TEKNIK ALAN Bu bulus, örnegin bir asEIlormülasyonu gibi bir biyolojik ürünü stabilize edebilen bilesimler ve yöntemler ile ilgilidir. ÖNCEKI TEKNIK Burada kullan-[gilîüzere bir biyolojik ürün terimi, canllîdrganizmalar kullanilârak hazlEllanabiIen bir üründür. Örnegin virüs veya bakteri, bir substrat olarak canlljjoku hücreleri kullanilârak asüârda kullanIia yönelik üretilebilmektedir. Humulin, baska bir biyolojik üründür; insan insülini üretmek için genetik olarak degistirilmis Escherichia coli bakterilerinin bir hastallE üretmeyen susunda sentezlenmektedir. Birçok biyolojik ürün, termal, fotokimyasal veya oksidatif bozunma gibi bozunmaya egilimlidir. Asliâr ve insülin gibi biyolojik ürünlerin dünya çapli-Ilde dagiümiaslîgerektiginden dolayEle farkIIZI bölgelerdeki ortam slîbklilZlarEbüyük ölçüde degiskenlik gösterdiginden dolaylîltaslla ve kullan a yönelik olarak asEEle diger biyolojik preparasyonlar stabilize edilmesine yönelik bir gereksinim bulunmaktadlB Asllâr için birkaç stabilizasyon yöntemi geçmiste kullanilIhlStlEl Bir strateji, örnegin -10 Santigrat derece (-10°C) ila - 70 Santigrat derece (-70°C) gibi çok düsük lelakIHZlarI kullanIiEbImustur. Ancak bu gibi düsük lelakIllZIa depolamaya yönelik olanaklar. bulunmamasübu yaklasn uygulanabilirligini lellEIlandlElnaktadlü Baska bir yöntem, pahalEbir prosedür olan Iiyoûlizasyondur. Liyofilize aslßr, orta derecede stabildir ve yaklaslKl 4° ila 8°C'de depolanabilmektedir. Ancak Iiyofilize asII kullanIi öncesinden suland Ellüiasügierektiginden dolayßlýlleulandlEllIhEpreparasyon, oda lehkllgllElda dururken potansiyelini kaybetmektedir. Bu, baglglEllEl kazandlîiinak için yetersiz titreye neden olabilmektedir ve bundan dolaylZI bir baglgllîlama programII basarlglîllglIEla neden olabilmektedir. Aslýb eklenen kimyasal stabilizatörlerin kullannÇlyine baska bir yaklasIdIEl Stabilizatörler, ya daha düsük lelakIHZta depolama veya liyofilizasyon yöntemleri ile birlikte kullanllBiaktadlB Ancak mevcut stabilizatörlerin hiçbiri, istenilen gelistirilmis sürdürülebilir stabilite düzeyini vermektedir. AyrlEla, albümin ve jelatin gibi bu kimyasal stabilizatörlerin birçogu, hayvan menselidir ve bu stabilizatörlerin dahil edildigi asllârl hayvan menseli çesitli ajanlar ile kontamine edilmesine dair bir risk tasIiaktadlB Bu gibi kontaminantlar, aslýEhlan hastada alerjik bir reaksiyona dair bir risk taslýlabilmektedir ve ayrüa, hayvan menseli kimyasallar ile stabilize edilen asllârda partiden partiye çesitlilige neden olabilmektedir. US 5 580 856 A saylIJJIlPatent DokümanÇlçözünür proteinlerin, baska bir deyisle dogal monomerik proteinin attlîllüias- yönelik veya kurutulmus bir proteinin sulandlEllüîasIan sonra agrega proteinlerin miktarII azaltllüias- yönelik bir yöntemi açllZIamaktadE Bu, osmolitler, Iiyotropik tuzlar, suda çözünür sentetik ve dogal polimerler, sürfaktanlar, sülfatlanmlglpolisakkaritler, proteinler ve tamponlar gibi bir dizi kimyasaII sulu bir çözeltide kullaniülaslüsüla gerçeklestirilmektedir. Ancak bir biyolojik ürünün termostabilitesini ve raf ömrünü arttßn bir yöntemi veya formülasyonu sunmamaktadE farmasötik bilesimin stabilizasyonuna yönelik yöntem ile ilgilidir. Stabilizasyon etkisi, L-arginin veya L-sisteinden seçilen bir agregasyon inhibitörü tarafIan saglanmaktad lElve bilesim, istege bagIEblarak bir tampon, bir tonisite degistirici ve/veya bir eksipiyan[kapsayabilmektedin Bilesim, pH 6.0 ve 7.0 araslfiüa bir pH'ta formüle edilebilmektedir. kristalin formlarIElve ayrlEla, TNFR2 polipeptitlerinin kristallerinin yapllÜialeb yönelik yöntemleri saglamaktadlü Uygun sulu çözücüler veya uygun kristalizasyon ajanlarIEßarlEldlün sulu çözücüler, kristalleri üretmek için kullanüîhaktadlü -20 Santigrat derece depolama için zarfllZl/irüslerin stabilizasyonuna yönelik bir yöntem ile açlEIamamaktadB ve de donma yukar-a virüslerin gelistirilmis termostabilitesini göstermemektedir. Arakawa ve ark.: XP, dondurularak kurutulmus veya dondurularak eritilmis çözeltideki protein stabilitesini kapsayan proteinlerin klgla ve uzun süreli stabilitesini etkileyen faktörleri incelemistir. Sekerler, amino asitler, aminler, polioller ve bazElluzlar dahil olmak üzere çok saylöh protein stabilizatöründen