TW200303359A - Expression of polypeptides in rod outer segment membranes - Google Patents

Description

200303359 ⑴ 玖、發明說明 (發明說明應敘明：發明所屬之技術領域、先前技術、内容、實施方式及圖式簡單說明) 技術領域 本發明廣言之係關於蛋白質結構生物及醫藥設計之領 域，明確言之，本發明係關於適以生產及純化均質性蛋白 之DNA構築體、細胞及動物。 先前技術

膜蛋白在細胞訊息交換、電子及離子平衡、細胞結構完 整性、細胞吸附作用及其他功能上是很重要的。膜蛋白中 ，又以G-蛋白偶合受體（GPCRs)特別令人感興趣，因為這 些蛋白是最大群且變異最大之受體蛋白質。人類基因體中 逾400種非感覺性GPCRs與調節許多生理流程有關，而數以 百計其他的GPCRs則與視覺、嗅覺及味覺的感受有關。有 效藥劑總銷售量中以GPCRs為標的者超過40%，且GPCRs仍 是整個醫藥工業上積極研究者。

蛋白質結構模式業已證明可用以預測配位體鍵結之機 制、預測造成疾病突變作用之效應，及輔助藥劑設計之用 。然而，要獲製原子分析結構之膜蛋白在技術上受到挑戰 ，有一大部分是因為在組織培養中膜蛋白表現作用（此為 慣用以獲製大量所要蛋白的方法）會產生缺少某些原態蛋 白所發現之轉譯後修飾作用（諸如脂肪酸醯化作用、磷酸 化作用及N-及〇-連結醣化作用），或此種修飾作用與原態 蛋白有不同的型態。這些差異會影響蛋白質的穩定性，致 使其難以以可溶性形式純化之。除此之外，在組織培養系 統中，分子與分子之間的正確轉譯後修飾作用會有所不同 200303359 _ (2) 發明說明續頁 ，此異質性對形成研究結構時所用之適當晶體能力有負面 的影響，例如，不論是純化自重組哺乳細胞株或桿狀病毒 /昆蟲細胞之GPCR牛視紫質相較於純化自牛桿狀細胞之視 紫質，其呈現不同含量的N-醣化作用，且在電泳膠片上亦 多出一條擴散的紋線，此顯示出其異質性所在（利夫斯 (Reeves)等人·，美國國家學院文獻 93 ·· 1 1487- 1 1492(1996))。 至今，只有鑑定出單一種的GPCR晶體結構，就是牛視 紫質（帕爾吉斯奇（Palczewski)等人，科學 289 ： 739-745 (2000))。視紫質是種位於視網膜上而與光訊息傳輸有關之 GPCR。為了製備高品質晶體，自牛視網膜之桿狀外部區 段膜純化出佔有90%總蛋白含量之視紫質。 不幸地，大多數其他有相似含量及純度之天然來源膜蛋 白並無法有效獲取，除此之外，如前所述，重組來源之組 織培養純化所得蛋白通常為異質性，因此，不適合作為結 構研究之用。因此，實有必要發展出一種能夠製備高含量 、高純度及高均質性蛋白質的方法，特別是諸如GPCRs的 膜蛋白，此種蛋白可用於結構研究，及其他的研究與醫療 應用上，本發明正滿足此一需要，且提供有關的優點。 發明内容 本發明提供一種轉殖基因構築體，其包括編碼光受體專 一性調控序列、膜關聯多肽及光受體外部區段膜標的送達 訊息之核酸，例如，本發明提供一種轉殖基因構築體，其 包括編碼視紫質啟動子、膜關聯多肽及桿狀外部區段 (ROS)標的送達訊息之核酸，除此之外，本發明提供一種 200303359 (: 具有轉 體包括 外部區 殖基因 之多肽 列、膜 本發 轉殖基 ，而該 源性，才: 基因與 合作用 除此 達構築 標的送 老鼠視 之同源 間產生 本發 兩個功 可與桿 訊息多 發明說明績頁 殖基因構築體之細胞或脊椎動物，該轉殖基因構築 編碼光受體專一性調控序列、膜關聯多肽及光受體 段標的送達訊息之核酸，另外，本發明提供包括轉 構築體所編碼的多肽之細胞萃取物或實質上純化 ，該轉殖基因構築體包括編碼光受體專一性調控序 關聯多肽及光受體外部區段標的送達訊息之核酸。 明亦提供含有轉殖基因之基因標的送達構築體，該 因編碼具有光受體外部區段標的送達訊息之多肽 轉殖基因兩側5’及3' DNA序列與視紫質基因具有同 暮築體與視紫質基因間之同源性重組作用導致轉殖 桿狀細胞專一性調控序列間產生人工操控性的結 之外，本發明提供一種包含轉殖基因之基因標的送 體，該轉殖基因編碼一種含有桿狀外部區段（ROS) 達訊息之多肽，該轉殖基因兩側5f及3’ DNA序列與 紫質基因具有同源性，構築體與老鼠視紫質基因間 性重組作用導致轉殖基因與桿狀專一性調控序列 人工操控性的結合作用。 明亦提供一種老鼠細胞，該細胞基因體中含有一或 能破壞之内因性視紫質基因對偶基因，及編碼包含 狀專一性調控序列人工操控結合之ROS標的送達 肽之轉殖基因。 除此之外，本發明提供一種老鼠，該基因體中含有一或 兩個破壞功能之内因性視紫質基因對偶基因，及編碼包含

(4) (4)200303359 發明說明續頁 可與桿狀專一性調控序列人工操控結合之ROS標的送達 訊息多肽之轉殖基因。 宜施方式 本發明提供在其光受體細胞中能表現轉殖基因多肽之 動物，及適以製備此種動物之細胞及構築體，例如，本發 明提供在其桿狀細胞外部區段膜中能表現轉殖基因多肽 之動物及適以製備此種動物之細胞及構築體。本發明構 築體較佳經過設計，以使得該同合子動物桿狀細胞產生極 V i或不產生内因性視紫質，因此，桿狀外部區段（R〇s) 膜中所表現的轉殖基因多肽在總R〇s膜蛋白含量中佔有 極大比例’並可輕易大量純化，而轉殖基因多肽之轉譯後 修飾作用亦為實質均質性，因此，本發明動物及方法所產 生的多肽可作為結構研究之用，以闡明其分子機制及配位 體交互作用’藉此提供藥劑設計上有用的資訊。R〇S膜表 現蛋白亦可用於其他技藝上已知需要高品質蛋白質或較 佳具有高品質蛋白質的應用上，包括功能性研究；配位體 、促進劑及拮抗劑篩選；抗體的製備；及醫藥的製劑。 在一個具體實例中，本發明提供一種轉殖基因構築體， 其包括編碼光受體專一性調控序列、膜關聯多肽及光受體 外部區段膜標的送達訊息之核酸，例如，本發明提供一種 轉殖基因構築體，其包含編碼視紫質啟動子、膜關聯多肽 及桿狀外部區段（ROS)標的送達訊息之核酸，除此之外， 本發明提供一種具有轉殖基因構采體之細胞或脊椎動物 ，該轉殖基因構築體包括編碼光受體專一性調控序列、膜 -10- 200303359 發明說明續買 (5) 關聯多肽及光受體外部區段標的送達訊息之核酸，另外， 本發明提供包括轉殖基因構築體所編碼的多肽之細胞萃 取物或實質上純化多肽，該轉殖基因構築體包括編碼光受 體專一性調控序列、膜關聯多肽及光受體外部區段標的送 達訊息之核酸。

本發明亦提供包括轉殖基因之基因標的送達構築體，該 轉殖基因編碼具有光受體外部區段標的送達訊息之多肽 ，該轉殖基因兩侧5’及31 DNA序列與視紫質基因具有同源 性，構築體與視紫質基因間之同源性重組作用導致轉殖基 因與桿狀專一性調控序列間產生人工操控性的結合作用。

在另一個具體實例中，本發明提供一種包含轉殖基因之 基因標的送達構築體，該轉殖基因編碼包括桿狀外部區段 (ROS)標的送達訊息之多肽，該轉殖基因兩側5’及3' DNA序 列與視紫質（亦稱視蛋白或桿狀視蛋白）基因具有同源性 ，構築體與一個視紫質對偶基因間發生同源性重組作用後 ，轉殖基因與桿狀專一性調控序列會發生人工操控性結合 作用，而視紫質對偶基因則功能被破壞。本發明基因標的 送達構築體較佳用以，例如，製備能於其桿狀外部區段膜 表現轉殖基因所編碼之多肽之動物，及製備用以產生此種 動物之適當ES細胞。 本專利說明書中所用”轉殖基因’’係指不會自然存在於 視紫質基因基因座上的DNA序列。轉殖基因可以編碼任何 想要表現於桿狀外部區段膜上之多肽，及編碼已知的序列 或欲測定之多肽。技藝中已知許多編碼人類及非人類多肽 -11 - 200303359 發明說明讀頁 之核甞酸序列（參考，例如GenBank&其他序列資料庫卜且 可輕易地定出其他的核苷酸序列。利用標準重組分子生物 方法（參考，例如山姆布魯克（Sambr〇〇k)等人， 錢室尬，第三版，冷泉灣印行，平景鎮，紐' 奥斯伯爾（Ausubel)等人，全丄生最复龙复，約翰威利 &孫（John Wiley & S〇n)，紐約（最新補充）；及類似者參考） 可合成或選殖出對mRNA穩定性及轉譯作用很重要之非轉 譯序列與適當編碼部分。 以實例而言，轉殖基因可編碼①蛋白偶合受體（GpcR) ，諸如人類、非人類哺乳動物、非哺乳動物脊椎動物、非 脊椎動物（例如昆蟲或線蟲）、酵母菌、細菌或植物之GpcR 。GPCRs為七穿膜區域多肽，其對配位體作出反應後，而 轉導G-蛋白偶合訊息。不同GPCRsi天然配位體包括肽、 生物源胺、St蛋白、核：¾:酸、離子、脂質、胺基酸、光及 氣味。以結構性而言，GPCRs可分為三個主要的次群，每 一次群均包括孤兒受體及已定出配位體之受體（參考吉瑟 (Gethe0，内分泌總論 21 : 90- 1 13 (2000))。 似視紫質/β2腎上腺素之GPCRs受體族群實例包括生物 源胺（腎上腺素、血清素、多巴胺、蕈毒素、組織胺及類 似物）、CCK、内皮素、速激肽、神經肽γ、TRH、神經緊 張素、蛙皮素、生長激素促泌素、脊椎及非脊椎動物視蛋 白、緩動素、腺铝、大麻鹼、退黑激素、嗅覺訊息、化學 趨素、fMLP、cSA、GnRH、二十燒化合物、白三晞類、fsh 、LH、TSH、甘丙素、核誓酸、鴉片、、催產素、血管加壓 -12- 200303359 ⑺ 發明說明績頁 素、體抑素及退黑激素之受體及蛋白酶所活化之GPCRs。 似升糖素/ VIP/降鈣素之GPCRs受體族群實例包括降鈣 素、CGRP、CRF、PTH、PTHrP、升糖素、似升糖素肽、GIP 、GHRH、PACAP、VIP、腸激素及蜘蛛毒素之受體。 代謝型神經傳送物質/鈣之GPCRs受體族群之實例包括 代謝型麩胺酸受體、代謝型GABA受體、鈣受體、犁鼻器 費洛蒙受體及味覺受體。

各種哺乳動物GPCRs (包括孤兒GPCRs)之核甞酸及胺基 酸^ 序歹丨J 之資料庫可在 http://www.darmstadt.gmd.de/-gpcrdb/ il www.GPCR.org網站查詢。本發明可以編碼任何GPCR (包括 已知GRCRs之變異體及突變體，或其任何所要之片段）之轉 殖基因進行之。 除了七穿膜（7TM)拓樸學外，此三者GPCR群間經確認序 列之相似性甚少。由於整體序列相似度相當低，所以7TM 中保守結構性”微區域’’的存在便支持了視紫質與其他 GPCRs間的演化關係。以視紫質結構為模板之GPCR藥劑標 的3D結構的分子模型成為電腦辅助GPCR藥劑設計的重要 一環（布利斯特羅斯（Ballesteros)等人，分子醫藥學，60 · 1-19 (2001) ;威希爾斯（Visiers)等人，酵素學方法 343 ： 329-71 (2002) ;吉許格恩（Gershengorn)及歐斯曼（Osman)，内分泌學， 142 : 2- 10 (2001))。然而，鑒於整體序列相似性低、分歧結 構部分的存在（布利斯特羅斯等人·，#遂），及分歧螺旋彎 内序列及長度缺乏相似性，故以視紫質結構為基礎之 GPCRs模式相當的複雜，因此，即使這些外部區段是大部 -13- 200303359 (8) 發明說明續頁 分GPCRs重要的配位體键結位置，但不能以發現於視紫質 晶體中的彎結構為模式。因此，最少需要數種GPCRs (諸 如大麻鹼受體，其已成為其他相近GPCRs有用之模板）來闡 明針對GPCR藥劑設計之結構基礎方法，除此之外，非-視 紫質GPCRs之結構可以定性出此次群受體中負責其結構 及功能完整性的重要保守特徵。

