TW200303922A - Compositions and methods for evaluating viral receptor/co-receptor usage and inhibitors of virus entry using recombinant virus assays - Google Patents

Description

(i) (i)200303922 玖、發明說明 (發明說明應敘明：發明所屬之技術領域、先前技術、内容、實施方式及圖式簡單說明) 在本申請案中，作者參考各種公開案，並在正文中記載 曰期。可在說明書最後，緊接在申請專利範圍之前，找到 依字母順序排列的這些公開案的全部引述。在本文中提及 的所有專利、專利申請案和公開案，無論是在前或在後， 均將其全文以引用的方式併入本文中。將這些公開案在其 全文中的揭示内容，以引用的方式併入本申請案中，以便 更充分地說明熟諳此藝者已知的技藝狀態，到在此描述本 發明並提出申請的日期為止。 先前技術 病毒侵入是抗-病毒治療有吸引力的新標靶，且目前正 在臨床前或臨床的研究中，評估大約ίο種設計成阻斷病毒 附接或膜融合的藥物（Richman，1998; PhRMA，1999; Stephenson, 1999)。有被膜的動物病毒，經由在病毒粒子膜 中的病毒蛋白質（被膜蛋白質）與細胞表面蛋白質（病毒受 體）的交互作用，附接並侵入宿主細胞中。由表面被膜蛋 白質調解受體認知和結合作用。 發明内容 因此，本發明的目標是提供一快速、敏感的表現型測 定，來測量病毒對病毒侵入抑制劑的感受性。 本發明更進一步的目標是提供逆轉錄病毒載體系統，其 產生含有衍生自各種來源之病毒被〜膜蛋白質的病毒顆 粒，並確認表現病毒受體，且准許病毒複製的細胞株。 本發明的其他目標是提供病毒被膜的表現載體，其能夠 200303922

(2) 接受衍生 本發明 於大多數 因，代替 本發明 HIV-1基因 毒表現載 本發明 受體向性 毒的品系 可藉著， 感受性的 使宿主細 生的核酸: 影響該指 活性上的 且該化合 碼的蛋白 該化合物. 缺乏該化 改變的感』 在本發 編碼病毒 遠病母'蛋 自患者、編碼被膜基因的斷片。 的其他目標是提供對生物-安全的載體，其相當 的HI V-1病毒基因組，但帶有蟲螢光素酶受體基 被膜區。 更進一步的目標是表現型測定，其藉著提供在 組 < 轉錄調節區（U3的3 ’副本）中帶有刪除的病 體’降低形成重組的有傳染力之HIV-1的可能性。 的另一個目標是提供能夠確認並判定受體/輔_ 的測定，其快速和精確地確認患者感染親何種病 本發明，藉著判定病毒是否對化合物具有改變之 方法，達成這些及其他目標，該方法包括：（a) 胞與化合物接觸，其中該宿主細胞包括病毒-衍 和指示劑基因，藉著該病毒-衍生之核酸的活性 ^劑基因的活性，使得在該病毒_衍生之核酸的 變化，結果產生在指示劑基因之活性上的變化， 物直接4間接瞄準該病毒，生之核㉟，或其編 質，並（b)檢測該指示劑基因的活性，其中在與 接觸之宿主細胞中，指示劑 ^ Π基因的活性相對於在 6物下之活性的差異，代表主 ^ ^ 两母對該化合物具有 ^:性。 明的一項觀點中，第一種 ^ ^ 胞包括病毒·衍生之 蛋白質的核酸，以及病毒表爾 .w 見载體，其缺乏編碼 曰貝的核酸，且其包括產生 h測信號的指示劑 200303922 (3)

核酸，使得該第一種細胞產生包括由該病毒-衍生之核酸 編碼之病毒蛋白質的病毒顆粒。可使第一種細胞在化合物 的存在下，與第二種細胞接觸，例如宿主細胞，其中該第 二種細胞表現與病毒顆粒結合的細胞表面受體。在一個具 體實施例中，本發明提供確認化合物是否抑制病毒侵入細 胞内的方法，其包括：（a)從被病毒感染的患者中，獲得 編碼病毒被膜蛋白質的核酸，（b)將（i)步騾（a)之核酸，和 (ii)病毒表現載體，其缺乏編碼被膜蛋白質之核酸，且包 括產生可檢測信號之指示劑核酸，共同-轉移感染到第一 種細胞内，使得該第一種細胞產生包括由獲自患者之核酸 編碼的被膜蛋白質的病毒顆粒；（c)使在步騾（b)中產生的 病毒顆粒，在化合物的存在下與第二種細胞接觸，其中該 第二種細胞表現與該病毒結合的細胞表面受體；（d)測量 由第二種細胞產生的信號量，以便判定該病毒顆粒的感染 力；並（e)比較在步騾（d)中測量到的信號量與在缺乏該化 合物時產生的信號量，其中在該化合物存在下，測量到降 低的信號量，表示該化合物抑制了病毒侵入第二種細胞 内。 在另一項觀點中，第一種細胞包括病毒·衍生之編碼病 毒蛋白質的核酸，以及病毒表現載體，其缺乏編碼該病毒 蛋白質的核酸，使得該第一種細胞產生包括由該病毒·衍 生之核酸編碼之病毒蛋白質的病毒顆粒。可使第一種細胞 在化合物的存在下，與第二種細胞接觸，例如宿主細胞， 其中該第二種細胞表現與病毒顆粒結合的細胞表面受 200303922 (4) 體。此外，第二種細胞亦包括產生可檢測信號的指示劑核 酸。在一個具體實施例中，將指示劑核酸整合到第二種細 胞的核酸内。 在一個具體實施例中，本發明提供在被病毒感染的患者 中，檢測能夠阻斷感染之抗體反應的發展的方法，包括（a) 使宿主細胞與得自患者的抗體製品接觸，其中該宿主細胞 包括編碼得自該患者之病毒蛋白質的核酸，以及產生可檢 測信號的指示劑核酸；（b)測量由該宿主細胞產生之可檢 測信號的含量；並（c)比較在步騾（b)中測量到的信號量， 與在缺乏抗體製品下所產生的信號量，其中在出現抗體製 品時測量到降低的信號量，表示該患者已經對病毒蛋白質 發展出能夠阻斷感染的抗體反應。 在另一個具體實施例中，本發明提供在被病毒感染的患 者中，檢測能夠阻斷感染之抗體反應的發展的方法，包 括：（a)將（i)編碼得自患者之病毒蛋白質的核酸，和（ii) 病毒表現載體，其缺乏編碼該病毒蛋白質之核酸，並包括 產生可檢測信號之指示劑核酸，轉移感染到第一種細胞 内，使得該第一種細胞產生包括由獲自患者之核酸編碼的 病毒蛋白質的病毒顆粒；（b)使在步驟（a)中產生的病毒顆 粒，與得自患者的抗體製品接觸；（c)使步騾（b)之病毒顆 粒和抗體製品與第二種細胞接觸，其中該第二種細胞表現 與該病毒結合的細胞表面受體；（d)測量由第二種細胞產 生的可檢測信號之含量，以便判定該病毒顆粒的感染力； 並（e)比較在步騾（d)中測量到的信號量，與在缺乏抗體製 -10· 200303922 (5) 品時所產生的信號量，其中在出現抗體製品時測量到降低 的信號量，表示該患者已經對病毒蛋白質發展出能夠阻斷 感染的抗體反應。 在另一個具體實施例中，本發明提供在被病毒感染的患 者中，檢測能夠阻斷感染之抗體反應的發展的方法，包 括：（a)將（i)編碼得自患者之病毒蛋白質的核酸，和（i i) 病毒表現載體，其缺乏編碼該病毒蛋白質之核酸，轉移感 染到第一種細胞内，使得該第一種細胞產生包括由獲自患 者之核酸編碼的病毒蛋白質的病毒顆粒；（b)使在步驟（a) 中產生的病毒顆粒，與得自患者的抗體製品接觸；（c)使 步騾（b)之病毒顆粒和抗體製品與第二種細胞接觸，其中 該第二種細胞表現與該病毒結合的細胞表面受體，且其中 該第二種細胞包括產生可檢測信號的指示劑核酸；（d)測 量由第二種細胞產生的可檢測信號之含量，以便判定該病 毒顆粒的感染力；並（e)比較在步騾（d)中測量到的信號 量，與在缺乏抗體製品時所產生的信號量，其中在出現抗 體製品時測量到降低的信號量，表示該患者已經對病毒蛋 白質發展出能夠阻斷感染的抗體反應。 在一個具體實施例中，該病毒蛋白質為被膜蛋白質。在 另一個具體實施例中，該病毒蛋白質為衣殼蛋白質。 在另一個具體實施例中，本發明提供在被病毒感染的患 者中，檢測能夠阻斷感染之抗體反應的發展的方法，包 括：（a)培養包括（i)編碼得自患者之病毒蛋白質的核酸， 和（ii)病毒表現載體，其缺乏編碼該病毒蛋白質之核酸， 200303922

(6) 且包括產生可檢測信號之指示劑核酸的第一種細胞，使得 該第一種細胞產生包括由獲自患者之核酸編碼的病毒蛋 白質的病毒顆粒；（b)使在步騾（a)中產生的病毒顆粒，與 得自患者的抗體製品接觸；（c)使步騾（b)之病毒顆粒和抗 體製品與第二種細胞接觸，其中該第二種細胞表現與該病 毒結合的細胞表面受體；（d)測量由第二種細胞產生的可 檢測信號之含量，以便判定該病毒顆粒的感染力；並（e) 比較在步騾（d)中測量到的信號量，與在缺乏抗體製品時 所產生的信號量，其中在出現抗體製品時測量到降低的信 號量，表示該患者已經對病毒蛋白質發展出能夠阻斷感染 的抗體反應。在另一個具體實施例中，（i)之核酸是（ii)之 病毒表現載體的一部分。在另一個具體實施例中，將（i) 之核酸整合到第一種細胞的基因組内。在另一個具體實施 例中，將（ii)之病毒載體整合到第一種細胞的基因組内。 在另一個具體實施例中，將（i)之核酸和（ii)之病毒載體整 合到第一種細胞的基因組内。在一個具體實施例中，該病 毒蛋白質為衣殼蛋白質。在另一個具體實施例中，該病毒 蛋白質為被膜蛋白質。 從下列的詳細說明，並參考附圖和實例，將使本發明的 特徵變得更清楚。下列的說明，討論進行本發明的裝置和 方法，有關於與確認和評估病毒侵入之抑制劑有關的表現 型測定，包括例如HIV-1和對HIV_1病毒侵入之抑制劑，但 並非作為本發明之限制。 實施方式 -12- 200303922

⑺ 本發明提供判定病毒是否對化合物具有改變之感受性 的方法，該方法包括：（a)使宿主細胞與該化合物接觸， 其中該宿主細胞包括病毒-衍生之核酸和指示劑基因，該 指示劑基因的活性，受到該病毒-衍生之核酸的活性的影 響，使得在該病毒·衍生之核酸活性上的改變，導致在該 指示劑基因之活性上的改變，且該化合物直接或間接瞄準 該病毒-衍生之核酸或其編碼之蛋白質，並（b)檢測該指示 劑基因的活性，其中在與該化合物接觸之宿主細胞中的指 示劑基因之活性，相對於在缺乏該化合物下之活性的差 異，代表該病毒對該化合物具有改變的感受性。 在一個具體實施例中，本發明提供確認化合物是否抑制 病毒侵入細胞内的方法，其包括：（a)從被病毒感染的患 者中，獲得編碼病毒被膜蛋白質之核酸；（b)將（i)步騾（a) 之核酸，和（ii)病毒表現載體，其缺乏編碼被膜蛋白質之 核酸，且其包括產生可檢測信號之指示劑核酸，共同轉移 感染到第一種細胞内，使得該第一種細胞產生包括由獲自 患者之核酸編碼的被膜蛋白質的病毒顆粒；（c)使在步騾 (b)中產生的病毒顆粒，在該化合物的存在下，與第二種 細胞接觸，其中該第二種細胞表現與該病毒結合的細胞表 面受體；（d)測量由第二種細胞產生的信號量，以便判定 該病毒顆粒的感染力；並（e)比較在步騾（d)中測量到的信 號量，與在缺乏該化合物時所產生的信號量，其中在該化 合物的存在下，測量到降低的信號量，表示該化合物抑制 了病毒侵入第二種細胞内。 -13 - 200303922 ⑻ 在另一個具體實施例中，本發明提供確認化合物是否抑 制病毒侵入細胞内的方法，其包括··（ a)從被病毒感染的 患者中，獲得編碼病毒被膜蛋白質之核酸；（b)將（i)步騾 (a)之核酸，和（ii)病毒表現載體，其缺乏編碼被膜蛋白質 之核酸，共同轉移感染到第一種細胞内，使得該第一種細 胞產生包括由獲自患者之核酸編碼的被膜蛋白質的病毒 顆粒；（〇使在步騾（b)中產生的病毒顆粒，在該化合物的 存在下，與第二種細胞接觸，其中該第二種細胞表現與該 病毒結合的細胞表面受體，且其中該第二種細胞包括產生 可檢測信號的指示劑核酸；（d)測量由第二種細胞產生的 信號量，以便判定該病毒顆粒的感染力；並（e)比較在步 騾（d)中測量到的信號量，與在缺乏該化合物時所產生的 信號量，其中在該化合物的存在下，測量到降低的信號 量，表示該化合物抑制了病毒侵入第二種細胞内。 在本發明的另一個具體實施例中，該指示劑核酸包括指 示劑基因。在本發明的另一個具體實施例中，該指示劑基 因為蟲螢光素酶基因。 在本發明的一個具體實施例中，該細胞表面受體為 CD4。在本發明的一個具體實施例中，該細胞表面受體為 化學激動素受體。在本發明的一個具體實施例中，該細胞 表面受體為CXCR4或CCR5。 在本發明的一個具體實施例中，該患者係感染HIV-1病 毒、肝炎病毒（像是HCV或HBV病毒），或任何其他的病 毒。在本發明的一個具體實施例中，步騾（a)之核酸包括 -14- 200303922

(9) 編碼gpl20和gp41的DNA。在本發明的一個具體實施例中， 該病毒表現載體包括HI V核酸。在本發明的一個具體實施 例中，該病毒表現載體包括HIV gag_pol基因。在本發明的 一個具體實施例中，該病毒表現載體包括編碼vif、vpr、 tat、rev、rpu 和 nef 的 DNA。 在本發明的一個具體實施例中，第一種細胞是哺乳動物 細胞。在本發明的一個具體實施例中，該哺乳動物細胞是 人類細胞。在本發明的一個具體實施例中，該人類細胞是 人類胚胎腎臟細胞。在本發明的一個具體實施例中，該人 類胚胎腎臟細胞是2 9 3細胞。 在本發明的一個具體實施例中，第二種細胞是人類T細 胞。在本發明的一個具體實施例中，第二種細胞是人類T 細胞白血病細胞株。在本發明的一個具體實施例中，第二 種細胞是周圍血液單核細胞。在本發明的一個具體實施例 中，第二種細胞是星形神經膠質瘤（astroglioma)細胞。在 本發明的一個具體實施例中，該星形神經膠質瘤細胞是 U 8 7細胞。在本發明的一個具體實施例中，第二種細胞是 人類骨肉瘤細胞。在本發明的一個具體實施例中，該人類 骨肉瘤細胞是Η T 4細胞。 在本發明的一個具體實施例中，該化合物與細胞表面受 體結合。在本發明的一個具體實施例中，該化合物是細胞 表面受體的配體。在本發明的一個具體實施例中，該化合 物包括抗體。在本發明的一個具體實施例中，該化合物抑 制膜融合。在本發明的一個具體實施例中，該化合物為 -15- 200303922

(ίο) 肤、肤模仿物、有機分子’或合成的化合物。在本發明的 一個具體實施例中，該化合物與病毒被膜蛋白質結合。 本發明提供製造組合物的方法，其包括將藉著按照在本 文中描述之篩選法（確認化合物之方法）確認的化合物與 載劑混合。在本發明的一個具體實施例中，該載劑為鹽 水、聚乙二醇、缓衝溶液、澱粉或有機溶劑。 本發明提供當細胞被病毒感染時，確認被該病毒結合之 細胞表面受體的方法，其包括（a)獲得包括（i)病毒之核 酸，和（ii)產生可檢測信號之指示劑核酸的病毒顆粒；（b) 使表現該細胞表面受體的細胞與得自步騾（a)之病毒顆粒 接觸；並（c)測量在細胞内之可檢測信號的量，其中信號 的產生，表示由該細胞表現之細胞表面受體被該病毒結 合，藉此確認當細胞被感染時，該細胞表面受體被該病毒 結合。 本發明亦&供確認抗體是否抑制病毒侵入細胞内的方 法，其包括：（a)從被病毒感染的患者中獲得編碼病毒被 膜蛋白質 < 核酸；（b)將⑴步驟（a)之核酸和（ii)病毒表現 載體，其缺乏編碼被膜蛋白質之核酸，且其包括產生可檢 測信號之指示劑核酸，共同轉移感染到第一種細胞内，使 侍該第一種細胞產生包括由獲自患者之核酸編碼的被膜 蛋白質的病毒顆粒；（c)使在步騾(b)中產生的病毒顆粒， 在抗體的存在下，與第二種細胞接觸，其中該第二種細胞 表現與該病毒結合的細胞表面受體；（(1)測量由第二種細 胞產生的信號量，以便判定該病毒顆粒的感染力；並〇) -16 - 200303922

(11) 比較在步騾（d)中測量到的信號量與在缺乏該抗體時產生 的信號量，其中在該抗體存在下，測量到降低的信號量， 表示該抗體抑制了病毒侵入第二種細胞内。 本發明提供判定病毒對抑制病毒細胞侵入之化合物的 感受性的方法，其包括：（a)從被病毒感染的患者中獲得 編碼病毒被膜蛋白質之核酸；（b)將（i)步驟（a)之核酸和（ii) 病毒表現載體，其缺乏編碼被膜蛋白質之核酸，且其包括 產生可檢測信號之指示劑核酸，共同轉移感染到第一種細 胞内，使得該第一種細胞產生包括由獲自患者之核酸編碼 的被膜蛋白質的病毒顆粒；（c)使在步騾（b)中產生的病毒 顆粒，在該化合物的存在下，與第二種細胞接觸，其中該 第二種細胞表現與該病毒結合的細胞表面受體；（d)測量 由第二種細胞產生的信號量，以便判定該病毒顆粒的感染 力；並（e)比較在步騾（d)中測量到的信號量與在缺乏該化 合物時產生的信號量，其中在該化合物存在下，測量到降 低的信號量，表示該病毒是對該化合物有感受性的。 本發明提供判定病毒是否對抑制病毒侵入細胞内之化 合物，與參考病毒相比較，具有增加之抵抗力的方法，該 方法包括（a)在第一個時間點，判定該病毒對該化合物的 感受性，例如，根據上述的方法；（b)在較晚的第二個時 間點，判定該病毒對該化合物的感受性；並（c)比較在步 騾（a)和（b)中判定的感受性，其中在較晚的第二個時間 點，在感受性上的降低，表示該病毒對該化合物有增加的 抵抗力。 -17- 200303922

本發明提供在病毒中’確認賦與對抑制病毒侵入細胞内 之化合物的抵抗力之突變的方法’其包括·· U)在以任何 化合物處理病毒之前，先判定病毒的核酸序列或胺基酸序 列；（b)獲得對該化合物有抵抗力的病毒；（c)判定得自步 騾（b)之有抵抗力病毒的核酸序列或胺基酸序列；（d)比較 步騾（a)和（c)之核酸序列或胺基酸序列，以便在該病毒 中，確認赋與對該化合物之抵抗力的突變。 在本發明的一個具體實施例中，在步騾（b)中獲得的病 毒，是在該化合物的存在下生長，直到發展出抵抗力為止 的步驟（a)之病毒。 在本發明的一個具體實施例中，在步騾（b)中獲得的病 毒，係分離自曾經接受該化合物之治療的患者。 在較佳的具體實施例中，本發明提供精確地和可再現地 測量HIV-1對病毒侵入抑制劑之感受性的裝置和方法。 在較佳的具體實施例中，本發明亦提供精確地和可再現 地測量HIV-1輔-受體向性的裝置和方法。 在較佳的具體實施例中，本發明提供精確地和可再現地 測I抗體調解之HIV-1中和作用的裝置和方法。 在較佳的具體實施例中，本發明進一步提供發現、充分 運用’並定出新穎或新藥物之特徵的裝置和方法，該新穎 或新藥物係瞄準在病毒附接和侵入過程中，各種已定義和 尚未定義的步騾。 在較佳的具體實施例中，本發明更提供發現、充分運 並定出HIV-1疫苗（預防性或治療性）之特徵的裝置和 -18- 200303922

