SU810811A1

SU810811A1 - Method of culturing hepatite a virus

Info

Publication number: SU810811A1
Application number: SU792727083A
Authority: SU
Inventors: Михаил Суренович Балаян; Александр Георгиевич Анджапаридзе; Елена Алексеевна Тольская
Original assignee: Институт Полиомиелита И Вирусныхэнцефалитов Amh Cccp
Priority date: 1979-02-19
Filing date: 1979-02-19
Publication date: 1981-03-07

Description

чсние 30 мин при 10000 об/мин и осадок ресуспендируют в дистиллированной воде, содержащей антибиотик канамицин в концентрации 0,5-1,0 мг/мл. Объем дистиллированной воды составл ет 1/5 от объема исходной вируссодержащей жидкости. Полученный в результате такой ироцедуры материал иснользуют дл заражени клеток . Параллельно готов т очищенный и концентрированный экстракт из фекалий, не содержащих вируе геиатита А.Chsnye 30 min at 10,000 rpm and the sediment resuspended in distilled water containing the antibiotic kanamycin at a concentration of 0.5-1.0 mg / ml. The volume of distilled water is 1/5 of the volume of the original vaccinated liquid. The material resulting from this procedure is used to infect cells. At the same time, a purified and concentrated extract from feces not containing the virus of geiatite A is prepared.

Культуры клеток Hela и ПЭО выращивают в среде Игла без сыворотки в иробирках (1,5x15 см). Заражение культур производ т через 18-24 ч после пересева клеток; удал ют культуральную жидкость и добавл ют концентрированный и очищенный фекальный экстракт, содержащий вирус гепатита А, из расчета 0,1 мл экстракта на 250000-500000 клеток. После контакта в течение 1 ч при 37°С в каждую пробирку с культурой внос т по 1,0-2,0мл среды Р1гла, содержащей трипсин в концентрации 15-60 мкг/мл. Пробирочные культуры инкубирзют в течение 18-48 ч при 37°С. Последующие пассажи также провод т в пробирочных культурах со средой Игла, содержащей трипсин в тех же концентраци х, но с добавлением экстракта «нормальных (не содержащих вирус гепатита А) фекалий в конечной концентрации 3,3-5,0%.Cultures of Hela cells and PEO are grown in Eagle's medium without serum in germs (1.5x15 cm). Cultures are infected 18-24 hours after cell transfer; the culture fluid is removed and a concentrated and purified fecal extract containing the hepatitis A virus is added, at a rate of 0.1 ml of extract per 250,000-500,000 cells. After contact for 1 hour at 37 ° C, 1.0-2.0 ml of P1gl medium containing trypsin at a concentration of 15-60 µg / ml is added to each culture tube. Test-tube cultures are incubated for 18-48 hours at 37 ° C. Subsequent passages are also carried out in test-tube cultures with Eagle's medium containing trypsin in the same concentrations, but with the addition of an extract of "normal (not containing hepatitis A virus) feces at a final concentration of 3.3-5.0%.

Дл обнаружени вируса гепатита А используют метод иммуноэлектроиной микроскопии (ИЭМ). Стандартную сыворотку , в которой было установлено наличие антител к вирусу гепатита А, развод т физиологическим раствором 1:40-1:1000 (в зависимости от ее титра). После этого 0,2 мл разведенной сыворотки смещиваюг с 0,8 мл вирусеодержащей жидкости (фекальный экстракт, культуральна жидкость , гомогенат клеток и т. п.). Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и затем ночь при 4С. Утром смесь центрифугируют в течение 2 ч при 15 000 об/мин, оеадок ресуспен.аируют в нескольких капл х дистиллированной воды и смещивают с равным объемом 2% раствора фоефорно-вольфрамовой киелоты (рН 6,8), вз той в качестве контрастирующего вещества. Через 30 с смесь нанос т на специальные сеточки дл электронной микроскопии. Объекты проематривают в электронном микроскопе при увеличении 50000 -100000.Immune Electroscopy (IEM) is used to detect hepatitis A virus. Standard serum, in which the presence of antibodies to the hepatitis A virus has been established, is diluted with a saline solution of 1: 40-1: 1000 (depending on its titer). After that, 0.2 ml of diluted serum is shifted from 0.8 ml of virus-containing fluid (fecal extract, culture fluid, cell homogenate, etc.). The mixture is kept at room temperature for 1 hour and then overnight at 4 ° C. In the morning, the mixture is centrifuged for 2 hours at 15,000 rpm, the pellets are resuspended in a few drops of distilled water and shifted with an equal volume of a 2% solution of phytophoric-tungsten kielota (pH 6.8), taken as a contrast agent. After 30 seconds, the mixture is applied to special nets for electron microscopy. Objects are screened with an electron microscope at a magnification of 50,000-100,000.

