TR2021004329A2 - Bi̇yoki̇myasal tibbi̇ tani ki̇ti̇ - Google Patents

Abstract

Buluş; Boc-Asn-Gly-OEt bileşiğini içeren deiyonize/distile suda stok çözeltisi ve Boc-Asp-Gly-OEt bileşiği içeren deiyonize/distile suda stok çözeltisi içeren deamidasyon hızı ölçüm kiti ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME BIYOKIMYASAL TIBBI TANI KITI Teknik Alan Bulus, in vitro diyagnostik (biyokimyasal tibbi tani vb.) alaninda biyolojik örnekler için veya diger alanlarda (eczacilik, kimya vb) kullanima uygun kit ile ilgilidir. Bulus özellikle, çözeltilerin, içerdikleri proteinlerin deamidasyon hizina etkisini ölçmek için kullanima uygun bir kit ile ilgilidir. Teknigin Bilinen Durumu Canli organizmalari olusturan yapisal ve islevsel temel moleküllerden biri proteinlerdir. Proteinler, amino asitlerin zincir halinde birbirlerine baglanmasi sonucu olusan büyük organik bilesiklerdir. Peptitler ise tanimlanmis bir düzende, oi-amino asitlerin birbirine baglanmasiyla olusan kisa polimerlerdir. Bir amino asit kalintisi ile digeri arasindaki bag bir "amit bag" veya peptit bagi olarak bilinir. Proteinler polipeptit molekülleridir (veya çok sayida polipeptit alt birimi barindirir). Temel fark peptitlerin kisa, polipeptitlerin/proteinlerin ise uzun olmasidir. Proteinlerin yapisinda yer alan 20 farkli aminoasitten ikisi olan asparajin (Asp, N) ve glutaminin (Gln, Q) yan zincirlerinde amid grubu bulunur. Bu aminoasitleri içeren proteinlerdeki amid gruplarinin ayrilmasina protein deamidasyonu denir. Protein deamidasyonu enzimatik olabilecegi gibi kendiliginden (spontan) de gerçeklesir. Deamidasyon sonucu proteinlerin yapisinda ve yükünde degisim meydana gelir. Özellikle nöronlar gibi uzun ömürlü hücrelerde bulunan uzun yari ömürlü proteinlerde meydana gelen deamidasyon sonucu deamide olmus proteinler zamanla birikerek, bu proteinlerde ve dolayisiyla bu proteinlerin bulundugu hücrelerde yapi ve islev bozukluklarina yol açabilir. Alzheimer, frontotemporal demans ve diger birçok kronik hastaliklarda protein deamidasyonunun önemli bir rolü olabilecegini destekleyen çok sayida bilimsel kanit literatürde rapor edilmistir. Bu nedenle deamidasyon hizini etkileyen faktörlerin veya girisimlerin tespit edilmesi, deamidasyonu önIeyebiIecek/yavaslatabilecek stratejilerin gelistirilmesi ve bireylerdeki deamidasyon hizlarinin tespit edilmesi gerekmektedir. Bu sayede yaslanma ve yasa bagli görülme sikligi artan hastaliklarin önlenmesi ve geciktirilmesinde çok kritik katkilari olabilecegi beklenmektedir. Sadece yaslanma degil ayrica protein yapisindaki farmasötik ilaçlarin (asilar gibi) stabilitesinde deamidasyon önemli bir faktördür. Bu ilaçlarin çözüldügü çözeltilerin protein deamidasyon hizina etkisinin ölçülmesi, çözeltilere eklendiginde deamidasyon hizini yavaslatacak girisimlerin yapilmasi gerekmektedir. Teknigin bilinen durumunda bu konuda çalismalar mevcuttur. U85273886 sayili Amerika Birlesik Devletleri patent basvurusu ise Bulus, bir protein L- izoaspartil metiltransferaz enzimi ile katalize edilen, fragmanlarinin seçici metilasyonu yoluyla polipeptidlerin izoaspartil içeriginin niceliksel belirlenmesi için yöntemler ve araçlar ile