研究為基 礎’選擇2 0微克/愛升的初級抗體（和陰性試劑對照組）力 價，進行其餘的研究。 免疫組織化學法 所有老鼠單株ΜΤΑΡ抗體的免疫組織化學測定均使用

Mouse EnVision+TM 套組（DAKO Corporation，Carpintena CA) ’根據製造者的說明書進行。關於石犧包埋的樣本，在 至少60分鐘之後，從在6〇t烘箱的培養中移出含有超薄切 片機-切開之切片的玻片，並冷卻至室溫。在二曱苯和階梯 式的乙醇中將玻片脫石蠟’以流動的水沖洗，並以去離子 91202.doc -76- 200427463 水沖洗三次。至於H.I.E.R·，在120°c的壓力鍋（BORG)中培 養玻片3分鐘，接著以胰蛋白酶處理i分鐘，然後以pBS(磷 酸緩衝之生理鹽水；DAK〇 Corp.)沖洗3次。利用在 EnV1S1〇n + TM套組中所含有的過氧化氫溶液中培養5_分鐘， 接著以PBS沖洗三次，阻斷内源過氧化氫酶活性。然後在室 溫下’將玻片與20微升/毫升的初級抗體（或適當的陰性試劑 對照組）一起培養30分鐘。以PBS沖洗玻片三次，並在室溫 下與得自EnVmon+頂套組之已標示的聚合物一起培養3〇 分鐘。接著以PBS沖洗三次，藉著與3,3，_二胺基聯苯胺四鹽 酸鹽溶液（DAKO Corp·) —起培養5分鐘，使過氧化酶反應呈 像。以自來水徹底沖洗組織切片，以哈里斯（Hams)蘇木素 浴液（不含汞）（Fisher-目錄第245-678號）進行對比染色，浸 在0.25%酸性醇中，在〇.2%氨中變藍，經由階梯式的乙醇脫 水，在二甲苯中變為澄清，並蓋上蓋玻片。 按照在本文中的描述，進行染色玻片的說明。計分系統 包括染色強度的分析。相對於含有以陰性對照組抗體染色 之相鄰切片的對照組玻片的強度，判斷受試物件的染色強 度，。將以陰性試劑對照組標示之切片的染色視為"背景"。 ” 表示相對於背哥盔举多。 ^ 月厅、…木邑 14·’丨表示弱染色。”2 + ”表示中 等的染色，而丨丨3 + ”表示強染多广失 ^ 邑（苓見表1)。以在所有元件中 觀察到的最高階級之強度來. 水報告染色強度，除了其中報告 延長計分計劃的特殊組織元 、凡件之外。按照在本文中的描 迷’使用MlcrosoftExcem行敘述統計。 結果 9l202.doc -77. 200427463 關於所有的結果（表1)，’，C”代表細胞質染色，MM"代表膜 ^色 且N代表核染色。為不同的組織元件提供從〇到3 + 的陽性染色細胞之百分比（表丨）。 在表1中顯示的資料，與先前在相同的腫瘤類型中，使用 以雜交作用為基礎之技術，在DNA或RNA層面檢測MTAp 之存在或缺乏所獲得的報告資料一致。 當在包埋在OCT化合物中之冷凍人類組織上，使用間接 免疫組織化學技術，測試三個對人類MTAP之抗-MTAP抗體 (純種系6.9，以及雞多株抗體之經過純化和未經純化的版 本）時，抗體都無法完成測試。 實例5-判定對抗人類MTAp蛋白質或其片段之抗體的抗原 決定位重疊 進行；％爭性酵素免疫測定，檢測抗體與由融合瘤細胞株 ATCC PTA-5001產生之單株抗體的抗原決定位重疊。關於 忒測疋’根據製造者的說明書，使用D_生物素基-卜醯胺基 己酉义-N-羥基琥珀醯亞胺酯（R〇che以叫加也以GmbH，目錄 第1 008 960號），將如同在本文中描述之重^τΑρ蛋白質 生物素基化。