SU935121A1

SU935121A1 - Method of producing sorbent for affinic chromatography of microbe lipases

Info

Publication number: SU935121A1
Application number: SU792818834A
Authority: SU
Inventors: Валда Улдовна Букбарде; Август Карлович Арен; Индулис Викторович Грузинь; Нина Николаевна Лестровая; Жанна Даниловна Лебедева; Ирина Михайловна Волкова; Евгения Леонгардтовна Рубан
Original assignee: Научно-производственное объединение "Биохимреактив"; Институт микробиологии АН СССР
Priority date: 1979-08-16
Filing date: 1979-08-16
Publication date: 1982-06-15

Description

Изобретение относитс к химической и микробиальной промышленности, в частности к получению биоспецифических гидрофобных сорбентов, примен емы дл выделени липофильных ферментов, в.частности липаз. Липазы наход т применение в пищево и медицинской промышленности, в произ водстве моющих и косметических средств. Известен способ получени сорбента дл аффинной хроматографии мик-робг ных липаз, который заключаетс в присоединении , ли ганда к нерастворимой матрице путем обработки последней BrCN-активированной сефарозы В - алифатическими аминами 1. Недостатками известного способа вл ютс использование полисахаридной матрицы, легко подвергающейс микробиальн )5)му заражению, обладающей низкими гидродинамическими характеристиками , а также недостаточна гидрофобность получаемого сорбента, в св зи с чем степень очистки при использовании данного сорбента составл ет 25 раза. Известен также способ получени сорбента дл аффинной хроматографии микробных липаз, включающий присоединение лиганда к нерастворимой матрице в результате обработки органического материала, например агара хлорангидридами жирных кислот. Реакцию провод т в пиридине или смес-и с ацетоном tl:1) в течение .10-12 ч. Достигаема степень очистки при использовании данного copбет тa раз 12). Недостатком этого способа вл етс то, что он не способен обеспечить получение сорбента с достаточно высокой гидрофобностью, обеспечивающей эффективность аффинной хроматографии липаз.. Кроме того, общим недостатком описанных способов получени сорбентов вл етс то, что используютс оргаиические матрицы, которые имеют сво ственные таким материалам недостатк низкую стабильность, подверженность к микробиальному заражению, неудов . летворительные гидродинамические характеристики вследствие сжимаемости полисахаридных матриц. Это не позвол ет достигать высоких результатов при использовании данных сорбентов. Целью изобретени вл етс повыш ние качества получаемого сорбента, т.е. повышение гидрофобноети, стабильности , улучшение эксплуатацион .ных характеристик сорбента. Указанна цель достигаетс тем, что согласно способу получени сор бента дл аффинной хроматографии ми робных липаз, включающему присоединение лиганда к нерастворимой матрице , в качестве нерастворимой матрицы сорбента используют силохром, который предварительно обрабатывают эпоксидной смолой в количестве 1 30 вес.% с последукмцим ее отверждением 3-51-ным водным раствором поли винилового спирта в присутствии три этиламина при 90-95°С активацией полученного продукта обработкой 5-20%-ным раствором гексамет1 ендии зоцианата при 105 110°С, а присоеди нение лиганда осуществл ют обработкой активированной матрицы алифатическим спиртом с числом угреродных атомов 5 -10 при весовом соотношении матрицы и спирта 1:(3-6) и температуре 100-105 С. Предлагаемый способ обеспечивает получение сорбента высокой гидрофоб ности, созданной как присоединением алкильной группы, так и полимерной пленкой на поверхности смлохрома. Получаемый сорбент обладает также высокой мех.