TW200416043A

TW200416043A - Epstein barr virus peptide epitopes, polyepitopes and delivery system therefor

Info

Publication number: TW200416043A
Application number: TW092130642A
Authority: TW
Inventors: Rajiv Khanna; Jaikumar Duraiswamy
Original assignee: Queensland Inst Med Res
Priority date: 2002-11-07
Filing date: 2003-11-03
Publication date: 2004-09-01
Also published as: HK1084129A1; US20070048329A1; WO2004041849A1

Description

200416043 五、發明說明（1) --- 【技術領域】本發明與非洲淋巴細胞瘤病毒（EBV)的免疫胜？有關，更特別的是，這項發明與細胞毒性型τ細胞的抗原決定基 (epitope)有關，此抗原決定基衍生自EBV的“^蛋白本發明亦提供藥學的成分，包括有EB V細胞毒性型T細胞抗原決定基，多抗原決定基，以及線病毒疫苗傳遞系統和一些治療EBV相關疾病的方法，這些相關疾病包括有霍奇金氏病（Hodgkin’s disease),鼻咽癌等，雖然不限於此發明中亦提供辨認EBV細胞毒性型T細胞抗原決定基的方法― 【先前技術】 '

I EBV不僅是分佈最廣的人類病毒之一，有些矛盾的是，它也和一些贅瘤（neop!asm)有關（Anagnostopoui.os 1 9 9 6 )·這些包括各種B細胞及τ細胞非霍奇金氏淋巴瘤，雈奇金氏病，以及一些淋巴上皮瘤狀癌 (lymphoepithelioma-like carcinomas)，其典型即為鼻咽癌·這些腫瘤與EBV的關係，以及EBV在體外的致癌潛力已被研究出來（Rickinson 1 9 9 6; Khanna2 0 0 0 ). CD8+ 丁細胞的活性在控制EBV感染中扮演重要角色，因為被感染細胞表面MHC_ I分子會呈現小分子？，而CD8+ T細胞會辨識這些？·對EBV具特異性的細胞毒性型T淋巴球（CTL)可在_ 試管中合成，取健康病毒帶原者的體表血液，帶原者帶有 EBV轉型淋巴球原細胞株（EBV-transformed LCLs，

Khannal 992 ; Murray 1 9 9 2 )自體移植細胞，刺激其記憶型 T細胞以得CTL·在一種LCL中，EBV會表現六個核抗原

第5頁 200416043 五、發明說明（2) (EMNAs 1，2，3A， 3C, 及LP)，以及兩個潛伏膜蛋白（ latent membrane protein，LMP1 及 LMP2)·在 CTL 對許多人類白血球抗原（HLA)的反應中，EBNA3家族（EBNA 3A， 3B， 3C)為免疫顯性（khanna 1 9 92; Murray 等 1 9 9 2 ). 霍奇金氏病以及鼻咽癌的腫瘤細胞皆會表現病毒蛋白以供CTLs抗原決定基辨識.這兩種惡性腫瘤會表現核抗原 EBNA1，即GAr (glycine-alanine repeat),玫匕抗原在蛋白質酵素體的降解中（proteasomal degradation)扮演順式抑制信號的角色，因此阻斷CTL的抗原決定基在細胞膜呈現（Levitskaya 1 9 9 5 ).病毒轉錄體的差異性剪接 (splicing)產生顯性蛋白質等形（isoforms)，其中CTL決定位缺失而對BARF0抗原決定基的呈現造成損害（Kienzle 2 0 0 0 ).和EBNA1 及BARF0 相反，LMP1 及LMP2 為EBV 專一性 CTLs的強烈標的，因此許多注意力皆集中在辨識此兩種抗原的抗原決定基（Lee 1997; Khanna 1998; Meij 2002)·

LMP1為一跨膜蛋白，其細胞質N端及C端區域被6個貫穿膜的片段分隔開.正常B細胞經由EBV轉型時，LMP1被認為疋隶重要的潛伏蛋白之一，而且在基因轉瘦鼠中僅有它能誘導惡性腫瘤出芽增生（Kulwichit 1998)·而且，LMP1 在B細胞的表現型中為基因多效性（piei〇tr〇pic effects),其中包括誘導抗原活化作用（Wang丨99〇 )，策劃細胞死亡抑制因子的表現（Henders〇n 1991; Laherty 1 9 9 2 )，以及經由TRAF訊號傳遞途徑活化NF- /c B (Hammarslijold 1992; Mosialos 1995).先前的研究顯示

200416043 五、發明說明（3) LMP 1的作用為一種結構上活化的接受體狀分子，與配基 (Ligand)結合無關· LMpi的(3端以活化區域啟動訊號傳導 (稱為CTAR1，胺基酸1 94 — 23 1及CTAR2，胺基酸3 3 2 - 38 6及口八1^3，胺基酸2 75 — 3 3〇) (；：1^1和(：1^1^2區域與帅—/€]6的誘導有關，CTAR2為主要NF- /cB活化體區域，而CTAR3最近被報導為與janus激？結合（Gires 1 9 9 9 ). 【内容】本發明採用一創新的I F N- r分析，在許多病毒帶原者的LMP1專一性τ細胞反應中用來處理大量的序列分析·此方法與細胞毒性功能分析結合，以評定LMP1專一性CTLs的❿ 溶解能力，溶解被EBV所感染的細胞·

在概略的形式上，此項發明提供一種衍生自LMP1的有效E B V胜？，適用於醫治腫瘤的免疫療法，包括B細胞及T 細胞非霍奇金氏淋巴瘤，霍奇金氏病，以及淋巴上皮瘤狀癌如鼻咽癌. 此項發明亦提供一線病毒疫苗運輸系統，在傳送EBv 的多抗原決定基結構時特別有效· 因此，發明中提出一EBV CTL抗原決定基？，由LMP1蛋白質中的胺基酸殘基至少9個以上相連續而組成，其中的 EBV CTL胜？並非YLQQNWWTL(SEQ ID NO:1 ); 參 ESDSNSNEG(SEQ ID N0:2 )或YLLEMLWRL (SEQ ID N0:3 )· 第一方面，本發明提供一純化分離的EBV CTL抗原決定基胜？，由胺基酸序列QRH(SEQ ID N0: 4 )組成. 在一較佳實施例，抗原決定基是從下面一組胺基酸序

第7頁 200416043 五、發明說明（4) 列中挑選出而組成： (i) QRHSDEHHH (SEQ ID NO:9); (ii) GQRHSDEHH (SEQ ID N0:10); (iii) YYHGQRHSD (SEQ ID N0:11); (iv) WMYYHGQRH (SEQ ID N0:12)· 第一方面其他實施例，抗原決定基是從下面一組胺基酸序列中挑選出而組成： (i) YYHGQRHSDEHH (SEQ ID N0:13); (ii) IWMYYHGQRHSD (SEQ ID N0:14); — (i iOLIWMYYHGQRHSDEHHH (SEQ ID N0:15). 第二方面，本發明亦提供一純化分離的EBV CTL抗原決定基胜？，由胺基酸序列AGNDG( SEQ ID NO: 5 )組成. 第二方面較佳實施例，抗原決定基是從下面一組胺基酸序列中挑選出而組成： (i )AGNDGGPPQ (SEQ ID NO: 16); (ιi)PSDSAGNDG (SEQ ID N0:17). 第二方面其他實施例，抗原決定基是從下面一組胺基酸序列中挑選出而組成： (i)SDSAGNDGGPPQ (SEQ ID N0:18); (iODSAGNDGGPPQL (SEQ ID N0:19); · (i iOPHSPSDSAGNDGGPPQL (SEQ ID N0:20). 第三方面，本發明亦提供一純化分離的EBV CTL抗原決定基胜？，由胺基酸序列QNW(SEQ ID N0:6 )組成，特別地，其中不包括YLQQNWWTL(SEQ ID N0:1 ).

200416043 五、發明說明（5) 第三方面較佳實施例，抗原決定基是從下面一組胺基酸序列中挑選出而組成： (i )IALYLQQNW (SEQ ID NO:21); (ii)ALYLQQNWW (SEQ ID N0:22); (i iOQNWWTLLVD (SEQ ID N0:23); (iv)LYLQQNWWT (SEQ ID N0:24). 第三方面其他實施例，抗原決定基是從下面一組胺基酸序列中挑選出而組成： (1)IALYLQQNWWTL (SEQ ID NO:25); (iOYLQQNWWTLLVD (SEQ ID NO:26); || (i ii)LI IALYLQQNWWTLLVD (SEQ ID N0:27). 第四方面，本發明亦提供一純化分離的EBV CTL抗原’ 決定基胜？，由胺基酸序列VLYS(SEQ ID N0: 7 )組成. 在一較佳實施例，抗原決定基是從下面一組胺基酸序列中挑選出而組成： (i) ALLVLYSFAL (SEQ ID N0:28); (ii) LLVLYSFAL (SEQ ID N0:29); (i iOALLVLYSFA (SEQ ID NO:30); (iv)VLYSFALML (SEQ ID N0:31). 第四方面其他實施例，抗原決定基是從下面一組胺基. 酸序列中挑選出而組成： (i) ALLVLYSFALML (SEQ ID N0:32); (ii) GALLVLYSFALM (SEQ ID NO:33); (iii) DWTGGALLVLYS (SEQ ID N0:34);

200416043 五、發明說明（6) (iv) GGALLVLYSFAL (SEQ ID N〇：35); (v) DWTGGALLVLYSFALML (SEQ ID NO:36). 第五方面，本發明提供一純化分離的EBV CTL抗原決定基胜？，由胺基酸序列DSNSNE(SEQ ID NO: 8 )組成，特別地，其中不包括ESDSNSNEGCSEQ ID N〇：2 )· 第五方面較佳實施例，抗原決定基是從下面一組胺基酸序列中挑選出而組成：

Cl )DSNSNEGRH (SEQ ID NO:37); - (iOSGHESDSNSNEG (SEQ ID NO:38); || (iii)TDDSGHESDSNSNEGRH (SEQ ID N0:39). 本發明亦提供一 E B V C T L抗原決定基異變體（v a r i a n t). 特別實施例為，此異變體含有表4所示的胺基酸序列（S EQ ID NOS40-50). 第六方面，本發明提供一分離純化蛋白，此蛋白由上述各方面至少一個以上的EBV CTL抗原決定基組成. 在一更佳實施例，此純蛋白為多抗原決定基 (polyepitope)蛋白，從下面一組胺基酸序列中挑選出而組成，ALLVLYSFA (SEQ ID N0:30)及 iaLYQQNW (SEQ ID❿ NO: 21). 在一較佳實施例中，純化的多抗原決定基蛋白由表5 所示的每一個E B V C T L抗原決定基組成

在一特別實施例中，純化的多抗原決定基蛋白由sEQ

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I D N 0 : 8 1所定的胺基酸序列組成· 第七方面，本發明提供一純化分離的核甘酸 =編碼上述任一方面的EBV CTL抗原決定基或多抗原決^ 在一較佳實施例，純化的核甘酸編碼SEQ I d . 所列的多抗原決定基胺基酸序列· · 在一更佳實施例，純化的核甘酸編碼SEQ iD 所列的胺基酸序列· ·

在一特別實施例，純化甘酸序列組成（SEQ ID N0S: 78-80). 的核甘酸由表4所定的一種核 63一65， 67-69， 71-76及乂第八方面，本發明提供一表現結構·蔣笛丄化核甘酸與位於表現載體中一個以上的·批/、方面的純連，組成此表現結構· 上的调控核甘酸序列相的·在一較佳實施例，|現結構是以腺病毒為運送基礎

在一特別貫施例，表現結構為一 $ p 編碼本發明中大多數的5；^ CTL抗原決定几美、；、定基結構，苐九方面，本發明提供一宿主細勝七士地A 含有第八方面所述的表現結構· 胞或有機體，其中弟十方面，本發明提供一藥學組合物面的EBV CTL抗原決定基，或純化核甘’由上述任一极甘酸，或是有其相戸

第11頁 200416043 五、發明說明（8) 編碼的表現結構所組成· 較佳ΐ施例，此藥學成分為一種免疫療法成分. 第更佳貫施例，此藥學成分為一種疫苗· 法勹2 方面，本發明提供一種治療EBV相關疾病的方相同種或多#ebvctl抗原決定基，或者是有其 :螞的表現結構施打到動物身上的步驟· 在治瘅t :的+方法包括施打蛋白質以及核酸組成物，用以雖^及乂或預防上醫治EBV相關疾病· τ細胞Λ不Λ熟知^βν相關疾病包括#B細胞及皮瘤狀、产氏淋巴瘤，隹可金氏病，以及幾種淋巴上狀应、其中鼻咽癌為特別受注目的形式· 在較t貫施例，動物為哺乳類· 在更佳貫施例，動物為人類·

在較佳貫施例，第十方面的方法更推半勺八以下步驟，依照接受治療病患的HLA類：來法挑更選進 CTL抗原決定基· 蝴土木挑選一個或多個EBV 的方ΐ十2 = 本發明提供—辨識EBV CTL抗原決定基扪乃沄，此方法包括以下步驟： (!)將大多數LMP1衍生的不同胜？製造出來 (1 1)由EBV血清反應呈陽性的個以JL的I P讨& ^ ^ a 1U體中取得T淋巴球，將一種< 从上的林巴球與一種以上的上述胜？、社人 3 =由該胜？的反應其中IF N- r鬲於標準量即表示該 ’

抗原決定基· 胜？含有至少一個EBV CTL

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五、發明說明（9) 在一較佳實施例’此方面包含另一步驟（ιν)，即檢測 (11)所製造出的一種或多種τ淋巴球是否能水解Εβν感染標的細胞. 第十三方面，本發明提供一種抗體，此抗體能與上述各方面的一種以上E B V C T L抗原決定基結合第十四方面，本發明提供一檢測方法，檢測一動物體中是否藏有EBV，或是曾接觸過EBV·此檢測法的步驟為，從該個體中分離出一種以T上淋巴球，將T淋巴球與本發明中一種以上的E B V C T L抗原決疋基相接觸，藉由τ細胞與-抗原決定基？的反應可顯示此動物體中藏有EBV或是曾接觸過 EBV. 在一較佳實施例，動物為嗔乳類· 在一更佳實施例，動物為人類· 此篇發明專利說明書中，n compr i sen， comprises”及 "c o m p r i s i n g，，用法互通，而#各有所指，所以一個隊述的整體或整體組可包括其他未陳述的整體或整體組· 【實施方法】此專利說明書描述許多新穎的與意料之外的EB V CTL 抗原決定基，其抗原決定基來自p丨蛋白質·用I F N - τ分析法與功能性細· 胞毒性分析法分析EBV CTL是否具有LMP1專〆性口1^的特性，即，水解被 E B V感染的標的細胞·

200416043 五、發明說明（ίο) 意外地，本發明中的C T L抗原決定基是選擇性的由 CTAR1與LMP1蛋白貫穿細胞膜的部分而來，實際上並不包括CTAR2區域與N端.