藉著在室溫下培養i小時，使綱毫微克的該 生物素基化之抗原’在⑽微升體積之pBs中，與鏈黴菌抗 生物素蛋白-塗覆的微量滴定盤(根據歐洲專利_A〇 344 Μ PBS/0.05%吐溫20沖洗 產製）結合。在以PBS/0.05%吐溫2〇冲洗四次之後，在室溫 下將其與利用過氧化酶（終濃度25〇毫單位/毫升）標示之單 株抗體6·9與待評估之抗體同時培養9G分鐘。再度以 四次之後，在室溫下將其與在含有過 91202.doc -78- 200427463 石朋酸鈉之緩衝溶液中的酵 束又貝/合液ABT® —起培養3〇分 隹里’隨後測量在405臺判^ 辨_ αα 在笔❹處的吸光度，做為已結合POD- 示不之早株抗體6 · 9之含量的、、目丨|旦乂古 〇 的測里值。將该值與在單獨培養 2抗體6·9時所獲得的值相比較。當在相對於單株抗體6.9 酵素-共輕物⑽毫單位/毫升），待評估之抗體的iq5•倍過量 處可檢測到至少50%的競爭時， — t 出現抗原決疋位的重疊。 實例6-藉著ELISA和免疫墨點半，泠剩> 几汉土 ”，、£/*，繪製抗-MTAP單株6.9抗 體抗原決定位之與圖 ，利用各種蛋白水解酵素（在個別的實驗中）消化重組的人 類ΜΊΓΑΡ蛋白質。關於胰蛋白酶消化，在坑下，在 如娜^福⑽㈣…^:丨之酵素對受質比例， ^于重組人類MTAP蛋白質的部分消化4小時。#著在各種 時間點監視消化的量，判定消化的時間。在非.還原和還原 (按照上述）SDS-PAGE兩者上，跑消化產物和對照組。關於 非還原綾膠，在12.5%(重量/體積）天然聚丙烯醯胺凝膠上 跑在蛋白水解消化作用之後獲得的片段。在分離之後，將 重組的蛋白質和經過消化的片段移至〇·22微米的硝基纖維 素膜上。按知、上述，利用抗-ΜΤΑρ單株抗體6.9探測墨點。 其他的具體實施例 本杳明不叉限於在本文中描述的那些具體實施例，但可 包括不達背本發明之精神及範圍的修改和變化。雖然已經 連同其特定之具體實施例描述本發明，但熟諳此藝者應了 解更進一步的修改亦在下列申請專利範圍的範圍内。此 外，在XI裡自馬庫（Markush)分類或其他別種分類的觀點說 9l202.doc -79· 明本發明之特徵或觀點，但熟说 茲山W 、口日匕毒者將承認本發明亦 猎此攸馬庫分類或種類的任何 可 十 彳成員或成員亞組之觀％ 來况明，並適當地排除個別的成員。 規”·、占 【圖式簡單說明】 本專利申請案含有至少-個以彩色製作的圖片。將在要 求亚支付必要的費用時，由美國專利和商標局（u s. and Trademark Off1Ce)提供具有彩色圖片之本專利申請公 開案的副本。 圖1敘述使用由融合瘤純種系6之四個繼代純種系所產生 的抗體，人類MTAP蛋白質的西方墨點。 圖2敘述使用由融合瘤細胞株PTA-5001產生之抗-MTAP 單株抗體，石蠟-包埋之多形性神經膠質母細胞瘤的免疫組 織化學墨點。 91202.doc -80- 200427463 序列表 <110> 美商沙美迪克斯公司 <120> 檢測及治療甲硫基腺荅磷酸化酶缺陷癌症之組合物及方法 <13〇> 076936-0308298 <14〇> 093103502 <141> 2004-02-13 <150> 60/460,715 <151> 2003-04-04 <150> 60/447,888 <151〉 2003-02-14 <160> 12 <170> ?汪1611红11版本3.2 <210> 1 <211> 283 <212>蛋白質 <213>人類 <400> 1

