TR2024011369A2 - Kan plazmasinda cu(ii)-neokuproi̇n kompleksi̇ne (cuprac reakti̇fi̇ne) dayali yeni̇ bi̇r kolori̇metri̇k glukoz ve total kolesterol tayi̇n yöntemi̇ - Google Patents

Abstract

Buluş, glukoz dehidrogenaz (GDH) ve kolesterol oksidaz (KOx) enzimlerinin kullanılmasıyla kan plazmasında bulunan glukoz ve total kolesterol miktarlarının Cu(II)-Neokuproin Kompleksi (CUPRAC Reaktifi) ile kolorimetrik olarak saptanmasını sağlayan bir yöntem ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME KAN PLAZMASINDA CU(II)-NEOKUPROIN KOMPLEKSINE (CUPRAC REAKTIFINE) DAYALI YENI BIR KOLORIMETRIK GLUKOZ VE Teknik Alan Bulus, glukoz dehidrogenaz (GDH) ve kolesterol oksidaz (KOX) enzimlerinin kullanilmasiyla kan plazmasinda bulunan glukoz ve total kolesterol miktarlarinin Cu(II)-Neokuproin Kompleksi (CUPRAC Reaktifi) ile kolorimetrik olarak saptanmasini saglayan bir yöntem ile ilgilidir. Önceki Teknik Kandaki glukoz tayini hekzokinaz/glukoz-6P dehidrogenaz (G6PH) içeren hekzokinaz deney kiti kullanilarak klinik olarak dogrulanmis spektrofotometrik yöntemle hastanelerde gerçeklestirilmektedir. Bu prosedürde glukoz, ATP ve heksokinaz varliginda glukoz-6-fosfata (G6P) dönüstürülmekte, daha sonra G6P, NADP+ varliginda G6PH ile 6-Fosfoglukonata yükseltgenmektedir. Son asamada, enzimatik olarak üretilen NADPH'nin A = 340 nm'de spektrofotometrik ölçümü alinarak kan plazmasinda glukoz tayinleri gerçeklestirilmektedir. Kanda kolesterol tayini ise Roche kolesterol testi kiti ile üçlü enzim sistemi kullanilarak hastanelerde kolorimetrik olarak gerçeklestirilmektedir. Bu yöntemde kolesterol esterleri, kolesterol esterazin (CE) etkisiyle bölünerek serbest kolesterol ve yag asitlerini ortaya çikarmaktadir. Ardindan kolesterol oksidaz (KOX) varliginda kolesterol, kolest-4-en-3-on,a yükseltgenir ve enzimatik reaksiyon sonucunda hidrojen peroksit olusur. Olusan hidrojen peroksit, peroksidazin (POD) varliginda fenol ve 4-aminofenazonun oksidatif baglanmasini etkileyerek kirmizi kinon-imin boya olusmasina neden olur, olusan boyanin renk yogunlugu kolesterol derisimi ile dogru orantilidir, A = 505 nm'de spektrofotometrik ölçümler alinarak kan plazmasinda kolesterol tayinleri gerçeklestirilmektedir. Ayrica Holmes ve arkadaslarina ait USl 1009516 sayili patent dokümaninda çoklu analizlere olanak saglayan sistem ve yöntemleri içeren bir çalismada az miktarda alinan kan örnegi ile 14 farkli analiz gerçeklestirilmektedir. Bu çalismada 120 ML kan örnegi bir anti-koagülan olan EDTA veya heparin (80 uL,si EDTA ve 40 uL,si heparin) ile karistirilmis ve iki farkli anti-koagülan içeren numune için iki ayri kaba aktarilmistir. Kan hücrelerini kan plazmasindan ayirmak için kaplar 1200 g'de 5 dakika santrifüjlenmistir. Çalismada toplam protein tahlili için, 10 ML EDTA içeren seyreltilmis plazma alinarak üzerine 20 ML bakir (II) sülfat içeren toplam protein tahlili reaksiyon karisimi eklenmistir. Inkübasyon sonrasinda olusan