(13) 方法，該HIV-1疫苗係瞄準在病毒附接和侵入過程中，各 種已定義和尚未定義的步驟。 在較佳的具體實施例中，本發明提供在改變對病毒侵入 抑制劑之感受性的HIV-1被膜蛋白質（gp41TM和gpl20SU) 中，確認胺基酸取代/突變的裝置和方法。 在較佳的具體實施例中，本發明提供定量在HIV-1被膜 中的特定突變，對病毒侵入抑制劑之感受性的影響的裝置 和方法。 在較佳的具體實施例中，本發明進一步提供判定經常在 顯示出改變對病毒侵入抑制劑之感受性的病毒中，單獨或 合併地觀察到之HIV-1被膜胺基酸取代/突變的裝置和方 法。 在較佳的具體實施例中，本發明提供在改變受體或輔-受體向性的HIV-1被膜蛋白質（gp41TM和gpl20SU)中，確認 胺基酸取代/突變的裝置和方法。 在較佳的具體實施例中，本發明提供定量在HIV-1被膜 中的特定突變，對受體或辅-受體向性之影響的裝置和方 法。 在較佳的具體實施例中，本發明更提供確認經常在顯示 出CXCR4或CCR5輔受體向性之病毒中，單獨或合併地觀 察到之HIV-1被膜胺基酸取代/突變的裝置和方法。 在較佳的具體實施例中，本發明提供在改變抗體調解之 中和作用的HIV-1被膜蛋白質（gp41TM和gpl20SU)中，確認 胺基酸取代/突變的裝置和方法。 -19- 200303922

(14) 在較佳的具體實施例中，本發明提供定量在HIV-1被膜 中的特定突變，對抗體調解之中和作用之影響的裝置和方 法。 在較佳的具體實施例中，本發明進一步提供確認經常在 顯示出抗體調解之病毒中和作用的病毒中，單獨或合併地 觀察到之HIV-1被膜胺基酸取代/突變的裝置和方法。 在較佳的具體實施例中，本發明更提供確認在患者試樣 病毒中經常觀察到，能夠中和HIV-1之抗體的裝置和方法。 在較佳的具體實施例中，本發明進一步提供確認需要 CD4結合作用來進行感染之病毒的裝置和方法。 在較佳的具體實施例中，本發明更提供確認不需要CD4 結合作用來進行感染之病毒的裝置和方法。 在較佳的具體實施例中，本發明亦提供確認顯示出CD4 獨立感染之患者試樣之發生率的裝置和方法。 在較佳的具體實施例中，本發明進一步提供確認需要 CD8結合作用來進行感染之病毒的裝置和方法。 在較佳的具體實施例中，本發明亦提供確認顯示出CD8 依賴性感染之患者病毒之發生率的裝置和方法。 在較佳的具體實施例中，本發明進一步提供確認需要 CXCR4化學激動素受體結合作用、CCR5化學激動素受體結 合作用，或CXCR4或CCR5結合作用（雙向性）來進行感染之 病毒的裝置和方法。 在較佳的具體實施例中，本發明更提供確認需要CXCR4 化學激動素受體結合作用、CCR5化學激動素受體結合作 -20- 200303922

⑼ 用，或CXCR4或CCR5結合作用（雙向性）來進行感染之病毒 的發生率的裝置和方法。 在較佳的具體實施例中，本發明進一步提供確認經常在 顯示出（a)對病毒侵入抑制劑改變感受性，（b) CXCR4或 CCR5輔-受體向性，和（c)抗體調解之病毒中和作用的病毒 中，單獨或合併地觀察到之HIV-1被膜胺基酸取代/突變的 裝置和方法。 在較佳的具體實施例中，本發明提供使用病毒侵入抑制 劑之感受性，來引導HIV-1治療的裝置和方法。 在較佳的具體實施例中，本發明更提供使用病毒侵入抑 制劑之感受性，來引導治療抗逆轉錄病毒藥物治療失敗之 患者的裝置和方法。 在較佳啲具體實施例中，本發明進一步提供使用病毒侵 入抑制劑之感受性，來引導治療最近感染HIV-1之患者的 裝置和方法。 在較佳的具體實施例中，本發明提供使用HIV-1輔-受體 向性，來引導治療抗逆轉錄病毒藥物治療失敗之患者的裝 置和方法。 在較佳的具體實施例中，本發明進一步提供使用HIV-1 輔-受體向性，來引導治療最近感染HIV-1之患者的裝置和 方法。 在較佳的具體實施例中，本發明更提供測量抗體調解之 HIV-1的中和作用，來監視在接種疫苗之後，最初的保護 性抗體反應的裝置和方法。 200303922

(16) 在較佳的具體實施例中，本發明進一步提供測量抗體調 解之HIV-1的中和作用，來監視在接種疫苗之後，最初的 治療性抗體反應的裝置和方法。 在較佳的具體實施例中，本發明更提供在一段時間内測 量抗體調解之HIV-1的中和作用，來監視在接種疫苗之 後，保護性抗體反應之耐久性的裝置和方法。 在較佳的具體實施例中，本發明進一步提供測量抗體調 解之HIV-1的中和作用，來發展並充分運用接種疫苗和原 始-補強計畫，使接種疫苗之效力和耐久性達到最大的裝 置和方法。 例如，在HIV-1的案例中，SU蛋白質（gpl20-SU)與穿透膜 被膜蛋白質（gp41-TM)緊密相關，其將複合物固定在病毒 膜上。藉著切開被膜基因之未切開前驅物產物gpl60，衍 生出被膜蛋白質gpl20和gp41。HIV_1與其細胞受體（CD4) 和輔受體（CCR5或CXCR4)的結合，促進了在TM蛋白質中 的構形變化，結果使病毒與細胞膜融合，且使病毒核心侵 入細胞質内（Retroviruses，1997)。雖然新的HIV侵入抑制劑 瞄準病毒被膜蛋白質（gp12〇/gp41)或宿主蛋白質（CD4、 CCR5、CXCR4)，但預期在HIV-1中大多數與抵抗力有關的 突變，是位在病毒的被膜基因中；例如一種病毒可能發展 的方式，是轉變輔-受體利用。侵入阻斷劑構成一種新穎 的抗-逆轉錄病毒藥物，且具有對抗目前具有多藥物抵抗 力之HIV-1變體的廣泛活性之潛力是很高的。在這類有潛 力的病毒侵入阻斷劑中，有融合抑制劑、受體/輔-受體拮 -22- 200303922

(17) 抗劑和疫苗。 $而’病毒侵入之抑制劑仍可能產生具有藥物抵抗力的 病毒（經由被膜基因的突變），因此，複雜的患者治療，類 似在Hlv之蛋白酶抑制劑（PRI)和逆轉錄酶抑制劑（RTI)治 療中所觀察到的。事實上，FDA核准之任何阻斷病毒侵入 的新藥’都需要抵抗力資料的評估。已經在融合抑制劑 Τ_20的案例中，證實需要測量對侵入阻斷劑之感受性的診 斷測定。在T-20的存在下，在活體外的繼代之後，已經報 告了顯示出降低對該藥物之感受性的病毒。此時，已不能 利用能夠測量阻斷病毒侵入之藥物感受性的便利表現型 測定。結果，臨床醫師將在缺乏提出藥物感受性所需的工 具之下’馬上面對量身定製之治療的挑戰。因此，從被感 染之患者中，精確測量對抑制病毒侵入之藥物的感受性的 了非測足’將是極有價值的。 例如，目前世界衛生組織（World Health 〇rganizati〇n)估計 指出全世界有超過3千3百萬人感染tHV-i，流行病Ams的 致病原。在美國有接近1百萬人感染，並有3〇萬人目前正 接受抗病毒治療（CDC，1999; WHO 1999)。對抗AIDS已成為 政府機構、大學實驗室和製藥/生物技術業之空前努力的 共同目標。為了治療HIV-1感染，FDA已經核准14種抗-病 毒藥物（Carpenter等人，2000)，且目前有20種以上的其他藥 物，正在臨床試驗中進行評估（PHRMA，1999)。已經核准的 藥物，藉著干擾蛋白酶（PR)或逆轉錄酶（RT)的酵素活性， 抑制HIV-1複製。PR抑制劑（PRIs)阻斷病毒感染和複製所需 -23· 200303922 (18) 之病毒蛋白質的適當形成，而RT抑制劑（RTIs)則阻斷病毒 複製其遣傳物質。因為亞-最適度的效力，目前最常併用 PRIs和RTIs來壓抑病毒的複製（Carpenter等人，2000)。 因此，想要提供一快速、精確的安全病毒測定，能夠評 估：病毒附接和侵入之抑制劑（包括融合、受體和輔-受體 抑制劑）；有助於病毒侵入抑制劑之藥物設計和治療的受 體/輔-受體病毒向性；在患者病毒對附接和侵入抑制劑之 藥物感受性上的改變；以及在對使用被膜蛋白質抗原的疫 苗接種之反應中所產生的病毒中和活性。 可對任何可能易感受病毒侵入抑制劑的病毒性疾病，以 及在關切對該病毒侵入抑制劑的抗-病毒藥物感受性和抵 抗力之處，使用本發明之方法，包括例如，包括但不限於 其他的慢病毒（例如HIV-2)、其他的逆轉錄病毒（例如 HTLV-1和2)、肝DNA病毒（hepadnaviruses)(例如人類B型肝 炎病毒）、黃病毒（例如人類C型肝炎病毒）和癌療病毒（例 如人類細胞巨大病毒）。 侵入阻斷劑構成一種新穎的抗·逆轉錄病毒藥物，且具 有對抗目前具有多藥物抵抗力之HIV-1變體的廣泛活性之 潛力是很高的。在這類有潛力的病毒侵入阻斷劑中，有融 合抑制劑、受體/輔-受體拮抗劑和疫苗。 融合抑制劑 設計出以競爭性之方式，抑制TM之構形變化的化合 物，稱為融合抑制劑，是有效的HIV-1複製抑制劑。雖然 已經在細胞培養系統和HIV-1感染的患者兩者中證實其活 -24- 200303922 (19) 性（Wild等人，1992; Judice等人，1997; Kilby等人，1998)，但 在U.S. Durgs中，對於HIV-1感染的治療，尚未核准在該類 中的任何融合抑制劑，像是T-20和T_1249 (Trimeris Inc·， USA)，其為高級臨床調查的對象。 受體/輔-受體拮抗劑 除了融合抑制劑，其在HIV-1已經與受體交互作用之後 作用以外，正努力進行發展預防HI V_1與CD4，或其兩個 主要輔-受體產生交互作用的藥物。已經在細胞培養系統 和動物模式中，證實這類試劑抑制HIV-1感染的能力。已 經確認前導化合物瞄準gpl20、CD4、由親巨噬細胞病毒（R5) 使用的CCR5辅·受體，或由親T_細胞病毒（X4)使用的 CXCR4 輔-受體（Allaway 等人，1993; Reimann 等人，1995; Baba 等人，1999; Bridger等人，1999)。 目前，在U.S· Durgs中，對於HIV-1感染的治療，尚未核 准在這些種類中的任何辅-受體拮抗劑，像是PRO 542 (Progenies Inc.，USA)、5a8 (Tanox，USA)、TAK-779 (Takeda Inc.， Japan)，以及 AMD-3100 (Anormed Inc·，Canada)，其為臨床前 或早期臨床調查的對象。因此，能夠確認並判定受體/輔-受體向性的測定，其快速並精確地判定患者被親何種病毒 的品系感染（例如HIV-1)，將有助於病毒侵入抑制劑的藥 物設計和治療。 疫苗 亦已經證明疫苗在人類對抗病原性病毒感染時，是有效 的策略，並有數種預防HIV-1感染的疫苗候選者，正在臨 -25- 200303922

(20) 床的發展中。在HIV-1疫苗的熱烈研究中，被膜蛋白質 gpl20和gp41是最明顯的候選者，而在^個進行臨床評估 的疫苗候選者中，有許多是以被膜為基礎的（phRMA，1999) 。通常認為有效的被膜疫苗，可謗發阻斷病毒感染之中和 抗體的產生（Mascola等人，2〇〇〇)。因此，迫切地需要能可 靠地測試這類中和抗體之效力，但不需延長病毒培養之敏 感的高輸貫量測定。這類剛定顯然可協助搜尋有效的 AIDS疫苗。當考量包括以千計之大患者族群的晚期臨床 試驗時，這是特別真實的。因為中和抗體應防止成功的感 染標細胞’故被膜受體測定將可有利地作為病毒中和測 定。 不幸的是’大多數的這些藥物組合，大部分僅在有限的 期間内是有效的，因為出現了具有藥物抵抗力的病毒。缺 乏RT和RNA聚合酶II固有的校對功能，與高含量、有錯誤 傾向之複製偶聯，容許諸如HIV-1之類的病毒迅速突變 (Coffin，1995)。該高突變頻率，促成HIV-1順利躲避長期藥 物治療的能力，導致病毒負荷反彈的結果。已經針對所有 14種已核准的藥物，以及許多調查中之化合物，描述了與 抵抗力有關之突變（Schinazi等人，1999)。因此，具有多-藥 物抵抗力的HIV-1變體，在已感染患者的照顧上，引起逐 漸增加的問題。欲達成長期的臨床利益，想要選出最強地 壓抑病毒之複製，並避免患者之病毒對該藥物產生抵抗力 的那些藥物（DHHs，2000)。長期溶液可依賴藥物抵抗力測 試，其可引導臨床醫師選擇最有效的藥物，來對抗患者的 •26- 200303922

(21) 病毒。在最近得自DHHs (DHHs，2000)的指導方針中，已經 確定對抵抗力測試的需求，建議在治療HIV-1感染的患者 時，例行地使用抵抗力測試。感受性測試亦可協助瞄準有 抵抗力之病毒的新藥物的發展。最近FDA諮詢委員會 (1999年1 1月），建議在為了 HIV-1而發展新的抗病毒藥物 時，使用抵抗力測試。 已經應用數種策略，來評估抗病毒藥物的感受性。基因 型測試以核甞酸序列或基因型為基礎，分析突變，並企圖 使這些突變與藥物抵抗力發生關連（Rodriguez-Rosado等人， 1999; Schinazi等人，1999)。然而，在基因型和表現型之間 的關係是複雜且不容易解釋的，而這些測試的結果不是定 量的。基因型藥物感受性資料的使用，需要由專家（Baxter 等人，1999)或電腦演算法解釋，且並非總是可預告治療成 果（Piketty等人，1999)。 表現型藥物感受性測定，在藥物的存在下，直接測量並 定量病毒複製的能力。早期的表現型測定，需要延長的病 毒培養，並因此是緩慢的、勞力密集的，且不容易自動化， 提供高的輸貫量（Japour等人，1993)。結果，認為這些早期 的表現型測試，對患者管理而言是不實用的。重組病毒-測定的發展（Shi和 Mellors，1997; Hertogs等人，1998)，簡化了 表現型測試，並增加輸貫量。然而，這些測定的主要缺點 是4 - 8週的漫長的反轉時間。最近，已經發展出重組的病 毒測定，以及能夠在一回合的複製期間内，測量藥物感受 性的其他測定（Zennou等人，1998; Petropoulos等人，2000)，結 -27- 200303922

(22) 果戲劇化地使反轉時間降至8-1〇天。抗·逆轉錄病毒治療 無效的患者’可獲益於表現型測定。這類測定對於患者而 言，是有吸引力的工具，因為它們對藥物感受性提供了直 接和快速的測量。 本發明之測足可用於其他的病毒感染，因為在這些家族 中之其他病毒所引起的感染，以及起因於在其他病毒家族 中之病毒的感染。此外’本發明之藥物感受性和抵抗力測 試，亦f用來篩選治療目前尚無可利用之療法的病毒性疾 病的化合物。 熟諳此藝者將知道可在本發明之藥物感受性和抵抗力 測試中’測試病毒的結構、生命週期和遣傳元件。這對於 本發明之實施是有用的，例如，瞭解逆轉錄病毒的生命週 期，以及逆轉錄病毒解救和感染力所需的病毒基因。被逆 轉錄病毒感染的細胞’排出含有二倍體RN A基因組的膜病 毒。病毒，散布著被膜糖蛋白（其用來決定感染力的宿主 範圍），與待感染之細胞漿膜的細胞受體附接。在受體結 合之後，病毒被内化並脫去外殼，使它通過宿主細胞的細 胞質。在它的旅途中，到達核或侵入核内’留在病毒核心 中的逆轉錄酶分子驅動了雙股DNA前病毒的合成，是藉著 tRNA分子與基因組病毒RNA之結合作用驅動的合成。接著 將雙股DN A前病毒整合到宿主細胞的基因組内’在那裏它 可擔任mRNAs編碼之病毒蛋白質和病毒知子基因組RNA 兩者的轉錄模板，並將其包裝成病毒核顆粒在匕們離 開被感染細胞的旅途中，核心顆粒移動通過、、田胞膜’與最 -28- 200303922

近被感染細胞的漿膜内侧附接，並出芽，以含有由病毒編 碼之被膜糖蛋白基因產物的膜束握住它們。一再地重覆感 染的循環一逆轉錄、轉錄、轉譯、組合病毒粒子和出芽 使感染蔓延。 病毒RN A，並由於前病毒DN A編碼數個順向作用元件的 結果，這對於成功地完成病毒的生命週期，是攸關生八 的。病毒粒子RNA在其3 ’端帶有病毒的啟動基因。複製特 技將病毒的啟動基因放在前病毒基因組的5’端，因此逆轉 錄該基因組。3’至5’逆轉錄病毒之LTR正好位在病毒的包 裝位置。逆轉錄病毒的生命週期需要由病毒編碼之反向作 用因子的存在。在病毒核心内，亦含有病毒- RNA_依賴性 DNA聚合酶（pol)—逆轉錄酶，並對病毒的生命週期而；θ 攸關生命的，因為它負貴將基因組RNA轉變為可整合的中 間前病毒DNA。病毒被膜糖蛋白eilv，亦為病毒與未感染 細胞附接及病毒散播所必需的。也有轉錄反向-激活的因 子，稱為反向活化劑（transactivators)，其可用來調節？细 整合之親代前病毒的轉錄程度。通常，複製·合格的（沒有 缺陷的）病毒是自給自足的’因為它們編碼全部的這些反 向-作用因子。但其有缺陷的配對物則不是自給自足的。 在DNA病毒的案例中，像是肝dnA病毒，瞭解感染所需 之生命週期和病毒基因，對於本發明之實施是有用的。尚 未完全定義HBV侵入的過程。HB V的複製使用RNA中間模 板。在被感染的細胞中，複製的第一個步騾是將不對稱的 鬆弛環狀DNA (rc-DNA)轉變為共價關閉的環狀dna -29- 200303922