ilgilidir. Asparagin yan zincirlerinin belirli protein bölgelerinde deamidasyonu ve ortaya çikan izoaspartat olusumu, hafif kosullar altinda protein degradasyonuna önemli bir katki olarak ortaya çiktigindan, bulus ayni zamanda izoaspartat olusumu ile baglantili protein bozunmasinin nicelendirilmesi için bir yöntemle de ilgilidir. Teknigin bilinen durumunda bu konuda çalismalar olsa da bunlar sadece saf proteinlerin iç kisminda bulunan bilesenleri dolayli olarak analiz etmeye imkan vermektedir. Sadece saflastirilmis proteinlerin deamidasyonunu ölçmek için kullanilabildigi için kan plazmasi gibi daha gibi karmasik matrise sahip biyolojik örnekler için kullanilamamaktadir. Insan ve diger canlilarin biyolojik örneklerinin (serum, plazma, tükürük, beyin omurilik sivisi, eklem sivisi, idrar, hücre/doku/organ ekstraktlari vb) protein deamidasyon hizi üzerindeki etkisinin ölçümü için kullanilabilecek bir test yöntemi halen mevcut degildir. Bu nedenle tibbi biyokimya laboratuvarlarinda da kullanilma potansiyeli olan, biyolojik örneklerin protein deamidasyon hizina etkisini ölçmek ve deamidasyon hizini etkileyen girisimlerin tespiti için kullanilacak bir test gelistirilmesi ihtiyaci vardir. Sonuç olarak yukarida anlatilan olumsuzluklardan dolayi ve mevcut çözümlerin konu hakkindaki yetersizligi nedeniyle; deamidasyon hizini ölçen kitlerle ilgili bir gelistirme Bulusun Amaci Mevcut bulus, yukarida bahsedilen gereksinimleri karsilayan, tüm dezavantajlari ortadan kaldiran ve ilave bazi avantajlar getiren deamidasyon hizi ölçüm kiti ile ilgilidir. Bulusun öncelikli amaci, protein yapisindaki farmasötiklerin kondugu çözeltilere eklendiginde bu çözeltilerin deamidasyon hizina etkisini ölçen bir kit gelistirilmesidir. Bulusun bir amaci, deamidasyon hizina etki eden faktörlerin tespit edilmesini, deamidasyon hiziyla ilgili bireysel farkliliklarin yaslanma ve yasa bagli görülme sikligi artan hastaliklarla korelasyonunun incelenmesini, deamidasyon hizinda artisla karakterize hastaliklarin tespit edilmesini saglayan bir ölçüm kiti gelistirilmesidir. Yukarida anlatilan amaçlarin yerine getirilmesi için bulus, Boc-Asn-Gly-OEt bilesigini içeren deiyonize/distile suda stok çözeltisi ve Boc-Asp-Gly-OEt bilesigi içeren deiyonize/distile suda stok çözeltisi ihtiva eden bir deamidasyon hizi ölçüm kitidir. Bulusun yapisal ve karakteristik özellikleri ve tüm avantajlari asagida yazilan detayli açiklama sayesinde daha net olarak anlasilacaktir ve bu nedenle degerlendirmenin de bu detayli açiklama göz önüne alinarak yapilmasi gerekmektedir. Bulusun Açiklamasina Yardimci Olacak Sekiller Sekil 1: Boc-Asn-GIy-OEt bilesiginin yapisi Referanslarin Açiklamasi 1 Boc- 4 -Oet Deaminasyona ugrayan bölge Bulusun Detayli Açiklamasi Bu detayli açiklamada bulus konusu deamidasyon hizi ölçüm kiti sadece konunun daha iyi anlasilmasina yönelik olarak ve hiçbir sinirlayici etki olusturmayacak sekilde açiklanmaktadir. Bulus konusu deamidasyon hizi ölçüm kiti en temel halinde; Boc-Asn-GIy-OEt bilesigini tercihen ve Boc-Asp-Gly-OEt bilesigi içeren deiyonize/distile Örnek bir görünümü Sekil 1*de verilen Boc-Asn-GIy-OEt bilesigi hem ölçümlerde kalibratör ve analitik