TR2024019398A2

TR2024019398A2 - Tissue scaffold formed by electrospinning of bacterial cellulose and its production method.

Info

Publication number: TR2024019398A2
Application number: TR2024/019398
Authority: TR
Inventors: Koluman Ahmet; N Gokhan Topal Bahatt; Hakmi Nesrin; A Bayraktar Bed; Thartori Huejda
Original assignee: Osti̇m Tekni̇k Üni̇versi̇tesi̇
Filing date: 2024-12-16
Publication date: 2025-01-21

Abstract

Buluş, biyolojik uyumluluğu yüksek, gözenekli ve işlevsel bir sinir dokusu iskelesi ve bunun üretim yöntemi ile ilgilidir. Buluşta sinir hücrelerinin yenilenme sürecini hızlandırmak amacıyla, aslan yelesi mantarından elde edilen kitosan ile biyouyumluluğu artırılmış ve Acetobacter Xylinum bakterisi kullanılarak üretilmiş selüloz bazlı bir bakteriyel matris kullanılmaktadır. Ayrıca, bu matrisin yüzeyi, polivinil alkol (PVA) çözeltisi ile elektroeğirme yöntemiyle kaplanarak bakteriyel selüloz üzerinde liflerden oluşan bir tabaka meydana getirilmektedir. Bu lifli yapı, gözenekli yapısıyla sinir hücrelerinin tutunmasını ve hareket etmesini (migrasyonunu) destekleyerek rejeneratif süreçlere katkı sağlamaktadır.The invention relates to a highly biocompatible, porous and functional nerve tissue scaffold and its production method. In order to accelerate the regeneration process of nerve cells, a cellulose-based bacterial matrix with increased biocompatibility using chitosan obtained from lion's mane mushroom and produced using Acetobacter Xylinum bacteria is used in the invention. In addition, the surface of this matrix is coated with polyvinyl alcohol (PVA) solution by electrospinning method to form a layer consisting of fibers on bacterial cellulose. This fibrous structure contributes to regenerative processes by supporting the adhesion and movement (migration) of nerve cells with its porous structure.