另一種方法是，本發明可以編碼GPCR以外膜蛋白之轉 殖基因進行之。膜蛋白包括針對細胞素、生長因子及激素 (包括血小板衍生生長因子、上皮生長因子、胰島素、似 胰島素生長因子、肝細胞生長因子、纖維母細胞生長因子 、細胞間質素、干擾素及類似物）之受體，膜蛋白亦包括 癒合分子（諸如整合素、鈣依賴黏附素及類似物）；免疫分 子（諸如抗體及其抗原键結片段、T-細胞受體、MHC分子 、細胞表面決定子及類似物）；離子通道物質；傳送子； 膜蛋白酶；死亡受體；核受體；複合藥劑抗性蛋白；膜環 化酶；酪胺酸激酶；膜磷酸酶；或胞隙接合蛋白。 本發明亦可以編碼非位於正常膜上之肽之轉殖基因進 行之。以此種應用而言，轉殖基因多肽或ROS標的送達訊 息中通常包括膜定位訊息，將於後文進一步說明。因此， 轉殖基因可編碼任何感興趣的多肽，諸如酵素（例如激酶 、磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、聚合酶及類似物）；鍵結蛋 白（例如轉錄因子、駐足蛋白、受體促進劑或拮抗劑及類 似物）；或結構蛋白（例如細胞結構蛋白、支架蛋白及類似 物）0 -14- 200303359 _ (9) 發明說明續頁 ROS膜上所表現的多肽較佳具有相當均質性的轉譯後 修飾作用，因此，本發明可以編碼具有廣泛地轉譯後修飾 作用多肽之轉殖基因進行之，包括複雙硫鍵、N-或0-連結 醣化作用、脂肪醯化作用或磷酸化作用。

適當的轉殖基因可以編碼天然存有的多肽，包括任何感 興趣物種之上述實例多肽，諸如人類、非人類哺乳動物、 其他脊椎動物、昆蟲、線蟲、其他非脊椎動物、植物、酵 母菌、其他真核生物、細菌或其他原核生物。較佳地，轉 殖基因可編碼具有與人類遺傳疾病相關突變的多肽，如此 可定出這些突變的結構性或功能性共同序列。

轉殖基因亦可編碼非天然存在之多肽，諸如與天然存在 多肽序列相較，包括加成、刪除或取代一或多個胺基酸之 多肽。此種變體多肽可用以，例如，定出多肽中重要功能 的殘基，諸如配位體及效應子鍵結位置，並幫助設計出適 當療效的配位體。另一種方式是，非天然存在多肽可以只 含有感興趣特定片段或區域，以助研究特定區域的結構或 功能。 亦可視情況在轉殖基因的中間區域、N-端或C-端位置包 括額外的序列，以提供較佳的特性。此種序列可包括，例 如，提供多肽上膜定位序列；幫助多肽分離或鑑定的序列 ;調控多肽功能、穩定多肽結構或幫助多肽摺疊的序列。 例如，如後文所述，桿狀外部區段（ROS)標的送達訊息 與膜定位訊息功能結合後，可將多肽定位至ROS膜上。因 此，倘多肽不含有正常的膜定位訊息，則可以利用重組方 -15- 200303359 發明說明續頁 (ίο) 法加以修飾轉殖基因，以使得所編碼的多肽包括膜定位訊 息。技藝中已知適當的膜定位訊息及其用以製備重組多肽 之方法，例如，包括，肉莖蔻酸化説息、棕櫚酸化訊息、 法尼基化訊息、異戊二晞基化訊息、GPI錨訊息及穿膜區 域序列。

幫助鑑定或分離轉殖基因多肽的適當序列是技藝中已 知的，並可包括針對市售或所產製抗體之抗原決定子標記 (例如HA、myc、FLAG)、穀光苷肽-S-移轉酶、聚-組胺酸 序列、螢光標記（例如綠色螢光蛋白）、生物冷光標記（例如 冷光酶）及類似物。

調控轉殖基因多肽功能、穩定轉殖基因多肽結構或幫助 轉殖基因多肽摺疊的序列包括，例如，對應正常功能配位 體、轉換子、效應子或支架分子之分子序列。以與感興趣 多肽之融合體來表現這些序列，需要確定兩個分子的接近 度及適當的立體結構，除此之外，融合序列可穩定多肽活 性或非活性結構，當需要某特定應用時，可以鑑定出活化 作用時的重要結構特徵。 例如，GPCR可以與其肽配位體、與遏制素或與G-蛋白α-次單位之融合體表現之。技藝中已知以重組方式製備功能 性GPCR-Goc融合體之方法（參考西夫特（Seifert)等人，醫藥 科學趨勢 20 : 383-389 (1999))。利用例行性之分子生物方 法可製備編碼其他所要融合蛋白之構築體。 以某些應用而言，較佳是構築編碼兩或多個含有ROS標 的送達訊息多肽之轉殖基因，不論其轉譯產物是分開的或 -16- 200303359 _ (11) I發明說明續頁

融合的。例如，轉殖基因可編碼兩個或多個含有ROS標的 送達訊息的不同受體多肽，諸如兩或多個不同GPCRs，同 樣地，轉殖基因可編碼一種含有一個ROS標的送達訊息之 多肽及另一種含有一個R0S標的送達訊息之多肽，其中該 兩種多肽正常的結合。因此，其中一種多肽可以是如前所 述另一種多肽的配位體、轉換子、效應子或支架分子。例 如，其中一種多肽可以是遏制素或Goc次單位，而另一種 多肽為GPCR。較佳是兩種或多種多肽一起使用（諸如在本 專利說明書中所述之篩選分析法），或以技藝中所熟知的 方法將其彼此分離，諸如以蛋白酶切除融合間的序列，或 以免疫學分離方法分離之。

在某些具體實例中，例如標的送達構築體、細胞或動物 中轉殖基因所編碼的多肽非為視紫質。有關所用之獨特多 肽，π視紫質π係指天然存在任何物種之視紫質多肽，及技 藝中所述應用至今任何之變異體或突變體形式。本專利說 明書所用π視紫質π係指去辅基蛋白質（另稱桿狀細胞視蛋 白），及共價連結色基的蛋白質。獨特視紫質含有連續性 序列之視紫質Ν-端胺基酸序列及C-端R0S標的送達訊息 。除非特別說明，否則獨特視紫質多肽非為與異質性多肽 融合之視紫質，諸如遏制素或Goc次單位。 明確言之，獨特視紫質實例包括野生型蟾蜍、老鼠、大 老、人類、豬及牛的視紫質，及動物模式中導致視網膜疾 病（視網膜色素變性（P23H、V20G、P27L ;各種經刪除或取 代C-端）、光受體退化（K296E)及先天夜盲症（G90D)之突變 -17- (12)200303359 發明說明績頁 視紫質（夫瑞迪克（Frederick)等人，視覺科學42 ： 826-833 (2001);李（Li)等人，美國國家璺險子_^ 92 ： 3551-3555 (1995) ·’ 西夫（Sieving)等人，神經科學雜就:21 : 5449-5460 (2001);及類似文獻）。

在一個具體實例中，本發明提供轉殖基因構築體，其包 含編碼光受體專一性調控序列、膜關聯多肽及光受體外結 段標的送達訊息之核酸，例如，本發明提供一種轉殖基因 構築體，其包含編碼視紫質啟動子、膜關聯多肽及桿狀外 部區段（ROS)標的送達訊息之核酸。在轉殖基因或本發明 標的構築體中’轉殖基因的兩側5’及3f DNA序列與感興趣 動物物種之視紫質基因具有同源性，合宜地動物物種為老 鼠。然而，本發明應用符合基因標的程序所採之其他物種 視紫質亦為範圍内，諸如大老鼠、天竺鼠、牛、蟾蜍、斑 馬魚、人類、豬、羊、山羊、貓、狗及非人類靈長類動物。

所謂與視紫質基因序列具有”同源性”之兩側核甞酸序 列係指該核茹酸序列與視紫質基因序列具有足夠的相似 性’可使得核誓酸序列及宿主細胞中内因性視紫質基因序 列間發生同源性重組作用。典型地，兩側同源性區域的核 甞酸序列與發生同源性重組作用標的處之内因性視紫質 基因之核嘗酸序列至少有9〇%相似度，諸如至少95%、98% 、99%或100%相似度。較佳地，為了增進同源性重組作用 頻率，兩側的同源區域與標的内因性對偶基因為同源系， 此意指兩側區域的DNA分離自與欲併入標的構築體之細 胞具有相同基因背景之細胞。 -18- 200303359 (13)

發明說明續I 利用技藝中所熟知的方法（參考何非利 人，直然遺傳學 15 ·· 216-219 (1997)及利姆（Lem)等人，美國 星院文獻 96 : 736-741 (1999))，可自老鼠基因體DNA 庫中分離出老鼠視紫質基因體DNA序列，其他物種視紫質 基因體DNA可以相似的方法獲得，例如，利用物種間具有 高程度同源性之視紫質cDNA，或其他物種之視紫質cdna 為探針，篩選所欲物種基因體庫，以分離出標的構築體中 所用之視紫質基因體DNA，而後製作基因體DNA的限制酶 圖瑨，並決定轉殖基因插入的適當區域。 田構采體引入至細胞中，兩側同源性DNA序列的長度足 以使標的構築體與細胞内因性視紫質基因發生同源性重 、、且作用’一般而言，兩側同源性序列越長，同源性重組作 用的效率越南。5’側序列的適當長度至少約1 kb，典型地 、 、力5 kb ’諸如約5 kb至約1〇 kb。同樣地，3’側 序列的適當县_ s , 反土少約1 kb，典型地從約1.5 kb至約15 kb ，諸如約5汕至約10讣。 為便同源性重έ I、、、且作用後，將轉殖基因引導至視紫質對偶 基因内的所要 y , 义置’需選擇轉殖基因兩側的同源性序列， 例如，倘欲利用肩沪、 ΒΤ $ β視紫質調控序列驅動轉殖基因的表現 ，則5'側同源性 、 田 列較佳含有此等序列，如此一來轉殖基 因將會坐落在重έ 、 料他甘 ‘斜偶基因調控序列的3丨側。為便在重組 對偶基因上進衣 禋姐丁 ^飾作用，諸如插入、刪除及取代，亦可 遣擇位於轉殖基 、兩側的同源性區域，例如，倘欲利用同 你性重組作用 P冊!1除部分視紫質基因（諸如原態5,側的調 -19- 200303359 (14) 發明說明續頁 節元素、一或多個基因外子、一或多個基因内含子），則 轉殖基因中兩側DNA序列不包括此等區域。刪除部分内因 性視紫質基因可用以確認功能性視紫質多肽不在桿狀細 胞中表現。 為便桿狀細胞中轉殖基因之轉錄作用及最終的轉譯作 用，構築體需經設計，以便轉殖基因與視紫質對偶基因 進行同源性重組作用後，可以與桿狀-專一性調控序列進 行人工操控性結合。本專利說明書中’’人工操控性結合·' 係指桿狀-專一性調控序列與轉殖基因的坐落位置，使得 轉殖基因是在桿狀-專一性調控序列的控制下進行轉錄 作用。