При просмотре в электронном микроскопе препаратов культуральной жидкости и гомогеиата клеток из заражеиных внруссодержащим материалом культур Mela и ПЭО обнаруживают скоплени характерных частиц вируса гепатита А диаметром 27 им, покрытых венчиком антител.When viewed in an electron microscope, preparations of the culture fluid and homogenate cells from cultures of Mela and PEO cultures infected with other materials containing cultures, accumulations of characteristic particles of hepatitis A virus with a diameter of 27 to them, covered with a rim of antibodies, are detected.

При просмотре аиалогичных ирепаратов из незараженных культур или культур, в When viewing a similar products from non-infected cultures or cultures,

которые вносили материал, не содержащий вирус гепатита А, скоплени вирусных частиц не наблюдают.which contributed material that does not contain the hepatitis A virus, no accumulation of virus particles is observed.

Уровень продукции вируса гепатита А в культурах клеток ориентировочно оценивают путем сопоставлени количества образовавшихс частиц этого вируса с количеетвом чаетиц полиовируса 1 типа (щтамм Махони), выращенного в идентичных услови х. Наиример: если в 1,0 мл жидкости содержитс 5 10 иифекцчонных (бл шкообразующих) единиц вируса Махонн , то это количество соответствует 5 10 вирусных частиц, обнаруживаемых электронномикроскопически, оно же соответствует 6000-8000 частиц, аггрегированиых антителами и вы вл емых методом ИЭМ в п ти чейках сетки. При исходной концентрации вируса Махони 5 Ю, 5 10 и т. д. инфекционных единиц в 1,0 мл оно составл ет соответственно 5 10, 5 10 5 10° и т. д. Физических вирусных частиц и 4 000-6 000, 2 000-3000 , 1000-2000 аггрегированных антителами вирусных частиц в п ти чейках сетки при иммуноэлектронной микроскопии. Обратный пересчет позвол ет на основании известного количеетва вирусиых частиц, определ емых методом ИЭМ, ориентировочно судить о концентрации вирусных частиц в исходном препарате.The level of production of hepatitis A virus in cell cultures is estimated by comparing the number of particles of this virus with the number of poliovirus type 1 patches (Mahoni germ) grown under identical conditions. Naimer: if in 1.0 ml of liquid there are 5 10 infectious (forming) units of the Mahonn virus, this number corresponds to 5 10 viral particles detected electron microscopically, it also corresponds to 6000-8000 particles, aggregated by antibodies and detected by the IEM method five grid cells. With an initial concentration of the Mahoney virus of 5 U, 5 10, etc., of infectious units in 1.0 ml, it is respectively 5 10, 5 10 5 10 °, etc. Physical virus particles and 4,000–6,000, 2 000-3000, 1000-2000 viral particles aggregated by antibodies in pixels of the grid under immunoelectron microscopy. The reverse recalculation allows, based on the known number of viral particles, determined by the IEM method, to roughly estimate the concentration of viral particles in the original preparation.

