TARIFNAME XY ES HUCRELERDEN FERTIL XY DISI HAYVAN URETIMI Teknik Alan Bulus, XY embriyonik kök ("ES") hücrelerinden elde edilen ve bir XY karyotipine sahip olan fertil disi hayvanlarin üretimi ile ilgilidir. Belirli bir somut örnekte, donör mürin ES hücrelerinden fertil XY disi fare üretilmesi için yöntemler ve terkipler tarif edilmektedir. Fenotipik disilerin olusumunu kolaylastirmak için in vitro fertilizasyon yöntemleri de tarif edilmektedir. Bulusun Arkaplani Genetigi degistirilmis fareler üretmek için yaygin olarak kullanilan ES hücre çizgilerinin neredeyse hepsi, genotipik erkek (XY) ES hücre çizgileridir. Sonuç olarak, FO jenerasyonunda, tüm XY hayvanlar erkektir. Çogu genetik modifikasyon, mevcut olan iki alelden birinde bir modifikasyon yaratmak için XY ES hücrelerinin hedeflenmesi yoluyla gerçeklestirilir; baska bir deyisle, donör fare ES hücresi, genetik modifikasyon için heterozigottur. Ancak, çogunlukla genetik modifikasyon için homozigot olan bir fare elde edilmesi istenir. Modifikasyonu içeren FO jenerasyonunda aslinda bütünüyle ES hücreden elde edilmis disi fare dogmadigi için, bir batinda dogan yavrulardan en az bir disinin (bir F1 disisi) genetik modifikasyon için heterozigot olabilmesi için FO erkegi tipik olarak bir disi (ör., ayni soydan üretilmis uygun bir disi) ile çiftlestirilir. Daha sonra, homozigot bir nesil elde etmek için, heterozigot F1 disisi bir F1 heterozigot erkegi ile melezlenir. Bu tür çiftlestirme gereklilikleri, maliyetli ve zaman alici adimlar içerir. Bir F0 jenerasyonunda bir üreme çifti olusturulmasi ya da en azindan büyük oranda ya da tamamen donör (XY erkek) ES hücresinden elde edilen bir FO disisi üretilmesi istenmektedir. Teknikte, bir donör erkek (XY) ES hücresinden, F0 jenerasyonunda fertil disi hayvan yapilmasi için yöntemler ve terkiplere ihtiyaç vardir. Bulusun Ozeti Bulus, bir FO jenerasyonunda fertil disi fenotipik olarak XY fare yapilmasi için, asagidakileri içeren bir yöntem saglamaktadir: (a) bir donör XY fare ES hücresinin, (i) en fazla 322 mOsm/kg ozmolalite gösteren bir baz besi ortami ve (ii) fare ES hücrelerinin kültür içinde tutulmasi için uygun Katki maddeleri içeren bir besi ortami içinde tutulmasi; (b) (a) adimindan gelen donör XY fare ES hücresinin, bir pre-morula konak fare embriyosuna eklenmesi; (c) konak embriyonun gebelik sürecine girmesi; ve (d) F0 jenerasyonunda, bir FO fenotipik olarak disi XY fare içeren fare nesli elde edilmesi; burada, FO fenotipik olarak disi XY fare, cinsel eriskinlige ulasmasi üzerine fertildir. Bulus, ayrica, bir FO jenerasyonunda embriyonik kök (ES) hücreden elde edilmis farelerin üretiminin verimliligini artirmak için, asagidakileri içeren bir yöntem de saglamaktadir:(a) bir donör XY fare ES hücresinin sunlari içeren bir besi ortami içinde tutulmasi: (i) bir baz besi ortami; ve (ii) fare ES hücrelerinin kültür içinde büyümesine uygun Katki maddeleri; burada, baz besi ortami, 1,5 - 2,2 mg/ml arasinda bir konsantrasyonda sodyum bikarbonat içerir ve 218-322 mOsm/kg arasinda bir ozmolaliteye sahiptir.(b) (a) Adimindan gelen donör XY fare ES hücresinin, bir pre-morula asamasi konak fare embriyosuna eklenmesi;(c) konak fare embriyosunun gebelik sürecine girmesi; ve(d) FO XY fare nesli elde edilmesi; burada, ES hücresinden elde edilen yavrularin, F0 jenerasyonunda üretilen tüm yavrulara orani, ES hücresinden elde edilen yavrularin, ozmolalitesi 322 mOsm/kg'den büyük olan bir besi ortami içinde tutulan donör XY ES hücrelerinden üretilen FO jenerasyonunda üretilen toplam yavrulara oranindan büyüktür. Bir yönde, bir XY donör hücresinden bir fertil disi insan disi hayvan yapmak için sunlari içeren bir yöntem tarif edilmektedir: (a) kimerik bir embriyo olusturmak için, insan disi bir konak embriyoya bir insan disi XY donör hücresi eklenmesi ve (b) insan disi bir disi hayvan olusturmak için kimerik embriyonun gebelik sürecine sokulmasi; burada, insan disi disi hayvan bir XY'dir ve cinsel eriskinlige ulasmasi üzerine fertildir. Bir yönde, insan disi hayvan, bir faredir. Bir yönde, insan disi XY disi hayvan, FO jenerasyonunda olusturulur. Bir yönde, F0 jenerasyonundaki insan disi disi XY hayvan, bir faredir ve %100 donör hücresinden gelen bir kürk rengine sahiptir. Bir yönde, FO jenerasyonunda olusturulan insan disi disi XY hayvan, en az %90, %92, %94, %96, %98 ya da %99,8 oraninda XY donör hücresinden elde edilir. Bir yönde, F0 jenerasyonundaki insan disi disi XY hayvan, yaklasik %100 donör hücresinden elde edilir. Bir yönde, konak embriyo hücresinin, FO jenerasyonundaki insan disi disi XY hayvana katkisi, 2000'de 1 hücreyi (%0,05) tespit edebilen bir nicel tayin ile belirlenir ve disi XY hayvanin hiçbir dokusu, konak embriyo hücresi katkisi için pozitif degildir. Bir somut örnekte, donör hücresi, bir genetik modifikasyon içerir. Bir somut örnekte, genetik modifikasyon, bir endojen nükleik asit diziliminin tamamen ya da kismen delesyonunu; bir ya da daha fazla nükleik asit sübstitüsyonunu; bir endojen nükleik asit diziliminin, ör., bir genin, bir heterolog nükleik asit dizilimi ile tamamen ya da kismen degistirilmesini; bir knock-out ve/veya knock-in islemini içerir. Bir yönde, yöntem, ayrica, genetik modifikasyon için heterozigot olan F0 jenerasyonundan bir XY erkegin, genetik modifikasyon için heterozigot olan F0 jenerasyonundan bir XY disi (ör., bir kardes) ile çiftlestirilmesi ve sözü edilen çiftlestirmeden, genetik modifikasyon için homozigot olan bir F1 jenerasyonu hayvani elde edilmesini içerir. Bir yönde, XY donör hücresi, konak embriyoya eklenmeden önce, baz besi ortami ve Katki maddeleri içeren bir besi ortami içinde tutulur ve burada, baz besi ortami, asagidakilerden olusan grup içinden seçilen bir özelligi gösterir: (a) yaklasik 250-310 mOsm/kg ozmolalite; (b) yaklasik 11-13 mS/cm iletkenlik; (c) yaklasik 60-105 mM konsantrasyonda bir alkalin metal ve halojenür tuzu; (d) yaklasik 20-30 mM konsantrasyonda bir karbonik asit tuzu; (e) toplamda en fazla 85-130 mM civarinda bir konsantrasyonda bir alkalin metal halojenür tuzu ve karbonik asit tuzu ve (f) bunlarin bir kombinasyonu. Bir somut örnekte, Katki maddeleri, ES hücrelerinin kültür içinde tutulmasi için bilesenler içerir. Bir somut örnekte, Katki maddeleri, fetal bovin serum (FBS), glutamin, antibiyotik(ler), piruvat, esansiyel olmayan amino asitler, 2-merkapt0etan0l ve LIF içinden bir ya da daha fazlasini içerir. Bir yönde, baz besi ortami, az tuzlu bir DMEM içerir. Özel bir yönde, az tuzlu DMEM, 85-130 mM NaCI konsantrasyonuna sahiptir. Bir yönde, baz besi ortami, ozmolalitesi düsük bir DMEM içerir. Özel bir somut örnekte, ozmolalitesi düsük DMEM, 250-310 mOsm/kg ozmolaliteye sahiptir. Bir yönde, baz besi ortami, iletkenligi düsük bir DMEM içerir. Özel bir yönde, iletkenligi düsük DMEM, 11-13 mS/cm iletkenlige sahiptir. Bir somut örnekte, donör hücresi, yaklasik 1, 2, 3, 4, 5, 6 gün, 1 hafta, 8, 9, 10, 11 ya da 12 gün, 2 hafta, 3 hafta ya da 4 hafta boyunca konak embriyoya eklenmeden önce belirtilen baz besi ortami arti Katki maddeleri içinde tutulur. Özel bir somut örnekte, donör hücresi, konak embriyoya eklenmeden önce en az bir hafta boyunca baz besi ortami arti Katki maddeleri içinde tutulur. Özel bir somut örnekte, donör hücresi, konak embriyoya eklenmeden önce 2-4 hafta boyunca baz besi ortami arti Katki maddeleri içinde tutulur. Bir yönde, konak embriyo, 2 hücre asamada, 4 hücreli asamada, 8 hücreli asamada, 16 hücreli asamada, 32 hücreli asamada ya da 64 hücreli asamada bir embriyodur. Baska bir yönde, konak embriyo, bir blastosisttir. Bir yönde, embriyo, bir pre-morula asamasi, morula asamasi, kompaktlasmamis morula asamasi ve kompaktlasmis morula asamasi içinden seçilen bir asamadadir. Bir yönde, embriyo asamasi, "Theiler (1989) "The House Mouse: Atlas of Mouse Development," Springer-Verlag, New York" referansli çalismada tarif edilen Theiler asamalarina atifla, bir Theiler Asamasi 1 (TS1), bir TS2, bir TSS, bir TS4, bir T85 ve bir TSG içinden seçilir. Özel bir yönde, Theiler Asamasi, T81, T82, T83 ve TS4 içinden seçilir. Bir yönde, embriyo, bir zona pellusida içerir ve donör hücresi, embriyoya zona pellusida içindeki bir delikten eklenen bir ES hücresidir. Bir yönde, embriyo, bir pre-blastosist embriyo içerir. Bir yönde, embriyo, morula asamasinda bir embriyo içerir. Ozel bir yönde, morula asamasindaki embriyo kümelenir. Bir yönde, embriyo, zona bulunmayan bir embriyo içerir. Bir yönde, XY donör hücresi, bir E8 hücresi, bir indüklenmis pluripotent kök (iPS) hücresi, bir pluripotent hücre ve bir totipotent hücre içinden seçilir. Özel bir yönde, XY donör hücresi bir fare E8 hücresidir ve konak embriyo bir fare embriyosudur. Bir somut örnekte, XY donör hücresi, ayni soydan üremis bir fare susundan bir ES hücresidir. Bir somut örnekte, XY donör hücresi, melez ya da ayri soydan üretmis bir fare susundan bir ES hücresidir. Bir yönde, konak embriyo, bir fare konak embriyosudur. Bir somut örnekte, fare konak embriyosu. ayni soydan üremis bir sustandir ve baska bir somut örnekte ise melez ya da ayri soydan üremis bir sustandir. Bir yönde, donör hücresi, bir fare donör hücresidir. Bir somut örnekte, konak embriyo ve donör hücresinin her ikisi de faredir ve her biri, birbirinden bagimsiz olarak, bir 129 susu, bir CS7BL/6 susu, 129 ve C57BL/6 susunun bir karisimi, bir BALC/c susu ya da bir Swiss Webster susu fareler arasindan seçilir. Belirli bir somut örnekte, fare, %50 129 ve %50 C57BL/6'dir. Bir somut örnekte, fare, 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 12981 (ör., 12981/SV, 12981/8vlm), 12982, 12984, 12985, 12989/8vEvH, 12986 (129/8vEvTac), 12987, 12988, 129T1, 129T2 olan bir sustan olusan grup içinden seçilen bir 129 susudur (bkz., ör., Festing v.d. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836). Bir somut örnekte, fare bir C57BL susudur; özel bir somut örnekte, CSTBL/A, 057BL/An, CSYBL/GrFa, CSTBL/KaLwN, CSYBL/G, C57BL/6J, CSYBL/öByJ, CSYBL/BNJ, CS7BL/10, CSYBL/108c8n, 057BL/10Cr, CSYBL/Ola arasindan seçilir. Özel bir somut örnekte, fare, yukarida bahsedilen 129 susu ve yukarida bahsedilen C578LI6 susunun bir karisimidir. Baska bir özel somut örnekte, fare, yukarida bahsedilen 129 suslarinin bir karisimi ya da yukarida bahsedilen BL/6 suslarinin bir karisimidir. Belirli bir somut örnekte, karisimin 129 susu, bir 12986 (129/8vEvTac) susunun karisimidir. Bir somut örnekte, XY fenotipik disi fare, ömrü boyunca 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ya da 9 batin canli fare üretir. Bir somut örnekte, XY disi fare, bir batinda en az 1,2, 3, 4, 5, 6, 7', 8, 9 ya da 10 yavru üretir. Bir somut örnekte, XY disi fare, bir batinda yaklasik 4-6 yavru üretir. Bir somut örnekte, XY disi fare, 2-6 batin üretir ve her bir batinda en az 2, 3, 4, 5 ya da 6 yavru bulunur. Bir somut örnekte, yavrularin yaklasik % 10, % 15, % 20, % 25, % 30, % 35, % 40, % 45 ya da % 50'si XY disi yavrulardir. Özel bir somut örnekte, yaklasik %15 - %25, XY disi yavrulardir. Bir yönde, genetik modifikasyon için heterozigot olan bir XY ES hücre kullanarak, genetik modifikasyon için homozigot olan bir fare üretmeye yönelik bir yöntem tarif edilmektedir. Bir yönde, bu yöntem, heterozigot bir XY donör ES hücresi olusturmak için bir XY donör ES hücresinin genetik olarak degistirilmesini, heterozigot XY donör ES hücresinin az tuzlu ve/veya ozmolalitesi düsük ya da iletkenligi düsük bir besi ortami içinde tutulmasi, heterozigot XY donör ES hücresinin pre-morula asamasinda bir konak embriyoya eklenmesini, konak embriyonun gebelik sürecine sokulmasini, ve gebelik sonrasinda, heterozigot modifikasyonu içeren ve en azindan kismen donör ES hücresinden elde edilen fertil bir F0 jenerasyonu disi XY fare elde edilmesini ve gebelik sonrasinda, heterozigot modifikasyonu içeren ve en azindan kismen donör ES hücresinden elde edilen bir fertil F0 jenerasyonu erkek XY fare elde edilmesini ve bir homozigot modifikasyon içeren bir F1 nesli elde etmek için FO erkegi ve F0 disisinin çiftlestirilmesini içerir. Bir yönde, FO jenerasyonu disi XY fare ve/veya F0 jenerasyonu erkek XY fare, en az %20 ya da daha fazla oranda donör ES hücresinden elde edilir. Bir yönde, FO disi XY fare, en az %30, %40, %50, %60, %70 ya da %80 oraninda donör ES hücresinden elde edilir. Bir yönde, F0 jenerasyonu disi XY fare ve/veya erkek XY fare, en az %90 oranda donör ES hücresinden elde edilir. Bir yönde, F0 disi XY fare, en az %92, %94, %96, %98, %99 ya da %99,8 oraninda donör ES hücresinden elde edilir. Bir yönde, FO disi XY fare ve/veya F0 erkek XY fare, %100 oranda ES hücreden elde edilen bir kürk rengine sahiptir. Bir yönde, F0 jenerasyonu fare, bir XY oosit içerir. Bir yönde, F1 jenerasyonu neslinden fare, bütünüyle donör ES hücresinden elde edilen bir genom içerir. Bir yönde, F0 jenerasyonu erkek ve F0 jenerasyonu disi farelerin, bütünüyle ES hücreden elde edilmis farelere yol açan çaprazlanma sikligi %100'dür. Bir yönde, bir fare yavrusu batini üretmek için, bu açiklamaya göre hazirlanan XY donör ES hücrelerinin konak fare embriyolarina eklenmesini, embriyolarin uygun bir fare içinde gebelik sürecine sokulmasini ve cinsel eriskinlige ulasmasi üzerinde fertil bir XY disi fare olan en az bir XY disi fare yavrusu içeren bir fare yavrulari batini elde edilmesini içeren bir yöntem tarif edilmektedir. Bir yönde, dogan disi fare yavrularindan cinsel eriskinlige ulasma üzerine fertil olanlarin yüzdesi yaklasik % 10, % 15, % 20, % 25, % 30, % 35, % 40, % 45 ya da % 50'dir. Özel bir yönde, bu yüzde yaklasik % 15-25rtir. Bir yönde, bir XY ES hücrenin kültür içinde tutulmasi için bir yöntem tarif edilmektedir ve bu yöntemde, XY ES hücre, XY ES hücrenin bir konak embriyoya eklenmesinden ve uygun bir disi fare içinde gebelik sürecine sokulmasindan sonra bir disi XY farenin gelisimini destekleyen ya da kolaylastiran kosullar altinda tutulur. Bu yöntem, bir baz besi ortami ve Katki maddeleri içeren uygun bir kültür besi ortami içinde tutulmasini içerir ve burada baz besi ortami, 240-320 mOsm/kg civarinda bir ozmolalite, 10-14 mS/cm civarinda bir iletkenlik, 50-105 mM civarinda bir konsantrasyonda alkalin metal halojenür tuzu, 10-40 mM civarinda konsantrasyonda bir karbonik asit tuzu ve/veya 80-140 mM civarinda konsantrasyonda bir karma alkalin metal tuzu ve karbonik asit tuzu içerir. Bir yönde, XY ES hücre, bir konak embriyoya eklenmeden önce yaklasik 1, 2, 3, 4, 5, 6 gün ya da 1 hafta, 8, 9, 10, 11 ya da 12 gün, 2 hafta, 3 hafta ya da 4 haftalik bir süre boyunca besi ortami (ES hücreleri korumak için Katki maddeleri ile birlikte) içinde tutulur. Belirli bir yönde, ES hücre, konak embriyoya eklenmeden önce yaklasik 2-4 hafta boyunca besi ortami (ES hücreleri korumak için Katki maddeleri içeren az tuzlu baz besi ortami) içinde tutulur. Bir somut örnekte, baz besi ortami, en fazla 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250 ya da 240 mOsm/kg civarinda bir ozmolalite gösterir. Bir somut örnekte, baz besi ortami, en fazla 240-320, 250-310 ya da 260-300 mOsm/kg civarinda bir ozmolalite gösterir. Belirli bir somut örnekte, baz besi ortami, yaklasik 270 mOsm/kg ozmolalite gösterir. Bir yönde, baz besi ortami, en fazla 