Teknik Alan Mevcut bulus oksalat ile ilgili rahatslîlllîlarl tedavi edilmesi ve önlenmesi için yöntemlerde kullanUB1ak üzere bilesenlerle ilgilidir. Daha ayrlEtUJJIblarak, bulus oksalat bozucu veya oksalat azaltlElEnzimleri içeren, bu tür yöntemlerde kullanIia yönelik bilesenler ile ilgilidir. Önceki Teknik Böbrek-idrar yolu tasüiiastallgllîdürolityaz) dünyanlîil her yerinde önemli bir sagIHZl problemidir. Ürolityazla baglantEltaslarI çogu sadece kalsiyum oksalattan veya kalsiyum oksalat ile kalsiyum fosfattan olusur. Diger hastalüî] durumlarEIda ayrlîb aslElEloksalat ile iliskili bulunmustur. Bunlara vulvodini, son asama renal hastalllZIa ilgili oksaloz, kardiyak iletkenlik bozukluklarDCrohn hastal[gil3le diger baglEsakia ilgili hastalEdurumlarlîlahildir. Oksalik asit ve/veya tuzu oksalat çok çesitli yiyeceklerde bulunur ve dolayEIîLla insan ve hayvan diyetindeki bir çok içerigin bir bilesenidir. Artmlgloksalat aIIiElarttElIBilgl miktarda Oksalik asit içeren glElhlarI yenmesinden sonra ortaya çliZhbiIir. Ispanak ve ravent gibi g-IarI yüksek miktarda oksalat içerdigi bilinir ancak diger 9. ve içeceklerinde bir çogu oksalat içerir. Oksalat bir çok 9. çesidinde bulundugundan dolayEiliem oksalatça düsük hem de lezzetli diyetler formülize etmek zordur. Ek olarak düsük oksalat diyet ile uyumluluk genellikle problemlidir. Endojen oksalat ayrlEa normal doku enzimleri tarafIan metabolik olarak da üretilir. Metabolik olarak üretilen oksalat kadar iyi abzorbe edilen diyet oksalat Içeren oksalat, doku enzimleri tarafIan metabolize edilenden farkllîiegildir ve dolaylgýla atilüîaIIIEl Atilliii temel olarak böbrekler yoluyla olur. OksalatI böbrek leErIaki derisimi kritiktir, artmlgloksalat derisimleri kalsiyum oksalat kristallerinin olusumu ve dolaylgîzla da ardIdan böbrek taslarII olusumu riskini arttIEIE Böbrek tasljolusma riski daha tamamen anlaslliiamlg birçok faktörün çevresinde döner. Böbrek veya idrar yolu tasühastal[glEBatEIJIkelerindeki nüfusun %12'si kadarIda görülürken bu taslarI %70'i kalsiyum oksat veya kalsiyum oksat artEkaIsiyum fosfattan olusur. Bazü bireyler (örn. Chron's hastallglEgibi bagli-;tak ile ilgili hastaligiüalan hastalar, iltihaplEbag [Bak hastalfglEl/eya steatore hastalarlZl/e ayrlîh jejunoileal bypass ameliyatügeçirmis hastalar) diyetlerinde digerlerine göre daha fazla oksalat abzorbe ederler. Bu bireyler için, oksalat ürolityazüljurumu önemli derecede artar. Artan hastalilZI durumu böbrekler ve idrarda artan oksalat seviyeleri sebebiyledir ve bu, bir kiside en yaygI görülen hiperoksalürik sendrom olup, baglßaksal hiperoksalüri olarak bilinir. Oksalat ayrlEh son asama renal hastalEglEblan hastalarda da bir problemdir ve artan idrar oksalatII vulvar vestibulitis (vulvodinya) ile de ilgili olduguna dair yakI zamanda kanifllar bulunmustur (Solomons, C.C., M.H. Melmed, S. M. Heitler [1991] "Calcium citrate for vulvar vestibulitis" Journal of Reproductive Medicine 36:879-882). Oksalatüjegredasyona ugratan bakteriler insan disk-an ayElîhlgtlEWlison, M. J., H. M. Cook, D. B. Milne, S. Gallagher, R. V. Clayman [1986] "Oxalate degradation by gastrointestinal bacteria from humans" J. Nu-tr. 116:455-460). Bu bakteriler çesitli hayvan türünün baglEak içeriklerinden izole edilmis oksalat azaltan bakteriye benzer bulunmuslardIEl (Dawson, K. A., M. J. Allison, P. A. Hartman [1980] "Isolation and some characteristics of anaerobic oxalate-de-grading bacteria the rumen" Appl. Environ. Microbiol. 40:833-839; Allison, M. J., H. M. Cook [1981] "Oxalate degradation by microbes of the large bowel of herbivores: the effect of dietary oxalate" Science 212:675-676; Daniel, S. L., P. A. Hartman, M. J. Allison [1987] "Microbial degradation of oxalate in the gastrointestinal tracts of rats" organizmalardan farklIlElve hem yeni bir tür hem de sIlEadEverilmistir (Allison, M. J., K. A. Dawson, W. R. Mayberry, J. G. Foss [1985] "Oxalabacter formigenes gen. nov., sp. nov.: oxalate-degrading anaerobes that inhabit the gastrointestinal tract" Arch. Microbiol. 141:1- Tüm insanlar baglEsak yollarIa 0. form/-genes popülasyonu tasIiazlar (Allison, M. J., S. L. Daniel, N. A. Comick [1995] "Oxalate-degrading bacteria" In Khan, 8. R. (ed.), Calcium Oxalate in Biological Systems CRC Press; Doane, L. T., M. Liebman, D. R. Caldwell [1989] Research 9:957-964). Jejunoileal bypass ameliyatlgeçirmis kisilerin dlgklîörneklerinde oksalat azaltan bakteriler çok düsük konsantrasyonlardadlîlveya hiç yoktur. (Allison ve ark. "Oxalate degradation by gastrointestinal bacteria from humans" J. Nutr. 116:455-460). AyrlEla belirli insanlar ve hayvanlar 0. form/'genes kolonileri tutabilirler ancak yine de açlKÇa anlaslßîayan sebeplerle yüksek oksalat seviyelerine sahip olabilirler. Gereken, oksalatla ilgili durumlar. tedavi edilmesi veya önlenmesi için vücutlarIaki oksalat seviyelerini azaltmak için insanlar ve hayvanlar için yöntemlerdir. Tercih edilen yöntemlere oksalat azaltan bilesenlerin verilmesi dahildir. Bulusun klEh aç[EIamasl:l Mevcut bulus Istem l'e göre oksalat ile iliskili rahatslîllKIarI tedavi edilmesi ve önlenmesine yönelik yöntemlerde kullanIia yönelik bilesimleri içermektedir. Mevcut bulusun bilesimleri bagßak kanalIa oksalat!] azaltan oksalat dekarboksilazlîl içermektedirler. BaglBak kanalIaki bu azaltIi iyi sagl[g]Darttlün sistemik oksalat seviyelerinde azaltIia yol açmaktadE Formil-CoA transferaz ve oksalil-CoA dekarboksilaz enzimlerinin oksalat bozunmaleUa önemli bir rol oynadlElarDtanIilanmlISIE Yöntemler ve bilesimlerde kullanHân enzimler sIlEllEl olmamak üzere formil-CoA transferaz, oksaliI-CoA dekarboksilaz, oksalat oksidaz, oksalat dekarboksilaz ve diger enzimler, es faktörler ve oksalat bozundurucu yollarI ikameleri olan veya oksalat metabolik yollarla iliskili olan, özellikle oksalat azaltIiElsaglayan es enzimleri içermektedir. Mevcut bulusun bir yapilândlîiinaleUa konak canllfila bu enzim veya enzimle ilgili aktiviteleri kodlayan dlgal polinükleotidlerde dönüstürülebilir ve dolaylîls-Lla oksalat azaltmayülegistirme becerisini de degistirilen konak cani. incelenebilir. Bu konak canlüörnegin, oral verilim ve/veya bagßaklarl kolonizasyonu için zellikle iyi adapte bir mikrop olabilir. Alternatif olarak, konak canllî.] dönüstürüldükten sonra istenlien enzim aktivitelerini üretecek ve dolaylîlsîla bitki maddesi tüketildiginde bu aktivitelerin baglEtakta mevcut kulacak bir bitki olabilir. Alternatif olarak, dönüstürülen bitkinin, tercihe göre dönüsüm tarafIan saglanan proteinlerin eylemler sebebiyle daha düsük miktarda oksalata sahip olabilir ve dolaylîlýla tüketildiginde bitki diyete dönüstürülmemis bitkiden çok fazla daha oksalat saglayamaz. Mevcut bulus ayrlEla oksalatla ilgili rahatsiZllaarEtedavi etmek veya önlemek için oksalat seviyelerini azaltmak için enzimlerden olusan bilesenlerden olusur. Örnegin, oksalat seviyelerinde bir düsüs, oksalatlîbzaltmak için çalgn enzimlerin verilmesiyle elde edilebilir. Bu enzimler izole ve saf olabilirler veya bir hücre Iizatlîrblarak verilebilirler. Hücre Iizatüoksalat azaltan fonksiyonlarElolan herhangi bir mikroorganizmadan