Дл такой оценки продукции вируса гепатита А в клеточных культурах этот ви рус, также как полиовирус 1 типа Махони, выращивают в культурах Ие1а. Далее определ ют количество образовавшихс вирусных частиц, вы вл емых методом ИЭМ в чейках сетки. Вирус Махони до исследовани в ИЭМ титруют в культуре ткани и определ ют количество физических частиц , соответствующих каждому данному разведению 10°, , 10, 10. После этого каждое разведение исследуют на содержание вируеных частиц методом ИЭМ. Сопоетавл ют результаты ИЭМ, иолученные с вирусом гепатита А и с вирусом Махони , поеле чего выбирают то разведение вируеа Махони, в котором количество частиц этого вируса нанболее близко к количеству частиц вируса гепатита А.For such an assessment of the production of hepatitis A virus in cell cultures, this virus, as well as Mahoney type 1 poliovirus, is grown in Ilata cultures. Next, the number of formed virus particles detected by the IEM method in the grid cells is determined. Before the study in the IEM, the Mahoney virus was titrated in a tissue culture and the number of physical particles corresponding to each given dilution was determined as 10 °, 10, 10. After that, each dilution was examined for the content of viral particles using the IEM method. The results of IEM are similar to those obtained with the hepatitis A virus and with the Mahoni virus, and the dilution of the Mahoni virus in which the number of particles of this virus is closer to the number of particles of the hepatitis A virus is chosen.

При выращивании вируса гепатита А в клеточных культурах содержание частиц этого вируса в культуральиых жидкост х через 12-20 ч носле заражени , установленное с помощью описанного выше способа , составл ет от 1 10 до 5- Ш вирусных частиц в 1,0 мл. Предлагаемый способ позвол ет повысить выход вируса.When cultivating hepatitis A virus in cell cultures, the content of particles of this virus in culture liquids after 12–20 hours after infection, established using the method described above, ranges from 10 to 5% virus particles in 1.0 ml. The proposed method allows to increase the yield of the virus.

Фор м у л а и 3 о б р е т е и и Form m u l a and 3 o b e e e u u

Способ ползчени вируса гепатита А путем экстракпии фекалий больных гепатитом А, отличающийс тем, что, с нслью повыщеии выхода вируеа, получен5 ным фекальным экстрактом заражают предварительно обработанные трипсином в концентрации 15-60 мкг/мл культуры клеток перевиваемых клеточных линий Hela и ПЭО, культивируют в среде с тем же5 содерл-ганием трипсина, a затем пассируют в той же среде с дополнительным введеиием фекального экстракта, не содержаще 6 го вирус гепатита А, в конечной концентрации 3,3-5,0%. Источники информации, прин тые во внимание нри экспертизе 1. S. М. Teinstone and at al. «Defection by immune electron microscopy of a virus- like antigen associated with acute illness, Science, vol. 182, p. 1026-1028, И)73.The method of creeping hepatitis A virus by extracting feces of patients with hepatitis A, characterized in that, with an increase in virus yield, the resulting fecal extract is infected with pretreated with trypsin at a concentration of 15-60 µg / ml of Hela and PEO cell lines cultured in cultured cells medium with the same 5 content of trypsin, and then pass in the same medium with additional administration of the fecal extract, not containing 6th hepatitis A virus, in a final concentration of 3.3-5.0%. Sources of information taken into account at the examination 1. S. M. Teinstone and at al. "Defects by microscopy of a virus, like antigen associated with illness, Science, vol. 182, p. 1026-1028, I) 73.

Claims

A method of producing hepatitis A virus by extracting feces of patients with hepatitis A, characterized in that, in order to increase the yield of the virus, the obtained fecal extract is infected with pretreated trypsin at a concentration of 15-60 μg / ml cell culture of transplantable Hela and PEO cell lines, cultivated in medium with the same trypsin content and then passaged in the same medium with the addition of a fecal extract containing no hepatitis A virus at a final concentration of 3.3-5.0%.