SU1614765A3

SU1614765A3 - Способ получени рекомбинантной плазмидной ДНК pHTN 713, кодирующей фактор некроза опухоли человека

Info

Publication number: SU1614765A3
Application number: SU853869300A
Authority: SU
Inventors: Ямада Масааки; Фурутани Ясуджи; Нотаке Мицие; Ямагиси Юнити
Original assignee: Дайниппон Фармасьютикал Ко., Лтд (Фирма)
Priority date: 1984-03-06
Filing date: 1985-03-05
Publication date: 1990-12-15
Also published as: JPH0157955B2; JPS60185799A

Abstract

Изобретение относитс к генетической инженерии, в частности к конструированию рекомбинантной плазмидной ДНК PHT N 713, кодирующей фактор некроза опухоли. ДНК плазмиды конструируют в результате культивировани человеческих макрофагов с индуктором, отделени фракции, содержащей и-РНК человеческого ФНО, от индуцированных клеток, получени одн-ДНК из и-РНК с использованием обратной траскриптазы с последующим превращением в дн-ДНК, введени дн-ДНК PBR 322, трансформации рекомбинантным вектором организма-хоз ина и получени клонов субклонировани к ДНК, кодирующей полипептид человеческого ФНО или его главной части, из отобранных клонов выдел ют рекомбинантную плазмидную РНК PHT N 713.

Description

Изобретение относитс к генетической .инженерии, в частности к конструированию рекомбинантной плазмидной ДНК,- кодирующей фактор некроза опухо- -ли человека.

Способ заключаетс в том, что конструируют ДНК плазмиды в результате культивировани человеческих макро- .фагов с индуктором, отделени фракции, содержащей и-РНК человеческого ФИО, от индуцированных клеток, получени одн-ДНК из л-РНК с использованием обратной транскриптазыс последующим привращением в дн-ДНК, введени дн-ДНК в вектор, трансформации рекомбинантным вектором организма хоз ина и получени клонов, субклонировани к-ДНК, .кодирующей полйпептид человеческого ФНО или его главную часть из отобранных клонов и вьщел ют рекомбинантную плаз- миднуьэ ДНК, кодирующую человеческий ФНО.

Данные, 1гглюстрирующ1 е предлагаемый способ, приведены в табл. 1-1, 1-2, 2-1, 2-2, 3-10. : П р И м е р 1. Получают макрофап .:человекао Полученные макрофаги высевают в чашку с плотностью клеток, равной приблизит ельно от 2-10 до 1-10 клеток на 1 см и предварительно культивируют при 35 -38°С, предпочтительно при 37°С, в атмосфере 100%-ной. влаж- .; ности, содержащей 5% двуокиси углерода , в течение приблизительно от 30 мин до 2 ч.

Затем в качестве индуктора прибавл ют эндотоксин, полученный из грам- отридательных бактерий, например лиOi

3 vl

Oi СП

Я

пополисахарид, полученный из Escheri- cfiia coli; Pseudomonas aeruginosa или Salmonella tyhi, a в качестве ингибитора синтеза белка прибавл ют цикло- гексимиДо Культивирование продолжают еще в течение 3-8 ч дл накоплени и-РНК человеческого ФИО в макрофагах. Количество эндотоксина, как правило, равно около 1-100 мкг/мл, В качестве индуктора можно дополнительно прибавить форболовый сложный эфир, такой как форбол-12-миристат-13-ацетат, форбол-12, 13-дидеканоат или форбол- -12,13-дибензоат в количестве прибли- зительно 1-2000 нг/мл. Количество ингибитора синтеза белка варьируетс в зависимости от его типа,Например,в случае циклогексимвда оно равно J 0,1-50 мкг/мл, В качестве культураль- ной среды можно использовать различны культуральные среды, пригодные дл культивировани клеток млекопитающих (RPMI-1640, МЕМ-среду Eagle и модификацию Dulbecco МЕМ-среды), В предпоч- тительном варианте в культуральную

среду прибавл ют сыворотку животных ;(такую как эмбриональна бычь сыво- I ротка или сыворотка теленка) в количестве приблизительно 1-20%, ; После культивировани экстрагируют общую РНК из клеток, а затем аффинной колоночной хроматографией на олиго- (дТ)-7делл1олозе или поли(У)-сафарозе-- и отдел ют фракцию, содержащую пол (А -и-РНК, Фракцию, обогащенную и-РНК ;человеческого ФИО, получают обработ- I кой фракции поли(А)-и-РНК электрофорезом на кислотно-мочевинном агароз- ном геле или центрифугированием в rpa диенте плотности са:;арозы.