yapllfnEl olabilir, örnegin, 0. form/gene& Özel bir yapllândlünada, verilen enzimler, bunlarla sIlEllüalmamak üzere örnegin oksalat dekarboksilaz, oksalat oksidaz, formil-CoA transferaz ve oksalil-CoA dekarboksilaz gibi enzimlerdir. Tercihe baglünlarak enzim etkinligini arttlEacak ek faktörler de verilebilir. Bu ek faktörler örnegin, oksalil CoA, MgCIz, ve TPP (tiamin difos-fat, vitamin Bi'in aktif bir formu) olabilir. Enzimleri içeren bilesenler bir veya daha fazla enzim içerir ve tercihe göre kofaktörler, koenzimler ve enzim etkinligini tek baslEla veya kombinasyon olarak arttlîabilen diger ajanlarma içerebilir. Mevcut bulusun bir yapliândünaslia oksalat seviyelerinde bir azalmaya oksalat azaltan enzimler salgllâmasEiçin degistirilmis Escher/'ch/'a co/i' gibi rekombinan bir mikrop taraflEUan üretilen oksalat azaltan enzimler verilerek erisilebilir. Rekombinan konak canIEl/eya cansE formda verilebilir. Mevcut bulusun diger bir özelligi, oral yolla verilme için farmasötik bilesenler ve/ve besin ilaveleri ile ilgilidir. Bu bilesenler oksalat azaltan enzimleri insanlar veya hayvanlar. baglfsaklar- salarlar. Mevcut bulusun bilesenleri farmasötik olarak kabul edilebilir formülasyonlardan olusur. Örnegin, mevcut bulusun bilesenleri, bilesenlerin al-I baglEtaklarI gönderimi gibi, istenilen bölgelere bilesenleri saglayan bir doz gönderim sistemi içerir. Mevcut bulusun bilesenleri süt, et ve yogurt gibi glöblarl ögesi olarak verilebilir. Oksalatla ilgili rahatslîlllîlara bunlarla sIlHllZI olmamak üzere, hiperoksaluriya, birincil hiperoksaluriya, idiopatik kalsiyum oksalat böbrek tasi] hastallglEI (ürolitiyaz), enterik hiperoksaluriya, volvodinya, oksaloz ile ilgili son asama böbrek hastallglElkardiyak kondüktans rahatslîllElarÇlenflamatuarlElibag [Bak hastallglüCrohn's hastallgEle ülseratif kolit dahildir. Sekillerin klEla açüillamasEl SEK. 1A yüksek kalsiyumlu bir diyetten verilerin grafigidir. SEK. IB düsük kalsiyumlu bir diyetten verilerin grafigidir. SEK. 2A sal-n oksalat. bir grafigidir. SEK. ZB sallElan oksalat. bir grafigi. SEK. ZC saIIn oksalatI bir grafigi. SEK. 3A-C saIIn oksalat. bir grafigi. SEK. 4 salIn oksalat. bir grafigi. Bulusun detaylüçlElamasEl Istem 1'e göre, mevcut bulus kullanIi için bilesenlerden olusur. Bilesenler oksalat azaltma yollarII bilesenleri olan enzimleri de içerebilir. BazElbilesenler bir veya daha fazla enzim içerir ve tercihe göre kofaktörler, koenzimler ve enzim etkinligi için gerekli veya istenilen diger faktörler içerebilir. Bilesenler bitkiler, hayvanlar veya insanlarda bulunan oksalat azaltlEDenzimler de dahil olmak üzere bir veya daha fazla enzim içerir. Bilesenler burada ögretilen oksalat azaltan enzimlerden bir veya daha fazlasIülçerir. Burada kullanIlglElgibi "bir veya daha fazla enzim" terimi, bir enzim olarak örnegin formil-CoA transferaz anlam. veya birden fazla olarak örnegin formiI-CoA transferaz ve oksalat dekarboksilaz anlamEla gelir. Önceki teknikte bilindigi gibi, terim bir enzim molekülü anlam. gelmez, bir veya daha fazla enzim türünün çoklu molekülleri anlam. gelir. Burada kullan.[gl|]_;ibi, oksalat azaltan enzimler ve oksalat miktarEindiren enzimler terimleri aynElamaçla kullanIJIEve herhangi bir organizmada oksalat. azalmasIa mevcut enzimler veya aktif parçalar ya da oksalat azaltabilecek aktif parçalardan olusan rekombinant proteinler anlam. gelir. Mevcut bulusun enzim bilesenleri ayrlîh mide veya baglîtak bölgesi taraf-an aktif enzim moleküllerinin azaltilBwasIan koruyacak formülasyonlar da içerebilir. Örnegin, enzimlerin bilesenleri, enzimleri koruyacak veya kafesleyecek bilesenler içerebilir. Enzimler PEG dahil olmak (ancak PEG ile sIlEIlElolmamak üzere) üzere diger bilesenlere kovalent olarak baglanmlglolabilir. Enzim, örnegin enzimleri salmak için bozulan veya enzimlerin yap-n girip çlElnas- izin veren ya da substratlarI enzimlere ulasmasEiçin yaplîia girmesine izin veren gözenek boyutlarlîib sahip polimerlerden yapllân üç boyutlu bir ag yap-I içi gibi bir yapi. içine kafeslenmis veya hapsedilmis olabilir. Örnegin, gözenek boyutu enzimlerin mevcut oldugu alana saIIi yapmak Için düsük moleküler ag lEllllZll]›ksalat ve format. geçmesine izin verir boyutta olabilir. AyrlEla, enzimler polimer yaplýla kovalent olarak baglEloIabilir veya olmayabilir. Proteolitik veya enzimlere zararlEtliger çevrelerde aktif enzimleri bozulmadan Mevcut bulus, bilesimlerin faaliyetinin var olan oksalatI miktarEi/e/veya konsantrasyonunu azalttlgiÇlve böylece oksalat nedeniyle hastallKlriskinin azaltIigiEihsan baglîsak kanaIII içine bir ya da daha fazla oksalat bozundurucu enzimleri içeren bilesimlerin tanmas- iliskindir. Mevcut bulus insanlar ve hayvanlarda oksalatla iliskili rahatslîllarl tedavi edilmesi ve Önlenmesine yönelik bilesimleri içermektedir. Bu tür bilesimler, oksalatla iliskili rahatslîllgll ciddiyeti veya insan veya hayvandaki vücut slîüârül'eya bag lE'taktaki oksalat. miktarlEb baglEl olarak bir ya da daha fazla gün boyunca günde bir ya da daha fazla kere uygulanabilmektedir. Tedaviler insan veya hayvanda istenmeyen seviyelerde oksalar mevcut oldugu sürece devam edebilmektedir. Örnegin, enzim bilesimi bir ya da daha fazla yllîldahil olmak üzere bir zaman arallgiElçin günde bir ya da daha fazla kere uygulanabilmektedir. Kronik oksalatla iliskili rahatslîllga sahip insanlar veya hayvanlar için, bilesim, insan veya hayvanItüm hayatEliioyunca uygulanabilmektedir. Oksalatla iliskili rahatslîlllZlarI tedavi edilmesi ve önlenmesine yönelik yöntemler oksalatEI azaltan enzimlerin etkili bir miktarIEliçeren bir bilesimin uygulanmasIEIiçermektedir. Bilesenlerdeki enzim miktarÇlkisinin bag Baklarlda mevcut oksalat. bir bölümünü azaltacak oksalat azaltan enzim etkinliginin bir etkinlik birimi miktarlEUan veya oksalat miktarliîlja bir azaltma baslatacak ya da bilesenin verilmesinden önce mevcut oksalat miktarMa karsllâst-Ilgia kisinin azalmgl oksalat miktarIEl koruyacak oksalat azaltan enzim etkinliginin etkinlik birim seviyesinden olusur. Tek bir doz bileseninde kullanllâbilecek oksalat azaltan enzim etkinliginin etkinlik birimi saym,0001 birim ila 5000 birim arasia, 5 birim ila 100 birim araleda ve bunun içinde kalan tüm aralllîlarda olabilir. Bilesenler ayrlîh diger enzimleri, kofaktörleri, substratlarükoenzimleri, mineralleri ve oksalat azaltllßîasia yardIicü diger ajanlarEiçerebilir. Enzimin bir birimi 37°C'de dakikada bir mikromol oksalat azaltacak enzim miktarIlB Bir yapllândlîilnada, mevcut bulus bir ya da daha fazla enzimin faaliyetinin baglEiakta mevcut olan oksalat. miktarElazalttlgD insan veya hayvan baglEagI, herhangi bir kaynaktan türetilen bir ya da daha fazla oksalat azaltEZEnzimi içeren, böbreklerde ve diger hücresel slîllârda oksalat. konsantrasyonunun azaltHh'îaleh neden olan bilesimlerin uygulanmasEl/e preparasyonuna yönelik yöntemleri içermektedir. Burada uygulanan enzimler oksalatEl azaltma ktadlü Herhangi bir teoriye baglEblmak istenilmemesine ragmen, baglBlsaklarlEl içeriklerinin oksalat azaltan bakteri veya oksalat azaltan enzimlerin bir veya daha fazla türüyle zenginlestirilmesinin