(24) (cccDNA)。該過程發生在被感染之肝細胞的核内，涉及完 成DNA正·股的合成’以及DNA末端的連接。在第二個步 驟中，藉著宿主RNA聚合酶轉錄cccDNA ’產生3.5kB RNA 模板（前基因組（PreSenome))。該前基因組與在病毒核心中 的蛋白質複合。第三個步騾涉及藉著使用由病毒編碼的P 蛋白質逆轉錄酶’幕寫前基因組之RN A，合成第一個反義 DNA股。P蛋白質亦作為最小股的DNA引子。最後，藉著 摹窝第一個DNA股，使用P蛋白質DNA聚合酶活性，並以 病毒RN A之低聚物作為引子，發生第二個正-意義DNA股 的合成。前基因組亦為了主要的結構核心蛋白質轉錄 mRNA。 設計和方法 (1)為了病毒被膜蛋白質，建構表現载體，它能夠接受患 者衍生之編碼被膜蛋白質的斷片 在一個具體實施例中，建構能夠在經過轉移感染的細胞 中，表現HIV-1被膜蛋白質的被膜表現載體。已經描述了 類似的表現載體，包括在美國專利第5,837,464號和 (Petropoulos等人，2000)中描述的，為了表現兩向老鼠白血 病病毒（amphotropic murine leukemia virus)(A-MLV)被膜蛋白 質而建構的質體（pAmphoEnv)。該pAmphoEnv載體使用人類 細胞巨大病毒（CMV)的速發早期基因啟動基因和SV40聚 腺善fe化作用信號序列，在經過轉移感染的細胞中產生 A-MLV被膜mRNA。藉著刪除A-MLV被膜基因，並導入限制 酵素切開位置，來修改pAmphoEnv質體，該限制酵素切開 -30- 200303922 (25) 位置能夠插入衍生自各種分離物，像是HIV-1的病毒被膜 片段。在HIV-1的案例中，被膜開放編閱架構跨越大約2,600 個核甞酸，並編碼被膜多蛋白gpl60。藉著細胞的類費林 蛋白酶（furin)切開gpl60多蛋白，產生兩個次單元，gp41和 gpl20。可按照下列的階段建構HIV-1被膜表現載體： (a) 以多選殖位置之多交聯劑（polylinker)代替得自被膜 表現載體（pAmphoEnv)的A-MLV被膜核酸序列 可藉著限制酵素的消化作用，從pAmphoEnv載體中刪除 A-MLV被膜核酸序列。可藉著與含有四個獨特的内部限制 位置（a，b，c，d)，以供插入被膜序列的雙螺旋寡核苷酸 多交聯劑連接，使經過消化的載體再度環化。可使用該連 接反應來轉化大腸桿菌，並可藉著限制作圖和DNA定序， 分別確認和證實含有正確多交聯劑序列的分子純種系。在 載體内導入多個獨特的選殖位置，可有助於HIV-1被膜序 列的插入。可以其在HIV-1被膜序列中的不常出現為基 礎，選擇在多交聯劑内的限制位置（LANL HIV-1資料庫， www.lanl.gov)。可將該載體稱為pCX。可藉著將報告者基因 或指示劑核酸，像是螢火蟲之蟲螢光素酶，插入pCX多選 殖位置内，並在經過轉移感染的細胞中測量來自指示劑核 酸或報告者基因活性的信號，證實pCX載體的官能度。當 在本文中使用’’指示劑核酸”時，意指用來作為指示劑之核 酸，其編碼的蛋白質、DNA或RNA結構可直接或經由反 應，引起可測量或可注意到的信號，例如顏色或具有可測 量之波長的光，或產生特定的DN A或RN A結構，可使用許

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(26) 多定量擴大測定中的任一種，擴大該核酸。 (b) 將病毒的被膜序列插入pCX被膜表現載體内 使用致突變引子進行PCR擴大作用，產生含有兩個與例 如HIV-1被膜開放編閱架構之開始和終止密碼子相鄰之獨 特限制位置（分別為a，b和c，d)的病毒被膜片段。在被膜 開放編閱架構的兩端導入兩個獨特的限制位置，可改善選 殖之HIV-1被膜片段藏匿有適合在pCX載體之多選殖位置 中找到的任一酵素之内部限制位置的機會。 在HIV-1的案例中，可使用兩個已完全定出特徵，在被 膜基因中具有已知差異的HIV-1之分子純種系，NL4-3 ( — 種謗導細胞融合之親T-細胞的實驗室品系）和JR-CSF ( — 種不謗導細胞融合之親巨嗤細胞的原始分離物），作為 PCR擴大作用的模板。可利用兩種限制酵素（每種酵素切 開片段的一端；例如a和c或b和d)，消化2,600個核苷酸的 擴大產物，接著藉連接作用插入pCX載體，並轉化大腸样 菌。可藉著限制作圖確認含有適當被膜序列的分子純種 系，並藉著DNA定序證實之。可使用所得的質體pHIVenv (NL4-3)和pHIVenv (JR_CSF)在經過轉移感染的細胞中，表 現HIV_1被膜蛋白質（圖1A)。可藉著在經過轉移感染的細 胞中，測量病毒的合成（西方墨點法），並藉著其假定型 (pseudotype)被膜缺陷逆轉錄病毒載體的能力，證實被膜表 現載體，像是pHIVenv載體的官能度。已經使用人類胚胎 腎臟293細胞株，證實高力價的病毒母液（Petropoulos等人， 2000)，然而本發明並不限於那些細胞株。為了獲自患者 -32- 200303922

(27) 並編碼病毒被膜蛋白質之核酸的轉移感染，其他適合作為 第一種細胞的細胞株，舉例來說，但並非限制本發明，包 括 5.25 ; HOX; U87; MT2; PM1; CEM 等等。將設計最適 合的細胞株，來表現一或多種輔·受體。 (Ο修改pex載體，改善選殖之病毒被膜序列的效力 ： 欲改善病毒被膜片段的選殖效力，可藉著在大腸桿菌 . lac啟動基因的控制之下，將細菌殺手基因卡匣（例如控制 細胞死亡之b基因（ccdB)或hok_殺手基因家族的成員）插入 籲 多選殖位置内，來修改pCX表現载體（Gerdes等人，1990;

Bernard和 Couturier，1992; Bernard等人，1993)。將經過修改的 載體稱為pCXccdB。在表現laci阻遏物，像是jmi〇9的細菌 品系中，壓抑ccdB殺手基因的轉錄。可使用該或相當的品 系，繁殖帶有ccdB殺手基因的質體，其在Uc啟動基因的 控制之下。相反的，在該系統中，不過度表現laeiq阻遏物， 像是DH5a和ToplO的細菌品系，不能維持表現“犯基因的 質體。因為ccdB的活性可殺死轉化物。DH5a和ToplO細胞 _ 可購自數個買主（Life Technologies或Invitrogen)。使用該選 擇性選殖法，在laciq細菌品系中繁殖親代表現载體。以兩 · 種移除ccdB基因卡g的限制酵素消化載體，而在的 — 案例中，是可與HIV-1被膜序列（a，b，c，d)之插入相容的。' 接著連接載體和被膜片段，轉化缺乏laeiq的細菌品系。一 旦轉化，便可使含有其中已經以病毒被膜插入物代替“犯 殺手基因之質體的細菌生長。含有保留或重建ecdB殺手基 因之質體的細菌不能存活。以此方式，使轉化細菌之族群 -33 - 200303922

(28) 富含質體，其含有病毒被膜插入物，但缺乏含有ccdB基因 的親代載體。pCXccdB載體的建構，對於該企畫之第I階 段的成功不是必要的，但預期它明顯地改善了衍生自患者 試樣之選殖HIV-1被膜序列的效力；因此，可改善維持病 毒序列之異種性的可能性。可藉著限制作圖和DN A定序， 證實pCXccdB載體的結構。 (d) 將病毒被膜序列插入pCXccdB表現載體内 可藉著建立含有病毒被膜序列和經過不完全消化之 pCXccdB載體DNA的連接反應，評估pCXccdB載體的官能 度。在細菌的轉化作用之後，可從個別的細菌純種系來製 備質體DNA，並藉著限制消化作用，分析病毒被膜片段的 存在和ccdB序列的缺乏。藉著從可經由AIDS研究試劑參考 程式（AIDS Research reagent reference program) (ARRRP), Rockville, Maryland獲得的總共13個可利用之HIV-1純種系 (pCRII-91US005.ll 、 pCRII-91006.10 、 pCRII-92US657.1 、 pCRII-92US711.14、pCRII_91US712.4、pCRII-92US714.1、 pCRII-91HT652.ll、pCRII-92BR020.4、pCRII-91HT65 1.1A > pCRII-92HT593.1、pCRII-92HT594.10 > pCRII-92HT596.4 > pCRII-92HT599.24)中，擴大被膜區，來測試該方法的可行 性。可將每個片段分別插入pCXccdB中，並可藉著限制作 圖及/或DNA定序，證實所得之pHIVenv表現載體的結構。 可藉著在經過轉移的細胞中，測量HIV-1被膜蛋白質合成 (西方墨點法），並藉著其假定型被膜缺陷逆轉錄病毒載體 的能力。證實每個pHIVenv載體的官能度。 -34- (29) (29)200303922

(2) 建構峰& _ •安全的病毒表現載體，其包括指示劑核酸 代替編碼被膜蛋白質者 根據類似 在美國專利第5,837,464號和Petrop〇ul〇s等人， 2000中插械 &的用來評估PR和RT抑制劑之裝置和方法，建 構生物-安全 的蜗毒載體，來評估病毒侵入抑制劑。本發 明之病主jb

母衣現載體可與（上述的）被膜表現載體一起，共同 -轉移感染至I π Θ細胞内，產生高力價的病毒母液。可評估這 類病毒Υ3Κ ^kl ί瑪毒侵入抑制劑的感受性，包括抗-病毒藥 物和中永^ 机植。在HIV-1的案例中，可從NL4_3中產生病毒 表現載昏#，w ^ 匕是完全定出特徵之有感染力的HIV-1病毒純 系 “ °可修改控制病毒基因表現的5,長端重覆段（LTR)， 以便在被轉移感染的細胞内，由C Μ V速發早期啟動基因 驅動病毒基因的轉錄（Naviaux等人，1996)。可刪除大多數 的被膜基因’但保留重要的控制元件，像是rev反應元件 (RRE)和附屬蛋白質密碼區（rev，tat)。插入在CMV啟動基 因·促進子序列（圖1B和3)控制之下的指示劑核酸，像是螢 火蟲蟲螢光素酶報告者基因卡匣，代替被刪除的被膜序 歹】°可藉著在被感染的細胞中，測量蟲螢光素酶活性，來 &视病毒的感染。雖然不可能，但可想像在逆轉錄病毒載 體和例如在被轉移感染之細胞中的pHIVenv序列之間的質 體間重組作用，可能導致有感染力之Hivq的產生。為了 努力產製生物安全的載體，可將數個遺傳變化導入HI V基 因組中。例如，刪除大部分的被膜基因，同時保留重要的 控制序列RRE ’並完成在載體之3, ltr的u3區域中，轉錄 35· 200303922

(30) 促進子序列的刪除（圖2)。在複製逆轉錄病毒基因組的期 間，在被感染的細胞中，位在病毒基因組之3 *端的U 3區域 係作為前病毒之5，LRT的U3區域之模板。這類前病毒在5’ LTR之U3區域中，缺乏強有力的啟動基因元件，並因此不 能在被感染的細胞中產生逆轉錄病毒的RN A。已經對數個 逆轉錄病毒载體系統，成功地使用該自我-失活（S IN)的策 略，包括 HIV_1 (Hwang等人，1997; Miyoshi等人，1998)。在本 發明的測定中，在被感染的細胞中不需要病毒基因表現， 因為是藉著由指示劑核酸產生的可檢測信號，像是由其自 己個別的啟動基因驅動之蟲螢光素酶活性的產生，來測量 病毒的感染（圖1B)。可藉著標準分子選殖程序，完成被膜 序列和轉錄促進子區域（U3)的刪除，並可由DNA序列分析 證實每個刪除。 薇載體的官能度，例如在Hivd的案例中，將載體命名 為pHIVlucMJ3 ’可藉著與上述之pHIVenv載體共同轉移感染 293細胞來證實。在經過轉移感染之細胞中，由這兩個載 體產生之病毒蛋白質的有效轉移互補作用，可導致病毒顆 粒的產生。可從培養物上清液中收獲病毒顆粒，並藉著西 方墨點法分析。可藉著P24 ELISA、定量PCR或TaqMan測定 的例行應用，定量病毒的力價。 進行本發明時，不一定產生自我-失活的病毒表現載 體’但想要改善測定的再現性和生物安全性。 (3)確認適合表現受體和輔·受體並支持病毒感染的細胞株 可砰估先前已經描述，且已知支持特定病毒感染的不同 -36- 200303922 (31) 哺乳動物細胞株。如同在本文中討論的，一個與HIV-1有 關的具體實施例，可藉著（a)以pHIVenv和pHIVlucAU3共同 轉移感染第一種細胞，（b)在轉移感染之後收獲病毒，（c) 在病毒侵入抑制劑的存在和缺乏兩者下，使用該病毒感染 第二種細胞，並（d)在被感染的細胞中測量蟲螢光素酶的 產生，來進行測定。 表1列舉評估HIV-1感染之這類細胞株的代表性實例，包 括細胞株及其相關之受體/輔-受體。可從公開的細胞儲藏 所獲得這些細胞株中的數種。 可使用從經過感染之293細胞培養物中獲得的病毒顆 粒’來感染各種不同的細胞株。在HIV-1的案例中，如同 上述，pHIVlucAU3載體在被膜基因和U3啟動基因η足進子 中含有刪除，因此，使利用由該載體產生之病毒顆粒感染 許可的細胞株，僅限於一回合的複製。這包括（a)病毒附 接和侵入，由病毒被膜蛋白質調解，按照描述由pHIVenv 載體以反向產生，（b)藉著RT將單股的病毒rnA轉變為雙 股的DNA ’以及（c)將病毒DNA整合到宿主細胞基因組内 (如病毒形成）。在被感染的病毒中，正常地出現由RN a聚 合酶II主動轉錄病毒基因的作用，接著可藉著在pHIVlucMJ3 載體中，刪除必要的病毒啟動基因-促進子序列，限制前 病毒的整合。然而，該限制作用不會在被感染的細胞中， 干擾蟲螢光素酶基因表現，因為該基因是由使用内部 CMV啟動基因之病毒基因表現獨立驅動的（圖1B)。可使用 在感染後所產生之蟲螢光素酶活性的含量，作為病毒感染 -37- 200303922 1 (32) 力的測量值。 HIV-1附接和侵入宿主細胞内，需要與初級受體（CD4) 及數個輔-受體之一產生交互作用，最常見的是CCR5和 CXCR4。可篩選已知其表現各種CD4、CCR5和CXCR4之組 合的細胞株。更特定而言，評估在表1中列舉的細胞株， 其表現（a) CD4 加 CCR5，（b) CD4 加 CXCR4，和（c) CD4 加 CCR5加CXCR4。單獨表現CD4受體，或僅表現任一個CCR5 或CXCR4輔·受體的細胞株，可作為有用的對照組，並可 用來評估HIV-1分離物，不需要CD4結合作用，或使用CCR5 和CXCR4以外的輔-受體。判斷細胞株適合性的首要標準 可以是藉著蟲螢光素酶產生所測量到的感染力（104-106相 對光單位）。此外，可以生長速率、存活力、穩定性和其 他認為有必要之參數為基礎，來評估細胞株。可選擇容易 維持，並例如在感染後，可藉著不同的被膜受體向性，例 如CD4/CXCR4和CD4/CCR5來感染它，產生大量蟲螢光素酶 活性的細胞株。可經由公開的儲存所，像是ARRRP，獲得 其他完全定出特徵，並支持例如HIV複製和表現HIV-1受體 和輔-受體（例如CEM-NKr_CCR5 ;釋放種類a)的細胞株。 再者，可使用標準程序促進細胞株，像是將海美溴胺 (polybrene)加至細胞（Porter等人，1998)，來促進感染。例如 在HIV的案例中，藉著以HIV-1實驗室品系感染，並與利用 有感染力之HIV-1所獲得的那些比較重組病毒感染力力 價，或藉著以在本文中描述之病毒表現質體直接轉移感染 細胞，並計算病毒產生的分數，來確認可供本發明使用之 -38- 200303922 (33) 其他有潛力的細胞株◦可藉著使用定量RT_pCR測定，檢 查病母轉錄本的堆積。可以類似之方式，確認適合其他病 毒的細胞株。 本發明可充分運用測定條件，並容許使用自動控制進行 患者試樣的高輸貫量測試。可充分運用試樣製備方法，以 便有效地捕捉病毒基因組和被膜RNAs。可充分運用 RT-PCR條件，而得以在低病毒負荷（每毫升約5〇〇個副本） 下，擴大患者-衍生的病毒被膜序列，像是mv-1被膜序列 (約2,600個鹼基對）。 (4) 證實測定的利用性 藉著從（1)在已完全定出特徵之抑制劑的存在下，測試 病母知：入之劑量·依賴性抑制作用；和（2)在已完全定出特 徵之HIV-1中和抗體的存在下，測試感染之劑量-依賴性抑 制作用所獲得的結果，證實本發明之測定的利用性。 評估本發明之病毒侵入測定的下列應用： 0 藉著病毒附接和侵入-抑制劑（包括融合、受體和 輔-受體抑制劑），檢測HIV-1複製的抑制作用； ii) 測量在對HIV-1附接和侵入抑制劑之感受性上的 改變；以及 iii) 檢測在瞄準HIV-1被膜蛋白質的疫苗反應中，所產 生之抗體的中和活性。 在較佳的具體實施例中，可藉著（a)利用pHIVenv和 pHIVlucAU3載體共同轉移感染第一種細胞，（b)在轉移感染 後大約48小時後，收獲病毒，（c)在病毒侵入抑制劑的存 -39- 200303922

(34) 在和缺乏之下，使用該病毒感染第二種細胞，並（d)在感 染後大約48-72小時，測量蟲螢光素酶的產生，來進行測 定。可以9 6 -孔之格式，對各種病毒侵入抑制劑濃度評估 HIV-1複製的劑量-依賴性抑制作用。對每種抑制劑，憑經 驗判定適當的濃度範圍。可按照蟲螢光素酶活性之抑制百 分比對藥物濃度（對數10)，將資料作圖。可使用電腦軟體 進行資料分析。使用抑制曲線，判定特定藥物或抗體的 50%抑制濃度（IC50)(圖6)。 使用按照上述建構的pHIVenv載體，評估衍生自各種已 完全定出特徵之HIV-1分離物的被膜蛋白質。欲定義被膜 輔-受體向性，在HIV-1的案例中，按照上述評估使用表現 CD4加CXCR4和CD4加CCR5之細胞的感染。在本發明之測 定中，可使用各種已知抑制HIV-1侵入的化合物（表2)，包 括非-專一製劑，像是磺化聚陰離子（硫酸葡聚醣和肝 素）。化學激動素，像是Rantes和SDF_I，分別為CCR5和CXCR4 化學激動素受體的天然配體（參見Alkhatib等人，1996; Bleul 等人，1996)，亦適用於本發明。此外，亦使用諸如T20和 T1249 (Trimeris，Inc.)、PRO 542 (Progenies)、5a8 (Tanox)之類 的病毒侵入抑制劑，來評估本發明之測定的利用性。 使用標準存活或細胞毒性測定，評估在標靶細胞中的藥 物毒性（例如，染料排除、MTS、ATP)。 已經描述了 HIV-1突變種對融合抑制劑T20顯示出降低 的感受性（Rimsky等人，1998)，且遺傳決定位（突變）使這些 病毒能夠在藥物的存在下，複製在被膜蛋白質（gp41-TM) 40- 200303922

(35)

内的地圖。欲證實本發明之測定能夠測量在藥物感受性 (也就是抵抗力）上的改變，（a)產製攜帶這些突變種被膜基 因的pHIVenv載體，（b)使用這些載體和pHIVlucAU3載體， 共同轉移感染第一種細胞，（c)收獲攜帶這些突變種被膜 蛋白質的病毒，並（d)在T20的存在下，測試病毒的感染 力。藉著比較攜帶突變種被膜蛋白質之病毒的IC5〇與缺乏 已定義之藥物抵抗力突變的那些，評估降低對T20之藥物 感受性。攜帶具有藥物抵抗力突變之被膜蛋白質的病毒， 可顯示出比攜帶缺乏藥物抵抗力突變之被膜蛋白質的病 毒更高的IC5〇值，也就是說，抑制作用可能需要較高的藥 物濃度（相當於在圖8中提供的資料）。可使用標準指定位 置之突變生成技術，根據標準草案（Petropoulos等人，2000 ;Ziermann等人，2000)，將藥物抵抗力突變導入被膜表現 載體（pHIVenv)内。