bakir protein kompleksinin ?F 540 nm'de spektrofotometrik ölçümleri alinarak kan plazmasindan toplam protein tayini gerçeklestirilmistir. Glukoz tahlili için 10 ML heparin içeren seyreltilmis plazma üzerine GOX içeren karisim eklenmistir. GOX ve kan plazmasindaki glukoz arasinda gerçeklesen enzimatik tepkimede, glukoz, glukonik aside yükseltgenirken; 02, H202'ye indirgenir. Daha sonra bu çözeltiye horseradish peroksidaz (HRP), 4- aminoantipirin ve 4-hidroksibenzoik asit içeren ikinci bir glukoz tahlil reaksiyon karisimi eklenmektedir. Birinci enzimatik tepkime sonrasinda olusan H202 ile 4- aminoantipirin ve 4-hidroksibenzoik varliginda HRP enzimi ile ikinci bir enzimatik reaksiyon gerçeklesir ve glukoz derisimine bagli olarak olusan renkli kinon-imin bilesiginin ?t = 510 nm'de spektrofotometrik ölçümleri alinarak kan plazmasindan glukoz tayini gerçeklestirilir. Toplam kolesterol tahlili için ise 10 ML EDTA içeren seyreltilmis plazma üzerine CE, KOX, HRP, N-etil-N-(2-hidroksi-3-sülfo propil)-3,5- dimetoksianilin (ALPS) ve 4-aminoantipirin içeren toplam kolesterol tahlil reaksiyon karisimi eklenmis ve ?t = 500 nm'de spektrofotometrik ölçümler alinmistir. Bu yöntemde de kolesterolün CE enzimiyle tepkimesi sonucu serbest kolesterol ve yag asitleri olusmaktadir. Ardindan KOX varliginda kolesterol, kolest-4-en3-on,a yükseltgenir ve enzimatik reaksiyon sonucunda H202 olusur. Olusan H202, HRP enzimi varliginda ALPS ve 4-aminoantipirin ile kolesterol derisimine bagli olarak 500 nmade absorbans veren renkli boya bilesigini olusturmaktadir. Daha sonra absorbans degisim oranini belirlemek için belirli bir süre sonra absorbans ölçümü tekrarlanmistir. Degisim orani üzerinden bir kalibrasyon egrisi çizilerek plazmadaki toplam kolesterol miktari tayini gerçeklestirilmistir. Kullanilan bu çoklu enzim sistemleri sadece bir numune için ölçüm yapmaya olanak tanimakta ve glukoz için hekzokinaz/glukoz-6P dehidrogenaz enzimleri, kolesterol için kolesterol esteraz/kolesterol oksidaz/peroksidaz tekrar kullanilamamaktadir. Enzimler pahali ürünler oldugu için bu durum hem çalisma maliyetini arttirmakta hem de enzim israfina sebep olmaktadir. Ayrica hastanelerde uygulanan glukoz tayin kiti ile sonuçlar UV bölgeye çok yakin bölgede 340 nmade alinmaktadir, bu dalga boyunda absorbans yapacak girisimcilerin olma olasiligi mevcuttur. USl 1009516B2 sayili patent dokümaninda, çoklu analiz için gelistirilmis yöntem ve sistemlerden bahsedilmektedir. Dokümanda Cu2+ iyonlari total protein analizi için kullanilmakta olup kan plazmasina bakir (II) sülfat içeren toplam protein tahlili reaksiyon karisimi eklenerek 540 nm,de ölçüm alinmaktadir. Teknikte var olan çalismalar incelendiginde glukoz dehidrogenaz (GDH) ve kolesterol oksidaz (KOX) enzimlerinin kullanilmasiyla kan plazmasinda bulunan glukoz ve total kolesterol miktarlarinin Cu(II)-Neokuproin Kompleksi (CUPRAC Reaktifi) ile kolorimetrik olarak saptanmasini saglayan