Дл подтверждени того, что получают фракцию и-РНК, кодирующую человеческий ФИО, и-РНК транслируют в белок и провер ют его биологическую актив- ность. Ввод т и-РНК в ооциты Xenopus laevis и анализируют цитотоксической активностью in vitro по отношению к мьшшным клеткам L транслированного белка.

Пример 2, Поли(А).-н-РНК 1ШИ обогащенную и-РНК фракцию используют р качестве матрицы, а (дТ) - в качестве затравки д.п синтеза одн-ДНК с использованием обратной транскрептазы (nanpiiMep, полученной из вируса птичьего миелобластоза в присутствии дАТФ, дПТД, дГТФ и дТТФ), Оид-ДНК используют в качестве матрицы и синтези

to J5 20 25

зО , Q

дс

50

5

p.sToT дн-ДНК с использованием обратной транскрептазы или ДНК-полимеразы Е,coli.

Результирующую дн-ДНК ввод т в . плазмиду pBR 322, расщепленную Pst эндонуклеазой рестрикции. Результирующие рекомбинантные плазмиды ввод т в клетку-хоз ин, такую как E,coliXl776, получают набор клонов к-ДНК путем отбора колоний, устойчивых к тетрациклину .

Набор к-ДНК подвергают гибридизации с использованием Р-меченного фрагмента к-ДНК кроличьего ОНО, отбирают целевые клоны, содержащие реком- ешнантные плазмиды, имеющие к-ДНК- вставку, кодирующую полипептид человеческого ФНО,

32

Р-Меченную к-ДНК синтезируют с использованием фракции поли(А)-и-РНК или фракции, обогащенной и-РНК чело- . веческого ФНО, в качестве матрицы. Отдельно в качестве матрицы используют фракцию и-РНК, полученную по аналогичной методике, за исключением того, что в качестве сьфь используют неиндуцированные макрофаги и синтезируют Р-меченную к-ДНК, В качестве индуцирующей отрицательной пробы используют Р-меченную к-ДНК, Из указанного выше набора к-ДНК отбирают клоны плаз- мид, сильно гибридизующиес с индукционной положительной пробой, но не гибридизующиес с индукционной отрицательной пробой.

Описанную ниже операцию провод т дл того, чтобы подтвердить то, что результирующие клоны содержат вставку к-ДНК, кодирующую полипептид человеческого ФНО„ Плазмидную ДНК вьще- л ют из вьпиеуказанньсх клонов, превращают в однонитевую ДНК нагреванием или щелочной обработкой и фиксируют на нитроцеллюлозных фильтрах. Фракцию и-РНК, содержащую и-РНК человеческого ФНО, добавл ют к фильтрам дл гибридизации с помощью фиксированной ДНК, Выделенную и-РНК ввод т в ооциты Xenopus laevis дл определени того, кодирует ли вьщеленна и-РНК полипеп- тид человеческого ФНО,

Вышеуказанными способами получают трансформированные сисгемы, имеющие рекомбинантные плазмиды, содержащие фрагмент ДНК, имеющий 1ггк;ледователь- ность оснований, ксь -ггик:м ; нтарную и-РНК человеческого .