此發中的L Μ P 1衍生型E B V 胜？（LMP1 -derivedEBVpeptides)適合用於治療EBV相關疾病的免疫療法·本發明中所考慮到的EBV相關腫瘤包括B細胞及T細胞非霍奇金氏淋巴瘤，霍奇金氏病，以及一些淋巴上皮瘤狀癌如鼻咽癌. 此項發明中，π純化分離的（i s 0 1 a t e d)"意指物質由其自然狀悲被移開或使其能夠被人類使用·純化分離的物質可能是本質地或根本地與其在自然狀態所伴隨存在的化合物分離，或是處理成一人工狀態並與其在自然狀.態所伴隨存在的化合物共存·分離出的化合物可能是天然的，化學合成的或重組的形式. 蛋白質是一種胺基酸聚合體·其胺基酸可以是自然或非自然的，D-或L-型，或是技術上所熟知的化學衍生^ 基酸（chemically derivatized amino acid). n胜？（peptide)1'是指含有少於50個以下胺基酸的蛋白 "多？（polypeptide)”是指含有50個以上胺基酸的蛋白質· E B V C T L抗原決定基π是指由E B V基因組編碼的—種胺基酸序列·在體外或體内，有MHC第一型存在的情況下當此胺基酸遇到一種以上的Τ細胞c 1 ο η 〇 t y p e時，它可以，

第14頁 200416043 五、發明說明（11) 發一種以上T細胞c lonotype的免疫反應·此外此定義亦包括丁細胞抗原決定基，例如輔助型T細胞（T h e 1 p e r )或β細胞抗原決定基.

與SEQ ID NOS: 4 -9 —致的胺基酸序列為本發明EBV 胜？中最小的共同區域（列於表2)· 本發明EBV CTL抗原決定基？為SEQ ID N0S: 10-39. ' 較適的說法為，此E Β V C T L抗原決定基？至少由9個連續的安基酸組成，但不會多於20個，在某些實施例中，此EBV CTL抗原決定基？由9， 12或 1 7個相連的胺基酸所組成. 在一個較佳實施例中，此EBV CTL抗原決定基？由下面一組胺基酸序列選出組成：SEQ ID N0:9; SEQ ID Ν0:1〇: SEQ ID NO:11; SEQ ID N0:12; SEQ ID N0:16; SEQ ID N〇：17； SEQ ID N0:21; SEQ ID N0：22; SEQ ID NO：23； SEQ ID N0:24; SEQ ID N0:28; SEQ ID N0:29; SEQ ID N〇:30; SEQ ID N0:31;以及 SEQ ID N0:37. 本發明亦認為如多？或多抗原決定基蛋白等的純化蛋白是由本發明中的一個，多個或可能是大量的EBV CTL抗原決定基？所組成·例如，此抗原決定基可能是單獨存在或重複存在，其中包括一前一後（tandemly)重複型抗原決定基· π隔開物（s p a c e r)π胺基酸可能亦包括一個或多個此純化蛋白中的EBV CTL抗原決定基？. 在一個實施例中，一個純化蛋白可能由一個，多個，更可能是大量的本發明EBV CTL抗原決定基？所組成·

第15頁 200416043 五、發明說明（12) 再另一個實施例中，一個純化蛋白基本上可能是由一個，多個，更可能是大量的本發明EBV CTL抗原決定基？所組成. 基本上由···所組成（consist essentially 〇f)H是指除了 E B V C T L抗原決定基序列之外，此文章中的這個或每個EBV CTL抗原決定基？不會包含5個，甚或3個以上的胺基酸· 就特殊的多抗原決定基蛋白而言，額外的胺基酸殘基是指"隔開物V胺基酸. -

本發明亦察覺，本發明的多抗原決定基蛋白可能額外❿ 地由一個或多個EBV CTL抗原決定基組成，諸如一個或多個列於表2或表5的先前技術LMP1抗原決定基，且/或EBV CTL 抗原決定基YLLEMLWRL (SEQ ID N0:2)，YLQQNWWTL (SEQ ID N0:1)且/ 或ESDSNSNEG (SEQ ID N0:3). 在一較佳實施例中，純化的多抗原決定基蛋白是由大量MHC第一型限制型LMP1且/或LMP2 CTL抗原決定基所組成· 較佳的說法是，至少有一個此CTL抗原決定基擁有下列其中之一的胺基酸序列，ALLVLYSFA (SEQ ID N0:30) and IALYQQNW (SEQ ID NO：21). _

在一個特別的較佳實施例中，純化的多抗原決定基是由1 3個EBV CTL抗原決定基所組成，EBV CTL抗原決定基含有以下各別的胺基酸：YLLEMLWRL (SEQ ID N0: 3); YLQQNWWTL (SEQ ID NO: 1)； ALLVLYSFA (SEQ ID

第16頁 200416043 五、發明說明（13) NO:30)； IAYLQQNW (SEQ ID N0：21); SSCSSCPLSKI (SEQ ID NO： 51); PYLFWLAAI (SEQ ID N0:52); TYGPVFMCL (SEQ ID N0:53); RRRWRRLTV (SEQ ID N0:54); LLSAWILTA (SEQ ID NO: 55); LTAGFLIFL (SEQ ID NO:56); VMSNTLLSAW (SEQ ID N0:57); IEDPPFNSL (SEQ ID N0:58); CLGGLLTMV (SEQ ID N0:59). 更佳的說法是，純化的多抗原決定基蛋白擁有SEQ I D NO : 8 1 (圖· 8 )所述的胺基酸序列. 在表5及圖8，多抗原決定基中的CTL抗原決定基是經篩選出來，包含有廣泛MHC第一型專一性的抗原決定基· 4 例如，這種最佳篩選的HLA專一性估計約包含了 90%的亞洲，非洲以及高加索族群. 發明中亦注意到，圖8中的純化蛋白（SEQ I D Ν0 : 8 1 ) 已被發明者證實會誘導多抗原決定基老鼠中的CD8+ CTL反應，此反應可保護老鼠，避免腫瘤發生· 同時亦考慮到EBV CTL抗原決定基的異變體· 一般來說，此文中所使用的異變體（variant)是將本發明的EBV CTL抗原決定基刪去一個或多個胺基酸，或是以不同胺基酸取代但本質上不改變其免疫誘發性·將某些胺基酸改變成具有廣泛相似特性的其他胺基酸，但並不改_ 變其免疫誘發性（保留取代，conservative substitutions)是為人熟知的技術· 選擇性取代（selecting substitution)會造成本質上功能改變，選擇性改變的保留度較小，其能被忍受的程度

第17頁 200416043 五、發明說明（14) 也相對較低· 一般來說，可能會造成蛋白質特性重大改變的取代作用有（a)親水基（如Ser或Thr)被疏水基（如A：La， Leu，I le，Phe或Val)取代；（b)Cys或Pr〇被其他基取代； (c)帶正電側鏈的殘基（如Arg，His或LyS)被帶負電的殘基 (如Glu或Asp)取代；（d)有大側鏈的殘基（phe或Trp)被小殘基（Ala或Ser)或無殘基（Gly)取代.

表4與SEQ ID N0S: 40 - 50提供了自然發生的EBV CTL 抗原決疋基異變體的特殊例子，如經化學修飾所產生的胺基酸殘基，生物素標定（biotinyla- tion)，與螢光染齊U 結合，加入抗原決定基標記（t a g )(如c - m y c，血凝素 (haemag- glutinin)以及FLAG), 以及能促使互補性蛋白表現偵測與純化的f u s i ο n p a r t n e r s (如麩胺基疏轉移？（glutathione-S-transferase),營光綠蛋白，六組織胺（hexah i st idi ne )與麥芽糖結合蛋白等，雖然不限於此. 在胺基酸的化學修飾方面包含但並不受限於以下作用，酿基化（acylation)修飾，amidination，Lys 的 pyr idoxy lat ion,烧 4匕還原(reductive alkylation),以 2，4，6 -三硝基本硫酸（TNBS)將胺基酸行三硝基本化作用，以過曱酸將Cysteine氧化成cysteis acid的羧基驢胺 (amide)修飾與硫氫基（sulphydryl)修飾，形成水銀衍生物，形成二硫化物（d i s u 1 p h i d e)與其他硫醇（ΐ h i ο 1 )化物的混合物，與亞蕴胺（m a 1 e i m i d e )反應，與峨酷酸 (iodoaceticacid)或乙醯胺（iodoacetamide)行 carboxymehtylation，以及在驗性pH下與氰酸行

第18頁 200416043 五、發明說明（15) carbarnoylation等，雖然不限於此· 在此方面，技術人員是指CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE 第15 章中 Eds. Coligan 等（John Wi ley & Sons NY 1 99 5- 2 0 0 0 )，此章中有廣泛的蛋白質化學修飾相關方法. 本發明的EBV CTL抗原決定基，EBV多抗原決定基以及包含此抗原決定基的蛋白質可以任何已知技術方法製造，包括但不局限於，化學合成，DNA重組技術，以及裂解 LMP1蛋白所得的胜？片段. " 在一個實施例中，EBV CTL抗原決定基可由化學方法儀[ 合成，包含固相與液相的合成.雖然參考文獻中有化學合成技術的範例，但這些方法是廣為人知的.其範例方法可見於SYNTHETIC VACCINES Ed· Nicholson (Blackwell Scientific Publications)的第9 章以及CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds Coligan et al., (John Wiley & Sons, Inc. NY USA 1995—2001).的第15 章·在此方面，參考文獻亦見於國際發表文章 (International publicati on)W0 99/02550 以及WO 97/45444· m 在其他實施例中，本發明的EBV CTL抗原決定基，更’ 佳的說法是，組成EBV CTL抗原決定基的蛋白質，可由技術人員照標準實驗步驟容易地製造出來，其實驗步驟範例詳述於Sambrook et al·，MOLECULAR CLONING.實驗手冊 (Cold Spring Harbor Press, 1 98 9 ),特另^是16， 17 章；

200416043 五、發明說明（16) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds.

Ausubel et al., (John Wiley & Sons, Inc. NY USA 1 9 9 5-2 0 0 1 )，特別是 10， 16 章；以及CURRENT pR〇T〇c〇LS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al., (John Wi ley & Sons’ lnc· NY USA 1 9 9 5- 2 0 0 1，特別是！ 5 及6 章· > 核甘酸與表現結構（expression constructs) 本發明提供一純化核甘酸，編碼本發明的EBV CTL抗原決定基或多抗原決定基. - 編碼本發明EBV CTL抗原決定基與異變體的核甘酸序 j 列被列於表4·編碼本發明其他EBV CTL抗原決定基的核甘酸序列，可容易地由已發表的完整LMP1編碼核甘酸序列推演出來，例如在Genbank Accession Number X58140 中. 本發明亦提供了編碼EBV CTL抗原決定基異變體的核甘酸序列，如表4所列（SEQ ID N0S: 63-65，67-69， 71 -76 以及78 -8 0 ). 編碼多抗原決定基的一純化核甘酸，其序列列於s E Q ID NO: 82以及圖8· 於此所用的π核甘酸（nu c 1 e i c a c i d)π意指單股或雙股的mRNA，RNA，cRNA，RNAi 以及DNA,其中 DNA 包括 cDNA 及翁 genomic DNA. •f多核甘酸（polynucleotide)’’是一個含有80個以上連續核甘酸的核酸（n uc 1 e i c a c i d )，而"寡核甘酸 (〇1丨忌01111(：16〇1：丨(16)”所含的連續核甘酸則少於8〇個.