standart olarak hem de biyolojik örneklere katilarak deamidasyona ugratilan unsur olarak kullanilmaktadir. Sekilde detaylari gösterilen, 800- (1) ve -Oet (4) Asparajin (Asn) (2) ile glisin (Gly) (3) dipeptidini bloke etmek içindir. Sekilde gösterilen deaminasyona ugrayan bölgede (5) "NHz" yapisi deamidasyonIa uzaklasirken yerine "OH" yapisi baglanmaktadir. Böylece Boc-Asn-Gly-OEt bilesigi Boc-Asp-Gly-OEt bilesigine dönüsür ve molekül agirligi yaklasik 1 (0.98) g/mol artar. Çözelti içindeki Boc-Asn-Gly-OEt bilesigi yapisindaki 800- (1) ve -OEt (4) yapilari; Asn (2) ile Gly (3) dipeptitinin islem sirasinda istenmeyen kimyasal gruplarla baglanmasini bloke etmeyi saglar. Asn (2) ile Gly (3) dipeptiti bilinen en hizli spontan deamidasyon özelligine sahip yapilardan biridir. Bu sebeple ölçümlerde kalibratör/analitik standart ve biyolojik örneklere katilarak deamidasyona ugratilan bilesik olarak kullanilmaktadir. Boc-Asn-Gly-OEt bilesigi spontan deamidasyon sonucu Boc-Asp- Gly-OEt bilesigine dönüstügü için Boc-Asp-Gly-OEt bilesigi kalibrasyon egrisi çizilmesinde Kalibratör ve analitik standart olarak kullanilmaktadir. Boc-Asp-Gly-OEt bilesigi ticari olarak mevcut olmayip özel olarak sentezlenmektedir. Deiyonize/distile su ise Boc-Asn-GIy-OEt ve Boc-Asp-Gly-OEt bilesiklerini çözmeyi saglar ve analitik kör olarak kullanilmaktadir. Bulusun örnek bir uygulamasinda gelistirilen deamidasyon hizi ölçüm kitiyle yapilan ölçüm islemi; Boc-Asn-GIy-OEt bilesiginin deiyonize/distile suda stok çözeltisinin ve seri diIüsyonIarinin hazirlanmasi; Boc-Asp-GIy-OEt bilesiginin deiyonize/distile suda stok çözeltisinin ve seri diIüsyonIarinin hazirlanmasi; Boc-Asn-GIy-OEt stok soIüsyonunun seri dilüsyonlari kullanilarak ölçüm yapilacak cihazda kalibrasyon egrisinin olusturulmasi; Boc- Asp-Gly-OEt stok soIüsyonunun seri dilüsyonlari kullanilarak ölçüm yapilacak cihazda kalibrasyon egrisinin olusturulmasi; deamidasyon hizina etkisi test edilecek olan biyolojik örnegin üç farkli tüpe uygun esit hacimde aIikotIanmasi; örnek tüplerinden birine Boc-Asn- Gly-OEt, digerine Boc-Asp-GIy-OEt (internal standart olarak) stok soIüsyonIarinin ve sonuncusuna kör olarak deiyonize/distile suyun reaksiyon final reaksiyon hacminin tercihen tüpten de tercihen LC-MS yöntemi ile öIçümIerinin yapilmasi; üç tüpün de inkübe edildikten sonra tercihen LC-MS yöntemi ile öIçümIerinin yapilmasi; Boc-Asn-GIy-OEt ve Boc-Asp-Gly- OEt eklenmis tüplerde yapilan ölçüm sonuçlarinin deiyonize/distile su eklenmis tüpte yapilan ölçümden çikarilmasi; Boc-Asn-Gly-OEt eklenen tüpte spontan deamidasyon sonucu olusan Boc-Asp-GIy-OEtinin öIçüImesier deamidasyon hizinin belirlenmesi islem adimlarini içermektedir. Mevcut bulus Boc-Asn-Gly-OEt bilesiginin çözelti içinde spontan deamidasyona ugrayarak Boc-Asp-Gly-OEt bilesigine dönüsmesi ve olusan Boc-Asp-Gly-OEt bilesiginin uygun bir analitik yöntemle ölçülmesi prensibine dayanmaktadir. Spontan deamidasyon hizi üzerindeki etkisi öIçüImek istenen her türlü örnege Boc-Asn-GIy-OEt çözeltisi katilarak ölçüm yapilmaktadir. 