bagirsak içeriklerinde oksalat. azalmasi sebep olduguna inanllBiaktadlE Bazübakteriler veya verilen enzimler azaltma islemini emilim bölgesinde veya emilim bölgesinin yakIIia gerçeklestirir. Bakterilerin veya verilen enzimlerin etkinligi diyet yoluyla allTilan oksalatI emilim seviyesini azaltlB Bagßaklarda oksalat derisiminin azalmasEl ayrlEla oksalat. hücreler ve genel dolasIidan kaldlEIlBiasEille de sonuçlanabilir. Daha detayllîl olarak, baglßaklarda oksalat derisiminde bir azalma ayrlEla oksalatlü kandan baglßaga daha fazla salIIilEa sonuçlanarak idrarda atllîhaslgereken oksalat miktarlljzaltabilir. DolaylgEa oksalat azaltan bakteri veya oksalat azaltan enzimlerin verilmesine yönelik yöntemler diyet sebepli hiperoksalüri tedavisine ek olarak birincil hiperoksalüri gibi oksalatla ilgili durumlarlîl tedavi etmek veya önlemek için kullanlßbilir. Mevcut bulusun bilesenleri insanlarda ve hayvanlarda saglElZlühksalat seviyelerinin saglanmasübin özellikle avantajIIE Oksalat azaltan enzimin tek bas. veya kombinasyon olarak baglEtaga verilmesi için farmasötik ve fonksiyonel glEIh olarak bilesenlere slîüeya macun formunda Iiyofilize olmus veya dondurulmus ve bir jel kapsül ya da baska bir baglEtaksal koruma ile hapsedilmis bakteriler ve enzimler dahildir. Jel kapsül materyal tercihen gastrik asitlin ve midenin enzimleri taraflEblan bozunmaya dayanllîllîancak baglßagl daha yüksek pH'IElie safra asidi bilesenleri taraf-an oksalat azaltan bilesenlerin dogal sallElIilEa bozunan bir gönderim haplZl ya da kapsülü olusturan bir polimer materyaldir. Sal-n bilesen daha sonra baglEtakta mevcut olan oksalatElzararslîl ürünlere dönüstürür. Farmasötik veya fonksiyonel besin taslîlîllâr da ayrlEla bakteri veya enzimlerle birlestirilebilir. Bunlara örnegin tuzlu fosfat tamponu dahildir. Yöntemler insanlar veya hayvanlar. baglEtak kanallEb oksalat azaltan bilesimlerin uygulanmaslübermektedir. Bir veya daha fazla oksalat azaltan enzimden veya bakteri ve enzimlerin kombinasyonundan olusan, verilecek oksalat azaltan bilesenler bileseni mide asidinin yan etkilerinden koruyacak sekilde tasarlanmEl kapsüller veya mikrokapsüller olarak gönderilebilir. Bir veya daha fazla çesitli baglEaksal koruyucu kaplama yöntemleri kullanllâbilir. Bu tür bagßaksal kaplamalar. tanIiIarlEb selüloz asetat ftalatI kullanIilZdahildir (CAP) (Yacobi, A., E. H. Walega, 1988, Oral sustained release formulations: Dosing and evaluation, Pergammon Press). Kaplama teknolojisinin diger tani-lar A.B.D. Pat. No. 5,286,495 dahildir. Mevcut bulusun bilesenleri ayrEla fitil olarak da formüle edilebilir. Bir veya daha fazla mikroorganizmadan, bir veya daha fazla oksalat azaltan enzimden veya kombinasyonlar ve kariglüiilardan olusan bu bilesenlerin bagiEaklara verilmeleri için diger yöntemlere, bilesenleri direk olarak gldh kaynaklar. eklemek dahildir. Bir veya daha fazla bakteri taze elde edilmis hücreler, dondurularak kurutulmus hücreler veya baska sekilde korunmus hücreler seklinde eklenebilir. Bir veya daha fazla enzim, Iiyofilize proteinler, kaplanmlg veya mikro kaplanmlgl enzim bilesenleri, enzimlerin etkinligini korumak için diger materyallerle kompleks haline getirilmis enzimler ve teknikte uzman kisilerin bilesenlere aktif enzimler eklemek için bildigi diger yöntemler olarak eklenebilir. GEIbIar, tatlarIlZlveya görünümlerini etkilemeden oksalat azaltan bilesenler içerebilir. Bu g-lar örnegin yogurt, süt, flgtliîl ezmesi veya çikolata olabilir. Yenildikten sonra, 9. ürünleri baglEsaklar tarafIan sindirilirken ve milirken, oksalat azaltan bilesenler, bir veya daha fazla mikroorganizma, bir veya daha fazla enzim veya kombinasyonlarEUa dahil olmak üzere baglîsaklarda mevcut oksalatüzaltarak oksalat. kan dolas" emilimini azaltE Yukarida belirtildigi gibi, çesitli glEIia türlerine oksalat azaltan bilesenler eklenebilir. Oksalat azaltan bilesenler içeren bu tür glZlhlarI yapIiEiçin yöntemlere, glöh maddesinin oksalat azaltan bir bilesenle karlgtlîllîhaslîtiahildir. Örnegin, oksalat azaltan mikroplar bir ortamda büyütülmüs ve bu ortamdan, örnegin santrifüj yoluyla, ayrilßig olabilir. Ticari bir süt ürününden elde edilen geleneksel yogurt kültürleri oksalat azaltan mikrobik kültürle karlgtlülâbilir. Kültürlerin karlglüiilîkjaha sonra tadEiieya tutarlHJgiEkötü etkilemeden temel günlük yogurt ön karisim. eklenebilir. Yogurt daha sonra geleneksel ticari prosedürler kullanilârak üretilip paketlenebilir. Baska bir örnekte, oksalat azaltan bakteri önceden üretilmis yogurtlara eklenebilir. Benzer bir yöntemde, bir veya daha fazla oksalat azaltan enzimden olusan bir oksalat azaltan bilesen yogurt bakterisi kültürü veya yogurt gElh ürününe eklenebilir. Yöntemlerin bir baska örnegi, oksalat azaltan bilesenin homojenize ve sterilize olduktan sonra süte eklenmesidir. Bu tür bir yöntem mevcut olarak LactobaC//lus acido-ph/Yi's organizmalarlEl süte eklemek için süt ürünleri endüstrisinde kullan llB1aktadiEl Bakteri içeren herhangi bir 9- kaynagEbksaiat azaltan bakteri eklenerek kullanllâbilir. Bu glöh ürünlerine isleme sßslda istenilen mikroorganizmalar. eklendigi peynir veya et ürünleri dahildir. Oksalat azaltan enzimler içeren oksalat azaltan bilesenler içeren glahlar mikroorganizmalar içeren g-Iarla sIiîliiZdegildir ancak aktif enzimlerin eklenebilecegi tüm g. kaynaklarEbu gllara dahildir. Genel olarak glElb malzemeleri olarak düsünülen malzemeler, enzimlerin glElh malzemesinin üretimi veya büyümesinin herhangi bir asamasIa glElh malzemesinde mevcut oksalat üzerinde veya insan veya hayvan tarafIan sindiriminin herhangi bir asamaslia veya baglE'lsakta mevcut oksalat üzerinde aktif olmasülçin, enzimler için bir tasMEÜnalzeme olarak kullanllâbilir. Bir yapllândlîilnada örnegin kullanilan 0. form/'genes, bakterisi suslarünormal hayvanlardan, hayvanlarda kullanilBiak üzere veya normal insanlardan baglBak içeriklerinin seyreltilmesi ile asllânmlSlolan anaerobik kültürlerden izole edilmis saf kültürlerdir. Oksalat azaltan kolonilerin tespitine izin veren özel bir kalsiyum oksalat içeren ortam kullanllâbilir. Bir yapllândlElnada, her bir susun safllgEl en az iki müteakip tekrarllj klonlama adnElkullanIiElyoluyla garantilenebilir. Kullanßlßlan 0. form/genes suslarühücresel yag asitleri modelleri, hücre proteinleri DNA ve RNA modellerinin (Jensen, N. S., M. J. Allison (1995) "Studies on the diversity among anaerobic oxalate degrading bacteria now in the species Oxalobacter formigenes" Abstr. to the General Meeting of the Amer. Soc. Microbiol., 1-29), ve oligonikleotid problara yanlflhrl (Sidhu ve ark. 1996) de dahil oldugu çesitli testlere dayallîblarak karakterize edilmistir. Bu bakterilerin iki grubu (türlerin mevcut tanIiIarIia mevcut olan Grup I ve II) tanIilanmlStlEl Kullanllân suslar, oksalat azaltma kapasiteleri ve insan baglîsak yolunda kolonilesme becerisi kanltlhr- dayalEblarak seçilmistir. Seçilen suslara türlerin Group 1 ve II'sinden temsilciler dahildir. Bir yapllândlîrlna çesitli deneklere uygun oksalat azaltan bakterinin seçilmesi, hazlEllanmasüle uygulanmasßla yönelik prosedürleri içermektedir. Sadece bu sekilde