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5 ya da 14,0 mS/cm civarinda bir iletkenlik gösterir. Bir yönde, baz besi ortami, en fazla 10-14 mS/cm ya da 11-13 mS/cm civarinda bir iletkenlik gösterir. Belirli bir yönde, baz besi ortami, 12-13 mS/cm civarinda bir iletkenlik gösterir. Belirli bir somut örnekte, baz besi ortami, 12-13 mS/cm civarinda bir iletkenlik ve 260-300 mOsm/kg civarinda bir ozmolalite gösterir. Baska bir özel yönde, baz besi ortami, yaklasik 90 mM NaCI konsantrasyonda sodyum klorür içerir. Baska bir özel yönde, sodyum klorür konsantrasyonu yaklasik 70-95 mM arasindadir. Baska bir özel yönde, baz besi ortami, yaklasik mM NaCI'den düsük bir konsantrasyonda sodyum bikarbonat içerir. Baska bir özel yönde, sodyum bikarbonat konsantrasyonu yaklasik 20-30 mM arasindadir. Bir yönde, baz besi ortami, en fazla yaklasik 100 mM konsantrasyonda bir alkalin metal ve halojenürtuzu içerir. Bir yönde, alkalin metal ve halojenürtuzu, NaCl'dir. Bir yönde, alkalin metal ve halojenür tuzunun konsantrasyonu en fazla 90, 80, 70, 60 ya da 50 mMidir. Bir yönde, alkalin metal ve halojenür tuzunun baz besi ortami içindeki konsantrasyonu yaklasik 60-105, 70-95 ya da 80-90 mM'dir. Özel bir yönde, bu konsantrasyon yaklasik 85 mM7dir. Bir yönde, baz besi ortami, bir karbonik asit tuzu konsantrasyonu sergiler. Bir yönde, karbonik asit tuzu, bir sodyum tuzudur. Bir yönde, sodyum tuzu, sodyum bikarbonattir. Bir yönde, karbonik asit tuzunun baz besi ortami içindeki konsantrasyonu en fazla 40, 35, 30, 25 ya da 20 mM*dir. Bir yönde, karbonik asit tuzunun baz besi ortami içindeki konsantrasyonu en fazla yaklasik 10-40, baska bir yönde ise yaklasik 20-30 mM'dir. Özel bir yönde, bu konsantrasyon yaklasik 25 ya da 26 mM*dir. Bir yönde, alkalin metal ve halojenür tuzunun ve karbonik asit tuzunun baz besi ortami içindeki konsantrasyonunun toplami en fazla 140, 130, 120, 110, 100, 90 ya da 80 mM*dir. Bir yönde, alkalin metal ve halojenür tuzunun ve karbonik asit tuzunun baz besi ortami içindeki konsantrasyonunun toplami yaklasik olarak 80-140, 85-130, 90-120, 95-120 ya da 100-120 mM*dir. Özel bir yönde, alkalin metal ve halojenür tuzunun ve karbonik asit tuzunun baz besi ortami içindeki konsantrasyonunun toplami yaklasik olarak 115 mM'dir. Bir yönde, alkalin metal ve halojenür tuzunun ve karbonik asit tuzunun mol orani 2,5,ten yüksektir. Bir yönde, bu oran yaklasik 2,6-4,0, 2,8-3,8, 3-3,6 ya da 3,2-3,4,tür. Bir yönde, bu oran 3,3-3,5'tir. Özel bir somut örnekte, bu oran 3,4rtür. Bir yönde, baz besi ortami, yaklasik 250-310 mOsm/kg arasinda bir ozmolalite ve yaklasik 60- 105 mM alkalin metal ve halojenür tuzu konsantrasyonu gösterir. Baska bir yönde, baz besi ortami, yaklasik 20-30 mM karbonik asit tuzu konsantrasyonuna sahiptir. Baska bir yönde, alkalin metal ve halojenür tuzunun ve karbonik asit tuzunun konsantrasyonlarinin toplami yaklasik olarak 80-140 mM'dir. Baska bir yönde, baz besi ortaminin iletkenligi yaklasik 12-13 mS/cmtdir. Bir yönde, bir donör XY ES hücresinin, bu belgede tarif edilen kosullar altinda kültür içinde tutulmasina yönelik bir yöntem açiklanmaktadir ve burada, donör XY ES hücresinin bir kimerik embriyo olusturmak üzere bir konak embriyoya eklenmesinden ve kimerik embriyonun uygun bir hayvan içinde gebelik sürecine sokulmasindan sonra, kimerik embriyo, en az %90 XY olan ve cinsel eriskinlige ulasmasi üzerine fertil hale gelen bir fare yavrusu olarak gelisir. Bir yönde, fare yavrusu en az %92, %94, %96, %98 ya da %99,8 oraninda XY'dir. Bir yönde, bir fertil XY disi hayvan üretmek için, bir XY donör hücresinin, donör hücresi bir konak embriyoya eklenmeden önce, az tuzlu baz besi ortami içeren bir besi ortami içinde tutulmasini, donör hücresinin konak embriyoya eklenmesini, konak embriyonun uygun bir hayvan içinde gebelik sürecine birakilmasini ve gebelik sonrasinda, XY disi hayvanin cinsel eriskinlige ulasma üzerine fertil hale geldigi bir XY disi hayvan elde edilmesini içeren bir yöntem tarif edilmektedir. Bir yönde, XY donör hücresi bir fare ES hücresidir ve konak embriyo, bir XX disi fareden bir embriyodur. Bir yönde, donör hücresinin tutuldugu kültür, bu belgede tarif edilen sekilde bir baz besi ortami ve fare ES hücrelerinin kültür içinde korunmasina uygun olan bir ya da daha fazla Katki maddesi içerir. Özel bir yönde, bir fare ES hücresinin kültür içinde korunmasina uygun olan bir ya da daha fazla Katki maddesi, FBS (90 ml FBS/0,5 L baz besi ortami), glutamin (2,4 mmol/O,5 L baz besi ortami), sodyum piruvat (0,6 mmoI/O,5 L baz besi ortami), esansiyel olmayan amino asitler (< 0,1 mmoI/O,5 L baz besi ortami), 2-merkapt0etan0l, LIF ve bir ya da daha fazla antibiyotiktir. Bir yönde, donör hücresi, donör hücresinin bir konak embriyoya eklenmesinden önce yaklasik 1, 2, 3, 4, 5 ya da 6 gün ya da 1 hafta, 8, 9, 10, 11 ya da 12 gün, 2 hafta, 3 hafta ya da 4 haftalik bir süre boyunca, az tuzlu bir baz besi ortami içeren bir besi ortami içinde tutulur. Belirli bir yönde, donör hücresi, donör hücresinin konak embriyoya eklenmesinden önce en az 2-4 hafta boyunca az tuzlu bir baz besi ortami içeren bir besi ortami içinde tutulur. Bir yönde, donör hücresi, az tuzlu baz besi ortami içeren bir besi ortami içinde tutulur (ör., dondurulur) ve donör hücresi, donör hücresinin konak embriyoya eklenmesinden önce en az 1, 2, 3 ya da 4 ya da daha fazla gün boyunca az tuzlu baz besi ortami içeren besi ortaminda çözündürülür ve korunur. Özel bir yönde, donör hücresi, az tuzlu baz besi ortami içeren bir besi ortami içinde en az bir kez pasajlanir; bu hücre, az tuzlu baz besi ortami içeren bir besi ortami içinde dondurulur ve bu hücre, az tuzlu baz besi ortami içeren bir besi ortami içinde çözündürülür ve konak embriyoya eklenmeden önce 1, 2, 3, 4, 5 ya da 6 gün ya da daha fazla ya da 1 hafta, 8, 9, 10, 11 ya da 12 gün, 2 hafta, 3 hafta ya da 4 haftalik bir süre boyunca büyütülür. Bir somut örnekte, donör hücresi, bir konak embriyoya eklenmeden önce bir, iki, üç ya da dört günlük bir süre boyunca tutulur. Bir somut örnekte, donör hücresi, 3 günlük bir süre boyunca belirtilen baz besi ortami içeren besi ortami içinde tutulur. Bir yönde, ayni F0 jenerasyonunda, her biri tamamen bir donör ES hücresinden elde edilen, fertil bir fare üreme çifti yapilmasi için asagidakileri içeren bir yöntem tarif edilmektedir: donör erkek fare XY ES hücrelerinin, bu belgede tarif edilen sekilde bir baz besi ortami ve Katki maddeleri içeren kültür içinde tutulmasi ve burada ES hücrelerinin en az bir günlük bir süre boyunca bu baz besi ortami ve Katki maddeleri içinde tutulmasi; kimerik embriyolar olusturmak için ES hücrelerinin konak embriyolara (ör., XX farelerinden) eklenmesi; kimerik embriyolarin uygun bir fare içinde gebelik sürecine birakilmasi ve uygun fareden, tamamen bir donör ES hücresinden elde edilen F0 jenerasyonu fertil bir erkek XY fare içeren ve tamamen bir donör ES hücresinden elde edilen FO jenerasyonu fertil bir disi XY fare içeren bir fare yavrulari batini elde edilmesi. Bir yönde, donör ES hücresi, bir genetik modifikasyon içerir. Bir somut örnekte, donör ES hücresi, heterozigot olan bir genetik modifikasyon içerir. Bir yönde, donör ES hücresi, bir heterozigot genetik modifikasyon içerir; F0 jenerasyonu fertil erkek fare ve F0 jenerasyonu fertil disi XY farelerin her biri, genetik modifikasyon için heterozigottur ve F0 jenerasyonu fertil erkek ve F0 jenerasyonu fertil disi birbiriyle çiftlestirilir ve genetik modifikasyon için homozigot olan bir F1 jenerasyonu fare nesli üretilir. Bir yönde, ES hücreleri, iki gün, üç gün ya da dört günlük bir süre ya da daha uzun bir süre boyunca korunur. Bir yönde, bir FO jenerasyonunda bir fertil disi XY fare üretmek için, (a) bir donör XY fare ES hücresinin, bir baz besi ortami ve fare ES hücrelerinin kültür içinde tutulmasi için uygun Katki maddeleri içeren bir besi ortami içinde tutulmasi, (b) donör XY fare ES hücresinin, bir konak embriyoya eklenmesi, (c) konak embriyonun gebelik sürecine birakilmasi, ve (d) XY disi farenin cinsel eriskinlige ulasmasi üzerine fertil hale geldigi bir XY disi fare nesli elde edilmesini içeren bir yöntem tarif edilmektedir. Bu yöne göre baz besi ortami, (1) 200 mOsm/kgrden baslayan ve 329 mOsm/kg'den az olan bir ozmolalite, (2) yaklasik 11-13 mS/cm arasinda bir iletkenlik, (3) yaklasik 50-110 mM arasinda bir konsantrasyonda bir alkalin metal ve halojen'ür tuzu, (4) yaklasik 17-30 mM arasinda bir konsantrasyonda bir karbonik asit tuzu ve (5) yaklasik 85-130 mM arasinda bir toplam konsantrasyonda alkalin metal halojen'ür tuzu ve karbonik asit tuzu arasindan seçilen bir ya da daha fazla özellik gösterir. Bir somut örnekte, donör XY fare ES hücresi, bir genetik modifikasyon içerir. Bazi somut örneklerde, genetik modifikasyon, bir endojen nükleik asit diziliminin bir ya da daha fazlasini, bir ya da daha fazla nükleik asidin bir sübstit'usyonunu; bir endojen nükleik asit diziliminin, bir heterolog nükleik asit dizilimi ile degistirilmesini; bir knock-out ve/veya knock-in islemini içerir. Belirli bir somut örnekte, genetik modifikasyon, bir STEAP2 geninin bir knock-out islemidir. Bir somut örnekte, baz besi ortami, diger seylerin yani sira, 50 ± 5 mM NaCl ve 26 ± 5 mM karbonat içerir (gösterir) ve ozmolalitesi 218 ± 22 mOsm/kg'dir. Özel bir somut örnekte, baz besi ortami, yaklasik 218 mOsm/kg ozmolalite ile yaklasik 3 mg/ml NaCI ve 2,2 mg/ml sodyum bikarbonat gösterir. Baska bir yönde, baz besi ortami, 87 ± 5 mM NaCl ve 18 ± 5 mM gösterir ve ozmolalitesi 261 ± 26 mOsm/kg'dir. Özel bir yönde, baz besi ortami, yaklasik 261 mOsm/kg ozmolalite ile yaklasik ,1 mg/ml NaCl ve 1,5 mg/ml sodyum bikarbonat gösterir. Baska bir somut örnekte, baz besi ortami, 110 ± 5 mM NaCl ve 18 ± 5 mM karbonat içerir ve ozmolalitesi 294 ± 29 mOsm/kg'dir. Ozel bir somut örnekte, baz besi ortami, yaklasik 294 mOsm/kg ozmolalite ile yaklasik 6,4 mg/ml NaCI ve 1,5 mg/ml sodyum bikarbonat gösterir. Baska bir somut örnekte, baz besi ortami, 87 ± 5 mM NaCI ve 26 ± 5 mM karbonat içerir ve ozmolalitesi yaklasik 270 ± 27 mOsm/kgidir. Özel bir somut örnekte, baz besi ortami, yaklasik 270 mOsm/kg ozmolalite ile yaklasik 5,1 mg/ml NaCl ve 2,2 mg/ml sodyum bikarbonat gösterir. Baska bir yönde, baz besi ortami, 87 ± 5 mM NaCl, 26 ± 5 mM karbonat ve 86 ± 5 mM glukoz gösterir ve ozmolalitesi 322 ± 32 mOsm/kgidir. Özel bir yönde, baz besi ortami, yaklasik 322 mOsm/kg ozmolalite ile yaklasik 5,1 mg/ml NaCl, yaklasik 2,2 mg/ml sodyum bikarbonat ve yaklasik 15,5 mg/ml glukoz gösterir. Bir yönde, F1 jenerasyonunda bir genetik modifikasyon için homozigot olan bir transgenik fare 'üretmek için, (a) yukaridaki yönteme göre 'üretilmis bir FO XY fertil disi farenin kohort bir F0 XY erkek fare ile melezlenmesi ve (b) genetik modifikasyon için heterozigot olan bir F1 nesli fare elde edilmesi adimlarini içeren bir yöntem tarif edilmektedir. Bu yöne göre, FO XY fertil disi fare ve F0 XY fertil erkek fareden her biri genetik modifikasyon için heterozigottur. Bazi yönlerde, genetik modifikasyon, bir endojen nükleik asit diziliminin bir ya da daha fazlasini, bir ya da daha fazla nükleik asidin bir sübstitusyonunu; bir endojen nükleik asit diziliminin, bir heterolog nükleik asit dizilimi ile degistirilmesini; bir knock-out ve/veya knock-in islemini içerir. Özel bir somut örnekte, FO XY fertil disi fare, ozmolalitesi 218 ± 22 mOsm/kg olan baz besi ortaminin 50 ± 5 mM NaCI ve 26 ± 5 mM karbonat içerdigi yukaridaki yönteme göre üretilmektedir. Belirli bir somut örnekte, baz besi ortami, yaklasik 218 mOsm/kg ozmolalite ile yaklasik 3 mg/ml NaCI ve 2,2 mg/ml sodyum bikarbonat gösterir. Bir yönde, yukaridaki yönteme göre üretilen, bir genetik modifikasyon için homozigot bir transgenik fare tarif edilmektedir. Bir yönde, yukaridaki yöntemlerden herhangi birine göre üretilen bir fertil disi XY fare tarif edilmektedir. Bir yönde, XY disi farenin elde edildigi ES hücreler, 50 ± 5 mM NaCI ve 26 ± 5 mM karbonat içeren ve ozmolalitesi 218 ± 22 mOsm/kg olan bir baz besi ortami içinde tutulur. Özel bir yönde, baz besi ortami, yaklasik 218 mOsm/kg ozmolalite ile yaklasik 3 mg/ml NaCI ve 2,2 mg/ml sodyum bikarbonat gösterir. Aksi açik bir sekilde belirtilmedigi ya da baglamdan anlasilmadigi sürece, bu belgede tarif edilen tüm yönler ya da somut örnekler birbiriyle birlestirilebilir. Sekillerin Kisa Tarifnamesi Sekil 1, farkli XY ES hücre klonlarindan üretilen FO jenerasyonu disi XY fareler kullanarak çiftlestirme sonuçlarini göstermektedir. Sekil 2, az tuzlu DMEM, DMEM ya da FS (Wnt-3a ile kosullandirilmis besi ortami; yani, bir Wnt-3a-ekspresyon yapisi ile transfekte edilmis fare L-hücreleri ile kosullandirilmis besi ortami) ile takviye edilmis az tuzlu DMEM, NaCI ve NaHCOa ile inkübe edilen ES hücrelerden XY disi fare üretimini göstermektedir. Ayrintili Tarifname "Baz besi ortami" ya da "baz besi ortamlari" ifadeleri, teknikte bilinen ve ES hücrelerin kültür içinde büyütülmesi ya da korunmasi için uygun olan bir baz besi ortami (ör., DMEM) içerir. Fertil bir XY disi üretmek için uygun olan baz besi ortamlari (yani, "az tuzlu DMEM"), ES hücrelerin kültür içinde korunmasi için tipik olarak kullanilan baz besi ortamlarindan farklidir. Baz besi ortamlari genel olarak tartisma amaçlari dogrultusunda, fertil XY disiler üretmek için uygun olmayan baz besi ortamlari bu bölümde ve asagidaki tabloda "DMEM" (ör., tipik DMEM besi ortamlari) olarak tarif edilmektedir. Fertil XY disilerin üretilmesi için uygun olan baz besi ortamlari tartisma amaçlari dogrultusunda, "az tuzlu DMEM" ifadesi kullanilmaktadir. ES hücrelerin kültür içinde korunmasi için tipik olarak kullanilan baz besi ortamlari (ör., DMEM) ile fertil XY disiler üretmek için uygun olan baz besi ortamlari (bn, "az tuzlu DMEM") arasindaki farklar bu belgede belirtilmektedir. "Az tuzlu DMEM" ifadesi kolaylik için kullanilmaktadir; fertil XY disiler 'üretmek için uygun olan DMEM, "az tuzlu" olma özelliginin yani sira, bu belgede tarif edilenleri içerir. Ornegin, Tablo 1'de gösterilen DMEM, Tablo 1*de gösterilen DMEM ile karsilastirildiginda farkli bir ozmolalite ve farkli bir iletkenlik ile sonuçlanacak sekilde, bu belgede verilen sodyum klorür ve/veya sodyum bikarbonat konsantrasyonlarinin degistirilmesi yoluyla fertil XY disiler 'üretilmesi için uygun hale getirilebilir. Baz besi ortamlarinin bir 'Örnegi, çesitli formlarda Dulbeco Modifiye Eagle Besi Ortamidir (DMEM) ('or., Invitrogen DMEM, Kat. No. 11971-025) (Tablo 1). Uygun bir az tuzlu DMEM, piyasada KO-DMEMTM olarak bulunmaktadir (Invitrogen Kat. No. 10829-018). Baz besi ortami, hücrelerin donör hücreleri olarak kültür için tutulmasi için kullanildigi zaman, tipik olarak, teknikte bilinen bir dizi Katki maddesi ile takviye edilir. Bu tür Katki maddeleri, bu açiklamada "Katki maddeleri" ya da "+ Katki maddeleri" olarak gösterilmektedir. Tablo 1: ES Hücreleri Korumak için DMEM Baz Besi Yerleri Bilesen mgIL mM Glisin 30 0,4 L-ArgininoHCI 84 0,398 L-Sistin02HCI 63 0,201 L-Glutamin 584 4 L-Histidin-HCl-H20 42 0,2 L-Izol'ösin 105 0,802 L-L"osin 105 0,802 L-Lizin-HCI 146 0,798 L-Metiyonin 30 0,201 L-Fenilalanin 66 0,4 L-Serin 42 0,4 L-Treonin 95 0,798 