Description

TARFNAME BAKTERIYAL SELÜLOZUN ELEKTROEGIRMESI iLE OLUSTURULMUS DOKU ISKELESI VE BUNUN ÜRETIM YÖNTEMI Bulusun Ilgili Oldugu Teknik Alan Bulus, Acetobacter Xylinum bakterisinden üretilen selüloz ve aslan yelesi mantarindan elde edilen eklenen kitosan ile biyouyumlulugu optimize edilmis bakteriyel matris ve sinir hücrelerinin kültürlenme etkisini artirmak üzere elektroegrilmis gözenekli polivinil alkol (PVA) kaplama içeren bir doku iskelesi ve bunun üretimi ile ilgilidir. Teknigin Bilinen Durumu Doku mühendisligi, hasar görmüs veya hastalikli dokularin ve organlarin yerine geçebilecek biyolojik yapilar olusturmayi amaçlayan disiplinler arasi bir bilim dalidir. Biyomühendislik, biyoteknoloji, hücre biyolojisi, malzeme bilimi ve biyokimya gibi farkli alanlarin bir araya geldigi bu çalisma alani, vücutta dogal olarak meydana gelen iyilesme süreçlerini desteklemek veya yerine koymak için hücreler, biyomalzemeler ve biyokimyasal faktörler kullanir. Bu teknoloji, laboratuvar ortaminda üretilen yapay dokularla organ nakli ihtiyacini azaltmayi, ilaç gelistirme çalismalarini hizlandirmayi ve daha iyi bir yasam kalitesi saglamayi hedeflemektedir. Doku mühendisligi, günümüzde çesitli alanlarda uygulanmaktadir. Tibbi uygulamalar arasinda kikirdak, kemik, deri, damar, kalp kapakçiklari gibi doku yenileme çalismalari öne çikar. Örnegin, yanik veya büyük yaralanma sonrasi hasarli deri dokusunun yeniden olusturulmasi için biyomühendislik ile üretilen yapay deri kullanilir. Organ rejenerasyonu ise karaciger, pankreas veya böbrek gibi organlarin kismen veya tamamen islev görebilen biyolojik yapilarla yenilenmesi üzerine yogunlasir. Ayrica, ilaç testleri ve gelistirme süreçlerinde laboratuvar ortaminda olusturulan doku modelleri kullanilarak daha güvenilir sonuçlar elde edilir. Kök hücre tedavisi ve gen terapisi gibi yenilikçi yöntemlerle, genetik hastaliklarin tedavisinde de büyük potansiyel sunmaktadir. Doku iskelesi, doku mühendisligi sürecinde hücrelerin büyümesi ve farklilasmasi için fiziksel bir destek saglayan, biyolojik veya sentetik malzemelerden üretilmis üç boyutlu bir yapidir. Bu iskele, hücrelerin baglanabilecegi, çogalabilecegi ve organizasyona girebilecegi bir mikro ortam sunar. Hücreler, iskele üzerinde büyürken biyolojik bir doku olusturur ve zamanla iskele biyolojik olarak parçalanarak yerini dogal dokuya birakir. Doku iskeleleri, vücudun kendini yenileyemedigi durumlarda hasarli dokularin tamirini kolaylastirmak ve yeni doku olusumunu desteklemek için kritik bir öneme sahiptir. Bir doku iskelesinin basarili bir sekilde islev görebilmesi için tasimasi gereken bazi temel özellikler vardir. Ilk olarak, biyouyumluluk önemlidir; iskele, vücut dokulari ile uyumlu olmali ve toksik reaksiyonlara yol açmamalidir. Biyobozunabilirlik, bir diger önemli özelliktir; iskele, doku yenilenme süreci tamamlandiginda biyolojik olarak parçalanarak vücut tarafindan emilmelidir. Mekanik dayaniklilik, iskelenin hedeflenen dokuya uygun mekanik özelliklere sahip olmasini gerektirir. Örnegin, kemik dokusu için daha sert ve saglam bir yapi gerekliyken, kikirdak dokusu için esnek bir yapi tercih edilir. Ayrica, iskele, hücrelerin tutunmasini, çogalmasini ve farklilasmasini desteklemek için mikro gözenekli bir yapiya sahip olmalidir. Vaskülarizasyon (damarlanma) sürecini destekleyerek dokunun beslenmesini ve oksijen alimini kolaylastirmak da önemli bir tasarim kriteridir. Doku iskelesi uygulamalari, birçok yenilikçi ve faydali özellige sahip olmasina ragmen hem laboratuvar asamasinda hem de klinik uygulamalarda çesitli sorunlarla karsilasmaktadir. Bu sorunlardan ilki yeterli biyouyumluluga sahip bir doku iskelesinin elde edilememesidir. Doku iskeleleri vücuda yerlestirildikten sonra bagisiklik sistemi tarafindan yabanci bir madde olarak algilanabilir. Bu durum, inflamasyona veya doku reddine yol açabilir. Biyomalzemelerin toksik veya yan etkileri, iskelelerin güvenli bir sekilde biyouyumlu malzemelerden üretilmesini gerektirir. Ancak her doku tipi için ideal bir malzeme bulunmasi genellikle zordur. Baska bir eksiklik ise hücrelerin yeterince tutunamamasi ve proliferasyon eksikligidir. Hücrelerin iskelenin yüzeyine tutunmasi, çogalmasi ve farklilasmasi istenen doku mühendisligi süreci için kritiktir. Ancak, bazi malzemeler veya yüzey özellikleri hücre tutunmasini yeterince destekleyemeyebilir. Mevcut teknikteki çözümlerin kisitliliklari ve yetersizlikleri, üretilen doku iskelesinin biyouyumlu olmamasi, hücrelerin yeterince tutunamamasi ve proliferasyon eksikligi gibi sebepler dolayisiyla doku iskelesi alaninda bir gelistirme yapilmasi gerekli kilinmistir. Bulusun Kisa Açiklamasi ve Amaçlari Bulus, biyolojik