olmamak üzere, genellikle bu denekler bu bakterileri baglEaklarIa barlEldlElnayan kisiler veya hayvanlardlîl Bu kolonisiz veya az kolonili kisiler, veya hayvanlar baglEtak içeriklerinde bulunan karEEl bakteriyel popülasyonlarda daha düsük derisimlerde organizmalar oldugunda bile 0. form/yenes bakterisinin hlîIEl/e kesin tespitini saglayan testler kullanilârak tannlanmlstlü Yöntemler ayrlaa oksalat azaltan bakterilerinin örnegin antibiyotik tedavi veya ameliyat sonrasEtlurumlar sebebiyle tükendigi kisileri tedavi etmek için de kullanllâbilir. Yöntemler ayrlEla örnegin oksalata duyarlHJEIve/veya asüüniktarda endojen oksalat üretimi sebebiyle oksalat azaltan bakteri kolonilerine sahip olmalariEla ragmen sagllllelîl oksalat seviyelerine sahip kisileri veya hayvanlarEIiedavi etmek için de kullanllâbilir. Kullanilâbilecek bakteriler en az iki yöntem yoluyla tanIiIanabilir: 1)Bu bakterilere özel oligonikleotid problar kullanllâbilir; ve/veya 2)10 mM oksalatlEbir anaerobik ortamda bir asllândlglEl/e asllânmadan sonra 1 ila 7 gün için 37°C'de oksalat kaybII belirlendigi bir kültür testi. 0. formigenes suslarII saf kültürleri genis fermentör serisi kültürlerinde yetistirilebilir vejücreler teknikte uzman olanlarI bildigi teknikler kullanilârak toplanabilir. Seçilmis tek bir sustan hücreler veya bilinen suslarI karlglînlÇlcanlHJglüorumak için gerekli oldugu sekilde isleme tabi tutulabilir (örn. trealoz veya gliserolle dondurularak kurutma) ve daha sonra mide asidinen geçisleri için hücreleri korumak için tasarlanmlgkapsüllerin (enterik kaplEkapsüller) içine yerlestirilirler. Hücreler, kisilerin ihtiyacIEh göre belirlenen miktarlarda ve arallklarda allEJIEl Bazüjurumlarda tek veya periyodik kullanIi gerekli ihtiyacEkarsllâyabiIirken baska durumlarda düzenli aIIi (örn. ögünlerle) gerekli olabilir. Bulus ayrEla 0. form/'genes hücreleri gibi oksalat azaltan organizmalardan veya baska kaynaklardan ya da rekombinant yollar gibi yöntemler tarafIdan hazlîllanmEloksalat azaltan enzimlerin insan baglBak yoluna verilmesi ile ilgilidir. Bir yapilândlülnada, oksalat azaltan enzimler saflastlElIfnlgve oral tüketim için farmasötik veya fonksiyonel glgh olarak hazlEllanmlgl olabilirler. Tercih edilen bir yapllândlEnada bu enzimler rekombinant olarak üretilirler. Bu enzimleri kodlayan DNA dizileri teknikte uzman kisiler tarafIan bilinmektedir ve örnegin WO 98/16632'de tanilanmlgtlEl Bu diziler, veya oksalat azaltan proteinleri kodlayan diger diziler, uygun bir konakta sal-bilir. Konak örnegin, E. co/I'veya LactabaciY/us olabilir. Dnüstürülmüs konak uygun düzenleyici ve tasIia sinyallerini içerecektir. Salgllânan protein izole, saflastlEllÜilglve burada açllZIandlgEsekilde verilmis olabilir. Alternatif olarak, istenilen oksalat azaltan proteinleri salgllâyan rekombinant konak verilebilir. Rekombinant konak canlÜ/eya canslîl formda verilebilir. Baska bir tercih edilen yapllândülnada enzimler kaplanmlgl veya midede inaktif hale gelmemeleri için enzimleri korumak için formüle edilmis veya degistirilmis ve ince baglEtakta oksalat zaltan etkinlikerini gerçeklestirmeleri için uygundurlar. Bu tür formülasyonlarI örnekleri teknikte uzman kisiler tarafIan bilinmektedir ve örnegin U.S. Pat. No. 5,286,495'te tanIiIanmIStlEl Burada kullanI[gll:lsekiIde oksalat azaltan enzimler, bunlarla sIlEIllZblmamak üzere oksalat yollaria yer alan tüm enzimleri içerirler ve oksalat oksidaz, oksalat dekarboksilaz, formil CoA transferaz ve oksalil CoA dekarboksilainlçerirler. Oksalat oksidaz daha yüksek bitkilerde salIlee oksalat. COz 'ye oksijen bagIlIEbksidasyonunu ve dogal olarak olusan H202'ye katalize eder. . OKsaIat oksidazlar örnegin arpa tohumu kökleri ve yapraklarlZIpancar saplarü ve yapraklarübugday tohumu, sorgum yapraklarEi/e muz kabuklarEgibi birçok kaynaktan saflastlEllEnlStE Arpa köklerinden oksalat oksidaz elde etmek için hlîlElliir üç adIillIstaflastlEna süreci gelistirilmistir. Arpa kökü oksalat oksidazIEkodlayan gen klonlanmlg dizilenmis ve sallîiinlgtlB Oksalat dekarboksilaz genellikle mantarlarda mevcuttur. Bakteriyel bir oksalat dekarboksilaz yakI zamanda B. subtilis'te bulunmus ve yvrk geni taraf-an kodlanmlgtlîl Oksalat dekarboksilaz, serbest oksalatI COZ ve fromata bozunmasIElkataliz eder. Bu enzim, Myrotheci'um, i/errucar-ia, Asperg//Ius n/'ger 'in belirli suslarElvebeyaz küf mantarlZTor/o/us versico/or'da dahil olmak üzere çok say. mantarda bulunmustur. Ham-mu//na ve/ut/pes oksalat dekarboksilazERodIaan gen klonlanmElve dizilenmistir; BakIîJWO 98/42827. Oksalil-CoA dekarboksilaz COA aktive bir substratta aktiftir ve formil CoA'ya dönüsür. Daha sonra bir formil-COA transferaz CoA üzerinde format ve oksalat degistirmek için hareket eder. Bu enzimler oksalat azaltan bakterilerde incelenmistir; toprakta mevcut olan Pseudomonas axa/at-i'cus ve insanlar da dahil olmak üzere omurgalilârl gastrointestinal yolunda mevcut olan Oxa/obacter formigenes. 0. form/'genes bag Eaktaki oksalik asit emilimini ve plazmadaki oksalik asit seviyelerini de düzenleyerek konaglîzla simbiyotik bir iliski göstermektedir. Sonuç olarak, bu bakterilerin yoklugunun idiopatik kalsiyum oksalat tekrarlEl ürolityaz ve jejunoîleal bypass ameliyatlElütakiben enterik hiperoksalüri, sistik fibröz ve iltihapllIlbaglEtak hastallElarElgibi oksalatla ilgili bozukluklarda bir risk faktörü oldugu bulunmustur. Daha önce oksalat azaltan çesitli enzimleri tanIiIayan ve bu enzimleri kodlayan genleri Oksalat azaltan enzim terimi oksalat oksidaz, oksalat dekarboksilaz, oksalil-CoA dekarboksilaz formil CoA transferaz ve oksalat veya oksalik asitle iliskiye girebilen enzimleri içerir ancak bunlarla sIIElllIdegildir. Bu enzimler dogal kaynaklardan türetilebilir veya teknikte bilinen rekombinant yöntemlerle sentezlenebilir ve baglanma bölgeleri, aktif bölgeler veya oksalat ya da oksalik asitle iliskiye girebilen parçalar gibi tüm parçalarEiçerir. Bu terim ayrlEh tüm gerekli kofaktörler, koenzimler, metaller veya oksalat ya da oksalik asitle iliskiye giren enzimde gereki olan baglama veya substrat materyalleri içerir ancak bunlarla sIlElllîtlegiIdir. Mevcut bulus ayrlEla bu enzimlerin tüm baglanma partnerlerini tartlgüve enzimlere baglanan veya enzimlerle iliski kuran antikor ve antikor parçalarIÜla içerir. 