第20頁 200416043 五、發明說明（17) π探針（probe)”可以是單股或雙股的寡核甘酸或多核甘酸，做上標記以適於北方點墨法（N 〇 r t h e r n b 1 〇 11 i n g ) 與南方點墨法（Southern blotting)中互補序列的偵測· 11引子（p r i m e r )n通常為一單股寡核甘酸，一般有 1 5 - 5 0個連續核甘酸可與其互補核甘酸’模板（t e m ρ 1 a t e )π 黏合（annealing), 並由MA合酸聚合酵素（polymerase)以模板為藍圖而延長，其DNA polymerase有Tag polymerase, RNA-dependent DNA polymerase 或 SequenaseTM. 本發明亦包括利用密碼序列重複性來做修飾的核甘 $ 酸· 在一個較特別的例子中，密碼的使用可以將核甘酸在特定有機體或細胞中的表現發揮到最大. 本發明的核甘酸中亦包含修飾過的嘌呤（pu r i n e s )(如 i no s i n e, methy lino sine 以及 methyl — adenosine)寺口修飾過的嘧啶（？71^11^〇^116)(如1：}^0111^(11116及 methy1cytos i ne ). 本發明亦提供了一表現結構（exp ression constructs)，此表現結構至少編碼一個，甚或大量的本發明EBV CTL抗原決定基. 適切地來說，此表現結構的組成是在一表現載體中 ® (expression vector)，將本發明的核甘酸序列與一個或夕個5周控型核甘酸序列操作性的連結· 表現載體中的”調控型序列”可包含加強子 (enhancer),啟動子（pr〇m〇ter)，spUce

第21頁 200416043 五、發明說明（18) donor/acceptor signals, Kozac sequence,終止子 (terminator)以及poly- a(jenyiati〇n 序列，它們以操作性連結，增加核甘酸序列或其所編碼蛋白質的表現· 於此所用的操作性連結（0 p e r a b 1 y 1 i n k e d )π是指本發明的核甘酸序列與調控型核甘酸序列有位置上的關聯，用以啟動，调郎或控制轉錄作用（transcripti〇n)· 調控型核甘酸序列通常對於表現用的宿主細胞或有機體較重要·在此技術領域中，適用於各種宿主細胞的表現載體或調控序列有許多種類. 在啟動子方面，結構性啟動子（如CMV，SV40， vaccinia，HTLV1以及人類延長因子啟動子）與誘導性/抑制性啟動子（如tet-repressible啟動子及IPTG-， metallothionine-或endysone-inducible 啟動子）皆廣為人知，而且亦包含於本發明中·若是為結合一個以上啟動子的雜交型啟動子（hybrid promoter)會更好· 適切地說，此表現結構包含一個以上的選擇性標記物 (marker)，這些標記物適用於轉型菌（如bia， kanR及 tetR)的篩選或轉型哺乳類細胞（如hygromyCine， G418以及嘌吟黴素（puromycin))的篩選. 表現結構也同時包含了一個fusi〇n partner(由表現載體特別提供），所以本發明中表現的重組蛋白是以 fusion protein表現· Fusion partner的好處是可以協助 fusion protein的辨識與/或純化.

Fusion partner 的範例已在前文中描述過· 一般來

第22頁 200416043 五、發明說明（19) 說，在以親和層析（affinity chromatography)純化 fusion protein 時，fusion partner 特別有用·在使用親和層析純化f usi on polypeptide時，層析的相關基質分別有抗體，蛋白質A-或G-，楚胱氨酸（glutathione)，直鏈澱粉（amyl ose-），以及鎳或鈷共軛樹脂·許多基質皆可買到整組的包裝，如適用於（HIS) fusion partner的

QIAexpressTM system (Qiagen)以及Pharmacia GST purification system. 適合於表現的宿主細胞可為原核或真核鈿胞，如大-腸桿菌（例如DH5 α )，乳酸菌，使用桿狀病毒表現系統的Sf 9❿ 細胞，哺乳類細胞株如淋巴球原細胞株，鼠科EL4細胞，以及純化自人或鼠等轉型宿主的脾細胞等等，雖不限於此· 表現結構可以任何以下技術導入宿主細胞或有機體，包括但不受限於此· heat shock transformation, 電穿孔法（electroporation)，DEAE-Dextran transfection(轉染），微注射（microinjection)，微質體仲介轉染（liposome- mediated transfection),硫酸甸沉殿，原生質融合，微粒子轟擊（microparticle bombardment), 病毒轉型等相似技術. 麵在一個特別實施例中，本發明提供一個表現結構形式，即多抗原決定基表現結構. 適切地说，此多抗原決定基結構適合於D N A疫苗使用由此實施例，編碼大量EBV CTL抗原決定基的核甘酸可由· 200416043 五、發明說明（20) 合成的募核甘酸來合成，以Splice Overlap by

Extension PCR 技術，此技術見於 Thomson et al.， 1995

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 5845. 在一些特別的形式中，本發明的表現結構可用於表現以及運送源自病毒的載體，如痘病毒與腺病毒. 當被使用為疫苗運送系統時，源自病毒的表現結構、經處理成VLPs或"裸露的’核甘酸專形式後可用於動物上在一特別實施例中，基於此實施例的一多抗原決定基表現結構是由牛痘（v a c c i n i a)病毒啟動子組成，如存在-於 plasmid vector 的ρ7·5 promoter. 4列如，Khanna et al·， 1992提出以標定物援助重組（marker rescue recombination)來生產TK —recombinant 牛# 病毒. 在一更加實施例中，本發明提供一腺病毒表現結構 (adenovirus-based expression construct)以用於疫苗運送糸統·腺病毒結構可用於感染大範圍的哺乳類或人類細胞，包括休眠或增生型細胞. ' 這種腺病毒表現結構可由結構性或誘導/抑制性的啟動子組成，如以四環素（t e t r a c y c 1 i n e)誘導/抑制的系統· 腺病毒表現結構的更佳形式為缺少一個以上E1基因的1 複製不全A5 腺病毒（replication-incompetent A5 adenovirus)· The Aden~X system of Clontech·即提供一此類系統· 下文詳細提供一特別好的腺病毒表現結構與疫苗運送

第24頁 200416043 五、發明說明（21) 系統. 藥劑組合物（Pha rmaceut i ca 1 compositions)與疫苗本發明亦提供由一個以上EBV CTL抗原決定基組& # 藥劑組合物，包含異變體與其衍生物，或是編碼相同抗原決定基的核甘酸表現結構. 更佳的藥劑組合物為π免疫治療組合物 (immun 〇 therapeutic composition)丨’，用於治療與預防處置前文所述的E B V相關疾病. — 在一特別實施例中，此藥劑組成物是疫苗. 疫苗形式可以為，由一個以上本發明EBV CTL抗原決定基組成的富含蛋白疫苗（proteinacious vaccine)形式，或是DNA疫苗形式，其特別例為前文所述的多抗原決定基表現結構. Μ A疫苗的合適相關技術可見於I n t e r n a t i ο n a 1 Publication WO 96/03144 and Thomson et al·， 1998， J· Immunol. 16 0 1717. 腺病毒結構的運送可經系統性施打於動物或是經由初級轉導抗原呈現細胞（f i r s ^ r a n s d u c i n g antigen-presenting cells)如樹突細胞，接著以轉導細胞施打於動物上. 在治療EBV相關疾病時，Ranieri et al. 1999 and 0&}1：16七81.於2〇〇1年提出了腺病毒轉導樹突細胞的運送範例.

第25頁 200416043 、發明說明（22) 適切地說，藥劑組成物更進一步由藥劑上相符人體，稀釋劑或賦形劑所組成· σ ^取 "藥劑上相符合的載體，稀釋劑或賦形劑”是指固體液體過濾、器，稀釋劑或做成膠囊的物質算可u y-么 ' 、任糸統處理時安全的使用·依處理4的特殊途徑來使用各種不同體·這些載體可能為下列物質，包括糖類，澱粉，纖維$ 與其衍生物，麥牙，動物膠，滑石，硫酸鈣，植物油，'二成/由，多元醇（P〇ly〇ls)，藻酸（alginic acid),碟酸緩衝液，乳化劑，專張鹽水與鹽類如包括氯化氫的礦物酸-鹽，溴化物與硫化物，有機酸如醋酸鹽，丙酸鹽 (propionate)與丙二酸鹽（malonates)，以及無熱原水 (pyrogen-free water). 有一篇描述藥劑上相符合的載體，稀釋劑或賦形劑的參考文獻，可見於前文所提及的Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N. J. USA, 1991). 可用任何女全途徑提供病患本發明的組成物·例如經由口，直腸，腸外注射，舌下，口腔，以及靜脈内，關節内，肌肉内，真皮内與皮下的注射，或經由吸入，眼球内，腹膜内，腦室内或穿透皮膚等類似途徑·例如，肌肉響内與皮下注射較適合於致免疫性組成物，富含蛋白疫苗以及DNA疫苗的施打. 藥劑形式包括藥片，散佈物（d i s p e r s i ο n s )，懸浮物，注射劑，溶液，糖漿，藥錠，膠囊，栓劑，喷劑，穿透皮

第26頁 200416043 五、發明說明（23) 膚的貼片等類似形式.藥劑形式也可包括注射或移植一種專門性裝置，此裝置受到控制，會釋放藥劑，或是其他形式的移植物，其經過修飾而有其他作用· 控制藥劑釋放可受其包覆物影響，有疏水性聚合物包括丙烯酸樹指，犧，高脂肪酒精（higher aliphatic alcohols)，多乳酸 (polyactic)與多甘醇酸（polyglycolic acids),以及一些纖維素衍生物如經丙基甲基纖維素 (hydroxypropylmethyl cellulose)·另夕卜，控制藥劑釋放也可能受其他物質使用而影響，如聚合物基質，微脂-體 (liposomes)且/ 或微球體（microspheres)· 適合口服或腸外注射的本發明藥劑組成物可以獨立單位呈現，如膠囊，小袋（sachets),，或藥片，每單位含有一種以上特定量的本發明藥劑，其中藥劑形式可能是粉末，顆粒，溶液，水溶液中的懸浮物，無水溶液，油分散於水中的乳膠或水分散於油中的乳膠·這種組成物可用任何配藥方法配製，但每種方法皆包含一項步驟，將含有_ 種以上必須成分的載體與一種以上上述藥劑結合· 一般來說，本發明的藥劑與液相載體或精細分隔的固相載體或兩者皆有，做完全一致的混合後製成組成物·之後若必須的話，在將產物塑成想要的外型. 可用與藥劑設計相容的方法來處理組成物，並做成有藥學作用的劑量·在本發明文章中，對病患投治藥劑的劑量應能在一段適當時間後在病患身上產生有利反應·投户的劑*2：應由醫師判斷，視投治對象的各種因素而定，如年

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性別，體重，一般健康狀況等在一個免疫療法組成物與疫苗的特別例子中，”藥劑上相符合的載體，稀釋劑或賦形劑”可為一增效劑 (adjuvant)·在此技術中將會了解，„增效劑，，是由一種以 ^物質組成，可增加疫苗的致免疫性與效力，增效劑無限疋的例子，包括奢又油（s q u a丨e n e)與鼓鯊稀（s q u a 1 e n e ) (或其他動物油）；抗衝共聚物（bl〇ckc〇p〇丨y[ners);洗滌

劑如 TweenR?80; QuUR A，礦物油如 Drakeol 〇r Mar co 1，植物油如花生油；c〇ry nebac t er i um衍生增效劑" 如Corynebacterium parvum; Propionibacterium 衍生增效劑如Propionibacterium acne;牛分枝桿菌 (Mycobacterium bovis) (Bacille Calmette and Guerin or BCG);百日咳博德氏桿菌抗原（B〇rdetella pertussis antigens);破傷風類毒素；diptehria類毒素；介白素 (interleukins)如interleukin 2 and interleukin 12; 單核球激素（monokines)如interleukin 1;腫瘤壞死因子；干擾素（interferons)如 gamma interferon;組合物如皂甘铭氩氧化物（saponin?al uminium hydroxide) or

Quil?A aluminium hydroxide;微脂體；ISCOMR 舆 I SCOMATR I XR增效劑；結核桿菌（myC〇bac t er i a 1 )細胞壁粹❿ 取物；合成性糖胜（glycopeptides)如胞壁驢雙胜（muramyl dipeptides)或其他衍生物；Avridine; Lipid A衍生物；硫酸翻聚葡萄糖（d e X t r a n s u 1 f a t e);單獨的 DEAE?Dextran或與硫酸銘的混合物；carboxy-

第28頁 200416043 五、發明說明（25) polymethylene 如 Carbopol, EMA ;丙烯酸共聚物（a cry 1 i c copolymer)乳膠如心〇^1人64 0 (6.2.11.3.?81:.心· 5,0 47,238 );水分散於油中的乳膠如Montanide ISA 7 20; 小兒麻痒病毒，牛疫或動物痘病毒蛋白；或這些的混合物· 在疫苗次單位方面，這種疫苗的一個製配範例是以 ISC0MR來製配，其描述於國際發表刊物W097/45444. 抗體（Antibodies) 本發明亦包括對抗EBV CTL抗原決定基的抗體· 一本發明的抗體可以是單株或多株的抗體·抗體製造，純化與使用的方法可見於Col igan et al.，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons NY, 1991-1994)的第二章中以及Harlow， E. & Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring

Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1 9 8 8,兩者皆可見於此說明的參考文獻. 一^般來况，本發明的抗體會與本發明的一個多？，片段，異變體或衍生物鍵結或接合·例如，抗體可能由多株抗體組成·製備這種抗體，可以將多？，片段，異變體或衍生物打入一生產用的物種，包括家鼠與家兔，以獲的多株抗體血清·技術熟練者皆熟知製備多株抗體的方法.可以使用的典型實驗步驟見於之前所提的Col igan et a 1.， CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,以及Harlow &

Lane, 1 9 8 8.