廣泛地接受保護對抗HIV-1感染的有效疫苗，應該謗發 強烈的體液免疫反應，其特徵在於廣泛交叉·反應的中和 抗體。因此，就醋準免疫原之高力價中和抗體的存在，例 行地評估接種疫苗之個體的血清。最近，使用HIV-1/猿免 疫缺陷病毒（SIV)嵌合型病毒獼猴（macaque)模式（SHIV)， Mascola和同事已經顯示被動轉移這類中和抗體，導致在 黏膜攻毒之後，降低了病毒負荷（Mascola等人，2000)。可 使用本發明之測定，快速並可靠地判定在瞄準被膜抗體， 像是HIV-1被膜抗體的疫苗反應中，所產製之抗體的病毒 中和活性。例如，本發明之測定可（a)產製表現各種已完 -41 - 200303922

(36) 全定出特徵之被膜蛋白質的pHIVenv載體，（b)使用這虺載 體與pHIVlucMJ3載體，共同轉移感染第一種細胞，收 獲病毒，並與連續稀釋的抗體製品或疫苗血清一起培養， (d)測试這些病毒在第二種細胞中的感染力。可按照先前 和在文獻中的描述，進行資料分析和IC5g判定。在Η”」 的案例中，可選擇病毒，代表不同的Hivq遺傳背景（例如 A、B、C、D、E、F型）、不同的細胞和辅_受體向性（巨噬 細胞/CCR5、T-細胞/CXCR4)，以及不同的被膜特性（細胞 融合和非-細胞融合，包括適合實驗室生長或原始分離 物）（表2)。從每種病毒中製備限定力價的母液可能是有益 的’以便藉著使用大約2〇-1〇〇 TCIDsg/孔的病毒輸入，並按 睬而要進行調整，使測定敏感性和再現性最優化。可以先 前證明的中和特性，或功能，像是其中和原始分離物的能 力，或物理性質，像是其與專一之卯12〇或卯41抗原決定 位結合的能力（表2)為基礎，來選擇抗體製品。可針對這 些已完全定出特徵之抗體試劑，在按照科學文獻中描述之 傳統病毒中和測定中的活性，判斷本發明之測定的實行。 <使用得自HIV-1感染個體之廣大代表組的血清，建立適 當範園的血清稀釋度，其可使測定敏感性達到最大，但使 細胞母性減至最少。可使用標準存活或細胞毒性測定，來 評估細胞毒性（例如，染料排除、MTS、ATP)。 提供下列的實例，進一步說明和解釋本發明，但不應在 任何方面用來加以限制。 實例1 :對HIV-1侵入抑制劑，測量表現型藥物感受性 -42- 200303922 (37) 本實例提供精確和可再現地測量對HIV-1附接和侵入 (以前集體地稱為侵入）抑制劑之感受性的裝置和方法。以 本實例為基礎，可改編該測量對HIV-1侵入抑制劑之感受 性的裝置和方法以適合其他的病毒，包括但不限於其他的 慢病毒（例如HIV-2)、其他的逆轉錄病毒（例如HTLV-1和 2)、肝DNA病毒（人類B型肝炎病毒）、黃病毒（人類C型肝 炎病毒）和疱疹病毒（人類細胞巨大病毒）。本實例進一步 提供了測量在對侵入抑制劑之感受性上的改變（增加或降 低）的裝置和方法。 使用在美國專利第5,837,464號（國際公開案第WO 97/27319號）中描述之表現型藥物感受性和抵抗力測試的 改編版，進行侵入抑制劑感受性的測量，將其以引用的方 式併入本文中。 設計一種載體，例如被膜表現載體（pHIVenv)，表現由患 者衍生之HIV被膜序列編碼的被膜多蛋白（gpl60)(圖1)。接 著藉著細胞的蛋白酶切開gpl60，產生表面（gpl20SU)和穿 透膜（gp41TM)次單元，其包括在HIV-1病毒顆粒之表面上 的被膜蛋白質。設計第二個載體，例如病毒表現載體 (pHIVluc或pHIVlucAU3)，表現基因組和次基因組的病毒 RNAs，以及除了被膜多蛋白以外的所有HIV蛋白質（圖ία 和 1B)。 在本申請案中，患者-衍生之斷片（們）相當於HIV_ 1被膜 多蛋白（gpl60)之密碼區（約2·5 KB)，並代表（a)藉著逆轉錄 -聚合酶連鎖反應法（RT-PCR)，使用從衍生自HIV-感染個體 -43 - 200303922

(38) 之病毒中分離出的病毒RNA，擴大的被膜序列’或（b)衍 生自HIV-1之分子純種系的被膜序列，其含有藉著親代分 子純種系（通常是NL4-3)之指定位置突變生成作用導入的 特定突變。 使用標準程序（例如RNA製劑（RNAgents)總RNA分離系 統，Promega, Madison WI 或 RNAzol，Tel-測試，Friendswood， TX)，進行病毒RNA的分離。將RT-PCR草案分成兩個步騾。 使用逆轉錄病毒的逆轉錄酶[例如Superscriptll (Invitrogen， Life Technologies) Moloney MuLV 逆轉錄酶（Roche Molecular Systems，Inc.，Branchburg，NJ)，或鳥類骨髓胚細胞過多病病 毒（AMV)逆轉錄病毒（Boehringer Mannheim, Indianapolis， IN)]，將病毒的RNA摹寫成第一股cDNA。然後使用熱穩定 的 DNA 聚合酶[例如 Taq (Roche Molecular Systems，Inc.， Branchburg，NJ)、Tth (Roche Molecular Systems，Inc·，Branchburg， NJ)、PrimeZyme (分離自 Thermus Brockianus，Biometra，Gottingen, Germany)]，或熱穩定聚合酶的組合，如同對於實行’’長 PCR’’ 的描述（Barnes，W.M·，（1994) Proc· Natl. Acad. Sci，USA 91， 2216-2220)[例如，Expand High Fidelity PCR System(Taq+Pwo)， (Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN) OR GeneAmp XL PCR套 組(Tth + Vent)，Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ), Advantage_2，（CloneTech)]，將該cDNA擴大成高副本數目。 使用寡-dT，將病毒的RNA逆轉錄成第一股cDNA。使用 被膜PCR引子、前進引子Xho/Pin和逆向引子Mlu/Xba (表 3)，擴大患者-衍生之斷片。設計這些引子擴大編碼gpl60 -44- 200303922

(39) 被膜i多蛋白的大約2.5 kB之被膜基因’同時在PCR擴大產 物的5’端，導入Xho I和Pin AI認知位置，並在PCR擴大產 物的3’端，導入Mlul和Xbal位置。 使用按照在美國專利第5,837,464號（國際公開案第WO 97/273 19號）中描述的，具有最少改編的核酸限制内切酶消 化作用、DNA連接和細菌轉化法，將患者-衍生的斷片（2.5 kB之被膜序列擴大產物）插入HIV-1被膜表現載體内。在5, 端利用Xho I或pin AI，或在3 ’端利用Mlu I或Xba I，消化該 大約2·5 kB的擴大產物。使用DN A連接酶，將所得的消化 產物連接到經過修改之pCXAS或pCXAT表現載體的5，Xho I/Pin AI和 3’ Mlu I/Xba I位置内。已經描述了 pCXAS 和 pCXAT 載體（在CPT的基本專利中，我相信是實例6，美國專利第 5,837,464號（國際公開案第w〇 97/27319號））。除了現存於 pCXAS和pCXAT中的Xho I、Mlu I和Xba I限制位置之外，經 過修改的pCXAS和pCXAT載體尚含有Pin AI限制位置。藉著 指定位置之突變生成作用，將Pin AI位置導入xh〇 1和Mhi工 位置之間’使得位在5’至3,的這四個位置，按照下列的順 序：Xho I、Pin AI、Mlu I和Xba I。在較佳的具體實施例中， 利用Pin AI和Mlu I消化2·5 kB擴大產物，並連接到經過修改 之pCXAS表現載體的5, Pin A][位置和3, Mlu工位置内。使用 該連接反應的產物來轉化大腸桿菌。在3〇-37^下，在24_36 小時的培養期間之後，從大腸桿菌培養物中純化表現載體 之質體DNA。欲確保該表現載體製品充分代表出現在特$ 患者 < 血清中的HIV準-物種，集合許多（>1〇〇)獨立的大腸 -45- 200303922

(40) 桿菌轉化物，並用來製備pHIVenv質體DNA。將為了表現 患者病毒衍生之被膜蛋白質之目的，而以此方式裝配的載 體，集體地稱為pHIVenv (圖1和3 )。 設計基因組HIV表現載體pHIVluc和pHIVlucAU3，轉錄 HIV基因組RNA和次基因組mRNAs，並表現除了被膜蛋白 質以外的所有HI V蛋白質（圖1B)。在這些載體中，已經刪 除部分的被膜基因，以便容納有功能的指示劑基因卡匣， 在該情況下，使用”螢火蟲蟲螢光素酶π來監視在抗-病毒 藥物的存在或缺乏下，病毒複製的能力。在pHIVlucAU3 中，已經刪除部分的3’ U3區域，以便防止病毒的RNAs在 被感染的細胞中，從5’ LTR轉錄。 使用包裝宿主細胞，其由人類胚胎腎臟細胞株293 (Cell Culture Facility，UC San Francisco，SF，CA)所組成，以及標 $巴 宿主細胞，其由表現CD4 (HT4)加CCR5和CXCR4的人類骨肉 瘤（HOS)細胞株，或表現CD4和CCR5，或CD4和CXCR4的 星形細胞瘤（U-87)細胞株所組成，來進行HIV-1侵入抑制劑 的感受性測定。 使用pHIVenv和pHIVluc或pHIVlucMJ3進行藥物感受性測 定。藉著以抵抗力測試載體D N A轉移感染包裝宿主細胞 (HEK 293)，產生含有由患者衍生之斷片編碼之被膜蛋白 質的假定型HIV顆粒。在轉移感染後（約48小時）收集病毒 顆粒，並用來感染表現HIV受體（也就是CD4)和辅-受體（也 就是 CXCR4，CCR5)的標靶細胞（HT4/CCR5/CXCR4 或 U_87/ CD4/CXCR4或U-87/CD4/CCR5)。在感染之後（約72小時），溶 -46- 200303922 (41) 解標輕細胞，並測量蟲螢光素酶活性。HI V必須完成一回 合的複製，以便成功地感染標靶宿主細胞，並產生蟲螢光 素酶活性。使用在被感染細胞中檢測定的蟲螢光素酶活性 含量，作為"感染力”的直接測量值（圖1和2)。如果因為任 何原因（例如缺乏適當的受體或辅-受體，抑制藥物活性、 中和抗體結合），使病毒不能侵入標乾細胞，便減少蟲螢 光素酶活性。藉著比較在缺乏藥物時的感染力與在出現藥 物時的感染力，來評估藥物感受性。可藉著比較”受試π 病毒之感受性與衍生自HIV-1之分子純種系，例如NL4-3或 ΗΧΒ2的已完全定出特徵之參考病毒（野外型）的感受性，定 量相對的藥物感受性。 將包裝宿主細胞播種在直徑10-公分的培養盤中，並在1 天後以pHIVenv和pHIVluc或pHIVlucAU3轉移感染。使用磷酸 鈣共同-沉澱程序進行轉移感染。在轉移感染之後，從1 至24小時，以新鮮的培養基置換含有DN A沉澱物的細胞培 養基。通常在轉移感染後2天，收獲含有病毒顆粒的細胞 培養基，並使其通過〇·45-毫米之濾紙。在感染之前，先 將標靶細胞平舖在細胞培養基中。通常在感染時（在感染 前1天），將侵入抑制藥物加至標靶細胞中。通常在感染後 3天，使用Steady-Glo試劑（Promega)和發光計，測定標乾細 胞的蟲榮光素酶活性。 在一個具體實施例中，證實融合抑制藥物（T-20，亦稱 為 DP178; Trimeris，Research Triangle Park，NC)的感受性（圖 6)。在缺乏T-20和各種範圍的T-20濃度下（X-軸為對數10之 -47· 200303922 (42) 刻度），感染表現CD4、CCR5和CXCR4的標靶細胞（HT4/ CCR5/CXCR4)。藉著比較在T-20存在下，在被感染細胞中 所產生之蟲螢光素酶的量，與在缺乏T-20下所產生之蟲螢 光素酶的量，來判定病毒複製的抑制百分比（y ·軸）。測試 親 R5 (JRCSF，91US005.il)、親 X4(NL4-3, 92HT599.24)和雙向 性（92HT593.1)病毒。藉著判定抑制50%病毒複製所需之 T-20濃度（IC50，在圖6中以垂直破折線表示），定量藥物的 感受性。具有較低IC5〇值的病毒比具有較高IC5〇值的病 毒，對T-20更具感受性。 在更進一步的具體實施例中，可測試對各種侵入抑制劑 的感受性。這些抑制劑包括，但不限於在表4(抗-HIV藥物 表）中列舉的藥物和化合物。 在第二個具體實施例中，證實屬於4-(六氫吡啶-1-基）丁 烷類化合物之CCR5抑制劑（Dorn，C.P·等人，（2001)，Finke，Ρ·Ε 等人，（2001); Merck，West Point，PA)的感受性。在缺乏 CCR5 抑制劑和各種範圍的CCR5抑制劑濃度下（x-軸為對數10之 刻度），感染表現CD4和CCR5的標靶細胞（U87/CD4/CCR5)。 藉著比較在CCR5抑制劑存在下，在被感染細胞中所產生 之蟲螢光素酶的量，與在缺乏CCR5抑制劑下所產生之蟲 螢光素酶的量，來判定病毒複製的抑制百分比（y-軸）。測 試親 R5 (JRCSF)、親 X4 (NL4-3)和雙向性病毒（92HT593.1)。 藉著判定抑制50%病毒複製所需之CCR5抑制劑濃度 (IC5G，在圖8中以垂直破折線表示），定量藥物的感受性。 具有較低IC5〇值的病毒比具有較高IC5G值的病毒，對CCR5 48· 200303922 (43) 抑制劑更具感受性。親X4病毒不感染U-87/CD4/CCR5標靶 細胞。 在第三個具體實施例中，證實CXCR4抑制劑（AMD3100; AnorMED)的感受性。在缺乏CXCR4抑制劑和各種範圍的 CXCR4抑制劑濃度下（χ·軸為對數1()之刻度），感染表現 CD4和CXCR4的標靶細胞（U87/CD4/CXCR4)。藉著比較在 CXCR4抑制劑存在下，在被感染細胞中所產生之蟲螢光素 酶的量，與在缺乏CXCR4抑制劑下所產生之蟲螢光素酶的 f，來判定病毒複製的抑制百分比（y -轴）。測試親R5 (JRCSF)、親X4 (NL4-3)和雙向性（92HT593.1)病毒。藉著判 定抑制50%病毒複製所需之CXCR4抑制劑濃度（IC5〇,在圖9 中以垂直破折線表示），定量藥物的感受性。具有較低IC50 值的病毒比具有較高IC5G值的病毒，對CXCR4抑制劑更具 感受性。親R5病毒不感染U-87/CD4/CXCR4標靶細胞。 可測量對CD4抑制劑（例如老鼠單株抗體5A8; Tanox， Houston，TX)的感受性。在缺乏CD4抑制劑藥物和各種範圍 的CD4抑制劑藥物濃度下（X-軸為對數10之刻度），感染表 現CD4和一或兩個輔-受體的標靶細胞（例如HT4/CCR5/ CXCR4、U-87/CD4/CXCR4 或 U-87/CD4/CCR5)。藉著比較在 CD4抑制劑存在下，在被感染細胞中所產生之蟲螢光素酶 的量，與在缺乏CD4抑制劑下所產生之蟲螢光素酶的量， 來判定病毒複製的抑制百分比（y-軸）。測試親R5 (例如 JRCSF)、親X4 (例如NL4-3)和雙向性（例如92HT593.1)病 毒。藉著判定抑制50%病毒複製所需之CD4抑制劑濃度 -49- 200303922

(44) (IC5〇)，定量藥物的感受性。具有較低IC5G值的病毒比具 有較高IC5G值的病毒，對CD4抑制劑更具感受性。 實例2 : 發現、最優化並定出新的和新穎的病毒侵入抑制 劑之特徵 在一個具體實施例中，可使用病毒侵入測定來確認可抑 制病毒侵入的新穎化合物/化學實體。在大化學庫之個別 成員的存在下，感染表現CD4和一或兩個輔-受體的標革巴 細胞（例如 HT4/CCR5/CXCR4、U-87/CD4/CXCR4 或 U-37/CD4/ CCR5)(高輸貫量篩選，HTS)。可藉著比較在特定化合物 的存在下，在被感染之標細胞中所產生之蟲螢光素酶的 量，與在缺乏該化合物下所產生之蟲螢光素酶的量，判定 化合物抑制病毒複製的能力（”命中”）。 在進一步的具體實施例中，可使用病毒侵入測定，使藉 著HT S確認之前導化合物的抗病毒活性發揮最大效用。可 測試前導化合物之經過化學修改的衍生物，確認具有提高 病毒侵入抑制活性的特定衍生物。在缺乏抑制劑候選者和 各種範圍之抑制劑候選者濃度下（X-軸為對數10之刻 度），感染表現CD4和一或兩個輔-受體的標靶細胞（例如 HT4/CCR5/CXCR4、U-87/CD4/CXCR4 或 U-87/CD4/CCR5)。藉 著比較在候選抑制劑的存在下，在被感染細胞中所產生之 蟲螢光素酶的量，與在缺乏候選抑制劑下所產生之蟲螢光 素酶的量，來判定病毒複製的抑制百分比（y-軸）。·藉著判 定抑制50%病毒複製所需之抑制劑候選者濃度（IC5G)，定量 藥物的感受性。具有較低IC5G值的衍生化合物比具有較高 -50- 200303922

(45) IC5G值的衍生物，是更具潛力的病毒侵入抑制劑（具有較大 的抗病毒活性）。 在更進一步的具體實施例中，可使用病毒侵入測定，定 出新病毒侵入抑制劑藥物候選者之作用機制的特徵，以及 ， 對抗各種病毒之抗病毒活性，在感受性上可能是不同的。 · · 在缺乏新的侵入抑制劑藥物候選者和各種範圍之侵入抑 .β 制劑藥物濃度下（X-軸為對數10之刻度），感染表現CD4和 一或兩個輔-受體的標靶細胞（例如HT4/CCR5/CXCR4、U-87/ · CD4/CXCR4或U-87/CD4/CCR5)。藉著比較在新的侵入抑制劑 的存在下，在被感染細胞中所產生之蟲螢光素酶的量，與 在缺乏新的侵入抑制劑下所產生之蟲螢光素酶的量，來判 定病毒複製的抑制百分比（y-軸）。測試親R5 (例如JRCSF) 、親X4 (例如NL4-3)和雙向性（例如92HT593.1)病毒。藉著 判定抑制50%病毒複製所需之CD4抑制劑濃度（IC5〇)，定量 藥物的感受性。 欲判定新的侵入抑制劑是否藉著阻斷CCR5或CXCR4輔- φ 受體而產生作用，在U-87/CD4/CCR5細胞中，對新的抑制 劑測試親R5病毒，並使用U-87/CD4/CXCR4細胞，對新的抑 i 制劑測試親X4病毒。R5病毒感染的抑制，表示CCR5輔-受體拮抗作用，相反的，X4病毒感染的抑制，表示CXCR4 * 輔-受體拮抗作用。R5和Χ4病毒感染的抑制，可能表示CD4 拮抗作用或膜融合的抑制作用。 欲定出新抑制劑對抗對其他同種類或不同種類之病毒 侵入抑制劑顯露出抵抗力，或具有降低之感受性的病毒之 -51- 200303922 (46) 活性的特徵，可在病毒侵入測定中，使用新的侵入抑制劑 藥物’測試選出名單之具有藥物抵抗力的病毒。該名單可 包括對CCR5抑制劑、CXCR4抑制劑、CD4抑制劑和膜融合 抑制劑’具有各種程度之感受性的病毒。該名單可包括具 有一或多個與降低對一或多種侵入抑制劑之感受性有關 的特定突變的病毒。 實例3 :確認改變對病毒侵入抑制劑之感受性的被膜胺 基酸取代/突變 本實例提供在HIV-1被膜中，確認賦與降低對病毒侵入 抑制劑之感受性/抵抗力的突變的裝置和方法。本實例亦 提供定量由特定的被膜突變所賦與之降低對侵入抑制劑 的感受性之程度的裝置和方法。 在侵入測定中，測試衍生自患者試樣的被膜序列，或衍 生自患者試樣的個別純種系’或藉著指定位置之突變生成 作用設計而含有特定突變的被膜序列，以便以已完全定出 特徵之參考標準物（例如NL4-3，ΗχΒ2)為基礎，定量藥物 的感受性。 在一個具體實施例中，評估符縱長之患者試樣（在不同 時間點，從相同患者中收集之病毒）的感受性。例如，在 開始治療之前、更換藥物治療之前或之後，或在更換疾病 進行之病毒學（RNA副本數目）、免疫學（CD4 T·細胞），或 臨床（機會感染）標記之如或之後，測量對侵入抑制劑的感 受性。 患者HIV試樣的基因型分析 -52· 200303922 (47) 可藉著廣泛可獲得的DNA定序方法，分析代表患者試樣 集合的被膜序列，或衍生自患者集合的純種系。在本發明 的一個具體實施例中，使用病毒RNA純化作用、RT/PCR 和二脫氧核苷酸鏈終止序列的定序化學法，以及毛細管凝 膠電泳（Applied Biosystems，Foster City，CA)，判定患者 HIV 試樣序列。將患者病毒集合或純種系的被膜序列與參考序 列、其他的患者試樣，或如果可獲得，與獲自在開始治療 之前相同患者的試樣相比較。針對與參考序列或治療前序 列不同的序列檢查基因型，並使其與在侵入抑制劑之感受 性上的差異發生關連。 指定位置突變種的侵入抑制劑感受性 藉著建構在已定義、易感受藥物之遺傳背景（例如NL4-3 參考品系）上含有特定突變之被膜表現載體（pHIVenv)，來 評估與在適性上之變化有關連的基因型變化。可單獨並/ 或與其他被認為可調解侵入抑制劑之感受性的突變一起 併入突變。使用任何可廣泛獲得的指定位置之突變生成方 法，將被膜突變導入pHIVenv載體内。在本發明的一個具 體實施例中，使用指定位置之突變生成的巨·引子PCR法 (Sarkar，G·和Summer，S.S·，1990)。使用在實例1中描述的病毒 侵入測定，測試含有特定被膜突變或突變組的pHIVenv載 體。在評估下，比較含有被膜突變之病毒的藥物感受性， 與缺乏該特定突變之在遺傳上已定義為易感受藥物之病 毒的藥物感受性。將造成在侵入抑制劑之感受性上觀察到 改變的特定突變，導入pHIVenv載體内。 -53 - 200303922