0. form/genes kullanIiEözellikle avantajIIEçünkü aerobik doku ortamlaria büyümeyen br anaerobdur ve insanlara ya da hayvanlara zehirli olan hiçbir bilesen üretmez. Hem 0. form/'genes hem de rekombinant bir konaga alternatif olarak CIoClostridium, Bacillus subtilis, Pseudomonas, LactobaciI-Ii, Bifidobacteria gibi diger oksalat azaltan bakteriler de kullanliâbilir. Bu tür alternatif bakterilerden üretilen oksalat azaltan enzimler veya tüm mikrop hastaya verilebilir. Mevcut bulus bir insan mide baglEkak kanal.. için bir veya daha fazla enzim, veya bakteri ve enzim kombinasyonlarlElEiçeren bilesimlerin uygulanmasüçin bilesimleri içermektedir. Bu tür bilesimler var olan oksalatI miktarÜ/e/veya konsantrasyonunun azaltllûiasIa etkilidir. Bu tür bilesimler oksalatla iliskili rahatslîlllîlarl tedavi edilmesi ve önlenmesinde etkilidir. Mevcut bulusun bir yönü insanI mide baglEak kanaIII içine oksalat bozunduran enzimlerin taniülhaslîiçin bilesimleri içermektedir. Bu tür enzimler bunlarla lellElllIrblmamak üzere oksalat oksidaz, oksalat dekarboksilaz, oksaliI-COA dekarboksilaz ve formII-CoA transferazlIl içermektedir. Bu enzimler teknikte uzmanlar tarafli-man bilinen kaynaklardan elde edilebilir. Örnegin, bitki enzimi oksalat oksidaz (OXO) Arpa tohumlar-an saflastmbilir ve oksalat dekarboksilaz bakteriyel veya fungal kaynaklardan saflastlîllâbilir. Alternatif olarak, oksalat azaltan enzimler rekombinant yollarla türetilebilir. Örnegin, klonlama, salIn ve saflastlîiina gibi rekombinant yollar örnegin 3. sabri/[5 oksalat dekarboksilaz enzimi gibi oksalat azaltan enzimleri elde etmek için kullanllâbilir. Bu tür rekombinant yollar teknikte uzman kisiler taraflEUan bilinmektedir. Örnegin, açlKlanan, genellikle, 5. subU/i's oksalat dekarboksilaz (Yi/rk) geninin klonlanmasüle sail"E Oksalat dekarboksilaz protein için gen (VW/O, çözünebilir bir sitosolik protein olarak aslElElsalgHâma için pET-9a ve pET-14b plazmide (N0vagen,WI), güçlü bakteriyofaj T7 destekleyici kontrolü aItIa klonlanmlStlÜ Salgllâma konaglîproteazlarda ADE3 eksikligi olan ve IacUV5 kontrolü altlEda T7-RNA polimerazI bir kromozom kopyaslüçeren E. call' susu BL 21(DE3) pLysS idi. AyrlEh bu sus, hücre duvarlEllEl peptidoglikan katmanlEa bir baglZlkesen ve T7 RNA polimerazIEéngeIleyen çift fonksiyonlu bir enzm olan T7 Iisozim kodlayan bir pET ile uyumlu plazmid tasß Bu da baslatilmamlgl bazal saIInI daha iyi kontrolünü saglar ve hücreyi verimli bir sekilde dondurarak kurutmak için iç zarElbozacak yöntemlerin (örnegin dondur-çöz veya hafif deterjanlar, vs.) kullanIiIEbaglar. Gen ürününün ekspresyonu izopropiI-ß-D- tiogalaktopiranosid (IPTG) eklenmesiyle baslatüIEl Bu dogrultuda bir yön, bir rekombinant mikrobu ile üretilmis olan oksalat bozundurucu enzimlerin uygulanmasIElçeren yöntemleri içermektedir. Çesitli salIl vektörleri ve konaklar, rekombinant proteinler olarak oksalat azaltan enzimler üretmek için kullanllâbilir ve bu tür yöntemler teknikte uzman olanlar taraflEUan bilinmektedir. Bir diger yön insan veya hayvanlEl mide baglîsak kanallEla oksalatEbozunduran bakterinin temin edilmesi ile oksalat azaltan absorpsiyon için yönemleri içermektedir. Bu tür bakteriler bunlarla sIlEllüMmamak üzere Oxa/obacter formi'genes, Klostridyum, Laktobasili, Bififobakteri, ve PseudomonasEiçerebilmektedir. 0. formr'genes insan dlSkEDörneklerinden ayrllîhlsl ve seçilen her bir koloni boyunca klonlanmlSIlEl Buna orijinal olarak 1996'da Dr. Milton Allison tarafIan Ixion Biyoteknoloji tarafIdan elde edilen HC-1 izolatlîrliahildir. Örnegin, insan susu HC-1 dondurulmus stoklarEl kullanllâbilir. Mevcut bulusun yöntemleri oksalatI varl[gll:l nedeniyle oksalat bozunduran bakterilerin bir ya da daha fazla türü ile bagli-saklar. zenginlestirilmesini, baglEak içeriklerinde oksalatI genel olarak azaltllîhaslü baglEliaktaki oksalat emiliminin azaltIiaslîJkan ve renal slîllârdaki oksalat konsantrasyonunun azaltllBiaslZl ve oksalatI varllgiüiedeniyle vücut üzerindeki zararlßtkilerin azaltllIhasIEîÇermektedir. Buna göre, mevcut bulusun bir yönü oksalat ile ilgili hastallkîar ve/veya sorunlarlEl artmlgl riskine sahip kisilerin baglElaklarIda oksalatüazaltabilecek oksalat azaltan bakteri veya oksalat azaltan enzimleri saglamak için bilesimlerden olusur. Bu tür hastalllZlar ve rahatslîllElara bunlarla sIlEIlEblmamak üzere, hiperoksaluriya, birincil hiperoksaluri, idiopatik kalsiyum oksalat böbrek tasüiastallglüürolitiyaz), enterik hiperoksaluri, volvodinya, oksaloz ile ilgili son asama böbrek hastal[glü kardiyak konduktans rahatslîllElarÇliltihaplEbaglElsak hastallglÇlCrohn hastallglüülseratif kolit, jöjunoileal baypas ameliyatEgeçirmis olan kisileri, yetersiz konsantrasyonlarda oksalat bozundurucu bakteriye sahip kisileri ve diger enterik hastallKl durumlarIEliçermektedir. Antibiyotik tedavi, kemoterapi tedavisi veya baglEtak floraslülegistiren herhangi baska bir tedavi görmüs insanlar mevcut bulustaki bilesimlerle ve yöntemlerle tedavi edilirler. Mevcut bulus degismis baglßak floras. sahip insanlar. oksalat azaltma becerisini geri getirmek için kullanümaktadlB Idrarla atilân oksalat seviyesinin artmasEböbrek taslarII olusmasIEtlestekler, böbrek yaralarlEla katk- bulunur ve hatta böbrek yetersizligi ile bile sonuçlanabilir. Buna göre, bulusun bir yönü böbrek taslarII olusmalelBzaltmak için bilesimlerden olusmaktadlEl BaglEtaklardaki tüm oksalat derisimlerinde bir düsüs ayrlîla oksalat. hücreler ve genel dolasIidan kaldlEllBiasüile de sonuçlanabilir. Daha detayIElolarak, oksalat derisiminin baglfsaklarda düsmesi, oksalat. kandan baglßaklara daha fazla sallElnasMa sonuçlanabilir. Herhangi bir teoriye bagnllîlkalmak istenilmese de, mevcut olarak oksalat. enterik giderilmesi için transepitelyal bir gradyan olduguna inanllßîaktadß Buna göre, mevcut bulusun bir yönü, kolonik oksalat salgllâmaslîlçin oksalatI transepitelyal gradyanEl/oluyla kandan oksalat saIIIllEJEI destekleyerek kandaki oksalat seviyelerini düsürmek için bilesimlerden olusmaktadlü Yöntem, insan veya hayvan baglEaklar- bir insan. oksalat derisimi veya seviyesini azaltacak bir bilesim saglamaktan olusur. Bu tür bir azaltma baglEtaklarda, kanda, serumda, doku slîllâria ve diger vücut slîllârIa bulunan oksalat miktarlljzaltmaktan olusabilir. Bir bilesim, oral yolla alIi için hazlEllanmlgl bir 0. form/genes macunundan olusur. Her bir 0. formigenes macunu partisi için tek bir stok HC-l sisesi genis ölçekli üretim fermantasyonunda büyümeyi baslatmak için bir tojum küldürü olusturmak için kullanllB'iIStE Her bir fermentasyondan bakteri santrifüjle toplanmlgl ve dondurarak kurutmaya karsElkoruma saglayan kriyoprotektif yardIicünaddelerle karlgtmlîhlstß Hücre macunu ayrlîla 107 ila 109 CFU/gram arallgllElja etkili olan ince bir tozla sonuçlanan dondurarak kurutmaya tabi tutulur. Sonuçta ortaya çllîlan toz bakterinin ince baglfsaga güvenli iletimi için enterik kaplEjelatin kapsüllerin içine yerlestirilir. arasÇIyaklasiEI 107 ila yaklasllZllO9 cfu/gram arasÇlyaklaslKl 107 ila yaklasllîllo8 cfu/gram ve aradaki tüm arallKIarda degisen bir veya daha fazla oksalat azaltan bakteri özütünden yaplEhlSlbilesimleri içermektedir. Mevcut bulusun bilesimleri oksalat azaltma etkinligine sahip bir veya daha fazla enzimden olusan bilesimleri da içerir. Bir yöne göre, bulus bir insan veya hayvanI mide baglfsak kanaIII içine enzim bilesiminin etkili bir miktar.. uygulanmasIEiçermektedir. Bir enzim bilesiminin etkili bir miktarÇlbaglEtaklarda oksalatüair miktar azaltma veya insanda bilesim verilmeden önce ölçülen seviyeden oksalat derisimini düsürme becerisine sahiptir. Bu tür bir ölçüm gIElh kaynaklarIdan bag [Baklarda mevcut oksalat ölçümü olabilir veya kan veya idrar gibi bir vücut s-a ölçülen bir seviye olabilir. Mevcut bulus Istem 1'e göre kullanma yönelik bir ya da daha fazla oksalat azaltan enzimi içeren oksalat azaltan bilesimleri içermektedir ve bunlara bu tür bilesimlerin günde 1 ila15 kere, günde üç