第29頁 200416043 五、發明說明（26) 用於代替多株抗體血清，單株抗體可以標準方法來製備，其範例詳述於之前所提的K〇hler & Milstein， 1 9 7 5，

Nature 256， 495，或最近修飾的c〇iigan et al.， CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY.將一種以上多？，片段，異變體或衍生物接種到生產用的物種，取其不死的脾臟細胞或其他抗體產生細胞來製備單株抗體· 本發明亦包括上述單株或多株抗體中，組成抗體的Fc 或Fab片段·另一說法是，抗體可由對抗本發明純化蛋白的單鏈抗體Fv(scFvs)所組成·這種scFv可以依照下列各文中的方法來製備，United States Patent No m 5,091，513， European Patent No 239,400 或Winter & Milstein，1991，Nature 3 49 2 93 的文章，見於參考文獻· 標記與本發明的抗體或抗體片段有關，才示§己可自下列各物選出使用，包括呈色劑，催化劑，酵素，螢光劑，化學冷光分子，鋼系離子如E u r 〇 p i u m (Eu34)，放射性同位素與直視標記（direct visual labe 1 ) ·直視標記可以由下列物質組成使用，包括金屬或非金屬膠體力子，染色粒子，酵素或受質，有機聚合體，乳膠顆粒，微脂體，或其他含有訊號產生物質的小囊泡，⑩ 以及類似物質. 於United States Patent Specifications U. S. 4, 366, 241，U.S· 4, 843, 000，and U.S· 4, 849, 338 詳細陳述許多可用來做標記的酵素，資料可查於此說明的參考

第30頁 200416043 五、發明說明（27) 文獻中· 本發明中有用的酵素標記有，鹼性磷酸？（alkaline phosphatase)， horseradish peroxidase, 螢光酵素（luciferase)，b-galactosidase，葡萄糖氧化媒（glucose oxidase),溶菌？（lysozyme),韻果酸去氫？（malate dehydrogenase)以及類似物質·蛋白質標記可以單獨使用或者與溶液中的第二個蛋白質結合來使用. 雖不限於此，但經由範例，螢光染劑可為 fluorescein isothiocyanate (F I T C ) , Oregon green, tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITL), 一 allophycocyanin (APC)以及R-Phycoerythrin (RPE) · φ 所以本發明可容易地被理解並付諸實際作用，下列非限制性的範例可引導技術人員，其中範例一提出本發明 EBV CTL抗原決定基的說明與免疫特性描述，範例二則提出腺病毒仲介的EBV多抗原決定基運輸方式· 範例範例一材料與方法細胞系的建立與維護 _ 以Β95.8，BL74與QIMR-WIL病毒分離群來將周邊β細胞做外源性病毒轉型（transf ormation)，由血清呈陽性的捐贈者來建立EBV轉型的LCLs.這些細胞系例行性地保持在下列培養基中，RPMI 1 64 0 添加 2 mM L-glutamine， 1〇〇

第31頁 200416043 五、發明說明（28) IU/ml penicillin 以及 100 mg/ml streptomycin plus 10% foetal calf serum (FCS).此外，胜？運輸物 (TAP)-negative B x T 雜交細胞系.174 ’ CEM.T2 (稱為T 2 ) (S a 11 e r 1 9 8 6 )做胜？穩定性分析· 為了產生PHA(植物性凝血素）裂殖胞，以PHA刺激PBMC(人類周邊血液單核球細胞）（CSL Ltd，Melbourne, Australia)，培養三天後，在培養基中加入MLA 144上清液與高度純化的重組人類11-2(]：11_2).每兩週更換社八與rIL -2上清液以使PHA裂殖胞增殖，最多至六週· - 病毒分離群（isolates) L C L s (淋巴球原細胞株）由一組不相干的健康捐贈者來建立，這些捐贈者為血清呈陽性的非洲人，高加索人以及巴布亞新幾内亞人·建立的方法為，在有0.1/zg/ml環包素A(cyclosporin A)的條件下（Mossl 988 )，讓培養的周邊淋巴球自發性的生長·總數為29的自發性LCLs( 11個高加索人1 1個巴布亞新幾内亞人2個非洲人以及5個東南亞人）被用來使每個獨立個體重獲其固有的EBV分離群.此外由EBV帶原的鼻咽癌活體切片直接定序丨6種來自東南亞人的病毒分離群· EBV基因片段的PCR與DNA定序特定單股核甘酸引子位於LMP1側面不同區域中，我們選這些引子來做PCR(表1)· PCR的產物以QiAquick spin

第32頁 200416043 五、發明說明（29) columns (Qiagen Inc· Cha tsworth, CA)純化，而且遵照製造者的實驗步驟以PRISM ready reaction dyedeoxy terminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems Inc·， Foster City, CA)從兩端做定序. 合成胜？（peptides) 胜？的胺基酸序列是由公佈的LMP1序列而來，這些 LMP1序列是原自高加索原型1 EBV strainB95.8.用 Merrifield solid phase method (M i motopes Pty Ltd； Melbourne，Australia)的方法在胜？自動合成器上合成45 ‘ 個胜？，胜？長度為1 7個胺基酸長，8個殘基重疊，且橫跨整個LMP1序列.胜？部分溶於2 0% DMSO at 2mg/ml中· EBV 陽性血清捐贈者（Seropositive donor) 招募一組來自不同種族的4 2位健康病毒帶原者與鼻咽癌患者來進行此研究·每位捐贈者經血清與PCR的DNA血型鑑定法後皆確定為HLA型. INF- r -ELISP0T 分析 EL I SPOT分析是用來得知，帶有LMP1胜？的陽性血清捐· 贈者其PBMC經刺激後是否能誘導τ細胞表現INF- r ·簡言之，將96個充分混合的纖維素醋膜盤（ceiiui〇se ester

membrane plates) (Millipore， Bedford, USA)預先塗上 100mL/well 的10mg/mL of anti-IFN-g mAb， 1-D1K

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五、發明說明（30) (Mabtech，Stockholm，Sweden),放在4°C 隔夜·每盤以 PBS沖洗3次，不具活性的部位以5%的牛胎血清佔住以阻隔·由HLA型健康EBV帶原者的全血中以Ficoll-Hypaque (Sigma)密度梯度離心分離出PBMCs.將PBMCs加入三個一組的we 11中，每well體積1〇〇mL$2· 5 ’ 105個細胞·然後將胜？加入PBMCs中，使最後濃度達5mg/Ml·同時做一組含三種不同細胞數的測試，三個we 1 1分別含2 . 5 ’ 105， 5 105 及1 ’ 105個PBMC細胞·分析PBMCs對不同濃度胜？的反應，胜？濃度分別為10mg/mL，5mg/mL及 — lmg/ml · 在負性控制實驗中，PBMCs培養在為加胜？的培養你基中·在3 7 °C， C02濃度5%下培養至隔天（約16-20小時），再前後分別以 PBST(0.05% of Tween-20 in PBS)與 PBS 沖洗三次，然後每well加入100 //1的lmg/mL anti-IFN - g mAb, 7-B6-1 (Mabtech, Stockholm, Sweden),室溫培養 3-4小時· 培養後再前後分別以PBST與PBS沖洗三次，在於每 well 力口入 100 //1 的 lmg/mL streptavidin-alkal ine phos- phatase conjugate (Sigma)，室溫培養2 小時·然後再前後分別以PBST與PBS沖洗三次.用鹼性磷酸？共軛受質與5 — bromo — 4 — ch1oro—3一indo1y1phosphate 矛口 nitroblue tetrazolium (BCIP /NBT; Sigma)進行30 分鐘到1小時的呈色反應，就可以看到呈黑點狀的個別I F N- g 製造細胞·以影像偵測軟體自動計算點數（I mag ePro) (Bharadwaj2001)，並以SFC(spot-forming cel ls)/106PBMCs表示.分泌IFN-g的T細胞，其數目計算

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五、發明說明（31) 是將實驗組的SFC值減去負性控制組的SFC值· 除去CD4+與CD8+細胞用抗人類C D 4 +或C D 8 +免疫磁性微小球 (i_unomagnetic beads)來去除新鮮PBMCs 中的CD4 + 或 CD8+細胞（Dynabeads M4 5 0-CD4 and M4 5 0-CD8)，分別為 (Dynal，Oslo，Norway)·之後以FITC-conjugated anti-CD8及PE- conjugated anti-CD4 antibody雙重染色，用Coulter EPICS XL細胞計數器的流式細胞儀（flow cytometry)確定上述去除作用的效率.以faCScan分析法可確定此實驗方法能除去>95%的CD4 +或CD8 +細胞·再重新計算一次細胞數，再將細胞溶於Ri〇中，並設置於一組三份的ELISP0T分析中. 多株CTL細胞系與LMP1專一性CTL同源細胞株的建立依先前公佈的方法（M〇ssl988; Khannal998)來建立多株 CTL· 細胞系（Poly- clonai CTL lines)與 LMP1 專一性 CTL 同源細胞株（LMP卜speci f ic CTL clones)·簡言之，在 wel 1體積2ml共24 wel 1的盤中用10 # μ的胜？與1 ， 106 個自體免疫細胞刺激2 ’ 1 06個PBMCs(刺激物對反應物比值為1:2)· 3天後加入含有IL —2 (1〇u/ml)的培養基讓細胞繼續增殖·到第7天時以r放射性（8 0 0 0 rad)自體LCLs再 -人刺激淋巴球·十天後，這些細胞成為多株細胞，在5 1C r 放射標準分析中作為對抗胜？至敏自體PHA裂殖胞

第35頁 200416043 五、發明說明（32) (peptide-sensitised autologous PHA blasts)的作用物· 為了產生對LMP1衍生胜？有專一性的周邊血液ctl同源細胞株，在well體積2ml共24 well的盤中加入培養基，並以胜？至敏的（l〇Ug 〇f peptide/ml)自體免疫細胞（1 ， 106)重新活化健康捐贈者的PBMCs(2 ’ 106). 3天後將細胞接種到〇 · 3 5 %的瓊酯糖上（a g a r 〇 s e )，並培養於含有I L - 2 (lOU/ml)的τ細胞培養基中· 3天後，長出的細胞株被轉移到圓底的96 - well培養孤中（Life Technologies)，並培養於含有IL - 2 (10U/ml)的T細胞培養基中· T細胞對丁細胞的殺害（T cell-丁 cell killing) 此項技術（B u r r o w s， 1 9 9 2 )的原理為，C T L細胞會對彼此呈現抗原，誘導特定胜？，導致T細胞殺死T細胞.CTL 同源細胞株（約3〇〇〇6113/*611)培養在含1〇11^胜？的25//1 T細胞培養基中·於37 °C培養3小時後用倒立顯微鏡觀察細胞溶解情形. 細胞毒性分析以合成的抗原決定基預先將標的細胞行致敏反應，然❶ 後以5 1 Cr培養9 〇分鐘·培養後以培養基沖洗細胞，將這些細胞作為5小時51 Cr放射標準分析的標的物（Moss， 1 98 8 ). MHC穩定性分析

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五、發明說明（33) 由EBV純化群得HLA A2限制型LMP1抗原決定基異變體，為了讓此異變體結合到MHC上，將T2細胞與2 0 0 // 1的每種胜？ (100 //g/ml)在26°C下培養14-16小時，接著在於37 °C下培養2-3小時.培養後以特定的單株抗體（〇82，八1[(：(：)，用 FACS方法測量HLA A2的表現. 結果 LMP1專一性T細胞在不同種族健康病毒帶原者體内的表現為了充分描述記憶型T細胞對陽性血清病毒帶原― 者體中LMP1的反應，我們使用ELISP0T分析法·這種分析法可以在體外快速地描繪LMP1專一性免疫反應而不會增長體内的細胞群·以整組具重疊性的4 5個LMP1胜？刺激自帶原者體中分離出的PBMC，並偵測會產生INF- r的細胞"^圖 1A及B代表用整組胜？做ELI SPOT分析的數據· 17個健康捐贈者中有7位有強烈的體外反應，在45種胜？中有7種有= 烈反應（3?(：範圍由39到8 24/ 1 0 6?6^1(：)(圖1人）·這此反鹿的一個有趣現象為，大部分的T細胞反應都直接針對這^ 存在於LMP1中跨膜部分與CTAR1區域的抗原決定基，然^ >又有任何反應是針對c τ A R 2與N端的部分（圖1 β ) ·特別的是，CTARl domain中幾乎有8〇%的區域皆會被了細胞你定·圖1列出所有會被不同捐贈者辨識的胜？，每個胜？3人不 17個胺基酸（l7mer peptides)·為了找出能對這些胜反應的T細胞，我們從7位會辨識l7mer胜？的捐贈者;八出PBMCs’將其分成CD4消去型與CD8消去型兩群，然後7再