bahsedilmistir. Ancak stabilizatörler, bir formülasyon ile birlikte kullanilîhamlgtlîl US 6 051 238 A saylIUPatent DokümanÇlarttlEllüilgltermostabiliteye sahip Iiyohlize asilâr ile ilgilidir. Formülasyon, 6-karbon polihidrik alkolü (örnegin, sorbitol), bir disakkarit (örnegin, sakaroz) ve bir tamponu kapsamaktadlB adjuvanlîl kullanan bilesimler ve yöntemler ile ilgilidir. Bilesim, ayrlîh, POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosf0k0lin) barlEldEnaktadlE Dolaylglýla, slîEl/e Iiyofilize viral asllâr ve diger biyolojik ürünler için iyilestirilmis kimyasal stabilizatörüne yönelik devam eden bir gereksinim bulunmaktadlEl Ayrlîh, bir lelaklllZlarallglII üzerinde uzatllîhlgldepolama stabilitesine sahip olan ve titrede azaltlßî Eindirgemeye sahip olan iyilestirilmis Iiyofilize veya sIîElviral asllâra yönelik bir gereksinim bulunmaktadB AsEl preparasyonlarII immünolojik aktivitesini gelistirmeye yönelik ilave bir gereksinim bulunmaktadlB BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Biyolojik ürünlerin stabilize edilmesine yönelik önceki teknik bilesimlerine ve yöntemlerine karslEJ, mevcut konunun bulus sahipleri, burada, çesitli biyolojik Ürünlerin termostabilitesini ve raf ömrünü gelistirebilen yeni bir stabilize edici formülasyon ve ilgili yöntemi kesfetmistir. Bulusun bir yaplßndßnasübir biyolojik ürünün termostabilitesini ve raf ömrünü gelistirebilen bir formülasyondur, bu formülasyon, sunlarlîlçermektedir: asagßhki formüller ile temsil edilen bir tersiyer amin N-oksit veya bunun bir türevi: burada R1, R2 ve R3, ayn Eleya farklßlabilmektedir ve her biri, 1 ila 4 karbon atomuna sahip düz veya dallanmlgldüsük alkil grubudur; formülasyon, bir Inorganik asit; glütamik asit veya bunun bir türevi; bir poliol; bir fizyolojik olarak kabul edilebilir tampon ve farmasötik olarak kabul edilebilir taslylc il'ermektedir; burada bivoloiik ürün. bir inaktive edilmis virüs, bir atenüe virüs ve bir canlElirüsten seçilen bir asIlEi ve burada formülasvon, bir antiien yaplßslîtermektedir. Formülasyonun tercih edilen bir yapilândlîilnasia tersiyer amin N-oksit, trimetilamin-N-oksit, (CH3)NO olmaktad E Bulusun baska bir yapliândlünasüyaklas bir milimolar ila yaklas[l2150 milimolar magnezyum klorür MgCIz; yaklasilg 8 milimolar ila yaklasilg 200 milimolar glütamik asit; yaklasik] 0.05 milimolar ila yaklasllZl 2.5 milimolar manitol; yaklasilZl bir milimolar ila yaklasElZl 500 milimolar trimetilamin-N-oksit; ve pH'ÜakIaslK] 6.5 ila yaklaslIZ] 8.5 ve tercihen ila yaklasllZ]7.5 arashîha ayarlamak veya korumak için etkili bir miktarda fizyolojik olarak kabul edilebilir bir tampon içeren bir inaktive edilmis veya atenüe virüs, bir adjuvan ve bir stabilizatör içeren bir as- Bulusun yine baska bir yapllândiîilnaslglbir biyolojik ürünün termostabilitesini ve raf ömrünü gelistirebilen bir formülasyondur, bu formülasyon sunlarügermektedir: yaklasllîlbir milimolar ila yaklaslKl 200 milimolar glütamik asit; yaklasiEI0.05 milimolar ila yaklaslEI 5 milimolar manitol; mililitre baslEla yaklasilZl 0.01 miligram ila mililitre baslEla yaklasilZl 0.1 miligram protamin, ve yaklasllZJyüzde 0.01 ila yaklasilZJyüzde 1 dekstroz, ve pH'lSlaklasiKlöS ila yaklas[lZJ8.5 ve tercihen ila yaklaslEI7.5 arasIa ayarlamak veya korumak için etkili bir miktarda fizyolojik olarak kabul edilebilir bir tampon. Bulus, ayrüa, sunlarügeren bir formülasyon ile ilgilidir: bir inaktive edilmis virüs veya bir atenüe virüs; alüm; trimetilamin-N-oksit; manitol; glütamik asit; magnezyum klorür; MgC12; sodyum klorür; ve formülasyonun pH'IlJ'akIasilglS'ta korumak için uygun bir tampon. Formülasyon, aglîlllKYhacim cinsinden yaklaslKlyüzde 0.1 ila aglîllüîl'hacim cinsinden yaklasilZlyüzde 0.5 alüm, ve tercihen aglîllilîl'hacim cinsinden yaklas[lZJyüzde 0.2 alüm; yaklasiE11.5 milimolar ila yaklas[lZ] milimolar trietilamin-N-oksit, tercihen yaklasDZIZ milimolar trietilamin-N-oksit; yaklas[El0.05 milimolar ila yaklasilZI 2 milimolar manitol, tercihen yaklasilZl 0.1 milimolar ila yaklaslEl 1.1 milimolar manitol; yaklaslKlS milimolar ila yaklasiKl 150 milimolar glütamik asit, tercihen yaklasik] milimolar sodyum klorür, tercihen yaklasllîl 145 milimolar ila yaklasllîl 500 milimolar sodyum klorür