(48) 在本發明的一個具體實施例中，證實藉著在gp41被膜蛋 白質中特定的藥物抵抗力突變，賦與對融合抑制劑τ_20的 降低感受性（圖7)。在缺乏T-20和各種範圍之Τ·20濃度下 (X-軸為對數10之刻度），感染表現CD4、CCR5和CXCR4的 細胞。藉著比較在Τ-20的存在下，在被感染細胞中所產生 之蟲螢光素酶的量，與在缺乏Τ-20下所產生之蟲螢光素酶 的量，來判定病毒複製的抑制百分比（y-軸）。測試在gp41 穿透膜被膜蛋白質中，含有一或兩個特定突變的同基因病 毒（在圖的說明中以紅色強調；Rimsky等人，J. Virol. 72:986-993)。藉著判定抑制50%病毒複製所需之Τ-20濃度 (IC5〇，以垂直破折線表示），定量藥物的感受性。具有較 低IC5G值的病毒，比具有較高IC5C值的病毒，對T-20更具感 受性。 在一個具體實施例中，將藥物抵抗力突變導入已完全定 出特徵的親X4 (NL4-3)和親R5 (JRCSF)病毒内。使用病毒侵 入測定測量T-20感受性（圖7)。藉著將受試病毒的IC5〇除以 HIV-1之HXB2品系的IC50,定出每種病毒在Τ·20感受性上的 倍數變化（FC)。已經在科學文獻中報告了類似突變種病毒 對Τ-20的敏感性（Rimsky等人）。在本具體實施例中，在gp41 之GIV基序（motif)(DIV，GIM，SIV)中具有一個突變的病 毒，比野外型病毒（GIV)，對T-20有更低的感受性。在GIV 基序（DIM，SIM，DTV)中具有兩個突變的病毒，比在GIV 基序中有一個或沒有突變的病毒，對T-20具有更低的感受 性。 -54- 200303922

(49) 在另一個具體實施例中，藉著定序敏感的和有抵抗力之 病毒的被膜基因，來確認可賦與對侵入抑制劑降低（或增 加）之感受性的突變。比較敏感的和有抵抗力之病毒的推 衍胺基酸序列，確認候選的藥物抵抗力突變。藉著將突變 導入藥物敏感性病毒内，並在病毒侵入測定中測量突變種 病毒的感受性，證明或反駁特定突變賦與改變之藥物感受 性的能力。在本文中代表性的實例中，對於顯示出不同 T-20感受性的病毒，將在HIV-1 gp41穿透膜被膜蛋白質之 第一個七價重覆段（HR-1)内的一段短胺基酸序列排成一 直線。所強調的胺基酸，代表已知賦與降低對T-20之感受 性的突變。 可使用類似的表現型和基因型分析，確認（a)改變/影響 對CCR5或CXCR4抑制劑之感受性，（b)指定X4、R5和雙向 性，以及（c )謗發中和抗體的被膜胺基酸序列。 在一個具體實施例中，證實藉著特定的被膜胺基酸序列 /突變，赋與降低對輔·受體（CCR5，CXCR4)抑制劑的感受 性。 在進一步的具體實施例中，證實藉著特定的被膜胺基酸 序列/突變，賦與降低對受體（CD4)抑制劑的感受性。 實例4 : 判定HIV-1輔-受體和受體向性 本實例提供判定HIV-1輔-受體向性的裝置和方法。本實 例亦提供判定HIV-1受體向性的裝置和方法。 在一個具體實施例中，確認使用CCR5輔·受體的病毒。 在相關的具體實施例中，確認使用CXCR4輔-受體的病 55- 200303922

(50) 毒。在進一步相關的具體實施例中，確認使用CCR5和 CXCR4的病毒。在更進一步相關的具體實施例中，確認使 用CCR5或CXCR4以外之輔-受體的病毒。 在另一個具體實施例中，確認使用CD4受體的病毒。在 相關的具體實施例中，確認使用CD8受體的病毒。在進一 步相關的具體實施例中，確認不需要CD4或CD8來感染細 胞的病毒。 在本具體實施例中，使用兩種細胞株進行測定。一種細 胞株表現CD4加CCR5 (U87/CD4/CCR5)，在本申請案中亦稱 為R5細胞。另一種細胞株表現CD4和CXCR4 (U87/CD4/ CXCR4)，在本申請案中亦稱為X4細胞。藉著以衍生自利 用pHIVenv和pHIVluc或pHIVlucAU3載體轉移感染之細胞的 重組病毒母液，感染個別的細胞培養物，進行病毒侵入測 定。pHIVenv載體含有患者病毒的衍生序列，並表現HIV-1 被膜蛋白質（gpl20SU，gp41TM)。在該具體實施例中，使 用在96孔培養盤中的R5和X4標靶細胞，來評估病毒（圖 3A)。通常，在感染前1天，平舖R5和X4細胞。在缺乏藥 物（無藥物）之下，在抑制濃度的優先抑制親R5病毒之藥物 (CCR抑制劑，例如六氫吡啶-1-基丁烷化合物）的存在下， 以及在抑制濃度的優先抑制親X4病毒之藥物（CXCR4抑制 劑，例如AMD3 100)的存在下，進行利用每種病毒母液的 感染。藉著比較在藥物存在和缺乏之下，在每種細胞類型 中產生之蟲螢光素酶活性的量，來評估輔·受體向性。在 該具體實施例中，藉著比較每種病毒優先感染R 5細胞或 •56· 200303922 (51) X4細胞（產生蟲螢光素酶活性）的能力，來解釋測定的結 果，如果病毒是雙向性的，則感染X 4和R 5兩種細胞。亦 評估CCR5或CXCR4抑制劑對阻斷感染（抑制蟲螢光素酶活 性）的能力（圖3B)。在該具體實施例中，親X4病毒感染X4 細胞，但不感染R5細胞，並藉著CXCR4抑制劑（AMD3100) 阻斷X4細胞的感染。在該具體實施例中，親R5病毒感染 R5細胞，但不感染X4細胞，並藉著CCR5抑制劑（六氫吡啶 -1-基丁烷化合物）阻斷R5細胞的感染。在該具體實施例 中，雙向性的病毒，或親X4與親R5病毒的混合物，感染 X4和R5細胞兩者，並藉著CCR5抑制劑阻斷R5細胞的感 染，且藉著CXCR4抑制劑阻斷X4細胞的感染。在該具體實 施例中，未-存活的細胞不能在X4或R5細胞中複製（未產 生蟲榮光素酶活性）。 在另一個具體實施例中，使用三種或更多的細胞株進行 測定。一種細胞株表現CD4加CCR5 (U87/CD4/CCR5)，在本 申請案中亦稱為R5細胞。另一種細胞株表現CD4和CXCR4 (U87/CD4/CXCR4)，在本申請案中亦稱為X4細胞。額外的 細胞株表現CD4加其他候選的HIV-1輔受體，包括但不限 於BONZO、B OB等等。參見表1。這些額外的細胞株表現 其他候選的輔·受體，但不表現CCR5或CXCR4。藉著以衍 生自利用pHIVenv和pHIVluc或pHIVlucAU3載體轉移感染之 細胞的重組病毒母液，感染個別的細胞培養物，進行病毒 侵入測定。pHIVenv載體含有患者病毒的衍生序列，並表 現HIV-1被膜蛋白質（gp120SU，gp41TM)。在該具體實施例 -57- 200303922 (52) 中，使用在9 6孔培養盤中培養的細胞，來評估病毒。在 R5細胞、X4細胞和表現CD4加候選輔-受體之細胞株中， 進行利用每種病毒母液的感染。藉著比較在每種細胞類型 中產生之蟲螢光素酶活性的量，來評估輔-受體向性。在 該具體實施例中，藉著比較每種病毒優先感染R5細胞或 X4細胞，或表現候選輔·受體之細胞株（產生蟲螢光素酶活 性）的能力，來解釋測定的結果。在該具體實施例中，親 X4病毒感染X4細胞，但不感染R5細胞。在該具體實施例 中，親R5病毒感染R5細胞，但不感染X4細胞。在該具體 實施例中，雙向性的病毒，或親X 4與親R 5病毒的混合物， 感染X4和R5細胞兩者。在該具體實施例中，表現任意候 選輔受體（不是CCR5也不是CXCR4)之細胞株的感染，係 歸因於該任意輔受體的向性。在該具體實施例中，未-存活的細胞不能在X4或R5細胞中複製。 在另一個具體實施例中，使用4種細胞株進行測定。一 種細胞株表現CD4加CCR5 (U87/CD4/CCR5)，在本申請案中 亦稱為R5細胞。第二種細胞株表現CD4和CXCR4 (U_87/ CD4/CXCR4)，在本申請案中亦稱為X4細胞。第三種細胞 株表現CD8加CCR5(U87/CD8/CCR5)，在本申請案中亦稱為 CD8/R5細胞。第四種細胞株表現CD8加CXCR4 (U87/CD8/ CXCR4)，在本申請案中亦稱為CD8/X4細胞。藉著以衍生 自利用pHIVenv和pHIVluc或pHIVlucAU3載體轉移感染之細 胞的重組病毒母液，感染個別的細胞培養物，進行病毒侵 入測定。pHIVenv載體含有患者病毒的衍生序列，並表現 -58- 200303922 (53) HIV_1被膜蛋白質（gpl20SU，gp41TM)。在該具體實施例中， 使用在9 6孔培養盤中培養的細胞，來評估病毒。在R 5細 胞、X4細胞、CDS/R5細胞和CD8/X4細胞中，進行利用每種 病毒母液的感染。藉著比較在每種細胞類型中產生之蟲螢 光素酶活性的量，來評估輔·受體向性。在該具體實施例 中，藉著比較每種病毒優先感染R5細胞、X4細胞、CD8/R5 細胞或CD8/X4細胞（產生蟲螢光素酶活性）的能力，來解釋 測定的結果。在該具體實施例中，親CD4病毒感染X4細胞 及/或尺5細胞。在該具體實施例中，親〇08病毒感染008/115 細胞及/或CDS/X4細胞。在該具體實施例中，雙向性（使用 CD4和CD8受體）的病毒，感染X4細胞及/或R5細胞加 CD8/X4及/或CD8/R5細胞。在該具體實施例中，表現CD8 但不表現CD4之細胞株的感染，係歸因於CD8受體的向 性。在該具體實施例中，未·存活的細胞不能在X4或R5細 胞中複製。 在進一步相關的具體實施例中，使用兩種細胞株進行測 定。一種細胞株表現CD4加CCR5和CXCR4 (HT4/CCR5/ CXCR4)。第二種細胞株表現CD8加CCR5和CXCR4 (HOS/ CD8/CCR5/CXCR4)。藉著以衍生自利用pHIVenv和pHIVluc或 pHIVlucAU3載體轉移感染之細胞的重組病毒母液，感染個 別的細胞培養物，進行病毒侵入測定。pHIVenv載體含有 患者病毒的衍生序列，並表現HIV-1被膜蛋白質（gpl20SU， gp41TM)。在該具體實施例中，使用在96孔培養盤中培養 的細胞，來評估病毒。在HT4/CCR5/CXCR4細胞和HOS/CD8/ -59· 200303922

(54) CCR5/CXCR4細胞中，進行利用每種病毒母液的感染。藉 著比較在每種細胞類型中產生之蟲螢光素酶活性的量，來 評估輔-受體向性。在該具體實施例中，藉著比較每種病 毒優先感染 HT4/CCR5/CXCR4 細胞或 HOS/CD8/CCR5/CXCR4 細胞（產生蟲螢光素酶活性）的能力，來解釋測定的結果。 在該具體實施例中，親CD4病毒感染HT4/CCR5/CXCR4細 胞，但不感染HOS/CD8/CCR5/CXCR4細胞。在該具體實施例 中，親00 8病毒感染1108/008/(：€115/€又€114細胞，但不感染 HT4/CCR5/CXCR4細胞。在該具體實施例中，雙向性（使用 CD4和CD8受體）的病毒，感染HT4/CCR5/CXCR4細胞和 HOS/CD8/CCR5/CXCR4細胞兩者。在該具體實施例中，表現 CD8但不表現CD4之細胞株的感染，係歸因於CD8受體的 向性。在該具體實施例中，未-存活的細胞不能在X4或R5 細胞中複製。 在另一個具體實施例中，使用兩種細胞株進行測定。一 種細胞株表現 CD4加 CCR5 和 CXCR4 (HT4/CCR5/CXCR4)。第 二種細胞株表現CCR5和CXCR4，但不表現CD4或CD8 (HOS/ CCR5/CXCR4)。藉著以衍生自利用pHIVenv和pHIVluc或 pHIVlucAU3載體轉移感染之細胞的重組病毒母液，感染個 別的細胞培養物，進行病毒侵入測定。pHIVenv載體含有 患者病毒的衍生序列，並表現HIV-1被膜蛋白質（gpl20SU， gp41TM)。在該具體實施例中，使用在96孔培養盤中培養 的細胞，來評估病毒。在HT4/CCR5/CXCR4細胞和HOS/CCR5/ CXCR4細胞中，進行利用每種病毒母液的感染。藉著比較 -60· 200303922

(55) 在母種細胞類型中產生之蟲勞光素酶活性的量，來評估 CD4和CD8獨立性感染。在該具體實施例中，藉著比較每 種病毒優先感染HT4/CCR5/CXCR4細胞或HOS/CCR5/CXCR4 細胞（產生蟲螢光素酶活性）的能力，來解釋測定的結果。 在該具體實施例中，CD4依賴性病毒感染HT4/CCR5/CXCR4 細胞，但不感染HOS/CCR5/CXCR4細胞。在該具體實施例 中，CD4獨立性病毒感染HOS/CCR5/CXCR4細胞和HT4/CCR5/ CXCR4細胞兩者。在該具體實施例中，缺乏CD4表現之細 胞株的感染，係歸因於CD4獨立性感染。在該具體實施例 中，未-存活的細胞不能在X4或R5細胞中複製。 實例5 : 確認改變輔-受體和受體向性的HIV-1被膜胺基 酸取代/突變 本實例提供確認指定或改變輔-受體向性（Χ4對R5對雙 重X4/R5)之HIV-1被膜胺基酸序列的裝置和方法。本實例 亦提供確認指定使用CXCR4或CCR5以外之輔-受體的 HIV-1被膜胺基酸序列的裝置和方法。本實例亦提供確認 特定之或受體向性（CD4對CD8)之HIV-1被膜序列的裝置 和方法。 按照在實例4中描述的，在侵入測定中，測試衍生自患 者試樣之被膜序列’或衍生自患者試樣之個別純種系’或 藉著指定位置之突變生成作用設計’而含有特定突變之被 膜序列，來判定輔-受體向性。 在一個具體實施例中’評估縱長之患者試樣（在不同時 間點，從相同患者中收集之病毒）的輔-受體向性。例如’ -61- 200303922

(56) 在開始療之如、更換藥物治療之前或之後，或在更換疾 病進行之病毒學（RNA副本數目）、免疫學（CD4 細胞）， 或臨床（機會感染）標記之前或之後，評估辅·受體向性。 在另一個具體實施例中，對從大量不同患者中收集的試 樣’砰估辅-受體向性。在進一步的具體實施例中，對從 大量患者中收集’代表不同病毒和患者族群的試樣，評估 輔-受體向性。這類患者族群可包栝，但不限於新近感染 的患者、慢性感染的患者、有進行性疾病的患者，以及接 丈抗逆轉錄病毒治療或免疫-治療的患者。這類病毒族群 可包括，但不限於具有不同遺傳特徵（a、B、c、D、E、 F、G型）的病毒、易感受抗逆轉錄病毒藥物的病毒、對於 抗逆轉錄病毒之藥物具有降低感受性/抵抗力的病毒。 患者HIV試樣的基因型分析 可藉著廣泛可獲得的DNA定序方法，分析代表串者試樣 集合的被膜序列，或衍生自患者集合的純種系。在本發明 的一個具體實施例中，使用病毒RNA純化作用、RT/pCR 和二脫氧核苷酸鏈終止序列的定序化學法，以及毛細管凝

膠電泳（Applied Biosystems，Foster City, CA)，判定串者 HIV 試樣序列。將患者病毒集合或純種系的被膜序列與參考序 列、其他的患者試樣，或如果可獲得，與在 a 仗間始治療I前 獲自相同患者的試樣相比較。針對與參考床幻上 _ _ ^ 7 〃外或治療前序 列不同的序列檢查基因型，並使其與在侵入 抑制劑之感受 性上的差異發生關連。 以遺傳方式定出特徵之病毒的辅·受體和受體向& •62- 200303922

(57) 藉著建構在已定義之遣傳背景（例如NL4-3為X4向性， JRCSF為R5向性）上含有特定突變的被膜表現載體（pHIVenv) ，來評估與輔-受體向性有關的被膜胺基酸序列。可單獨 並/或與其他被認為可調解輔-受體用法的突變一起併入 突變。使用任何可廣泛獲得的指定位置之突變生成方法， 將被膜突變導入pHIVenv載體内。在本發明的一個具體實 施例中，使用指定位置之突變生成的巨-引子PCR法（Sarkar， G·和Summer，S.S·，1990)。使用在實例1中描述的病毒侵入測 定，測試含有特定被膜突變或突變組的pHIVenv載體。在 評估下，比較含有被膜突變之病毒的輔-受體向性，與缺 乏該特定突變之在遣傳上已定義的病毒之輔·受體向性。 藉著將突變導入已完全定出特徵的參考病毒内，並按照在 實例4中描述的病毒侵入測定中，評估該突變種的輔-受體 向性，證明或反驳特定突變賦與改變之輔-受體向性能 力。將造成在輔-受體向性上觀察到改變的特定突變，導 入pHIVenv載體内。 在本發明的一個具體實施例中，藉著評估在gpl20表面 被膜蛋白質之V3環内的胺基酸序列，來確認R5向性的遣 傳決定位。藉著比較大量親X4和親R5病毒的胺基酸序 列，確認在評估之下的胺基酸序列。選擇在X4和R5病毒 之間的一致差異，來進行評估。藉著指定位置之突變生成 作用，建構以已完全定出特徵之X4親代純種系（例如 NL4-3，HXB2)為基礎，在gpl20被膜蛋白質之V3環中含有 特定的” R5候選者”突變的同基因病毒，並按照在實例4中 -63 - 200303922