200416043 五、發明說明（34) 用ELISP0T分析法檢測·這些胜？中有5個對CD4+與CD8+ 丁細胞皆有活性，這顯示這些序列在MHC第一型與MHC第二型限制性抗原決定基中皆存在· 再另一方面，胜？DWTGGA LLVLYSFALML清楚的只對CD8+ T細胞有活性· 然而對胜？TDDSGHES DSNSNEGRH的反應則是CD4+ T細胞佔優勢（圖 2A&B).胜？TDDSGHESD SNSNEGRH 對CD4 的反應與先前Leen 等所觀察到的結果一致，Leen等繪出HLA DQ2限制型抗原決定基的序列圖. LMP1專一性T細胞反應的詳細緣圖使用經過刪減的17mer胜？做ELI SPOT分析，得LMP1專一性CD 8+ T細胞反應妁細部繪圖·實驗起初以1 2mer重疊性胜？來做分析，以繪出17mer胜？中產生免疫反應的區域·圖 3 A-D中的胜？取自4位捐贈者的1 2mer胜？分析數據· 共有 12種12mer胜？被認為可能是決定因子（表3)·基於這些 12mer胜？，我們用橫跨1 2mer胜？的9mer胜？來界定出抗原決定基的隶短序列·圖4 A-D為4捐者的數據·共有18種 9mer胜？被認為可能是最短的抗原決定基序列（表3) ·其中兩種（YLLEMLWRL and YLQQNWWTL)在之前已被確定是CTL抗原決定基（Khanna， 1 9 98 )，而其它的則是在此研究中第一鄱次被發現. 新LMP1 CTL抗原決定基的特性描述為了進一步描述最小T細胞抗原決定基的特性，我們

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五、發明說明（35) 製備出對這些抗原決定基有專一性的多株CTL細胞系與同源CTL細胞系·用合成的胜？刺激來自陽性血清健康捐贈者的PBMCs，並以5 lCr放射標準分析來建立CTL同源細胞株或多株細胞系· 圖5與圖6為兩種新抗原決定基（I ALYLQQNW and ALLVLYSFA)的一系列數據·先以胜？致敏性自體PBMC 來刺激，接著再以放射性自體LCL連續重複刺激以產生 I ALYLQQNW胜？專一性同源細胞株·用51 Cr放射標準分析來篩選出對胜？致敏性自體與異體PHA裂殖胞以及LCLs有活性的I ALYLQ QNW胜？專一性同源細胞株·圖5A清楚地顯示「 I ALYLQQNW胜？專一性同源細胞株在辨識標的細胞及LCLs 時，兩者共的同區域只有HLA B5 7，這表示此抗原決定基只受HLA B57對偶基因限制·用最小抗原決定基來滴定自體PHA裂殖胞進一步確定了 CTL同源細胞株的精細專一性· 先前對HIV CTL抗原決定基的研究顯示，相似的HLA第一型分子可呈現出完全相同的CTL抗原決定基（Goulder et al·， 2 0 0 0 )·因為一般的HLA B57與HLA B58亞型只有幾個胺基酸的差異，而且他們有相似的胜？結合區域，所以我們便探究IALTLQQNW是否也會受到HLA B58對偶基因的限制·我們對兩位HL A B58陽性血清健康捐贈者的研究也確實顯示對IALTLQQNW抗原決定基有強烈反應（表3).這些觀察顯示，此抗原決定基展現出對HLAB57與HLAB58的雙重 HLA限制·用與上述相同方式來確認HLA-A2限制型CTL抗原決定基·以胜？專一性T細胞系來確認ALLVLYSFA的HLA A2 限制性（圖6 A ) · 接著以最小胜？劑量反應分析來證實

第39頁 200416043 五、發明說明（36) A L L V L Y S F A抗原決定基專一 C T L同源細胞株的精細專一性 (圖 6B)· 其他171^1^胜？，了00 30心303化—01^，在£113?01[分析中表現出與CD8 +丁細胞有反應，分析中有3/21的健康捐贈者其反應大小介於131-190 SFC/106PBMC之間（圖ία).取自兩位不同捐贈者的多株C T L細胞系會辨識以胜？包覆的自體PHA裂¾胞（數據未列出來）·有兩位捐贈者（MM與RE)會分別辨識胜？ESDS NSNEG與DSNSNEGRH，但這些最小的胜？並不會導致C T L細胞系的產生·值得注意的是，L e e η等之前已繪出一個位於1 7個序列之間的HLA DQ2限制性Τ細胞抗原決定基（表3 ) · 不同人種對HLA第一型LMP1 CTL抗原決定基的辨識為了確定對HLA第一型LMP1 CTL抗原決定基辨識的頻率，我們用E L I S Ρ 0 丁分析法從一組不同種族的健康病毒帶原者中篩選出PB MC ·分析的詳細摘要列於表3 .此分析中包含4種不同的HLA第一型限制τ細胞抗原決定基以及一種 HL Α第二型限制Τ細胞抗原決定基.我們觀察到有3 5 _ 4 5 %的受測者對HLA-A2 限制型 YLLEMLWRL，YLQQNWWTL 與 ALLVLYSFA抗原決定基有強烈反應這些反應在高家索人中有較高的一致性，而這些抗原決定基被東南亞人辨識的頻率則較低· HLA-B57限制型IALYLQQNW扛原決定基會被 5/7的HLA B57陽性個體辨識·有趣的是一些HLA β58陽性捐贈者（3/5)對此抗原決定基也有辨識率，而且其辨識率

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200416043 五、發明說明（37) 與HLA B57陽性捐贈者相同，由此進一步證實了此抗原決定基有雙重的HLA第一型限制性· jjLA第二型限制LMP1抗原決定基TDDSGHESDSNSNEGRH會被所有三位健康的病毒帶原者所辨識. 源自不同地理區域的EBV分離群其HLA第一型限制LMP1 CTL 抗原決定基的序列分析我們實驗是目前與先前的工作皆專注於LMp丨抗原決定基（Khanna， 1 9 9 8 )，用reference type IEBV strain，- Β95· 8再活化的CTLs來確認LMP1抗原決定基·然而在治療 EBV相關惡性腫瘤時，這種抗原決定基若是有療法的基礎，我們就必須首先確定這些抗原決定基的編碼序列在世界各地不同族群的不同EBV中保留的程度為何·因此，我們從健康病毒帶原者與NPC活體切片中分離出許多ebv，並將其編碼L Μ P1抗原決定基的D N A區域做序列分析.四種 LMP1 抗原決定基（IALYLQQNW，ALLVLYSFA，YLLEMLWRL and Y L Q Q N W W T L)序列分析結果的詳細摘要列於表4 ·由高加索，非洲以及東南亞人中分離出的病毒，其HLA A2限制型 (ALLVLYSFA 與 YLQQNWW TL)以及 HLA B57 與 B58 限制型（I ALYLQQNW)皆高度保留（表4).只有少數顯示出有輕_ 微的序列變異·在巴布亞新幾内亞人中，雖然YLQQNWw TTL and I ALYLQQNW抗原決定基通常是保留的，然而取代的情形在ALLVLYSFA中更加普遍.每單一個分離群中.就有一個明確的改變，在第7位置由Ser變為Ala (.表4).

第41頁 200416043 五、發明說明（38) 對不同人種的HLA A2限制型抗原決定基（YLLEMLWRL) 做序列分析發現了一個有趣的基因變異形式· 高加索人中有5/11對抗原決定基YLLEM LWRL表現出B95.8的原型，其他7/11則有一些改變，影響一個以上的殘基（表4). 在四個分離群中，位置2的leucine，位置5的methionine以及位置8的arginine分別被取代為phenylalanine， isoleucine以及glycine· 其他兩個分離群在位置2與位置 5或只有位置5有取代情形· 分離自東南亞族群的病毒，其序列分析顯示幾乎所有分離群皆有相同的取代情形，其-中包括位置2(L—F)與位置5(M—I)的取代·有一個分離群在4 位置4有突變（E — D )·在這必須重要地強調，自發性L C L s 與NPC活體切片所分離出的病毒一般都表現出相同的突變形式（表4 ) · 在東南亞分離群中，並沒有檢測到任何的野生型·有趣的是在東南亞人中發現到的抗原決定基 YLLEMLWRL顯性基因變異（YFLEILW RL)也經常出現在高加索人的病毒中. 為了更進一步確定抗原決定基YLLEMLWRL其基因異變體的特性，我們合成每種基因異變體的胜？，並用EBV專一性CTLs來做HLA結合與免疫辨識的實驗·圖7顯示，在致敏性自源PHA裂殖胞水解專一性CTL同源細胞株時，大多數異_ 變體胜？的作用效率皆比野生原型YLLEMLWRL的抗原決定基低.只有一種變異序列YLLEILWRL與野生型有相同的辨識率圖7A·而且在以常見於東南亞人的異變體（YFLEILWRL) 培養T2細胞時，並無法挽救HLA A2的表現（圖7B).然而其

第42頁 200416043 五、發明說明（39) 他異變體（丫？1^11^^丫1^£11^1^與丫[1^11^1^)卻明顯地增加T2細胞上MHC的表現· 這表示造成這些異變體喪失其抗原性質的原因是T細胞接受體與MHC胜？複合體間作用不佳，而不是MHC與胜？不結合. 範例二材料與方法合成一個重組的LM P 1多抗原決定基插入子編碼多抗原決定基胺基酸序列的DNA序列是由通用密· 碼子（codon)所編成·我們將有20個鹼基對重疊的5條代表多抗原決定基的募核甘酸（引子卜5的範圍在74-1〇〇鹼基之間），用圖8 所示的〇veriap Extension and stepwise asymmetric PCR以剪接方式使它們黏合在一起簡言之，用開始時為南溫的PCR反應（94。C for 1分鐘）來放大 LMPj與LMPB的多抗原決定基專一性引子，反應體積2〇 “ ^ 内含聚合酵素混合物與PCr缓衝液，反應進行5個循環 5 個循環終了時，PCR程式會停在72t，將上述液體2“·1 移到72 °C預熱的反應液中，與LMpc引子及多抗原決定美一性前置引子作用，反應體積20 /z i，進行另五個循環土在第10個循環時，程式會再度停頓，再將2 轉移到'"新船反應溶液中，與LMPD引子及多抗原決定基專一性前置作用，，應體積20 進行另五個循環.重複PCR步驟亩到二有券核甘酸都已接合·在最後一個步驟中，用多. 決定基序列專一性前置引子與倒置引子將最後一個步ς的

第43頁 200416043 五、發明說明（40) 2 A1反應液做2 5個循環的放大. 編碼此片段的核甘酸序列從5 ’端起依序為一個Bam Η I 限制？辨識位置，一個Κ 〇 z a k序列，一個m e t h i ο n i n e起始密碼，13個連續的最小LMP1與LMP2 CTL抗原決定基（表5)，一個停止密碼，一個EcoRI限制？辨識位置（圖8) ·將純化出的全長片段接入pcDNA3表現載體的BamHI/EcoRI位置，做序列分析已確定無突變. 製備Ad 5-LMP多抗原決定基疫苗載體 ~ 使用 Adeno-X System (CLONTECH，Palo Alto，CA)高養. 效率的接合方法{Mizuguchi 1 99 8 & 1 9 9 9 }來製備重組的 A d 5腺病毒（圖8 )· L Μ P1多抗原決定基插入子被接到 pAd-Track的EcoRI與BamHl位置上，再用轉移感染 HEK293細胞（人類胚胎腎臟293細胞）將重組的Ad5載體包入感染性腺病毒中·以冷凍-溶解方法取得轉感染細胞. 建立並維持細胞株用B 9 5 · 8病毒分離群將周邊B細胞做外源性病毒轉型以建立EBV轉型的LCLs·這些細胞株一直被保存在添加有2 mM L-glutamine, 100 IU/ml penicillin and 100 streptomycin 與 10% FCS (培養基）的rpmi 1 64 0 中 (Gibco Invi- trogen Corp., Carlsbad, CA).此外， HEK293細胞{Graham, 1977}被保存在含i〇%牛胎血清 (fetal bovine serum)的DM EM 中·

第44頁 200416043 五、發明說明（41)