içerebilmektedir. Aç[Elanan formülasyonlar, halihazlîcila kullanllâbilir stabilizatörleri bulunduran bu gibi ürünlere klýasla uzatilBilSl bir süre boyunca asiiârI ve diger biyolojik ürünlerin titresinde beklenmedik derecede aza ItÜIh @indirgeme saglama ktadiü AçilZJanan formülasyonla r gelistirilmis stabilitesi, özellikle leZive Iiyofilize viral asllâr için önemli olabilmektedir. Ek olarak aç[Elanan formülasyonlar, örnegin serum, albümin ve jelatin gibi hayvan menseli bilesenlerin çogunu veya tamam Ebulundurmamaktad @ve bundan dolayEiiormüIasyonun uyguland [gilîbir bireyde alerjik reaksiyona yönelik daha düsük bir risk sunmaktadB Hayvan menseli bilesenlerin beraberinde getirdigi kontaminasyona büyük ölçüde sahip olmayan açilZlanan bilesenler, bir partiden partiye hayvan menseli bilesenlere sahip formülasyonlardan daha yeknesaktE SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil, 37°C'de 4, 7 ve 12 gün sonra degerlendirilen, bulusun bir yapilândlîilnasl göre farkIEi stabilizasyon formülasyonlarlEUa alüme adsorbe edilen YF 17D virüsünün stabilitesini gösteren bir grafiktir. AYRINTILI AÇIKLAMA Bulusun tercih edilen yapilândlEinalarII bir açilîlamaslîiasaglâaki gibidir. Bulusun belirli yapiiând HnalarIiEl, yalnlîta örnek olarak gösterildigi ve bulusun sIlEilarüilarak gösterilmedigi anlasiiâcaktlü Baslangigta bulus, asaglki daha ayrlütilliîaçiiîlama ile en genel yönleriyle açiEIanmaktadlE Bulusun bilesimlerinin ve yöntemlerinin özellikleri ve diger ayrlEtllâriJ istemlerde ayrIEla belirtilmektedir. Tarifnamenin açlKlamasEl'e istemleri boyunca "içermektedir" ve "barIiEinaktadIEi kelimeleri ve bunlar. varyasyonlarÇi"bunIarIa sIIEIimImamak kaydlýia kapsayan" anlam. gelmektedir ve baska k-ilarÇi katkEi maddelerini, bilesenleri, tamsayilârüveya adIiIarEidiSiamasü amaçlanmamaktadlEi(ve dlSIamamaktadlE). Bu tarifnamenin açiElamasEiie istemleri boyunca tekiller, baglam aksini belirtmedikçe çogullarlZi kapsamaktadlE Özellikle belgisiz sifâtl kullanligiüiiurumlarda bu özellikle, baglam aksini belirtmedikçe, çogullugu ve ayrIEia tekilligi Bulusun belirli bir yönü, yapilândlüinaslZi/eya örnegi ile baglantiIJJJJIarak açiiZIanan nitelikler, tamsayilâr, özellikler, bilesikler, kimyasal kilar veya gruplar, bunlarla uyumsuz olmadigiEl sürece burada açiEIanan herhangi bir baska yön, yapilândiEina veya örnege uygulanabilir oldugu anlasllâcaktlü Bu tarifnamede açiEianan niteliklerin tamamEQböerlikle ekli istemler ve özet ve/veya açEElanan herhangi bir yöntemin veya prosesin adllarII tamamüiahil), bu gibi niteliklerin ve/veya adnlarI karsiIJKIDoIarak dlglarlayan oldugu kombinasyonlar haricinde herhangi bir kombinasyonda birlestirilebilmektedir. Bulus, önceki herhangi bir yapllândlünanl ayrlEtüârEile kiîlflbnmamaktadm Bulus, bu tarifnamede açiKIanan özelliklerden herhangi bir yeni özellik ve bunlar. herhangi bir yeni kombinasyonu (ekli istemler ve özet dâhil), veya böylelikle açIJZlanan herhangi bir yöntemin veya prosesin adIilarIan herhangi bir yani adIi veya bunlari herhangi bir kombinasyonu ile ilgilidir. AçllZlanan konunun bulus sahipleri, çözeltide inaktive edilmis bir virüs, özellikle bir alüm ile adsorbe edilmis sarllîlimma virüsü verebilen kimyasallar. taranmalela yönelik bir çallglna tasarlamigtlEl Yüksek çithHHfiarama sonrasIa test için birçok kombinasyon seçilmistir. BunlarI arasIan belirli kombinasyonlar, stabilite bak an beklenmedik, önemli bir artlglüretmistir. AçilZlanan formülasyonun bilesenlerinden birkaçÇlbulus sahiplerinin bilgisi kadarEla, biyolojik formülasyonlarlEl, özellikle asü formülasyonlarII stabilize edilmesi için önceden hiç kullanllîhamlgtlü Burada, bir biyolojik ürünün termostabilitesini ve raf ömrünü gelistirebilen bir formülasyon açiEIanmaktadlB bu formülasyon, sunlarübermektedir: asaglâbki formüller ile temsil edilen bir tersiyer amin N-oksit veya bunun bir türevi: burada R1, R2 ve R3, ayn Eieya farkllîilabilmektedir ve her biri, 1 ila 4 karbon atomuna sahip düz veya dallanmigl düsük alkil grubudur; formülasyon, bir inorganik asit; glütamik asit, HOOC(CH2)2CH(NH2)COOH veya bunun bir türevi; bir poliol; bir fizyolojik olarak kabul edilebilir tampon ve farmasötik olarak kabul edilebilir tasMEEicermektedirmurada bivoloiik ürün, bir inaktive