(58) 的描述，測試輔-受體向性。在缺乏R5 (六氫吡啶-1·基丁 烷化合物）和X4 (AMD3 100)抑制劑之下，以及在抑制濃度 之R5和X4藥物濃度的存在下，感染表現CD4加CCR5 (例如 U-87/CD4/CCR5)，或 CD4 加 CXCR4 (U-87/CD4/CXCR4)的細 胞。將使親X4病毒變成親R5病毒的胺基酸取代作用，定 為R5向性之遺傳決定位的特徵。 在本發明的相關具體實施例中，藉著評估在gpl20表面 被膜蛋白質之V3環内的胺基酸序列，來確認X4向性的遺 傳決定位。藉著比較大量親X4和親R5病毒的胺基酸序 列，確認在評估之下的胺基酸序列。選擇在X4和R5病毒 之間的一致差異，來進行評估。藉著指定位置之突變生成 作用，建構以已完全定出特徵之R5親代純種系（例如JRCSF) 為基礎，在gp 120被膜蛋白質之V3環中含有特定的”X4候選 者”突變的同基因病毒，並按照在實例4中的描述，測試輔 -受體向性。在缺乏R5 (六氫吡啶-1-基丁烷化合物）和X4 (AMD3100)抑制劑之下，以及在抑制濃度之R5和X4藥物濃 度的存在下，感染表現CD4加CCR5 (例如U-87/CD4/CCR5)， 或CD4加CXCR4 (U-87/CD4/CXCR4)的細胞。將使親X4病毒 變成親R5病毒的胺基酸取代作用，定為R5向性之遺傳決 定位的特徵。 在本發明的相關具體實施例中，藉著評估在整個gpl20 表面被膜蛋白質内的胺基酸序列，來確認X4或R5向性的 遺傳決定位。 在本發明的相關具體實施例中，藉著評估在gp41穿透膜 •64· 200303922

(59) 被膜蛋白質内的胺基酸序列，來確認X4或R5向性的遣傳 決定位。 在本發明的相關具體實施例中，藉著評估在gpl2〇表面 被膜蛋白質之V3環内的胺基酸序列，來確認指定使用 CCR5和CXCR4以外之輔受體的遺傳決定位。藉著比較能 夠在不表現CXCR4或CCR5，但表現其他候選輔-受體之細 胞上複製的病毒的胺基酸序列，確認在評估之下的胺基酸 序列。選擇在這些非-X4、非R5病毒，以及X4和R5病毒之 間，在胺基酸序列上的一致差異，來進行評估。藉著指定 位置之突變生成作用，建構以已完全定出特徵之X4 (例如 NL4-3)或R5 (例如JRCSF)親代純種系為基礎，在gpl20被膜 蛋白質之V3環中含有特定的”非-X4，非-R5候選者”突變 的同基因病毒，並按照在實例4中的描述，測試輔·受體向 性。在缺乏R5 (六氫吡啶-1-基丁烷化合物）和X4 (AMD3100) 抑制劑之下，以及在抑制濃度之R5和X4藥物濃度的存在 下，感染表現CD4加CCR5 (例如U-87/CD4/CCR5)，CD4加 CXCR4 (U-87/CD4/CXCR4)，以及CD4加其他候選輔-受體 (U87/CD4/X)的細胞。將賦與非-X4、非-R5輔-受體向性的 胺基酸取代作用，定為該特定輔-受體向性之遺傳決定位 的特徵。 在本發明的相關具體實施例中，藉著評估在整個gpl20 表面被膜蛋白質内的胺基酸序列，來確認其他輔-受體向 性的遺傳決定位。 在本發明的相關具體實施例中，藉著評估在gp41穿透膜 -65· 200303922

(60) 被膜蛋白質内的胺基酸序列，來確認其他輔-受體向性的 遺傳決定位。 在本發明的另一個具體實施例中，藉著評估在gpl2〇表 面被膜蛋白質之V 3環内的胺基酸序列，確認指定使用c D 8 (除了 CD4之外，或代替CD4)作為Ηΐν·1之受體的遗傳決定 位。藉著比較能夠在不表現CD4，但表現CD8之細胞上複 製的病毒的胺基酸序列，確認在評估之下的胺基酸序列。 選擇在這些親CD4病毒和親CD8病毒之間，在胺基酸序列 上的一致差異，來進行評估。藉著指定位置之突變生成作 用’建構以已完全定出特徵之親CD4 (例如NL4-3、JRCSF) 親代純種系為基礎，在gp 120被膜蛋白質之V3環中含有特 定的” CD 8候選者”突變的同基因病毒，並按照在實例4中 的描述，測試CD8受體向性。感染表現CD4加CCR5 (例如 U-87/CD4/CCR5) ^ CD4^ CXCR4 (U-87/CD4/CXCR4) ^ COSJjn CCR5 (例如 U-87/CD8/CCR5)，CD8加 CXCR4 (U-87/CD8/CXCR4) 的細胞。將能夠在表現CD8但不表現CD4之細胞中複製的 胺基酸取代作用，定為CD8向性之遺傳決定位的特徵。 在本發明的相關具體實施例中，藉著評估在整個gpl2〇 表面被膜蛋白質内的胺基酸序列，來確認C D 8向性的遺傳 決定位。 在本發明的相關具體實施例中，藉著評估在gp41穿透膜 被膜蛋白質内的胺基酸序列，來確認CD 8向性的遺傳決定 位。 實例6 :測量fnv-丨抗體中和作用 •66- (61) (61)200303922

本實例提供評估調解HIV-1中和作用，在本申請案中亦 %為病母中和作用之抗體的裝置和方法。本實例亦提供評 <在‘染HIV-1之患者内的抗體，其病毒中和活性的裝置 和方法本實例亦提供評估在以治療性疫苗和疫苗候選者 接種疫田 < 個體或動物内的抗體，其病毒中和活性的裝置 和=法。本實例亦提供評估在以保護性（防止或預防性） 疫田和疫田候選者接種疫苗之個體或動物内的抗體，其病 毒中和活性的裳置和方法。本實例亦提供評估專_單株或 多株抗體製品之病毒中和活性的裝置和方法。 在又’幻足中，測試衍生自患者試樣的被膜序列，或衍 生自患者試樣的個別純種系，或藉著指定位置之突變生成 作用汉汁’而含有特定突變的被膜序列，來評估抗體調解 之中和作用。 在一個具體實施例中，在縱長之患者試樣（在不同時間 點，從相同患者中收集之病毒）中評估抗體調解的中和作 用例如’企圖在接種疫苗之前、在接種疫苗過程之間， 以及在接種疫苗過程之後的增長時間點，評估病毒中和作 用。在相關的具體實施例中，企圖在接種候選疫苗之前、 在重覆接種過程之間，以及在接種過程之後的增長時間 點’評估包括，但不限於老鼠、大鼠、兔子、豬和牛之動 物的血β。在一個具體實施例中，對預防性疫苗和疫苗候 選者評估病毒中和作用。在另一個具體實施例中，對治療 性疫苗評估病毒中和作用。 在另一個具體實施例中，對收集自大量不同患者之試樣 -67- 200303922

(62) 評估病毒中和作用。在進一步的具體實施例中，對收集自 代表不同患者族群和不同病毒族群之大量患者的試樣’評 估病毒中和作用。”患者族群”可包括，但不限於新近感染 的患者、慢性感染的患者、有進行性HIV/AIDS疾病的患 者、有快速發展之疾病的患者、有緩慢發展之疾病的患者 (通常稱為長期非-前進者）、接受抗逆轉錄病毒治療或免 疫-治療（例如介白素-2或其他細胞激動素）的患者、經接 種疫苗或未接種疫苗的患者。”病毒族群”可包括，但不限 於具有不同遗傳特徵和地理來源（A、B、C、D、E、F、G 型）的病毒、易感受抗逆轉錄病毒藥物的病毒、對於抗逆 轉錄病毒之藥物具有降低感受性/抵抗力的病毒、原始分 離物、為了在細胞培養中生長而改編的分離物（通常稱為 實驗室改編的病毒）、謗導融合細胞（SI)的病毒、不謗導-融合細胞（N SI)的病毒、親巨嗤細胞（Μ)病毒、親T -細胞（T ) 病毒和雙向性（Μ和Τ)病毒。 定出患者抗體的特徵（患者抗體對標準病毒名單） 在該具體實施例中，使用表現HIV-1受體CD4加HIV-1輔-受體CCR5和CXCR4的標靶細月包（HT4/CCR5/CXCR4)，來進行 測定。這類細胞株能夠評估對親R5和Χ4兩者病毒之抗體 的中和活性。在相關的具體實施例中，使用兩種標乾細胞 株進行測定。一種細胞株表現CD4加CCR5 (U-87/CD4/CCR5) ，並用來測試親R5病毒，另一種細胞株表現CD4加CXCR4 (U_87/CD4/CXCR4)，並用來評估親Χ4病毒。藉著以衍生自 利用pHIVenv和pHIVluc或pHIVluc Δυ3載體轉移感染之包 -68 - 200303922 (63) 裝宿主細胞的重組病毒母液，感染個別的標把細胞培養 物，進行病毒侵入測定。在該具體實施例中’ pHIVenv載 體含有特定的、已完全定出特徵之病毒的被膜序列’並表 現HIV-1被膜蛋白質（gpl20SU，gp41TM)。這類病毒代表”標 準病毒名單，，（參見上述的病毒族群）。一些，但不是全部 病毒的合理實例，可由在表4中列舉之標準名單構成。使 用標準病毒名單，比較獲自許多不同患者及/或動物（參見 上述的患者族群）之血清的中和抗體活性。在該具體實施 例中，使用在9 6孔培養盤中培養的標靶細胞來評估病毒。 通常，在感染前1天，以每孔5,0〇〇個細胞平舖HT4/CCR5/ CXCR4標靶細胞，或以每孔10,〇〇〇個細胞平舖U-87/CD4/ CCR5和U-87/CD4/CXCR4。在感染標靶細胞之前，先將待評 估之血清或抗體製品與每種病毒母液一起預先-培養（通 常是1小時）。測試未經稀釋和逐漸增加稀釋（通常是4至5 個連續的1 0-倍稀釋）的血清或抗體製品。亦在缺乏抗體 (無抗體）之下，以每種病毒母液感染標靶細胞。藉著在抗 體存在和缺乏兩者之下，比較在標靶細胞中虞生之蟲螢光 素酶活性的量，來評估病毒的中和作用。在該異體實施例 中，藉著比較每種抗體優先阻斷感染標輕細胞（降低或減 少蟲榮光素酶活性）的能力’來解釋測定的結果。藉著记 錄能夠阻斷標靶細胞感染的最高抗體稀釋度（最大稀 釋）（也就是能夠降低在缺乏抗體下所產生之蟲螢光素酶 活性50%的最高稀釋度），來定量病毒中和活彳生° 定出患者HIV-1的特徵（患者病毒對標準抗體名單） _69_ 200303922

(64) 在該具體實施例中，使用表現HIV-1受體CD4加HIV-1輔· 受體CCR5和CXCR4的標靶細胞（HT4/CCR5/CXCR4)，來進行 測定。這類細胞株能夠評估對親R5和X4兩者病毒之抗體 的中和活性。在相關的具體實施例中，使用兩種標靶細胞 株進行測定。一種細胞株表現CD4加CCR5 (U-87/CD4/CCR5) ，並用來測試親R5病毒，另一種細胞株表現CD4加CXCR4 (U-87/CD4/CXCR4)，並用來評估親X4病毒。藉著以衍生自 利用pHIVenv和pHIVluc或pHIVlucAU3載體轉移感染之包裝 宿主細胞的重組病毒母液，感染個別的標把細胞培養物， 進行病毒侵入測定。在該具體實施例中，pHIVenv載體含 有患者病毒衍生之被膜序列，並表現HIV-1被膜蛋白質 (gpl2〇SU，gp41TM)。在該具體實施例中，使用得自不同 患者族群（參見上述的患者族群）的病毒，及/或不同的病 毒族群（參見上述的病毒族群），來建構pHIVenv載體。在 病毒侵入測定中評估衍生自pHIVenv載體的假定型HIV，以 便經由特定的、已完全定出特徵之抗體製品的名單，判定 它們是否易感受中和作用。這類抗體代表”標準抗體名單" 。一些，但不是全部抗體的合理實例，可由在表4中列舉 之標準名單構成。在該具體實施例中，使用在9 6孔培養盤 中培養的標靶細胞來評估病毒中和作用。通常，在感染前 1天，以每孔5,000個細胞平舖HT4/CCR5/CXCR4標靶細胞， 或以每孔10,000個細胞平舖U-87/CD4/CCR5和U-87/CD4/ CXCR4。在感染之前，先將每種患者衍生之病毒母液與在 標準抗體名單中的每種抗體製品一起培養（通常是1小 -70· 200303922

(65) 時）。測試未經稀釋和各種稀釋度（通常是4至5個連續的 10 -倍稀釋）的血清或抗體製品。亦在缺乏抗體（典抗體）之 下，以每種病毒母液感染標靶細胞。藉著在抗體存在和缺 乏兩者之下，比較在標靶細胞中產生之蟲螢光素酶活性的 量，來評估病毒的中和作用。在該具體實施例中，藉著比 較每種抗體優先阻斷感染標靶細胞（降低或減少蟲螢光素 酶活性）的能力，來解釋測定的結果。藉著記錄能夠阻斷 標靶細胞感染的最高抗體稀釋度（最大稀釋）（也就是能夠 降低在缺乏抗體下所產生之蟲螢光素酶活性5 0%的最高 稀釋度），來定量病毒中和活性。 定出患者HIV-1的特徵（患者病毒對患者抗體） 本實例提供在患者中檢測中和抗體反應之演化，以及躲 避中和反應之病毒品系演化的方法。在該具體實施例中， 使用表現HIV_1受體CD4加HIV-1輔·受體CCR5和CXCR4的 標靶細胞（U87/CD4/CCR5/CXCR4 或 HT4/CCR5/CXCR4)，來進

行測定。這類細胞株能夠評估對親R5和X4兩者病毒之抗 體的中和活性。在相關的具體實施例中，使用兩種標靶細 胞株進行測定。一種細胞株表現CD4加CCR5 (U-87/CD4/ CCR5)，並用來測試親R5病毒，另一種細胞株表現CD4加 CXCR4 (U-87/CD4/CXCR4)，並用來評估親X4病毒。藉著以 衍生自利用pHIVenv和pHIVluc或pHIVlucAU3載體轉移感染 之包裝宿主細胞的重組病毒母液，感染個別的標把細胞培 養物，進行病毒侵入測定。在該具體實施例中，pHIVenv 載體含有患者病毒衍生之被膜序列，並表現HIV-1被膜蛋 -71- 200303922 (66) 白質（gpl20SU，gp41TM)。在該具體實施例中，使用不同 的病毒族群來建構pHI Venv載體。不同的病毒族群係衍生 自連續（也就是縱長的）血漿樣本（也就是在不同時間點， 從相同患者中收集之病毒）。在病毒侵入測定中評估衍生 自pHIVenv載體的假定型HIV，以便經由衍生自得自患者之 連續血漿樣本的抗體名單，判定它們是否易感受中和作 用。因此，在該具體實施例中，相同患者是病毒族群和抗 體兩者的來源。在該具體實施例中，使用在例如9 6孔培養 盤中培養的標把細胞，來評估病毒。通常，以每孔1 0，0 0 〇 個細胞平舖 U-87/CD4/CCR5/CXCR4、U-87/CD4/CCR5 和 U-87/CD4/CXCR4細胞株，或以每孔5,〇〇〇個細胞平舖HT4/ CCR5/CXCR4細胞株。在感染那一天，平舖標輕細胞。在 標靶細胞感染之前，先將每種病毒母液與待評估之血清或 抗體製品一起預先-培養（通常是1小時）。測試未經稀釋和 逐漸增加稀釋（通常是4至5個連績的5-或10-倍稀釋）的血 清或抗體製品。亦在缺乏抗體（無抗體）之下，以每種病毒 母液感染標靶細胞。藉著在抗體存在和缺乏兩者之下，比 較在標乾細胞中產生之蟲螢光素酶活性的量，來評估病毒 的中和作用。在該具體實施例中，藉著比較在不同時間點 衍生自患者之抗體，優先阻斷在不同時間點衍生自患者之 假定型病毒感染標靶細胞（降低或減少蟲螢光素酶活性） 的能力，來判定測定的結果。藉著記錄能夠阻斷標靶細胞 感染的最高抗體稀釋度（最大稀釋）（也就是能夠降低在缺 乏抗體下所產生之蟲螢光素酶活性50%的最高稀釋度），來 -72- 200303922 (67) 定量病毒中和活性。因此，該具體實施例容許測試在患者 中’在免疫學上不同之HI V品系和中和抗體反應，在一段 時間内的共同演化。 對一組1 4個未經治療、罹患原發HI V感染的患者使用該 方法。以2-4個月的間隔，從每個患者中抽取血漿樣本（平 均追蹤高達18個月，範圍從6至39個月）。將病毒與連續5_ 倍稀釋之抗體一起培養，並用來感染表現CD4加CCR5和 CXCR4辅-受體的標靶細胞。發現1 4個患者中有1 2個對病 毒產生強的中和抗體反應。在圖1 〇中提供得自代表性患者 的資料。然而，每個後續的病毒一致且迅速地逃脫了同時 發生的中和抗體反應。在病毒顯露之後數個月，發展出高 峰中和力價（平均1:1497稀釋度，範園從1:339至1:4627)，且 該反應隨後仍持績升高數個月至數年。中和抗體力價通常 對得自相同患者之早期病毒，比對晚期病毒更大。對異種 的R5原發病毒（jr-CSF)之中和反應，是弱且延遲的。對χ4 實驗室品系（NL4-3)的反應，在一段時間内增加，但在強 度上’在患者中是多變的。中和抗體反應對自體病毒的大 小，與平均血漿HIV RNA或HIV感染的期間無關。因此， 病毒的中和逃脫速度是值得注意的，並代表中和抗體可能 對病毒的演化，發揮以前未獲重視之程度的選擇性壓力。 這些資料與自然史和疫苗發展有重大的關連。 實例7 :確認謗發、改變或阻止中和抗體反應的hiV-1被 膜胺基酸序列 本實例提供確認謗發/促進或改變，或阻止抗體調解之 •73- 200303922

(68) HI V-1感染的中和作用（在本申請案中亦稱為病毒中和作 用）之HIV-1被膜胺基酸序列的裝置和方法。 按照在實例6中的描述，在侵入測定中測試衍生自患者 試樣I被膜序列，或衍生自患者試樣的個別純種系，或藉 著指定位置之突變生成作用設計，含有特定突變的被膜^ 列。 在一個具體實施例中，在縱長之患者試樣（在不同時間 點，從相同患者中收集之病毒）中，評估抗體調解之中= 作用。例如，企圖在接種疫苗之前、在接種疫苗過程之間， 以及在接種疫苗過程之後的增長時間點，評估病毒中和作 用。在一個具體實施例中，對預防性疫苗評估病毒中和作 用。在另一個具體實施例中，對治療性疫苗評估病毒中和 作用。 在另一個具體實施例中，對收集自大量不同患者之試樣 評估病毒中和作用。在進一步的具體實施例中，對收集自 代表不同病毒和患者族群之大量患者的試樣，評估病毒中 和作用。這類患者族群可包括，但不限於新近感染的患 者、慢性感染的患者、有進行性疾病的患者、接受抗逆轉 錄病毒治療或免疫-治療的患者、經接種疫苗或未接種疫 苗的個體。這類病毒族群可包括，但不限於具有不同遺傳 特徵（A、B、C、D、E、F、G型）的病毒、易感受抗逆轉 錄病毒藥物的病毒、對於抗逆轉錄病毒之藥物具有降低感 受性/抵抗力的病毒、原始分離物，或為了在細胞培養中 生長而改編的分離物（通常稱為實驗室-改編的病毒）、謗 -74- 200303922