анической прочностью, стабильностью, высокими гидродинамическими характеристиками. После введени алкильных групп первичными насыщенными спиртами в состав сорбента вход т только те ио низирующиес вторичные аминогруппы, которые образовались в результате активации гексаметилендиизоцианатом . Общую гидрофобность полученного данным способом сорбента повышают также гидрофобные участки молекул эпоксидной смолы и отвердител поливинилового спирта, который после Активации гексаметилендиизоциа14 натом содержит полностью гидрофобную цепь. Наличие алкильных групп, а также гидрофобных групп эпоксидной смолы и поливинилового спирта подавл ет электростатическое действие вторичных аминогрупп. Это обеспечивает селективную адсорбцию липаз на данном сорбенте, котора основана на гидрофобных взаимодействи х, и в результате повышает степень очистки фермента. Выбранные параметры стадий синтеза обеспечивают .наиболее оптимальное протекание всех реакций. Способ заключаетс в следую1цем. В колбу загружают силохром (удельна поверхность MVT, средний диаметр пор 1000-1300 Л) и раствор эпоксидной смолы в ацетоне. Систему подключают к вакууму на несколько минут дл удалени воздуха из пор носител . После выпаривани растворител добавл ют 3 5%-ный водный раствор поливинилового спирта в соотношении массы силохрома к массе раствора 1:5-10 и триэтиламин до концентрации его в растворе 1-2%. Смесь перемешивают на вод ной бане при 9095 С в течение 1 ч. Фильтруют и промывают гор чей водой и ацетоном. После высушивани добавл ют раствор гексаметилендиизоцианата в сухом толуоле в соотношении массы силохрома к массе раствора , Перемешивают при 105-1Ю С в течение 1 ч. После фильтровани и высушивани добавл ют соответствующий спирт в соотношении масс твердой фазы и раствора . Перемешивают в течение 1 ч. Фильтруют, промывают и сушат. Использование получаемого предлагаемым способом сорбента позвол т ет достичь степени очистки липаз в 13-23 раза. П р и м е р 1. В колбу загружают 20 г силохрома и раствор 0,2 г эпоксидной смолы в 70 мл ацетона. Систему подключают к вакууму на 1-2 мин дл удалени воздуха из пор силохрома . После eunapfHeeHMP растворител на ротационном испарителе добавл ют 100мл водного раствора поливинилового спирта, 2 мл триэтиламина и нагревают на вод ной бане при 9095С в течение 1 ч. Фильтруют, промывают гор чей водой, ацетоном и сушат . К полученному продукту добев59The invention relates to the chemical and microbial industries, in particular to the preparation of biospecific hydrophobic sorbents, which are used to isolate lipophilic enzymes, in particular lipases. Lipases are used in the food and medical industry, in the production of detergents and cosmetics. A known method for producing a sorbent for affinity chromatography of microbial lipases, which consists in attaching a gand to an insoluble matrix by treating the last BrCN-activated Sepharose B - with aliphatic amines 1. The disadvantages of this method are the use of a polysaccharide matrix that easily undergoes microbial) 5 a) infection with low hydrodynamic characteristics, as well as insufficient hydrophobicity of the resulting sorbent, in connection with which the degree of purification when using this sorbent is 25 times. There is also known a method for producing a sorbent for affinity chromatography of microbial lipases, which involves attaching a ligand to an insoluble matrix as a result of treating organic material, for example, agar with fatty acid chlorides. The reaction is carried out in pyridine or in a mixture with acetone and tl: 1) for .10-12 hours. A degree of purification is achieved when using this combbat 12 times. The disadvantage of this method is that it is not capable of producing a sorbent with a sufficiently high hydrophobicity, which ensures the effectiveness of affinity chromatography of lipases. In addition, a common disadvantage of the described methods for the preparation of sorbents is that organic matrices are used. lack of low stability, susceptibility to microbial