L-Triptofan 16 0,0784 L-Tirozin disodyum tuzu dihidrat 104 0,398 L-Valin 94 0,803 Kolin Klor'ür 4 0,0286 D-Kalsiyum pantotenat 4 8,39 X 10'3 Folik Asit 4 9,07 x 10-3 Niasinamit 4 0,0328 Piridoksin-HCI 4 0,0196 Riboflavin 0,4 1,06 x 10'3 Tiamin'HCI 4 0,0119 Bilesen mg/L mM i-Inositol 7,2 0,04 Kalsiyum Klorür (CaCh) (susuz) 200 1,8 Ferrik Nitrat (Fe(N03)3-9H20) 0,1 2,48 x 104 Magnezyum Sülfat (MgSO4) (susuz) 97,67 0.814 Potasyum Klorür (KCI) 400 5,33 D-Glukoz (Dekstroz) 4500 25 Fenol Kirmizisi 15 0,0399 DMEM'in NaCIINaHCOs Içerigi Sodyum Bikarbonat (NaHC03) 3700 44,05 Sodyum Klorür (NaCI) 6400 110,34 Az tuzlu DMEMiin NaCI/NaHCOs Içerigi Sodyum Bikarbonat (NaHC03) < < 44,05 3700 Sodyum Klorür (NaCI) < < 6400 110,34 "Katki maddeleri" terimi ya da "+ Katki maddeleri" ifadesi, donör hücrelerinin kültür içinde büyütülmesi ya da korunmasi için, ör., kültür icinde donör hücrelerin pluripotent ya da totipotent özelliginin korunmasi için eklenen elemanlari kapsar. Ornegin, insan disi ES hücrelerin kültür içinde büyütülmesi ya da korunmasi için uygun olan besi ortami Katki maddeleri arasinda fetal bovin serum (FBS), glutamin, penisilin ve Streptomisin (ör., penstrep), piruvat tuzlari (ör., sodyum piruvat), esansiyel olmayan amino asitler (ör., MEM NEAA), 2-merkapt0etan0l ve LIF sayilabilir. Insan disi donör hücrelerinin kültür içinde korunmasina yönelik besi yerlerinin çesitli yönlerinde, yaklasik 500 ml baz besi ortamina asagidaki Katki maddeleri eklenir: yaklasik 90 ml FBS (ör., Hyclone FBS Kat. No. SH30070.03), yaklasik 2,4 milimol glutamin (ör., yaklasik 12 ml 200 mM glutamin çözeltisi, ör., Invitrogen Kat. No. 25030-081), penisilin: streptomisin (ör., 60.000 birim Penisilin G sodyum ve 60 mg Streptomisin sülfat ile birlikte 51 mg NaCI; ör., yaklasik 6 ml lnvitrogen pennstrep, Kat. No. 15140-122), yaklasik 0,6 milimol sodyum piruvat (ör., 6 ml 100 mM sodyum piruvat, Invitrogen Kat. No. 11360-070), yaklasik 0,06 milimol esansiyel olmayan amino asitler (ör., yaklasik 6 ml MEM NEAA, ör., MEM NEAA, Invitrogen Kat. No. 11140-050), yaklasik 1,2 ml 2-merkapt0etan0l ve yaklasik 1,2 mikrogram LIF (ör., yaklasik 120 mikrolitrelik 106 birim/ml LIF preparati; ör., yaklasik 120 mikrolitre Millipore ESGROTM-LIF, Kat. No. ESG1107). Fertil XY disileri üretmek için XY ES hücrelerin korunmasi amaciyla baz besi yerleri olusturulurken, tipik olarak ayni miktarlarda ayni Katki maddeleri kullanilir ancak baz besi ortaminin terkibi (DMEM7den, ör., yukaridaki tabloda tarif edilen besi yerlerinden) farklilik gösterir ve fark (farklar), bu belgede anlatilan farklara karsilik gelir. Bazi yönlerde, Katki maddeleri, Wnt ile kosullandirilmis besi yerleri, ör., Wnt-Sa ile kosullandirilmis besi yerleri içerir. Donör hücrelerine ve/veya konak embriyolara atiflardaki "hayvan" terimi memeliler, baliklar ve kuslari kapsar. Memeliler, ör., insanlar, insan disi primatlar, kemirgenler (ör., fare, siçan, hamster, kobay) ve besi hayvanlarini (ör., büyükbas türleri, ör., inek, dana, vb., küçükbas türleri, ör., koyun, keçi, vb. ile domuz türleri, ör., domuzlar ve yaban domuzlari) kapsar. Kuslar, ör., tavuk, hindi, devekusu, kaz, ördek, vb.'ni kapsar. Donör hücrelerine ve/veya konak embriyoya atifla "insan disi hayvan" ifadesi, insanlari kapsam disi birakir. Çesitli yönlerde, donör hücresi ve/veya konak embriyo, asagidakilerden bir ya da birkaçi degildir: Akodon türleri, Myopus türleri, Microtus türleri, Talpa türleri. Çesitli yönlerde, donör hücresi ve/veya konak embriyo, bir normal dogal sus özelligi XY disi fertilitesi olan herhangi bir tür degildir. Çesitli yönlerde, donör hücresi ya da konak embriyoda bir genetik modifikasyon bulunmasi durumunda, genetik modifikasyon, bir XYY ya da XXY, bir Tdy-negatif cinsiyet degisimi, Tdy-pozitif cinsiyet degisimi, bir X0 modifikasyonu, bir anöploidi, bir SRY translokasyonu ya da modifikasyonu, bir fgf9"' genotipi ya da bir SOX9 modifikasyonu degildir. Genel Görünüm Donör ES hücrelerinden ve konak embriyolardan insan disi hayvanlar, ör., fareler üretme yöntemleri teknikte bilinmektedir. Donör ES hücreleri, hücrelerin, bir konak embriyoya yerlesme becerisini artiran ve dolayisiyla donör ES hücreleri ve konak embriyo tarafindan olusturulan bir hayvana kismen ya da büyük ölçüde katkida bulunan belirli özellikler için seçilir. Olusan hayvan, büyük ölçüde ES hücrenin genotipine (ör., XY ya da XX) bagli olarak erkek ya da disi olabilir. Fare üretmeye yönelik ES hücre çizgilerinin çogunlugu, bir erkek XY genotipine sahiptir. Y kromozomunun memeli cinsiyetinin belirlenmesindeki agirligi nedeniyle, XY ES hücreler, bir konak embriyoya eklendikleri ve gebelik sürecine birakildiklarinda, birinci jenerasyonda (F0) neredeyse her zaman kimera olan, yani erkek donör ES hücresinden (XY) elde edilen hücreler ve erkek (XY) ya da disi (XX) olabilen konak embriyodan elde edilen hücreler içeren fenotipik olarak erkek hayvanlara yol açar. FO jenerasyonunda fenotipik disiler gözlendigi ölçüde, bu, tipik olarak, bir disi XX embriyoya XY ES hücreleri eklenmesinden kaynaklanir ve bu da ES hücre katkisi embriyonik genital çizginin erkeklesmesi için yetersiz olan bir kimeraya yol açar. Çogu durumda, bu tür disi kimeralar, XY ES hücrelerden elde edilen oositler üretmez ve bu nedenle, ES hücre genomunu sonraki jenerasyona iletemez. Nadir durumlarda, disi kimeralar, XY ES hücrelerden elde edilen oositler üretmez; bu disiler, ES hücre genomunu sonraki jenerasyona iletebilir (bkz. ör., Bronson v.d. (1995) High incidence of XXY and XYY males among the offspring of female chimeras from embryonic stem cells, Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:3120- 3123). Spesifik mutasyonlar sonucunda, bir XY genotipine sahip fenotipik olarak disi fareler ortaya çikabilir. Bkz. ör., LoveIl-Badge v.d. (1990) XY female mice resulting from a heritable mutation in the primary testis determining gene, Tdy, Development 109:635-646; ayrica bkz. Colvin v.d. (2001) Male-to-Female Sex Reversal in Mice Lacking Fibroblast Growth Factor 9, Cell 104(6):875-889 (Fgf-l- XY females that die at birth from lung hypoplasia). Güney Amerika kemirgen Akadon türleri, XY disileri içerir (bkz. ör., Hoekstra v.d. (2000) Multiple origins of XY female mice (genus Akodon): phylogenetic and chromosomal evidence, Proc. R. 800. Lond. B 267z1825-1831), ancak bu tür farelerden ES hücre çizgileri genel olarak mevcut degildir ve olsa bile yaygin olarak kullanilmamaktadir. Bazi durumlarda, ör., VELOCIMOUSE® yöntemi kullanilarak (bkz. ör., ABD Pat. No. 7.659.442, 7.576.259, 7.294.754 ve Poueymirou v.d. (2007) F0 generation micefully derived from gene- targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses, Nat. Biotech. 25(1 2- p):91-99) J 2).01-00, bütünüyle donör ES hücresinden elde edilen FO jenerasyonu fareleri elde edilmesi mümkündür. Normal kosullar ve Standart deney kosullari altinda, XY donör ES hücreleri yalniz bütünüyle ES hücreden elde edilmis fenotipik olarak erkek fareler üretirken, XX ya da X) (Y kromozomunu kaybetmis olan XY ES hücreler) olan ES hücreler, yalniz bütünüyle ES hücreden elde edilmis fenotipik olarak disi fareler üretir. Bütünüyle ES hücresinden elde edilmis erkek ve disi farelerden homozigot hedefli mutasyonlara sahip fareler üretilmesi, ilk olarak, birbiriyle melezlendigi zaman F2 jenerasyonunda homozigot nesil üretme potansiyeline sahip olan F1 jenerasyonu heterozigot erkek ve disilerini üretmek için iki müteakip jenerasyon çiftlesme gerektirir. Bulusu yapanlar, bir XY donör hücresi (ör., fenotipik olarak erkek bir fareden elde edilen bir XY donör hücresi) ve uygun bir konak embriyodan fenotipik olarak disi bir fertil XY fare üretmeye yönelik bir yöntem gelistirmistir. Bu yöntem, F0 jenerasyonunda bir üreme çifti (bir erkek F0 ve bir disi F0) olusturmaya imkan saglayan bir farenin F0 jenerasyonunda üretilmesini içerir. Bu, özellikle donör hücresi bir heterozigot genetik modifikasyon içerdigi ve bir homozigot fare istendigi zaman faydalidir. Bu açiklama, donör fare CY ES hücrelerinden fenotipik olarak disi fertil XY fareler üretilmesini tasvir etmesine ragmen, bu belgede tarif edilen yöntemler ve terkipler, her türlü uygun insan disi hücreden (ör., bir iPS hücresi, bir ES hücre ya da bir pluripotent hücre) ve her türlü uygun insan disi embriyodan fenotipik olarak disi XY fertil insan disi hayvanlar üretilmesi için de uygulanabilir. Bir donör hücresinin korunmasi için kosullar içeren ve böylece bir konak embriyoya donör hücresinin eklenmesi yoluyla bir hayvan olusturmak için bu donör hücresinin kullanilmasi durumunda, bu sekilde üretilen hayvanin fenotipik olarak disi bir fertil XY hayvan içermesini saglayan yöntemler ve terkipler tarif edilmektedir. Fenotipik olarak disi fertil bir XY hayvan, yumurtlamak için ve embriyonun gebelik sürecini geçirerek canli bir hayvan dogurmak dahil olmak üzere, hayvanda yumurtlama ile üretilen bir yumurtanin döllenmesi üzerine bir embriyo tasiyabilmek için fenotipik olarak yeterince disi özellik sergileyen bir hayvani kapsar. Bulusu yapanlar, çesitli yönlerde, en az yaklasik %10, %15, %20 ya da %25 ya da daha büyük oranda, bir XY fare ES hücresinden bir fertil disi XY fare dogumuna yol açan bir yöntem gelistirmistir. Hayvan Yetistiriciligi Bir yönde, bir sperm hücresi ve bir yumurta hücresinden bir disi hayvan üretmek için, sperm hücresi ve/veya yumurta hücresinin döllenmeden önceki bir, iki, üç ya da dört ya da daha fazla gün boyunca az tuzlu baz besi ortami içeren bir besi ortaminda tutulmasini, sperm hücresi ve yumurta hücresinin döllenmis bir yumurta olusturmak için döllenmeye izin veren kosullar altinda temasa sokulmasini, döllenmis gebelik için yumurtanin uygun bir konak içine yerlestirilmesini, konagin gebelik sürecine birakilmasini ve bir disi hayvan içeren bir batin elde edilmesini içeren bir yöntem tarif edilmektedir. Bir yönde, döllenmis yumurta, ayrica, uygun konaga yerlestirme öncesinde bir, iki, üç ya da dört ya da daha fazla gün boyunca az tuzlu baz besi ortami içeren bir besi ortami içinde de tutulur. Bir yönde, döllenmis bir yumurta ya da bir embriyodan bir disi hayvan üretilmesini kolaylastirmak için, döllenmis yumurta ya da embriyonun uygun bir konaga yerlestirme öncesinde bir, iki, üç ya da dört ya da daha fazla gün boyunca az tuzlu baz besi ortami içeren bir besi ortaminda tutulmasini, döllenmis yumurta ya da embriyonun gebelik için uygun bir konak içine yerlestirilmesini, konagin döllenmis yumurta ya da embriyonun konak içinde gebelik sürecine birakilmasini ve bir disi hayvan içeren bir batin elde edilmesini içeren bir yöntem tarif edilmektedir. Bir yönde, bu belgede tarif edilen yöntemler ve terkipler disi bir evcil hayvan, disi bir evcillestirilmis çiftlik hayvani, bilimsel arastirma denegi olarak disi bir hayvan ya da nesli tükenen türlerden bir hayvan üretmek için kullanilir. Bir somut örnekte, bu hayvan bir fare, siçan, hamster, maymun, kedi, köpek, inek, at, boga, koyun, keçi, domuz, geyik ve bizondur. `ORN EKLER 'Ornek 1: Don'ör XY ES Hücreleri ve Konak Embriyolar Donbr Hücreleri ve Konak Embriyolar. Donör ES hücreleri, 12986C57BI6/F1 melez hücrelerdir. Donör ES hücreleri, kullanima kadar %10 DMSO ihtiva eden dondurucu besi ortami içinde dondurulmustur. Donör ES hücreleri, buzu çözüldükten sonra, asagida tarif edilen sekilde baz besi ortami içinde tutulmustur. Konak embriyolar, Swiss Webster (SW) farelerinden alinmis ve kullanima kadar KSOM besi ortami (Millipore) içinde tutulmustur. Sekiz hücreli embriyolar yukarida tarif edilen sekilde elde edilmistir (Poueymirou v.d. (2007) Nature Biotech. 25(1 ):91 - 99; ABD Pat. No. 7.659.442, 7.576.259 ve 7.294.754). DMEM ES hücreler: Hazirlanan ve DMEM içinde dondurulan ES hücreler, DMEM içinde çözdürülmüs, üç gün boyunca büyütülmüs ve DMEM içinde konak embriyolara mikro enjekte edilmistir. Az tuzlu DMEM ES hücreleri: Hazirlanan ve az tuzlu DMEM içinde dondurulan ES hücreler, az tuzlu DMEM (KO-DMEM) içinde çözdürülmüs, üç gün boyunca büyütülmüs ve DMEM içinde konak embriyolara mikro enjekte edilmistir. FS az tuzlu DMEM: Hazirlanan ve az tuzlu DMEM içinde dondurulan ES hücreler, az tuzlu DMEM (440 ml) + %10 Wnt-Sa ile kosullandirilmis besi ortami (F8) (60 ml) içinde çözdürülmüs ve DMEM içinde konak embriyolara mikro enjekte edilmistir. Az tuzlu DMEM + NaCl + NaHCOaz Hazirlanan ve NaCI (1.300 mg/L) ve NaHCOa (1.500 mg/L) eklenmis az tuzlu DMEM içinde dondurulan ve DMEM içinde konak embriyolara mikro enjekte edilen ES hücreler. %10 Wnt-3a ile kosullandirilmis besi ortami (FS): Wnt-3a ile kosullandirilmis besi ortami, bir Wnt-3a ekspresyon vektörü (ATCC CRL-2647) ile dönüstürülmüs olan fare L hücrelerinin kültürlerinden yapilmistir. L hücreleri, bir FibraStageTM (New Brunswick) içinde, ATCC talimatlarina göre (DMEM yerine KO-DMEMTM kullanilmasi hariç olmak üzere) büyütülmüstür. 'Ornek 2: Donbr ES Hücrelerinden Elde Edilen F0 Jenerasyonu Farelerin Uretilmesi F0 Jenerasyonu Farelerin Uretilmesi. Donör ES hücreler, fare ES hücrelerinin bu belgede tarif edilen sekilde baz besi ortami arti Katki maddeleri içinde tutulmasi hariç olmak üzere yukarida tarif edilen sekilde (Poueymirou v.d. (2007) Nature Biotech. 25(1):91-99; ABD Pat. No. 7.659.442, 7.576.259 ve 7.294.754) VELOCIMOUSE® yöntemi kullanilarak 8 hücreli pre-morula asamasi konak embriyolara eklenmistir. Mikro enjeksiyon için, ES hücreler büyütülmüs ve embriyolara mikro enjekte edilmistir ve embriyolar, tasiyici annelere yerlestirme Öncesinde KSOM ya da DMEM besi ortami içinde gece boyunca kültüre birakilmistir. 'Ornek 3: Don'ör XY ES Hücrelerden F0 Jenerasyonu Fertil Disi Fareler Tipik bir protokolde, ES hücreler, KO-DMEMTM varliginda çözdürülmüs ve bir pasaj için büyütülmüstür (yaklasik 5 gün boyunca). Pasajlanan hücreler, daha sonra, bir gen hedefleme vektörü ile elektroporasyona tabi tutulmus ve ardindan KO- DMEMTM (Invitrogen Kat. No. 10829-018) içeren bir besi ortami içinde 10 gün boyunca seçime sokulmustur. Ilaca dirençli hücreler hasat edilmis ve K0- DMEMTM içeren bir besi ortami içinde yayilmis ve ardindan dondurulmustur. Mikro enjeksiyon için, hücreler KO-DMEMTM içinde çözdürülmüs ve K0- DMEMTM içinde 3 gün boyunca büyütülmüs ve ardindan DMEM içinde embriyolara mikro enjekte edilmistir. Daha sonra, embriyolar gebelik süreci için Tasiyici annelere aktarilmistir. Fare yavrulari, ilk olarak, üreme çiftlerinin seçilmesi için dis üreme organlarinin görünümüne bagli olarak disi ya da erkek olarak karakterize edilmistir. Sekil 1, F0 XY disilerinin yüksek oranda fertilite sergiledigini göstermektedir. 