Met Ala Ser Gly Thr Thr Thr Thr Ala Val Lys lie Gly lie lie Gly 15 10 15

Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Glu lie Leu Glu Gly Arg Thr Glu Lys 20 25 30

Tyr Val Asp Thr Pro Phe Gly Lys Pro Ser Asp Ala Leu lie Leu Gly 35 40 45 *

Lys lie Lys Asn Val Asp Cys lie Leu Leu Ala Arg His Gly Arg Gin 50 55 60

His Thr lie Met Pro Ser Lys Val Asn Tyr Gin Ala Asn lie Trp Ala 65 70 75 80

Leu Lys Glu Glu Gly Cys Thr His Val lie Val Thr Thr Ala Cys Gly 85 90 95 91202 200427463

Ser Leu Arg Glu Glu lie Gin Pro Gly Asp lie Val lie lie Asp Gin 100 105 110

Phe He Asp Arg Thr Thr Met Arg Pro Gin Ser Phe Tyr Asp Gly Ser 115 120 125

His Ser Cys Ala Arg Gly Val Cys His lie Pro Met Ala Glu Pro Phe 130 135 140

Leu Arg Cys His Ser Lys Gly Thr Met Val Thr lie Glu Gly Pro Arg 165 170 175

Phe Ser Ser Arg Ala Glu Ser Phe Met Phe Arg Thr Trp Gly Ala Asp 180 135 190

Val 工le Asn Met Thr Thr Val Pro Glu Val Val Leu Ala Lys Glu Ala 195 200 205

Gly lie Cys Tyr Ala Ser lie Ala Met Ala Thr Asp Tyr Asp Cys Trp 210 215 220

Lys Glu His Glu Glu Ala Val Ser Val Asp Arg Val Leu Lys Thr Leu 225 230 235 240

Lys Glu Asn Ala Asn Lys Ala Lys Ser Leu Leu Leu Thr Thr lie Pro 245 250 255

Gin lie Gly Ser Thr Glu Trp Ser Glu Thr Leu His Asn Leu Lys Asn 2β0 265 270

Met Ala Gin Phe Ser Val Leu Leu Pro Arg His 275 280 9 6A頻 2 N ^ 2 2 da >>>> 0 12 3 I—- ΊΧ f—I I-*-2 2 2 2 < < < < <4〇0> 2 gaattccgct ccgcactgct cactcccgcg cagtgaggtt ggcacagcca ccgctctgtg 60 gctcgcttgg ttcccttagt cccgagcgct cgcccactgc agattccttt cccgtgcaga 120 catggcctct ggcaccacca ccaccgccgt gaagattgga ataattggtg gaacaggcct 180 200427463 ggatgatcca gaaattttag aaggaagaac tgaiaaaatat gtggatactc catttggcaa 240 gccatctgat gccttaattt tggggaagat aaaaaatgtt gattgcatcc tccttgcaag 300 gcatggaagg cagcacacca tcatgccttc aaaggtcaac taccaggcga acatctgggc 360 tttgaaggaa gagggctgta cacatgtcat agtgaccaca gcttgtggct ccttgaggga 420 ggagattcag cccggcgata ttgtcattat tgatcagttc attgacagga ccactatgag 480 acctcagtcc ttctatgatg gaagtcattc ttgtgccaga ggagtgtgcc atattccaat 540 ggctgagccg ttttgcccca aaacgagaga ggttcttata gagactgcta agaagctagg 600 actccggtgc cactcaaagg ggacaatggt cacaatcgag ggacctcgtt ttagctcccg 660 ggcagaaagc ttcatgttcc gcacctgggg ggcggatgtt atcaacatga •ccacagttcc 720 agaggtggtt cttgctaagg aggctggaat ttgttacgca agtatcgcca tggcgacaga 780 ttatgactgc tggaaggagc acgaggaagc agtttcggtg gaccgggtct taaagaccct . 840 gaaagaaaac gctaataaag ccaaaagctt actgctcact accatacct'c agatagggtc 900 cacagaatgg tcagaaaccc tccataacct gaagaatatg gcccagtttt ctgttttatt 960 accaagacat taaagtagca tggctgccca ggagaaaaga agacattcta attccagtca 1020 ttttgggaat tcctgcttaa cttgaaaaaa atatgggaaa gacatgcagc tttcatgccc 1080 ttgcctatca aagagtatgt tgtaagaaag acaagacatt gtgtgtatta gagactcctg 1140 aatgatttag acaacttcaa aatacagaag aaaagcaaat gactagtaaa catgtgggaa 1200 aaaatattac attttaaggg ggaaaaaaaa aaccccacca ttctcttctc cccctattaa 1260 atttgcaaca ataaagggtg gagggtaatc tctactttcc tatactgcca aagaatgtga 1320 ggaagaaatg ggactctttg gttatttatt gatgcgactg taaattggta cagtatttct 1380 ggagggcaat ttggtaaaat gcatcaaaag acttaaaaat acggacgtcc tttggtgctg 1440 ggaactctac atctagcaat ttctctttaa aaccatatca gagatgcata caaagaatta 1500 tatataaaga agggtgttta ataatgatag ttataataat aaataattga aacaatctga 1560 atcccttgca attggaggta aattatgtct tagttataat ctagattgtg aatcagccaa 1620 ctgaaaatcc tttttgcata tttcaatgtc ctaaaaagac acggttgctc tatatatgaa 1680 gtgaaaaaag gatatggtag cattttatag tactagtttt gctttaaaat gctatgtaaa 17 40 tatacaaaaa aactagaaag aaatatatat aaccttgtta ttgtatttgg gggagggata 1800 91202 1360 200427463 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2269 ctgggataat ttttattttc tttgaatctt tctgtgtctt cacatttttc tacagtgaat ataatcaaat agraaagggc cgtaaaaata aaagtggatt tagaaagatc cagttcttga aaacactgtt tctggtaatg aagcagaatt taagttggta atattaaggt gaatgtcatt taagggagtt acatctttat tctgctaaag aagaggatca ttgatttctg tacagtcaga acagtacttg ggtgtgcaac agctttctga gaaaagctag gtgtataata gtttaactga aagtttaact atttaaaaga ctaaatgcac attttatggt atctgatatt ttaaaaagta atgtgagctt ctccttttta tgagttaaat tattttatac gagttggtaa tttgtgcctt ttaataaagt ggaagcttgc tttttaaaaa aaaaaaaaaa gcggaattc <210> 3 <211> 156 <212〉 蛋白質 <213〉 人類 <400> 3

Met Glu Pro Ala Ala Gly Ser Ser Met Glu Pro Ser Ala Asp Trp Leu 1 5 10 15

Ala Thr Ala Ala Ala Arg Gly Arg Val Glu Glu Val Arg Ala Leu Leu 20 25 30

Glu Ala Gly Ala Leu Pro Asn Ala Pro Asn Ser Tyr Gly Arg Arg Pro 35 40 45 lie Gin Val Met Met Met Gly Ser Ala Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu 50 55 60

Leu His Gly Ala Glu Pro Asn Cys Ala Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg 65 70 75 80

Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val 85 90 95

Leu His Arg Ala Gly Ala Arg Leu Asp Val Arg Asp Ala Trp Gly Arg 100 105 110

Leu Pro Val Asp Leu Ala Glu Glu Leu Gly His Arg Asp Val Ala Arg 115 120 125 91202 -4- 200427463