infection, unsuccessful. satisfactory hydrodynamic characteristics due to the compressibility of polysaccharide matrices. This does not allow achieving high results when using these sorbents. The aim of the invention is to improve the quality of the sorbent obtained, i.e. increase hydrophobic, stability, improved operational characteristics of the sorbent. This goal is achieved in that according to the method of producing sorbent for affinity chromatography of microbial lipases, including the attachment of a ligand to an insoluble matrix, silochrome is used as an insoluble sorbent matrix, which is pretreated with epoxy resin in an amount of 1-30 wt.% And followed by its hardening 3 -51% aqueous solution of polyvinyl alcohol in the presence of three ethylamine at 90-95 ° С by activating the obtained product by treating with a 5–20% solution of hexametanelendium zocyanate at 105–110 ° С, and the ligand is combined by treating the activated matrix with an aliphatic alcohol with the number of carbonaceous atoms of 5 -10 with a weight ratio of matrix and alcohol 1: (3-6) and a temperature of 100-105 C. The proposed method provides a sorbent of high hydrophobicity, created as an addition of alkyl groups, and polymer film on the surface of the smear. The resulting sorbent also has high mechanical strength, stability, high hydrodynamic characteristics. After the introduction of alkyl groups by primary saturated alcohols, the sorbent contains only ionized secondary amino groups that are formed as a result of the activation of hexamethylenediisocyanate. The overall hydrophobicity of the sorbent obtained by this method also increases the hydrophobic portions of epoxy resin and hardener polyvinyl alcohol, which, after activation of hexamethylenediisocyanat14, contains completely hydrophobic chain. The presence of alkyl groups as well as hydrophobic groups of epoxy resin and polyvinyl alcohol suppresses the electrostatic action of secondary amino groups. This provides selective adsorption of lipases on this sorbent, which is based on hydrophobic interactions, and as a result increases the degree of purification of the enzyme. The selected parameters of the synthesis stages provide the most optimal course of all reactions. The method is as follows. Silochrome (MVT specific surface area, average pore diameter 1000-1300 L) and a solution of epoxy resin in acetone are loaded into the flask. The system is connected to a vacuum for several minutes to remove air from the pores of the carrier. After evaporation of the solvent, a 3% aqueous solution of polyvinyl alcohol is added in a mass ratio of silochrome to a mass of 1: 5-10 and triethylamine to a concentration of 1-2% in solution. The mixture was stirred in a water bath at 9095 ° C for 1 hour. It was filtered and washed with hot water and acetone. After drying, a solution of hexamethylene diisocyanate in dry toluene in the mass ratio of silochrome to the mass of solution is added. The mixture is stirred at 105-1 ° C for 1 hour. After filtering and drying, the corresponding alcohol is added in the mass ratio of the solid phase and solution. Stir for 1 hour. Filter, wash and dry. The use of the sorbent produced by the proposed method makes it possible to achieve a degree of purification of lipases by 13–23 times. PRI me R 1. A flask is charged with 20 g of silochrome and a solution of 0.2 g of epoxy resin in 70 ml of acetone. The system is connected to a vacuum for 1-2 minutes to remove air from the pores of the silochrome. After eunapfHeeHMP solvent on a rotary evaporator, add 100 ml of an aqueous solution of polyvinyl alcohol, 2 ml of triethylamine and heat on a water bath at 9095 ° C for 1 hour. Filter, rinse with hot water, acetone and dry. To the received product dob59