bulus konusu yöntemin gelistirilmesi ihtiyaci duyulmustur. Bulusun Amaçlari Bu bulusun amaci, glukoz dehidrogenaz (GDH) ve kolesterol oksidaz (KOX) enzimlerinin kullanilmasiyla kan plazmasinda bulunan glukoz ve total kolesterol miktarlarinin Cu(II)-Neokuproin Kompleksi (CUPRAC Reaktifi) ile kolorimetrik olarak saptanmasini saglayan bir yöntemin gelistirilmesidir. Bu bulusun bir baska amaci, kan plazmasinda bulunan ve hastaliklarin teshisi sirasinda önemli olan glukoz ve kolesterol miktarlarinin hassas ve hizli bir sekilde saptanmasina olanak saglayan bir yöntemin gelistirilmesidir. Bulusun Ayrintili Açiklamasi Bu bulusun amacina ulasmak için gerçeklestirilen yönteme iliskin görseller ekli sekillerde gösterilmistir. Bu sekiller; Sekil 1A: 1,5 mM NAD+ ortaminda farkli derisimlerde glukoz içeren çözeltilerin GDH immobilize Si02@Fe3O4 ile 30 dk etkilesimden sonra enzimatik tepkimeyle açiga çikan NADHanin [Cu(Nc)2]2+ ile kolorimetrik tepkimesi sonucu olusan Sekil 1B: Bulus konusu yöntemde glukoz için elde edilen dinamik aralik grafiginin görünümüdür. (n=3) Sekil 1C: Bulus konusu yöntemde glukoz için elde edilen dogrusal kalibrasyon grafiginin görünümüdür. (n=3) Sekil 2A: Farkli derisimlerde kolesterol içeren çözeltilerin KOX immobilize Si02@Fe3O4 ile 30 dk etkilesimden sonra enzimatik tepkimeyle açiga çikan H202,nun [Cu(NC)2]2+ ile kolorimetrik tepkimesi sonucu olusan [Cu(NC)2]+,nin UV-VIS bölgesinde kaydedilen spektrumlarinin görünümüdür. Sekil 2B: Bulus konusu yöntemde kolesterol için elde edilen dinamik aralik grafiginin görünümüdür. (n=3) Sekil 2C: Bulus konusu yöntemde kolesterol için elde edilen dogrusal kalibrasyon grafiginin görünümüdür. (n=3) Bulus, glukoz dehidrogenaz (GDH) ve kolesterol oksidaz (KOX) enzimlerinin kullanilmasiyla kan plazmasinda bulunan glukoz ve total kolesterol miktarlarinin Cu(ll)-Neokuproin Kompleksi (CUPRAC Reaktifi) ile kolorimetrik olarak saptanmasini saglayan bir yöntem ile ilgili olup, - glukoz dehidrogenaz (GDH) veya kolesterol oksidaz (KOX) enzimlerinin manyetik nanopartiküllere tutturulmasi, - KOX ile kolesterolün tepkimesi sonucu olusan H202 ve GDH ile glukozun tepkimesi sonucu olusan NADHain miknatis yardimiyla ayrilmasi, - miknatis yardimiyla ayrilan H2]2+ ile kolorimetrik tepkimesi sonucu olusan [Cu(Nc)2]+ kompleksinin absorbans ölçümü yapilarak kandaki glukoz veya total kolesterolün hesaplanmasi adimlarini içermektedir. Bulus konusu yöntemde kolorimetrik tepkimelerin gerçeklestirilmesi sirasinda toplam antioksidan kapasite (TAC) tayininde kullanilmak üzere 2004 yilinda Apak ve arkadaslari tarafindan gelistirilen ve patenti alinan (l48/002-P) CUPRAC reaktifi kullanilmaktadir.1 Alinan kan plazmasi örnekleri girisim yapacak bilesenleri uzaklastirmak amaciyla etanol ile seyreltilmistir. Etanol ile girisim yapabilecek proteinlerin çöktürülmesi sirasinda glukoz ve kolesterol analiti çözelti fazinda kalmaktadir. Bulusta ilk olarak enzimler literatüre