Tyr Leu Arg Ala Ala 130

Ala Gly Gly Thr Arg 135

Gly Ser Asn His Ala Arg 140 lie Asp Ala Ala 145

Glu Gly Pro Ser Asp 150 lie Pro Asp 155 <21〇> 4 <211> 1218 <212> DNA <213〉人類 <4〇0> 4 cccaacctgg ggcgacttca ggtgtgccac attcgctaag tgctcggagt taatagcacc 60 tcctccgagc actcgctcac ggcgtcccct tgcctggaaa gataccgcgg tccctccaga 120 ggatttgagg gacagggtcg gagggggctc ttccgccagc accggaggaa gaaagaggag 180 gggctggctg gtcaccagag ggtggggcgg accgcgtgcg ctcggcggct gcggagaggg 240 ggagagcagg cagcgggcgg cggggagcag catggagccg gcggcgggga gcagcatgga 300 gccttcggct gactggctgg ccacggccgc ggcccggggt cgggtagagg aggtgcgggc 360 gctgctggag gcgggggcgc tgcccaacgc accgaatagt tacggtcgga ggccgatcca 420 ggtcatgatg atgggcagcg cccgagtggc ggagctgctg ctgctccacg gcgcggagcc 480 caactgcgcc gaccccgcca ctctcacccg acccgtgcac gacgctgccc gggagggctt 540 cctggacacg ctggtggtgc tgcaccgggc cggggcgcgg ctggacgtgc gcgatgcctg 600 gggccgtctg cccgtggacc tggctgagga gctgggccat cgcgatgtcg cacggtacct 660 gcgcgcggct gcggggggca ccagaggcag taaccatgcc cgcatagatg ccgcggaagg 720 tccctcagac atccccgatt gaaagaacca gagaggctct gagaaacctc gggaaactta 780 gatcatcagt caccgaaggt cctacagggc cacaactgcc cccgccacaa cccaccccgc 840 tttcgtagtt ttcatttaga aaatagagct tttaaaaatg tcctgcctnt taacgtagat 900 atatgccttc ccccactacc gtaaatgtcc atttatatca ttttttatat attcttataa 960 aaatgtaaaa aagaaaaaca ccgcttctgc cttttcactg tgttggagtt ttctggagtg 1020 agcactcacg ccctaagcgc acattcatgt gggcatttct tgcgagcctc gcagcctccg 1080 gaagctgtcg acttcatgac aagcattttg tgaactaggg aagctcaggg gggttactgg 1140 91202 1200 200427463 1218 cttctcttga gtcacactgc tagcaaatgg cagaaccaaa gctcaaataa aaataaaata attttcattc attcactc <210> 5 <21i> 173 <212> 蛋白質 <213> 人類 <400> 5

Met Glv Arg Gly Arg Cvs Val Gly Pro Ser Leu Gin Leu Arg Gly Gin 1 * 5 10 15

Glu Trp Arg Cys Ser Pro Leu Val Pro Lvs Gly Gly Ala Ala Ala Ala ^ 20 25 一 30

Glu Leu Gly Pro Gly Gly Gly Glu Asn Met Val Arg Arg Phe Leu Val 35 40 45

Thr Leu Arg lie Arg Arg Ala Cys Gly Pro Pro Arg Val Arg Val Phe 50 55 60

Val Val His lie Pro Arg Leu Thr Gly Glu Trp Ala Ala Pro Gly Ala 65 70 . 75 80

Pro Ala Ala Val Ala Leu Val Leu Met Leu Leu Arg Ser Gin Arg Leu 85 90 95

Gly Gin Gin Pro Leu Pro Arg Arg Pro Gly His Asp Asp Gly Gin Arg " 100 105 110

Pro Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ala Pro Arg Arg Gly Ala Gin Leu Arg 115 120 125

Arg Pro Arg His Ser His Pro Thr Arg Ala Arg Arg Cys Pro Gly Gly 130 135 140

Leu Pro Gly His Ala Gly Gly Ala Ala Pro Gly Arg Gly Ala Ala Gly 145 150 155 160

Arg Ala Arg Cys Leu Gly Pro Ser Ala Arg Gly Pro Gly 165 170 91202 200427463 <210> β <211> 1275 <212> DNA <213〉人類 <400> 6 cctccctacg ggcgcctccg gcagcccttc ccgcgtgcgc agggctcaga gccgttccga β〇 gatcttggag gtccgggtgg gagtgggggt ggggrggggg tgggggtgaa ggtggggggc 120 gggcgcgctc agggaaggcg ggtgcgcgcc tgcggggcgg agatgggcag ggggcggtgc 180 gtgggtccca gtctgcagtt aagggggcag gagtggcgct gctcacctct ggtgccaaag 240 ggcggcgcag cggctgccga gctcggccct ggaggcggcg agaacatggt gcgcaggttc 300 ttggtgaccc tccggattcg gcgcgcgtgc ggcccgccgc gagtgagggt tttcgtggtt 360 cacatcccgc ggctcacggg ggagtgggca gcgccagggg cgcccgccgc tgtggccctc 420 gtgctgatgc tactgaggag ccagcgtcta gggcagcagc cgcttcctag aagaccaggt 480 catgatgatg ggcagcgccc gagtggcgga gctgctgctg ctccacggcg cggagcccaa 540 ctgcgccgac cccgccactc tcacccgacc cgtgcacgac gctgcccggg agggcttcct 600 ggacacgctg gtggtgctgc accgggccgg ggcgcggctg gacgtgcgcg atgcctgggg 660 ccgtctgccc gtggacctgg ctgaggagct gggccatcgc gatgtcgcac ggtacctgcg 720 cgcggctgcg gggggcacca gaggcagtaa ccatgcccgc atagatgccg cggaaggtcc 7 80 ctcagacatc cccgattgaa agaaccagag aggctctgag aaacctcggg aaacttagat 840 catcagtcac cgaaggtcct acagggccac aactgccccc gccacaaccc accccgcttt 900 cgtagttttc atttagaaaa tagagctttt aaaaatgtcc tgccttttaa cgtagatata 960 tgccttcccc cactaccgta aatgtccatt tatatcattt tttatatatt cttataaaaa 1020 tgtaaaaaag aaaaacaccg cttctgcctt ttcactgtgt tggagttttc tggagtgagc 1080 actcacgccc taagcgcaca ttcatgtggg catttcttgc gagcctcgca gcctccggaa 1140 gctgtcgact tcatgacaag cattttgtga actagggaag ctcagggggg ttactggctt 1200 ctcttgagtc acactgctag caaatggcag aaccaaagct caaataaaaa taaaataatt 1260 ttcattcatt cactc 127 5 91202 200427463 <210> 7 <211> 105 <212> 蛋白質 <213〉 人類 <400> 7