本專利說明書中”光受體專一性調控序列’’係指足以引 導轉殖基因在光受體細胞中進行轉錄作用之順向DNA元素 。光受體細胞為桿狀細胞或視錐細胞。”光受體-專一性•’ 意指該轉殖基因至少可以在光受體細胞中表現，但非指轉 殖基因唯一能在光受體細胞中表現。光受體專一性調控序 列包括引導光受體細胞中基因表現之啟動子序列，及視情 況，可以調控此等細胞中基因表現程度之促進子序列。 技藝中已知數種光受體-專一性調控序列，例如，包括 膜蛋白及溶解性蛋白之啟動子。膜蛋白之光受體-專一性 啟動子包括，例如，盤膜邊緣蛋白/rds (莫利茲（Moritz)等人， 基因 298 : 173- 182 (2002))，及鳥嘌呤核甞酸環化酶-E (度德 (Duda)等人，分子細胞生化學 189 : 63_70 (1998);約翰斯頓 (Johnston)等人，基因 193 : 219-227 (1997))。溶解性蛋白之 -20- 200303359 發明說明續頁 (15) 光受體-專一性啟動 阿爾法次單位（阿姆得（Ahmad)等人，神經化學雜誌 62 ： 396-399 (1994))及遏制素（曼尼（Mani)等人，生物化學雜誌 274 : 15590- 15597 (1999);奇古奇（Kikuchi)等人，分子細胞生 物—曼 I3 : 44〇〇-44〇8 (丨的3))。視錐細胞專一性啟動子實例 包括’例如紅及綠可見色素（沙帕（Shaaban)及迪普（Deeb)， 39 : 885-896(1998))，及視錐細胞遏制素（魯 (Zhii)等人，FEBS^^, 524 : 1 16- 122 (2002))。 本專利說明書中”桿狀-專一性調控序列，，係指足以引導 t 土因在桿狀細胞中進行轉錄作用之順向DNA元素。，， 現俨專性思指茲轉殖基因至少可以在桿狀細胞中表 ^ 私轉殖基因唯一能在桿狀細胞中表現。為了基因 知的适達構築體用 性視紫用& #狀-專—性調控序列通常是内因 考圖n。。玉序列，其包含於轉殖基因5'侧DNA序列内（參 其他的物㉟、一種情形I，桿狀-專-性調控序列為 現之其他其9視序、質碉控序列，或是可以在桿狀細胞中表 或γ次單位誶周&基因，諸如遏制素、轉導蛋白α、β 狀-專—性弋、酉9酶α、Ρ或γ次單位，或恢復蛋白。桿 子序列，及^ &主序列包括引導桿狀細胞中基因表現之啟動 度之促進；㈢/兄’可以调控此等桿狀細胞中基因表現程 運予序列。 物種間椁狀細胞中的β — π 調節序列7 勺反向因子可以辨識視紫質基因的 〜，例如，Ρ试昍止其2 可以引導表 〜牛及人頰兩者之視紫質調節元素 从光文體細胞表現轉殖基因（沙克（Zack) ^ 21 - 聲明說淨續頁 200303359 (16) 等人，神經元6 ·· 187- 199 (1991);尼（Nie)等人，1物化學雜 誌271 ·· 2667-2675 (1996))。因此桿狀-專一性調節序列包括 任何脊椎動物視紫質的調節元素（例如老鼠、其他嚆齒動 物、牛、蟾餘、人類、豬、羊、_、狗、非人類靈長類動 斑馬魚）及包括非-原態DNA序 物 已經定出一些物種之視紫質調節序列（包括啟動子及促 進子元素），包括蟾蜍（曼尼等人，生物化學雜諸 28 : 36557-36565 (2001))、老鼠（利姆等人·，神經元 6 ： 201-210 (1991))及牛（尼等人，生物化學魏誌271: 2667-2675 (1996)) 。這些研究證明相對牛視紫質mRNA起始位置處之_2174至 + 70 bp …735 至 +70 bp、-222至 +70 bp ;及_ 176至 +70 bp之片段 能夠引導轉殖基因老鼠中光受體-專一性基因的表現（尼 等人，(1996))，並證實最小細胞-專一性啟動子位 於牛視紫質轉錄作用起始位置中·176至+7g bp區域。同樣 =:老鼠視紫質基因4.4贼〇.川片段能夠引導轉殖基因 老乳中光受體-專一性 基因的表現（利姆等人·，前述 並證實最小細胞_專_性啟動子位於牛视紫^ 料用起始位置5，側5〇〇 _。除此之外，牛…J 鼠及大老藏视势暫 | p#員老 吏之古卢保 因轉綠起始5,位置約至約2kb

處 < 问度保守區域已證明 KD 人.，重A (1996))。 、、、、乂乍用的促進子區域（尼等 倘有需要，可將原態 ，以增進組織專一性^ 飾成桿狀-專一性調節元素 〈乎性或表現程戶 元素，以增加表現程产，而 "例如，可删除負向調節 反而不改樂4曰 才干狀細胞專一性（曼尼等 -22- 200303359 (17) 發明說明續頁 ·，iA (2001))。除此之外，亦可視情況包含數套促進 予π素，並視情況刪除啟動子及促進子元素之間的序列。 根據桿狀-專一性正向及負向調節元素之知識，熟識技藝 者可決定引導轉殖基因於桿狀細胞中表現的適當序列。 利用轉殖基因蟾蜍可輕易地進行確認引導桿狀-專—性 基Q表現之特定調控序列的方便分析法。將可偵測受體基 口（諸如綠色螢光蛋白或冷光酶（或所要之轉殖基因）人工 2控性地連結至候選桿狀_專一性調控序列上，並利用標 卞方法將構栄體轉染至受精的蟾蜍胚胎中，所得蝌蚪桿狀 胞中文體基因的表現作用證實該調節序列引導桿狀·專 I*生基因表現作用（參考曼尼等人·，遂_(2001))。 轉殖基因所表現之多肽亦可包含光受體外部區段標的 迗達訊息，以便將多肽引導至光受體外部區段膜上。例如 含椎動物桿狀細胞係由包含視紫質盤膜（其以纖毛狀物 與内邵區段連結）之堆積盤之外部區段所組成◦本專利說 明書中所用，，光受體外部區段標的送達訊息，，係指可將異 源性多肽引導至光受體外部區段膜之肽序列。可接受之光 又體外邵區段標的送達訊息不會只將多肽引至光受體外 邵區段膜上，但在光受體細胞其他部份少量多肽的表現不 运迨成負面影響，只要該多肽在光受體外部區段膜上的表 現量夠多即可。 轉殖基因所表現之多肽亦可含有桿狀外部區段（尺〇§)標 的送達訊息，以便將多肽引導至R0S膜上。脊椎動物桿狀細 胞係由包含視紫質盤膜（其以纖毛狀物與内部區段連結） -23- 200303359 (18) 發明說明續頁 之堆積盤之外部區段所組成，外部區段中含有該細胞的代 謝裝置’諸如粒線體及高爾基氏體。本專利說明書所用 π桿狀外部區段標的送達訊息”係指可將異源性多肽引導 至ROS膜上之肽序列。可接受之ROS標的送達訊息不會只 將多肽引導至ROS膜上，在桿狀細胞其他部份（包括内部區 段、細胞核或軸突體）少量的多肽表現不會造成負面影響 ，只要該多肽在ROS膜上的表現量夠多即可。 利用能表現異源性多肽及非洲蟾蜍視紫質區域之崁合 體’在非洲蟾蜍視紫質啟動子的控制下，已經測定出脊椎 動物ROS標的送達訊息的必要及充分特徵。這些研究證明 非洲蟾蜍視紫質的C-端8個胺基酸（SSSQVSPA ; SEQ ID NO ·· 1)足以提供含有膜結合訊息之異源性多肽以外部區段膜 作為送達標的，含有非洲蟾蜍視紫質C-端25個胺基酸 (DEDGSSAATSKTEASSVSSSQVSPA; SEQIDNO: 2)之月太亦可 有效的以外部區段膜作為含有膜結合訊息之異源性多肽 之送達標的。然而，這些序列不足以提供細胞質多肤以 ROS為送達標的（太姆（Tam)等人，細胞生物雜語 151: 1369-1380 (2000)) 〇 較長視紫質雙半光胺酸棕搁基化之訊息序列（諸如非洲 蟾蜍視紫質C-端44個胺基酸（KQFRNCLITTLC*C*GKNPFGD-EDGSSAATSKTEASSVSSSQVSPA ; SEQ ID N〇：3)能提供不具 有自己膜結合序列之多肽以外部區段膜為送達標的（太姆 等人，前述 (2000))。非洲蟾蜍C-端ROS序列中兩個棕櫚基 化之半胱胺酸殘基以星號表示。 -24- 200303359 (19) 發明說明績頁

物種間可辨識ROS標的送達訊息。例如，人類視紫質可 恢復剔除視紫質基因老鼠中桿狀光受體之功能性（麥克納 利（McNally)等人，人類分子遺傳學 8 : 1309- 13 12 (1999))。因 此，ROS標的送達訊息可以是任何脊椎動物（例如，老鼠、 其他嚆齒動物、牛、蟾蜍、人類、豬、羊、貓、狗、非人 類靈長類、斑馬魚）之天然存在的ROS序列，或是非天然存 在的序列。各種物種的視紫質序列是技藝中所熟知的（參 考，例如，GenBank gi : 129207 (人類）；gi : 223659 (牛）； gi : 129210 (老鼠））。因此，ROS標的送達訊息可以包含任 何脊椎動物物種（例如，老鼠、其他嚷齒動物、牛、蟾蜍 、人類、豬、羊、貓、狗、非人類靈長類、斑馬魚）視紫 質之原態C-端序列，或非天然存在的序列，諸如許多物種 ROS排歹J後所定出之一致性序列。

例如，ROS標的送達訊息可包括老鼠、人類及牛視紫質 C-端共有的 8個（ETSQVAPA; SEQ ID NO: 4)或 9個（TETSQVAPA ;SEQ ID NO : 5)殘基，其可被rholD4單株抗體辨識（莫爾代 (Molday)等人，生物化學 22 : 653-660(1983);麥克奇吉 (MacKenzie)等人，生物化學 23 ·· 6544-6549(1994);莫爾代 等人，生物化學 24 : 776-781(1985))。較佳利用rho 1D4抗體 ，以標準免疫分析法來偵測表現含有以1D4抗原決定子為 ROS標的送達訊息之轉殖基因多肽，及分離多肽。另一種 合宜地的ROS標的送達序列含有牛視紫質C-端15個殘基 (STTVSKTETSQVAPA ; SEQ ID NO : 6)，其他適當的 ROS標的 送達序列為相對於脊椎動物視紫質的C-端胺基酸（諸如約 -25· 200303359 _ (20) 發明說明續頁 8至約50個胺基酸）。 如前述有關光受體專一性調控元素及桿狀-專一性調控 元素，用以確認候選光受體外部區段標的送達訊息或ROS 標的送達訊息之合宜分析法，是製備能於其光受體細胞或 ' 桿狀細胞中表現多肽/標的送達訊息融合體（及視情況另 外含有可偵測之部份）之轉殖基因蟾蜍，並利用顯微鏡觀察 將轉殖多肽引導至光受體或桿狀細胞外部區段膜情形（參 考，例如，莫利茲等人，生物化學雜誌 276 ： 28242-28251 · (2001);及太姆等人，前述 (2000))。 在一個具體實例中，本發明提供一種轉殖基因構築體， 其包含編碼光受體專一性調控序列、膜關聯多肽及光受體 外部區段標的送達訊息之核酸，例如，光受體可為桿狀或 視錐細胞。在一個具體實例中，光受體專一性調控序列為 視紫質啟動子或視錐細胞色素啟動子。在另一個具體實例 中，光受體專一性調控序列源自脊椎動物，諸如青蛙或老 鼠。在某些具體實例中，轉殖基因所編碼的膜關聯多肽為 _ G蛋白偶合受體（GPCR)，諸如大麻鹼受體。另外，膜關聯 多肽可為融合蛋白。在一個具體實例中，光受體外部區段 標的送達訊息源自青蛙視紫質或視椎細胞色素。除此之外 ，光受體外部區段標的送達訊息可源自老鼠或可包含SEQ IN NO : 4或 SEQ ID NO : 10之序歹J。 如後文進一步說明，本發明提供一種包含轉殖基因構築 · 體之載體，其具有編碼光受體專一性調控序列、膜關聯多 _ 肽及光受體外部區段標的送達訊息之核酸。利用技藝中所 -26- 200303359 _ (21) 發明說明續頁 熟知之標準步驟及本專利說明書中所述者，此載體可用以 產生含有轉殖基因構築體之細胞，該轉殖基因構築體具有 編碼光受體專一性調控序列、膜關聯多肽及光受體外部區 段標的送達訊息之核酸。在一個具體實例中，該細胞為脊 椎動物細胞，諸如青娃或老鼠細胞。在另一個具體實例中 ，該細胞在老鼠體中，或自老鼠體中分離。在另一個具體 實例中，該細胞為桿狀細胞或視錐細胞，另外，本發明提 供含有轉殖基因構築體所編碼之多肽之細胞萃取物或實 質純化之多肤’該轉殖基因構築體包括編碼光受體專一性 調控序列、膜關聯多肽及光受體外部區段標的送達訊息之 核酸。 除此之外，本發明提供一種包括轉殖基因構築體之脊椎 動物（諸如青蛙或老鼠），該轉殖基因構築體包含編碼光受 體專一性調控序列、膜關聯多肽及光受體外部區段標的送 達訊息之核酸。在一個具體實例中，可自這些轉殖基因脊 椎動物中產製桿狀細胞或桿狀細胞外部區段膜萃取物，此 萃取物可用以純化含有光受體外部區段標的送達訊息之 實質純化多肽。 本發明亦提供含有轉殖基因之基因標的送達構築體，該 轉殖基因編碼具有光受體外部區段標的送達訊息之多肽 ，其中轉殖基因兩侧y及3’ DNA序列與視紫質基因具有同 源性，構築體與視紫質基因間的同源性重組作用會導致轉 殖基因及桿狀-專一性調控序列間產生人工操控性結合。 在一個具體實例中，膜關聯多肽為GPCR，諸如大麻鹼受 200303359 _ (22) 發明說明續頁 體，在另一個具體實例中，膜關聯多肽為融合多肽，除此 之外，如前所述，光受體外部區段標的送達訊息可包含 SEQ ID NO : 4或SEQ ID NO : 10，或源自青蛙或老鼠視紫質 ，或青娃或老鼠視錐細胞色素。