göre sentezlenen manyetik nanopartiküllere (Si02@Fe304 nanoparçaciklari) kitosan ve ardindan glutaraldehit çapraz baglama yoluyla tutturulmus ve gerekli optimum kosullar (enzim miktari, manyetik nanopartikül miktari ve enzimatik reaksiyon süresi) belirlenmistir. Kan plazmasi içerisinde bulunan toplam kolesterol, KOX ile kolesterolün tepkimesi sonucu olusan H202 üzerinden tayin edilmektedir. Kan plazmasi içerisinde bulunan glukoz miktari ise GDH ile glukozun tepkimesi sonucu olusan NADH üzerinden tayin edilmektedir. Enzimatik tepkime sonucu açiga çikan H202 ve NADH çözeltilerinden magnetik nanopartiküller miknatis yardimiyla kolaylikla ayrilarak farkli bir ortama alinabilmektedir. Ikinci adimda ise enzimatik tepkime sonucu olusan ve miknatis ile ayrilma sonucu baska bir kaba alinan H2]2+ ile kolorimetrik tepkimesi sonucu olusan sari turuncu renkli [Cu(Nc)2]+ kompleksinin 450 nmade absorbans ölçümü yapilarak hesaplanmaktadir. Bu çalismada GDH enzimine bagli glukoz biyosensörü mekanizmasina göre önce NAD+ varliginda Si02@Fe3O4 üzerindeki GDH ve çözeltideki glukoz arasinda enzimatik bir tepkime gerçeklesir. Bu reaksiyonun sonunda, glukoz glukonik aside yükseltgenirken; koenzim NAD+ NADH'ye indirgenir. GDH ile immobilize edilmis Si02@Fe3O4 nanoparçaciklari bir miknatisla ayrildiktan sonra, CUPRAC reaktifi ile enzimatik olarak üretilen NADH arasinda kolorimetrik tepkime gerçeklesir. Bu reaksiyondan sonra, glukoz biyosensörü, olusan sari-turuncu [Cu(Nc)2]+ kompleksinin 450 nm'de absorbansinin ölçümüne dayali olarak olusturulur. KOX biyosensörüne ait mekanizmaya göre önce moleküler 02 varliginda Si02@Fe304 üzerindeki KOX ve çözeltideki kolesterol arasinda enzimatik bir tepkime gerçeklesir. Bu reaksiyonun sonunda kolesterol kolestenona yükseltgenirken; 02 H202'ye indirgenir. KOX ile immobilize edilmis Si02@Fe304 nanoparçaciklari bir miknatisla ayrildiktan sonra, CUPRAC reaktifi ile enzimatik olarak üretilen H202 arasinda ikinci bir reaksiyon gerçeklesir. Bu reaksiyondan sonra, kolesterol biyosensörü, olusan sari- turuncu [Cu(NC)2]+ kompleksinin 450 nm'de absorbansinin ölçümüne dayali olarak olusturulur. Bu bulus ile enzimatik tepkime sonucu glukoz ve total kolesterolün kan plazmasindaki tayini kolorimetrik olarak dogru ve hassas bir sekilde gerçeklestirilmektedir. Yöntemde kullanilan oksidaz enzimine dayali tepkime: Kolesterol + 02 _9; Kolestenon + H202 .......................... (Enzimatik tepkime) Yöntemde kullanilan dehidrogenaz enzimine dayali tepkime: Glukoz + NAD+ --- Glukonik asit + NADH + H+ .............. (Enzimatik tepkime) 2 [Cu(Nc) Bulus konusu yöntem ile glukoz dehidrogenaz veya kolesterol oksidaz enzimi kullanilarak kan plazmasinda glukoz veya total kolesterol tayini gerçeklestirilmektedir. Bahsedilen enzimler Si02@Fe304 nanoparçaciklari üzerine tutturuldugu için tekrar tekrar kullanima olanak saglayarak maliyeti düsürmekte ve israfi önlemektedir. Kanda glukoz tayini için