edilmis virüs, bir atenüe virüs ve bir canIEl/irüsten secilen bir asIiîi ve burada formülasvon, bir antii'en vapitâsü Icermektedir. Formülasyonun tercih edilen bir yapllând Hnaslüda tersiyer amin N-oksit, trimetilamin-N-oksit, (CH3)3NO olmaktadlE Yukarlki formülde R1, R2 ve R3'ü açiElamak için burada kullanI[g]Ei[izere "düsük alkil grubu" terimi, 1 ila 4 karbon atomuna sahip alkil gruplarElbelirtmektedir. Örnegin R1, R2 ve R3'ün her biri; bir metil, bir etil, bir propil, bir n-bütil ve bir izobütil grubundan bagislîl olarak seçilebilmektedir. AçlIZlanan formülasyonun bir yapüândlîrlnaslda inorganik asit, magnezyum klorür, MgCIz olmaktadß Bulusun çesitli yapllândlîilnalaria poliol, örnegin manitol, C6H8(OH)6 gibi bir C3 ila bir C8 poliol olabilmektedir. Trietilamin-N-oksit konsantrasyonu, yaklasüîl 1.5 milimolar (mM) ila yaklaslKJ 800 mM veya yaklaslEZ mM ila yaklaslEöOO mM veya tipik olarak yaklasila2.0 mM ila yaklasllöZO mM araleUa olabilmektedir. Magnezyum klorür (MgCIz) konsantrasyonu, yaklasllZJO.8 mM ila yaklasilîl80 mM veya yaklasllZlS mM ila yaklasllZlSO mM ve tipik olarak yaklaslEll mM ila yaklasllZllZ mM arasIa olabilmektedir. Glütamik asit konsantrasyonu, yaklasllZl 5 mM ila yaklaslEl 500 mM veya yaklasllg 7 mM ila yaklasilZJ 300 mM veya tipik olarak yaklas[lZl8 mM ila yaklaslEl 100 mM araleUa olabilmektedir. Manitol konsantrasyonu, ag lillllîyhacim cinsinden yaklasllîlyüzde 0.01 ila ag IEllllZyhacim cinsinden yaklasüZJ yüzde 5 veya yaklasllZl yüzde 0.01 ila yaklasllZJ yüzde bir (1) veya tipik olarak yaklasllZl yüzde 0.02 olabilmektedir. Terim burada kullanIlgiElüzere "aglEllllZVhacim cinsinden", bir anlamlEla gelmektedir. Yüzde, milimetre (mL) olarak çözeltinin toplam hacmine bölünen gram (9) olarak çözünen madde aglIlgiian hesaplanmaktadlü Manitol konsantrasyonu, bulusun bir yapllândlîrlnaslüla göre bir aslZformülasyonunda veya bir stabilizatör çözeltisinin her birinde yaklasilg005 mM ila yaklasllgz mM arasEUa ve tercihen, yaklasilaoil mM ila yaklasllali mM arasIa olabilmektedir. Fizyolojik olarak kabul edilebilir tampon, pH'ÜaklaslElöS ila yaklaslKI8.5 veya yaklasllZl7.0 ila yaklasilZl8.0 ve tipik olarak yaklasllZl7.5 arasüda ayarlamak veya korumak için etkili bir miktarda bulunabilmektedir. Uygun bir tampon, örnegin ayrlîb su sekilde bilinen Tris HCI gibi bir tris tampon olabilmektedir: 2-Amino-2-(hidroksimetil)-1,3-pr0pandiy0l, hidroklorür; ve Tris (hidroksimetil) aminometan Hidroklorür; veya bir fosfat tamponu. Ancak kimya veya biyokimya tekniklerinde uzman kisiler, deneyi bozmadan, baska bir tamponun, bulusun bir yapllând lElnaleUa kullanIia yönelik uygun oldugu belirleyebilmektedir. Bulusun tercih edilen bir yapllândlülnasüörnegin bir sarllîümma virüsü gibi bir inaktive edilmis veya bir atenüe virüsü içeren bir aslZformüIasyonudur, bu asEformülasyonu, yaklaslKl 1.2 milimolar (mM) ila yaklaslE 12 milimolar (mM) magnezyum klorür (MgCIz), yaklas[lZ] 10 mM ila yaklasllîl 100 mM glütamik asit, yaklasilîl0.1 mM ila yaklaslEll.1 mM manitol, yaklaslKJ2.0 mM ila yaklaslEZO mM trimetilamin-N-oksit, ve pH'lSlaklaslE65 ila yaklasilg8.5 ve tercihen yaklasllZi7.0 ila yaklasIE] 8.0 arasIa ayarlamak ve/veya korumak için etkili bir miktarda fizyolojik olarak kabul edilebilir bir tampon içeren bir inaktive edilmis veya atenüe virüs, bir adjuvan ve bir stabilizatör içermektedir. Mevcut konunun bulus sahipleri, ayrlEla protaminin, biyolojik ürünler için bir stabilize edici formülasyona etkili bir katklîbldugunu kesfetmistir. Örnegin bulusun baska bir yapliândlünasü bir biyolojik ürünün termostabilitesini ve raf ömrünü gelistirebilen bir formülasyon, sunlarü içermektedir: yaklasllZlbir milimolar ila yaklaslElZOO milimolar glütamik asit, yaklasllîl0.05 mM ila yaklasilîlS mM manitol, mililitre baslEla yaklasilZl 0.01 miligram ila mililitre baslîila yaklasllZl 0.1 miligram protamin, ve yaklaslKJyüzde 0.01 ila yaklasllîlyüzde 1 dekstroz, ve pH'lSlakIaslEJ65 ila yaklaslEJ 8.5 ve tercihen yaklasilZJ 7.5 arasIda ayarlamak veya korumak için etkili bir miktarda fizyolojik olarak kabul edilebilir bir tampon. Protamin konsantrasyonu, ayrIEla, yaklasllZl 0.005 miligram ila yaklasllîl 0.2 miligram araleUa olabilmektedir. Protamin temelli formülasyondaki