Met Met Met Gly Ser Ala Arg Val Ala Glu Leu I 5 10

Ala Glu Pro Asn Cys Ala Asp Pro Ala Thr Leu 20 ^ 25

Asp Ala Ala Arg Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu 35 40

Leu Leu Leu His Gly 15 Thr Arg Pro Val His 30 Val Val Leu His Arg 45

Ala Gly Ala Arg Leu Asp Val Arg Asp Ala Trp 50 55 一

Gly Arg Leu Pro Val 60

Asp Leu Ala Glu Glu Leu Gly His Arg Asp Val 65 70 > 75

Ala Arg Tyr Leu Arg 80

Ala Ala Ala Gly Gly Thr Arg Gly Ser Asn His 85 90

Ala Arg lie Asp Ala 95

Ala Glu Gly Pro Ser Asp lie Pro Asp 100 105 <210> 8 <211> 897 <212> DNA <213〉 人類 <40〇> 8 tgtgtggggg tctgcttggc ggtgaggggg ctctacacaa gcccccaccc tggctctgac cattctgttc tctctggcag ccgagtggcg gagctgctgc tgctccacgg cgcggagccc tctcacccga cccgtgcacg acgctgcccg ggag'ggcttc gcaccgggcc ggggcgcggc tggacgtgcg cgatgcctgg ggctgaggag ctgggccatc gcgatgtcgc acggtacctg cagaggcagt aaccatgccc gcatagatgc cgcggaaggt aaagaaccag agaggctctg agaaacctcg ggaaacttag ctacagggcc acaactgccc ccgccacaac ccaccccgct

gcttcctttc cgtcatgccg 60 gtcatgatga tgggcagcgc 120 aactgcgccg accccgccac 180 ctggacacgc tggtggtgct 240 ggccgtctgc ccgtggacct 300 cgcgcggctg cggggggcac 360 ccctcagaca tccccgattg 420 atcatcagtc accgaaggtc 480 ttcgtagttt tcatttagaa 540 91202 200427463 aatagagctt ttaaaaatgt cctgcctttt aacgtagata taagccttcc cccactaccg 600 taaatgtcca tttatatcat tttttatata ttcttataaa aatgtaaaaa agaaaaacac 660 cgcttctgcc ttttcactgt gttggagttt tctggagtga gcactcacgc cctaagcgca 720 cattcatgtg ggcatttctt gcgagcctcg cagcctccgg aagctgtcga cttcatgaca 780 agcattttgt gaactaggga agctcagggg ggttactggc ttctcttgag tcacactgct 840 agcaaatggc agaaccaaag ctcaaataaa aataaaataa ttttcattca ttcactc 897 質 6白類 9 1蛋人 <21〇> <211〉 <212> <213> <400> 9

Met Glu Pro Ala Ala Gly Ser Ser Met Glu Pro Ser Ala Asp Trp Leu 1 5 10 15

Ala Thr Ala Ala Ala Arg Gly Arg Val Glu Glu Val Arg Ala Leu Leu 20 25 30

Glu Ala Gly Ala Leu Pro Asn Ala Pro Asn Ser Tyr Gly Arg Arg Pro 35 40 45 lie Gin Val Gly Arg Arg Ser Ala Ala Gly Ala Gly Asp Gly Gly Arg 50 55 60

Leu Trp Arg Thr Lys Phe Ala Gly Glu Leu Glu Ser Gly Ser Ala Ser 65 70 75 80 lie Leu Arg Lys Lys Gly Arg Leu Pro Gly Glu Phe Ser Glu Gly Val 85 90 95^

Cys Asn His Arg Pro Pro Pro Gly Asp Ala Leu Gly Ala Trp Glu Thr 100 105 110

Lys Glu Glu Glu 115 91202 -9- 200427463 <210〉 10 <211> 1515

<212〉 DNA <2：L3>人類 <40〇> 10 cccaacctgg ggcgacttca ggtgtgccac attcgctaag tgctcggagt taatagcacc 60 tcctccgagc actcgctcac ggcgtcccct tgcctggaaa gataccgcgg tccctccaga 120 ggatttgagg gacagggtcg gagggggctc ttccgccagc accggaggaa gaaagaggag 180 gggctggctg gtcaccagag ggtggggcgg accgcgtgcg ctcggcggct gcggagaggg 240 ggagagcagg cagcgggcgg cggggagcag catggagccg gcggcgggga gcagcatgga 300 gccggcggcg gggagcagca tggagccttc ggctgactgg ctggccacgg ccgcggcccg 360 gggtcgggta gaggaggtgc gggcgctgct ggaggcgggg gcgctgccca acgcaccgaa 420 tagttacggt cggaggccga tccaggtggg tagaaggtct gcagcgggag caggggatgg 480 cgggcgactc tggaggacga agtttgcagg ggaattggaa tcaggtagcg cttcgattct 540 ccggaaaaag gggaggcttc ctggggagtt ttcagaaggg gtttgtaatc acagacctcc 600 tcctggcgac gccctggggg cttgggaaac caaggaagag gaatgaggag ccacgcgcgt 660 acagatctct cgaatgctga gaagatctga aggggggaac atatttgtat tagatggaag 720 tcatgatgat gggcagcgcc cgagtggcgg agctgctgct gctccacggc gcggagccca 780 actgcgccga ccccgccact ctcacccgac ccgtgcacga cgctgcccgg gagggcttcc 840 tggacacgct ggtggtgctg caccgggccg gggcgcggct ggacgtgcgc gatgcctggg 900 gccgtctgcc cgtggacctg gctgaggagc tgggccatcg cgatgtcgca cggtacctgc 960 gcgcggctgc ggggggcacc agaggcagta accatgcccg catagatgcc gcggaaggtc 1020 cctcagacat ccccgattga aagaaccaga gaggctctga gaaacctcgg gaacttagat 1080 catcagtcac cgaaggtcct acagggccac aactgccccc gccacaaccc accccgcttt 1140 cgtagttttc atttagaaaa tagagctttt aaaaatgtcc tgccttttaa cgtagatata 1200 tgccttcccc cactaccgta aatgtccatt tatatcattt tttatatatt cttataaaaa 1260 tgtaaaaaag aaaaacaccg cttctgcctt ttcactgtgt tggagttttc tggagtgagc 1320 actcacgccc taagcgcaca ttcatgtggg catttcttgc gagcctcgca gcctccggaa 1380 gctgtcgact tcatgacaag cattttgtga actagggaag ctcagggggg ttactggctt 1440 91202 -10- 200427463 ctcttgagtc acactgctag caaatggcag aaccaaagct caaataaaaa taaaataatt 1500 ttcattcatt cactc 1515 <21〇> 11 <211> 27 <212> DNA <213> 人造的序列 <220〉 <223>人造序列的說明··選殖MTAPcDNA的引子 <40〇> 11 ctcgcccact gcagattcct ttcccgr 27 <21〇> 12 <211> 27 <212> DNA <213〉 人造的序列 <220> <223〉人造序列的說明：選殖MTAPcDNA的反義引子 <400> 12 ggcagccatg ctactttaat gtcttgg 27 9I：02 -11-