uyumlulugu yüksek, gözenekli ve islevsel bir sinir dokusu iskelesi ile ilgilidir. Bulusta sinir hücrelerinin rejenerasyonunu hizlandirmak üzere aslan yelesi mantarindan elde edilen eklenen kitosan ile biyouyumlulugu optimize edilen ve Acetobacter Xy/inum bakterisinden üretilen selüloz ihtiva eden bir bakteriyel matris içermektedir. Ek olarak söz konusu matris, elektroegrilmis polivinil alkol (PVA) çözeltisi ile kaplanarak bakteriyel selüloz üzerine bir lif tabakasi olusturulmaktadir. Bu elektroegrilmis tabaka, gözenekli bir yapi olusturarak, sinir hücrelerinin migrasyonunu ve tutunmasini desteklemektedir. Bulusun bir amaci, sinir hücrelerinin büyüme ve farklilasmasini hizlandiran bir doku iskelesi elde etmektir. Bulusta kullanilan aslan yelesi mantarindan elde edilen biyoaktif bilesenler, sinir büyüme faktörünü (NGF) uyararak nöronlarin büyümesini ve farklilasmasini tesvik etmektedir. Bulusun baska bir amaci biyouyumlu ve biyobozunur bir doku iskelesi elde etmektir. Bu amaçla bakteriyel selüloz ve aslan yelesi mantarindan elde edilen biyopolimerleri kullanarak biyouyumlu bir yapi olusturulmaktadir. Ayrica, biyobozunurluk sayesinde iskele, sinir dokusu rejenerasyonu tamamlandiginda vücut tarafindan emilir ve yerini dogal dokuya birakir. Bu özellik, ek cerrahi müdahaleye ihtiyaç duyulmamasi ve enfeksiyon riskinin azalmasi gibi avantajlar elde edilmektedir. Ek olarak, bulusta hücrelerin tutunmasini ve migrasyonunu kolaylastiran bir doku iskelesi edilmesi amaçlanmaktadir. Bu amaçla üretim yönteminde kullanilan elektroegirme metodu ile nanolifli yapi elde edilmektedir. Bu sayede hücrelerin tutunmasini ve migrasyonunu kolaylastiran genis bir yüzey alani elde edilmektedir. Bulusun Ayrintili Açiklamasi Bulus, biyouyumlulugu yüksek ve gözenekli bir sinir dokusu iskelesi ile ilgilidir. Bulusa konu doku iskelesi; a. AcetobacterXyIinum bakterisinden elde edilen bakteriyel selüloz matrisi, b. matrisin biyolojik uyumlulugunu optimize etmek üzere aslan yelesi mantarindan elde edilmis toz kitosan, c. sinir hücrelerinin migrasyonunu ve tutunmasini desteklemek üzere bir elektroegrilmis polivinil alkol (PVA) kaplamasi içermektedir. Bulusta aslan yelesi mantarindan elde edilen kitosan ile bakteriyel selüloz matrisinin biyouyumlulugu optimize edilmektedir. Bu matris, elektroegirme yöntemi kullanilarak PVA çözeltisi ile kaplanmaktadir ve bakteriyel selüloz üzerine böylece bir lif tabakasi olusturulmus olur. Bu elektroegrilmis tabaka, gözenekli bir yapi olusturarak, sinir hücrelerinin migrasyonunu ve tutunmasini desteklemektedir. Son olarak, elde edilen gözenekli sinir dokusu iskelesi, kültürlenmis sinir hücreleri ile test edilmektedir ve entegre olmaktadir. Bu kompleks süreç, sinir dokusu mühendisligi alanindaki ilerlemelerin bir örnegi olup, gelecekte nörolojik rehabilitasyon ve sinir rejenerasyonu uygulamalarinda kullanilabilecek potansiyeli yansitmaktadir. Bu çalisma, biyomalzeme bilimi, mikrobiyoloji ve nöroloji alanlarinda kapsamli bir multidisipliner yaklasimin basarili bir örnegini temsil etmektedir. Bulusa konu sinir dokusu iskelesinin üretim yöntemi; a. Acetobacter Xylinum bakterisinin 10 gram pepton bakteriyel, 20 gram glikoz, gram sakkaroz, 1 gram kafein içeren besleme ortaminda en az üç haftalik bir fermentasyon sürecine tabi tutulmasi, b. aslan yelesi mantarlarinin yikanmasi, blenderde parçalanmasi, en az 10 gün oda sicakliginda kurutulmasi, c. elde edilen aslan yelesi mantari numunesinin demineralizasyon basamaginda çözeltisine eklenmesi, ardindan numunenin 500 rpm'de 15 dakika 50'de karistirilarak distile su ile nötr olana kadar yikanmasi ve yikanan numunenin en az 7 gün oda sicakliginda kurutulmasi, . numunedeki proteinin uzaklastirilmasi adiminda 1/20 g/mL oraninda 2M sodyum hidroksit (NaOH) içinde 4 saat 80°C'de 700 rpm ile karistirilmasi, ardindan distile su ile yikanmasi ve en az 7 gün boyunca oda sicakliginda kurutulmasi, . numuneden elde edilen kitinin deasetilasyon adiminda 1/10 g/mL oraninda ile nötr olana kadar yikanmasi ve en az 7 gün boyunca oda sicakliginda kurutulmasi ile kitosanin elde edilmesi, fermentasyon sonucunda elde edilen bakteriyel selüloz matrisine ögütülerek toz haline getirilmis en az agirlikça %1 oraninda kitosanin homojen bir sekilde serpilmesi, fazla kitosanin silkelenmesi ve kaplamadaki bosluklarin üzerine tekrar serpilmesi ve fazla kitosanin tekrar silkelenmesi ile ince bir katman kitosan kaplamasinin elde edilmesi, . ardindan bakteriyel selüloz matrisinin etüv ortaminda 40°C'ta 4-7 gün boyunca kurutulmasi, . hücre kültüründe hazir sinir hücresinin süspansiyon haline getirilmesi, 3000 rpm/dk hizinda santrifüj ile sinir hücrelerinin elde edilmesi ve elde