33 F0 XY disisinden yirmi bir tanesi yavru üretmistir. Ornek 4: DMEM ile Az Tuzlu DMEM,in Karsilastirilmasi Bir Advanced® Model 3250 Tek Numuneli Ozmometre üzerinde ozmolalite ölçülmüstür. Iletkenlik, bir Mettler Toledo GmbH SevenMultiTM ECN # 15055 iletkenlik ölçer ile ölçülmüstür. Az tuzlu DMEM ve DMEMin (her birinde Katki maddeleri de bulunur), XY ES hücrelerden F0 jenerasyonu XY disilerinin olusumu üzerindeki etkisi arastirilmistir. Tablo 2, ilave tuz ve/veya Katki maddesi içeren ve içermeyen baz besi yerlerinin ozmolalite ve iletkenlik degerlerini göstermektedir. "+ Katki maddeleri" ifadesi = asagidakilerin eklenmesi (0,5 L baz besi ortamina): 90 ml Hyclone FBS (Kat. No. SH30070.03), 12 ml Invitrogen glutamin çözeltisi (Kat. No. 25030-081), 6 ml Invitrogen Pen Strep (Kat. No. 15140-122), 6 ml Invitrogen sodyum piruvat (Kat. No. 11360- 070), 6 ml MEM NEAA (Invitrogen Kat. No. 11140-050), 1,2 ml 2-merkapt0etanol ve 120 mikrolitre Millipore ESGROTM-LIF (Kat. No. ESG1107). Sekil 2, konak embriyolara mikro enjeksiyon öncesinde farkli besi yerleri içinde büyütülen XY ES hücrelerin karsilastirmasini göstermektedir. Az tuzlu DMEM içinde büyütülen ve tutulan ve ardindan embriyolara enjekte edilen XY ES hücreler, XY disiler üretmistir. NaCI ve NaHCOs ile takviye edilmis az tuzlu DMEM içinde büyütülen ve tutulan ve ardindan embriyolara enjekte edilen XY ES hücreler, XY disiler üretmemistir. Bu, XY ES hücreler az tuzlu DMEM içinde tutuldugu zaman XY disi üretiminin desteklendigini ve XY ES hücrelerin cinsiyet oraninin, baz besi ortaminin tuz konsantrasyonu degistirilerek kontrol edilebildigini göstermektedir. Az tuzlu DMEM içine Wnt-3a ile kosullandirilmis bir besi ortami (%10 F8) eklenmesi, FO XY disilerinin üretim sikligini artirmistir. Ayrica, ES hücreler az tuzlu DMEM içinde tutuldugu zaman, FO jenerasyonunda ES hücreden elde edilmis fareler üretme verimliligi artmistir. ES hücreden elde edilmis yavrularin, F0 jenerasyonunda üretilen tüm yavrulara orani, DMEM içinde tutulan ES hücreler için yaklasik %23 oranindan, az tuzlu DMEM içinde tutulan ES hücreler için %61e ve %10 Wnt-3a ile kosullandirilmis besi ortami ile takviye edilmis az tuzlu DMEM içinde tutulan ES hücreler için %72'ye çikmistir. Bkz. Sekil 2. Tablo 2: DMEM ve Az Tuzlu DMEM Fiziksel Özelliklerinin Karsilastirmasi ES Hücreler için besi ortami Iletkenlik Ozmolalite (mS/cm) (mOsmlkg) Az Tuzlu DMEM, tek basina 12,84 270 DMEM, tek basina 15,40 337 A2 Tuzlu DMEM + NaHCOs + NaCI, tek basina 15,82 342 A2 Tuzlu DMEM + Katki maddeleri 12,75 279 DMEM + Katki maddeleri 14,91 330 A2 Tuzlu DMEM + NaHCOs + NaCI + Katki maddeleri 15,29 335 Ornek 5: F0 Jenerasyonu Farelerin Analizi Kürk Rengi. Fareler, donör XY ES hücreler (aguti) ve konak embriyodan (beyaz) kürk rengi katkisi bakimindan analiz edilmistir. F0 jenerasyonu farelerden hiçbiri, konak embriyolardan herhangi bir kürk rengi katkisi sergilememistir. Cinsiyet. F0 jenerasyonu yavrular, dis cinsel organlarin görsel muayenesi ile disi ya da erkek olarak belirlenmistir. FO yavrularina görsel muayeneye göre cinsiyet atanmis ve bu yavrular üreme için eslestirilmistir. Genotipleme. X kromozomu üzerinde bir dizilime özgü bir TAQMANTM QPCR tayini kullanilarak bir X kromozomunun varligi tespit edilmistir. Y kromozomu üzerinde bir dizilime özgü bir TAQMANT'VI QPCR tayini kullanilarak Y kromozomunun varligi tespit edilmistir. Fenotipik olarak disi F0 jenerasyonu farelerin genotiplemesi, test edilen fenotipik olarak disi farelerde X kromozomunun tek bir kopyasini ve Y kromozomunun tek bir kopyasini göstermistir. Karyotipleme: Alti adet F0 jenerasyonu XY disileri karyotiplenmistir. Karyotipleme sonuçlari, alti disinin tamaminin normal bir X ve normal bir Y kromozomuna sahip oldugunu göstermistir. XY Disi Ureme Anatomisi. Birkaç F0 jenerasyonu XY disisi, iç üreme organlari bakimindan incelenmistir. Incelenen FO XY disilerinin hepsi, normal disi iç üreme organlarina sahip görünmüstür. Her bir üreme organinda (yumurtalik, yumurta kanali, rahim) genotiplenmis ve sonuçlar, dokularin tekbiçim bir XY genotipine sahip oldugunu göstermistir. 'Ornek 6: Ozmolalitenin, ES H'ücreden Elde Edilmis Yavrular ve XY Disileri Uretme Verimliligi Uzerindeki Etkisinin Analizi Ozmolalitenin, az tuzlu ve az karbonatli DMEM içinde tutulan XY ES hücrelerinden XY disileri üretilmesi üzerindeki etkisini belirlemek amaciyla, ozmolaliteyi DMEM ozmolalitesine getirmek için az tuzlu ve az karbonatli DMEM'e glukoz eklenmistir. Bir Advanced® Model 3250 Tek Numuneli Ozmometre üzerinde ozmolalite ölçülmüstür. Tablo 3: Ozmolarite, Tuz ve Karbonatin ES Hücresinden Elde Edilen Yavrular ve F0 XY Disileri Uzerindeki Etkisi Besi ortami Ozmolalite NaCl NaHC03 Glukoz ES ES Hücresinden (mOsm/kg) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) Hücresinden Elde Edilmis Elde Edilmis Yavrular Yavrular/Tüm XY erkek XY disi Yavrular DMEM 13/58 0/13 329 6,4 3,7 4,5 13/13 (%224) (%0) DMEM- 36/71 10/36 270 5,1 2,2 4,5 26/36 LS/LC (%50,7) (%27,8) DMEM- 20/50 3/20 322 5,1 2,2 15,5 17/20 LSILC/HG (%40) (%15) DMEM- 53/58 18/53 218 3,0 2,2 4,5 35/53 VLSILC (%91,4) (%34,0) DMEM- 50/57 17/50 261 5,1 1,5 4,5 33/50 LS/VLC (%87,7) (%34) DMEM- 49/68 14/49 294 6,4 1,5 4,5 35/49 VLC (%72,1) (%286) Donör XY ES hücreleri, diger seylerin yani sira 5,1 mg/ml NaCI, 2,2 mg/ml NaH003 ve 15,5 mg/ml glukoz içeren ve ozmolalitesi 322 mOsm/kg olan az tuzlu, az karbonatli ve yüksek glukozlu DMEM ('"DMEM-LS/LC/HG'l) içinde tutulmustur. Sözü edilen ES hücrelerin VELOCIMOUSE® yöntemine (yukarida belirtilen) göre embriyolar içinde transferi üzerine, ortaya çikan ES hücreden elde edilmis F0 neslinin tümünün %151, fenotipik olarak disi XY fareler olmustur. Bir negatif kontrol olarak, FO jenerasyonunda, DMEM içinde tutulan ES hücrelerden fenotipik olarak disi XY fare elde edilmemistir ("DMEM": 6,4 mg/ml NaCl, 3,7 mg/ml NaHCOs ve 4,5 mg/ml glukoz; 329 mOsm/kg). Bu %15 F0 XY disi sonucu, DMEM ile elde edilen ES hücrelerden (329 mOsm/L) %0 F0 XY disiler ile az tuzlu ve az karbonatli DMEM ("DMEM-LS/LC": 5,1 mg/ml NaCI, 2,2 mg/ml NaHCOs ve 4,5 mg/ml glukoz; 270 mOsm/kg) içinde tutulan ES hücrelerden elde edilen %27,8 FO XY disi fareler arasinda yer almaktadir. Bu nedenle, bir yorum, ozmolalitenin hepsi için olmasa da bir miktar disilestirme etkisi sagladigidir. Alternatif bir açiklama ise az tuz ve/veya az karbonatin, disilestirme etkisi sagladigi ve yüksek glukozun, XY ES hücrelerin disilesmesini bir dereceye kadar engelledigidir. Bkz. Tablo 3. Ayrica, ES hücreler, DMEM-LS/LC/HG içinde tutuldugu zaman ES hücreden elde edilmis fareler üretme verimliligi (Tablo 3) (yani, yaklasik %40), DMEM içinde tutulmus olan ES hücrelerinkinden daha yüksek (yani, yaklasik %22) olmustur ancak DMEM-LS/LC için olan kadar (yani, yaklasik % 51) yüksek olmamistir. Bkz. Tablo 3. Ornek 7: Tuz Konsantrasyonunun, ES Hücreden Elde Edilmis Yavrular ve XY Disileri Uretme Verimliligi Uzerindeki Etkisinin Analizi Tuz konsantrasyonu ya da iyon kuvvetinin, XY ES hücrelerden XY disiler üretme üzerindeki etkisini belirlemek için, ES hücreler, çok az tuzlu DMEM (DMEM-VLS/LC: 3,0 mg/ml NaCl, 2,2 mg/ml NaHCOa, 4,5 mg/ml glukoz; 218 mOsm/kg) içinde tutulmustur. Sözü edilen ES hücrelerin VELOCIMOUSE® yöntemine (yukarida belirtilen) göre embriyolar içinde transferi üzerine, ortaya çikan ES hücreden elde edilmis F0 neslinin tümünün %34*ü, fenotipik olarak disi XY fareler olmustur; bu da %27,81ik DMEM-LS/LC kontrol seviyesinin biraz üstündedir. Ilginç bir sekilde, DMEM-VLS/LC besi yerleri içinde tutulan ES hücrelerin transferinden elde edilen FO yavrularinin %91,4'ü, ES hücreden elde edilirken, DMEM-LS/LC ve DMEM Kontrollerinde yalniz sirasiyla %50,7 ve %22,4 ES hücreden elde edilmistir. Baska bir deneyde, ES hücreler, yüksek tuzlu ve az karbonatli besi ortami içinde (DMEM- HS/VLC: 6,4 mg/ml NaCI, 1,5 mg/ml NaHCOs, 4,5 mg/ml glukoz; 294 mOsm/kg) tutulmustur. Sözü edilen ES hücrelerin VELOCIMOUSE® yöntemine (yukarida belirtilen) göre embriyolar içinde transferi üzerine, ortaya çikan ES hücreden elde edilmis F0 neslinin tümünün %28,6'si, fenotipik olarak disi XY fareler olmustur; bu da %27,8'Iik DMEM-LS/LC kontrol seviyesinin biraz üstündedir. Ilginç bir sekilde, DMEM-HS/VLC besi yerleri içinde tutulan ES hücrelerin transferinden elde edilen FO yavrularinin %72,1*i, ES hücreden elde edilirken, DMEM-LS/LC ve DMEM Kontrollerinde yalniz sirasiyla %50,7 ve %22,4 ES hücreden elde edilmistir. Bu sonuçlar, az tuz ve/veya az karbonatin, ES hücreden elde edilmis FO neslinin ve F0 XY disilerin oraninin artmasina katkida bulundugunu teyit etmektedir. (Bkz. Tablo 3.) Ornek 8: Karbonat Konsantrasyonunun, ES hücreden Elde Edilmis Yavrular ve XY Disileri Uretme Verimliligi Uzerindeki Etkisinin Analizi Karbonat konsantrasyonunun, XY ES hücrelerden XY disileri üretilmesi üzerindeki etkisini belirlemek amaciyla, ES hücreler, az tuzlu ve çok az karbonatli besi yerleri (DMEM-LS/VLC: 5,1 mg/ml NaCI, 1,5 mg/ml NaHCOa, 4,5 mg/ml glukoz; 261 mOsm/kg) Sözü edilen ES hücrelerin VELOCIMOUSE® yöntemine (yukarida belirtilen) göre embriyolar içinde transferi `üzerine, ortaya çikan ES hücreden elde edilmis F0 neslinin tümünün %34iü, fenotipik olarak disi XY fareler olmustur; bu da %27,8'Iik DMEM-LS/LC kontrol seviyesinin biraz üstündedir. Ilginç bir sekilde, DMEM-LSA/LC besi yerleri içinde tutulan ES hücrelerin transferinden elde edilen FO yavrularinin %87,7'si, ES hücreden elde edilirken, DMEM-LS/LC ve DMEM Kontrollerinde yalniz sirasiyla %507 ve %22,4 ES hücreden elde edilmistir. Bu sonuçlar, az karbonatin, ES hücreden elde edilmis F0 neslinin ve F0 XY disilerin oraninin artmasina katkida bulundugunu teyit etmektedir. (Bkz. Tablo 3.) `Ornek 9: F0 XY Disi Farelerin Fenotipi F0 XY fenotipik disi fareler, ayni susun F1 XY fenotipik farelerine kiyasla nispeten normal fenotip özellikleri sergilemistir. Bununla birlikte, XY disi fareler, her bir fiziksel parametre için daha büyük bir degerler araligi göstermistir. Eriskin XY disilerinin vücut agirligi, yaklasik 15 gram ile yaklasik 30 gram arasinda degisiklik göstermis ve ortalamasi yaklasik 21,5 gram olmustur. Eriskin XX disilerinin vücut agirligi, yaklasik 16 gram ile yaklasik 17 gram arasinda degisiklik göstermis ve ortalamasi yaklasik 16,8 gram olmustur. Anüs ve cinsel organlar arasindaki mesafe orani belirlenmis ve bir vücut kitle orani olarak hesaplanmistir (anogenital mesafe / (cm) / vücut kütlesi (9)). F0 XY disileri için oran, yaklasik 0,16 cm/g ortalama ile yaklasik 0,11 cm/g ila yaklasik 0,24 cm/g arasinda degisiklik göstermistir. F1 XX disileri için oran, yaklasik 0,18 cm/g ortalama ile yaklasik 0,17 cm/g ila yaklasik 0,19 cm/g arasinda degisiklik göstermistir. XY disi fareler ve XX disi fareler için Çesitli organlarin (ön, karaciger, böbrekler, kalp ve akciger ve dalak) ilgili kütleleri arasinda anlamli bir fark olmamistir. Ilgili kütleler, organ kütlesi (mg) / vücut kütlesi (9) olarak ifade edilmektedir. F0 XO disilerinin karacigerinin ilgili kütlesi, yaklasik 42 mg/g ortalama ile yaklasik 35 mg/g ila yaklasik 50 mg/g arasinda degisiklik göstermistir. F1 XX disilerinin karacigerinin ilgili kütlesi, yaklasik 42,5 mg/g ortalama ile yaklasik 37,5 mg/g ila yaklasik 46,9 mg/g arasinda degisiklik göstermistir. FO XO disilerinin böbreklerinin ilgili kütlesi, yaklasik 13,4 mg/g ortalama ile yaklasik 11,5 mg/g ila yaklasik 15 mg/g arasinda degisiklik göstermistir. F1 XX disilerinin böbreklerinin ilgili kütlesi, yaklasik 13,7 mg/g ortalama ile yaklasik 12,6 mg/g ila yaklasik 13,8 mg/g arasinda degisiklik göstermistir. F0 XO disilerinin kalp ve akcigerlerinin ilgili toplam kütlesi, yaklasik 16,1 mg/g ortalama ile yaklasik 14,3 mg/g ila yaklasik 18,9 mg/g arasinda degisiklik göstermistir. F1 XX disilerinin kalp ve akcigerlerinin ilgili toplam kütlesi, yaklasik 15,9 mg/g ortalama ile yaklasik 14,7 mg/g ila yaklasik 16,1 mg/g arasinda degisiklik göstermistir. F0 XO disilerinin dalaginin ilgili kütlesi, yaklasik 3,3 mg/g ortalama ile yaklasik 2,7 mg/g ila yaklasik 6,6 mg/g arasinda degisiklik göstermistir. F1 XX disilerinin dalaginin ilgili kütlesi, yaklasik 3,8 mg/g ortalama ile yaklasik 2,7 mg/g ila yaklasik 4,0 mg/g arasinda degisiklik göstermistir. F0 XY disi farelerinin, genetik olarak özdes F1 XX disilerine kiyasla, elektrolit, enzim, glukoz, protein, Iipit ve diger belirtileri nispeten normal serum seviyelerinde gösterdigi belirlenmistir. Bununla birlikte, XY disi fareler, her bir ölçülmüs serum parametresi için daha büyük bir degerler araligi göstermistir. Eriskin XY disilerinin serum sodyum seviyeleri, yaklasik 150 mEq/L ila yaklasik 159 mEq/L arasinda degisiklik göstermistir ve XX disileri için bu seviyeler yaklasik 148 mEq/L ila yaklasik 155 mEq/L arasinda degisiklik göstermistir. Eriskin XY disilerinin serum potasyum seviyeleri, yaklasik 0,7 mEq/L ila yaklasik 7 mEq/L arasinda degisiklik göstermistir ve XX disileri için bu seviyeler 0,7 mEq/L civarinda olmustur. Eriskin XY disilerinin serum Klorür seviyeleri, yaklasik 111 mEq/L ila yaklasik 121 mEq/L arasinda degisiklik göstermistir ve XX disileri için bu seviyeler yaklasik 113 mEq/L ila yaklasik 120 mEq/L arasinda degisiklik göstermistir. Eriskin XY disilerinin serum kalsiyum seviyeleri, yaklasik 7 mEq/L ile yaklasik 9 mEq/L arasinda degisiklik göstermistir ve XX disileri için bu seviyeler 7 mEq/L civarinda olmustur. Eriskin XY disilerinin serum alkalin fosfataz seviyeleri, yaklasik 124 U/L ila yaklasik 285 U/L arasinda degisiklik göstermistir ve XX disileri için bu seviyeler yaklasik 191 U/L ila yaklasik 236 U/L arasinda degisiklik göstermistir. Eriskin XY disilerinin serum aminotransferaz seviyeleri, yaklasik 21 U/L ila yaklasik 285 U/L arasinda degisiklik göstermistir ve XX disileri için bu seviyeler yaklasik 13 U/L ila yaklasik 34 U/L arasinda degisiklik göstermistir. Eriskin XY disilerinin serum aspartat seviyeleri, yaklasik 42 U/L ila yaklasik 190 U/L arasinda degisiklik göstermistir ve XX disileri için bu seviyeler yaklasik 42 U/L ila yaklasik 269 U/L arasinda degisiklik göstermistir. Eriskin XY disilerinin serum Iipaz seviyeleri, yaklasik 16 U/L ila yaklasik 49 U/L arasinda degisiklik göstermistir ve XX disileri için bu seviyeler yaklasik 21 U/L ila yaklasik 26 U/L arasinda degisiklik göstermistir. Eriskin XY disilerinin serum glukoz seviyeleri, yaklasik 227 mg/dL ila yaklasik 319 mg/dL arasinda degisiklik göstermistir ve XX disileri için bu seviyeler yaklasik 255 mg/dL ila yaklasik 270 mg/dL arasinda degisiklik göstermistir. Eriskin XY disilerinin toplam serum protein seviyeleri, yaklasik 4,6 mg/dL ila yaklasik 5,2 mg/dL arasinda degisiklik göstermistir ve XX disileri için bu seviyeler yaklasik 4,6 mg/dL ila yaklasik 4,8 mg/dL arasinda degisiklik göstermistir. Eriskin XY disilerinin serum albümin seviyeleri, yaklasik 3 mg/dL ila yaklasik 3,5 mg/dL arasinda degisiklik göstermistir ve XX disileri için bu seviyeler yaklasik 3,1 mg/dL ila yaklasik 3,2 mg/dL arasinda degisiklik göstermistir. Eriskin XY disilerinin serum Kolesterol (toplam) seviyeleri, yaklasik 58 mg/dL ila yaklasik 108 mg/dL arasinda degisiklik göstermistir ve XX disileri için bu seviyeler yaklasik 61 mg/dL ila yaklasik 85 mg/dL arasinda degisiklik göstermistir. Eriskin XY disilerinin serum trigliserit seviyeleri, yaklasik 42 mg/dL ila yaklasik 89 mg/dL arasinda degisiklik göstermistir ve XX disileri için bu seviyeler yaklasik 39 mg/dL ila yaklasik 48 mg/dL arasinda degisiklik göstermistir. Eriskin XY disilerinin serum HDL seviyeleri, yaklasik 29 mg/dL ila yaklasik 57 mg/dL arasinda degisiklik göstermistir ve XX disileri için bu seviyeler yaklasik 23 mg/dL ila yaklasik 42 mg/dL arasinda degisiklik göstermistir. Eriskin XY disilerinin serum LDL seviyeleri, yaklasik 3,7 mg/dL ila yaklasik 11 mg/dL arasinda degisiklik göstermistir