GDH-Si02@Fe3O4 nanoparçaciklari, kanda kolesterol tayini için ise KOX-Si02@Fe3O4 nanoparçaciklari defalarca kullanilarak kararli sonuçlar elde edilmistir. Önerilen yöntem ile spektroskopik ölçümler 450 nm görünür bölgede alinarak UV bölgede olabilecek girisimlerin önüne geçilmektedir. Ayrica 340 nmade NADPHanin molar sogurma katsayisi (6600 L/mol.cm) [Cu(NC)2]+,nin 450 nm,deki molar sogurma katsayisindan daha düsüktür. Dolayisiyla bulus konusu yöntem ile kan plazmasinda glukoz ve total kolesterol analizine olanak taniyan maaliyeti düsük ve temiz ürün kimyasini içeren CUPRAC reaktifi kullanima dayali bir yöntem gelistirilmistir. Genel olarak bir biyosensör, hedef analitin konsantrasyonuyla orantili bir sinyal üreterek fizyolojik, biyokimyasal degisim veya belirli bir analitin (ölçülmesi gereken kimyasal veya biyolojik bir madde) varligina iliskin bilgileri tespit eden, ileten ve kaydeden analitik bir cihazdir. Biyosensörler biyolojik tanimlayici katman (biyoreseptör) ve dönüstürücü olmak üzere iki temel bilesenden olusmaktadir. Biyoreseptör spesifik olarak hedef analiti tanir. Bulusta bahsedilen glukoz ve kolesterol biyosensörlerinde Si02@Fe3O4 nanoparçaciklari yüzeyine kitosan ve ardindan glutaraldehit çapraz baglama yoluyla tutturulmus GDH veya KOX enzimi biyoreseptör göreVini üstlenmektedir. Bu biyoreseptörler yani GDH enzimi NAD+ varliginda glukoz ile KOX enzimi ise kolesterol ile etkileserek H202 veya NADH derisimi (kimyasal sinyalleri) olusturur. Enzimatik tepkime sonucu elde edilen H202 veya NADH çözeltileri CUPRAC reaktifi ile kolorimetrik bir tepkimeye daha sokulur ve elde edilen kimyasal sinyaller UV-VIS spektrofotometresi yardimiyla (ölçülebilen büyüklü olarak elektronik sinyallere) absorbansa dönüstürülür. Yöntemde manyetik nanopaitiküllere immobilize edilmis GDH ve KOX enzimleri ile substratlarinin (GDH için glukoz, KOX için kolesterol) tepkimesi sonucu olusan H2]2+ ile tepkimesinden yararlanilmaktadir, kolorimetrik reaksiyon sonucu olusan sari renkli [Cu(Nc)2]+ kompleksinin 450 nm,deki absorbansi ölçülerek kanda glukoz ve kolesterol tayini yapilmaktadir. Bulusta ilk olarak literatürden yararlanilarak Fe3O4 sentezi gerçeklestirilmistir. Bu amaçla Zhang ve arkadaslarinin 2020 yilinda gerçeklestirdigi bir çalisma çözülmüs ve ortamdan 02 uzaklastirmak amaciyla 10 dakika boyunca Argon gazi geçirilmistir. Sistemden Argon gazi geçirmeye devam edilerek pH 9,0 olana kadar derisik NH3 ilave edildi. Daha sonra hazirlanan çözelti 60 dakika boyunca 80 0C,de bekletilerek siyah renkli manyetik Fe304 parçaciklarin çöktügü gözlenmistir. Olusan siyah renkli Fe304 miknatis yardimiyla ayrilarak nötral pH"a gelene kadar saf suyla yikanmistir. Daha sonra etanol ile yikanarak 50 0Cade vakum etüVünde 24 saat kurutulmus ve 5,6 g manyetik Fe3O4 nanopartikül elde edilmistir. 