本發明另外提供一種含有轉殖基因之基因標的送達構 築體，該轉殖基因編碼具有光受體外部區段標的送達訊息 之多肽，其中轉殖基因兩側5’及3’ DNA序列與前述之視紫 質基因具有同源性，並另外含有陽性篩選標記（諸如新黴 素抗性基因）。在另一個具體實例中，陽性篩選標記兩側 為ΙοχΡ位置。在另一個具體實例中，基因標的送達構築體 另外包括陰性篩選標記，諸如白喉桿菌毒素A片段基因。 在某些具體實例中，基因構築體的5’側DNA序列含有視紫 質啟動子，諸如老鼠或青蛙的視紫質啟動子。除此之外， 31側序列可含有部分老鼠視紫質基因外子1及部分老鼠視 紫質基因外子2。除此之外，本發明提供含有基因標的送 達構築體之載體或細胞，該基因標的送達構築體具有編碼 光受體外部區段標的送達訊息之多肽，其中轉殖基因兩侧 5’及3’ DNA序列與前述之視紫質基因具有同源性。 在一個具體實例中，本發明提供一個轉殖基因，其包含 編碼視紫質啟動子、膜關聯多肽及桿狀外部區段（ROS)標 的送達訊息之核酸。以實例而言，如圖2所示，非洲蟾蜍 視紫質基因啟動子可插在編碼融合有9個胺基酸ROS標的 送達訊息（SEQ ID NO : 5)之全長人類大麻鹼受體2 (CB2)之 核苷酸前面，除此之外，例如，非洲蟾蜍視紫質基因啟動 -28- (23) 200303359 爱明說明續頁 子可插在編碼融合有15個胺基酸R〇s標的送達訊息⑴ NO : 10)之全長人類大麻鹼受體2 (CB2)之核苷酸前面。構 築體可轉染至蟾蜍胚胎中，以CB2抗體之免疫定位法確定 桝科ROS膜中多肽的表現作用。$ —個本專利說明書所述 實例，顯示融合至綠色螢光蛋白之非-視紫質GPCRs (諸如 CB2及EDG2受體）可正確地以轉殖基因非洲蟾蜂的視網膜 外部區段為標的（實例iv)。 ，除此之外’纟發明提供轉殖基因構築體，丨包含編碼光 受體-專一性啟動予、膜關聯多肽及ROS標的送達序列之核 酸。技藝中已知數種光受體-專一性啟動子，例如，膜蛋 白及溶解性蛋白之啟動子。膜蛋白之光受體_專—性啟動 子包括，例如，盤膜邊緣蛋白/rds (莫利茲等人，基因 :173- 182 (2002)) ’及鳥嘌呤核甞酸環化酶(度德等人分 纽胞㈣189:63·70 (1惰);'約翰斯镇等人:址’二 .219-227 (1997))。料性蛋白之光受體_專_性啟動子包 括’例如’桿狀轉導蛋白之阿爾法次單位（阿姆得等人並一 也學雜」!' 62 ·· 396-399 (1994))及遏制素（曼尼等人，物 化學雜誌 274 : 15590- 15597 (Ί999、：奇丄* #』 ’ )寸古奇寺人，全子細胞 主姻-樣（1993))。視錐細胞_專_性啟動子實 1 39 : 885-896 (1998)) ’及視錐細胞遏制素（魯等人叩則 公告 524 : 116-122 (2002)) 。 ? 本發明另外提供轉殖基因構築體，並句本總 G 口、兩碼組織性啟 動子、膜關聯多肽及R〇S標的送達序列夕仿給 」芡核®^。組織性啟 例包括’例如紅及綠可見色素（沙帕及迪普，_牙斗㈣ -29- 200303359

篆明說明續頁 動子實例是技藝中所熟知的，包肖，例如巨細胞病毒 (CMV)啟動子及SV40 T抗原啟動子序列。在此實例中，合 使用光受體專-性或視紫質啟動子時，序列膜關聯多肤: 有較廣泛的表現型,態，然而，在此實例構築體中，簡標 的运達序列在表現型態上有某些的限制性。 本發明另外提供轉殖基因構築體，其包含編碼視紫質啟 力予及不具有R〇S標的送達序列之膜關聯多肽之核酸。例 如’膜關聯多肽可為膜通道多肽或〇歌（諸如大麻驗受體） 。广此實例中’膜關聯多肽可標的送達至表現視紫質的細 胞續如光受體細胞）。膜關聯多肽會表現在整個細胞，包 括杯狀細胞外部區段及細胞内其他的位置。光受體細胞中 廣布高爾基氏體及内質網會適當擅疊並分類大量的多肤 。膜關聯多肽可自整個細胞萃取物，&自細胞部分之萃取 物中純化出來。 轉殖基因或基因標的送達構築體亦可包含一或多個篩 選標記。構築體通常包含至少一個陽性筛選標記，當標的 細胞基因體中存有該陽性篩選標記時，表示該構築體已插 入基因體中，其可隨意插入或以同源性重組作用進行插入 。較佳地，該構築體中亦可包含陰性篩選標記，通常位在 直線標的構築體的5,或3’側，但在同源性區域之外。當標 勺、’田胞基因體中沒有陰性篩選標記，而同時存有陽性篩選 標i己時，更能使細胞中構築體以同源性重組作用插入至其 基因體中，而非隨意的插入。熟識技藝者可選擇適當基因 標的适達構築體之陽性及陰性篩選標記，而其使用方法是 -30- 200303359 發明說明續頁 (25) 技藝中所熟知的。 陽性篩選標記包括賦予細胞生存之表現性基因，諸如賦 予藥物新黴素、潮黴素、嘌呤黴素或組胺酚抗性之基因。 另一種方式，由於可獲取缺乏次黃嘌呤磷酸核糖移轉酶 (HPRT)之ES細胞株，因此，表現性HPRT基因可作為陽性篩 選標記，並以HAT培養基篩選轉染細胞（莫樂（Muller)，登i 機制 82 : 3-21 (1999))。

陰性篩選標記包括對細胞具有直接或間接毒性之表現 性基因，陰性篩選標記實例為編碼白喉桿菌毒素-A片段 (DTa)之表現性基因。另一個陰性篩選標記為簡單疱療病 毒胸腺嘧啶激酶（tk)基因，其使得細胞對毒性核苷酸類似 物（諸如更昔洛韋（gancyclovir)或FIAU)具有敏感性。另一個 陰性篩選標記是其產物可被免疫毒性共軛物所辨識，諸如 iL_2f體基因的產物可被重組免疫毒素抗_Tac (Fv)_pE4(^

辨識（莫樂，過述(1"9);古貝亞西（Kobayashi)等人，核酸 -¾-究· 24 ·· 3653-3655 (1996)) 〇 示於圖1中的實例基因標的送達構築體中，轉殖基因5, i、J同源性序列（其編碼包括C-端R〇s標的送達訊息之GpcR) 包含約老鼠視紫質基因丨-5 kb，包括原態5，側調控元素。 轉殖基因的3,側同源性序列包含約老鼠視紫質基因卜5以 ，包括部分基因外子丨及視情況基因外子2。5，及3，侧同 性序列的總長度通常介於4至8 kb之間，5，及3，側同源性 列通常為1.5 kb或更長，承堂 、 人又长更吊為2 kb或更長，長度有部分 視適當的限制酶位置而定。構签辦 且叩疋傅术耶可包含作為陰性篩 -31 - 200303359 _ (26) 發明說明續頁 標記之表現性白喉桿菌毒素A基因（DTa)，及在其轉殖基因 3 ’側作為陽性篩選標記之表現性標記新黴素基因。此構築 體與老鼠視紫質對偶基因發生同源性重組作用後，將轉殖 基因與標記新黴素序列插入至視紫質調控序列的3 ’端，如 此便刪除了部分基因外子1。因此，原態老鼠視紫質調控 序列可引導轉殖基因在桿狀細胞中的表現，而ROS標的送 達訊息則將所編碼之多肽定位在ROS膜上。在視紫質對偶 基因上插入轉殖基因會功能性破壞視紫質基因的表現，因 此，標的對偶基因為同合子之動物中視紫質的表現量非常 低，或難以偵測到，而轉殖基因則表現於ROS膜上。 本發明亦提供一種包括基因標的送達構築體之載體，及 包括基因標的送達構築體之宿主細胞。適當的載體可以是 質體、嗜菌質體、嗜菌體、BAC或其他可插入大段DNA之 選殖載體。載體通常含有複製源頭，以便使該構築體可以 在宿主細胞中增幅。載體較佳亦含有可用以篩選含有該載 體的宿主細胞之篩選標記。為便增幅載體，典型地宿主細 胞為細菌細胞，但另一種是可為酵母菌、昆蟲或哺乳動物細 胞。將載體引入至宿主細胞中的方法是技藝所熟知的（參考 ，例如，山姆布魯克等人，前述 (2001);奥斯柏爾等人，直 述(最新版））。 適以應用基因標的送達之載體可購買得之（例如，斯特 基因公司及利克肯遺傳學公司）。適合用於哺乳動物細胞 之合宜地基因標的送達載體包含陽性及陰性篩選標記，及 插入同源性基因序列與轉殖基因序列之適當選殖位置。 -32- 200303359 (27) 發明說明續頁 為了某些應用，可將標的細胞或轉殖基因動物基因體中 的陽性篩選標記去除。因此，基因標的送達構築體可含有 以人工操控性連結到一或多個可輔助其自基因體切除位 置之陽性篩選標記。適合輔助切除專一性DNA序列之序列 包括位置專一性重組酶的辨識位置。各種的位置專一性重 組酶包括來自嗜菌體、細菌及酵母菌之酵素，及其技藝中 所熟知的辨識位置（參考奇比（Kilby)等人，遺傳學趨勢 9 :413-421 (1993))。熟識技藝者可選擇適當的序列及相對 的酵素，用以選擇性去除陽性篩選標記。 專一性DNA切除的實例系統是Cre/lox重組系統。Cre/lox 重組系統與嗜菌體P1的位置專一性重組酶Cre (pauses ^combination)的使用有關，其可辨識並键結至名為loxP Qocus crossover圣in £1)之34-bp長部分迴文標的序歹J。ΙοχΡ序歹1J定 為 SEQIDNO:7 (5f〜ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3，) 。Cre重組酶能夠利用分子内重組作用，有效的切除任何 兩個位於相同相對方向之ΙοχΡ位置間的序列，位於兩個相 同相對方向之ΙοχΡ位置之間的DNA序列稱為’f標記π序列， 由於Cre的活性，一個ΙοχΡ位置留在基因體内，而另一個ΙοχΡ 則在所切除的環狀片段中（參考圖1 ;參考莫樂，前述 (1999);及奇比等人，前述 (1993))。 切除標的對偶基因中標記DNA序列（諸如標記陽性篩選 標記）是技藝中所知的，其中一種方法是暫時性表現標的 胚胎蛉細胞（ES)中表現匣的Cre，而後篩選ES選殖體，確認 已刪除掉標記序列（參考柯素（Xu)等人，基因學 30 : 1-6 200303359 — (28) 發明說明續頁 (2001);葛（Gu)等人，科學 265 : 103- 106 (1994))。另一種方 法是將含有標記序列基因體之轉殖基因老鼠與帶有 Ella-Cre基因的轉殖基因老鼠交配（柯素等人，前述 (2001) ;樂克索（Lakso)等人，美國國家學院文獻 93 ： 5860-5865 (1996))。另一種方法是將Cre-表現質體注入帶有標記序列 轉殖基因動物受精卵之原核中（柯素等人，前述 (2001))。 在後面兩個方法中，利用篩選來確定子代老鼠中已刪除標 記序列。熟識技藝者可決定其他另外去除標的對偶基因中 標記序列的方法。 本發明亦提供一種細胞，其含有一或兩個功能破壞視紫 質對偶基因之基因體，及另外含有編碼包括以人工操控連 結桿狀-專一性調控序列之ROS標的送達訊息多肽之轉殖 基因，本發明另外提供一種動物，其含有功能破壞視紫質 對偶基因之一或兩者之基因體，及另外含有編碼包括以人 工操控連結桿狀-專一性調控序列之R0S標的送達訊息多 肽之轉殖基因。 在某具體實例中，該細胞可以是老鼠細胞，而該動物是 老鼠。然而，本發明亦可以其他物種作為基因送達步驟之 標的，諸如老鼠、天竺鼠、牛、蟾蜍、人類、豬、羊、山 羊、貓、狗、非人類靈長類或斑馬魚。 本專利說明書中有關視紫質對偶基因所用”功能破壞’’ 一詞係指對偶基因中含有阻礙編碼多肽正常功能之突變 ，諸如阻礙正常視紫質多肽表現之突變作用，或阻礙正常 視紫質多肽表現的含量。本專利說明書中所用’’功能破壞’’ -34- 200303359 (29) 發明說明續頁 及’’剔除基因n具有同樣的意義。造成功能破壞的突變作用 可以為插入、刪除或點突變作用。

在一個具體實例中，當兩個視紫質基因的對偶基因均為 功能破壞後，該動物細胞中視紫質基因產物實質上才會減 少或實質上沒有。所謂”實質上減少”意指動物桿狀細胞所 產生的視紫質含量低於50%的正常量，而所謂’’實質上沒 有”係指在動物桿狀細胞所產生的視紫質基本上無法偵測 到。雖然實質上減少或實質上沒有視紫質含量之動物典型 地係破壞視紫質基因的編碼區域，但是另一個方式是破壞 該基因的順向-調控元素，如此該基因的轉錄作用便為逆 向調控。