Ad5-LMPPoly載體轉殖HLA A2/Kb基因轉殖鼠的免疫作用此研究中所使用的HLA A2/Kb基因轉殖鼠已於別處描述過（Theobald 1997)·這些老鼠會表現0]1111161^(： class I分子，這個分子的結構組成為，人類A*0 2 0 1對偶基因的 alpha 1 與alpha2 domain,以及老鼠h—2Kb class I 分子的alpha 3 domain.用腹腔注射位老鼠接種疫苗，打入1〇8 呈斑單位（plaque forming units，？1?1])的^5— LMPp〇1y 或控制組的腺病毒· 3週後收成脾臟細胞，並測試抗源決_ 定基專一性T細胞反應·用此說明文中所述的體内CTL分析以及E L I S P 0 T分析檢測T細胞反應· 激發腫瘤形成和多抗源決定基的免疫作用以兩種不同接種方式來有效施打LMP多抗源決定基疫田.苐一個貫驗方式為，腹腔注射Ad5- LMPpoly或控制組的腺病毒（109 PFU/mouse)使HLA A2/Kb老鼠產生免疫作用，3週後再皮下注107個射活的虬4 —A2/Kb —LMpi細胞以誘發腫瘤·規律性觀察2 1天並以尺規測量腫瘤大小·第二個貝驗方式為，先以l〇7cell/m〇use的EL4-A2/Kb-LMP1腫瘤細胞打入老鼠以誘發腫瘤，1 〇天後當腫瘤直徑大小約 0.2cm時，再以Ad5- LMPpoly或控制的腺病毒誘發老鼠的免疫反應·規律性觀察腫瘤縮小的情形以判定LMP多抗源決定基疫苗的治療效率依照institute animal ethics aommi tee的準則，老鼠腫瘤若大於1 · 〇cm則必須使其死亡，

第45頁 200416043 五、發明說明（42) 結果 CTL多抗源決定基的内源性加工與CTL辨識作用為了測试多抗源決定基（Ad5 一LMPp〇ly )所編碼的LMp抗源决疋基（表5)是否為内源性加工（end〇gen〇USly process)，我們將被Ad5-LMPpoly感染的標的細胞與LMP1 或LMP2專一性CTL多株細胞混合·這些CTL細胞株是來自於健康的病毒帶原者·被Ad5 —LMPp〇ly感染，與HLA相符的纖維母細胞或LCLs能有效地被個別的LMP專一性CTL細胞—株所辨識（圖9 ) ·這些結果清楚地顯示，腺病毒多抗源決定4 基中的HLA第一型限制性^!^多抗源決定基能被有效的加工並呈現給標的細胞. 在接下來的實驗中，用腺病毒的多抗源決定基刺激 CTL使其在體外產生二級反應，這些CLt源自於健康EBV陽性血清個體的p B M C ·所產生的多株細胞系作為對抗自源性 ΡΗΑ裂殖胞的作用物，這些裂殖胞已先被LMP1與LMP2抗原決定基致敏化·圖10的數據清楚地顯示LMP多抗原決定基能高度有效地喚起多重CTL反應，其反應對每一位捐贈者 HLA對偶基因所表現的抗原決定基有專一性.例如，LMP1 〇多抗原決定基會引發Τ細胞對抗原決定基YLQ (HLA A2-restricted， LMP1)以及CLG (HLA Α2-restricted,

LMP2)的強烈反應，與抗原決定基ALL (HLA A2-restricted， LMP1)以及YLL (HLA A2-， A68- and A69-restricted，LMP1)也有反應·

第46頁 200416043 五、發明說明（43) 相反的是，以EBV轉型LCLs刺激誘導LMP專一性T細胞的表現程度很低，而且其溶解LMP致敏性標的細胞的反應低於可被债測的程度（數據未顯示）.

Ad5-LMPpoly疫苗的免疫作用反轉TLMpi表現腫瘤的生長為了檢測腺病毒LMP 1多抗原決定基疫苗所誘導的T細胞反應是否能對抗表現LMP1的腫瘤，用Ad5- LMPpoly或控制組的腺病毒免疫誘導兩組HLA A2/Kb老鼠（10隻老鼠一組），誘導14天後再aEL4_A2/Kb-LMPl細胞誘導腫瘤形成，並規律觀察腫瘤生長情形·雖然兩組都有腫瘤長出，但以$ 控制組腺病毒感染的老鼠腫瘤生長情形較劇烈，而且對腫瘤的誘導形成並無顯示任何保護作用（圖丨丨）.於此必須強調，兩組對腫瘤的誘導皆無保護作用，這表示抗原決定基專一性的免疫反應是此保護作用的關鍵（數據未顯示），討論霍奇金氏病與鼻咽癌有一個共同的特徵，其Εβν抗原決定基的表現通常都受EBNA1，LMP1與LMP2所限制·其中 EBNA1為保遵作用，避免HLA第一型典型路線的進行 (Levi tskaya，1 9 9 5 )，所以只有LMP1與[肝2為標的性抗原，$用於發展新的免疫策略以治療霍奇金氏病與鼻^ 癌·其治療方法主要在增加T細胞對LMP抗原決定基^反應，這在治療復發的霍奇金氏病與鼻咽癌時將會很有我們採用ELI SPOT分析以充分描繪一組病毒帶原者中[ΜΗ

第47頁 200416043 五、發明說明（44) 專一性T細胞的反應·在這些受測者中，5 5-6 0%的高加索人有LMP1專一性τ細胞的反應，另一方面，這種反應在東南亞的病毒帶原者與鼻咽癌患者中則較少見· 目前研究有一個有趣的現象，8 0 %以上的T細胞反應都是直接作用於貫穿細胞膜的區域以&CTAR1 d〇main·特別有趣的是，不同的受測者皆會優先結合CTAR1 domain.由 EL ISP0T分析法檢定出的15mer determinants(含15個胺基酸的決定因子）中，有3/7是位於CTAR1 domain中·換句話說，我們無法偵測到T細胞對任何位在c端CTAR2 domain 一中的胜？有反應，然而，CTAR2 domain對許多LMP1所仲介的4 功能來說都是必須的·先前的研究顯使，單單只有此區域的缺失或突變就會完全破壞LMP1仲介的訊號傳導與調節作用·雖然T細胞對CTAR2 domain沒有反應的確切原因還未知’但有可能是E B V會保護此重要的功能區域以避免受到 /曰在的免應控制·如果知道CTAR2為何不受作用的原因就有y能找到對CTAR2 domain起免疫作用方式，如此不僅能阻礙LMP1仲介的轉型作用，也能破壞一般細胞與惡性細胞潛在的感染能力. 士先W的研究提出，不同地理區的…^序列有高度不同的變異性·在使用LMP1作為治療復發的肋與肿^疾病時這# ，基因薆異疋最大的阻力·因此，確定B95.8的LMP1序列 =同地理區EB V中的保留情形是很重要的，研究一大組司地理區的人，由周邊血液分離出EBV，同時也做 1 '趾切片’我們發現τ細胞上來自LMP1的抗原決定基序

第48頁 200416043 五、發明說明（45) 列保留程度通常很高·此驗就中有3 / 4的抗原決定基序列表現出輕微的變異情形·有重大變異的唯一序列為HLA A 2 supertype-restricted YLLEMLWRL，其在不同地區的的 EBV中有不同的序列形式·這對東南亞族群特別重要，因為其YLLEMLW RL抗原決定基區域内有相同形式的基因變異·而且在分離自NPC切片與自發性LCLs抗原決定基中，其基因變異情形相同·雖然在高加索族群的YLLE MLWRL抗原決定基中也發現共同的序列變異，但這些分離出的抗原決定基在每一特定地理區會額外表現出不同的基因變異-對YLLEMLWRL抗原決定基的基因變異做抗原分析發現，與 $ 野生型序列相較，其普遍見於東南亞族群的變異序列不僅難被CTLs辨識，也明顯的不被叽人A2結合·相反的，雖然一些變異序列（YFLEILWGL與YLMEILWRL)不易被T細胞辨識，但它們對HLA A2的結合卻沒有明顯影響·雖然此抗原決定基内基因變異的確切的原因與機制還未明，但有可能是在NPC流行的東南亞中，這些變異可能有助於保護這些分離出的病毒避免受到Εβν專一性CTL的免疫反應·

由於LMP1有高度致癌可能性，所以用整段LMpi作為疫田或是治療NPC與HD的免疫療法皆非永久可行·而且，目 $的實驗已證實在健康病毒帶原者中，LMpi通常只引發非常低的T細胞反應·這可能是因為LMP1位於貫穿膜的區域，使其不易進入典型的㈣C cl ass I代謝路徑·使用高度保留的LMP1與LMP2作為多抗原決定基疫苗明顯地能夠克服種潛在的限制性. °

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由目前的發明物顯示，以腺病毒作為載體，能夠表現 LMP多抗原蛋白（含有一系列最小[評丨與]” cTl抗原決定基）的疫苗能夠引起MHC限制型CTL的多重獨立反應·這些抗原決定基在人類細胞中能產生有效的内源性加工，也能在健康的病毒帶原者中喚起對LMP專一的記憶型τ細胞反應·而且，腺病毒多抗原決定基疫苗也能引發初級τ細胞反應，這些反應對腫瘤誘導系統有治療的效果· 於此需特別強調，針對HD與NPC的多抗原決定基疫苗有許多勝於傳統疫苗之處，傳統的疫苗含有全長的LMP抗原·夕抗原決疋基蛋白非常不穩定，而且由於他們的2級 ^ 與3級結構，他們在細胞質中會快速地被分解·另一方面，王長的L Μ P抗原不可能被快速分解，而且會引起細胞内多種訊號傳導作用，導致注射部位二級癌症的發生·其他重要優點包括，多抗原決定基疫苗以微小的構造，不需其他相關物質，就可引發長期CTL反應以對抗大量的CTL抗原決定基·最後，多抗原決定基疫苗也可能克服任何LMΡ1基因變異的問題，LMP1的基因變異普遍存於世界不同族群中. 若要以CTL療法治療大量的NPC與HD病患，被治療的族群中H L Α對偶基因的頻率必須要高·在此文中除了限制 LMP1， LMP2專一性反應的對偶基因a 11外，A24與B4 0特別. 令人感到興趣，因為這兩個基因在中國南方族群中很常見 U11， 56%; A24，27%; B40, 28 °/。），特別是 NPC 在此族群中為地方性疾病·因此，我們發展出一種新的多抗原決定基的治療疫苗，使用不具複製能力的腺病毒，内含有LMP1 可有效作用在9 0 %以上的亞洲，整個專利說明書的主要目的是要描述本發明的較佳實而不將本發明限制於任一實施例或專一性的特性集 200416043 五、發明說明（47) 與LMP2抗原決疋基，這些抗原決定基被普遍存於不同種族的HLA對偶基因所限制（A2， All， A23，A24, B27， B40與 B57)·估計這些最佳篩選的MHC第一型限制性抗原決定基非洲以及南加索族群· 施例，合·此文中所解釋描述的實施例可做許多更改或修飾而不會月棄本發明的概括精神與範圍· β =3兄明書中提及的所有電腦程式，言十算方法，專利及科學性文章都完整的收錄在此文的參考文獻中.

200416043 圖式簡單說明 ----~~ 表一：此專利說明書中EBV免疫的健康捐贈者或是Νρ(：的HLA抗原類型（第一型）. 表二：可被健康病毒帶原者體内EBV專一性丁細胞所辨

LMP1序列· J 表三：T細胞對MHC第一型與MHC第二型UP1抗原決定基的反應頻率，LMP1抗原決定基來自不同種族中的健個體與NPC患者. > 表四：由各族群中分離出的HLA第一型[評丨抗原決定

基’包括高加索人’非洲人，中國人，巴布亞新-樂内亞人及印度尼西亞人·每個抗原決定基的核甘編碼序列與其變異都特別獨立標示出來· SEQ J D

Ν0:30的序列異變體被表示為MQ，a n〇:40. SEQ ID N0:21的序列異變體被表示為SEq ^

N0S:U-43· YLLEMLWRL(SEQ ID Ν0··3)的序列異變體被表示為SEQ ID N0S:44-48· YLQQNWWTL(SEQ ID N0:1)的序列異變體被表示為SEq a n〇s:49&5〇· 野生型與異變體抗原決定基的編碼序列被表示為 SEQ ID NOS: 62-80. 表五：EBV多抗原決定基胜？的序列與的特異性· YLLEMLWRL (SEQ ID NO： 3); YLQQNWWTL (SEQ ID ^ NO: 1)； ALLVLYSFA (SEQ ID NO：30)；IAYLQQN W(SEQ ID N0:21); SSCSSCPLSKI (SEQ ID NO: 51); PYLFWLAAI (SEQ ID N0:52); TYGPVFMCL (SEQ ID NO：53); RRRWRRLTV (SEQ ID NO: 54);

第52頁 200416043 圖式簡單說明 LLSAWILTA (SEQ ID NO: 55); LTAGFLIFL (SEQ ID NO:56); VMSNT LLSAW (SEQ ID N0：57); IEDPPFNSL (SEQ ID NO:58); CLGGLLTMV (SEQ ID NO: 59). 圖1 :陽性血清的健康個體中LMP 1專一性T細胞體外反應的圖示· A:以LMP1與INF-τ重疊合成的胜？（10M g/ml)刺激陽性血清健康個體中PMBC (人體周邊血液單合細胞）的合成，並用材料與方法中所描述的 ELISP0T分析法測量·結果表示法為，每1 〇6PBMC一中形成點狀細胞的個數（spot forming cell, SFC). φ Β:在LMP1蛋白中Τ細胞活性的圖表分佈· C:在 ELI SPOT分析法中能被健康的病毒帶原者所辨識的抗原決定基胺基酸序列：胜？ 9 (SEQ ID N0: 36); 胜？ 17 (SEQ ID NO: 60);胜？21 (SEQ ID NO: 27);胜？ 24 (SEQ ID NCh 15);胜？ 25 (SEQ ID NO: 61);胜？ 27 (SEQ ID NO: 39);胜？ 38 (SEQ ID N0:20). 圖2 :體外偵測由CD4+與CD8+T細胞所分泌的IFN- r，再以 LMP 1胜？刺激反應·以材料與方法中所述的抗人類 CD4 與CD8 免疫磁性微小球（immunomagnetic beads)· 將CD4+或CD8+細胞從PBMCs中去除.將這些細胞重新溶於培養基中，再以DWTGGALLVLYSFALML (SEQ ID NCh 36;組 A)與 TDDSGHESDSNSNEGRH (SEQ I D N 0 : 3 9 ;組B )胜？（ 1 〇 m g / m 1)刺激反應，接著