л ют 80 мл 5 -ного раствора гексаметилендиизоцианата в сухом толуоле и перемешивают при в течение 1 ч Фильтруют, промывают на фильтре толуолом и сушат в вакуум-сушильном шкафу. Содержание изоцианатных групп 0,06 мг-экв/г силохрома. 80 ml of a 5% solution of hexamethylene diisocyanate in dry toluene are added and the mixture is stirred for 1 hour. It is filtered, washed on the filter with toluene, and dried in a vacuum oven. The content of isocyanate groups is 0.06 mg-eq / g of silochrome.

Активированную основу загружают в колбу с 100 мл амилового спирта и перемешивают при в течение 1 ч Фильтруют, промывают этанолом и сушат . Содержание амиловых групп около О, 05 мг-экв на 1 г сухого сорбента.The activated base is loaded into a flask with 100 ml of amyl alcohol and stirred at for 1 h. It is filtered, washed with ethanol and dried. The content of amyl groups is about 0.05 mg-eq per 1 g of dry sorbent.

Так как алкильные группы не поддаютс пр мому определению, их содержание определ етс из расчета, что степень превращени изоцианатных групп в .алкильные группы составл ет около 801.Since the alkyl groups cannot be directly determined, their content is determined on the basis that the degree of conversion of the isocyanate groups to alkyl groups is about 801.

Пример2. В колбу загружают , 20 г силохрома и раствор г эпоксидной смолы в 70 мл ацетона. Систему подключают к вакууму на 1-2 мин дл удалени воздуха из пор силохро;ма . После выпаривани растворител добавл ют 200 мл 5%ного водного раствора поливинилового спирта, 2 мл триэтиламина и нагревают на вод ной бане при 90-95С в течение 1 ч. Фильруют , промувают гор чей водой, аценом и сушат. Example2. A flask is charged with 20 g of silochrome and a solution of g of epoxy resin in 70 ml of acetone. The system is connected to a vacuum for 1-2 minutes to remove air from the pores of the silochrome; ma. After evaporation of the solvent, 200 ml of a 5% aqueous solution of polyvinyl alcohol, 2 ml of triethylamine are added and heated on a bath at 90-95 ° C for 1 hour. Filtered, rinsed with hot water, acene and dried.

К полученному продукту добавл ют 120 мл 20 -ного раствора гексаметилендиизоцианата в сухом толуоле м перемешивают при 105°€ в течение 1 ч Фильтруют, промывают на фильтре толуолом и сушат в вакуум-сушильном шкафу. Содержание изоцианатных групп 0,16 мг- экв/г.120 ml of a 20% solution of hexamethylene diisocyanate in dry toluene is added to the resulting product and the mixture is stirred at 105 ° C for 1 hour. It is filtered, washed on the filter with toluene and dried in a vacuum oven. The content of isocyanate groups is 0.16 mg-eq / g.

Активированную основу загружают в колбу с 120 мл октилового спирта и перемешивают при в течениеThe activated base is loaded into a flask with 120 ml of octyl alcohol and stirred for

1ч. Фильтруют, гцэомывают этанолом и сушат. Содержание октиловых групп около 0,13 мг-экв/г сорбента. 1h It is filtered, ethanol is added and dried. The content of octyl groups is about 0.13 mg-eq / g of sorbent.

Примерз. В колбу загружают 20 г силохрома и раствор 6 г эпок Сидней смолы в 70 мл ацетона. Систему подключают к вакууму на 1-2 мин дл удалени воздуха из пор смлохрома . После выпаривани растворител добавл ют 200 мл 3 -ного водного раствора поливинилового спирта,Froze A flask is charged with 20 g of silochrome and a solution of 6 g of Epoch Sydney resin in 70 ml of acetone. The system is connected to a vacuum for 1-2 minutes to remove air from the pores of the chlorine. After evaporation of the solvent, 200 ml of a 3% aqueous solution of polyvinyl alcohol are added,

2мл тризтиламина и нагревают на зод ной бане при 90-95°С в течение 1 ч. Фильтруют, промывают гбр чей водой , ацетоном и сушат.2 ml of triztilamine and heated on an ice bath at 90-95 ° C for 1 hour. Filtered, washed with water, acetone, and dried.

К полученному продукту добавл ют 120 мл 10 -ного раствора гексамети16120 ml of a 10% hexameti solution are added to the resulting product.

лендииэоцианата в сухом толуоле и перемешивают при в течение 1ч. Фильтруют, промывают на фильтре толуолом и сушат в вакуум-суиильном шкафу. Содержание изоцианатных групп Q,2k мг-зкв/г.land of thiouleate in dry toluene and stirred at for 1 h. Filtered, washed on the filter with toluene and dried in a vacuum cupboard. The content of isocyanate groups Q, 2k mg-cqv / g.