熟識技藝者了解各種製備包括兩個功能破壞視紫質基 因基因體及特定轉殖基因的細胞或動物之方法。例如，當 包括轉殖基因的基因標的送達構築體與内因性視紫質基 因間發生同源性重組作用後，因此該轉殖基因會插入至視 紫質對偶基因（稱為’’基因引入’’），如此便可獲製此種細胞 或動物，另一種方式，以直接或將轉殖基因動物與剔除基 因動物交配來獲製此等細胞獲動物的方式，是將轉殖基因 隨意插入至剔除視紫質基因背景者。 本發明細胞咸欲包括植入動物前所獲製的細胞（諸如胚 胎幹細胞、生殖細胞或胚胎細胞）；存在於轉殖基因動物 或其子代中的細胞；獲自轉殖基因動物之細胞或該細胞子 代，諸如器官、組織、經分離的原級細胞或已建立的細胞 株。 -35- (30) 200303359 發明說明績_ 狀，例如，細胞為存 本發明細胞視情況表現轉殖基因多 "^ m ^ ΛΤ 於轉殖基因動物中的桿狀細胞，或分+ ’自轉殖基因動物之 桿狀細胞，或該細胞的子代，諸如已金、 哽互的桿狀細胞株。 分離自轉殖基因動物之本發明桿狀細胞通常可以 殖基因多肽及將多肽定位置R0S膜上之 、白 的送達訊息 ，0為桿狀-專一性調控元素引導彳 |等才干狀細胞的轉錄作用。 用於基因引入方法之適當基因標 述。用以制冰，. 的适達構築體如前所 迩用以製備細胞及動物之基因# &、、，i 技蓺中所吃々的冲 基口&的迗達構築體的方法是 孜-中所热知的，間而言之，藉由 (包括電穿孔法、磷酸鈣沉澱法 邊中所知的万法 射法、微脂粒轉染法及類 E糊精轉染法、微注 入至適當細胞（諸一胎^ / 冑標的送達構築體引 的送達構築體及内因性相：：）’而後在足以讓引入的標 下培養細胞-段時間，利*質基因發生重組作用的條件 方法來鑑定含有該插入 用（諸如）上述的陽性/陰性篩選 定所篩選的細胞中Λ DNA的細胞，而後利用標準技術鑑 用，諸如利用可F八二 現紫質基因座的同源性重組作 刀内因拉#丄 針或α子對進 對偶基因與重組對偶基因的探 倘要不經交配步法或PCR。 胞，可以對显人Z 座生视紫質基因破壞之同合子細 ^ T /、5子細胞 等人，分子細胳4 』樂劑增強法（莫替森（Mortensen) 式是利用一個挪U : 2391-2395 (1992))。另一種方

^兒（新黴I 性重組作用後蔣_ ·、·<素抗性基因）來篩選第一次同源 对弟—個 用不同的標記… f偽基因破壞之野生型細胞，而後 、 如〉朝槪4 Λ ^京抗性基因）篩選第二次同源性 '36- 200303359 (31) 發明說明續冥 重組作用後將第二個對偶基因破壞之異合子細胞。 為了產生基因引入動物，將含有重組對偶基因的胚胎幹 細胞（ES)引入原始胚囊體中或與桑椹胚凝集’而後將原始 胚囊體或桑椹胚植入假懷孕的養母動物中’讓胚胎發育至 成熟。所得之動物是個崁合體，其具有胚胎幹細胞分裂而 來的細胞。由於崁合動物生殖細胞係來自胚胎幹細胞，使 得該動物與野生型動物交配後，會導致所有體細胞及生殖 細胞均具有基因引入的基因之異合子動物’而異合子動物 交配後會產生同合子動物。用以進行同源性重組作用、製 備及鑑定具有重組對偶基因之崁合、異合子或同合子動物 時，所獲製、培養及操作ES細胞及其他適當細胞的方法是 技藝中所熟知的，可參考，例如西迪威（Sedivy)等人，基因 標的，W· H.夫利曼（Freeman)及公司，紐約（1992);約尼 (Joyner)(出版）基因標的：實際操作法（a Practical Approach) ，牛津大學出版社，紐約，第二版（1998);及立德曼 (Ledermann)，生理實驗 85 ·· 603-613 (2000)) 〇 以另一個基因引入策略而言，將適當的轉殖基因構築體 引入至視紫質基因功能破壞的基因背景者中，可製備本發 明之細胞及動物。具有功能破壞視紫質基因的老氣品種述 於技藝中（參考，例如，何非利斯等人,自然请彳15 ： 216-219 (1997);利姆等人，1國國家學院文獻96 ： 736-741 (1999))，可以相似的方法製備這些老鼠的子代或另外剔除 基因之動物品種。 插入轉殖基因所用的適當構築體含有編碼轉殖基因多 -37- 200303359 (32) I發明說明續頁 月大及以人工操控連結至桿狀-專一性調控序列之R〇S訊息 之DNA序列，適當的多肽、R〇s訊息及桿狀-專一性調控序 列業已前述。用於轉殖基因構築體中之桿狀-專一性調控 序列為老鼠視紫質2.1 kb 5，Hindlll片段（吉格（Geiger)等人， · ϋ...科支研究 35 : 2667-2681 (1994))。 製備轉殖基因動物的方法是技藝中所熟知的，以典型的 方法實例而言，將轉殖基因DNA構築體引入受精卵（接合 子）之雄原核中’而後將其植入至假懷孕的雌性受體動物 · 中，讓胚胎發育生長至成熟，利用南方墨潰法或pCR方法 鑑定含有轉殖基因（異合子基因轉殖種動物）之子代。不同 的基因轉殖種動物之轉殖基因插入處不同，其會影響其基 因的表現。鑑定能於桿狀細胞適當表現轉殖基因多肽之動 物品種，並與野生型動物交配，產生更多具有相同插入位置 的動物（參考西迪威等人，前述（1992);何更（H〇g㈣等人，老 鼠胚胎實作:實驗室手冊，第二版，》泉灣實驗室。994”。 技蟄中另一種方法可用以將轉殖基因引入至動物中，以 _ 產生轉殖基因動物之轉殖基因種品系（參考，例如何更等 人，㈤述’ 1994，美國專利申請案5,6〇2,299 ; 5，175,384 ; 6,〇66,778 ;及6,037,521)。此種方法包括，例如，反轉錄病 毒媒介基因轉移至生殖細胞品系之方法（凡得帕頓（van如 等人，美凰舅家82: 6:148-6152 (1985)) ·’胚 月口私牙孔法（羅（Lo), …胞龙复色3 ·· 1803 - 1814 (1983)) · ;及精子媒介基因轉移法（樂威特納（Lavhran〇)等人，^ 57 : 717-723 (1989))。 -38- 200303359 (33) 發明說明續頁 為製備具有剔除視紫質基因背景的轉殖基因動物，通常 會將轉殖基因動物與剔除基因動物交配，另一種方式是， 將轉殖基因引入至剔除視紫質對偶基因之接合子中，讓接 合子以前述方法生長至成熟，不論是以何種方法，鑑定所 要基因型的子代及交配所產生的其他動物。

本發明動物較佳地可用於各式的應用上，該動物基因體 中包含一或兩個功能破壞内因性視紫質對偶基因，另外包 含編碼多肽之轉殖基因，該多肽包括以人工操控性連結桿 狀-專一性調控序列之ROS標的送達基因訊息。例如，可自 動物眼睛桿狀細胞上的外部區段膜分離出大量實質純化 轉殖基因多肽。以此目的而言，由於兩個内因性視紫質對 偶基因均功能破壞，而導致實質上未表現内因性視紫質的 動物是較佳，如此，含有視紫質的ROS膜污染性會降至最 低，且可以簡化純化的過程。除此之外，包含轉殖基因多 肽之完整桿狀細胞及其萃取物可用於本發明應用上。

在一個具體實例中，本發明細胞及動物可以包含本發明 轉殖基因構築體，並保有内因性視紫質基因。例如，實例 IV中所產生的轉殖基因蟾蜍含有轉殖基因構築體，其並未 剔除内因性視紫質基因。在此實例中，轉殖基因構築體包 含CB2受體或EDG2受體，其可在同時具有内因性視紫質基 因之轉殖基因蟾蜍桿狀細胞中表現。 正常動物中，桿狀外部區段盤膜上蛋白質含量中有約 90%為視紫質。在本發明動物中，因為轉殖基因的桿狀細 胞專一性表現作用，及在所編碼的多肽中包含ROS標的送 -39- 200303359 (34) 發明說明續頁 達訊息，因此，咸預期桿狀外部區段盤膜上蛋白質實質比 例（諸如至少10%、25%、50%、75%或更多）被轉殖基因多 肽取代。 正常動物中，每個老鼠眼睛中所純化的視紫質典型產量 約0.1-1.0毫微莫再（李（Li)等人，院文獻 92 ： 355 1-3555 (1995);凡何瑟（Van Hooser)等人，美國國家學院 文獻 97 : 8623_8628 (2000))。在本發明動物中，咸預期自 相似大小眼睛中可製備出相似含量的轉殖基因多肽，實際 上的含量端視動物種類而定。 熟識技藝者可決定自本發明動物桿狀細胞中實質純化 轉殖基因多肽之適當方法。通常，取出適當數目動物之視 網膜’以帕帕瑪斯特（Papermaster)等人，t素學方法 81 : 48-52 (1982)或歐卡達（Okada)等人，光學生物學67 : 495-499 (19 9 8)所述的方法分離出：^干狀外部區段，例如，將視網膜 置於蔑糖緩衝液中均質化’以低速離心法沉殿粗製RQS並 以密度梯度離心法分離實質純化ROS。以某些應用而言， 使用桿狀細胞萃取物、視網膜萃取物或眼晴萃取物為起始 來源進行實質純化轉殖基因多肽更為方便。 利用適當清潔劑可溶解ROS膜上的轉殖基因多肽，溶解 條件較佳為最佳的條件，以便以單一步驟即可純化多肽。 例如，具有適當親水性-親脂性比例烷基（硫）葡萄糖苷（例 如庚基硫葡萄糖：y：)配合雙價陽離子可以單一步驟自R〇s 純化視紫質（歐卡達等人，前述—(1998))。另一種方式是， 戒識技藝者可根據多肽的生物及免疫特性及特定應用所 200303359 (35) 發明說明績頁 需的純化程度來選用生化及免疫方法，以進一步地將溶解 性多肽純化。較佳地，利用1D4單株抗體辨識含有包括1D4 抗原決定子之ROS標的送達訊息之多肽，因此，利用技藝 中所熟知及本專利說明書所述之標準免疫親合力程序（參 考實例VI)分離轉殖基因多肽。 獲製足夠濃度及純度的轉殖基因多肽，以便製備x_光結 曰曰學研先分析晶體之用。如前文所述，與組織培養中所表 現的多肽相反的是ROS中所表現的多肽在轉譯後修飾作 鲁 用相當的均質，此特性大大助於結晶作用。產製高品質結 晶的條件端視多肽本身而定，然而，製備視紫質結晶的實 例條件揭示於歐卡達等人，結構生物學雜誌130 ： 73-80 (2000)中’且咸預期與許多的轉殖基因GPCRs及其他分離自 ROS膜上的轉殖基因多肽有關。簡而言之，以懸滴蒸發擴 欢作用’自包含約30 mM MES或醋酸鈉、5-7 mM β-巯醇、 65-90 Zn(〇Ac)2、〇·55-〇·75% ΗΤΡΟ、0·45%-0·55%壬基葡萄糖 菩及0.84-0.86 “硫酸銨緩衝液體中至少含有約5毫克/毫升 | 多肤之溶液製備結晶。用以增進結晶作用之其他的結晶緩 衝液及添加物是技藝所熟知的（參考，例如，利斯（Rees)等人 ’蛋白質工程：實作方法，牛津大學印行，牛津（1992))。 實質純化轉殖性多肽亦可用以製備抗體，此種抗體較佳 用以辨識原態多肽或具有原態轉譯後修飾作用之多肽。針 對此一目的，視情況地轉殖性多肽可共軛至載體蛋白及/ · 與佐劑一起調配之，以增加其免疫力，並用以免疫適當的 動物。製備多株及單株抗體及其抗原-鍵結片段（例如， -41 - 200303359 (36) 發明說明續頁 、VH及Fd ;單價片段，諸如Fv、Fab及Fab，；雙價片段，諸 如F(ab’）2 ;單鏈Fv(scFv);及FC片段）方法述於，例如，何 洛（Harlow)及萊恩（Lane)，:實驗室手冊·冷泉灣實驗 室，紐約（1989);戴（Day)，E.D.，造階免痦化璺 第二版， Wiley-Liss，Inc·，紐約，NY(199〇)，及柏利克（B〇rreaeck)(出版）， 抗體工程，第二版，牛津大學印行，紐約（19 9 5)。 實質純化轉殖性多肽的另一個應用為藥學製劑。例如， 倘轉殖性多肽為抗體，則可共軛至毒素上，並施與專一性 表現相對抗原之標的細胞（諸如腫瘤細胞）之個體。另一個 實例中，倘轉殖性多肽為受體促進劑或拮抗劑，則可施與 罹患調控受體訊息有關病徵之個體。各種多肽在醫藥上的 應用是技藝中所熟知的，或可測定之。實質純化多肽可與 醫藥學上可接受賦型劑一起調配之，多肽的含量及精確的 調配物端視多肽的生物活性及欲施用的途徑而定，調配藥 學的適當方法及賦型劑述於，例如，雷明頓氏藥學科學（麥 克發表公司，伊士頓，Pa·，最新版）。 目前市售劑量40%總銷售係以GPCRs為標的。闡明GPCR (諸如CB1受體）的結構可支持CB1受體及其他結構性相關 受體（諸如CB2)在藥劑發明上的努力。自從發現大麻鹼之 神經性效應係由CB1受體媒介後，CB1已為藥劑發明標的 。CB2受體表現於免疫系統的細胞中，可為自體免疫及其 他疾病的標的（葛威茲（Gurwitz)及可龍（Kloog)，今日分子藥 學 4 : 196-200 (1998)) 〇 轉殖性多肽亦可用於藥劑篩選應用上，例如，桿狀細胞 200303359 _ (37) Γ發明說明續ΐ 、ROS膜萃取物，或實質上純化多肽可與候選化合物接觸 反應，並測定該化與多肽鍵結的能力。鍵結多肽之化合物 為多肽的候選配位體、促進劑、拮抗劑或反促進劑。接著 下來，利用針對特定多肽之適當功能性分析方法測定化合 物功能效應。用於篩選分析方法之適當候選化合物包括化 學性或生物性分子，諸如簡單或複合性的有機分子、含有 之金屬化合物、碳水化合物、肽、蛋白質、擬肽、聽蛋白 、脂蛋白、核酸、抗體及類似物，而此等化合物庫可輕易 地製備之，或市購之。各種鍵結分析方法（包括高產量键 結分析方法）為技藝中所熟知的，且可用於篩選分析方法 中，包括液閃接近測定分析法（SPA)、UV或化學交錯連社 方法、競爭性鍵結分析方法、生物分子相互反應分析法 (BIA)、表面電漿共振法（SPR)、質譜分析法（Ms)、核磁共 振法（NMR)及螢光極性分析法（FPA)。熟識技藝者可針對特 定的篩選應用來決定適當的化合物及分析方法。 藥劑篩選分析方法中，可使用能表現轉殖性多肽之轉殖 性動物之完整細胞（包括動物視網膜中的桿狀細胞及純化 自動物之桿狀細胞）’包括類似前述之鍵結分析方法及功 能性基礎篩選分析方法，適當的功能性基礎篩選分析方去 端視多肽的正常功能而定，例如，倘轉殖性多肽為一個典 體，則可決定經由受體針對化合物產生反應之訊息。實= 性訊息分析方法端視受體的特性而定，但可包括，例如， 測定改變第二訊息子的產量及轉換，Ντρ水解、離予戈胺 基酸的流入或流出、改變的膜電位、蛋白磷酸化作用的擗 -43· 200303359 (38) ---- 發明說明續夏 減、酵素的改變活性、改變 白皙M i + 々白-蛋白作用、細胞内蛋 白貝的再足位或基因表現的引 虫 嗖庳子八；4 ’ 衣些桿狀細胞中相關 放應子分子或受體基因非正常存 、、 古，利用其阴 功能性分析方法而 :以表現入或轉殖性方法可進-步修飾動物基因體 二自：”分。同樣地，亦可利用功能性基礎分析方 ，、、、喪生或人為突變所造成的轉殖性多肽活性效 應0 …、4技盛者可決定本發明轉殖性動物 轉殖性多肽之额外應用。 、細胞及實質純化