(69) 導融合細胞（SI)的病毒，或不謗導-融合細胞（NSI)的病 毒、親巨嗟細胞（M)病毒、親細胞（T)病毒和雙向性（M 和Τ)病毒。 患者HIV試樣的基因型分析 可藉著任何廣泛可獲得的DNA定序方法，分析代表患者 試樣集合，或衍生自患者集合之純種系的被膜序列。在本 發明的一個具體實施例中，使用病毒RNA純化作用、 RT/PCR和二脫氧核甞酸鏈終止序列的定序化學法，以及 毛細管赛疋膠電泳（Applied Biosystems，Foster City，CA)，判定 患者ΗIV試樣序列。將患者病毒集合或純種系的被膜序列 與參考序列、其他的患者試樣，或如果可獲得，與在開始 治療之如獲自相同患者的試樣相比較。針對與參考序列或 治療前序列不同的序列檢查基因型，並使其與在侵入抑制 劑之感受性上的差異發生關連。 在遺傳上定出特徵之病毒的抗體調解之中和作用 藉著建構在已定義之遺傳背景（例如，對χ4向性而言是 NL4_3 ’對R5向性而言是jrcSF)上含有特定突變的被膜表 現載體（pHIVenv)，來評估與病毒中和作用有關連的被膜 胺基酸序列。可單獨並/或與其他被認為可調節病毒中和 作用的突變一起併入突變。使用任何可廣泛獲得的指定位 置之突變生成方法，將被膜突變導入pHIVenv載體内。在 本發明的一個具體實施例中，使用指定位置之突變生成的 巨-引子 PCR法（Sarkar，G·和 Summer，S.S·，1990)。使用在實例 6中描述的病毒侵入測定，測試含有特定被膜突變或突變 75- 200303922 (70) 組的pHIVenv載體。可選擇特定的抗體製品（也就是已完全 定出特徵的單株或多株抗體製品）、得自HI V感染患者的 血清，或得自接種疫苗之個體的血清，來比較中和活性。 在評估下，比較含有被膜突變之病毒的抗體中和作用，與 在遺傳上已定義、缺乏該特定突變之病毒的抗體中和活 性。藉著將該突變導入已完全定出特徵之參考病毒，並按 照在實例6中的描述，在病毒侵入測定中，評估該突變種 病毒之抗體調解的中和作用，來證實或反駁特定突變賦 與、改變或阻止抗體中和活性的能力。將造成在病毒中和 作用上觀察到之改變的特定突變，導入pHIVenv載體内。 在本發明的一個具體實施例中，藉著評估在gpl20表面 被膜蛋白質之V3環内的胺基酸序列，來確認病毒中和作 用的遣傳決定位。藉著比較大量病毒的胺基酸序列，該病 毒可以或不可被各種已完全定出特徵之抗體製品、患者血 清，或得自接種疫苗之個體的血清中和，來確認正在進行 評估的胺基酸序列。選擇在V3環胺基酸序列中，在可以 或不可被中和的病毒之間的一致差異，來進行評估。藉著 指定位置之突變生成作用，建構以已完全定出特徵之親代 純種系（例如NL4-3，HXB2，JRCSF)為基礎，在gpl20被膜 蛋白質之V3環中含有特定的”病毒中和候選者”突變的同 基因病毒，並按照在實例6中的描述，測試抗體調解之中 和作用。感染表現CD4加CCR5 (例如U-87/CD4/CCR5)、CD4 加 CXCR4 (U-87/CD4/CXCR4)，或 CD4 加 CCR5 和 CXCR4 (HT4/CCR5/CXCR4)的細胞。認為改變謗發、改變或阻止抗 -76- 200303922

體中和作用的胺基酸取代作用，對於病毒中和作用是很重 要的。 在本發明的相關具體實施例中，藉著評估在整個gpl2〇 表面被膜蛋白質内的胺基酸序列，來確認病毒中和作用的 遺傳決定位。 在本發明的相關具體實施例中，藉著評估在gp41穿透膜 被膜蛋白質内的胺基酸序列，來確認病毒中和作用的遗傳 決定位。 實例8 :測量對病毒侵入抑制劑的感受性，引導治療決定 本實例提供使用病毒侵入抑制劑之感受性，引導HIV-1 之治療的裝置和方法。本實例進一步提供使用病毒侵入抑 制劑之感受性，引導治療先前曾經接受利用病毒侵入抑制

<是不良的黏附、藥物抵 可能有毒性的藥物。在該 -77· 200303922 (72) 具體實施例中，抵抗力測試載體係衍生自患者病毒試樣， 並使用表現型病毒侵入測定，用來測試對各種病毒侵入抑 制劑的感受性。病毒侵入抑制劑包括，但不限於融合抑制 劑（例如 T-20、T-1249)、輔受體拮抗劑（AMD3100、AMD8664 、TAK779、PR0542和六氫吡啶-1-基丁烷化合物），以及CD4 拮抗劑（MAb 5A8)。適當的治療決定係以病毒侵入測定的 結果（例如，參見圖4B)，以及额外的相關實驗室測試結果 和臨床資訊為基礎。 在另一個具體實施例中，使用患者病毒對病毒侵入抑制 劑的感受性，引導先前未曾以包括一或多種病毒侵入抑制 劑的抗逆轉錄病毒攝生法治療過之患者的治療。引導可包 括，但不限於（a)闡明可利用的藥物治療選擇，（b)選擇更 具活性的治療攝生法，（c)闡明對病毒侵入抑制劑的基準 線感受性，和（d)減少使用無活性和可能有毒性的藥物。 在治療無經驗的患者時，因為兩個理由，使判定病毒侵入 抑制劑的基準線感受性是很重要的。首先，病毒對侵入抑 制劑的天然感受性，可廣泛地改變（例如，參見圖4A)。其 次，增加病毒侵入抑制劑的使用，將無疑地導致產生藥物 抵抗力變種的結果，它可能傳播至新近感染的個體。在該 具體實施例中，抵抗力測試載體係衍生自患者病毒試樣， 並使用表現型病毒侵入測定，用來測試對各種病毒侵入抑 制劑的感受性。病毒侵入抑制劑包括，但不限於融合抑制 劑（例如 T-20、T_1249)、輔-受體拮抗劑（AMD3100、AMD8664 、ΤΑΚ779、PR0542和六氳吡啶-1-基丁烷化合物），以及CD4 -78- 200303922 (73) 拮抗劑（MAb 5A8)。適當的治療決定係以病毒侵入測定的 結果（例如，參見圖4B)，以及額外的相關實驗室測試結果 和臨床資訊為基礎。 實例9 : 測量HIV-1輔-受體向性，引導治療決定 本實例提供使用HIV-1輔-受體（CCR5，CXCR4)向性，引 導HIV-1治療的裝置和方法。本實例進一步提供使用HIV-1 輔-受體向性，引導治療抗逆轉錄病毒藥物治療無效之患 者的裝置和方法。本發明更提供使用HI V-1輔·受體向性， 引導治療新近感染HIV-1之患者的裝置和方法。 本實例提供使用病毒HIV-1輔-受體向性，引導治療ην」 的裝置和方法。本實例進一步提供使用HIV-1輔-受體向 性，引導治療先前曾經接受利用病毒侵入抑制劑之抗逆轉 錄病毒治療之患者的裝置和方法。本發明更提供使用 HIV-1輔-受體向性，引導治療先前未曾接受利用病毒侵入 抑制劑之治療之患者的裝置和方法。 在一個具體實施例中，使用患者病毒之輔-受體向性， 引導包括一或多種辅_受體拮抗劑之抗逆轉錄病毒攝生法 無效之患者的治療。通常將治療無效（亦稱為病毒學上的 失敗）定義為部分抑制的抗病毒治療，結果產生可檢測含 量的病毒’這通常是在患者血漿中測量到的。引導可包 括’但不限於（a)闡明在已治療之患者中升高病毒負荷的 原因（也就是不良的黏附、藥物抵抗力、改變輔·受體向 性），（b)闡明可利用的藥物治療選擇，（幻選擇更具活性的 治療攝生法，和（d)減少使用無活性和可能有毒性的藥 -79- 200303922

(74) 物。在接受CCR5拮抗劑治療的患者中，監視輔-受體向 性，具有臨床上的重要性，因為藥物壓力可能產生轉變為 CXCR4輔-受體向性的結果。X4病毒（CXCR4輔受體向性） 與R5病毒（CCR5輔-受體向性）相比較，與較差的預後有 關。在該具體實施例中，抵抗力測試載體係衍生自患者病 毒試樣，並使用表現型病毒侵入測定，用來測試對各種輔 -受體拮抗劑的感受性。輔-受體拮抗劑可包括，但不限於 AMD3100、AMD8664、TAK779、PR0542和六氫吡啶-1-基丁 燒化合物。適當的治療決定係以病毒侵入測定的結果（例 如，參見圖4B)，以及額外的相關實驗室測試結果和臨床 資訊為基礎。 在另一個具體實施例中，使用患者病毒的輔-受體向 性，引導先前未曾以包括一或多種輔-受體拮抗劑的抗逆 轉錄病毒攝生法治療過之患者的治療。引導可包括，但不 限於（a)闡明基準線輔-受體向性，（b)闡明可利用的藥物治 療選擇，（c)選擇更具活性的治療攝生法，和（d)減少使用 無活性和可能有毒性的藥物。判定基準線輔-受體向性， 具有重大的臨床意義。利用適當輔-受體拮抗劑（R5對X4 向性）或拮抗劑們（雙向性或混合向性）的治療，可能產生 較有效和持久的反應。在該具體實施例中，抵抗力測試載 體係衍生自患者病毒試樣，並使用表現型病毒侵入測定， 用來測試對各種輔-受體拮抗劑的感受性。輔-受體拮抗劑 可包括，但不限於 AMD3100、AMD8664、TAK779、PR0542 和六氫吡啶-1-基丁烷化合物。適當的治療決定係以病毒 -80- 200303922

(75) 侵入測定的結果，以及額外的相關實驗室測試結果和臨床 資訊為基礎。 圖式簡單說明 圖1A :被膜表現和病毒表現載體的結構 修改HIV被膜表現載體（pHIVenv)，接受已經從患者血裝 試樣中擴大的被膜序列。名稱a/b和c/d意指位在HIV-1被膜 多蛋白（gpl60)之5’和3’末端的核酸限制内切酶位置。HIV 表現載體（pHIVlucAU3)編碼除了被膜多蛋白之外的所有 HIV蛋白質。已經刪除一部分的被膜基因，以便容納指示 劑基因卡匣，在該案例中，使用”螢火蟲蟲螢光素酶"來監 視在抗-病毒藥物的存在或缺乏下，病毒複製的能力。已 經部分地刪除3’U3區域，避免從5，LTr轉錄而感染細胞。 在该系統中產生的病毒’僅限於一回合的複製。 圖1B :以細胞為基礎的侵入測定 藉著以pHIVenv和pHIVlucAU3共同·轉移感染宿主細胞， 進行藥物感受性、辅-受體向性和病毒中和測試。利用衍 生自受試病毒或患者試樣的HIV被膜序列，將宿主細胞產 生的HIV顆粒假-定型。在轉移感染之後收集病毒顆粒（_48 小時），並用來感染表現HIV受體（例如CD4)和輔·受體（例 如CXCR4，CCR5)的標靶細胞。在感染之後（·72小時），溶 解標乾細胞，並測量蟲螢光素酶活性。ΗIV必須完成一回 合複製，以便成功地感染標乾宿主細胞，並產生蟲榮光素 酶活性。如果病毒不能侵入標靶細胞，就減少蟲螢光素酶 活性。可使用該系統來評估對侵入抑制劑、受體和輔-受 200303922

(76) 體向性和病毒中和作用的感受性。 圖2 : HIV被膜表現載體 從患者試樣中擴大HIV被膜序列，並使用核酸限制内切 酶位置（5’ a/b和；Tc/d)，插入表現載體内。由人類細胞巨大 病毒（C Μ V)的速發早期基因啟動基因，駕馭被膜轉錄作 用。使用猿病毒40 (SV40)聚腺智：酸化作用信號序列（Α + )， 將被膜RN Α聚腺嘗酸化。設計位在CMV啟動基因和HIV被 膜序列之間的插入序列，以便在被轉移感染的細胞中，增 加被膜mRNA的含量。FL表現全長的被膜蛋白質（gpl20， gp41) ; ACT表現缺乏gp41之C-終端細胞質尾功能部位的被 膜蛋白質（gpl20，gp21); +CT表現含有一致的預先-限定 之pg41細胞質尾功能部位的被膜蛋白質（gpi20，gp41); gp 120表現衍生自患者之gp 120，連同一致的預先·限定之 gp41 ; gp41表現一致的預先·限定之gpi2〇，連同衍生自患 者的gp41蛋白質。 圖3 A :輔-受體向性篩選測定 在本圖中，使用兩個細胞株進行測定。一個細胞株表現 004和（^115(上6格）。另一個細胞株表現〇04和€乂€114(下6 格）。藉著以大量的衍生自利用pHIVenv和pHIVlucAU3轉移 感染之細胞的重組病毒母液感染細胞，來進行測定。所示 之實例代表在缺乏藥物（無藥物），或在優先抑制親R5 (CCR抑制劑）或親X4(CXCR4抑制劑）病毒之藥物的存在 下，進行在96孔培養盤感染中格式化之96個病毒的分析。 藉著比較在藥物的存在和缺乏之下（關於測定結果的解 -82· (77) (77)200303922

釋，參見圖3B)，在每種細胞類型中產生之蟲榮光素略活 性的含ΐ ’來坪估輔-受體向性。 圖3 Β :判定輔-受體向性 在本圖中，藉著在表現CD4/CCR5之細胞（R5細胞）或表現 CD4/CXCR4之細胞（χ4細胞）中，比較每種試樣之病毒感染 (產生蟲螢光素酶活性）的能力，來解釋測定的結果。亦評 估CCR5或CXCR4抑制劑獨特阻斷感染（抑制蟲螢光素酶活 陳）的把力親Χ4病毒（綠格）·感染Χ4細胞但不感染R5細 胞。藉著CXCR4抑制劑阻斷χ4細胞的感染。親R5病毒（藍 格）_感染R5細胞但不感染χ4細胞。藉著CCR5抑制劑阻斷 R5細胞的感染。雙向性或X4/R5混合物（黃格）感染乂4和r5 細胞。藉著CCR5抑制劑阻斷R5細胞的感染，並藉著cXCR4 抑制劑阻斷X4細胞的感染。未存活的病毒（紅格）_不能在 X4或R5細胞中複製。 圖4A :對融合抑制劑測量侵入抑制劑的感受性 在本圖中，證實對融合抑制劑T-20的感受性。在缺乏 T-20，以及在各種範園的τ_20濃度（x_軸為對數1〇的刻度） 之下，感染表現CD4、CCR5和CXCR4的細胞。藉著比較在 T-20的存在下，在被感染細胞中產生之蟲螢光素酶的量， 與在缺乏T_20下所產生之蟲螢光素酶的量，來判定病毒複 製的抑制百分比（y·軸）。測試親R5、親Χ4和雙向性病毒。 藉著判定抑制50%病毒複製所需的T-20濃度（IC：5()，以垂直 破折線表示），定量藥物的感受性。具有較低IC5()值的病毒 比具有較高IC5〇值的病毒，對T-20更具感受性。NL4-3 :完 -83- 200303922

(78) 全定出特徵的親X4品系，JRCSF :完全定出特徵的親R5品 系，91US005.il :獲自NIH AIDS研究和參考試劑程式（AIDS Research and Reference Reagent Program)(ARRRP)的親 R5 分離 物，92HT593.1 :獲自NIH ARRRP的雙向性（X4R5)分離物， 92HT599.24 ：獲自 NIH ARRRP 的親 X4 分離物。 圖4B :利用藥物抵抗力突變，測量侵入抑制劑的感受性 在本圖中，證實藉著在gp41被膜蛋白質中特定的藥物抵 抗力突變，賦與降低對融合抑制劑T-20的感受性。在缺乏 T-20，以及在各種範圍的T-20濃度（x_軸為對數10的刻度） 之下，感染表現CD4、CCR5和CXCR4的細胞。藉著比較在 T-20的存在下，在被感染細胞中產生之蟲榮光素酶的量， 與在缺乏T-20下所產生之蟲螢光素酶的量，來判定病毒複 製的抑制百分比（y-軸）。測試在gp41穿透膜被膜蛋白質 中，含有一或兩個特定突變的同基因病毒（在圖的說明中 以紅色強調）。藉著判定抑制50%病毒複製所需的Τ·20濃度 (IC5〇，以垂直破折線表示），定量藥物的感受性。具有較 低IC5G值的病毒，比具有較高IC5G值的病毒，對T-20更具感 受性。

無突變（野外型序列）：GIV 單一突變：GIV，DIM，SIV 雙重突變：DIM，SIM，DTV 圖5A :對CCR5抑制劑測量侵入抑制劑的感受性 在本圖中，證實對CCR5抑制劑（merck化合物）之感受 性。在缺乏CCR5抑制劑，以及在各種範圍的CCR5抑制劑 濃度（X-軸為對數10的刻度）之下，感染表現CD4和CCR5的 -84- 200303922

(79) 細胞（R5細胞）。藉著比較在CCR5抑制劑的存在下，在被 感染細胞中產生之蟲榮光素酶的量，與在缺乏CCR5抑制 劑下所產生之蟲螢光素酶的量，來判定病毒複製的抑制百 分比（y-軸）。測試親R5、親X4和雙向性病毒。藉著判定抑 制50%病毒複製所需的CCR5抑制劑濃度（IC5G，以垂直破折 線表示），定量藥物的感受性。具有較低IC5G值的病毒，比 具有較高IC5G值的病毒，對CCR5更具感受性。親X4病毒不 感染R5細胞。NL4-3 :完全定出特徵的親X4品系。 JRCSF :完全定出特徵的親R5品系，92HT593.1 :獲自NIH ARRRP的雙向性（X4R5)分離物。 圖5B :對CXCR4抑制劑測量侵入抑制劑的感受性 在本圖中，證實對CXCR4抑制劑（AMD3100)之感受性。 在缺乏CXCR4抑制劑，以及在各種範圍的CXCR4抑制劑濃 度（X-軸為對數10的刻度）之下，感染表現CD4和CXCR4的 細胞（X4細胞）。藉著比較在CXCR4抑制劑的存在下，在被 感染細胞中產生之蟲螢光素酶的量，與在缺乏CXCR4抑制 劑下所產生之蟲螢光素酶的量，來判定病毒複製的抑制百 分比（y_軸）。測試親R5、親X4和雙向性病毒。藉著判定抑 制50%病毒複製所需的CXCR5抑制劑濃度（IC5G，以垂直破 折線表示），定量藥物的感受性。具有較低IC5G值的病毒， 比具有較高1C5〇值的病毒，對CCR5更具感受性。親R5病 毒不感染X 4細胞。 NL4-3 :完全定出特徵的親X4品系 JRCSF :完全定出特徵的親R5品系 92HT593.1 :獲自NIH ARRRP的雙向性（X4R5)分離物。 -85- 200303922

(80) 圖6 :被膜序列的擴大作用 本圖證實產生相當於全長被膜序列，或刪除被膜序列之 細胞質-尾的擴大區。跑道編號相當於在凝膠右邊，鄰接 每個編號顯示的輔-受體向性。 圖7 :標靶細胞受體和輔-受體表現 所示之點圖，代表得自FACS (螢光激活細胞分類）測定 的結果，使用對抗CCR5或CXCR4的抗體（出示於Y軸）。在 圖下列舉表現輔受體的細胞株，並沿著X-軸顯示CD4螢 光。抗-CXCR4抗體與表現相對應之輔·受體CXCR4的細胞 最強地結合。 圖8 :藉著輔-受體拮抗劑的抑制作用 在投予輔-受體拮抗劑之後，顯示X4和R5抑制作用。 圖9 :融合抑制劑肽 對屬於在病毒膜和細胞膜之間的融合抑制劑之肽，顯示 CXCR4抑制劑舆圖和胺基酸序歹丨J。 圖10:病毒感染力的中和作用 將病毒與連續5 -倍稀釋的抗體（血漿）一起培養，並用來 感染U-87/CD4/CCR5/CXCR4標靶細胞。使用矩陣格式，對 連續的抗體試樣（列），測試連續的病毒試樣（排）。中和值 代表抑制病毒感染力50%所需的血漿（抗體）稀釋度（IC50)。 \ 數目越大，稀釋度越大，反映較高的抗體中和力價。以月 /曰/年表示試樣收集之曰期。亦對兩個參考病毒：NL4-3 (X4實驗室品系），JRCSF (R5主要分離物），測試每個血漿 試樣的中和活性。 -86 - 200303922 (81) 表1 細胞