diger bilesenlerin konsantrasyonu, örnegin trimetilamin-N-oksit temelli formülasyon için yukari aç[E]anan gibi olabilmektedir. AçllZlanan formülasyonlardan herhangi biri, alüminyum hidroksit gibi bir adjuvan içerebilmektedir. Açllîlanan formülasyonlardan herhangi biri, insülinin raf ömrü ve/veya verimliliginin uzatüüwaslîl için uygun olabilmektedir. AçlEJanan formülasyonlardan herhangi biri, bir inaktive edilmis virüs, bir atenüe virüs, bir canIEl virüs ve bunlar. kombinasyonlarlüiçeren bir biyolojik ürün için uygun olabilmektedir. Formülasyon ile kullanIia yönelik bir inaktive edilmis virüs veya bir atenüe virüs, bir sarllîumma virüsü olabilmektedir. Biyolojik ürün, bir tek bakteri veya birden fazla bakteri, veya bakterilerin bir kombinasyonu ve bir veya daha fazla virüs içerebilmektedir. Aç[lZ|anan formülasyonun çesitli yapllândlElnalarÇlörnegin insan, kedi, köpek, at, domuz, slgllîJ koyunu kapsayan herhangi bir tür tarafIan kullanIia yönelik amaçlanan asUârEiçeren biyolojik bilesimlerin stabilizasyonuna uygulanabilmektedir. Bu formülasyonlarIyapllândlElnalarDörnegin rekombinant proteinler, sünzim bilesimleri ve viral olarak iletilen vektörleri kapsayan proteinlerin stabilizasyonunda kullanilâbilmektedir. Burada kullanIfgiEüzere "aslZl terimi, bulaslEEhastalllZlarI önlenmesi, hafifletilmesi veya tedavisi için uygulanan, virüsler, bakteriler, rickettsiae gibi canlüatenüe veya inaktive edilmis (ölü) mikroorganizmalarlül, veya bunlardan elde edilen antijenik proteinler veya diger maddelerin diger antijenlerinin bir süspansiyonu anlam. gelmektedir. Bir atenüe asÇlbunlarI sayrlghnllgill kaybedilmesine ancak koruyucu baglgllZHglEHndükleme yeteneklerini korunmasi yol açan olumsuz kosullara tabi tutulan canlüikroorganizmalardan veya virüslerden hazlEIlanan bir asIIE Bir atenüe asl,__l ayri& bir "replikatif aslîl olarak bilinmektedir çünkü bu, yeniden üretebilen organizmalarEbarlEUlElnaktadB Bulusun bir yapilândlîilnas- göre bir formülasyon, tam-hücre preparasyonlarIa daha az risk taslýlan hücresiz mikroorganizmalar. saflastlEIlanlS] antijenik bilesenlerinden hazlEianan bir hücre içermeyen asübir hücresiz asmlabilmektedir. Bu gibi bir "hücresiz aslZhI bir örnegi, antraksa karsEbaglgiEJlEJ kazand Elnak için kullanilân, Bacillus anthracis kültürlerinin bir hücresiz protein ekstraktüilan bir antraks as-lEI Baska bir örnek, hiçbir viral nükleik asit barIIEInayan ve kültür ortam lEL'Ian elde edilen yalnlîta küçük miktarlarda viral olmayan ajanlarEBarIan bir aslîdlarak bir"altbirim aslgîlolmaktadIEl Hücresiz asllâr ve altbirim asllârII olumsuz reaksiyonlara neden olmasÇIatenüe bakteri veya bir tam, atenüe veya inaktive edilmis viryon barlEUBin bir aslýb kis-;asla daha az muhtemeldir. Aç[Elanan formülasyon, bir antijen yapüsüiçeren bir asüpreparasyonunun stabilitesinin gelistirilmesi için uygun olabilmektedir. AçllZlanan formülasyondan herhangi biri, bir virüs benzeri partikül, bir altbirim, bir toksoid, bir plazmit, bir peptit, bir polipeptit, bir füzyon proteini, bir konjuge polisakkarit, bir rekombinant protein, bir DNA, bir RNA ve bunlar. kombinasyonlar-an seçilen bir partikül içeren bir asi kullanlßbilmektedir. AçilZJanan formülasyonlar, St. Louis ensefaliti virüsü, Japon ensefaliti virüsü, keneyle geçen ensefalit virüsleri, dang virüsü, Kyasanur orman hastalglîl virüsü ve bunlarlEl kombinasyonlarIian seçilen bir inaktive edilmis virüs veya bir atenüe virüsü kapsayan bir biyolojik ürünün stabilitesini gelistirebilmektedir. Kßmllg kabakulak, klîbmElEl suçiçegi,polio, hepatit A, hepatit B, herpes simplex 1, herpes simplex 2, kuduz, influenza A, influenza B, H1N1, rotavirüs ve bunlar. kombinasyonlarlEUan seçilen bir inaktive edilmis virüs veya bir atenüe virüsü kapsayan bir bilesimin stabilitesi, aç[lZlanan formülasyonlardan herhangi bir ile gelistirilebilmektedir. Bulusun bir yapllândlîiinasü kedi, Bordetella, Bordetella bronchiseptica ve bunlarlE] kombinasyonlarldan seçilen bir bakteriyi kapsayan bir asEleya baska biyolojik bilesimdir. Aç[lZlanan formülasyon, bunlarla sIIEllljbImakslîIEl, sunlarEkapsayan su asEtürleri için uygun olabilmektedir: bununla tedavi edilecek hastanI Iezyonundan yeni izole edilmis mikroorganizmalardan hazlîlianan bir otojen