第53頁 200416043 圖式簡單說明以ELI SPOT分析法測出是否有INF- r分泌· 圖3:以ELI SPOT分析法找出抗原決定基最小序列圖·由捐贈者者MM (組A&B)，RE (組C), LL (組D)所得PBMC，與胜？（5 // g/ml/)及inf - r重疊產物反應·以ELISP0T 分析法測量· 結果以SFC/1 06PBMC表示. 圖4 :以ELI SPOT分析法找出最小抗原決定基序列圖·由捐贈者LL (組A)，MM(組B)，RE(組C&D)所得PBMC與胜？（1 /zg/ml/)及inf - r重疊產物反應，再以 ELISP0T分析法測量.結果以SFC/106PBMC表示.— 圖5·· A :對I ALYLQQNW專一性CTL純系MM22做HLA第一型限__ 制分析（HLA class I-restriction). 有些自體與異體的EBV轉型LCLs和PHA裂殖胞（blast)與捐贈者MM有相同的HLA第一型對偶基因，用以和CTL純系MM22反應· PHA裂殖胞先和IALYLQQNW抗原決定基行致敏反應· 此分析中作用物與標的物的比例為2 : 1. B ：以 CTL純系MM23做IALYLQQNW抗原決定基辨識反應.以一系列稀釋的胜？和PHA裂殖胞行致敏反應，再和 IALYL QQNW專一性CTL純系MM23反應· 圖6 : A :對得自捐贈者LL的ALLVLYSFA專一性CTL做HLA第一型限制分析·有些自體與異體的PHA裂殖胞與捐贈® 者LL有相同HLA第一型對偶基因，在有或沒有胜？的條件下與抗原決定基專一性C T L純系反應· 此分析中作用物與標的物的比例為丨〇 ·· 1 · B ··用得自捐贈者LL 的CTL做ALLVLY SFA辨識反應· PHA裂殖胞與一系列

第54頁 200416043 圖式簡單說明稀釋的胜？反應，再與ALLVLYSFA專一性CTL純系反應· 圖7: A:異變體與原型HLA A2限制性LMP1抗原決定基 YLLEMLWRL (prototypic HLA A2-restricted LMP1 e pi tope)的CTL辨識反應· PHA裂殖胞與一系列稀釋的胜？行致敏反應，再與任一YLLEMLW RL專一性CTL 純系（SB7) 反應· B··用異變體與原型HLA A2限制十生LMP1A原決定；^在丁2細胞上伯支MHC穩定十生分析· 丁2 細胞起初在2 6 °C下以2 0 0 /z 1的每種胜？培養1 4 -1 6小時，接著於37 °C下培養2-3小時· HLA A2在這些細胞中表現的情形以HLA A2專一性單株抗體做FACS來分析· 圖8 : DNA重組線病毒載體的結構圖示·所合成的DNA編碼一個含有 13HLA 第一型 LMP1(13 HLA class I -restricted LMP1)的多抗原決定基蛋白質（SEQ ID NO: 79)，以及LMP2 抗原決定基（SEQ ID NO: 79，亦見於表5 ) ·此多抗原決定基蛋白質的DN A編碼序列是使用抗原決定基專一性引子（primer)(表示為 LMP-A， LMP-B， LMP-C 及LMP-D)，藉由mutual prining與overlap extension的技術合成·此片段® 的核甘酸序列編碼有（從5’端）BamH I限制？切除位， Kozak序列，甲硫胺酸起始密碼，13個前後相連的最小L Μ P1 C T L抗原決定基，一個停止碼，以及一個在 3’端的EcoR I限制？切除位· LMP1抗原決定基的插入

第55頁 200416043 圖式簡單說明子（insert)是由 pcDNA3. 1 表現載體（expression vector)切下然後併入pAdTrack 表現載體中.在E. c〇1 i中放大和重組後，再以轉染的人類胚胎腎2 9 3細 ^(transfecting human embryonic kidney 293 cel ls，HEK)將Ad5-LMPpoly 載體包入感染性腺病毒中· 以冷凍與解凍的方法來收成重組的腺病毒. 圖9 : CTL抗原決定基的内源性加工，CTL抗原決定基編碼有Ad5LMP多抗原決定基. 圖1 0 : Ad5LMP多抗原決定基的致免疫性 - (i mmunoge ne c i ty ). 圖11: Ad5LMP多抗原決定基（Ad5 - LMPpoly)的免疫作用提供保護能力以對抗表現LMP1的EL4-A2/Kb腫瘤細胞. 兩組老鼠（m ice), 每組6隻，分別用Ad5-LMPpoly或控制組的腺病毒（control adenovirus)(108 PFU /mouse)使其產生免疫·免疫反應後21天，老鼠以 EL4-A2/KB-LMP1 細胞（l〇7cell/mouse)做皮下免疫試驗，並於免疫試驗後1 6天監測腫瘤大小.腫瘤大小數據以平均±標準差表示（mean ± SE).

第56頁 200416043 圖式簡單說明表1 捐贈者代號 HLA類型人種來源 DM A24 A29 B44 高加索人 NK A2 B14B44 高加索人 LC A1 B8B18 高加索人 LL A2 B7 B44 高加索人 MM A1 A3 B44B57 高加索人 RE A1 A3 B50 B57 印度人 GC A1 A2B7B51 高加索人 MW A1 A3 B8B35 高加索人 - DY All A32 B35B44 高加索人 TN All A24 B54 B75 越南人 W MG A1 A3 B7 高加索人 \ MB A1 A24 B7 B58 印度人 JD A31 A33 B35 B58 印度人 IM A1 All B8 B51 高加索人 LM A28 A32B12 高加索人 SS A2 A24 B8 B60 高加索人 SE A2 A29 B44 B60 高加索人 SB A2B35B57 高加索人 CS A3 A23 B35 B44 高加索人 JT A2 A32 B44 B62 高加索人 MS A1 A24 B7 B8 高加索人 • DS A2 B44 B60 高加索人 WS A2 A32 B27 B60 高加索人 EL A2A3B7B35 局加索人 KG A1 A3 B7 B57 高加索人 JG A1 B8B57 高加索人 iiiiiii 第57頁 200416043 圖式簡單說明 AS A2 A3 B7 B35 高加索人 JF 無篩檢類型高加索人 CV 無篩檢類型越南人 TL A2B13 B58 泰國人/中國人 PR A2 A4 B35 B60 泰國人/中國人 PA A2 All B60 泰國人 WE A2 A3 3 B44 B46 泰國人 SUr A2 A3 B13 B61 泰國人 CHu A2 A3 B7 B35 泰國人/中國人 SUm A2B57 泰國人 SO A1 A24 B35 B57 泰國人 AN A3 A33 B57 B75 泰國人 CHa All A24 B57B62 泰國人 SUc All A24B51 B58 泰國人 Cl A2 A33 B46 B58 泰國人冲國人 iiiiiii 第58頁 200416043 圖式簡單說明

胜編號抗原決定基序列辨識的12個胺基酸序列最小辨識序列 CTL反應 HLA限制型參考資料 9 DWTGGALLVLYSFALiML ALLVLYSFALML ALLVLYSFAL Y HLAA2 GALLVLYSFALM llvLysfal Y ND DWTGGALLVLYS ALLVLYSFAL Y HLAA2 GGALLVLYSFAL VLYSFALML Y HLAA2 17 LVLGIWIYLLEMLWRRLG IYLLEMLWRLG YLLEMLWRL Y HLA A2 Khanna 等 21 ILLALYLQQNWWTLLVD IALYLQQNWWTL IALYLQQNW Y HLA B57/B58 YLQQNWWTLLVD ALYLQQNWW Y ND YLQQNWWTL Y HLAA2 Khanna 等 QNWWTLLVD NT ND LYLQQNWWT NT ND 24 LIWMYYHGORHSDEHHH YYHGQRHSDEHH QRHSDEHHH ND ND IWMYYHGQRHSD GQRHSDEHH ND ND YYHGQRHSD NT ND WMYYHGQRH NT ND 2Ί TDDSGHESDSNSNEGRH SGHESDSNSNEG ESDSNSNEG Y HLA DQ2 Lee等 DSNSNEGRH ND ND 38 PHSPSDSAGNDGGPPQL SDSAGNDGGPPQ AGNDGGPPQ ND ND DSAGNDGGPPQL PSDSAGNDG NT ND

111III1 第59頁 200416043 圖式簡單說明表3 抗原決定基受測者HJLA類型受測者代碼人種來源 CTL 反應(SFC/106PBMC) ALLVLYSFA A2 LL 高加索人 192 A2 GC 高加索人 96 A2 NK 高加索人 88 A2 SE 高加索人 10 A2 EL 高加索人 80 A2 TL 越南人 128 A2 PR 泰國人/中國人 0 A2 PA 泰國人/中國人 0 A2 WE 泰國人 0 A2 DS 高加索人 1184 — A2 WS 高加索人 592 A2 SUr 泰國人 0 A2 SB 高加索人 480 A2 CHu ,泰國人 0 A2 SUm 泰國人/中國人 0 A2 CI(NPC) 泰國人/中國人 0 LALYLQQNW B57 RE 印度人 897 B57 SB 高加索人 455 B57 MM 高加索人 80 B57 SUm 泰國人/中國人 0 B57 KG 高加索人 1952 B57 SO 泰國人 48 B57 AN 泰國人 100 B57 Cha 泰國人 0 B58 MB 印度人 240 B58 JD 印度人 955 B58 TL 越南人 504 B58 SUc(NPC) 泰國人 0 B58 CI(NPC) 泰國人/中國人 0

IIRIIBI 第60頁 200416043 圖式簡單說明表4病毒來源抗原決定基序列 HLA限制類型分離群的數目 B95.8 GCC CTC CTT GTC CTC TAT TCC TTT GCT ALLVLYSFA HLA A2

—G 非洲人 2 東南亞人(自發）--G … 4 東南亞人(NPC) 14 巴布亞新幾內亞—A — T-G — — G-- — — 7 ......A - - ......A - - IIHIl 第61頁 200416043 圖式簡單說明

B95.8 ATT GCT CTC TAT CTA CAA CAA AAC TGG I ALYLQQNW HLAB57&B58 商加索人 … 一 —c ___ - Η - … ·— 非洲Α ........................... 南?^ 人（自 ) — — --- --- — --- -- — --- 4 14 10 東南亞人(NPC) … 巴布亞新幾內亞 ___ ___ ___ __c - - - Η ΙΙβϋΙΙΙ 第62頁 200416043 圖式簡單說明抗原決定基序列 HLA限制類型分離群的數目

病毒來源 B95.8 TAC TTA TTG GAG ATG CTC TGG CGA CTT YLLEMLWRL HLA A2 1 高加索人 ___ —c --- - F - .....τ … - I - - - - … —c ___ - F - - I - —G-G - G - 非洲人 ......... - I - — … … 東南亞人(自發） — 一 - F - - F - - I · .....G —_ —C —T — D I - .....G ~ 東南亞人(NPC) - F - - I - .....G ~ 巴布亞新幾內亞.....C - F .....C —G 15

-T

- F

-T Μ

第63頁 200416043 圖式簡單說明

B95.8 TAT CTA CAA CAA AAC TGG TGG ACT CTA YLQQNWWTL HLA A2 尚加索人 ........................... - - Η...... ) ——— ——— ——— —« ——— 鱗 —··· *** 東南亞人(NPC) ........................... 巴布亞新幾內亞........................... ___ — — —C __- — — — — - - - Η - - - - - 10 15 10

第64頁 200416043 圖式簡單說明表5 抗原決定基序列抗原決定基代碼 EBV抗原 LMP1位置 hla限制類型參考資料 YLLEMLWRL YLL LMP1 aal25-133 HLA A2, A68, A69 (Khannal998) YLQQNWWTL YLQ LMP1 aal59-167 HLAA2 (Khannal998) ALLVLYSFA ALL LMP1 aa51-60 HLA A2 此硏究 IALYLQQNW IAL LMP2 aal56-164 HLAB57, B58 此硏究 SSCSSCPLSKI SSC LMP2 aa340-350 HLA All (Lee1997) PYLFWLAAI PYL LMP2 HLA A23 (Khannal998) TYGPVFMCL TYG LMP2 aa419-427 HLA A24 (Lee1997) RRRWRRLTV RRR LMP2 aa23 6-244 HLA B27 (Lee1997) LLSAWILTA LLS LMP2 aa447-455 HLA A2.3 (Lee1997) LTAGFLIFL LTA LMP2 aa453-461 HLA 2.1 (Lee1997) VMSNTLLSAW VMS LMP2 aa442-451 HLA A25 (Lee1997) IEDPPFNSL IED LMP2 aa200-208 HLA B40 (Lee1997) CLGGLLTMV CLG LMP2 aa426-434 HLAA2.1 (Lee1997) ΙΙΙΙϋΙΙΙ 第65頁