kereden fazla, günde iki kereden fazla, veya günde bir kere uygulanmasIIZI içermektedir. Bu tür uygulamalar oksalat rahatslîlllîlarll tedavi edilmesi veya önlenmesi için bir ay veya bir yllîlboyunca sürekli olarak her gün uygulanabilmektedir. Örnegin, bir insana oksalatla ilgili rahatslîllKlarElIedavi etmek veya önlemek için birkaç yilîl boyunca günde bir kereden fazla oksalat azaltan bilesim verilebilmektedir. Bu tür bir kullanIi, farmasötiklerin bilinen verilme yollarüaracügllýla gerçeklestirilebilir. Oral veya baglEak yollarEbracEIgllýla kullanIi veya 9. malzemeleriyle birlikte kullanIi mevcut bulus tarafIdan incelenmistir. Bu tanIilamada ve ekli istemlerde de kullanIlgllîgibi, eger içerik açlKça aksini belirtmiyorsa Burada içerilen tüm patentler, patent basvurularEl ve referanslar özellikle kendi bütünlüklerinde referans olarak dahil edilmistir. Asaglkiler bulusu uygulamak için prosedürleri anlatan örneklerdir. Bu örnekler hiçbir sekilde mevcut bulusun kapsamElüzerine sIlEllamalar koymamaktadE Tersine, ekli istemlerin kapsamIan çlElnadan teknikte uzman olanlarlEl kendilerine, buradaki tanilarlîbkuduktan sonra önerebilecekleri, çesitli diger yapllândlülnalar, modifikasyonlar ve bunlar. esdegerlerinin de kapsandlglüçllîça anlasllBiaIIB Örnekler 1, 2, 4, 5, 6 ve 7 bulusun bir parçasljiegildir. Yüksek Riskli Hastalar. Tedavisi Birincil Hiperoksalüri hastalar. tercihen günün iki büyük ögünüyle birlikte 0. form/'genesin dondurularak kurutulmus tozunu içeren enterik kapIEkapsüller yedirilmistir. Her bir boy-2 kapsül en az /gram içeren 137 mg Iiyoûlize toz kitlesi içerir. Yüksek riskli hastalar Için bu ömür boyu devam edecek bir tedavi olabilir. Klinik çallgtnalardaki denekler, tedavi durduruldugunda kolonilesmenin düstügünü göstermistir. Klinik çalismada, tedavi 4 hafta boyunca gerçeklestirilmistir ve iki haftalüZJ bir takip süreci olmustur. 4 haftaliKJ tedavi, kan ve idrar oksalat seviyelerinde, taban seviyelerine göre önemli bir düsüsle sonuçlanmlgtlü Ancak, takip sürecinde Oksalobakter için dlgkßaylilarljizalmglve plazma ve idrar oksalat degerleri artmaya baslamlgtlü DolaylîlEa, azalmlgloksalat kosullarlßaglamak için oksalat azaltan bilesimlerin sürekli olarak yedirilmesinin gerekecegi önerilmistir. Kolonie olup kendilerini sürekli olarak baglEiakIarda sürdürebilecek bakterileri içeren bilesimler oksalat azaltan bilesimlerin daha az verilmesiyle sonuçlanabilir. Enterik kaplElO. form/'genes hücreleri, oksalatla ilgili hastalEElar için yüksek riskteki hasta popülasyonlarEiiarafIan yutulabilir. Bunlara asaglEllakiler dahildir: 1. Örnegin Primer Hiperoksalüri gibi bir genetik bozukluk sebebiyle çok fazla baglEak oksalatEmreten kisiler 2. Enterik bir hastalilg (enterik hiperoksalüri) sebebiyle yüksek idrar oksalatIElürolityaz riskindeki kisiler. Idiyopatik tas hastal[g]I birden çok geçirmis, ürölityaz geçmisi olan kisiler. Son asama renal hastallElsebebiyle yüksek serum oksalat seviyeli kisiler. Vulvar vestibulitisi olan kisiler. 99:55" Hindistan ve Sudi Arabistanda belirli bölgeler ve mevsimlerde bulundugu sekilde yüksek oksalat seviyeli diyeti olan kisiler. Buna ayrlîla oksalatça zengin olan Ebanag gibi gIIarü tercih eden kisiler de dahildir. YukarlElb açiKIanan kisilerden veya hayvanlardan herhangi birine mevcut bulusun bir bilesimi saglanabilir. Örnegin, normal baglBak oksalat seviyelerinden daha yüksek seviyeye sahip bir kisi, günde iki kere, içeriklerini kalI baglEsaga göndermek için tasarlanmlgl yaklasilZl olarak 106 cfu 0. form/'genes içeren bir kapsülle tedavi edilir. Kapsül tercihen yiyecek ile verilir. Düsük Riskli Hastalar Tedavisi: Enterik kapllîkapsüllerde saglananlar gibi enterik korumalElO. form/'genes hücreler ayrlEia oksalatla ilgili hastalllîl için düsük riskli popülasyonlardaki kisiler tarafIan da yutulabilir. Bu hastalarüiksalat azaltan bakteri gibi oksalat azaltan materyallerin bilesimlerini içeren bir veya iki tedaviyle kolonize etmek istenir. Bu hastalar oksalat azaltan materyal olan tedavileri ya destekleyici olarak ya da süt veya yogurt gibi gIIara eklenmis olarak rutin olarak alabilirler. 1. Oral antibiyotik tedavisi veya ishal hastallglljhöbetleri sebebiyle normal oksalat azaltan bakteri popülasyonlarlükaybetmis kisiler. 2. Daha ileri ki hayatta rekabetçi mahrumiyet kosullarlîgerçeklestiginden daha kolay bir sekilde normal koruyucu Oksalobakter popülasyonu yerlessin diye bebekler asllânabilir. Düsük riskli kisiler veya hayvanlar günde iki kere, içeriklerini kaII baglîslsaga göndermek Için tasarlanmlgl en az 107 cfus bir veya daha fazla 0. form/'genes gibi oksalat azaltan organizmalar içeren bir kapsülle tedavi edilir, Kapsül tercihen yiyecek ile verilir. Hiperoksalürinin kontrolü için axa/obacter form/genes'den oksalat azaltan enzimlerin verimliligini degerlendirmek için bir çallglna gerçeklestirilmistir. Kullanllân hayvanlar: Erkek Sprague Dawley SlglanlarüBW 250-300 9 Uygulanan Diyetler: Normal Diyet (N.D.): Harlan Teklad TD 89222; 0.5% Ca, 0.4% P Kullanllân Ilaç: Oxa/obacter farmigeneslizatl (enzimlerin kaynagLIlOxalyl CoA, MgClz ve TPP ile Iiyofilize karmü Ilaç TaslýlEESistem (Kapsüller): Klinik öncesi slgan çallglnalarlîlçin Boy 9 kapsüller (Capsu- Gel) Enterik Kaplama Eudragit L-. Bazal 24 saat idrar toplama. Oxa/obacter for-m/genes için d Eçünalizi--slgnlarda Oxalobacter for-m/'genes kolonisi yok. Deneysel Protokol: A. Uzun-vade ÇallSlnalar: Hayvan Protokolü: Grup I (n=4): Lizatlßksalat diyeti yedirildi. Slghnlara her gün aksam 4:00'da iki kapsül ve gece boyunca oksalat diyeti verilmistir. Diyet gün içinde kaldlülhilgtlüßabah 8:00'dan Grup 11 (n=4): Grup I'de açilZlandlgiüsekilde oksalat diyeti yedirildi (Hiperoksalüri Kontrolleri) Yukarlöbki tedavinin 7. Günü ve 9. Gününde 24 saat idrar örnekleri toplanmlgtü Yukarlöla gösterilen iki süan grubu için ortalama idrar oksalat konsantrasyonu üzerine veriler, Oksalobakter Iizat yedirmenin hiperoksalüri kontrollerine (Grup II) göre Grup 1 slganlarlülda idrar oksalat konsantrasyonunu azalttigilüllîgöstermistir. Enzimler, gastrointestinal yolda uzun bir süre boyunca aktif olamazlar dolayisiyla asaglElh anlat-@EsekHde kist-i vadeli çallginalar gerçeklestirilmistir. Hayvan Protokolü: Grup 1 (n=4): Sabah 8:00'da bir kapsül; iki saat boyunca oksalat diyeti (farelere gece boyu yemek verilmemistir ki bu süreçte iyi yesinler) ve sabah 10:00'da bir kapsül yedirildi. Grup II (n=4): Grup I'de oldugu gibi iki saat boyunca oksalat diyeti. Sonraki bes saatlik süreç boyunca hayvanlardan idrar toplanmE ve oksalat konsantrasyonu için analiz edilmistir. Bu, çallginanl 11, 12 ve 15. günlerinde gerçeklestirilmistir. Bu çallgh'ianl sonuçlarlÇlOksalobakter Iizat yedirmenin oksalattan sonraki 5 saatlik süreçte ve Grup I sir-;anlari verilen ilaçlarI hiperoksalüri kontrol grubuna (Grup II) göre idrar oksalat seviyelerinde önemli bir düsüs sagladiglllîgöstermistir. Bu noktada iki slÇhn grubu araslîitla bir geçis gerçeklestirilmistir. C. Geçis Çallginalarlîl Hayvan Protokolü: yedirilmistir. Grup II: Grup I'deki gibi oksalat diyeti yedirilmeden önce günde iki kere 1 kapsül yedirilmistir. Geçisten sonra 2. ve 5. günlerde yukarlBhki K-i B'de açlElandlglEtsekilde idrar oksalat seviyeleri üzerinde oksalobakter Iizat yedirmenin etkisi için klgb dönem çallglna gerçeklestirilmistir. Geçis çallSlnaIarüOksalobakter Iizat yedirilen önceki hiperoksalüri Grup II slgbnlarII idrar oksalat seviyelerinde bir düsüs göstermistir. ZlÜolarak, Grup 1 slghnlarEllacI verilmemesi üzerine hiperoksalüriye dönmüstür. Farelere Oxa/obacter form/genes Hücreleriyle Tedavi Diyete Oksalobakter formigen hücreler eklendiginde diyet oksalatliîl sonunu degerlendirmek için çallgina gerçeklestirilmistir. Yöntemler: Erkek Wistar slglanlarlüb iki farkIEldeney boyunca ormal kalsiyum (%1), yüksek oksalat (%0,5) diyet, veya düsük kalsiyum (%0,02) yüksek oksalat (%0,5) diyet yedirilmistir. 