edilen sinir hücrelerinin mikroskop altinda tek tek alinarak iskelenin yüzeyine yayarak bakteriyel selüloz matrisine sinir hücrelerinin entegre edilmesi, agirlikça %10 polivinil alkolün (PVA) suda çözülmesi ve 65°C'de 2 saat manyetik karistiricida homojenize edilmesi, bakteriyel selüloz matrisinin elde edilen PVA çözeltisi ile 14.000 V, 15 cm mesafeden, saatte 1 mL akis hizi parametreleri kullanilarak elektroegirme yöntemi ile kaplanmasi TR TR TR TR TR TRDESCRIPTION TISSUE SCABEL FORMED BY ELECTROSPINING BACTERIAL CELLULOSE AND ITS PRODUCTION METHOD Technical Field to Which the Invention Relates The invention relates to a tissue scaffold comprising cellulose produced from Acetobacter Xylinum bacterium and added chitosan obtained from lion's mane fungus, a bacterial matrix with optimized biocompatibility, and an electrospun porous polyvinyl alcohol (PVA) coating to increase the culturing effect of nerve cells, and its production. State of the Art Tissue engineering is an interdisciplinary branch of science that aims to create biological structures that can replace damaged or diseased tissues and organs. This field of study, which brings together diverse fields such as bioengineering, biotechnology, cell biology, materials science, and biochemistry, uses cells, biomaterials, and biochemical factors to support or replace the body's naturally occurring healing processes. This technology aims to reduce the need for organ transplants, accelerate drug development, and provide a better quality of life through laboratory-produced artificial tissues. Tissue engineering is currently being applied in various fields. Among its medical applications, tissue regeneration studies such as cartilage, bone, skin, blood vessels, and heart valves stand out. For example, bioengineered artificial skin is used to regenerate damaged skin tissue after burns or major injuries. Organ regeneration, on the other hand, focuses on replacing organs such as the liver, pancreas, or kidneys with partially or fully functional biological structures. Furthermore, more reliable results are achieved by using tissue models created in laboratory settings in drug testing and development processes. Innovative methods such as stem cell therapy and gene therapy also offer great potential in the treatment of genetic diseases. A tissue scaffold is a three-dimensional structure made of biological or synthetic materials that provides physical support for cell growth and differentiation during the tissue engineering process. This scaffold provides a microenvironment in which cells can attach, proliferate, and organize. As cells grow on the scaffold, they form a biological tissue, and over time, the scaffold biodegrades, giving way to natural tissue. Scaffolds are critical for facilitating the repair of damaged tissues and supporting the formation of new tissue in situations where the body cannot regenerate itself. There are several key characteristics that a tissue scaffold must possess for its successful function. First, biocompatibility is important: The scaffold should be compatible with body tissues and not cause toxic reactions. Biodegradability is another important property; the scaffold should biodegrade and be absorbed by the body once the tissue regeneration process is complete. Mechanical durability requires that the scaffold possess mechanical properties appropriate for the target tissue. For example, a more rigid and robust structure is required for bone tissue, while a flexible structure is preferred for cartilage. Furthermore, the scaffold should have a microporous structure to support cell adhesion, proliferation, and differentiation. Facilitating tissue nutrition and oxygen uptake by supporting the vascularization process is also an important design criterion. Despite possessing many innovative and beneficial features, tissue scaffold applications face several challenges both in laboratory and clinical applications. The first of these is the inability to obtain a scaffold with sufficient biocompatibility. Once implanted in the body, tissue scaffolds can be perceived by the immune system as foreign substances. This can lead to inflammation or tissue rejection. The toxic or side effects of biomaterials necessitate that scaffolds be manufactured from safely biocompatible materials. However, finding an ideal material for every tissue type is often challenging. Another shortcoming is insufficient cell adhesion and lack of proliferation. Cell adhesion, proliferation, and differentiation on the scaffold surface are critical to the desired tissue engineering process. However, some materials or surface properties may not adequately