6 Magnetik Nanopaitiküllerin Silanizasyonu: Magnetik nanopartiküllerin daha kararli olmasi ve daha etkili bir enzim immobilizasyonu için yüzeyinin önce Tetraetoksisilan (TEOS) daha sonra Aminopropil)trietoksisilan (APTES) ile silanlanmasi literatüre göre gerçeklestirilmistir. Ilk asamada Fe304 nanopartikülleri TEOS ile kaplandi. Bu dk ultrasonik banyoda bekletildi. Ortama 2,5 mL derisik NH3 ilave edildikten sonra 2 mL TEOS eklendi. Son dispersiyon, oda sicakliginda 20 saat boyunca mekanik olarak sürekli karistirildi. Manyetik Fe304/Si02 nanoparçaciklari miknatisla ayrilarak toplandi ve sirayla etanol ve saf su ile yikandi.2 Ikinci asamada nanopartiküller APTES ile kaplandi. Bu amaçla 1,0 g Fe304/Si02 nanoparçaciklari 60 ml etanol içinde yaklasik 1 saat ultrasonik banyoda bekletildi, ardindan 6,0 ml derisik NH3 ilave edildi ve 10 dakika homojenize etmek için yine ultrasonikasyona tabi tutuldu. Sürekli mekanik karistirma altinda, karisima 4,0 mL APTES ilave edildi. Reaksiyon 8 saat boyunca 50°C'de mekanik olarak karistirildi. Elde edilen ürünler daha sonra miknatis ile manyetik olarak ayrildi ve nötr olana kadar etanol ve deiyonize su ile iyice yikandi. Son olarak, APTES ile modifiye edilmis Fe oda sicakliginda vakum altinda 24 saat kurutuldu. 3 Enzim immobilizasyonu: Bulusta kullanilmak üzere enzim immobilizasyonun 1. adiminda 15 mg rpmade 1 saat karistirilip, miknatisla ayrilip saf su ile iyice yikandiktan sonra ikinci adima geçilmistir. Ikinci adimda miknatisla ayrilan nanopartiküllere 1 mL pH ve 300 uL glutaraldehit ilave edildikten sonra sirasiyla 150 rpm,de 1 saat karistirma, miknatisla ayirma ve pH 5,0 PBS ile yikama islemi uygulanmistir. Üçüncü adimda ise glutaraldehit ile islem görmüs nanopartiküllere yine 1 mL pH 5,0 PBS ve optimize edilen miktarda enzim ilave edilip, 150 rpmade 1 saat karistirma, miknatisla ayirma ve pH 5,0 PBS ile yikama islemleri uygulanmistir. Son adimda yüzeye adsorplanmis nonspesifik enzimleri uzaklastirmak için %1 Bovine Serum Albumin (BSA) ile yikama (150 rpm,de 1 saat karistirilarak), miknatisla ayirma ve pH 5,0 PBS ile yikama islemleri uygulanarak enzim immobilize Si02@Fe3O4,ler kullanima hazir hale getirilmistir. Enzim immobilizasyon esnasinda kullanilmak üzere GDH miktari 0,4 mg, KOX olarak optimize edilmistir. Tasarlanan biyosensörlerin analitik performans çalismalari: GDH enzimine dayali gelistirilen glukoz biyosensörünün analitik performans çalismalarina ait spektrum ve grafikler Sekil 1,de verilmistir. Sekilde kaydedilen spektrumlardan, absorbansin glukoz derisimine bagli olarak arttigi görülmektedir. Ayni zamanda çekilen fotograflardan da derisimle renk siddetinin arttigi da tespit edilmistir. Sekilde glukozun kalibrasyon egrisinden elde edilen dogru denklemi uM, LOD degerleri 0,31 uM bulunmustur. Tekrarlanabilirlik için üç farkli olarak bulunmustur. %RSD degerinin %1,6 bulunmasi tasarlanan glukoz biyosensörün oldukça iyi bir tekrarlanabilirlige sahip oldugunu göstermektedir. KOX enzimine dayali gelistirilen glukoz biyosensörünün analitik performans çalismalarina ait