Claims (1)

1. 200427463 拾、申請專利範圍： 1. 一種MTAP-結合劑，其專一地結合在包埋之生物試樣中 的人類甲硫基腺苷磷酸化酶（MATP)蛋白質，且其中該生 物試樣不是包埋在OCT化合物中。 2. 根據申請專利範圍第1項之MTAP-結合劑，其中該結合劑 是抗體。 3. 根據申請專利範圍第2項之MTAP-結合劑，其中該抗體是 多株抗體。 4. 根據申請專利範圍第2項之MTAP-結合劑，其中該抗體是 單株抗體。 5. 根據申請專利範圍第4項之MTAP-結合劑，其中該單株抗 體是由融合瘤細胞株ATCC PTA-5 001所產生。 6. 根據申請專利範圍第1項之MTAP-結合劑，其中該包埋之 生物試樣是被包埋在石填中。 7. 根據申請專利範圍第1項之MTAP-結合劑，其中該包埋之 生物試樣是經過固定的。 8. 根據申請專利範圍第1項之MTAP-結合劑，其中係利用福 馬林固定該包埋之生物試樣。 9. 一種融合瘤細胞株，其產生專一地結合人類MTAP蛋白質 之單株抗體，其中該細胞株為ATCC PTA-5 001。 10· —種單株抗體，其專一地結合人類MTAP，其中該單株抗 體係由融合瘤細胞株ATCC PTA-5 001產生。 1 1 · 一種單株抗體，其中該抗體結合與由融合瘤細胞株ATCC PTA-5 001產生之單株抗體相同的人類MTAP抗原決定位。 91202.doc 200427463 1 2. —種融合瘤細胞株，其中該細胞株產生單株抗體，其妹 合與由融合瘤細胞株ATCC PTA-500 1產生之單株抗體相 同的人類MTAP抗原決定位。 13. —種製造經過分離之融合瘤的方法，其產生可用來評估 包埋之生物試樣是否包括含有人類MTAP蛋白質之細胞 的抗體’其中該方法包括··使用包括人類MTAP多肽或其 片段之組合物來免疫哺乳動物；從經過免疫之哺乳動物 中分離脾臟細胞；將經過分離之脾臟細胞與永存不死的 細胞融合，形成融合瘤；並針對在包埋之生物試樣中， 專一地結合該人類MTAP蛋白質之抗體的產製，篩選個別 的融合瘤。 14. 一種在包埋之生物試樣中，檢測人類MTAp蛋白質之存在 或缺乏的方法，包括： (1) 使該生物試樣與MTAP_結合劑接觸，若人類1^了入1>蛋 白質出現在該包埋試樣中，便與其形成結合複合物； (2) 檢測該結合複合物的含量，並藉此檢測在組織切片中 MTAP的存在’其中檢測到很少至無結合複合物，表 示在該生物試樣中有很少或沒有人類MTAP蛋白質；且 其中該生物試樣不是被包埋在〇CT化合物中。 i 5 .根據申請專利第i 4項之方法，其中該結合劑是抗體。 .根據申請專利第15項之方法，其中該抗體是多株抗體。 17.根财請專利第15項之方法，其中該抗體是單株抗體。 1 8 ·根據申睛專利第1 7項 貝 < 万忐，其中该早株抗體是由融合 瘤細胞株ATCCPTAJOOl所產生。 91202.doc 其中該生物試樣是經過固 拫據申請專利第14項之方法 定的。 其中该生物試樣被包 其中係利用福馬林固 其中以可檢測標記標 根據申請專利範圍第14項之方法 壇在石蠟中。 21.根據申請專利範圍第20項之方法 疋該石蠟-包埋之生物試樣。 22·根據申請專利範圍第15項之方法 示該抗體。 / 23·根據申請專利範圍第15項 石丨止 方法，其中該抗體係藉著下 列步驟來檢測·· (1) 使该抗體與以可檢測方式桿 、加不之弟一個抗體，在使第 個抗體與该抗體結合的條件下接觸；並 (2) 檢測如此結合的第二個抗體。 •根據申凊專利範圍第i 5項之方法，#中該抗體係藉著下 列步驟來檢測： (1) 使该抗體與第二個抗體，在使第二個抗體與該抗體結 合的條件下接觸； (2) 使該第二個抗體與以可檢測方式標示之第三個抗 體’在使第三個抗體與該第二個抗體結合的條件下接 觸；並 (3)檢測如此結合的第三個抗體。 2 5.根據申請專利範圍第14項之方法，其中該包埋之生物試 樣係得自罹患癌症的患者。 26.根據申請專利範圍第25項之方法，其中該癌症為非-霍奇 91202.doc 200427463 金氏淋巴瘤、間皮瘤、原發性腦惡性、非，小細胞肺癌、 白血病、膀胱癌、胰臟癌、軟組織肉瘤、骨肉瘤或頭和 頸的癌症。 2 7. —種在經過固定並包埋在石蠟中之生物試樣中，檢測人 類MTAP蛋白質之存在或缺乏的方法，其包括： (1)加熱該試樣； (2)將該試樣脫石蝶； (3) 在该試樣中誘導抗原決定位恢復； (4) 將该試樣與專一地結合人類％丁人]?蛋白質之結 合劑一起培養，形成結合複合物；並 ()k測在σ亥生物试樣中結合複合物的含量，其中檢測到 很少至無結合複合物，表示在該試樣中有很少或沒有 人類ΜΤΑΡ蛋白質。 28.根據申請專利範圍第27項之方法，其中該抗原決定位恢 復係使用熱。 29. 30. 根據申請專利節_ i R , 」乾lij弟28項之方法，更進一步包括在加熱 之後，加入蛋白水解酵素。 根據申請專利範圍第29項之方法，其中該蛋白水解酵素 為騰蛋白酶。 31·根據申請專利範圍第27項之方法， 疋及、，工過固定並以石蠟包埋的試樣。 、種k擇心者，以便利用針對MTAP缺陷癌症之治療獨 法…療MTAP缺陷癌症的方法，其中該方法包 驟： 9l202.doc 心曙274 63 (1) 提供得自該患者之癌症的包埋生物試樣； (2) 使該試樣與MTAP-結合劑接觸，其專一地與出現在爷 試樣中之人類MTAP蛋白質形成結合複合物；並 μ (3) 檢測該結合複合物的含量，並藉此檢測在該試樣中之 人類ΜΤΑΡ蛋白質的含量，其中具有很低或沒有可檢 測之結合複合物的癌症，表示該癌症可接受針對 ΜΤΑΡ缺陷癌症的治療。