ve XX disileri için bu seviyeler yaklasik 3,7 mg/dL ila yaklasik 13 mg/dL arasinda degisiklik göstermistir. Eriskin XY disilerinin kan 'L'ire azot (BUN) seviyeleri, yaklasik 12 mg/dL ila yaklasik 27 mg/dL arasinda degisiklik göstermistir ve XX disileri için bu seviyeler yaklasik 18 mg/dL ila yaklasik 21 mg/dL arasinda degisiklik göstermistir. Eriskin XY disilerinin serum magnezyum seviyeleri, yaklasik 1,6 mg/dL ila yaklasik 3,2 mg/dL arasinda degisiklik göstermistir ve XX disileri için bu seviyeler 2,1 mg/dL civarinda olmustur. Eriskin XY disilerinin serum inorganik fosfat seviyeleri, yaklasik 5,1 mg/dL ila yaklasik 10 mg/dL arasinda degisiklik göstermistir ve XX disileri için bu seviyeler yaklasik 7,2 mg/dL ila yaklasik 8,4 mg/dL arasinda degisiklik göstermistir. Eriskin XY disilerinin serum ürik asit seviyeleri, yaklasik 0,9 mg/dL ila yaklasik 3,5 mg/dL arasinda degisiklik göstermistir ve XX disileri için bu seviyeler yaklasik 0,7 mg/dL ila yaklasik 2,2 mg/dL arasinda degisiklik göstermistir. `Ornek 10: F1 Jenerasyonunda Homozigot Genetigi Degistirilmis Fare Uretimi Bir genetik modifikasyon için homozigot olan F1 fareleri üretilip üretilemeyecegini belirlemek için, bir STEAP2 geninin en az bir knock-out islemine tutulmus alelini içeren FO XY disi fareler, ayni STEAP2 geni knock-out islemini içeren XY erkek kohort ile çiftlestirilmistir. STEAP2 (prostat 2'nin alti adet transmembran epitel antijeni) geni, demir red'uktaz ve bakir redüktaz etkinligine sahip olan varsayilan bir 6 membranli metalloredüktaz için kodlama yapar ve bu genin, in vitro ortamda hem demir hem de bakir için hücresel alimi uyardigi gösterilmistir. Bir hücre yüzeyi antijeni olarak, STEAP2, prostat kanserinde potansiyel bir tani ya da terapi hedefidir. STEAP2, tedavi edilmemis primer ve hormon-refrakter prostat kanserlerinde, iyi huylu prostat hiperplazilerine kiyasla büyük ölçüde daha yüksektir ve bu da prostat kanseri gelisimine dahil oldugunu göstermektedir. STEAP2 KO fareler bildirilmemistir. Bkz. Ohgami v.d., BLOOD, Cilt 108(4):1388-1394, 2006.) Sonuçlar, Tablo 4ite gösterilmektedir. TR TR TR TR TR TR TR DESCRIPTION PRODUCTION OF FERTILIZED XY FEMALE ANIMALS FROM XY ES CELLS Technical Field The invention relates to the production of fertile female animals having an XY karyotype derived from XY embryonic stem ("ES") cells. In a specific embodiment, methods and compositions are described for producing fertile XY female mice from donor murine ES cells. In vitro fertilization methods are also described to facilitate the generation of phenotypic females. Background of the Invention Nearly all of the ES cell lines commonly used to produce genetically modified mice are genotypic male (XY) ES cell lines. Consequently, in the FO generation, all XY animals are male. Most genetic modifications are accomplished by targeting XY ES cells to create a modification in one of the two alleles present; in other words, the donor mouse ES cell is heterozygous for the genetic modification. However, it is often desirable to obtain a mouse that is homozygous for the genetic modification. Since no female mouse derived entirely from ES cells is actually born in the FO generation containing the modification, the FO male is typically mated with a female (e.g., a suitable female from the same line) so that at least one female in a litter (an F1 female) is heterozygous for the genetic modification. The heterozygous F1 female is then crossed with an F1 heterozygous male to produce a homozygous generation. Such mating requirements involve costly and time-consuming steps. It is desirable to create a breeding pair in an F0 generation, or at least to produce an FO female derived largely or entirely from donor (XY male) ES cells. There is a need in the art for methods and compositions for making fertile female animals in the F0 generation from a donor male (XY) ES cell. Summary of the Invention The invention provides a method for making fertile female phenotypically XY mice in the F0 generation, comprising: (a) maintaining a donor XY mouse ES cell in a nutrient medium containing (i) a base medium having an osmolality of up to 322 mOsm/kg and (ii) additives suitable for maintaining mouse ES cells in culture; (b) introducing the donor XY mouse ES cell from step (a) into a pre-morula host mouse embryo; (c) inducing the host embryo to gestation; and (d) obtaining a mouse line comprising a phenotypically female XY mouse in the F0 generation; wherein the FO phenotypically female XY mouse is fertile upon reaching sexual maturity. The invention also provides a method for increasing the efficiency of producing embryonic stem (ES) cell-derived mice in an FO generation, comprising: (a) maintaining a donor XY mouse ES cell in a nutrient medium comprising: (i) a base nutrient medium; and (ii) additives suitable for the growth of mouse ES cells in culture, wherein the base medium contains sodium bicarbonate at a concentration of 1.5 to 2.2 mg/ml and has an osmolality of 218-322 mOsm/kg. (b) introducing the donor XY mouse ES cell from Step (a) into a pre-morula stage host mouse embryo; (c) initiating the gestation period of the host mouse embryo; and (d) obtaining a FO XY mouse generation, wherein the ratio of offspring from the ES cell to all offspring produced in the F0 generation is greater than the ratio of offspring from the ES cell to total offspring produced in the FO generation from donor XY ES cells maintained in a nutrient medium having an osmolality greater than 322 mOsm/kg. In one aspect, a method for making a fertile female human animal from an XY donor cell is described, comprising: (a) introducing a human female XY donor cell into a female human host embryo to create a chimeric embryo, and (b) gestating the chimeric embryo to create a human female animal, wherein the human female animal is an XY and is fertile upon reaching sexual maturity. In one aspect, the human female animal is a mouse. In one aspect, the human female XY female animal is created in the FO generation. In one aspect, the human female XY animal in the F0 generation is a mouse and has a coat color that comes from 100% donor cells. In one aspect, the human female XY animal created in the FO generation is derived from at least 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, or 99.8% XY donor cells. In one aspect, the human female XY animal in the F0 generation is derived from approximately 100% donor cells. In one aspect, the contribution of host embryo cells to the human female XY animal in the FO generation is determined by a quantitative assay capable of detecting 1 cell in 2000 (0.05%), and no tissue of the female XY animal is positive for host embryo cell contribution. In one embodiment, the donor cell comprises a genetic modification. In one embodiment, the genetic modification includes a complete or partial deletion of an endogenous nucleic acid sequence; one or more nucleic acid substitutions; a complete or partial replacement of an endogenous nucleic acid sequence, e.g., a gene, with a heterologous nucleic acid sequence; a knock-out and/or knock-in process. In one aspect, the method further includes mating an XY male from the F0 generation that is heterozygous for the genetic modification with an XY female from the F0 generation that is heterozygous for the genetic modification (e.g., a sibling), and obtaining from said mating an F1 generation animal that is homozygous for the genetic modification. In one aspect, the XY donor cell is maintained in a nutrient medium comprising base medium and additives prior to addition to the host embryo, wherein the base medium exhibits a property selected from the group consisting of: (a) an osmolality of about 250-310 mOsm/kg; (b) a conductivity of about 11-13 mS/cm; (c) an alkaline metal halide salt at a concentration of about 60-105 mM; (d) a carbonic acid salt at a concentration of about 20-30 mM; (e) an alkaline metal halide salt and a carbonic acid salt at a total concentration of no more than about 85-130 mM, and (f) a combination thereof. In one embodiment, the additives comprise components for maintaining ES cells in culture. In one embodiment, the additives include one or more of fetal bovine serum (FBS), glutamine, antibiotic(s), pyruvate, non-essential amino acids, 2-mercaptoethanol, and LIF. In one aspect, the base medium comprises a low-salt DMEM. In a specific aspect, the low-salt DMEM has a NaCl concentration of 85-130 mM. In one aspect, the base medium comprises a low-osmolality DMEM. In a specific embodiment, the low-osmolality DMEM has an osmolality of 250-310 mOsm/kg. In one aspect, the base medium comprises a low-conductivity DMEM. In a specific aspect, the low-conductivity DMEM has a conductivity of 11-13 mS/cm. In one embodiment, the donor cell is maintained in the specified base medium plus additives before being added to the host embryo for approximately 1, 2, 3, 4, 5, 6 days, 1 week, 8, 9, 10, 11 or 12 days, 2 weeks, 3 weeks, or 4 weeks. In a specific embodiment, the donor cell is maintained in the base medium plus additives for at least one week before being added to the host embryo. In a specific embodiment, the donor cell is maintained in the base medium plus additives for 2-4 weeks before being added to the host embryo. In one aspect, the host embryo is an embryo at the 2-cell stage, 4-cell stage, 8-cell stage, 16-cell stage, 32-cell stage, or 64-cell stage. In another aspect, the host embryo is a blastocyst. In one aspect, the embryo is at a stage selected from a pre-morula stage, morula stage, non-compacted morula stage, and compacted morula stage. In one aspect, the embryo stage is selected from a Theiler Stage 1 (TS1), a TS2, a TSS, a TS4, a T85, and a TSG, with reference to Theiler stages described in "Theiler (1989) "The House Mouse: Atlas of Mouse Development," Springer-Verlag, New York." In a particular aspect, Theiler Stages are selected from T81, T82, T83, and TS4. In one aspect, the embryo contains a zona pellucida, and the donor cell is an ES cell inserted into the embryo through a hole in the zona pellucida. In one aspect, the embryo contains a pre-blastocyst embryo. In one aspect, the embryo contains an embryo at the morula stage. In a particular aspect, the morula stage embryo is clustered. In one aspect, the embryo comprises an embryo lacking a zona. In one aspect, the XY donor cell is selected from an E8 cell, an induced pluripotent stem (iPS) cell, a pluripotent cell, and a totipotent cell. In a particular aspect, the XY donor cell is a mouse E8 cell and the host embryo is a mouse embryo. In one embodiment, the XY donor cell is an ES cell from an inbred mouse strain. In one embodiment, the XY donor cell is an ES cell from an outbred or outbred mouse strain. In one aspect, the host embryo is a mouse host embryo. In one embodiment, the mouse host embryo is from an inbred strain, and in another embodiment, it is from an outbred or outbred strain. In one aspect, the donor cell is a mouse donor cell. In one embodiment, the host embryo and the donor cell are both mice, and each is independently selected from a 129 strain, a CS7BL/6 strain, a mixture of 129 and C57BL/6 strains, a BALC/c strain, or a Swiss Webster strain mouse. In a particular embodiment, the mouse is 50% 129 and 50% C57BL/6. In one embodiment, the mouse is a 129 strain selected from the group consisting of a strain 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 12981 (e.g., 12981/SV, 12981/8vlm), 12982, 12984, 12985, 12989/8vEvH, 12986 (129/8vEvTac), 12987, 12988, 129T1, 129T2 (see, e.g., Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836). In one embodiment, the mouse is a C57BL strain; In a particular embodiment, CSTBL/A is selected from 057BL/An, CSYBL/GrFa, CSTBL/KaLwN, CSYBL/G, C57BL/6J, CSYBL/öByJ, CSYBL/BNJ, CS7BL/10, CSYBL/108c8n, 057BL/10Cr, CSYBL/Ola. In a particular embodiment, the mouse is a mixture of the above-mentioned strain 129 and the above-mentioned strain C578LI6. In another particular embodiment, the mouse is a mixture of the above-mentioned strains 129 or a mixture of the above-mentioned strains BL/6. In a particular embodiment, strain 129 of the mixture is a mixture of a strain 12986 (129/8vEvTac). In one embodiment, an XY phenotypic female mouse produces 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9 litters of live mice in her lifetime. In one embodiment, an XY female mouse produces at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 offspring per litter. In one embodiment, an XY female mouse produces about 4-6 offspring per litter. In one embodiment, an XY female mouse produces 2-6 litters, with each litter containing at least 2, 3, 4, 5, or 6 offspring. In one embodiment, approximately 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, or 50% of the offspring are XY females. In a specific embodiment, approximately 15% - 25% are XY female offspring. In one aspect, a method is described for generating a mouse that is homozygous for the genetic modification using an XY ES cell that is heterozygous for the genetic modification. In one aspect, the method comprises genetically modifying an XY donor ES cell to create a heterozygous XY donor ES cell, maintaining the heterozygous XY donor ES cell in a low-salt and/or low-osmolality or low-conductivity medium, introducing the heterozygous XY donor ES cell into a host embryo at the pre-morula stage, gestating the host embryo, and after pregnancy, obtaining a fertile F0 generation female XY mouse containing the heterozygous modification and derived at least partially from the donor ES cell, and after pregnancy, obtaining a fertile F0 generation male XY mouse containing the heterozygous modification and derived at least partially from the donor ES cell, and mating the FO male and the F0 female to obtain an F1 generation containing a homozygous modification. In one aspect, the FO generation female XY mouse and/or the F0 generation male XY mouse are derived from at least 20% or more donor ES cells. In one aspect, the FO female XY mouse is derived from at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, or 80% donor ES cells. In one aspect, the F0 generation female XY mouse and/or the male XY mouse are derived from at least 90% donor ES cells. In one aspect, the F0 female XY mouse and/or the F0 male XY mouse have a coat color derived from 100% ES cells. In one aspect, the F0 generation mouse contains an XY oocyte. In one aspect, the F1 generation mouse comprises a genome derived entirely from the donor ES cell. In one aspect, the frequency of crossbreeding between F0 generation male and F0 generation female mice resulting in entirely ES cell derived mice is 100%. In one aspect, a method for producing a litter of mice is described, comprising introducing XY donor ES cells prepared according to this disclosure into host mouse embryos, gestating the embryos in a suitable mouse, and obtaining a litter of mice comprising at least one XY female mouse pup that is a fertile XY female mouse upon reaching sexual maturity. In one aspect, the percentage of the female mouse pups