Активированную основу загружают в колбу с 60 МП децилового спирта и перемешивают при в течение 1 ч, фильтруют, промывают этанолом и сушат. Содержание дециловых групп около 0,2 нг-экв/г сорбента.The activated base is loaded into a flask with 60 MP of decyl alcohol and stirred at 1 h, filtered, washed with ethanol, and dried. The content of decyl groups is about 0.2 ng-eq / g of sorbent.

Пример. 2вг активированного силохрома по примеру 2, содержащего 0,1б мг-зкв/г изоцианатных групп, загружают в колбу с 120 мл амилового спирта и перемешивают при в течение 1 ч. Фильтруют, промывают этанолом и сушат. Содержание амиловых групп около 0,13 мг-экв/г сорбента.Example. 2vg of activated silochrome according to Example 2, containing 0.1b mg-SQV / g of isocyanate groups, are loaded into a flask with 120 ml of amyl alcohol and stirred for 1 hour. Filter, wash with ethanol and dry. The content of amyl groups is about 0.13 mg-eq / g of sorbent.

Пример 5« 20 г активированного силохромэ по примеру 2, содержащего 0,16 мг-экв/г изоцианатных групп, загружают в колбу с 80 мл децилового спирта и перемесмвают при 105-110°С в течение 1 ч. Фильтруют, промывают этанолом и сушат. Содержание дециловых групп около 0,13 мг-экв/г сорбента .Example 5 “20 g of activated silochrome according to example 2, containing 0.16 mEq / g of isocyanate groups, are loaded into a flask with 80 ml of decyl alcohol and stirred at 105–110 ° C for 1 hour. Filtered, washed with ethanol and dried. . The content of decyl groups is about 0.13 mg-eq / g of sorbent.

Результаты присоединени алкильных групп к матрице приведете в таблице.The results of the addition of alkyl groups to the matrix will be listed in the table.

Пример 6. К 800 мг сорбента с октиловы « группами добавл ют 6 мг ферментного раствора липазы (725 ед.) в 0,01 И фосфатном буфере. Смесь оставл ют лри на 2 ч, периодически встр хивал, после чего частицы носител с адсорбированной липазой ото(.1льтровывают, помещают в колонку (10 в диаметре ) и промывают буфером до исчезновени белка в Промывных водах. В фильтрате определ ют липолитическую активность по методу Ота и Ямада, а также белок по методу Поури в модификации Хартри . Количество адсорбированных белка и активности определ ют по разности содермкани белка и активности в исходном материале и в фильтрате, полученном после отделени частиц носител с адсорбированным белком. Адсорбированный белок элюируют 15 мл 50 fe-oro раствора ; тиленгли: ол и 15 мл 0,5%-ного раствора дезоксихолата натри оЭлюирование тритоном х-100 провод т в услови х непрерывного градиента концентрации (0,01-0,2)Example 6. To 800 mg of sorbent with octyl groups add 6 mg of enzyme solution of lipase (725 units) in 0.01 And phosphate buffer. The mixture is left to stand for 2 hours, shaken periodically, after which the carrier particles with adsorbed lipase are otto () dried, placed in a column (10 in diameter) and washed with buffer until the protein disappears in the wash water. In the filtrate, the lipolytic activity is determined by the method Ota and Yamada, as well as Pouri protein in Hartree modification. The amount of adsorbed protein and activity is determined by the difference between the amount of protein and activity in the starting material and in the filtrate obtained after separating the carrier particles from 15 ml of a 50 fe-oro solution; Tilengli: ol and 15 ml of a 0.5% aqueous solution of sodium deoxycholate, the elution with Triton x-100 is carried out under conditions of a continuous concentration gradient (0.01-0.2 )

77

150 мл. Получают увеличение удельной активности (степень очистки) в 23 pdsa в наиболее активных фракци х , выход активности составл ет 525. . 150 ml. An increase in specific activity (purity) of 23 pdsa in the most active fractions is obtained, the yield of activity is 525..