support cell adhesion. Due to the limitations and inadequacies of existing technical solutions, the inadequacy of the produced scaffolds, insufficient cell adhesion, and lack of proliferation, development in the field of tissue scaffolding has become necessary. Brief Description and Objectives of the Invention The invention relates to a highly biocompatible, porous, and functional nerve tissue scaffold. The invention comprises a bacterial matrix containing cellulose produced from Acetobacter Xy/inum bacteria, with optimized biocompatibility, and added chitosan obtained from the lion's mane mushroom to accelerate the regeneration of nerve cells. Additionally, the matrix is coated with an electrospun polyvinyl alcohol (PVA) solution to form a fiber layer on the bacterial cellulose. This electrospun layer creates a porous structure, supporting the migration and adhesion of nerve cells. One aim of the invention is to obtain a tissue scaffold that accelerates the growth and differentiation of nerve cells. The bioactive components obtained from the lion's mane mushroom used in the invention promote the growth and differentiation of neurons by stimulating nerve growth factor (NGF). Another aim of the invention is to obtain a biocompatible and biodegradable tissue scaffold. For this purpose, a biocompatible structure is created using bacterial cellulose and biopolymers obtained from lion's mane fungus. In addition, thanks to biodegradability, the scaffold is absorbed by the body and replaced by natural tissue when nerve tissue regeneration is completed. This feature provides advantages such as eliminating the need for additional surgical intervention and reducing the risk of infection. In addition, the invention aims to produce a tissue scaffold that facilitates cell adhesion and migration. For this purpose, a nanofibrous structure is obtained by the electrospinning method used in the production method. In this way, a large surface area that facilitates cell adhesion and migration is obtained. Detailed Description of the Invention The invention relates to a highly biocompatible and porous nerve tissue scaffold. The scaffold of the invention consists of; a. The present invention includes a. ... This complex process exemplifies advances in neural tissue engineering and reflects the potential for future applications in neurological rehabilitation and nerve regeneration. This study represents a successful example of a comprehensive multidisciplinary approach in the fields of biomaterials science, microbiology, and neurology. The production method for the neural tissue scaffold in question is as follows; a. Fermentation of Acetobacter Xylinum bacteria in a nutrient medium containing 10 grams of bacterial peptone, 20 grams of glucose, 1 gram of sucrose, and 1 gram of caffeine for at least three weeks, b. Washing the lion's mane mushrooms, crushing them in a blender, and drying them at room temperature for at least 10 days, c. the obtained lion's mane mushroom sample is added to the solution in the demineralization step, then the sample is mixed at 500 rpm for 15 minutes and washed with distilled water until it becomes neutral and the washed sample is dried at room temperature for at least 7 days, . in the step of removing the protein in the sample, it is mixed with 700 rpm at 80 ° C for 4 hours in 2M sodium hydroxide (NaOH) at a ratio of 1/20 g/mL, then washed with distilled water and dried at room temperature for at least 7 days, . Obtaining chitosan by washing the chitin obtained from the sample with a ratio of 1/10 g/mL in the deacetylation step until it becomes neutral and drying it at room temperature for at least 7 days, homogeneously sprinkling chitosan at a rate of at least 1% by weight, which is ground into powder, onto the bacterial cellulose matrix obtained as a result of fermentation, shaking off excess chitosan and sprinkling it again on the gaps in the coating and shaking off excess chitosan again to obtain a thin layer of chitosan coating, then drying the bacterial cellulose matrix in an oven at 40 ° C for 4-7 days, Suspending the prepared nerve cell in cell culture, obtaining nerve cells by centrifuging at 3000 rpm/min, taking the obtained nerve cells one by one under a microscope and spreading them on the surface of the scaffold to integrate the nerve cells into the bacterial cellulose matrix, dissolving 10% polyvinyl alcohol (PVA) by weight in water and homogenizing it at 65°C for 2 hours in a magnetic stirrer, coating the bacterial cellulose matrix with the obtained PVA solution by electrospinning using the parameters of 14,000 V, 15 cm distance, 1 mL flow rate per hour.