born that are fertile upon reaching sexual maturity is about 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, or 50%. In one particular aspect, this percentage is about 15-25%. In one aspect, a method is described for maintaining an XY ES cell in culture, wherein the XY ES cell is maintained under conditions that support or facilitate the development of a female XY mouse after the XY ES cell is introduced into a host embryo and gestated in a suitable female mouse. This method involves maintaining the cells in a suitable culture medium containing a base medium and additives, wherein the base medium contains an osmolality of around 240-320 mOsm/kg, a conductivity of around 10-14 mS/cm, an alkaline metal halide salt at a concentration of around 50-105 mM, a carbonic acid salt at a concentration of around 10-40 mM, and/or a mixed alkaline metal salt and carbonic acid salt at a concentration of around 80-140 mM. In one aspect, the XY ES cell is maintained in the medium (with additives to maintain the ES cells) for a period of approximately 1, 2, 3, 4, 5, 6 days or 1 week, 8, 9, 10, 11 or 12 days, 2 weeks, 3 weeks, or 4 weeks before being introduced into a host embryo. In one particular aspect, the ES cell is maintained in nutrient medium (low salt base medium containing additives to preserve the ES cells) for about 2-4 weeks before being added to the host embryo. In one embodiment, the base medium exhibits an osmolality of up to 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, or 240 mOsm/kg. In one embodiment, the base medium exhibits an osmolality of up to 240-320, 250-310, or 260-300 mOsm/kg. In one particular embodiment, the base medium exhibits an osmolality of about 270 mOsm/kg. In one aspect, the base medium exhibits a conductivity of around 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, or 14.0 mS/cm. In one aspect, the base medium exhibits a conductivity of around 10-14 mS/cm or 11-13 mS/cm. In a particular aspect, the base medium exhibits a conductivity of around 12-13 mS/cm. In a particular embodiment, the base medium exhibits a conductivity of around 12-13 mS/cm and an osmolality of around 260-300 mOsm/kg. In another particular aspect, the base medium contains sodium chloride at a concentration of about 90 mM NaCl. In another specific aspect, the sodium chloride concentration is between about 70-95 mM. In another specific aspect, the base medium contains sodium bicarbonate at a concentration of less than about mM NaCl. In another specific aspect, the sodium bicarbonate concentration is between about 20-30 mM. In one aspect, the base medium contains an alkaline metal and halide salt at a maximum concentration of about 100 mM. In one aspect, the alkaline metal and halide salt is NaCl. In one aspect, the concentration of the alkaline metal and halide salt is between 90, 80, 70, 60, or 50 mM. In one aspect, the concentration of the alkaline metal and halide salt in the base medium is about 60-105, 70-95, or 80-90 mM. In one specific aspect, the concentration is about 85 mM. In one aspect, the base medium exhibits a concentration of a carbonic acid salt. In one aspect, the carbonic acid salt is a sodium salt. In one aspect, the sodium salt is sodium bicarbonate. In one aspect, the concentration of the carbonic acid salt in the base medium is at most 40, 35, 30, 25, or 20 mM*. In one aspect, the concentration of the carbonic acid salt in the base medium is at most about 10-40 mM, and in another aspect, it is about 20-30 mM. In one particular aspect, the concentration is about 25 or 26 mM*. In one aspect, the sum of the concentration of the alkaline metal and halide salt and the carbonic acid salt in the base medium is at most 140, 130, 120, 110, 100, 90, or 80 mM*. In one aspect, the sum of the concentration of the alkaline metal and halide salt and the carbonic acid salt in the base medium is about 80-140, 85-130, 90-120, 95-120, or 100-120 mM*. In a particular aspect, the sum of the concentration of the alkaline metal and halide salt and the carbonic acid salt in the base medium is about 115 mM. In one aspect, the mole ratio of the alkaline metal and halide salt and the carbonic acid salt is greater than 2.5. In one aspect, the ratio is about 2.6-4.0, 2.8-3.8, 3-3.6, or 3.2-3.4. In one aspect, the ratio is about 3.3-3.5. In a particular embodiment, the ratio is 3.4. In one aspect, the base medium exhibits an osmolality of about 250-310 mOsm/kg and an alkaline metal and halide salt concentration of about 60-105 mM. In another aspect, the base medium has a carbonic acid salt concentration of about 20-30 mM. In another aspect, the sum of the concentrations of the alkaline metal and halide salt and the carbonic acid salt is about 80-140 mM. In another aspect, the conductivity of the base medium is about 12-13 mS/cmt. In one aspect, a method is disclosed for maintaining a donor XY ES cell in culture under the conditions described herein, wherein, after introducing the donor XY ES cell into a host embryo to form a chimeric embryo and gestating the chimeric embryo in a suitable animal, the chimeric embryo develops into a mouse pup that is at least 90% XY and becomes fertile upon reaching sexual maturity. In one aspect, the mouse pup is at least 92%, 94%, 96%, 98%, or 99.8% XY. In one aspect, a method for producing a fertile XY female animal is described, comprising maintaining an XY donor cell in a nutrient medium containing a low-salt base medium before adding the donor cell to a host embryo, adding the donor cell to the host embryo, allowing the host embryo to gestate in a suitable animal, and, after gestation, obtaining an XY female animal in which the XY female animal becomes fertile upon reaching sexual maturity. In one aspect, the XY donor cell is a mouse ES cell and the host embryo is an embryo from an XX female mouse. In one aspect, the culture in which the donor cell is maintained comprises a base medium as described herein and one or more additives suitable for maintaining mouse ES cells in culture. In one particular aspect, the one or more additives suitable for maintaining a mouse ES cell in culture are FBS (90 ml FBS/0.5 L base medium), glutamine (2.4 mmol/0.5 L base medium), sodium pyruvate (0.6 mmol/0.5 L base medium), non-essential amino acids (<0.1 mmol/0.5 L base medium), 2-mercaptoethanol, LIF, and one or more antibiotics. In one aspect, the donor cell is maintained in a medium containing a low salt base medium for a period of approximately 1, 2, 3, 4, 5, or 6 days, or 1 week, 8, 9, 10, 11, or 12 days, 2 weeks, 3 weeks, or 4 weeks before introducing the donor cell into a host embryo. In a particular aspect, the donor cell is maintained in a medium containing a low-salt base medium for at least 2-4 weeks before adding the donor cell to the host embryo. In one aspect, the donor cell is maintained (e.g., frozen) in a medium containing a low-salt base medium, and the donor cell is thawed and maintained in the medium containing a low-salt base medium for at least 1, 2, 3, or 4 or more days before adding the donor cell to the host embryo. In a particular aspect, the donor cell is passaged at least once in a medium containing a low-salt base medium; the cell is frozen in a medium containing a low-salt base medium, and the cell is thawed in a medium containing a low-salt base medium and grown for 1, 2, 3, 4, 5 or 6 days or more, or 1 week, 8, 9, 10, 11 or 12 days, 2 weeks, 3 weeks or 4 weeks, before being added to a host embryo. In one embodiment, the donor cell is maintained for a period of one, two, three or four days before being added to a host embryo. In one embodiment, the donor cell is maintained in a medium containing the specified base medium for a period of 3 days. In one aspect, a method is described for making a fertile mouse breeding pair in the same F0 generation, each derived entirely from a donor ES cell, comprising: maintaining donor male mouse XY ES cells in culture containing a base medium and additives as described herein, wherein the ES cells are maintained in the base medium and additives for a period of at least one day; introducing the ES cells into host embryos (e.g., from XX mice) to form chimeric embryos; gestating the chimeric embryos in a suitable mouse, and obtaining from the suitable mouse a litter of mouse offspring comprising an F0 generation fertile male XY mouse derived entirely from a donor ES cell and an FO generation fertile female XY mouse derived entirely from a donor ES cell. In one aspect, the donor ES cell comprises a genetic modification. In one embodiment, the donor ES cell contains a genetic modification that is heterozygous. In one aspect, the donor ES cell contains a heterozygous genetic modification; the F0 generation fertile male mouse and the F0 generation fertile female XY mice are each heterozygous for the genetic modification, and the F0 generation fertile male and the F0 generation fertile female are mated to each other, producing an F1 generation generation of mice that are homozygous for the genetic modification. In one aspect, the ES cells are maintained for a period of two days, three days, or four days or longer. In one aspect, a method for producing a fertile female XY mouse in a FO generation is described, comprising (a) maintaining a donor XY mouse ES cell in a nutrient medium comprising a base nutrient medium and additives suitable for maintaining mouse ES cells in culture, (b) introducing the donor XY mouse ES cell into a host embryo, (c) allowing the host embryo to gestate, and (d) obtaining a generation of XY female mice in which the XY female mouse becomes fertile upon reaching sexual maturity. According to this aspect, the base medium exhibits one or more of the following selected from (1) an osmolality starting from 200 mOsm/kg and less than 329 mOsm/kg, (2) a conductivity between about 11-13 mS/cm, (3) an alkaline metal and halide salt at a concentration between about 50-110 mM, (4) a carbonic acid salt at a concentration between about 17-30 mM, and (5) an alkaline metal halide salt and a carbonic acid salt at a total concentration between about 85-130 mM. In one embodiment, the donor XY mouse ES cell comprises a genetic modification. In some embodiments, the genetic modification includes one or more of an endogenous nucleic acid sequence, a substitution of one or more nucleic acids; It involves replacing an endogenous nucleic acid sequence with a heterologous nucleic acid sequence; a knockout and/or knock-in process. In one specific embodiment, the genetic modification is a knockout of a STEAP2 gene. In one embodiment, the base medium contains (indicates), among other things, 50 ± 5 mM NaCl and 26 ± 5 mM carbonate and has an osmolality of 218 ± 22 mOsm/kg. In a specific embodiment, the base medium contains (indicates) approximately 3 mg/ml NaCl and 2.2 mg/ml sodium bicarbonate with an osmolality of approximately 218 mOsm/kg. In another aspect, the base medium exhibits 87 ± 5 mM NaCl and 18 ± 5 mM and has an osmolality of 261 ± 26 mOsm/kg. In a specific aspect, the base medium exhibits about 0.1 mg/ml NaCl and 1.5 mg/ml sodium bicarbonate with an osmolality of about 261 mOsm/kg. In another embodiment, the base medium contains 110 ± 5 mM NaCl and 18 ± 5 mM carbonate and has an osmolality of 294 ± 29 mOsm/kg. In a specific embodiment, the base medium exhibits about 6.4 mg/ml NaCl and 1.5 mg/ml sodium bicarbonate with an osmolality of about 294 mOsm/kg. In another embodiment, the base medium contains 87 ± 5 mM NaCl and 26 ± 5 mM carbonate and has an osmolality of about 270 ± 27 mOsm/kg. In a particular embodiment, the base medium exhibits about 5.1 mg/ml NaCl and 2.2 mg/ml sodium bicarbonate with an osmolality of about 270 mOsm/kg. In another aspect, the base medium exhibits 87 ± 5 mM NaCl, 26 ± 5 mM carbonate and 86 ± 5 mM glucose and has an osmolality of 322 ± 32 mOsm/kg. In one particular aspect, the base medium exhibits about 5.1 mg/ml NaCl, about 2.2 mg/ml sodium bicarbonate, and about 15.5 mg/ml glucose, with an osmolality of about 322 mOsm/kg. In one aspect, a method is described for generating a transgenic mouse that is homozygous for a genetic modification in the F1 generation, comprising the steps of (a) crossing a FO XY fertile female mouse generated according to the method above with a cohort F0 XY male mouse, and (b) obtaining an F1 generation mouse that is heterozygous for the genetic modification. In this aspect, the FO XY fertile female mouse and the F0 XY fertile male mouse are each heterozygous for the genetic modification. In some aspects, the genetic modification includes one or more of an endogenous nucleic acid sequence, a substitution of one or more nucleic acids; comprising replacing an endogenous nucleic acid sequence with a heterologous nucleic acid sequence; a knock-out and/or knock-in process. In a particular embodiment, a FO XY fertile female mouse is produced according to the above method wherein the base medium contains 50 ± 5 mM NaCl and 26 ± 5 mM sodium bicarbonate with an osmolality of 218 ± 22 mOsm/kg. In a particular embodiment, the base medium contains about 3 mg/ml NaCl and 2.2 mg/ml sodium bicarbonate with an osmolality of about 218 mOsm/kg. In one aspect, a transgenic mouse homozygous for a genetic modification produced according to the above method is described. In one aspect, a fertile female XY mouse produced according to any of the above methods is described. In one aspect, ES cells from which XY female mice are derived are maintained in a base medium containing 50 ± 5 mM NaCl and 26 ± 5 mM carbonate with an osmolality of 218 ± 22 mOsm/kg. In one particular aspect, the base medium exhibits approximately 3 mg/ml NaCl and 2.2 mg/ml sodium bicarbonate with an osmolality of approximately 218 mOsm/kg. Unless clearly stated otherwise or evident from the context, all aspects or concrete examples described in this document may be combined. Brief Description of the Figures Figure 1 shows the mating results using FO generation female XY mice generated from different XY ES cell clones. Figure 2 illustrates the production of XY female mice from ES cells incubated with low-salt DMEM, DMEM, or FS (Wnt-3a-conditioned medium; i.e., medium conditioned with mouse L-cells transfected with a Wnt-3a-expressing construct) supplemented with low-salt DMEM, NaCl, and NaHCOa. Detailed Description The terms "base medium" or "base media" include a base medium (e.g., DMEM) known in the art and suitable for growing or maintaining ES cells in culture. Base media suitable for producing a fertile XY female (i.e., "low-salt DMEM") differ from the base media typically used for maintaining ES cells in culture. For the purposes of discussing certain media generally, media that are not suitable for producing fertile XY females are described in this section and in the table below as "DMEM" (i.e., typical DMEM media). For the purposes of discussing certain media suitable for producing fertile XY females, the term "low-salt DMEM" is used. The differences between certain media typically used for maintaining ES cells in culture (i.e., DMEM) and certain media suitable for producing fertile XY females (bn, "low-salt DMEM") are noted in this document. The term "low-salt DMEM" is used for convenience; DMEM suitable for producing fertile XY females contains, in addition to its "low-salt" properties, the characteristics described in this document. For example, the DMEM shown in Table 1 can be made suitable for the production of fertile XY females by varying the sodium chloride and/or sodium bicarbonate concentrations given herein, resulting in a different osmolality and a different conductivity compared to the DMEM shown in Table 1. An example of a base medium is Dulbeco's Modified Eagle Medium (DMEM) in its various forms (e.g., Invitrogen DMEM, Cat. No. 11971-025) (Table 1). A suitable low-salt DMEM is commercially available as KO-DMEM™ (Invitrogen Cat. No. 10829-018). When used to maintain cells for culture as donor cells, the base medium is typically supplemented with a number of additives known in the art. Such Additives are shown as "Additives" or "+ Additives" in this description. Table 1: DMEM Base Media for Maintaining ES Cells Component mgIL mM Glycine 30 0.4 L-ArginineHCl 84 0.398 L-CystineHCl 63 0.201 L-Glutamine 584 4 L-Histidine-HCl-H2O 42 0.2 L-Isoleucine 105 0.802 L-Lysine-HCl 105 0.802 L-Lysine-HCl 146 0.798 L-Methionine 30 0.201 L-Phenylalanine 66 0.4 L-Serine 42 0.4 L-Threonine 95 0.798 L-Tryptophan 16 0.0784 L-Tyrosine disodium salt dihydrate 104 0.398 L-Valine 94 0.803 Choline Chloride 4 0.0286 D-Calcium pantothenate 4 8.39 X 10-3 Folic Acid 4 9.07 x 10-3 Niacinamide 4 0.0328 Pyridoxine-HCl 4 0.0196 Riboflavin 0.4 1.06 x 10-3 Thiamine-HCl 4 0.0119 Component mg/L mM i-Inositol 7.2 0.04 Calcium Chloride (CaCh) (anhydrous) 200 1.8 Ferric Nitrate (Fe(NO3)3-9H2O) 0.1 2.48 x 104 Magnesium Sulfate (MgSO4) (anhydrous) 97.67 0.814 Potassium Chloride (KCl) 400 5.33 D-Glucose (Dextrose) 4500 25 Phenol Red 15 0.0399 NaClINaHCOs Content of DMEM Sodium Bicarbonate (NaHCO3) 3700 44.05 Sodium Chloride (NaCl) 6400 110.34 NaCl/NaHCOs Content of low-salt DMEM Sodium Bicarbonate (NaHCO3) < < 44.05 3700 Sodium Chloride (NaCl) < < 6400 110.34 The term "additives" or the expression "+ Additives" encompasses elements added for the growth or maintenance of donor cells in culture, e.g., to maintain the pluripotent or totipotent nature of donor cells in culture. For example, in the culture of human non-ES cells, Additives may include fetal bovine serum (FBS), glutamine, penicillin and Streptomycin (e.g., penstrep), pyruvate salts (e.g., sodium pyruvate), non-essential amino acids (e.g., MEM NEAA), 2-mercaptoethanol, and LIF. In various aspects of media for the maintenance of human female donor cells in culture, the following Additives are added to approximately 500 ml of base medium: approximately 90 ml of FBS (e.g., Hyclone FBS Cat. No. SH30070.03), approximately 2.4 millimoles of glutamine (e.g., approximately 12 ml of 200 mM glutamine solution, e.g., Invitrogen Cat. No. 25030-081), penicillin:streptomycin (e.g., 51 mg of NaCl with 60,000 units of Penicillin G sodium and 60 mg of Streptomycin sulfate; e.g., approximately 6 ml of Invitrogen pennstrep, Cat. No. 15140-122), approximately 0.6 millimoles of sodium pyruvate (e.g., 6 ml of 100 mM sodium pyruvate, Invitrogen Cat. No. 11360-070), about 0.06 millimoles of nonessential amino acids (e.g., about 6 ml of MEM NEAA, e.g., MEM NEAA, Invitrogen Cat. No. 11140-050), about 1.2 ml of 2-mercaptoethanol, and about 1.2 micrograms of LIF (e.g., about 120 microliters of a 106 units/ml LIF preparation; e.g., about 120 microliters of Millipore ESGRO™-LIF, Cat. No. ESG1107). When preparing media for the maintenance of XY ES cells to produce fertile XY females, the same amounts of the same additives are typically used, but the composition of the base medium (from DMEM, e.g., the media described in the table above) differs, and the difference(s) correspond to the differences discussed herein. In some aspects, the additives include Wnt-conditioned media, e.g., Wnt-Sa-conditioned media. The term "animal" in reference to donor cells and/or host embryos includes mammals, fish, and birds. Mammals include, e.g., humans, non-human primates, rodents (e.g., mice, rats, hamsters, guinea pigs) and livestock (e.g., large species, e.g., cows, calves, etc., small species, e.g., sheep, goats, etc., and porcine species, e.g., pigs and wild boars). Birds include, e.g., chickens, turkeys, ostriches, geese, ducks, etc. The term "non-human animal" when referring to donor cells and/or the host embryo excludes humans. In various aspects, the donor cell and/or host embryo is not one or more of the following: Akodon spp., Myopus spp., Microtus spp., Talpa spp. In various aspects, the donor cell and/or host embryo is not any species for which a normal natural breed characteristic is XY female fertility. In various aspects, when a genetic modification is present in the donor cell or host embryo, the genetic modification is not an XYY or XXY, a Tdy-negative sex reversal, a Tdy-positive sex reversal, an X0 modification, an aneuploidy, an SRY translocation or modification, an fgf9"' genotype, or a SOX9 modification. Overview Methods for generating non-human animals, e.g., mice, from donor ES cells and host embryos are known in the art. Donor ES cells are selected for certain characteristics that increase the ability of the cells to implant in a host embryo and thereby contribute partially or substantially to an animal generated by the donor ES cells and host embryo. The resulting animal can be male or female, depending largely on the genotype of the ES cell (e.g., XY or XX). The majority of ES cell lines for producing mice are male XY. Because of the predominance of the Y chromosome in mammalian sex determination, XY ES cells, when added to a host embryo and allowed to gestate, almost always give rise to phenotypically male animals in the first generation (F0) that are chimeras, that is, cells derived from a male donor ES cell (XY) and cells derived from the host embryo, which can be either male (XY) or female (XX). To the extent that phenotypic females are observed in the FO generation, this typically results from the addition of XY ES cells to a female XX embryo, resulting in a chimera whose ES cell contribution is insufficient to masculinize the embryonic genital line. In most cases, such female chimeras do not produce oocytes derived from XY ES cells and, therefore, cannot transmit the ES cell genome to the next generation. In rare cases, female chimeras do not produce oocytes derived from XY ES cells; these females cannot transmit the ES cell genome to the next generation. can be transmitted to future generations (see, e.g., Bronson et al. (1995) High incidence of XXY and XYY males among the offspring of female chimeras from embryonic stem cells, Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:3120–3123). Specific mutations can result in phenotypically female mice with an XY genotype. See, e.g., LoveIl-Badge et al. (1990) XY female mice resulting from a heritable mutation in the primary testis determining gene, Tdy, Development 109:635–646; see also Colvin et al. (2001) Male-to-Female Sex Reversal in Mice Lacking Fibroblast Growth Factor 9, Cell 104(6):875–889 (Fgf-l-XY females that die at birth from lung hypoplasia). Akodon strains contain XY females (see, e.g., Hoekstra et al. (2000) Multiple origins of XY female mice (genus Akodon): phylogenetic and chromosomal evidence, Proc. R. 800. Lond. B 267z1825-1831), but ES cell lines from such mice are not generally available and, even if available, are not widely used. In some cases, e.g., using the VELOCIMOUSE® method (see, e.g., U.S. Pat. Nos. 7,659,442, 7,576,259, 7,294,754 and Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses, Nat. Biotech. 25(1 2- p):91-99) J 2).01-00, It is possible to obtain FO mice derived from all donor ES cells. Under normal and standard experimental conditions, XY donor ES cells produce only phenotypically male mice derived from all ES cells, while ES cells that are XX or X (XY ES cells that have lost the Y chromosome) produce only phenotypically female mice derived from all ES cells. Generating mice with homozygous targeted mutations from all ES cell-derived male and female mice requires two subsequent mating generations to first produce F1-generation heterozygous males and females that, when crossed with each other, have the potential to produce homozygous offspring in the F2 generation. The inventors have developed a method for generating a phenotypically female fertile XY mouse from an XY donor cell (e.g., an XY donor cell derived from a phenotypically male mouse) and a suitable host embryo. This method involves producing a mouse in the F0 generation that allows the creation of a breeding pair (a male F0 and a female F0) in the F0 generation. This is particularly useful when the donor cell contains a heterozygous genetic modification and a homozygous mouse is desired. Although this description describes the generation of phenotypically female fertile XY mice from donor mouse CY ES cells, the methods and compositions described herein are also applicable to the generation of phenotypically female XY fertile human female animals from any suitable human female cell (e.g., an iPS cell, an ES cell, or a pluripotent cell) and any suitable human female embryo. If a donor cell is used to generate an animal by introducing the donor cell into a host embryo, the animal thus produced will contain a phenotypically female fertile XY animal. Methods and compositions are disclosed. A phenotypically female fertile XY animal includes an animal that is phenotypically female enough to be able to bear an embryo upon fertilization of an egg produced by ovulation in the animal, including ovulation and the ability to gestate the embryo to give birth to a live animal. In various aspects, the inventors have developed a method that results in the birth of a fertile female XY mouse from at least about 10%, 15%, 20%, or 25% or greater of an XY mouse ES cell. Animal Husbandry In one aspect, to produce a female animal from a sperm cell and an egg cell, the sperm cell and/or egg cell are maintained in a nutrient medium containing a low-salt base medium for one, two, three, or four or more days prior to fertilization, and the sperm cell and egg cell are fertilized to form a fertilized egg. A method is described comprising: contacting the fertilized egg in a suitable host for fertilization, allowing the host to gestate, and obtaining a litter containing a female animal. In one aspect, the fertilized egg is further maintained in a nutrient medium containing a low-salt base medium for one, two, three, or four or more days prior to implantation into a suitable host. In one aspect, to facilitate production of a female animal from a fertilized egg or an embryo, a method is described comprising maintaining the fertilized egg or embryo in a nutrient medium containing a low-salt base medium for one, two, three, or four or more days prior to implantation into a suitable host, implanting the fertilized egg or embryo into a suitable host for gestation, allowing the fertilized egg or embryo to gestate within the host, and obtaining a litter containing a female animal. In one aspect, the method is described comprising: The methods and compositions described herein are used to produce a female pet, a female domesticated farm animal, a female scientific research subject, or an animal from an endangered species. In one embodiment, the animal is a mouse, rat, hamster, monkey, cat, dog, cow, horse, bull, sheep, goat, pig, deer, and bison. `EXAMPLE APPENDICES` Example 1: Donor XY ES Cells and Host Embryos Donor Cells and Host Embryos. Donor ES cells are 12986C57BI6/F1 hybrid cells. Donor ES cells are frozen in freezing medium containing 10% DMSO until use. After thawing, donor ES cells are maintained in base medium as described below. Host embryos were obtained from Swiss Webster (SW) mice and ES cells were prepared and frozen in DMEM, thawed in DMEM, grown for three days, and microinjected into host embryos in DMEM. Low-salt DMEM ES cells: ES cells were prepared and frozen in DMEM, thawed in low-salt DMEM (KO-DMEM), grown for three days, and microinjected into host embryos in DMEM. FS low-salt DMEM: ES cells were prepared and frozen in low-salt DMEM, thawed in low-salt DMEM (KO-DMEM), grown for three days, and microinjected into host embryos in DMEM. Frozen ES cells were thawed in low-salt DMEM (440 ml) + 10% Wnt-Sa conditioned medium (F8) (60 ml) and microinjected into host embryos in DMEM. Low-salt DMEM + NaCl + NaHCOase ES cells were prepared and frozen in low-salt DMEM supplemented with NaCl (1,300 mg/L) and NaHCOa (1,500 mg/L) and microinjected into host embryos in DMEM. 10% Wnt-3a conditioned medium (FS): Wnt-3a conditioned medium was made from cultures of mouse L cells transformed with a Wnt-3a expression vector (ATCC CRL-2647). L cells were cultured in a FibraStage™ (New Brunswick) according to ATCC guidelines (KO-DMEM™ instead of DMEM). Example 2: Generation of F0 Generation Mice Derived from Donor ES Cells Generation of F0 Generation Mice. Donor ES cells were grown into 8-cell pre-morula stage host embryos using the VELOCIMOUSE® method as described above (Poueymirou et al. (2007) Nature Biotech. 