spektrum ve grafikler ise Sekil 2,de verilmistir. Sekilde kaydedilen spektrumlardan, absorbansin kolesterol derisimine bagli olarak arttigi görülmektedir. Sekilde kolesterolün kalibrasyon egrisinden elde edilen dogru araligi 1-125 uM, LOD degerleri 0,32 uM bulunmustur. Tekrarlanabilirlik için üç farkli kalibrasyon grafiginden ortalama kalibrasyon grafiginin egimi kolesterol biyosensörün oldukça iyi bir tekrarlanabilirlige sahip oldugunu göstermektedir. Girisim çalismalari: CUPRAC reaktifinin birçok bilesikle tepkime verdigi bilinmektedir, özellikle kanda bulunan askorbik asit (AA), dopamin (DA) ve ürik asit (UA) ile CUPRAC reaktifi indirgenerek sari turuncu renkli Cu(I)-Neokuproin kompleksini olusturmaktadir. Daha önce yayinlanan bir çalismada akisa enjeksiyon analiz sisteminde Pt, Pd ve bimetalik nanopartiküllerle modifiye kalem grafit elektrot kullanimina dayali amperometrik glukoz biyosensör tasariminda AA, UA ve DA girisimlerinin bir ön yükseltgen olan NaBi03 ile kolaylikla giderildigi rapor edilmistir. 4 Girisim gidermek amaciyla analitler (glukoz ve kolesterol) önce 0,5 g NaBiO3 içeren bir siringadan 5-10 kez geçirilmistir. Daha sonra enzim immobilize magnetik nanopartiküller kullanilarak enzimatik tepkimeleri ve ardindan CUPRAC ilavesiyle kolorimetrik tepkimeler gerçeklestirilmis ve absorbans degerlerinden girisim yapip yapmadiklari ve girisim yapan bilesiklerin ön yükseltgenle giderilip giderilmedigi belirlenmistir. Bu amaçla çalismada analitle es derisimde girisimciler içeren (1:1) ve analit derisiminden 10 kat daha az girisimci içeren (10:1) çözeltilerin bir kismi NaBiO3,ten geçirilmis (NaBiO3,lü), bir kismi da ön yükseltgenden geçirilmemistir (NaBiOýsüz). Böylece hem ön yükseltgenden geçirilen hem de geçirilmeyen çözeltilerin GDH veya KOX immobilize Si02@Fe3O4 kullanilarak enzimatik tepkimeleri gerçeklestirilmis ve miknatisla ayrilan çözeltilere ardindan CUPRAC çözeltisi ilave edilmis ve absorbans degerleri kaydedilerek Tablo 1 ve 2,de verilmistir. Moleküller Analit: Girisimci Enzimatik tepkime (ET) (30 dk) + Kolorimetrik tepkime (KT) (5 dk) (A450) G: 50 "M, Girisimci: 50 "M (1:1 NaBiOfsüz NaBiOflü için) veya 5 "M (10:1) için :1:l:l 1,522±0,051 0,762±0,019 Tablo 1: GDH immobilize Si02@Fe3O4 NP kullanimina dayali glukoz biyosensörü için yapilan girisim çalisma sonuçlari Moleküller Analit: Girisimci Enzimatik tepkime (ET) (30 dk) + Kolorimetrik tepkime (KT) (5 dk) K: 50 "M, Girisimci: 50 "M (1:1 NaBiOfsüz NaBiOflü için) veya 5 "M (10:1) için Tablo 2: KOX immobilize Si02@Fe304 NP kullanimina dayali kolesterol biyosensörü için yapilan girisim çalisma sonuçlari Tablo 1 ve 2,den görüldügü gibi DA, AA, UA ve bu üç girisimcinin karisimi CUPRAC reaktifi ile kolorimetrik tepkimeye girerek önemli oranda absorbans vermistir. Ön yükseltgenden geçirildikten sonra ise absorbanslarin ciddi anlamda azaldigi tespit edilmistir. Bu da NaBi03,ün bu bilesikleri yükseltgedigini kanitlamaktadir, böylece