Если полученные клонированные ДНК |Не содержат цельного участка, кодиру- ;ющего полипептид человеческого ФИО, то отбирают к-ДНК большего размера отбором из набора к-ДНК с использо- ванием в качестве пробы клонирован- ных ФНО-фрагментов к-ДНК из трансформированных систем

Клонированную к-ДНК, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность полипептида человеческого ФНО, анализируют путем определени последовательностей оснований некоторых фрагментов клонированной к-ДНК, обнаруживают последовательность оснований, гомологическую последовательность оснований к-ДНК кроличьего ФНО и отбирают те к-ДНК, которые

каетс с ФИО кроличьей шшзмы. Это указьшает на то, что полна аминокис- последовательность полипептида человеческого ФНО не все гда необходима дл экспрессии активности, частично модифидиро1занный полипептид человеческого фНО также обладает активностью , поскольку он содержит актив-,

0 НЬ1Й центр полного поли пептида ФНО,

II р и м е р 3. Модификацию ДНК провод т расщеплением ДНК подход щей эн- донуклеазной рестрикции и отщеплением одного или больше кодона подход щш- И

J5 экзрнуклеазами и/или эндонуклеазами, вз тым11 индивидуально или в сочетании, с последующим замещением на дегенеративные или другие кодоиы, например на кодоны, синтезированные химически

25

содержат последовательность оснований, 20 по фосфотризфирному способу или отщеп- соответствующую цельному кодирующему участку дл полипептида человеческого ФНО.

Гомологичность между последовательностью оснований, кодирующей кроличий ФНО, и последовательностью оснований, кодирующей полипептид человеческого ФНО, а также гомологичность между установленными аминокислотными последовательност ми полипептида кроличьего ФНО и полипептида человеческого ФНО представлена, соответственно, в табл. 5 и 6.

Из этой гомологичности и из установленных N-концевых и С-концевых аминокислотных последовательностей кроличьего плазменного ФНО делают вы35

лением кодонов.

П р и м е р 4о Получение полипептида человеческого ФНО.

Плазмиду, кодирующую полипептид человеческого ФНО, получают введением клонированной к-ДНК, кодирующей полипептид человеческого ФНО, в подход щий вектор. Можно использовать все векторы, пролиферирующие в трансфор- 30 мируемых микроорганизмах.

Плазмиду дл получени неслитого полипептида конструируют св зыванием фрагмента ДНК, содержащего последовательность оснований, кодирующую полипептид человеческого ФНО, где инициирующий кодон АТС прибавлен к з -окончанию и стоп-кодон (ТАА, TAG или TGA) имеетс в 3 -конце, с фрагменвод о том, что К-ДНК человеческого ФИО кодирует полипептид-предшественник ФНО, содержащий 233 аминокислотных остатка, а сам полипептид человеческого ФНО представл ет собой полипептид , соответствующий 155 аминокислотным остаткам от карбокси-окончани предшественника„

Наличие гомологичности последовательностей оснований и установленных аминокислотных последовательностей человеческого ФНО и кроличьего ФНО указывает на то, что они фшЮгенетически происход т из одного и того же гена, и свидетельствуют о том, что значительна часть- обычных участков представл ет собой последовательность, необходимую дл экспрессии биологической активности. Однако, как показано ниже, полный полипептид человеческого ФНО иммунологически не пересекаетс с ФИО кроличьей шшзмы. Это указьшает на то, что полна аминокис- последовательность полипептида человеческого ФНО не все гда необходима дл экспрессии активности, частично модифидиро1занный полипептид человеческого фНО также обладает активностью , поскольку он содержит актив-,

НЬ1Й центр полного поли пептида ФНО,

экзрнуклеазами и/или эндонуклеазами, вз тым11 индивидуально или в сочетании, с последующим замещением на дегенеративные или другие кодоиы, например на кодоны, синтезированные химически

по фосфотризфирному способу или отщеп-

лением кодонов.

Плазмиду, кодирующую полипептид человеческого ФНО, получают введением клонированной к-ДНК, кодирующей полипептид человеческого ФНО, в подход щий вектор. Можно использовать все векторы, пролиферирующие в трансфор- мируемых микроорганизмах.