本發明非侷限於此。 下列實例係欲以說明本發明

實例I 此貫例說明基因標的送達構築體的構築方 <，其係以 G A白偶口文體取代老鼠視網膜上的視紫質。

利用何非利斯等人，J)然遺僂聲15 : 216-219 (1997)中所 述的方法製備含有老鼠視紫質所有五個基因外子之基因 體片段及其調節元素。簡而言之，利用視紫質cDNA探針 自λ嗜菌體庫中分離出含有129Sv_衍生老鼠基因體片段 的選殖體，此片段的限制酶圖譜顯示的相關限制酶位置尹 於圖1中（最上圖）。將原始基因體片段的11 kb BamHl片段續 轉殖至pKO Scrambler V907載體（利克肯恩遺傳公司）上，產 生基因體轉殖體示於圖1中。 利用標準分子生物學方法首次構築出包括在其C-端含 !D4標諸之G-蛋白偶合受體cDNA及新黴素抗性基因（兩側 接有ΙοχΡ位置）之轉殖基因匣，簡而言之，利用PCR，以編 -44- 200303359 (39) 發明說明續頁 碼順向讀取9個胺基酸1D4抗原決定子標誌之序列取代 (TETSQVAPA ； SEQ ID NO ： 5)取代 GPCR cDNA的終止密碼， 而後接終止密碼。 將帶標諸的GPCR接合至以楊（Yang)等人，P美國國家：輋 院文獻 95 : 3667-3672 (1998)揭示方法所製備之pi〇xp-neo_ ΙοχΡ (”標記 neon)匣上，而後，將GPCR/標記neo匣接合至視 紫質基因體選殖體上，接合位置介於視紫質啟動子及基因 外子1之間，刪除部分基因外子1編碼序列，如此，GPCR ^ 的表現是以視紫質啟動子驅動。 亦可將白喉桿菌素A鏈匣（樂布卡克（Labarca)等人，美國 國家學院文獻 98 ·· 2786_2791 (2001))接合至構築體的3,端， 而產生示於圖1中之標的構築體。因此，該構築體同時包 含可切除的陽性篩選標記（neo)及陰性篩選標記（DTo〇，可 用以篩選發生同源性重組作用之ES細胞。 利用相似的方法，可製備以其他轉殖基因取代老鼠視紫 質基因之標的構築體。 _

實例II 此實例說明基因標的送達構築體的構築方式，其係以人 類大麻鹼受體2取代老鼠視網膜上的視紫質。 自人類胰臟cDNA庫中選殖出人類大麻鹼受體2 (CB2) cDNA (Genbank取得編號X74328)。以PCR技術，利用有意 義引子 5、GCC GCC ACC ATG GAG GAA TGC TGG GTG AC - (SEQ ID NO ·· 8)及無意義引子 5，-TTA GGC TGG AGC CAC CTG .

GCT GGT CTC CGT CTT GGA AGC GGT GGC AGA G(SEQ ID NO -45- 200303359 發明說明續頁 (40) ·· 9)將編碼9個胺基酸之1D4標誌加至CB2 C-端上，定序接 合處，以確認CB2/1D4融合體是可基因讀碼。將附有磷酸 甘油酸酯激酶啟動子及聚腺苷酸訊息序列並有loxP位置 隨侧之新黴素抗性匣（neo)插入CB2/1D4融合的下游處，用 CB2-neo匣取代介於視紫質基因Xhol位置間的DNA片段，刪 除轉譯起始位置上游的15 bp及視紫質基因前Π 1密碼則可 產生標的構築體，將附有RNA聚合酶II啟動子的白喉桿菌 毒素A鏈（DTa)插入在標的構築體的3’端，則可產生陰性筛 選體。

實例III 此實例說明如何將基因標的送達構築體引入胚胎幹細 胞（ES)中，及產生轉殖基因老鼠。 以電穿孔法將將實例I或II中所述的基因標的送達構築 體送至129Sv ES細胞中，並將ES細胞培養在新黴素類似物 G418環境下。正確標的Es選殖體（其具有改變的視紫質基 因座，如圖1或2所示）對G418有抗性，不正確標的選殖體 則會被所表現的DTa基因殺死。藉由PCR分析及南方黑、、責 法篩選G418抗性選殖體之DNA，以確認同源性重組作用發 生。 ^ 以Cre重組酶表現載體（諸如巨細胞病毒-質體）暫時 性轉染ES細胞，並利用PCR_增幅基因片段來確認兩側ι〇χ 間的neor基因已被Cre-媒介切除。 切除ne〇r基因之正確標的ES細胞選殖體以微注射方法送 至C57BL/6原始胚囊體中，而後將其移入製假性懷孕的= -46- 200303359 (41) 熒明說明續頁 性老鼠中。藉由混合的毛色鑑定崁合雄性子代，並與雌性 老鼠交配，利用PCR技術及南方墨潰法鑑定出具有異合子 標的對偶基因的子代，而後，異合子動物雜交產生同合子 老鼠。 同合子老鼠會產生轉殖基因多肽，取代了桿狀細胞外部 區段膜上的視紫質。

實例IV

此實例說明兩個非視紫質GPCRs (CB2受體及EDG2受體） 在轉殖基因非洲蟾餘（Xenopus laevis)桿狀細胞上的表現。

製備融合構築體，其包含將綠色螢光蛋白（GFP)融合至 人類CB2受體或人類溶血磷脂酸第2型（EDG2)受體，除此之 外’將老鼠視紫質C-端片段15個胺基酸SATASKTETSQVAPA (SEQ ID NO : 10)序列融合至GFP上，以為桿狀外部區段標 的送達訊息序列。蟾蜍視紫質啟動子片段（XOP)(本專利說 明書為SEQ ID NO : 11)作為引導表現融合蛋白之用（亦參考 GenBank取得編號L07770,其含有部分的啟動子序列及曼尼 等人，生物化學雜誌 276 : 36557-36565 (2001))。最後的構 築體含有（5’至3’的方向）非洲蟾蜍視蛋白啟動子（XOP)、人 類CB2或EDG2受體、GFP及作為桿狀外部區段標的送達訊 息（ID4)之編碼老鼠視紫質C-端的15個胺基酸序列。 將融合構築體（分別名為PXOP-CB2-GFP-1D4及pXOP-EDG2-GFP-1D4)直線化，並注射至數百個非洲蟾蜍卵中， 在存活期高達7天或以上（發展期42或更後）的蝌蚪可表現 出CB2-GFP-1D4及EDG2-GFP-1D4多肽，並可傳送至轉殖基 -47- 200303359 _ (42) 發明說明續頁 因非洲蟾蜍桿狀細胞細胞外部區段上。20%的轉殖基因 蟾蜍蝌蚪視網膜上可鑑定出綠色螢光，不同蝌蚪間綠色螢 光強度各異，但大多數較只表現溶解性GFP- 1D4融合蛋白 的轉殖基因蟾餘球Μ斗強。

利用共焦顯微鏡進一步分析蝌蚪視網膜冷凍切片中 CB2-GFP-1D4及EDG2-GFP-1D4多肽在細胞中的位置。顯微 鏡觀察研究證實CB2-GFP-1D4及EDG2-GFP-1D4多肽與膜有 關聯，大部分是表現在桿狀外部區段的圓盤上，小部分的 融合肽位於桿狀内部及突觸之侧膜上。少部分的多肽會累 積在内質網及高爾基氏體上，此顯示融合肽經過適當的摺 疊，且在膜的表面上。此發現顯示過度表現偶合視紫質啟 動子的CB2受體並不會飽和天然表現於視網膜上CB2受體 的摺疊機制，利用視覺系統之這些結果確認了高含量 GPCRs的表現作用。

藉由PCR，利用編碼受體序列之引子增幅人類基因體 DNA庫（諾瓦基因公司）中的人類CB2受體之選殖體（GenBank 取得編號X74328)。利用Taqplus DNA聚合酶（斯特基因公司） 產生PCR產物（CB2·· 1083 bp)，將其選殖至pCRII載體（因威特 基因公司）上，定序該PCR產物，以確認在PCR增幅時沒 有引入突變作用。人類EDG2選殖體市購之（因威特基因公 司）。 PXOP-CB2-GFP-1D4及 pXOP-EDG2-GFP-lD4表現質體構築 方式如下：以Agel/AccIII切割pXOP-Cl-EGFP載體（獲自泰德 威尼爾博士，貝樂醫藥學院，休士頓，德州）去除EGFP序 -48- 200303359 __ (43) 發明說明續頁

列，並再將其接合起來產生pXOP-Clminus質體。編碼老鼠 視蛋白最後15個胺基酸的聚連結子及AFP(優柏基因公司） 序列插入至pXOP-Clminus上，產生pXOP-Nl-GFP-lD4質體。 利用CB2或EDG2序列-專一性引子分別自載體pCRII-CB2及 pCDNA3.1gs-EDG2增幅編碼CB2及EDG2受體之cDNAs。在這 些片段的起始密碼處加上Kozak序列，增幅產物插入至 PXOP-N1-GFP-1D4的 SrfI位置，產生了 pXOP-CB2-GFP-lD4及 PXOP-EDG2-GFP-1D4表現質體。定序所得質體，以確認具 有正確的基因讀碼序列。 以轉殖基因作用而言，利用Endofrec max-prep步驟（吉因 公司）純化DNA，並以Notl及FspI切割pXOP-CB2-GFP-1D4及 ρΧΟΡ - EDG2-GFP-1D4 ，切割後純化直線化的4.7 kb

(XOP-CB2-GFP-1D4)或 4.9 kb (X0P-EDG2-GFP_1D4)片段，最 後用水沖提。以古羅爾（Kroll)及亞馬亞（Amaya)所述的限制 酵素媒介整合法（古羅爾及亞馬亞，發育 122 ： 3173-3183 (1996))製備轉殖基因非洲蟾蜍胚胎。限制酵素媒介整合法 係在含有6% (重量/體積）非可爾（Ficoll)之0.43 MMR中進行 ° 13 MMR含有 1〇〇 mM NaCl、2 mM KC1、1 mM MgCl2、2 mM CaCl2 及5111]\41^?丑3，？117.4。處於4-8個細胞期的胚胎轉移至0.13 MMR、6%非可爾中，適當的腸胚胚胎沁濕在〇· 13 MMR中直 至約發展期42，而後轉移至去氯水中，以0.01%之3-胺基苯 甲酸乙酯（西格馬公司）麻醉蝌蚪，並利用奥林匹克螢光解 剖顯微鏡監控綠色螢光蛋白的表現作用。