aslîltüberküloza karsElbagElKlilZl kazandlülnak için ve mesane kanserinin tedavisinde kullanüân bir BCG aslglîl (Mycobacterium bovis Calmette-Guerin susu); koleraya karsü baglglElilZJ kazandlElnada kullanllân ölü Vibrio cholerae'ninbir kolera asEbreparasyonu; difreti, tetanoz ve bogmaca öksürügüne karsEles zamanlmlarak baglglKlilZJkazandlîilnak için kullanilân; difteri ve tetanoz toksoidleri ve bogmaca asEIlDTP), difteri ve tetanoz toksoidleri ve bogmaca as-I bir kombinasyonu; difteri, tetanoz, bogmaca ve Haemophilus influenza tip b taraflEUan enfeksiyona karsEés zamanllîl olarak baglgiKlilZl kazanmak için kullanilan; difteri ve tetanoz toksoidleri ve adsorbe edilmis bogmaca aslgü'e Haemophilus b konjuge asÇIdifteri, tetanoz toksoidi ve bogmaca asEEl/e b konjuge asII bir kombinasyonu; Haemophilus b konjuge asEGHbCV), difteri toksoide veya bir spesifik difteri, meningokokal veya tetanoz proteine kovalent olarak baglanan Haemophilus influenza tip b'nin bir preparasyonu; Haemophilus b polisakkarit aslgüHbPV), Haemophilus influenza tip b'den elde edilen saflastlîllIhElkapsüler polisakkaridin bir preparasyonu; inaktive edilmis hepatit A aslîühücre kültüründe yetistirilen hepatit Ah. bir atenüe susundan elde edilen bir inaktive edilmis tam viryon aslîhepatit B asElZl/a hepatit B {hepatit B'ye karsEîhaktive edilmis) taslîlEJErII insan plazmasIan ya da maya hücrelerinde (hepatit B'ye karsEl asEIIgibi bir insan diploid hücre aslîlîllHDCV); bir influenza virüs asEJörnegin iki influenza A virüs susunu ve bir influenza B virüs susunu barIÜn bir trivalan asüveya bir H1N1 aslglîl rekombinant teknolojisi taraflEUan üretilen bir Lyme hastallgiîhslgürekombinant OspA), dEl yüzey proteini A'nI (OspA) preparasyonu ve Borrelia burgdorferi'nin bir hücre yüzeyi lipoproteini; canIIIßir klîamlEl kabakulak ve klîamlEblElvirüsü asIEEGMMR), canlÇlatenüe kümüg kabakulak ve klîlamlEgMvirüslerinin bir kombinasyonu; bir klîhmllîl ve klîlamlEçüîlvirüsü aslîlÇl canlÇbtenüe klîiamUZJve klîhmiKÇilglvirüslerinin bir kombinasyonu; canllîbir klîiamiElvirüsü asElZl bir canlü atenüe virüs asElîl menenjite baglgilîlilîl saglamak için kullanllân Neisseria meningitidis'in kapsüler polisakkarit antijeninin bir preparasyon; canIEEbir kabakulak virüs aslîlîl bogmacaya karsEbagiSElK] kazandiEinak için kullanllân ancak genellikle difteri ve tetanoz toksoidleri (DTP veya DtaP) ile kombinasyon halinde kullanüân bir bogmaca aslgIZÖIü Bordetella pertusis bacillinin bir preparasyonu, bir tam-hücre aslîlîi/eya bunun saflastlîllüîlgantijenik bilesenleri (hücresiz aslîj bir veba asßgölü Yersinia pestis bacillinin bir preparasyonu;bir pnömokokal heptavalan konjuge aslgüdifteri toksinin bir toksik olmayan varyant- baglanan Streptococcus pneumoniae'nin yedi serotipinden kapsüler polisakkaridin bir preparasyonu; birpolivalan pnömokok asEÇlpnömokokal hastallgiI çogunluguna neden olan Streptococcus pneumoniae'nin 23 serotipinden kapsüler polisakkaritlerin bir preparasyonu; inaktive edilmis bir poliovirüs asEIIPV), poliomyelite karsEbaglgKliklkazandlEinak için kullanllân formalin-inaktive edilmis poliovirüslerin bir süspansiyonu; canlEbir poliovirüs oral asEKOPV), canlüatenüe poliovirüslerin üç türünün bir kombinasyonunun bir preparasyonu; maruziyet öncesi ve sonrasi] kuduz baglSIElamasEiçin kullanilân bir inaktive edilmis kuduz virüsü; rotaviral gastroenterite karsElbebekIerin bagElEliKlkazanmasüiçin kullanilân; canIlIlbir rotavirüs oral aslîlglfetal rhesus diploid hücrelerinde yetistirilen dört rotavirüs türünün bir karElEnlHan üretilen bir canlljbral virüs aslgücanllîbir kßmilîgllîlve kabakulak virüsü asEÇtanlßtenüe kâmiiîgilîlve kabakulak virüslerinin bir kombinasyonu; bir canlERlîlamiEçilZJvirüs asEÇIbir canlßtenüe virüs asigiSSabin asEEGpoliovirüse karsmanllßram Salk aslîlîüpoliovirüse karslîhaktive edilmemis); bir tifo aslgîl (bir parenteral Elite fenol ile inaktive edilmis bakteri as-üatenüe Ty21a'dan hazlElianan bir oral canlllsÜ/e tifo Vi kapsüler polisakkaritten haziEllanan bir parenteral asIîLEkapsayan tifo atesine karsi] baglSIEIEIZI kazandiEiiEiasEl için kullanüân Salmonella typhi'nin birkaç preparasyonundan herhangi biri); ve canlBuçiçegi virüs asigîbuçiçegi ve herpes zostere karsEl