SU732278A1

SU732278A1 - Способ модификации полисахаридов

Info

Publication number: SU732278A1
Application number: SU772565936A
Authority: SU
Inventors: Дануте Повило Янкаускайте; Аста Антано Дикчювене; Альгимантас-Антанас Бронислово Паулюконис; Антанас-Скайстутис Антано Глемжа
Original assignee: Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии
Priority date: 1977-12-28
Filing date: 1977-12-28
Publication date: 1980-05-05

Description

Изобретение относитс к химии .природных соединений, точнее к способам получени носителей (сорбентов дл иммобилизации, а также дл хроматографическсй очистки белков, в особенности ферментов. Известен способ модификации амин целлюлозы серюуглеродом и изобутилхлорфермиатом , позвол ющий получить сорбенты дл ковалентного св зывани ферментов 1. Полученный сорбент может взаимодействовать с водой, в частности с атмосферной влажностью, что отрицательно вли ет на его устойчивость. Использование его как сорбента дл св зывани ферментов возможно тольк в водных растворах, так как фермент не только не раствор ютс в органических растворител х; но и инактиви руютс ими.Поэтому сорбент в процес се его применени взаимодействует не To.jibKO с ферментом, но и с раст ворителем - водой. Наиболее близким к предлагаемому вл етс способ модификации целлюло зы путем ее обработки гексаметилендиизоцйанатом с целью получени производного цел.люлозы, содержаиего .свободные изоцианатные группы, пригодного дл использовани в качестве сорбента иммунобелков 2. Однако применение таких соединений дл иммобилизации белков (в том числе ферментов) осложнено тем, что из-за реагировани изоцианатов со всеми реакционноспособными группами белков легко происходит потер каталитической активности ферментов, вследствие модификации активного центра или других участков, а также тем, что значительное количество содержащихс изоцианатных групп тер етс в побочной реакции гидролиза, поэтому сорбционна емкость носителей небольша . Цель изобретени - разработка способа получени , модифицированных полисахаридов, пригодных .дл иммобилизации и хроматографической очистки белков, в том числе ферментов , облгщающих химической стабильностью , повышенной сорбционной емкостью , и тем самым расширение арсенала носителей (сорбентов) . Указанна цель достигаетс тем, что модификаци полисахаридов осуществл етс их обработкой диизоцианатами с последующей дополнительной обработкой бифункциональными или

Монофункциональными соединени ми в стехиометрическсйч избытке.

В качестве бифункциональных сое- динений используют алифатические диамины и дикарбоновые кислоты С«- С а в качестве монофункциональных соединений используют алифатические ,

спирты Cj- CQ,

В качестве нерастворимого полисахарида прнмен)т целлюлозу, агароау , декст ран, хитин, крахмал и их производные в виде порошков или гранул. Реакци с диизоцианатом проводитс в безводных органических растворител х , не содержащих подвижных атомов водорода,, например, в д и океане , ацетон е,хл о ро(|юрме и др. Реакцию катализируют третичные основани и кислоты, наиболее подход щим вл етс триэтиламин. Предпочтительны умеренные температуры - 20-50 С,

Промежуточное производное после-удалени непрореагировавшего диизоцианата промыванием органическим растворителем,Подвергают взаимодействию с бифункциональньлм или монофункциональным соединением, содержащим подвижные атокжа водорода, структура которого: выбираетс в зависимости от назначени носител . Реакци проводитс в присутствии органического растворител и катализатора, как указано дл первой стадии, или без растворител , примен избыток реагента.

В зависимости от длины алифатической цепочки Я получают носители с различной отдаленностью функциональных групп (-NHj, -СООН и др.) от полисахаридной матрицы.

Пример 1. Получение носител , содержащего аминогруппы. К суспензии 3,0 г порошковой ц.еллюлозы в 30 мл безводного диоксана прибавл ют 1 мл 2,4-толуолдиизоцианата, 5 капель триэтиламина и смесь медленно перемешивают б .4 при температуре 40-5О С. Затем целлюлозу отфильтровывают, промывают на фильтре 5-6 порци ми диоксана по 20 мл. Полученное промежуточное производное по данным элементарного анализа содержит 4,7%N. В ИКспектре имеетс полоса поглощени при 2270 , соответствующа свободным изоцианатным группам. Производное суспендируют в растворе 0,2 г гексаметилендиамина в 30 мл диоксана , содержащего 5 капель триэтиламина . Смесь нагревают 4, ч при 6080 с , после чего носитель отфильтровывают , промывают несколькими порци ми диоксана,смеси диоксан-вода 1:1 и водой. По данным элементарного анализа продукт содержит 6,5% N. Концентрацию вводимых аминогрупп можно варьировать путем изменени исходного соотношени полисахариддиизоцианат , а также изменением интенсивности условий реакции. Полученный носитель, содержащий

аминогруппы, активируют известным глутаральдегидным методом и исполь ,зуют дл иммобилизации ферментов.

Результаты определени активности нгданобилизованных препаратов приведены в таблице. Дл сравнени там же приведены данные, полученные при иммобилизации тех же ферментов йа широк он спал ьзуемс носителе макропористом аминосилохроме С-80 проведенной в аналогичных услови х и с теь же исходным соотношением фермент:носитель.

По примеру 1 242 6220 6,1

Аминосилохром С-80 152 2270 1,4

П р и м е р 2, Получение носител , содержащего карбоксильные группы. Носитель получают как в примере 1,

только вместо раствора гексаметилендиамина примен ют раствор 2,0 г

себациновой кислоты в 30 мл диокса- . на. По данным элементарного анализа продукт содержит 4,5% N. Дл иммобилизации ферментов синтезированный

носитель активируют водорастворимым карбодиимидом известным методом., Получены иммобилизованные препараты с активностью глюкозооксидазы 1120 Е/г, аспергил{1опепсина - 6,2 Е/г.

Пример 3. Получение носителей , содержащих гидрофобные радикалы . Получение носител ведут как в примере 1, только вместо раствора гексаметилендиамина используют октиловый спирт. После аналогичной обработки получают носитель, содержа1ЧИЙ октиловый остаток, присоединенный к фенильному кольцу через амидную св зь (по данным элементарного анализа продукт содержит

4,0% N). Функциональные свойства носител обусловлены гидрофобным взаимодействием с молекулами белков . При адсорбционной иммобилизации глюкозооксидазы на этом носитепе получен препарат с активностью 80 Е/г, в то врем как при применении исходной немодифицированной целлюлозы активность равна нулю. Аналогичным образом модифицирована сефароза CL-4B, только в этом

случае водна суспензи носител переводитс в органический растворитель и обратно в водную среду промыванием смес ми дноксан-вода с постепенно увеличивающейс (обратно-уменьшающейс ) концентрацией

Claims

Формула изобретения

1. Способ модификации полисахаридов обработкой диизоцианатами, от-

ЗОдичающийся тем, что, с целью получения сорбентов, обладающих химической стабильностью и высокой сорбционной емкостью, для иммобилизации или хроматографической 35 очистки белков, проводят дополнительную обработку полученного продукта ’ бифункциональными или Монофункциональными соединениями в стехиометрическом избытке.

40
2. Способ по п,1, отличающий с я тем,что в качестве бифункциональных соединений используют алифатические диамины и дикарбоновые КИСЛОТЫ С₂- Сд.
3. Способ по n.J, отличаю45 щ и й с я тем, что в качестве монофункциональных соединений используют алифатические спирты Cg- Cg.