Claims

200416043 六、申請專利範圍 1 · 一個分離純化出的EBV CTL抗原決定基胜？是由LMP1蛋白中的胺基酸殘基至少連續9個所組成，其中EBV CTL胜？並非YLQQNWWTL (SEQ ID N0:1); ESDSNSNEG (SEQ ID N〇. 2)或 YLLEMLWRL (SEQ ID N0:3). · 2.專利申請範圍第2項中純化的EBV CTL抗原決定基胜？是由下列一組胺基酸選出而組成： (i) QRH (SEQ ID N0：4)； (ii) AGNDG (SEQ ID N0：5)； (i)QNW(SEQIDN0:6)，特別排除、 YLQQNWWTL (SEQ ID NO:1 )； (iv) VLYS (SEQ ID N0:7)； · (v) DSN SNE (SEQ ID NO: 8)，特別包含胺基酸序列 ESDSNSNEG (SEQ ID NO:2). 3 ·專利申凊苐2項中純化的E B V C T L抗原決定基胜？本質上由下列一組胺基酸序列選出而組成：、 (i) QRHSDEHHH (SEQ ID N0：9); (ii) GQRHSDEHH (SEQ ID N0：l〇)； (iii) YYHGQRHSD (SEQ ID N0:11); (iv) WMYYHGQRH (SEQ ID N0：12). 4·專利申請第3項中純化的EBV CTL抗原決定基胜？本質上鲁由下列一組胺基酸序列選出而組成： ' (i) YYHGQRHSDEHH (SEQ ID N0：13); (ii) IWMYYHGQRHSD (SEQ ID N0:14)； (iii )LIWMYYHGQRHSDEHHH (SEQ ID N0：15).

第66頁 200416043

5.專利申請第2項中純化的EBV CTL抗原決定基本質上由下列一組胺基酸序列選出而組成： (i)AGNDGGPPQ (SEQ ID N0:16); (i i)PSDSAGNDG (SEQ ID NO:17). 6·專利申請第5項中純化的EBV CTL抗原決定基本質上由下列一組胺基酸序列選出而組成： (i) SDSAGNDGGPPQ (SEQ ID N0:18)； (ii) DSAGNDGGPPQL (SEQ ID N0:19)； (iii) PHSPSDSAGNDGGPPQL (SEQ ID NO：20). — 7·專利申請第2項中純化的EBV CTL抗原決定基本質上由下謂_ 列一組胺基酸序列選出而組成： (i) IALYLQQNW (SEQ ID NO:21); (ii) ALYLQQNWW (SEQ ID NO:22); (iii )QNWWTLLVD (SEQ ID NO:23); (iv) LYLQQNWWT (SEQ ID N0:24). 8. 專利申請第7項中純化的EBV CTL抗原決定基本質上由下列一組胺基酸序列選出而組成： (i) IALYLQQNWWTLCSEQ ID N0:25); (ii) YLQQNWWTLLVD (SEQ ID N0:26); ^ (iii) LIIALYLQQNWWTLLVD (SEQ ID N0:27). ' 9. 專利申請第2項中純化的EBV CTL抗原決定基胜？本質上由下列一組胺基酸序列選出而組成： (i)ALLVLYSFAL(SEQ ID N0:28); (ii)LLVLYSFAL (SEQ ID NO:29);

第67頁 200416043 六、申請專利範圍 (iii) ALLVLYSFA (SEQ ID N0:30); (iv) VLYSFALML (SEQ ID N0:31). 10.專利申請第9項中純化的EBV CTL抗原決定基胜？本質上由下列一組胺基酸序列選出而組成·· (i) ALLVLYSFALML (SEQ ID NO:32); (ii) GALLVLYSFALM (SEQ ID N0:33); (iii) DWTGGALLVLYS (SEQ ID N0:34); (iv) GGALLVLYSFAL (SEQ ID NO:35); (v) DWTGGALLVLYSFALML (SEQ ID NO:36). — 1 1 ·專利申請第2項中純化的EBV CTL抗原決定基胜？本質上由下列一組胺基酸序列選出而組成： (i) DSNSNEGRH (SEQ ID N0:37)^ (ii) SGHESDSNSNEG (SEQ ID N0：38); (ii)TDDSGHESDSNSNEGRH (SEQ ID NO:39). 12· 一個純化的E B V C T L抗原決定基胜？本質上由下列一組胺基酸序列選出而組成：SEQ ID N0:9; SEQ ID N0:10: SEQ ID NO:11; SEQ ID N0：12; SEQ ID N0:16; SEQ ID N0:17; SEQ ID N0:21； SEQ ID NO：22; SEQ ID N0:23; SEQ ID N0:24; SEQ ID N0：28; SEQ ID NO；29; SEQ ID NO:30; SEQ ID N0:31;以及 SEQ ID N0:37 13· —個EBV CTL抗原決定基胜？異變體擁有SEq π N〇S:40-50中任一胺基酸序列. 14· 一個純化的蛋白質是由一個以上的EBv CTL抗原決定基所組成’這些抗原決定基是專利申請範圍第1 2項中的

第68頁 200416043 六、申請專利範圍 EBV CTL抗原決定基· 15· 專利申請範圍第1 4項中的純化蛋白質為一種多抗原決定基蛋白，由下列一組胺基酸序列選出而組成： ALLVLYSFA (SEQ ID N0:30)以及 IALYQQNW (SEQ ID N0: 21). 1 6 · 專利申請範圍第1 4項中的純化多抗原決定基蛋白由1 3 個E B V C T L抗原決定基所組成，分別有胺基酸序列 YLLEMLWRL (SEQ ID NO: 3); YLQQN WWTL (SEQ ID NO: 1); ALLVLYSFA (SEQ ID N0:30); IAYLQQNW (SEQ ID NO: 21); SSCSSCPLSKI (SEQ ID NO: 51); PYLFWLAAI (SEQ · ID NO:52); TYGPVFMCL (SEQ ID N0:53); RRRWRRLTV (SEQ ID NO:54) ； LLSAWIL TA (SEQ ID NO: 55); LTAGFLIFL (SEQ ID N0:56); VMSNTLLSAW (SEQ ID N0:57); IEDPPFNSL (SEQ ID N0:58); CLGGLLTMV (SEQ ID NO: 59). 17. 專利申請範圍第1 5項中的純化多抗原決定基蛋白由 SEQ I D NO : 8 1所列的胺基酸序列組成· 18. 一個純化的核甘酸編碼有專利申請範圍第1 2項中的任一個EBV CTL抗原決定基· 19. 一個純化的核甘酸編碼有專利申請範圍第1 4-1 7項中的任一個E B V C T L抗原決定基. 2 0. —個純化的核甘酸編碼有專利申請範圍第1 3項中的任一個E B V C T L抗原決定基· 21.專利申請範圍第20項中的核甘酸是由SEQ ID N0S:

第69頁 200416043 ---—. 申請專利範圍 …65，6 7 —6 9，71 組成. 78~80所列的任一核甘酸序列所 22'專利申請範圍第19項中所列的核甘酸序列所組成的核甘酸是由SEQ I D N0 : 8 0 2j.—個表現結構的組成.曰— 利申請範圍第18-22項中的 < 疋在—個表現载體中，含有專上的調節核甘酸· 壬一個純化核甘酸以及一個以專利申請範圍第23項中 25. 專利申請範圍第24項^ f現結構是以腺病毒構成， 81所列的胺基酸序列· 、表現結構編碼有SEQ ID N0—: 26. —個宿主細胞或有機體表現結構所組成疋由專利申請範圍第23項中的 2J.—個藥劑組合物有一個基，這些抗原決定基為專利t!!化βν 0几抗原決定 3決定基，、及藥劑上相#=弟I’，中的任何抗 2 8.專利申請範m卩7 。的載體，稀釋劑或賦形劑· 广是由下列—=2基:===含有一胺基酸序 29.專利申與1ALYQQNW (SEQ ID N0:21). 定基蛋白申：ί圍弟27項中的藥劑組合物含有-多抗原決, 3〇,華ID N〇:81所列的核甘酸序列所組成.· 構以及筚,:;且合物包含專利申請範圍第23項中的表現結構:兑纟範圍第3〇項中的藥劑組合物含有一表現結 …為馬有下列胺基酸序列其中之—：ALLVLYSFA (SEQ 200416043 六、申請專利範圍 ID NO:30)與 IALYQQNW (SEQ ID N0:21), 3 2.專利申請範圍第2 9項中的藥劑組合物含有一表現結構，其中編碼一多抗原決定基蛋白，含有SEQ ID N0:81 所列的核甘酸序列. 3 3.專利申請範圍第3 2項中的藥劑組合物含有S EQ I D N0 : 8 2 所列的核甘酸序列. 3 4 ·專利申凊範圍第2 7 - 3 3項中的任一藥劑組合物皆為一種免疫治療組合物. 3 5·專利申請範圍第3 5項中的藥劑組合物是一種疫苗.— 36· EBV相關疾病的治療方法以及/或預防處理方法包括對一個動物施打一種以上的純化EBV CTL抗原決定基，這，些決定基為專利申請範圍第卜丨2項中的任一抗原決定基. 3 7 ·專利申請範圍第3 6項的方法中至少有一抗原決定基含有下列胺基酸序列之一：ALLVLYSFA (SEQ ID Ν0··30)以及 IALYQQNW (SEQ ID Ν0:21). 3 8 ·專利申請範圍第3 5項的方法中至少有一抗原決定基是由SEQ ID Ν0: 81所列的核甘酸序列組成· 3 9· E B V相關疾病的治療方法以及/或預防處理方法包括對一個動物施打專利申請範圍第23項中的表現結構· 4 0·專利申請範圍第3 9項的方法中，表現結構編碼一多抗原決疋基蛋白，由下列一組胺基酸序列選出而組成： ALLVLYSFA (SEQ ID NO:30)舆 IALYQQNW (SEQ ID N0:21). 41 ·專利申請範圍第39項的方法中的表現結構編包含SEQ

第71頁 200416043

六、申請專利範圍 I D N 0 ·· 8 2所列的核甘酸序列· 42·專利申請範圍第36-41項的方法中，EBV相關疾病是選自B細胞及τ細胞非霍奇金氏淋巴瘤，霍奇金氏病，以及一些淋巴上皮瘤狀癌· 4 3·專利申請範圍第4 2項的方法中，EBV相關疾病是畠順癌（NPC)· " 4 4·專利申請範圍第3 6 - 4 3項的方法中的動物是哺乳類. 4 5·專利申請範圍第44項的方法中的哺乳類是人類· 46·專利申請範圍第45項的方法中的EBV抗原決定基胜？〜是依接受治療病患的HLA類型而定· ·疋 47·結合到EBV CTL抗原決定基的抗體與專利申請範圍第 1 - 1 2項中的任—抗原決定基或專利申請範圍第丨3項中的一異變體相符合.

48·、一個檢測某一動物是否藏有Εβν，或是曾接觸過⑽^ 檢測方法·此檢測法的步驟為，從該個體中分離出一種 T上淋巴球，將T淋巴球與本發明中一種以上的e b v ◦ τ l拉 1 j疋基相接觸，這些抗原決定基與專利申請範圍第1 一 ^ 任：抗原決定基相符合，藉由T細胞與抗原決定基 •的反應可顯示此動物藏有EBV或是曾接觸過Εβν •專利申請範圍第48項的方法中的動類 •專：：請範圍第49項的方法中的哺乳夂驟種確職CTL抗原決定基的方法，此方法… 將大多數LMP1衍生的不同胜？製造出來

第72頁 200416043 六、申請專利範圍 (1 i ) 由EBV血清反應呈陽性的個體中得丁淋巴球，將一種以上的淋巴球與一個以上的上述胜？結合， (iii) 藉由T淋巴球對該胜？的反應來測量IFN- 7的產量，其中IFN- τ高於標準量即表示該胜？含有至少一個EBV CTL 抗原決定基. 5 2 ·專利申請範圍第5 1項的方法包含另一步驟（i v )，此步驟為檢測步驟（i i )所製造出的一或多種T淋巴球是否能水解EBV感染標的細胞.

5 3.由專利申請範圍第52項的方法所純化出的EBV CTL抗 L系決定基. 54.專利申請範圍第53項中純化出的CTL抗原決定基含有下列一組胺基酸序列之一：SEQ ID N0: 9; SEQ ID N0: 10: SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:16; SEQ ID N0:17; SEQ ID N0:21; SEQ ID N0:22; SEQ ID N0:23; SEQ ID N0:24; SEQ ID NO:28; SEQ ID N0:29; SEQ ID NO:30; SEQ ID N0:31; and SEQ ID N0:37.

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