14C - 0ksalat( çalEtnanI 1. gününde ve tekrar 7. gününde verilmistir. Oxa/obacter form/yenes hücreleri (380 mg/d) 5 ila 11. günler araletla slganlarl içme suyuna verilmistir. Oksalattan 14C'nin sonu, dlgkü idrar ve solunan havada 14C analizine dayalEloIarak ölçülmüstür. Kontrol periyodu (Oksalobakter hücreleri yedirilmeden önce) boyunca slgtinlarl saglad[gl:löz kontrol ve ölçüm 1 ila 4. gün arasIda gerçeklestirilmistir; deney periyodu (bakteriyel hücreler yedirildiginde) boyunca ölçümler 7 ila 11. günler araleda gerçeklestirilmistir. Sonuçlar: oksalattan üretilen karbon dioksit olarak) geri kazanilîhlgtEancak tüm vakalarda sünlara Oksalobakter hücreleri yedirildigi dönemde daha fazla 14C geri kazanlEnlSIlEl(SEK. la) Bu, diyet kalsiyumca düsükken (%0,02) elde edilen sonuçlarla zlflllîlçünkü bu durumda 14C oksalat. %50'sinden fazlasElslganlara Oksalobakter hücreleri yedirildiginde deneysel periyod boyunca havaya solunan karbondioksitte geri kazanilIhlStlEl(SEK. 1b). Bu sonuçlar kontrol periyodunda (Oksalobakter hücreleri yedirilmeden önce) geri kazanlßn çok düsük 14C miktarlarIan (%S'ten az) çarplEDbir sekilde farklIlE DolaylEIEa slglanlara Oxa/obacter form/genes hücreleri yedirmek baglBak yolunda bozunan diyet oksalat miktarIEönemli bir sekilde arttlElnlStlE 2.0ksalobakter hücreleri yedirmek ayri& idrarda atan 14C -oksalat miktarlEJEI da azaltmlgtE Hem kontrol hem de deneysel dönemler için bu dönemler içinde her bir gün olarak 4 günlük toplama degerleri süsüla SEKIL 2a ve 2b'de gösterilmistir. Slglan dlgkllâria geri kazanilân oksalat miktarlarlîlayrlîla (Oksalobakter hücrelerinin yedirildigi) deneysel periyod süresince kontrol periyodunda bulunandan daha azdlEl(SEK 2c). Çogu laboratuvar slglanlîbaglîsak yolunda Oksalobakter tasiaz (kolonilesmis degillerdir). Mevcut bulus, bu oksalat azaltan bakterilerin amaca uygun bir sekilde slglanlara verilmesinin diyet oksalat. büyük bir klglnII bozunmas. sebep oldugunu ve dolaylgýla diyetten gelen oksalatI daha az.. idrarda atIIigiÜgöstermistir. Diyet kalsiyumun oksalat bozunmasIaki etkileri isaretlenmistir. Oksalobakter tarafIan çözülme ve uygunlugun sIlEllEblmaleb sebep olarak kalsiyum oksalatla kompleks olusturur ve slglanlara yüksek kalsiyumlu diyet yedirildiginde bozunan miktar, kalsiyum diyeti azken bozunan miktarlardan çok daha düsüktür. 0. form/genes Yedirmenin Domuzlarda Idrarda Oksalat AtHIJIJzerindeki Etkisi Domuzlar dogal olarak Oksalobakter kolonisine sahiptir. Deney domuzlarIa diyete antibiyotik destekle dekolonizasyona ulasilîhlstE Domuzlara zaten tükettikleri et suyunda Oksalobakter kültürü yedirilmistir. Domuzlara soya fasulyesi/mlîlîl bazlüyem 1300 mg oksalat/kg eklenmis olarak yedirilmistir. Bazal diyet 680 mg oksalat/kg içermektedir. Sonuçlar üç ayrljiomuz için SEKIL 3a-c'de gösterilmistir. Üç domuzda da idrardaki oksalat, Oksalobakter tüketimi boyunca ciddi miktarda azalmlStIEl Bu domuzlarda oksalat salgilâma, üç domuz için de minimum yaklaslE] 6 mg/g kreatinine azalmlgtlü Bu, oksalatslîlformüllü diyet kullanan insanlarda gözlemlenen 8-10 mg/g kreatinin seviyesiyle karsilâstlElâcaktE Bu seviye, diyet yükü göz ard Ebdildiginde insanlarda endojen senteze denk getirilmistir. Bu seviyenin domuzlarda endojen sentezi yansifillgiEl/e baglEtak emiliminin Oksalobakter tedavisi yoluyla önlendigi gözlemlenmektedir. AyrIEla, bu sonuçlar yutulan Oksalobakterin hem eklenen kristalize oksalatEhem de yemekten ortaya çliZlan ve biyolojik olarak mevcut olan oksalatEkaldEabildigini göstermektedir. Bu deneyde her bir domuza sabah ögünüyle 1,0 9 hücre pestili yedirilmistir. 0.6'nI O.D600 tahminini olusturur. 100 L'lik fermantasyon çalmaslîbize ortalama 50-60 gr hücre Elak aglîlllglßaglamaktadliîl Dolaylglýla, 1 gr Elak aglEIlilZlEHiücre yaklasiß 3.5 x 1011 canlljiiücredir. 3,5 x 1011 canIEliiücre dozu yukar- belirtildigi sekilde kg diyet bas. mevcut yaklasilîl2,0 gr oksalat. baglîsakta emilimini önleyebilir (1300 mg eklenmis oksalat+ 680 mg diyette mevcut olan oksalat). Hayvanlar ögün bas. 1 kg diyet tüketmislerdir. DomuzlarI vücut aglElligiEi/aklasllîl 200 Ibs olup domuzlarI sindirim sisteminin insanlarlûkine çok yakI olduguna inanilB1aktadlB Insanlarda günlük ortalama oksalat tüketimi günde üç ögüne bölünen diyek bilesimine baglüblarak yaklasilZl 100-400 mg'dEve dolaylgs-Lla oksalat. diyet emilimini önlemek için 108 ila 1010 canlEliiücre günlük dozu yeterli olur. Yüksek oksalat diyeti yedirilen sünlarda idrarda oksalat atlIlEiilEkia 0. form/'genes desteginin Yüksek oksalatIEIJir diyeti takiben kolonizasyon durumu ve idrarda oksalat seviyeleri üzerine 0. form/'genes gibi oksalat azaltan bir bakterinin dondurulup kurutulmus canlElhücreIerinden olusur. Formül doz bag. yaklasilg 106-107 cfu/ gram içerir. Formül ayrlîb trehaloz ve maltodekstrin gibi dondurarak koruma ajanlarlüla içerir. Yöntemler: Erkek Harlan Sprague Dawley slghnlar rastgele 3 gruba atanmlSIlEl(grup baslElaö hayvan). Grup 1'deki hayvanlar kontrol grubu olup günde iki kez oral sondayla doz seviyesi 10° koloni olusturan birim (CFU) boy 9 enterik kapllîplasebo formülü bu gruba verilmistir. Grup 2 ve 3'teki hayvanlara günde iki kez süsüla 106 ve 107 CFU doz seviyesinde oral sonda yoluyla boy 9 enterik kaplEkapsül formunda Oxa/abacter form/'genes IxOC-3 formülü verilmistir. Kapsül sondayEtakiben üç grup da otoklavlanmlgl musluk suyuyla yllZbnmlsIlEl Ilk allgtlîilna dönemini takiben tüm gruplara gram basi %1 oksalat eklenmis standart diyet verilmistir. Test materyalleri ve plasebo kontrol materyalleri, standartlastlEllIhlgl protokole göre hazlîllanmlgtlü Kullanl öncesi tüm test materyallerinin temsili örnekleri tanlüsaflkjlüle test kapsülellerinin gücünü dogrulamak ve doz döneminde plasebo kontrol materyalinde Oxa/o- bacter farmagene olmad [glülmogrulamak için analiz edilmistir. Diyet, kapsüllerin bos midede doz olarak verildiginden emin olmak için sabah ve aksam sondasIlZI takiben 15 dakika sonra baslayarak günde iki kere 1 saatlik süreyle sIlEIlandlEllInlSIlEl Su ad Iibitum saglanmlgtlü Guda tüketimi günde iki kez kaydedilmistir. 