   33. 34. 根據申請專利範圍第3 2項之方法，其中該治療攝生法包 括抑制重新嘌呤合成的化合物。 根據申請專利範圍第33項之方法，其中該藥物為亞硝 基基丙胺酸、10-炔丙基_1〇-脫氮雜胺基蝶呤（PDx)、 N-(4-(((2,4-二胺基-6-喋啶基）甲基）甲胺基）苯甲醯基）-L-榖胺酸）（胺曱碟呤）、AG2037(Agouron/Pfizei·)、4-胺基喋 酸基穀胺酸（胺基蝶呤）、2,4-二胺基-5-曱基-6-[[(3,4,5-三 曱氧苯基）胺基]曱基]喹唑啉（三甲曲沙）、派瑞曲辛、10-乙基-脫氮雜-胺基蝶呤（依達曲沙）、4’-亞甲基-10-脫氮雜 胺基蝶呤（MDAM)、10-快丙基-5,8-二脫氮雜葉酸 (PDDF)、N-[5-[N-(3,4-二氫-2-曱基-4-氧基。奎°圭淋-6-基曱 基）-Ν-曱胺基]-2〃塞吩曱醯基-L-穀胺酸（雷替曲赛； ZD1694，拓優得）、Ν-[4-[2-(2-胺基-3,4-二氫-4-氧基-7Η-吡咯并[2,3-d]-嘧啶-5-基）乙基]-苯甲醯基]-L-穀胺酸 (LY231514 ; Lilly)、6-(2’ -曱酸基-2’ -莕基-乙基）-2 -胺基 -4(3H)-氧基喹唑啉（LL95509)、（6及，3)-5，1〇-二脫氮雜四氫 葉酸（DDATHF)、4-[2-(2-胺基-4-氧基-4,6,7,8-四氫-3H-