共焦顯微鏡觀察轉殖基因非洲蟾蜍眼睛的方法如下：4°C -49- 200303359 __ (44) 發明說明績頁 下，以含有4%對甲醛之0.1 Μ磷酸鹽緩衝液（PBS)、pH 7.5 ，將轉殖基因蝌蚪（發展期48或更老）隔夜固定。蝌蚪置於 4°C下，在30%蔗糖-PBS中冷凍保護2小時至隔夜，樣品包 埋在OCT:免疫培養基（2: 1)中，以冷凍切片機切出12-14 微米之冷凍切片，利用488毫微米雷射光及505透光濾片之 蔡斯510共焦顯微鏡觀察CB2-GFP-1D4及EDG2-GFP-1D4。

實例V

本實例說明人類CB1受體標的送達構築體之構築方式。 為產製在視紫質基因座上引入CB1-1D4基因之老鼠，需 先製備標的送達構築體，其中部分視紫質基因外子1被 CB1 - 1D4融合體力口上兩侧帶有ΙοχΡ之新黴素抗性（neo)匣（參 考圖1)取代。以電穿孔法將標的送達構築體引入至ES細胞 中，並篩選出對G418抗生素具有抗性的細胞。利用PCR及 南方墨潰法篩選出在視紫質基因座上進行同源性重組作 用之陽性ES細胞。

老鼠視蛋白基因體片段的選殖方式如下。利用視紫質 cDNA為模板，從老鼠129sv衍生基因體DNA庫中分離出數個 λ嗜菌體選殖體，以各種的限制酵素切割，並確認該基因 結構與以前所報告者（歐爾-歐巴迪（al-Obaidi)等人，生物 化學雜誌 265 : 20563-20569 (1990))相符。製備CB1-1D4融合 構築體及標的送達構築體的方式如下。在CB1的C-端上加 上老鼠視紫質1D4標誌，利用設計用來將老鼠視紫質最後 15個胺基酸插入至受體終止密碼前端之引子，以Pfii聚合 酶增幅CB1的cDNA，在構築體的末端亦併入Smal限制位置 -50- 200303359 (45) 發明說fl續頁 及Kozak序列，其有助於將此片段序選殖至基因標的送達 構築體中，定序接合處，確認CB1/1D4融合體為可讀碼基 因。兩側有ΙοχΡ位置之新黴素抗性匣（neo)(具有磷酸甘油酯 激酶啟動子及聚腺嘌呤作用訊息）插入在CB1/1D4融合體

的下游處。用CBl-neo匣取代視紫質基因Xhol位置間的DNA 片段後’刪除了轉譯起始位置上游15 bp及視紫質基因的前 面111密碼後，可製備標的送達構築體。具有RNA聚合酶η 啟動子的白喉桿菌毒素^鏈（DT α)插入至標的送達構築體 3’端’以作為陰性篩選之用。改變的基因座可以老鼠視蛋 白啟動子來表現1D4-標誌人類CB1受體，而内因性視紫質 則失活。

實例VT 此只例說明純化桿狀細胞外部區段上GpCRd々方法。 本專利說明書所述純化視紫質兩步騾的方法可為純化 表現於老氣視網膜桿狀細胞外部區段之GPCRs (諸如cbi 及CB2受體）之實例。以薦糖梯度離心法為基礎，自視網膜 卒取物中純化出桿狀細胞外部區段是可靠的方法(參考帕 帕瑪斯特，黯81: 48_52 (1982))。此方法係利用 〇ptlprep為在度梯度培養基來分離老鼠視網膜（張（τα% )等 282 : 117_121⑽8))。此桿狀外部區段強化步驟 疋自能表現GPCR之棘飱其阴土 < 轉殖基因老鼠桿狀外部區段上純化 —的第一個㈣，除此之外，因為r〇s標的送達序列（諸 SATASKTETSQVAPA (SEQ ID NQ :⑼此是多肽傳送至 桿狀細胞外部區段所必須者)會標諸在每個_C-端上 -51 - 200303359 (46) 發明說明續夏 ，因此，純化步騾中可以使用與該序列具有反應性的抗體 。莫爾代氏1D4單株抗體顯示對此序列具有高度的親合力 ，而其已用以純化視紫質及其他的經1D4標誌的GPCRs (許 馬大（Shimada)等人，生物化學雜誌 277 ： 31774-31760 (2002) •，米撒比可夫（Mirzabekov)等人，國際生物技術 1 8 · 649-654 (2000);衛（Weng)等人，生物化學雜誌 57 ·· 57- 102 (1997))。

如圖4所示，以1D4免疫親合力層析法所純化之視紫質的 A280/A500比例為1.6-1.7 (圖4B)，此顯示此樣品的視紫質經 純化且具有功能。一致性地，當樣品進行SDS-PAGE後， 並經卡馬西藍（Coomassie Blue)染色後，只有兩條紋線（單體 或雙體），以20公分長管柱免疫親合力層析法純化之視紫 質在大部分之濃縮分液中可達〜2毫克/毫升（圖4A)。在離 心性濃縮器中經過濃縮3-4次後，視紫質濃度足以進行結 晶試驗 °

免疫親合力管柱根據下列方法製備之。抗1D4標誌（視紫 質上九個C-端殘基）之單株抗體係由1D4融合瘤細胞所產 生。以兩個層析法步驟將抗體純化成均質性。首先，1.5 公升的融合瘤澄清液經10 mM Tris-Cl (pH 8)進行透析作用 ，加入至含有55克之DEAE纖維素管柱中，並以溶於10 mM Tris-Cl (pH 8)中之0-0·5 M NaCl梯度沖提，以SDS聚丙烯酿胺 膠片電泳作用（PAGE)分析分液，將含有抗體的分液倒在一 起，並以蛋白-A键結緩衝液（皮爾斯公司之ImmunoPure® (A) IgG鍵結緩衝液）稀釋成1 : 1。此抗體溶液加入至5毫升r蛋白 -A西法洛斯（Sepharose)管柱（法瑪西亞公司）中，並以0·1 Μ -52- 200303359 (47) 發明説明續頁 甘胺酸pH 2.8沖提。分液立即以1〇% 1 μ Tris-Cl pH 8中和， 最終的抗體經磷酸緩衝鹽液（pBS)緩衝液透析，並根據製 造商所建議的步驟將其偶合至溴化氰-活化-瓊脂醣基質 (AminoLink Plus Gel，購自Pierce)，偶合密度為每毫升膠體1〇 毫克之抗體。

所有純化視紫質的步驟是在微弱紅光下進行，第一個步 驟包括以蔗糖梯度離心法純化黑暗保存牛視網膜萃取物 中之桿狀細胞外部區段強化物（帕帕瑪斯特，前述），接著 下來，將桿狀外部區段製備物溶解在含有2〇 mM正-十二基 -β-D-麥芽糖站之緩衝液1 (20 mM Bis-tris丙貌，pH 7.4，50 mM NaCl)中，並將其加入至1D4親合力管柱中，加入呈現視紫 質九個C-端殘基（TETSQVAPA)之0.1 mM競爭肽（溶於緩衝液 2 (20mM Bis-tris丙烷，pH 7.4，150 mM NaCl))進行沖提，利 用SDS-PAGE分析最濃縮分液之純度。

實例VII

此實例說明經1D4標語之大麻驗受體1之特性。 在異質系統系統中表現大麻鹼受體可用以測定純化作 用的步騾，及用以研究這些受體不尋常的行為，諸如大量 的凝集作用、純化作用中在清潔劑中的不穩定性，或在純 化過程中對專一性配位體（諸如促進劑及拮抗劑）失去键 結特性，因此，製備能穩定表現經1D4標誌之CB1受體之 HEK293細胞株，並力口以定性。 利用1D4抗體，以免疫墨潰法偵測CB1-1D4融合多肽，亦 可偵測到某些雙體的形成，視紫質亦可發現此一現象。去 -53· 200303359 —— (48) 發明說明續頁 醣化作用可明顯減少多肽族群中的異質性。 質體的構築方式及轉染至哺乳動物HEK293細胞的方法 如下所述。將帶有經1D4標誌之人類CB1 cDNA轉殖至 pCDNA3.1/Zeo (因威特基因公司）中，並定序之。將Hindlll 及Xhol限制酶併入引子中，其可幫助將此片段續選殖至 pCDNA3.1/Zeo上的複選殖位置上。為了穩定轉染作用，利 用微脂粒轉染胺（Lipofectamine) 2000 (因威特基因公司）將 表現載體轉染至HEK293細胞，以G418進行抗生素篩選及轉 殖體篩選後，利用1D4抗體，以免疫墨潰法分析轉殖體中 受體的表現作用，進而篩選出表現高含量CB1之穩定細胞 株。 利用免疫墨潰法偵測多肽表現的方法如下。將一百萬的 CB1-表現HEK293細胞溶解於含有蛋白酶抑制劑、内核酸酶 及1 mM MgCh之低張緩衝液中，室溫下培養反應5分鐘後， 利用離心作用收集破壞的膜，以緩衝液清洗2次之後’ 將膜溶解於100微升1%内含正_十二基麥芽糖茹之 PBS緩衝液’並以離心方式去除不溶的物質。將1微升的内 糖知S# (西格馬公司pNGase F)加至％微升的樣品中’並在 室溫下培養反應1小時，取出樣品（1〇微补）進行SDS-PAGE ，而後將膠片上的多肽轉潰至硝基纖維素腺上，以5%脫 脂乾燥牛奶阻斷非專一性鍵結丨小時，炎與〇·2微克/毫升 1D4—次柷體培養1小時，清洗之後，將朦與〇·1微克/ ¾升 HRP-共軛二次抗體培養反應丨小時，清洗，存與化學冷光 受質培養反應5分鐘，以照相器偵測訊號。 -54- (49) 200303359 發明說明續貢: 所有上述括號内或 引文，不論是否發表；：广供的雜諸文章、參考及專利 明書參考。 鲨體又覃均—併併入本專利說 雖然本發明係以1 與 r的夂彳& + 处貝例說明參考，但是咸欲了解所進 丁式知改不脫離本發明精神之外。 式簡I 明 圖1所示是在老鼠视網 ^ # 码艇杯狀外邵區段（R〇s)膜上表現 轉殖基因多肽之實例性美、， 、 土因^的运達構築體及標的策略 。薇基因體選殖體中句本去㈡ a甲包3老乳視紫質基因（另稱為視蛋白 基因或桿狀視蛋白基因、t 1 p U )上五個基因外子（El至E5)。該轉殖 基因為G-蛋白偶合受體（GpCR)，其匕端上帶有r〇s標的送 達Λ心（策略匣）。轉殖基因的表現是被老鼠視紫質啟動子 (箭頭的5’端)控制。圖上標示可切除之陽性篩選標幟— 兩側為ΙοχΡ位置）及陰性篩選標幟（DTa)。 圖2所π為在轉殖基因非洲蟾蜍之桿狀外部區段表現人 類大麻受體2 (CB2)實例性構築體。 圖3所示：（A)表現EDG2-GFP-ID4多肽之轉殖基因蝌虫斗眼 睛中GFP融合多肽的螢光影像，（B)結合光學影像及螢光影 像’表現EDG2-GFP-1D4多肽之另一轉殖基因蝌蚪眼晴的側 面影像，（C) EDG2-GFP-1D4轉殖基因蟾蜍視網膜切片之共 焦影像’其顯示綠色螢光在桿狀細胞的外部區段（〇g)上， 及（D)表現CB2-GFP-1D4多肽之轉殖基因蟾蜍視網膜切片 之共焦影像，綠色螢光發現於桿狀細胞外部區段上。Is :内部區段，N ··細胞核，橫線為1〇微米。 -55- 200303359 _ (50) 發明說明續頁 圖4所示（A)為利用含有固定1D4抗體之洋菜膠所進行之 視紫質免疫親合力純化作用，（B)A部分中最為濃縮分液的 純化視紫質之吸收圖譜及（C)桿狀外部區段萃取物（第1行） 及A部分中最為濃縮分液的純化視紫質（第2行）之 SDS-PAGE結果。

-56- 200303359 <110〉 <120〉 表 列 序 表 之 肽 多 之 膜 藥奇ill斯段 N 醫斯C洛 區 特吉寧特部 西西、^斯外 * 1 威爾(L利狀 諾帕李布桿 η

公(P}B 司 k S W e z c 11 a a e o Γ e CT o t z s y z Γ (K 夫} 特Llall 斯(J 士口 恩 卡瓊

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蜍 質蟾 白、^'1 344蛋非 <130> FP-NS 5497 <140> 091133890 <141〉2002-1 1-20 <150〉US 09/990,185 <151〉2001-1 1-21 <160〉11 <170〉FastSEQ視窗版 4.0 <210> 1 <211> 8 <212〉蛋白質 <213〉非洲蟾蜍 <400> 1

Ser $er Ser Gin Val Ser Pro Ala 1 S <210> 2 <211> 25 <212>蛋白質 <213> 非洲蟾蜍 <400> 2

Asp Glu Asp Gly Ser Ser Ala Ala Thr Ser Lys 1 5 10 val Ser Ser Ser Gin Val Ser Pro Ala <210> <211〉 <212〉 <213〉 <400〉 3