Пример. К100 мг сорбента с дециловыми группами добавл ют 2 мл ферментного раствора (96 ед.) в 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,6). Услови адсорбции и десорбций такие же, как в примере . Выход фермента 81% от активности исходного матрриала , увеличение удел-ьной активности в 20 раз в наиболее активных фракци х.Example. K100 mg of sorbent with decyl groups was added 2 ml of enzyme solution (96 units) in 0.01 M phosphate buffer (pH 7.6). The conditions for adsorption and desorption are the same as in the example. The output of the enzyme is 81% of the activity of the starting material, an increase in the specific activity by a factor of 20 in the most active fractions.

1818

Технико-экономическа эффективность предлагаемого способа состоит в улучшении качества получаемых сорбентов - повышении гидрофобности, стабильности и других характеристик, что позвол ет достигнуть высоких степеней очистки липаз. Липазы высокой степени очистки наход т широкое применение в народном хоз йстве: медицине, в производстве моющих и косметических средств, в пищевой промышленности.The technical and economic efficiency of the proposed method consists in improving the quality of the sorbents obtained — increasing the hydrophobicity, stability, and other characteristics, which allows achieving high degrees of purification of lipases. High purity lipases are widely used in the national household: medicine, in the production of detergents and cosmetics, in the food industry.

Предполагаемый экономический эффект от внедрени способа составит около 100 тыс.руб. формула изобретени Способ получени сорбента дл аффин ной хроматографии микробных липаз, включающий присоединение лиганда к нерастворимой матрице, отличающ и и с тем, что, с целью повышени гидрофобности, стабильности, улучшени эксплуатационных характеристик сорбента, в качестве нерастворимой матрицы сорбента используют силохром, который предварительно обрабатывают эпоксидной смолой в количестве 130 весД с последующим отверждением ее водным раствором поливинилового спирта в присутствии триэтиламина при 90-95С и активацией 93 12 полученного продукта обработкой 520%-ным раствором гсксаметилендиизоцианата при 105-110 0, а присоединение лиганда осуществл ют обработкой активированной матрицы ал)1фатическим спиртом с числом углеродных атомов 5-10 при весовом соотношении матрицы и спирта 1:(3-6j и температуре 100-105°С. Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1.Патент США h 013512, кл.195-66, 1977. 2.Патент США t 3901763, кл. 195-66, :1975.The estimated economic effect from the implementation of the method will be about 100 thousand rubles. Claims The method of obtaining a sorbent for affinity chromatography of microbial lipases, including the attachment of a ligand to an insoluble matrix, is also distinguished by the use of silochrom, which is pretreated, to increase the hydrophobicity, stability, and performance of the sorbent. 130 pts of epoxy resin, followed by curing it with an aqueous solution of polyvinyl alcohol in the presence of triethylamine at 90-95 ° C and activation of 93 12 p of the product obtained by treatment with a 520% solution of gscamethylene diisocyanate at 105-110 0, and the ligand is added by treating the activated matrix al) with 1 phatic alcohol with 5-10 carbon atoms at a weight ratio of matrix and alcohol 1: (3-6 j and temperature 100- 105 ° C. Sources of information taken into account in the examination 1. US patent h 013512, cl. 195-66, 1977. 2. US patent t 3901763, class 195-66,: 1975.

Claims

Claim

A method of producing a sorbent for affinity chromatography of microbial lipases, including attaching a ligand to an insoluble matrix, is characterized in that, in order to increase hydrophobicity, stability, and improve the operational characteristics of the sorbent, a silochrome is used as the insoluble matrix of the sorbent, which is previously treated with epoxy resin in an amount of 130 wtD followed by its curing with 3-5% aqueous solution of polyvinyl alcohol in the presence of triethylamine at 90-95 ° C activation

1 12 of the obtained product by treatment with a 520% solution of gsxamethylene diisocyanate at 105-1 ° C, and the ligand is attached by treating the activated matrix with aliphatic alcohol with the number of carbon atoms of 5th at a weight ratio of matrix to alcohol of 1: (3-6) and temperature 100-105 ° C.