Claims

REQUESTS

1. It is a highly biocompatible and porous nerve tissue scaffold, and it is characterized by; a. Bacterial cellulose matrix obtained from Acetobacter Xylinum bacteria, b. Powdered chitosan obtained from lion's mane mushroom to optimize the biocompatibility of the matrix, c. An electrospun polyvinyl alcohol (PVA) coating to support the migration and adhesion of nerve cells.

2. A production method of a nerve tissue scaffold according to claim 1, characterized in that; The Acetobacter Xylinum bacteria were subjected to a fermentation process of at least three weeks in a feeding medium containing 10 grams of peptone bacterial, 20 grams of glucose, 30 grams of sucrose, 1 gram of caffeine, washed the lion's mane mushrooms, crushed them in a blender, dried at room temperature for at least 10 days, the obtained lion's mane mushroom sample was added to the solution in the demineralization step, then the sample was mixed at 500 rpm for 15 minutes at 50°C and washed with distilled water until neutral and the washed sample was dried at room temperature for at least 7 days, and the protein in the sample was removed by mixing it in 2M sodium hydroxide (NaOH) at a ratio of 1/20 g/mL for 4 hours at 80°C with 700 rpm, then washing with distilled water and drying at room temperature for at least 7 days, mixing the chitin obtained from the sample in the deacetylation step at 1/10 g/mL in 60% NaOH at 700 rpm at 90°C for 4 hours, then washing with distilled water until it becomes neutral and drying at room temperature for at least 7 days to obtain chitosan, sprinkling at least 1% by weight chitosan, which has been ground into powder, onto the bacterial cellulose matrix obtained as a result of fermentation in a homogeneous manner, shaking off excess chitosan and sprinkling it again on the gaps in the coating and shaking off excess chitosan again to obtain a thin layer chitosan coating, . then drying the bacterial cellulose matrix in an oven at 40°C for 4-7 days, The process includes the following steps: suspending the nerve cell ready in cell culture, obtaining the nerve cells by centrifuging at 3000 rpm/min and integrating the nerve cells into the bacterial cellulose matrix by spreading the obtained nerve cells on the surface of the scaffold under a microscope, dissolving 10% polyvinyl alcohol (PVA) by weight in water and homogenizing it at 65°C for 2 hours in a magnetic stirrer, coating the bacterial cellulose matrix with the obtained PVA solution by electrospinning using the parameters of 14,000 V, 15 cm distance, 1 mL flow rate per hour.