   91202.doc 200427463 嘧啶并[5,4,6][1，4]—塞畊-6-基）_(3)-乙基]_2,5^塞吩甲醯基 胺基-L-穀胺酸（AG2034)和 N-[5-(2-[(2,6-二胺基-4(3H)-氧基嘧啶-5-基）硫基]乙基）噻吩甲醯-2_基]穀胺酸 (AG2009)、6R2’，5’噻吩基5，1〇_二脫氮雜四氫葉酸 (LY3 09 8 8 7)、（3)-2-[4-[^-[(3,4一二氫-2,7-二曱基-4-氧基 -6-喹唑啉基）甲基]丙炔基胺基氟苯甲醯胺 基]-4-(1Η-1，2,3,4-四唑-5 -基）丁酸（ZD933 1)、N-[4-[N-[(3,4-二氫-2,7-二甲基-4-氧基_6_喹唑啉基）曱基]_1^丙-2- 炔基胺基]-2-氟苯甲醯胺基]-L_榖胺酸（ZM214888)、 Ν(αΗ4-[5-(2,4-二胺基泰雷啶基）戊_卜炔_4_基]苯甲醯 基]Ν(δ) -半鄰笨二曱酿基-鳥胺酸或n(c〇-(4-胺基-4-脫 氧喋基）-Ν(δ)-半鄰苯二甲醯基鳥胺酸（ΡΤ523)。 35.根據申請專利範圍第32項之方法，其中該結合劑為抗體。 3 6.根據申請專利範圍第35項之方法，其中該抗體為多株抗 3 7.根據申請專利範圍第32項之方法，其中該抗體為單株抗 3 8.根據申請專利範圍第37項之方法，其中該單株抗體是由 融合瘤細胞株ATCC ΡΤΑ-5001所產生。 3 9.根據申睛專利範圍第3 2項之方法，其中該包埋之生物試 樣是已經固定的。 40·根據申請專利範圍第32項之方法，其中該生物試樣被包 埋在石蠟中。 41.根據申請專利範圍第40項之方法，其中係利用福馬林固 91202.doc 200427463 定該石蠟-包埋的生物試樣。 2 ·根據申請專利範圍第3 2項之方法，其中該癌症為非-霍奇 金氏淋巴瘤、間皮瘤、原發性腦惡性、非-小細胞肺癌、 白血病、膀胱癌、胰臟癌、軟組織肉瘤、骨肉瘤或頭和 頸的癌症。 43 · —種判定包埋之生物試樣是否含有人類MTAP蛋白質的 套組，包括··（a)MTAP-結合劑，其專一地與包埋之人類 MTAP蛋白質結合，形成結合複合物；以及（b)能夠發出該 結合複合物形成之信號的指示劑。 44.根據申請專利範圍第43項之套組，其中該結合劑為抗體。 45 ·根據申凊專利範圍第44項之套組，其中該抗體為單株抗 體。 46·根據申請專利範圍第45項之套組，其中該單株抗體係由 融合瘤細胞株ATCCPTA-5001產生的。 47. —種在試樣中檢測人類MTAp蛋白質存在或缺乏的方 法，包括： (1) 使試樣與融合瘤細胞株ATCC PTA-5 001產生的單株 抗體或結合相同於融合瘤細胞株AtcC PTA-5001產 生的單株抗體之抗原決定位的單株抗體接觸，其中該 單株抗體專一地結合至人類MTAP蛋白質，以形成結 合複合物；及 (2) 判定在試樣中結合複合物的存在或缺乏，結合複合物 的出現代表人類MTAP蛋白質存在於在試樣中。 48. 根據申請專利範圍第47項之方法，其中該單株抗體係利 200427463 用於西方墨點法。 49·根據申請專利範圍第47項之方法，其中該單株抗體係利 用於ELISA。 50·根據申請專利範圍第10項之方法，其中該抗體係固定在 固體表面上。 5 1’ 種MTAP-結合劑，其係專一地結合出現在包埋之生物 試樣中的人類MTAP蛋白質並產生以染色強度為基礎的 統計分數，其容許確認包埋的試樣包含以同種接合子之 方式刪除編碼人類MTAP蛋白質之基因的細胞，其中該包 埋之生物試樣不是包埋於OCT化合物中。 52·根據申請專利範圍第51項之MTAP-結合劑，其中該結合 劑為抗體。 53·根據申請專利範圍第52項之MTAP-結合劑，其中該結合 劑為多株抗體。 54·根據申請專利範圍第52項之MTAP-結合劑，其中該結合 劑為單株抗體。 55·根據申請專利範圍第54項之MTAP-結合劑，其中該單株 抗體係由融合瘤細胞株ATCC PTA-5001產生。 5 6.根據申請專利範圍第4項之MTAP-結合劑，其中該抗體具 有對於人類MTAP之大於ΙΟ^Μ·1之結合親和力。 57·根據申請專利範圍第56項之MTAP-結合劑，其中該抗體 具有大於107M-1之結合親和力。 5 8.根據申請專利範圍第17、37或47項之方法，其中該抗體 具有對於人類MTAP之大於105M-1之結合親和力。 9l202.doc 200427463 59·根據申請專利範圍第58項之方法，其中該抗體具有大於 107m-1之結合親和力。 60_種MTAP·結合劑，其係專一地結合至來自試樣之mtap 蛋白貝’ δ亥试樣係以手工、使用Thinprep處理器、使用 Cytospm裝置、或藉由離心技術固定於玻片上形成塗片。 6 L根據申請專利範圍第60項之ΜΤΛΡ-結合劑，其中該結合 劑為抗體。 62·根據申請專利範圍第61項之ΜΤΑρ_結合劑，其中該抗體 為多株抗體。 63.根據申請專利範圍第61項之ΜτΑρ_結合劑，其中該抗體 為早株抗體。 64. 65. 根據申請專利範圍第63項之ΜΤΑΡ-結合劑，其中該單株 抗體係由融合瘤細胞株ATCCpTA — 5〇〇1產生。 其中該試樣 其中該試樣 其中該試樣 其中該試樣 其中該試樣 根據申凊專利範圍第60項之MTAP-結合劑 係來自血液。 66·根據申請專利筋圖笛 月寸J祀图弟6〇項之MTAP-結合劑 係來自骨髓。 67·根據申請專利筋jfl $ π 觀固弟6〇項之ΜΤΑΡ-結合劑 係來自滲漏液。 68·根據申請專利範圚箓 祀圓弟60項之ΜΤΑΡ-結合劑 係來自尿液。 69·根據申請專利範圍箓 固弟60項之ΜΤΑΡ-結合劑 係經固定。 91202.doc