1. Gün (oksalat destekli diyet öncesi) ve bundan sonra haftaIIJZJ olarak dlSkÜ/e 24 saat idrar örnekleri toplanmigtlEl Idrar verileri, doz gruplarüve zamana yönelik ortalama idrar parametrelerindeki farklar için tekrarlEblçüm analizi yoluyla analiz edilmistir. Doz grubu ve zaman arasIa herhangi bir muhtemel iliskiyi degerlendirmek için zaman iliskisi kosullu bir doz grubu da eklenmistir. Sonuçlar: Analizin sonuçlarlÇltüm parametreler için doz gruplarEl/e zaman arasIa istatistiksel olarak önemli (p<0.0001) bir iliski oldugunu, yani idrar parametresi profilinin zaman süresince göre doz gruplarlZlarasIda farkllZloldugunu göstermistir. Bu iliskinin yorumlanmasi yardlcEl olmak için, ortalama idrar parametrelerine göre doz gruplarüraslüba bir fark olup olmadlgillîl belirlemek için her bir parametre için bir zaman noktaleb göre verilerin bir analizi gerçeklestirilmistir. Analiz, düsük doz ve yüksek doz gruplarElçin, taban çizgisinden 7 güne idrar oksalatia bir art& oldugunu (iki grup için de p<0,0001) oldugunu ancak 7 gün ila 28 Ancak plasebo grubu için taban çizgisinden 28 güne bir artlg vardlE(p=0,0010). AyrEla, 21. günde ve 28. günde plasebo Grup I'in ortalama idrar oksalat seviyeleri düsük (Grup II) ve yüksek (Grup III) doz gruplarIlEkinden önemli derecede yüksekti ancak düsük ve yüksek doz arasIa önemli bir degisiklik yoktu. Dolaylgýla, tedavi edilen sElanlarda idrar oksalatIda, plasebo verilen slglanlara göre genel olarak önemli bir idrar oksalatEbzalmasI] gerçeklesmistir. Primer Hiperoksalüri (PH) hastalarIa oral olarak 0. form/-genes verilmesinin idrar oksalat seviyeleri üzerindeki etkileri. Yöntemler: Primer Hiperoksalüri (PH) hastasEloldugu biyopsiyle kaniElhnan dokuz hasta çallsmaya katili1lgtlEl Ilk taban çizgisi degerlendirmeleri allEUithan sonra tüm deneklere 4 hafta boyunca ana yemekleriyle günde iki kere Oksa/obacter form/genes 1 g hücre macunu (2 1010 cfu/gram) verilmistir. Bu süre boyunca tüm hastalar normal ilaçlarIElalmaya devam etmis, normal diyetlerine devam etmeleri istenmis ve sliîIZIaIIiIlarElnormaldeki kadar yüksek tutmalarEistenmistir. Ispanak ve ravent dlglEUa yüksek oksalatlEgIIar yasaklanmamlgtlü 0k50/0bacter kolonizasyonu ve idrar ve oksalat plazma seviyeleri üzerindeki etkisi 5. ve 6. haftalarda ölçülmüstür. Tedavi verimliligi, normal böbrek fonksiyonlu deneklerdeki idrar oksalat atlülîlilýla son-asama renal hastalilZllI(ESRD) deneklerdeki plazma oksalatElaç-an takip edilmistir. Sonuçlar: 1. Tedavi, normal idrar fonskiyonlu deneklerde idrar oksalatII önemli bir sekilde azaldlgllEllZIgöstermistir. Plazma oksalatüdokuz denekten yedisinde önemli derecede azaImISIlB ESRD hastasEiki denekte plazma oksalatIa çarplîübir azalma olup, bir trans- epitelyal gradyana karsßndojen oksalat. baglEaga enterik atIilIçin kanEsaglamIStlEl ortalama veya yüksek oksalat seviyeleri içeren diyetler alan normal, sagliElEgönüIlüler tarafIan iyi tolere edilmistir. 28 gün boyunca günde iki kez 1,0 gr hücre macunu dozu PH hastalarEilarafIan iyi tolere edilmistir. Oksalat Azaltan Enzim Bilesimlerine Yüksek Risk Hastalar Tedavisi Primer hiperoksalüri hastalar. günde iki kez, tercihen günün iki ana yemegiyle birlikte, oksalat dekarboksilaz ve/veya oksalat oksidaz içeren, Iiyofilize oksalat azaltan enzim bilesimi içeren bir veya daha fazla enterik kaplljkapsül yedirilmistir. Enzim bilesiminin etkili bir miktarlZl verilmistir. Örnegin, her boyut 2 kapsül her bir enzimden yaklasllZl5-100 birim içermektedir. Yüksek riskli denekler için bu uzun bir süre boyunca, muhtemelen yasam boyu tedavi olarak, devam edecek bir alIidlB Tedavi durduruldugunda kolonizasyon azalacaktlü Oksalat azaltan enzimlerden olusan oksalat azaltan bilesimlerin enterik kaplükapsülleri, oksalatla ilgili hastalilîl için yüksek risk sahibi hasta popülasyonlar. verilebilir. Bunlara asagßhkiler dahildir: 1.Örnegin Primer Hiperoksalüri gibi bir genetik bozukluk sebebiyle çok fazla baglEtak oksalatEüreten kisiler 2.Enterik bir hastallKJ (enterik hiperoksalüri) sebebiyle yüksek idrar oksalatlEIJrolityaz riskindeki kisiler. 3.Idiyopatik tas hastallgll birden çok geçirmis, ürölityaz geçmisi olan kisiler. 4.Son asama renal hastalilleebebIyle yüksek serum oksalat seviyeli kisiler. .Vulvar vestibulitisi olan kisiler. 6.Hindistan ve Sudi Arabistanda belirli bölgeler ve mevsimlerde bulundugu sekilde yüksek oksalat seviyeli diyeti olan kisiler. Buna ayrlEla oksalatça zengin olan Epanag gibi glölalarlîliercih eden kisiler de dahildir. Yukari açiElanan kisilerden veya hayvanlardan herhangi birine mevcut bulusun bir bilesimi saglanabilir. Örnegin, normalden yüksek endojen seviyelerine sahip bir insan günde iki kez içerigini kalI baglîsaga göndermek için tasarlanmlgl yaklasüZl O.formigenes gibi bir oksalat azaltan bakterinin 107 cfu'su tarafIan saglanana benzer bir enzim etkinligine sahip bir enzim bilesiminin etkili bir miktarIEiçeren bir kapsülle tedavi edilir. Kapsül tercihen yiyecek Oksalat Azaltan Enzim Bilesimlerine Düsük Risk Hastalar Tedavisi Enterik kaplEIkapsüllerde saglananlar gibi oksalat azaltan enzimler oksalat dekarboksilaz ve/veya oksalat oksidazI bir karlglmüldan olusan enterik korumalübksalat azaltan bilesimler ayrlEla oksalatla ilgili hastaIlElar için düsük riske sahip veya oksalatla ilgili rahatslîllKlar için riske sahip popülasyonlardaki kisilere de verilebilir. Tercih edilen tedavi rejiminde enzim bilesiminin etkili bir miktarlîxlerilir. Bilesimlerin bu hastalara, oksalatla ilgili rahatslîIUZlar için risk altIayken daha kisa süre boyunca veya oksalatla ilgili rahatswga katk- bulunan materyallerle birlikte aynlZlanda verilmesi istenir. Bu hastalar oksalat azaltan bilesim olan tedavileri ya destekleyici olarak ya da süt veya yogurt gibi glfllalara eklenmis olarak rutin olarak alabilirler. Bunlara oral antibiyotik tedavisi veya ishal hastallgllîhöbetleri sebebiyle normal oksalat azaltan bakteri popülasyonlarIERaybetmis kisiler veya bebekler dahildir. Düsük riskli kisiler veya hayvanlar günde iki kere, içeriklerini kalI baglElsaga göndermek için tasarlanmlg enzim bilesiminin etkili bir miktarIEik;eren bir kapsülle tedavi edilir. Örnegin, her boyut 2 kapsül her bir enzimden yaklasllîl 5-100 birim içermektedir. Kapsül tercihen yiyecek Burada açilZIanan örnekler ve yapilândlElnanI sadece açilZIaylEßmaçlEbldugunu ve bunarI ekli istemlerin kapsam. dahil edilecegi anlasilüial- Verilen Dozun Yüzdesi w Kontrol: Deneysel: O. formigenes hücreleri p .1 0.10 SEKIL 1A Verilen Dozun Yüzdesi l Kontrol: Deneysel: O. formigenes hücreleri SEKIL IB Verilen Dozun Yüzdesii SEKIL 2A Den evsel: O. formigenes hücreleri Idrarda Oksalat Deneysel: O. formigenes hücreleri OKSALAT m kontrol m deneysel SIÇAN NUMARASI SEKIL 2c SEKIL 3A SEKIL 3B SEKIL 3C Oksalat Atimi (mg/g Cr) Oksalat Atiini (mg/g Cr) Oksalat Atimi (mg/ g Cr) VERILEN OKSALOBAKTER / 104 /\ Günler 125.' VERILEN OKSALOBAKTER 4100 //\` '- 75« \ \ 50 \ / \ O 2 4 8 8 10 !2 14 Günler 40 .. _ VERILEN OKSALOBAKTER 304 i i ` H" \ l `i Günler Tablo-l :0.FORMIG EN ES DESTEGININ (leC-3 FORMULU) YUKSEKQKSALAT DlYETl [LE BESLENEN SICANLARDA IDRAR OKSALAT ATIMI (MIKROMOL/GUN) UZERINDE ETKISI Grup I = %1 oksalat (HOD)+ 0 cfu *1 p<0.000l Grup I ile karsilastirilmca Grup II = HOD + 106 cfu O.formigcnes h p=0.0022 Grup 1 ile karsilastirilinca Gnip III = HOD + 107 cfu O.f0rinigenes C p=0.0041 Gmp I ile karsilastirilinca TR TR TR TR