Плазмиду дл получени неслитого полипептида конструируют св зыванием фрагмента ДНК, содержащего последовательность оснований, кодирующую полипептид человеческого ФНО, где инициирующий кодон АТС прибавлен к з -окончанию и стоп-кодон (ТАА, TAG или TGA) имеетс в 3 -конце, с фрагментом ДНК, кодирующим промотор и последовательность Shine-Dalgarno. Плазмиду конструируют в результате введени фрагмента к-ДНК, имеющего последовательность ОСНОВАНИЙ, кодирующую

полипептид человеческого ФНО, где в 3 -конец добавлен обрывающий кодон, в вектор, в результате чего трансл ционна считывающа структура соответствует структуре в структурном гене. Способ получени полипептида человеческого ФНО в форме слитого полипептиа имеет преимущество, вьфажающеес в сведении к минимуму разложени проукта в трансформированных клетках- хоз евах. Полный полипептид человечесого ФНО, соответствующий аминокислотой последовательности от серина в 2 положении до- лейцина в 236 полоуе- ии, в верхних строчках табл. 6, не со

10

держит метионина. Следовательно плаз- мида/ сконструированна введением фрагмента к-ДНК человеческого ФИО, св занного с 3 -окончанием дгоследова- тельности оснований структурного сливаемого гена через метиониновый кодон (АТС), позвол ет человеческий ФИО в виде слитого продукта способом рас1чеплени метиониновой пептидной св зи, например обработкой бромцианом,Трансформированные организмы получают введением экспрессивного вектора в организм-хоз ин,; -такой как (шкро- организм, например E.coli, После это- Го культивированием трансформированных организмов получают пЪлипептид человеческого ФИО или полипептид, со- держащ1-1й метионин в N-окончании. Продукт может накапливатьс как в цитоплазме , так и Б периплазме клеток-хоз ев в зависимости от способа конструировани экспрессивного вектора, Дп TorOj чтобы вызвать вьщеление nojranen-25 тида в периплазме, конструируют плаз- миду с использованием гена, кодирующего секреторньй белок, такой как ген щелочной фосфатазы (phoA) или ген бел-.

15

20

ка, св зьгоающего фосфат (phoS), в ре- 0 , аргинином, кофеином, П15окаином,

зультате св зывани ДНК, кодирующей полипептид человеческого ФНО,в правильной трансл ционной считывающей структ фе с указанным выше геном в подход щем месте после участка ДНК, кодиругощего сигнальньш пептид.

Результирующие трансформированные организмы культивируют в подход щих услови х до полной выработки целевого полипептида. После этого полицептид экстрагируют из культ фы.После накоп- выработавшегос полипептида Е Ц - :топлазме клетки-хоз ева подвергают разрушению обработкой лизоцимом, замораживанием и размораживанием или ультразвуковым диспергированием, либо с использованием пресса Френча, после чего центрифугируют или фильтруют и собирают экстракт,

Полученный таким образом полипептид о шщают обычными спогобами очист- ки белков, например сочетанием высалн- вани , ультрафильтрации, диализа, ион- нообмеиной хроматографии, гель-фильтрации , электрофореза, аффинной хроматографии и т,д.

I

Описанным выше способом получают полипептид человеческого ФНО по изоб35

40

45

50

55

хлористоводородной кислотой, глюконо-.- вой кислотой и т„п.

Модификацию полипептида человеческого ФНО или -его аллельного мутантного полипептида провод т по известным методикам,.

Химические и физико-химические свойства полипептида,

{олекул рньй вес,

Молекул рный вес рЧ-ФНО измер ют гель-фильтрационным анализом на колонке с Т 8К-гелем G 3000 SW в соответствии с жидкостной хроматографией высо-. кого давлени , использу 0,2 И фосфатный (рН 7) буфер с или без 8 М мочевины и 0,5% 2-меркаптоэтанола в качестве растворител , В качестве белков-маркеров молекул рного веса ис- пользуют бычий сывороточный альбумин. (MW 66000), кроличью триозефосфотизо- меразу (MW 53000), ичный альбумин (MW 45000), свиной пепсин (MW 32700), соевый i чгибитор трипсина (MW 20500), лошадиный миоглобин (MW 17800) и лошадиный цитохром-С (MW 12400),

В результате устанавливают, что рЧ-ФНО имеет молекул рный вес 45000± ±5000 и 18000+3000 дальтон соответст0

5 .

5

0

ретениго и/или полипептид с метионином на N-конце полипептида.