細胞 受體 5.25 CXCR4, CD4, CCR5 (未完全表現）BONZO 5,25 JLuc4.M7 CD'CCR5，BONZO HOS.CD4.CCR5 CD4,CCR5 HOS.CD4.CXCR4 CD4, CXCR4 HOS.CD4 CD4,低程度表現CCR5和CXCR4 HOSHT4R5GFPwt CD4r CXCR4, CCR5 HOS,CD4.CCR5-GFP.M7#6 窣 CD4, CXCR4, CCR5 P4.CCR5 CD4, CXCR4, CCR5 U87.CD4 CD4 U87.CD4R5 C04.CCR5 U87.CD4X4 CD4,CXCR4 MT2 CD4, CXCR4 MT4 CD4, CXCR4 PM1 CD4, CXCR4, CCR5 CEmNKrCCRS CD4, CXCR4, CCR5 -87 - (82)200303922 表2 代表性的病毒和試劑 89.6, SF2 RSX4/SI ARRRPb 92BR014,92US076 R5-X4/SI/B 1 ARRRP JR-CSF, 91US005 R5/NSI/B ARKRP 91US054 SI® ARRRP NL43, ΜΝ,ΕΙΙ X4/B ARRRP 92ΗΓ599 X4 ARRRP 92UG031 R5/NSI/A ARRRP (IN-HOUSE) 92ΤΗ014, 92ΤΗ026 R5/NSI/B ARRRP (IN-HOUSE) 92BR025, 93MW959 R5/SI/C ARRRP ΟΝ-HOUSE) 92UG035 R5/NSI/D ARRRP (IN-HOUSE) 921Ή022,92ΤΗ023 R5/NSVE ARRRP (IN-HOUSE) 93BR020 R50C4/SI/F ARRRP ON-HOUSE)

Mabs2F5,1577 gp41TM ARRJRP Mabs IGlbl2,2G12,48D gpl20SU AJRRRP 中和血清2號，HIV-IG 多棒的 ARRRP CD4-IG gpl20SU Genentech CD4-IOG2 gpl20 SU Adaxc SCD4 Sigma Progenies T20 (DP178) gp41 TM Tiimeris Rantes, IPla/b CCR5 SIGMA/ARRRP SDFla/b CXCR4 SIGMA/ARRRP AMD 3100 CXCR4 AnorMed 硫酸葡聚醣，肝素 非專一的 Sigma V* si(謗導融合細胞），NSI(非-謗導融合細胞的） A^CAEf (被膜類型的名稱） bAli)S研究和參考試劑程式 -88- 200303922 (83) 表3

用來測試HIV被膜之擴大作用的引子 RT引子 RT env_N3 5!-GGA GCA TIT AGA AGC AGO AAC ACA GC-3( RTenv 9720 5-TTC CAG TCA VAC CTC AGG TAC-31 RT env 9740 5-AGa CCA ATG ACTTAY AAG G-31 5TCR引子 5' env 5'-GGG CTC GAG ACC GOT CAG TGG CAA TGA GAG TGA AG-3T 5' env_JXho/Pin 5'-GGG CTC GAG ACC GGT GAG CAG AAG ACA GTG GCA ATGA-3， 5丨 env一 START 5-GGG CTC GAG ACC GGT GAG CAG AAG ACA GTG GCA ATG-3， 3'PCR引子 3' env 5M3GG TCT AGA ACG CGT TGC CAC CCA TCT TAT AGC AA_3， 3' env JXba/Mlu S^GGG TCT AGA ACG CGT CCA CTT GCC ACC CAT BIT ATA cc^y 5* -GGG TCT AGA ACG CGT CCA CTT GCC ACC CAT BIT A-31 3* delta CT 5f-GAT GGT CTA AGA CGC TGT TCA ATA TCC CTG CCT AAC TC-3·

-89 - 200303922 (84) 表4(名單1) 抗-mv藥物

ACT.ZDY 齊多夫定 Retrovir Glaxo/Wcllcomc 3TC 拉米夫定 Epivir GlaxaWcllcome AZT + 3TC Combivir QaxoAVeDcome d4T 司他伏定 Zeni Briitol-Mycrs/Squibb ddl 去羥肌甞 Vukx Bristol-Myera/Squibb ddC 扎西他賓 Hivid Hoffinan LaRoche 1592U89 濟而鋼 Ziagen Glixo/Wcllcomc A2T + 3TC + 1592U89 Trizivir Glaxo/Wdlcomc (-)PTC (5-氟-3TC;可維雷西） 安春西賓 Triangle Phanxsaccuticals (-)FTC + (+)FTC (50:50) 雷西米 QuadPhanna DAPD (活性的DXG) 安多西維 Triangle Pharaaaccudcails MdA (2_ 氟-ddA) 洛德諾塞 Medlmmunc Oncology (US Bioscicnce) BCH-106S2, dOTC (2-脫氫-3-嘮-4- 硫代胞嘧啶） BioChcm Phanna, Inc, EMfFC Thanglc Phannaccudcab (Schicazi) 雙-POC PM?MGS^331> 泰諾福韋 1 Gilead Sciences 雙-POKiPMEA (GS-S40) 艾德福章二匹夫松_ QUead Sciences BI'RG-557 奈維拉平 Viiaraunc Boehiinger/IngJcheim (Roxanoc) BHAPPNU^0132T 地拉維定 Rescriptor Pharmacia & Upjohn DMP266 CL.743, 726) 希寧 Susdys Dupont PhannaccuDeals (Avid) MKC442 (寇可汀諾） 安米維樂 Trmnglc/Miuubishi Kasci AG-1549 (SI 153)(在掌控下） 卡普維樂 Agouron Phwmaccutica]s AZT.ZDV 齊多夫定 Retrovir Glwo/Wdlcojiic 3TC 拉米夫定 Epivir GlaxoAVellcome AZT + 3TC Coinbivir Gjaxo/Wcllcomc d4T 司他伏定 Zerit Brblol-Mycrs/Squibb -90- 200303922 (85) 藥物/化合物 ’ !名 商標 製造者 ddl 去幾肌甞 Vito Bristol-Mycrs/Squibb ddC 扎西他賓 Hivid ΗοίϋοαΑη LaRixhe 1592U89 濟而鋼 Zia^eo Glaxo/Wellcome ACT+3TC + 1592U 的 Trizivir Glaxo/WeUcoibfi WFTC (5-氟-3TC;可維雷西）. 安春西賓 Triangle Pharmaceuticals (-)PTC-K+)FTC (50:50) 雷西米 QuadPhanna DAPD (活性的DXG) 安多西維 TYiangle Phaimaceudcals F«ddA (2-氟-ddA) ^德諾塞 Mcdlnumme Oacology (US Biosdencc) BCH-10652.dOTC (2-脫氧-3-噚-4· 硫代胞嘧啶） _ BioChem Pharma. Inc. DkWFC Triangle Phamiaceutical» (Schinazi) (Sch)DflZl)雙^—”― — ㈤― 雙〜POM PMEA (GS-S40) ΤΖΓΤΓΤΓΖ * f德福章二匹夫松

Gilead Sciences BI-RO-587 奈維拉平 Viramunc Bochimger/lnglehciiii (Roxanne) BHAPPNU-90152T 地拉維定 Rescriptor Pharmacia & Upjoho DMP 266 (1/743,726) 希寧 Sustiva Dupont Pharmaceuticals (Avid) MKC442 (寇可汀諾） 安米維樂 Tnin^lc/MitsubiiH Kaicl ACMM9(SI153)(在掌控下） 卡普維樂 Agoorcm PharaiaccucicalK ΡΝΠϋ-142721 Pharmacia & Upjohn DPC-961» -963, -083. -08? DuPont Phanzuccuticals SJ-3366 也是侵入抑制劑？ Samjm Pharmaceuticals BHAPPNU«g7201 阿替章啶 Upjohn GW420867X：(，奎喔琳） (2-* gen. HBY 097) Glaxo/Wellcomc (Hocchst Bayer) TMC 120 (R147681) Tibotcc TMC 125 (RI65335) Tiboicc R861S3 提維拉平 Janssen Pharmaceuticals 卡拉諾萊A wetm 沙4納維_(hgc) 沙P奎納維-(sgc) Invirnsc Fottivase Sarawak Mcdichcm Pharmaceuticals Hof&aan LaRochc MK-639 (1^735, 524) | 英地納維） Cnxivan Merck Research LabonUories -91- 200303922 (86) 藥物/化合物 俗名 ： 商標 製造者 ABT-538 (A-8d538) 利托那維 Noivir Abbott Laboratories AG1343 娜芙維亞 Viracepi Agoorcm Phannaccuticals 141W?4(VX-478) 安普那章 Agcncrase GIaxo-WdIcomc/V«Tcx ABT-37S/r Ί ^匹那章/利托納維 Ktlctn. Abbott Labamiorics BMS勾2· 632(氮雜-肽> Brisiol-Mycri-Squibb PNU-14O690 提普那韋 Phannncia & Upjohn DMP450 (環狀脲） 莫佐那維 TVianglc/A vid (ph Ι/Π) TMC I26 (艾瑞克森氏化合物） Hbotcc GAV433908 (VX-175) 安普那韋前藥 GlflxoAVcIloomc/Vcitcx 1^6.423 (在掌控下） Merck PEM78390 (二^^/比喃酉同;） Faxkc Davis {Boehringer· IcgJchcixtO 新候選者？ Roche DPC681 和 684 DuPont Phannaccuticals AQ-1T76 (脱 U7 g KN1-764) — Agouxon Pharmaceuticals Τ-20(κρ41) 潘塔福赛 Tnjmeris Phazxnoccudcals T1249 (gp41) Tnmeds PhanaAceuticfih D-肽抑制劑(gp41)小分子 SCH-C 」 Schering-Plough AMD-311 (CXCR4) (拜赛克萊） AnorMED AMD-3664 (CXCR4) (巨赛克萊） AnorMED ALX4<MC(CXCR4) U.PA FP2I399 Fuji Phannac«uticalg PR0 542(gpI20) CD41gG2 Progenies Phannaccudcals PRO-140 (CCR5) MAb CCR5 Progenies Phannaccuiicalfi T-22 (CXCR4) (肽，18-體） Met^DF-1 (CXCR4) TAK779 (CCR5拮抗劑） Takeda AOP-Kiuitcs (CCR5) Gryphon Sciences Ranlcs 9-68 (CCR5) CCR5拮抗劑 4-(六氫说淀-1"* 基)丁烷類 Merck a -免疫激動素-NNS03 (CCR5, CXCR4) a -眼鏡蛇毒素 PhyloMcd Caip. -92- 200303922 (87)

以粗體字表示FDA核准的藥物，紅色=中斷發展，藍色=不確定

-93- 200303922 (88) 表4(名單2)

俗名(縮寫） 商標名 公司 FDA核准日期 齊多夫定，AZT Retrovir Glaxo Wellcome March 87 去羥肌甞，ddl Videx Bristol Myers-Squibb October 91 札西他賓，ddC Hivid Hof&nan-La Rcx±e June 92 司他伏定，d4T Zerit Bristol Myers-Squibb June 94 拉米夫定，3TC EpiYir Glaxo Wellcome November 95 沙p奎納維，SQV，hgc Invixase Hofi&nan-La Roche December 95 沙峻納維，SQV，sgc Fortovasc Hoffinan-La Roche Npvcxnber 97 利托納維，RTV Notvir Abbott Laboratories March 96 英地納維，IDV ' Crixivan Merck Co., Inc. March 96 奈維拉平，NVP Viramune Boehringer iigclheim June 96 娜芙維亞，NFV Viracept Agouron Pharmaceuticals March 97 地拉維定，DLV Rescriptor Pharmacia & Upjohn April 97 ZDV+3TC Corabivir Glaxo Wellcome September 97 希寧，EFV Sustiva DuPont Pharmaceuticals September 98 濟而鋼，ABC Ziagen Glaxo Wellcome February 99 安普那韋 Ageoerasc Glaxo Wellcome April 99 囉匹那韋/利托納維 Kaletra Abbott September 2000 ZDV+3TC+ABC Trizivir GlaxoSmithKline November 2000

• 94- 200303922

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Amprcnavir. J, Virol. 74:4414-4419. -99- 200303922 序列一覽表 <110〉Richman，Douglas Wrin, Mary Petropoulos, Christos Little， Susan Huang， Wei Parkin，Neil Whitcomb, Jeanette <120>利用重組病毒試驗評估病毒受體/輔-受體用途及病毒侵入抑制劑之 組合物及方4 <130> 11068-008-228 <140〉 092103099 <141> 2003-02-14 <150> US 10/077,027 <151> 2002-02-15 <160> 10 <170> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213〉人造的 <220〉 <223〉引子 <400〉 1 ggagcattta caagcagcaa cacagc 26 <210〉 2 <211> 21 <212〉DNA <213〉人造的 <220〉 <223〉引子 <400> 2 ttccagtcav acctcaggta c 21

<210> 3 <211〉 19 <212〉DNA 200303922 <213〉人造的 <220〉 <223>引子 <400> 3 agaccaatga cttayaagg <210〉 4 <211> 35 <212> DNA <213>人造的 <220〉 <223>引子 <400〉 4 gggctcgaga ccggtcagtg gcaatgagag tgaag <210> 5 <211〉 37 <212> DNA <213>人造的 <220> <223>引子 <400> 5 gggctcgaga ccggtgagca gaagacagtg gcaatga <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213>人造的 <220〉 <223>引子 <400> 6 gggctcgaga ccggtgagca gaagacagtg gcaatg <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213>人造的 <220> <223>引子

19 35 37 36

-2- 200303922

<400〉 7 gggtctagaa cgcgttgcca cccatcttat agcaa 35 <210> 8 <211> 38 <212〉DNA <213〉人造的 <220> <223>引子 <400〉 8 gggtctagaa cgcgtccact tgccacccat bttatagc 38 <210〉 9 <211〉 34 <212〉DNA <213〉人造的 <220〉 <223>引子 <400> 9 gggtctagaa cgcgtccact tgccacccat btta 34 <210> 10 <211> 38 <212〉DNA <213>人造的 <220> <223>引子 <400> 10 gatggtctaa gacgctgttc aatatccctg cctaactc 38

Claims (1)

1. 200303922 拾、申請專利範園 1. 一種在被病毒感染之患者中，檢測能夠阻斷感染之抗 體反應發展的方法，包括： (a) 使宿主細胞與得自該患者之抗體製品接觸，其中該 宿主細胞包括編碼得自該患者之病毒蛋白質的核 酸，以及產生可檢測信號的指示劑核酸； (b) 測量由該宿主細胞產生之可檢測信號的量；並 (c) 比較在步騾（b)中測量到的可檢測信號量，與在缺 乏該抗體製品下所產生的信號量，其中在抗體製品 的存在下，測量到降低的信號量，表示該患者已經 發展出對病毒蛋白質，能夠阻斷感染的抗體反應。 2. —種在被病毒感染之患者中，檢測能夠阻斷感染之抗 體反應發展的方法，包括： (a) 將下述轉移感染至第一種細胞 i) 編碼得自患者之病毒蛋白質的核酸，和 ii) 缺乏編碼該病毒蛋白質之核酸，並包括產生可 檢測信號之指示劑核酸的病毒表現載體， 使得該第一種細胞產生包括由獲自該患者之核酸 編碼的病毒蛋白質的病毒顆粒； (b) 使在步騾（a)中產生的病毒顆粒與得自該患者之抗 體製品接觸； (c) 使步騾（b)之病毒顆粒和抗體製品與第二種細胞接 觸，其中該第二種細胞表現與該病毒結合的細胞表 面受體； 200303922

   (d) 測量由第二種細胞產生之可檢測信號的量，以便判 定該病毒顆粒的感染力，並 (e) 比較在步騾（d)中測量到的信號量，與在缺乏該抗 體製品下所產生的信號量，其中在抗體製品的存在 . 下，測量到降低的信號量，表示該患者已經發展出 / ψ 對病毒蛋白質，能夠阻斷感染的抗體反應。 ，- 3. —種在被病毒感染之患者中，檢測能夠阻斷感染之抗 體反應發展的方法，包括： _ (a) 將下述轉移感染至第一種細胞 i) 編碼得自患者之病毒蛋白質的核酸，和 ii) 缺乏編碼該病毒蛋白質之核酸的病毒表現載 體， 使得該第一種細胞產生包括由獲自該患者之核酸 編碼的病毒蛋白質的病毒顆粒； (b) 使在步騾（a)中產生的病毒顆粒與得自該患者之抗 體製品接觸； φ (c) 使步騾（b)之病毒顆粒和抗體製品與第二種細胞接 觸，其中該第二種細胞表現與該病毒結合的細胞表 。 * 面受體，且其中該第二種細胞包括產生可檢測信號 . r · 的指示劑核酸； τ (d) 測量由第二種細胞產生之可檢測信號的量，以便判 定該病毒顆粒的感染力；並 (e)比較在步騾（d)中測量到的信號量，與在缺乏該抗 體製品下所產生的信號量，其中在抗體製品的存在 200303922

   下，測量到降低的信號量，表示該患者已經發展出 對病毒蛋白質，能夠阻斷感染的抗體反應。 4. 根據申請專利範圍第1、2或3項之方法，其中該病毒蛋 白質為被膜蛋白質。 . 5. 根據申請專利範圍第1、2或3項之方法，其中該病毒蛋 ψ 白質為衣殼蛋白質。 6. —種在被病毒感染之患者中，檢測能夠阻斷感染之抗 體反應發展的方法，包括： 籲f (a) 培養第一種細胞，其包括 i) 編碼得自患者之病毒蛋白質的核酸，和 ii) 缺乏編碼該病毒蛋白質之核酸，並包括產生可 檢測信號之指示劑核酸的病毒表現載體， 使得該第一種細胞產生包括由獲自該患者之核酸 編碼的病毒蛋白質的病毒顆粒； (b) 使在步騾（a)中產生的病毒顆粒與得自該患者之抗 體製品接觸； φ (c) 使步騾（b)之病毒顆粒和抗體製品與第二種細胞接 觸，其中該第二種細胞表現與該病毒結合的細胞表 y 面受體； . ¥ - (d) 測量由第二種細胞產生之可檢測信號的量，以便判 ’ 定該病毒顆粒的感染力；並 (e)比較在步騾（d)中測量到的信號量，與在缺乏該抗 體製品下所產生的信號量，其中在抗體製品的存在 下，測量到降低的信號量，表示該患者已經發展出 200303922

   對病毒蛋白質，能夠阻斷感染的抗體反應。 7. 根據申請專利範圍第6項之方法，其中（i)之核酸是（ii) 病毒表現載體的一部分。 8. 根據申請專利範園第6項之方法，其中將（i)之核酸整合 到第一種細胞的基因組内。 9. 根據申請專利範圍第6項之方法，其中將（ii)之病毒載 體整合到第一種細胞的基因組内。 10. 根據申請專利範圍第6項之方法，其中將（i)之核酸和（ii) 之病毒載體整合到第一種細胞的基因組内。 11. 根據申請專利範圍第6項之方法，其中該病毒蛋白質為 衣殼蛋白質。 12·根據申請專利範圍第6項之方法，其中該病毒蛋白質為 被膜蛋白質。 13.根據申請專利範圍第12項之方法，其中該（i)之核酸是 (ii)病毒表現載體的一部分。 14·根據申請專利範圍第12項之方法，其中將（i)之核酸整 合到第一種細胞的基因組内。 15.根據申請專利範圍第12項之方法，其中將（ii)之病毒載 體整合到第一種細胞的基因組内。 16·根據申請專利範圍第12項之方法，其中將（i)之核酸和 (ii)之病毒載體整合到第一種細胞的基因組内。