baglgiEJUZl kazandiEInak için kullanilân canliZlatenüe insan herpes virüsü 3'ün (suçiçegi-zoster virüsü) bir preparasyonu. Bulusa göre bir aslZlformülasyonunun çesitli yapHândlîilnalarÇifizyolojik tuzlu su çözeltisi, pH-kontrollü ajanlar, koruyucular, organik çözücüler, hidrofobik ajanlar ve sürfaktanlar gibi adjuvan ve farmasötik eksipiyanlar olarak alüminyum hidroksit içerebilmektedir. Bir asüaslsîßtabilize etmek için burada açlKlanan etkili bir miktarda bir formülasyonun aslýh eklenmesiyle stabilize edilebilmektedir. Burada açiEIanan herhangi bir formülasyona göre stabilize edilen bir asüintramüsküler enjeksiyon ile asII uygulanmaslüçeren bir yöntem tarafIan verilebilmektedir. Bir süjede bir hastaligll tedavi edilmesine ve/veya önlenmesine yönelik bir yöntem, hastallgiEl tedavi etmek veya önlemek için burada açlKJanan herhangi bir stabilizatör formülasyonuna göre bir asi. etkili bir miktarda süjeye uygulanmaslüçerebilmektedir. ÖRNEKLENDIRME Inaktive Edilmis SarIJ-Iumma Virüsü (YFV) AslElII Preparasyonu Formülasyon Öncesi Alt-Parti Olusumu Baslanglgklinik deney için üç doz düzeyi tasarlanmaktadlEl Kitle Ilaç Maddesi, yüksek doz için uygun konsantrasyondadß inaktive edilmis virüs, formülasyon tamponundadlîl (hedef formülasyon: 10 mM Tris, 145 ila . Nihai NaCl konsantrasyonu, Kitle Ilaç Maddesinin hedef potansiyelini gerçeklestirmek için gereken seyreltme faktörüne bagIEl olacaktlE Kitle Ilaç Maddesi, orta doz düzeyinde Alt-Parti M'yi hazlIllamak için seyreltme tamponu (10 mM Tris, ile on kere seyreltilmektedir. Kitle Ilaç Maddesi, düsük doz düzeyinde Alt-Parti L'yi haziElamak için seyreltme tamponu ile yüz kere seyreltilmektedir. Kalan Kitle Ilaç Maddesi, yüksek doz malzeme için baslanglglmalzemesi olan Alt-Parti H olmaktadlEI Üç alt-partilerine hepsi, 2 ila 8°C'de steril PETG siselerinde depolanmaktadlîl Alüme Adsorpsiyon Alüminyum hidroksit, Kitle Ilaç Ürününde °/oû.2'lik bir yaklasllZl nihai konsantrasyonu gerçeklestirmek için bunun PETG kablîida Formülasyon Öncesi Alt-partiye eklenmektedir. eklenmektedir. Alt-parti, 2 ila 8°C'de yaklasllZJolarak 4 saat boyunca tamamen karlStlElIlüiaktadlE SonrasIda alüm ila adsorbe edilen alt-parti, eksipiyan tampon eklemesine kadar 2 ila 8°C'de depolanmaktadEI Bu, Alüm ile Formüle Edilmis Inaktive Edilmis Virüstür. Alüme Adsorpsiyonun Nitelenmesi Niteleme çal EinalarÇlalüm ta rafüdan inaktive edilmis YFV'nIn tam adsorpsiyonunu temin etmek amaclîla gerçeklestirilmistir. %02 oranIa alüm (nihai konsantrasyon) mevcudiyetinde veya yoklugunda YFV barilün tüpler, 2 ila 8°C'de 4 sa boyunca karlgtlîlliilgtlü YFV ± alüm karlglülilarElîbarIBin çözeltiler, oda süakügiia 10 dakika boyunca yaklastlîlolarak 3000 dds'de (rpm) santrifügasyon vasltâslýla temizlenmistir, ve süpernatan aklSkanIar toplanmlgtlü Çözeltide kalan (adsorbe edilmemis) YFV miktarüalüm baglüinalzeme için 2E10 monoklonal ELISA tahlili kullanilârak ölçülmüstür. Kontrol numunesindeki (alüm yoktur) YF antijeni miktarEi alüme adsorbe edilmemis YFV antijen yüzdesini hesaplamak için kullanilîhlgtlEl Yalnlîta %0.09 oranIia antijen olarak gösterilen sonuçlar, alüme baglanmamlgtlü Ek olarak, YF antijenini koruyan kosullar altIa YF virüsü antijeninin adsorpsiyonunu göstermeye yönelik bir çaba ile çok saylEiia deney gerçeklestirilmistir. Ne yüksek pH (pH 10) ne de yüksek tuz (0.5M NaCI), alümden virüsü ayrlgtünada etkili yollar olmustur. EksipiyanlarI Eklenmesi: Alüm ile adsorbe edilen virüs kitlesinin stabilizasyonu Alüm formülasyonunun tamamlanmasElsonrasIa, alüm ile formüle edilen, inaktive edilmis virüsü stabilize etmek için eksipiyanlar eklenmektedir. Formüle edilen virüs, 10 mM Tris HCI, trimetilamin-N-oksit, pH 7.5 oranlarIia bir yaklastlZJ nihai konsantrasyona ayarlanmaktadlEl EksipiyanlarI bir on kere konsantre edilmis çözeltisi, 10 mM Tris HCl, 145 mM NaCl, 120 mM bir hedef bilesim ile hazlEIianmaktadlE 10x konsantre edilmis eksipiyan çözeltinin bir kEinÇblüm ile formüle edilen, inaktive edilmis virüsün 9 partisine eklenmektedir. Ortaya çilZlan süspansiyon, dolana kadar 2 ila 8°C'de depolanan Kitle Ilaç Ürününü olusturmak için 2 ila 8°C'de 5 dk boyunca karlgtülîhaktadlîl Kitle ilaç ürünü, gama radyasyonu tarafIan sterilize edilerek saglanan PETG plastik