1-100 oC arasi sicaklikta 1 dakika - 1 ay arasi süre boyunca bekletilen bu karisimdaki Boc-Asn-Gly-OEtinin spontan deamidasyona ugramasi saglanir. Inkübasyon süresince karisim içindeki Boc-Asn-GIy-OEt dipeptidinin deamidasyonu sonucu moIeküIden spontan olarak -NH2 grubu [Sekil 1:(5)] çikarken -OH grubunun katilmasiyla bilesikteki asparajin izoaspartata veya aspartata dönüsecek ve molekül agirliginda yaklasik 1 (0.98) g/mol kütle artisi olusacaktir. Kütledeki bu degisim yani olusan Boc-Asp-Gly-OEt ve Boc- grubu ile bilesikte yeni olusan aspartatin -OH grubunun farkli kimyasal özelliklerine dayali optimize edilmis her türlü farkli yöntemle de ölçüm yapilabilmektedir. Mevcut bulus konusu deamidasyon hizi ölçüm testi ile bireylerin/hastalarin biyolojik örneklerinin deamidasyon hizi üzerindeki etkisinin ölçülmesi, deamidasyon hizina etki eden ve tespit edilecek bireysel farkliliklarin yaslanma ve yasa bagli görülme sikligi artan hastaliklarla korelasyonunun incelenmesi, deamidasyon hizinda artisla karakterize hastaliklar tespit edilirse bu hastaliklara erken tani koymak amaciyla ve hastaliklara yatkinligi tespit etmek için belirteç (marker) olarak kullanilmasi saglanmaktadir. TR TR TR TR TR

Claims (1)

1.ISTEMLER Deamidasyon hizi ölçüm kiti olup, özelligi; Boc-Asn-Gly-OEt bilesigini içeren deiyonize/distile suda stok çözeltisi ve Boc-Asp-GIy-OEt bilesigi içeren deiyonize/distile suda stok çözeltisi içermesidir. Istem 1,e uygun bir kit olup, özelligi; Boc-Asn-GIy-OEt bilesigini içeren deiyonize/distile Istem 2iye uygun bir kit olup, özelligi; konsantrasyonun 0.25 mM olmasidir. Istem 1,e uygun bir kit olup, özelligi; Boc-Asp-GIy-OEt bilesigi içeren deiyonize/distile Istem 4*e uygun bir kit olup, özelligi; konsantrasyonun 0.25 mM olmasidir. Istem 1 ila Siten herhangi birine uygun bir deamidasyon hizi ölçüm kiti ile yapilan bir hiz ölçüm yöntemi olup, özelligi; Boc-Asn-GIy-OEt bilesiginin deiyonize/distile suda stok çözeltisinin ve seri dilüsyonlarinin hazirlanmasi; Boc-Asp-GIy-OEt bilesiginin deiyonize/distile suda stok çözeltisinin ve seri dilüsyonlarinin hazirlanmasi; Boc-Asn-Gly-OEt stok solüsyonunun seri dilüsyonlari kullanilarak ölçüm yapilacak cihazda kalibrasyon egrisinin olusturulmasi; Boc-Asp-Gly-OEt stok solüsyonunun seri dilüsyonlari kullanilarak ölçüm yapilacak cihazda kalibrasyon egrisinin olusturulmasi; Deamidasyon hizina etkisi test edilecek olan biyolojik örnegin üç farkli tüpe uygun esit hacimde alikotlanmasi; Örnek tüplerinden birine Boc-Asn-GIy-OEt, digerine Boc-Asp-GIy-OEt (internal standart olarak) stok soIüsyonIarinin ve sonuncusuna kör olarak deiyonize/distile suyun reaksiyon final reaksiyon hacminin 1/1000 - 1/2 araliginda olacak sekilde ekIenmeIeri; Ölçümün basinda üç tüpten de ölçümlerinin yapilmasi; Üç tüpün de inkübe edildikten sonra ölçümlerinin yapilmasi; Boc-Asn-GIy-OEt ve Boc-Asp-GIy-OEt eklenmis tüplerde yapilan ölçüm sonuçlarinin deiyonize/distile su eklenmis tüpte yapilan ölçümden çikarilmasi; - Boc-Asn-Gly-OEt eklenen tüpte spontan deamidasyon sonucu olusan Boc-Asp-Gly- OEt*nin ölçülmesiyle deamidasyon hizinin belirlenmesi 7. Istem 6,ya uygun bir yöntem olup, özelligi; ölçümlerin LC-MS yöntemi ile yapilmasidir. 8. Istem 6,ya uygun bir yöntem olup, özelligi; reaksiyon hacminin 1/10 olmasidir. TR TR TR TR TR