bu girisimlerin NaBi03 ile giderilecegi tespit edilmistir. Kan plazmasinda glukoz ve kolesterol tayini: Çalismalar tamamlandiktan sonra yapay kanda ve kan plazmasinda glukoz ve kolesterol ölçümleri gerçeklestirilmistir. Bu amaçla yapay kan örnegi normal bir insan kan plazmasinda bulunan 4,7 mM glukoz, 1 mM kolesterol, 0,2 mM 4,5 mM KCl, 1,6 mM MgClz, 5,0 mM CaCl2 ve %0,1 HSA içerecek sekilde literatüre göre hazirlanmistir.5 Gerçek kan plazmasinda glukoz ve toplam kolesterol ölçümleri için ilave edilerek proteinlerin çöktürülmesi (beyaz renk) saglanmistir. Bu durumda kan örnekleri 10 kat seyreltilmistir. 4000 rpm,de 15 dk santrifüjlendikten sonra, askorbik asit, dopamin ve ürik asit gibi girisimcileri önceden yükseltgeyerek gidermek için berrak kisimlar enzimatik tepkime öncesi 0,5 g NaBi03 dolgulu siringadan geçirilmistir. Daha sonra berrak plazma çözeltileri bilinen hacimde (X uL, genelde bir deney tüpüne ilave edilmis üzerine yine 750 uL 1,0 M NH4CH3COO ve 500-X uL saf su ilavesinden sonra enzim immobilize Si02@Fe3O4 ve optimize edilen kosullar altinda enzimatik tepkimesi gerçeklestirilmistir. Deney tüpündeki nanopartiküller miknatisla ayrildiktan sonra örneklerdeki glukoz veya kolesterol miktari (Cö) kadar açiga çikan oksidaz enzimi için H202 ve dehidrogenaz enzimi için NADHain CUPRAC reaktifi ile kolorimetrik tepkimesi saglanmis ve 450 nm,deki absorbans degerleri ölçülmüstür (A1). Daha sonra örnek içeren enzim immobilize nanopartiküllere ayrica 25 HM ([X]) glukoz veya kolesterol standart katkisi yapilmis ve absorbans (A2) degerleri kaydedilmistir. Örneklerdeki glukoz veya kolesterol miktarlari Cö/(Cö+[X]) = A1 /A2 formülü ile hesaplanmistir. Ayrica kullanilan kan örneklerin glukoz içerikleri kitler araciligiyla Biyokimya laboratuvarinda ölçülmüs ve elde edilen sonuçlarla tasarlanan biyosensör sonuçlari karsilastirilarak Tablo 3 ve 4,te verilmistir. Bulunan glukoz derisimleri (mM) Örnek GDH Medikal hastanesi Tablo 3: GDH immobilize Si02@Fe3O4 kullanimina dayali glukoz biyosensörü için gerçek örnek çalismalarindan elde edilen sonuçlar Bulunan glukoz derisimleri (mM) Örnek GDH Medikal hastanesi Tablo 4: KOX immobilize Si02@Fe304 kullanimina dayali kolesterol biyosensörü için gerçek örnek çalismalarindan elde edilen sonuçlar (* Yapay kana ilave edilen kolesterol derisimi, , Geri kazanim sonuçlari) Tablolar incelendiginde yapay ve gerçek kan örneklerinde analiz edilen glukoz ve toplam kolesterolün dogru bir sekilde saptandigi, kan örneklerine eklenen analitlerin (glukoz veya kolesterol) %100,e yakin bir geri kazanimla elde edildigi görülmektedir. Sonuçlar diger bilinen yöntem (Medikal hastanesi) ile karsilastirilarak birbirini destekleyen sonuçlar elde edilmistir. Bulus konusu yöntem, alternatif uygulama alani olarak farkli enzimler ile birlikte tarimda pestisit analizi islemlerinde kullanilabilecektir. TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR

Claims (1)

1.