siselerde 2 ila 8°C'de depolanmaktadlB Plastik PETG siselerinin ürün temas yüzeyi, polietilen tereftalat glikol kopolyesterden olusturulmaktadlü Siselerdeki ürün temas yüzeyleri, USP <88 Sütü/I standartlarIDiarsHâmasügin gösterilmistir. Eksipiyan seçimi Alüm ile adsorbe edilen kitlenin stabilitesini optimize etmek için deneyler yaklasIiII bir tasarnühlîlandlîilmlg kosullar aItIda, baska bir deyisle 37°C'de YF virüsünün stabilitesi üzerindeki etkileri için GRAS maddelerinin çesitli kombinasyonlarlütamamlamak üzere kullanUIhlStlEl Tablo 2.2.9, hiçbir eksipiyan kontrolün olmamasEGlO mM Tris, 145 mM NaCl, pH 7.5) ile karsilâstlElliân en yüksek virüs stabilitesiniüreten bes formülasyon kosulunu listelemektedir.10 mM Tris, 145 mM NaCl, pH 7.5 bariün inaktive edilmis, alüm ile formüle edilen YF, 5 farklEformülasyon karlglmll mevcudiyetinde 12 gün boyunca 37°C'de inkübe edilmistir (Tablo 2.2.9). YF virüs titresi, alüm ile bagIEl/irüsü ölçen 2E10 monoklonal ELISA formatEllullanllârak günler 4, 7 ve 12'de belirlenmistir (Kesit 2.2.7.1.3); eksipiyan karlglmlarlü barißn formülasyonlar için titreler, yalnlîta NaCI-Tris HCl barIan kontrol numunesinin titresi ile karsllâstlEllüilgtlB Sonuçlar, alüm-ELISA Birimleri olarak ifade edilmektedir. SEKIL 1'de gösterildigi Üzere formülasyon karlgliîlilarlîaz ve 5), Gün 12'de en yüksek stabiliteyi saglamlgtlü Yüksek konsantrasyonda manitol, formülasyon karElElEGZYyi islevsiz yapmlgtlEi bundan dolayEl formülasyon karlglmEhumarasEß), nihai formülasyon için temel olarak seçilmistir. Sekil, 37°C'de 4, 7 ve 12 gün sonra degerlendirilen, farkllîliormülasyon tamponlarIa alüme adsorbe edilen YF 17D virüsünün stabilitesini gösteren bir grafiktir. 2E10 monoklonal ELISA taraf-an ölçülen YF titresi, alüm, test edilen bes formülasyon için grafige dönüstürülmektedir. Bu formülasyonlar, X-ekseninde numara ile gösterilmektedir; bu bilesimler asag-ki tabloda gösterilmektedir. KaII siyah çizgiler, inkübasyonun 4. günündeki titreyi temsil etmektedir, gri çizgiler inkübasyonun 7. günündeki titreyi temsil etmektedir ve çaprazlamas. çevrilmis çizgiler, inkübasyonun 12. günündeki titreyi temsil etmektedir. Asaglki tablo, inaktive edilmis, alüm ile baglDYF 17D virüsünün stabilizasyonu için test ettigimiz birçok formülasyon karlSlEliEtlan yalnlîta birkaçIIIistelemektedir. Tablo 2.2.9 Inaktive Edilmis, Alüm ila BaglElYF 17D virüsünün Stabilizasyonu için Test Edilen Formülasyon KarlglBilarEl Formülasyon KarlglIIlEKimligi Bilesenler: 1 Dekstran sülfat, 8.2 mM Malik asit, pH 7.5 2 Dekstr02, pH 7.5 4 Glütamik asit, pH 7.5 Formülasyon karlgtlfrlilîhumara (5)'teki tuz konsantrasyonunun, stabilite üzerindeki etkisini Trimetilamin-N-oksit, pH 7.5 bar-En inaktive edilmis, alüm ile formüle edilen YF 17D virüsü, Kontrol numunesi, 10 mM Tris, 145 mM NaCI barlEUlElnIgtlB YF virüs titresi, alüm ile bagllîvirüsü ölçen 2E10 monoklonal ELISA formatllullanllârak belirlenmistir. Alüm ile formüle edilen YF virüsü, 150 mM NaCl'de en stabil haldedir. 2E10 epitopun allEbnmasElle ölçüldügü üzere formüle edilmis, inaktive edilmis alüm ile bagllîlirüs, tuz konsantrasyonu arttllîça azalmlStlEl Bu verilere dayanarak, nihai formülasyon için kabul edilebilir bir profil saglamak amaclEa bir 145 ila 500 mM NaCI arallgilîbelirlenmistir. Baska bir örnekte, alüminyum hidroksit ("alüm") adjuvanlrîla adsorbe edilen bir beta-propiolakton (BPL) ile inaktive edilmis tam viryon asElhazlElhnmlStlE Intramüsküler enjeksiyonlar ile uygulanmasElçin enjeksiyona yönelik bir süspansiyon olarak saglanan aslZI kesintisiz Afrika yesil maymun böbrek (Vera) hücre kültüründe yetistirilen YF 17D susundan imal edilmistir. Virüs, Vera hücre kültürü aklgkanian hasat edilmistir, derinlik filtrasyonu, ultrafiltrasyon ile saflastlBIE'ilStlB beta-propiolakton (BPL) ile inaktive edilmistir, ayrlEla kromatografi ile saflastlEllBilgtB alüminyum hidroksit adjuvana adsorbe edilmistir ve bulusun bir yapllândlünas- göre stabilizatörler ile formüle edilmistir. AsÇP/00.2 alüm, 10 mM Tris HCI, 145 trimetilamin-N-oksit; pH 7.5 barIlElnak üzere formüle edilmistir. 37°C'de 4, 7 ve 12 gün sonra degerlendirilen, farklEformülasyon tamponlarlda alüme adsorbe edilen YF 17D virüsünün stabilitesi TR TR TR TR TR TR TR