25(1):91-99; U.S. Pat. Nos. 7,659,442, 7,576,259 and 7,294,754), except that mouse ES cells were maintained in base medium plus additives as described herein. For microinjection, ES cells were grown and microinjected into embryos, and the embryos were cultured overnight in KSOM or DMEM medium prior to implantation into surrogate mothers. Example 3: Fertile Female Mice Generation from Donor XY ES Cells In a typical protocol, ES cells were thawed in the presence of KO-DMEM™ and grown for one passage (approximately 5 days). The passaged cells were then electroporated with a gene-targeting vector and then subjected to selection for 10 days in medium containing KO-DMEM™ (Invitrogen Cat. No. 10829-018). Drug-resistant cells were harvested and plated in medium containing KO-DMEM™ and then frozen. For microinjection, cells were thawed in KO-DMEM™ and grown in KO-DMEM™ for 3 days before being microinjected into embryos in DMEM. The embryos were then transferred to surrogate mothers for gestation. Mouse pups were initially characterized as female or male based on the appearance of their external reproductive organs to select breeding pairs. Figure 1 shows that F0 XY females exhibited a high rate of fertility. Twenty-one of 33 F0 XY females produced offspring. Example 4: Comparison of DMEM with Low-Saline DMEM Osmolality was measured on an Advanced® Model 3250 Single Sample Osmometer. Conductivity was measured with a Mettler Toledo GmbH SevenMulti™ ECN # 15055 conductivity meter. The effects of low-salt DMEM and DMEM (each containing additives) on the formation of F0-generation XY females from XY ES cells were investigated. Table 2 shows the osmolality and conductivity values of the various media with and without added salt and/or additives. "ingredients" = addition of the following (to 0.5 L of base medium): 90 ml Hyclone FBS (Cat. No. SH30070.03), 12 ml Invitrogen glutamine solution (Cat. No. 25030-081), 6 ml Invitrogen Pen Strep (Cat. No. 15140-122), 6 ml Invitrogen sodium pyruvate (Cat. No. 11360-070), 6 ml MEM NEAA (Invitrogen Cat. No. 11140-050), 1.2 ml 2-mercaptoethanol and 120 microliters Millipore ESGRO™-LIF (Cat. No. ESG1107). Figure 2 shows a comparison of XY ES cells grown in different media before microinjection into host embryos. and then injected into embryos, XY ES cells produced XY females. XY ES cells grown and maintained in low-salt DMEM supplemented with NaCl and NaHCO3 and then injected into embryos did not produce XY females. This suggests that the production of XY females is supported when XY ES cells are maintained in low-salt DMEM and that the sex ratio of XY ES cells can be controlled by varying the salt concentration of the base medium. Addition of a medium conditioned with Wnt-3a (10% F8) to low-salt DMEM increased the frequency of production of FO XY females. Furthermore, the efficiency of producing ES-derived mice in the FO generation was increased when ES cells were maintained in low-salt DMEM. The ratio of ES-derived offspring to all offspring produced in the F0 generation was approximately 23% for ES cells maintained in DMEM. This rate increased from 61% for ES cells maintained in low-salt DMEM to 72% for ES cells maintained in low-salt DMEM supplemented with 10% Wnt-3a-conditioned medium. See Figure 2. Table 2: Comparison of Physical Properties of DMEM and Low-Salt DMEM Media for ES Cells Conductivity Osmolality (mS/cm) (mOsmlkg) Low-Salt DMEM alone 12.84 270 DMEM alone 15.40 337 A2 Saline DMEM + NaHCOs + NaCl, alone 15.82 342 A2 Saline DMEM + Additives 12.75 279 DMEM + Additives 14.91 330 A2 Saline DMEM + NaHCOs + NaCl + Additives 15.29 335 Example 5: Analysis of F0 Generation Mice Coat Color. Mice were analyzed for coat color contribution from donor XY ES cells (agouti) and host embryo (white). None of the F0 generation mice exhibited any coat color contribution from the host embryos. Sex. F0 generation offspring were determined as female or male by visual inspection of the external genitalia. FO offspring were sexed based on visual inspection and were paired for breeding. Genotyping. The presence of an X chromosome was detected using a TAQMAN™ QPCR assay specific for a sequence on the X chromosome. The presence of a Y chromosome was detected using a TAQMAN™ QPCR assay specific for a sequence on the Y chromosome. Genotyping of phenotypically female F0 generation mice revealed a single copy of the X chromosome and a single copy of the Y chromosome in all phenotypically female mice tested. Karyotyping: Six F0 generation XY females were karyotyped. Karyotyping results showed that all six females had a normal X and a normal Y chromosome. XY Female Reproductive Anatomy. Several F0-generation XY females were examined for internal reproductive organs. All FO XY females examined appeared to have normal female internal reproductive organs. Each reproductive organ (ovary, fallopian tube, uterus) was genotyped, and the results showed that the tissues had a uniform XY genotype. Example 6: Analysis of the Effect of Osmolality on the Efficiency of Producing XY Females and Offspring from ES H Cells To determine the effect of osmolality on the production of XY females from XY ES cells maintained in low-salt, low-carbonate DMEM, glucose was added to low-salt, low-carbonate DMEM to bring the osmolality to that of DMEM. Osmolality was measured on an Advanced® Model 3250 Single Sample Osmometer. Table 3: Effects of Osmolarity, Salt and Carbonate on Offspring Obtained from ES Cells and F0 XY Females Medium Osmolality NaCl NaHCO3 Glucose ES (mOsm/kg) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) ES Cell Obtained Offspring Offspring/All XY male XY female Offspring DMEM 13/58 0/13 329 6.4 3.7 4.5 13/13 (%224) (%0) DMEM- 36/71 10/36 270 5.1 2.2 4.5 26/36 LS/LC (%50.7) (%27.8) DMEM- 20/50 3/20 322 5.1 2.2 15.5 17/20 LSILC/HG (40%) (15%) DMEM- 53/58 18/53 218 3.0 2.2 4.5 35/53 VLSILC (91.4%) (34.0%) DMEM- 50/57 17/50 261 5.1 1.5 4.5 33/50 LS/VLC (87.7%) (34%) DMEM- 49/68 14/49 294 6.4 1.5 4.5 35/49 VLC (72.1%) (286%) Donor XY ES cells were cultured in a medium containing, among other things, 5.1 mg/ml NaCl, 2.2 mg/ml NaH003 and 15.5 mg/ml glucose, with an osmolality of 322 mOsm/kg were maintained in low-salt, low-carbonate, high-glucose DMEM ('"DMEM-LS/LC/HG'l). Upon transfer of these ES cells into embryos according to the VELOCIMOUSE® method (mentioned above), 151% of all F0 generations derived from the resulting ES cell-derived F0 mice were phenotypically female XY mice. As a negative control, in the FO generation, no phenotypically female XY mice were obtained from ES cells maintained in DMEM ("DMEM": 6.4 mg/ml NaCl, 3.7 mg/ml NaHCOs, and 4.5 mg/ml glucose; 329 mOsm/kg). This 15% F0 XY female result was obtained from ES cells maintained in DMEM (329 mOsm/L) and 0% F0 XY females from ES cells maintained in low-salt, low-carbonate DMEM ("DMEM-LS/LC": The 27.8% FO obtained from ES cells maintained in DMEM (5.1 mg/ml NaCl, 2.2 mg/ml NaHCO3, and 4.5 mg/ml glucose; 270 mOsm/kg) is among the 27.8% FO obtained from XY female mice. Therefore, one interpretation is that osmolality provides some, but not all, female effect. An alternative explanation is that low salt and/or low carbonate provides a female effect, and high glucose inhibits female effect of XY ES cells to some extent. See Table 3. Furthermore, when ES cells were maintained in DMEM-LS/LC/HG, the efficiency of generating ES cell-derived mice (Table 3) (i.e., approximately 40%) was higher than that of ES cells maintained in DMEM (i.e., approximately 22%), but not as high as that for DMEM-LS/LC. (i.e., approximately 51%). See Table 3. Example 7: Analysis of the Effect of Salt Concentration on the Efficiency of Producing ES Cell-Derived Offspring and XY Females To determine the effect of salt concentration or ionic strength on producing XY females from XY ES cells, ES cells were maintained in very low-salt DMEM (DMEM-VLS/LC: 3.0 mg/ml NaCl, 2.2 mg/ml NaHCOa, 4.5 mg/ml glucose; 218 mOsm/kg). Upon transfer of these ES cells into embryos according to the VELOCIMOUSE® method (above), 34% of all the resulting ES cell-derived F0 progeny were phenotypically female XY mice, slightly above the DMEM-LS/LC control level of 27.81%. Interestingly, In this figure, 91.4% of the FO offspring obtained from the transfer of ES cells maintained in DMEM-VLS/LC media were derived from ES cells, while only 50.7% and 22.4% of the ES cells were derived from DMEM-LS/LC and DMEM Controls, respectively. In another experiment, ES cells were maintained in high-salt, low-carbonate medium (DMEM-HS/VLC: 6.4 mg/ml NaCl, 1.5 mg/ml NaHCO3, 4.5 mg/ml glucose; 294 mOsm/kg). Upon transfer of these ES cells into embryos according to the VELOCIMOUSE® method (mentioned above), 28.6% of all the resulting ES cell-derived F0 progeny were phenotypically female XY mice, which corresponds to 27.8% DMEM-LS/LC is slightly above the control level. Interestingly, 72.1% of the FO offspring obtained from the transfer of ES cells to DMEM-HS/VLC media were derived from ES cells, while only 50.7% and 22.4% of the FO offspring obtained from ES cells were derived from ES cells in DMEM-LS/LC and DMEM Controls, respectively. These results confirm that low salt and/or low carbonate contribute to an increase in the proportion of FO offspring derived from ES cells and the proportion of F0 XY females. (See Table 3.) Example 8: Analysis of the Effect of Carbonate Concentration on the Efficiency of Producing ES Cell-Derived Offspring and XY Females To determine the effect of carbonate concentration on the production of XY females from XY ES cells, ES cells were cultured in low-salt and very low-carbonate media (DMEM-LS/VLC: Upon transfer of the aforementioned ES cells into embryos according to the VELOCIMOUSE® method (mentioned above), 34% of all ES cell-derived F0 progeny were phenotypically female XY mice, which is slightly above the DMEM-LS/LC control level of 27.8%. Interestingly, 87.7% of the FO progeny obtained from transfer of ES cells maintained in DMEM-LSA/LC media were ES cells, while only 507% and 22.4% of ES cells were obtained in DMEM-LS/LC and DMEM Controls, respectively. These results suggest that low carbonate levels are associated with the ES cell-derived F0 progeny and the F0 XY mice. (See Table 3.) Example 9: Phenotype of F0 XY Female Mice F0 XY phenotypic female mice exhibited relatively normal phenotypic characteristics compared to F1 XY phenotypic mice of the same strain. However, XY female mice showed a greater range of values for each physical parameter. Body weight of adult XY females ranged from about 15 grams to about 30 grams, averaging about 21.5 grams. Body weight of adult XX females ranged from about 16 grams to about 17 grams, averaging about 16.8 grams. The ratio of the distance between the anus and the genitals was determined and calculated as a body mass ratio (anogenital distance / (cm) / body mass (9)). For F0 XY females, the ratio ranged from about 0.11 cm/g to about 0.24 cm/g, with a mean of about 0.16 cm/g. For F1 XX females, the ratio ranged from about 0.17 cm/g to about 0.19 cm/g, with a mean of about 0.18 cm/g. There were no significant differences between the relative masses of various organs (forehead, liver, kidneys, heart and lung, and spleen) for XY female mice and XX female mice. The relative masses are expressed as organ mass (mg) / body mass (9). The relative mass of the liver of F0 XO females ranged from about 35 mg/g to about 50 mg/g, with a mean of about 42 mg/g. The relative mass of the liver of F1 XX females ranged from about 37.5 mg/g to about 46.9 mg/g, with a mean of about 42.5 mg/g. The relative mass of the kidneys of FO XO females ranged from about 11.5 mg/g to about 15 mg/g, with a mean of about 13.4 mg/g. The relative mass of the kidneys of F1 XX females ranged from about 12.6 mg/g to about 13.8 mg/g, with a mean of about 13.7 mg/g. The relative total mass of the heart and lungs of F0 XO females ranged from about 14.3 mg/g to about 18.9 mg/g, with a mean of about 16.1 mg/g. The relative total mass of the heart and lungs of F1 XX females ranged from about 14.7 mg/g to about 16.1 mg/g, with a mean of about 15.9 mg/g. The relative mass of the spleen of F0 XO females ranged from about 2.7 mg/g to about 6.6 mg/g, with a mean of about 3.3 mg/g. The relative mass of the spleen of F1 XX females ranged from about 2.7 mg/g to about 4.0 mg/g, with a mean of about 3.8 mg/g. F0 XY female mice were found to exhibit relatively normal serum levels of electrolytes, enzymes, glucose, protein, lipids, and other markers compared to genetically identical F1 XX females. However, XY Female mice showed a greater range of values for each measured serum parameter. Serum sodium levels of adult XY females ranged from about 150 mEq/L to about 159 mEq/L, and for XX females these levels ranged from about 148 mEq/L to about 155 mEq/L. Serum potassium levels of adult XY females ranged from about 0.7 mEq/L to about 7 mEq/L, and for XX females these levels were around 0.7 mEq/L. Serum Chloride levels of adult XY females ranged from about 111 mEq/L to about 121 mEq/L, and for XX females these levels were around 0.7 mEq/L. levels ranged from about 113 mEq/L to about 120 mEq/L. Serum calcium levels of adult XY females ranged from about 7 mEq/L to about 9 mEq/L, and for XX females these levels were around 7 mEq/L. Serum alkaline phosphatase levels of adult XY females ranged from about 124 U/L to about 285 U/L, and for XX females these levels ranged from about 191 U/L to about 236 U/L. Serum aminotransferase levels of adult XY females ranged from about 21 U/L to about 285 U/L, and for XX females these levels were around 7 mEq/L. these levels ranged from about 13 U/L to about 34 U/L. Serum aspartate levels for adult XY females ranged from about 42 U/L to about 190 U/L, and for XX females these levels ranged from about 42 U/L to about 269 U/L. Serum lipase levels for adult XY females ranged from about 16 U/L to about 49 U/L, and for XX females these levels ranged from about 21 U/L to about 26 U/L. Serum glucose levels for adult XY females ranged from about 227 mg/dL to about 319 mg/dL. and for XX females these levels ranged from about 255 mg/dL to about 270 mg/dL. Total serum protein levels of adult XY females ranged from about 4.6 mg/dL to about 5.2 mg/dL, and for XX females these levels ranged from about 4.6 mg/dL to about 4.8 mg/dL. Serum albumin levels of adult XY females ranged from about 3 mg/dL to about 3.5 mg/dL, and for XX females these levels ranged from about 3.1 mg/dL to about 3.2 mg/dL. Serum Cholesterol (total) levels of adult XY females ranged from about Serum triglyceride levels in adult XY females ranged from about 42 mg/dL to about 89 mg/dL, and for XX females, they ranged from about 39 mg/dL to about 48 mg/dL. Serum HDL levels in adult XY females ranged from about 29 mg/dL to about 57 mg/dL, and for XX females, they ranged from about 23 mg/dL to about 42 mg/dL. Serum LDL levels in adult XY females ranged from about 3.7 mg/dL to about 11 mg/dL, and for XX females, these levels ranged from about 3.7 mg/dL to about 13 mg/dL. Blood nitrogen (BUN) levels in adult XY females ranged from about 12 mg/dL to about 27 mg/dL, and for XX females, these levels ranged from about 18 mg/dL to about 21 mg/dL. Serum magnesium levels in adult XY females ranged from about 1.6 mg/dL to about 3.2 mg/dL, and for XX females, these levels ranged from 2.1 mg/dL. Serum inorganic phosphate levels for adult XY females ranged from about 5.1 mg/dL to about 10 mg/dL, and for XX females, these levels ranged from about 7.2 mg/dL to about 8.4 mg/dL. Serum uric acid levels for adult XY females ranged from about 0.9 mg/dL to about 3.5 mg/dL, and for XX females, these levels ranged from about 0.7 mg/dL to about 2.2 mg/dL. Example 10: Production of Homozygous Genetically Modified Mice in the F1 Generation To determine if F1 mice homozygous for a genetic modification could be produced, a FO XY female mice containing at least one knockout allele of the STEAP2 gene were mated with a cohort of XY males containing the same STEAP2 gene knockout. The STEAP2 (six transmembrane epithelial antigen of the prostate 2) gene encodes a putative six-membrane metallo-reductase with iron reductase and copper reductase activity and has been shown to stimulate cellular uptake of both iron and copper in vitro. As a cell-surface antigen, STEAP2 is a potential diagnostic or therapeutic target in prostate cancer. STEAP2 is significantly higher in untreated primary and hormone-refractory prostate cancers than in benign prostatic hyperplasia, suggesting its involvement in prostate cancer development. STEAP2 KO mice have not been reported. See Ohgami et al., BLOOD, Vol. 108(4):1388-1394, 2006.) The results are shown in Table 4.TR TR TR TR TR TR TR TR