Lvs Gin Phe Arg Asn Cys Leu He Thr Thr Leu Cys Cys Gly Lys As π 15 10 15

Pro Phe Gly Asp Glu Asp Gly Ser Ser Ala Ala Thr Ser Lys Thr Glu 20 2S 30

Ala Ser Ser Val ser Ser Ser Gin Val Ser Pro Ala 35 40 200303359 _ 序列表續頁 <210> 4 <211> 8 <212〉蛋白質 <213〉現代人 <400> 4

Glu Thr Ser Gin Veil Ala Pro Ala 1 5 <210> 5 <211〉 9 <212〉蛋白質 <213〉現代人 <400> 5

Thr Glu Thr Ser Gin Val Ala Pro Ala 質牛 白通 615蛋普 <210〉 <211〉 <212〉 <213> <400> 6

Ser Thr Thr Vail $er Lys Thr Glu Thr Ser Gin Val Ala Pro Ala IS 10 IS <210> 7 <211〉34 <212〉DNA <213> 嗜菌體P 1 <400〉 7 ataacttcgt atagoataca ttatacgaag ttat 24 <210> 8 <211〉29 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>合成引子 <400> 8 2i gccgccacca tggaggaatg ctgggtgac <210> 9 <211〉49 <212> DNA <213> 人工序列 序列表續買 200303359 <220> <223>合成引子 <400〉 9 ttaggctgga gccacctggc tggtctccgt cttggaagcg gtggcagag 4$ <210> 10 <211〉 15 <212〉蛋白質 <213〉小家鼠 <400> 10

Ser Ala Thr Ala Ser Lys Thr Glu Thr Ser Gin Val Ala Pro Ala 上 5 10 15 <210〉 11 <211〉1360 <212〉DNA <213> 非洲蟾蜍 <400〉 11 ctttatacat tgctcacaaa tgagttgaac tggcagctca cgaatgggac atggagctgt 60 catttactat gctccccaat gcaagtgcta gagcactaaof gggtgcaaaa agagagctcc 1^0 ttcgtgctaa ttctaaaagc attgatcctg gggcccagct gtgctgtgga agggaaaggg 180 tcaataaagg ggacatctgc aatcttcccc ttcccoacat gaatacagtg ctgcttgatg 240 cag-g-aactga tgaatcccgg tctccctgct ccatttttga g-tacagagac ctgtgaaatc 30〇 tagagaaccig caagacatga ttcaaagtgc taagngcaaa aaacaatggt ggtttatatc 360 tgtctttgta ctttacttgt tcacttacag tccctacaat tgtgtctagt gcagtggtcc 420 CGaaccagta gctcgrttagt aacatgttgc tcccccaacc ccttggatgt tg-ctcccaat 480 ggcctcaaaa caattgctta t£tttcaatt ccaggcaacft tttggttgca taaaaaccag 54〇 gcctatggcc aaacagagee ccctctgggc tgcaaatcca caaagggcta ccaaatagac 600 satcatattc tttattaggc accccaaggg cttttCtcac gcttgtgctg ctccgcaact 660 ctttttacat ttgasitgtgg· cttatgggtfc aaaaaggcgc aacacaaaca aataatctat 72 0

tatttacaca ctagtcaaga ctggtgctca gctgtggttt gaagattcta attcaatgaa /SO ctaatggtaa cc^gggccgg atttggattt ct:gcagcccc taggccatgc ggtcctaacg 64 0 tctgtccacg acgagtctta ttgccatoca cccgcaactc ccgcaagtgc aa^-ttttgga 900 gcaccggtgc tcttcagcaa gtggctcjggc ggcatgccgt coctaaaagt tcgccgccct 960 aggcacaggc ctttgtggcc tctccacaaa tccaagcctg atggtaacta aatgtagagg 1〇20 gaactgagta aaccccaaaa atggctgccc tg^ctcctac aatatggaat tatctcctgt 1080 ^ggtcagacc . tggatttctt c*ctgt：cactt ttaaatacac ttccttcttg tgtgt七taac 1140 agagagagag attgacaggt gtagacttaa tacgtttaag gcjaagccaat taacactttg 1200 caattttagc ttggattaca gtgattaaca gtgcgctaaa tcctttgttc gtgacgctgg 1260 gggttgcaag cttactccag gtgggacttt aaaaggacga ggggacagtg ggtcatactg 1320 tagaacagct tca.gttggga tcacaggctt ctagggatcc 1360

Claims (1)

1. 200303359 拾、申請專利範圍 1 . 一種轉殖基因構築體，其包括編碼光受體專一性調控序 列、膜-關聯多肽及光受體外部區段標的送達訊號之核 酸，其中多肽非為視蛋白。 2.根據申請專利範圍第1項之構築體，其中光受體為桿狀 細胞。 3 .根據申請專利範圍第1項之構築體，其中光受體為桿狀 細胞。 4.根據申請專利範圍第1項之構築體，其中光受體專一性 調控序列為硯紫質啟動子。 5 .根據申請專利範圍第1項之構築體，其中光受體專一性 調控序列為視錐細胞色素啟動子。 6.根據申請專利範圍第1項之構築體，其中光受體專一性 調控序列源自脊椎動物。 7 .根據申請專利範圍第6項之構築體，其中光受體專一性 調控序列源自青蛙。 8 .根據申請專利範圍第6項之構築體，其中光受體專一性 調控序列源自老鼠。 9. 根據申請專利範圍第1項之構築體，其中多肽為0蛋白-偶合受體（GPCR)。 10. 根據申請專利範圍第9項之構築體，其中GPCR為大麻鹼 受體。 11. 根據申請專利範圍第1項之構築體，其中多肽為融合多肽。 12. 根據申請專利範圍第1項之構築體，其中光受體外部區 200303359 _ 申請專利範圍續頁 段標的送達訊號包括SEQ ID NO : 4。 13. 根據申請專利範圍第1項之構築體，其中光受體外部區 段標的送達訊號包括SEQ ID NO : 10。 14. 根據申請專利範圍第1項之構築體，其中光受體外部區 段標的送達訊息源自青蛙視紫質基因或青蛙視錐細胞 色素基因。 15. 根據申請專利範圍第1項之構築體，其中光受體外部區 段標的送達訊息源自老鼠。 16. 根據申請專利範圍第15項之構築體，其中光受體外部區 段標的送達訊息源自老鼠視紫質基因或老鼠視錐細胞 色素基因。 17. —種載體，其包括根據申請專利範圍第1項之構築體。 18. —種細胞，其包括根據申請專利範圍第1項之構築體。 19. 根據申請專利範圍第18項之細胞，其中該細胞為脊椎動 物細胞。 20. 根據申請專利範圍第19項之細胞，其中該細胞為青蛙細 胞。 21. 根據申請專利範圍第19項之細胞，其中該細胞為老鼠細 胞。 22. 根據申請專利範圍第18項之細胞，其中該細胞在老鼠内。 23. 根據申請專利範圍第18項之細胞，其中該細胞分離自老 鼠。 24.根據申請專利範圍第18項之細胞’其中該細胞為桿狀細 200303359 _ 申請專利範圍續頁 25. 根據申請專利範圍弟18項之細胞，其中該細胞為視錐細 胞。 26. —種源自根據申請專利範圍第24項範圍細胞之萃取物 ，其包括該細胞之外部區段膜。 27. —種源自根據申請專利範圍第25項範圍細胞之萃取物 ，其包括該細胞之外部區段膜。 28. —種分離自根據申請專利範圍第24項之細胞或其萃取 物之實質純化轉殖基因多肽，其包括光受體外部區段標 的送達訊息。 29. —種分離自根據申請專利範圍第25項之細胞或其卒取 物之實質純化轉殖基因多肽，其包括光受體外部區段標 的送達訊息。 30. 根據申請專利範圍第18項之細胞，其中該細胞另外包含 功能破壞之視蛋白基因。 31. —種桿狀細胞或其外部區段膜萃取物，其分離自其基因 體包括根據申請專利範圍第1項構築體之脊椎動物。 32. —種源自其基因體包括根據申請專利範圍第1項構築體 之脊椎動物之實質純化轉殖基因多肽，其包括分離自光 受體細胞或其萃取物之光受體外部區段標的送達訊息。 33. —種基因標的送達構築體，其包括編碼含有光受體外部 區段標的送達訊息之膜-關聯多肽之轉殖基因，該轉殖 基因兩侧之V及3’ DNA序列與視紫質基因具有同源性， 其中構築體與視紫質基因間的同源性重組作用導致 該轉殖基因與視紫質-專一性調控序列間會產生人工操 200303359 申請專利範圍續頁 控性結合作用，而其中多肽非為視紫質。 34. 根據申請專利範圍第33項之構築體，其中多肽為0蛋白-偶合受體（GPCR)。 35. 根據申請專利範圍第34項之構築體，其中GPCR為大麻鹼 受體。 36. 根據申請專利範圍第33項之構築體，其中多肽為融合蛋 白。 37. 根據申請專利範圍第33項之構築體，其中光受體外部區 段標的送達訊息包括SEQ ID NO : 4。 38. 根據申請專利範圍第33項之構築體，其中光受體外部區 段標的送達訊息包括SEQ ID NO : 10。 39. 根據申請專利範圍第33項之構築體，其中光受體外部區 段標的送達訊息源自青蛙視紫質基因或青蛙視錐細胞 色素基因。 40. 根據申請專利範圍第33項之構築體，其中光受體外部區 段標的送達訊息源自老鼠視紫質基因或老鼠視錐細胞 色素基因。 41. 根據申請專利範圍第33項之構築體，其另外包括陽性篩 選標記。 42. 根據申請專利範圍第41項之構築體，其中陽性篩選標記 為新黴素抗性基因。 43. 根據申請專利範圍第4 1項之構築體，其中陽性篩選標記 兩侧為ΙοχΡ。 44.根據申請專利範圍第33項之構築體，其另外包括陰性篩 200303359 _ 申請專利範圍讀頁 選標記。 45. 根據申請專利範圍第44項之構築體，其中陰性篩選標記 為白喉桿菌毒素A片段基因。 46. 根據申請專利範圍第33項之構築體，其中視紫質-專一 性調控序列包括視紫質啟動子。 47. 根據申請專利範圍第33項之構築體，其中5’侧DNA序列 包括老鼠視紫質啟動子。 48. 根據申請專利範圍第33項之構築體，其中3 ’侧序列包括 部分之老鼠視紫質基因體外子1。 49. 根據申請專利範圍第33項之構築體，其中3，序列包括 老鼠視紫質基因外子2。 50. —種載體，其包括根據申請專利範圍第33項之構築體。 51. —種細胞，其包括根據申請專利範圍第33項之構築體。 52. —種老鼠細胞，其基因包括： a) —或兩個功能破壞之内因性視紫質基因對偶基因 ，及 b) 編碼包括與視紫質-專一性調控序列人工操控性結 合之光受體外部區段標的送達訊息多肽之轉殖基因， 其中該多肽非為視紫質。 53. 根據申請專利範圍第52項之細胞，其中多肽為GPCR。 54. 根據申請專利範圍第53項之細胞，其中GPCR為大麻鹼受 體。 55. 根據申請專利範圍第52項之細胞，其中多肽為融合蛋白。 56. 根據申請專利範圍第52項之細胞，其中光受體外部區段 200303359 申請專利範圍續頁 標的送達訊息包括SEQ ID NO : 4。 57. 根據申請專利範圍第52項之細胞，其中光受體外部區段 標的送達訊息包括SEQ ID NO : 10。 58. 根據申請專利範圍第52項之細胞，其中光受體外部區段 標的送達訊息源自青蛙視紫質基因或青蛙視錐細胞色 素基因。

   59. 根據申請專利範圍第52項之細胞，其中光受體外部區段 標的送達訊息源老鼠視紫質基因或老鼠視錐細胞色素 基因。 60. 根據申請專利範圍第52項之細胞，其中基因體包括功能 破壞之兩個内因性視紫質對偶基因。 61. 根據申請專利範圍第52項之細胞，其中轉殖基因被插入 一或兩個内因性視紫質對偶基因。 62. 根據申請專利範圍第52項之細胞，其為一種胚胎幹細胞。 63. 根據申請專利範圍第52項之細胞，其係在老鼠内。

   64. 根據申請專利範圍第5 2項之細胞’其分離自老鼠。 65·根據申請專利範圍第52項之細胞，其為桿狀細胞。 66.—種根據申請專利範圍第65項之細胞萃取物，其包括該 細胞外部區段膜。 67. —種分離自根據申請專利範圍第65項之桿狀細胞或其 萃取物之實質純化轉殖基因多肽，其包括光受體外部區 段標的送達訊息。 68. —種桿狀細胞，或其外膜萃取物，其分離自具有如下基 因體之老鼠： -6- 200303359 申請專利範圍績頁 a) —或兩個功能破壞之内因性視紫質基因對偶基因 ，及 b) 編碼包括與視紫質-專一性調控序列人工操控性結 合之光受體外部區段標的送達訊息多肽之轉殖基因， 其中該多肽非為視紫質。 69. —種分離自根據申請專利範圍第6 8項之桿狀細胞或其 萃取物之實質純化轉殖基因多肽，其包括RO S標的送達 訊息。