Пример 5, Под модифицированными полипептидами человеческого ФИО подразумевают полипептиды, полученные из аллельных мутантов ДНК кодиру- Ю1чей полипептид человеческого ФНО (ал- лельный мутантный полипептид), их получают в результате присоединени аминокислоты или пептида (состо щего из двух или более аминокислот) к N-OKOH- чанию или С-окончанию полипептида человеческого ФНО или аллельного мутант- ного полипептида, или в результате удалени одной или больше аминокислоты из полипептида человеческого ФНО, или аллельного мутантного полипептида (например, удалени 4 аминокислот из N-окончани по шпептида человеческого ФНО), а также прои:;водные, такие как сложные эфиры, ацильные производные или амиды кислот, образованные с использованием функциональной группы в молекуле, остатка амина в N-конце или -карбоксильного остатка в С-конце, и их соли, образованные аминоостатками или карбоксильными остатками, например с гидроокисью натри ,гидроокисью

5

0

5

0

5

{олекул рньй вес,

В результате устанавливают, что рЧ-ФНО имеет молекул рный вес 45000± ±5000 и 18000+3000 дальтон соответственно в отсутствии и присутствии мочевины и 2-меркаптоэтанола,

к-ДНК, введенна в экспрессивную плазмиду pHTR 91, кодирует 155 амино- кислотных остатков (за исключением метионина, происход щего из инициирующего кодона АТС), Из установленной аминокислотной последовательности рассчитывают молекул рньй вес рЧ-ФНО JQ (17097 дальтон), Рассчитанный молекул рный вес согласуетс со значением, определенным в присутствии мочевины и 2-меркаптоэтанола.

Этот факт указьшает на то, что 5 рЧ-ФНО присутствует в виде мономера (субъединицы) в присутствии мочевины и 2-меркаптоэтанола, но существует в виде агрегата, например в форме триме- ра, при отсутствии денатурирующих 20 агентов,

Изоэлектрическа точка,

Изоэлектрическую точку определ ют гель-электрофорезом с изоэлектрофоку- сированием при 3 Вт в течение 3 ч с 25 использованием пластинки 5%-ного по- лиакриламидного гел ;и градиента рН от 4,0 до 6,5,

Белок окрашивают Кумасси бриллиантовым голубым. Отдельно гель нарезают ЗО полосками 3 мм шириной и вымачивают В 20 мМ трис-НС1 (рН 7,8) буфере дл элюировани белка. Цитотоксическую ктивность четко наблюдают в элюат.е з гел , вырезанного из места, соответствующего положению белка, опредеенному прокрашиванием.

Как бьшо установлено, изоэлектри- че ска точка рЧ-ФНО равна 5,9+0,3.

Аминокислотный состав 40

Аминокислотый состав рЧ-ФНО опреел ют с помощью аминокислотного микроанализатора флуорометрическим способом с использованием ортофталевого альдегида после гидролиза образца хло-д ристоводородной кислотой. /

50 мкг рЧ-ФНО гидролизуют в бн.НС при 11 . Аминокислотньй состав рас- считьшают с корректированием на основе значений, определенных в каждом об- п разце, гидролизованном 24,48 и 72 ч, Цистин и цистеин определ ют в виде цистеиновой кислоты, превращенной с помощью окислени пероксимуравьиной ; кислотой. Триптофан определ ют по флуорометрическому способу.

Результаты сведены в табл. 7.

Аминокислотньй состав хорошо согласуетс с составом, рассчитанным из

последовательности оснований, кодиру- юпдих полипептид человеческого ФИО.

Определение N-концевой аминокислотной последовательности.

N-Концевую аминокислотную последовательность рЧ-ФНО определ ют по методике разложени Эдмана.

Фенилтиогид гнтоинаминокислоту, получающуюс из N-концевой аминокислоты в способе разложени по Эдману, идентифицируют с помощью жидкостной хроматографии высокого давлени с использованием колонки (4,6x250 мм) с TSK- гелем DDS 120А, Эти операции многократно воспроизвод т дл определени новых последовательно образующихс N-концевьгх аминокислот.

Обнаруживают последовательно, что N-концева аминокислотна последовательность рЧ-ФНО вл етс следующей;

NH -Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro- -Ser-Asp

Некоторые полипептиды, получаемые в микроорганизмах при применении технологии рекомбинантной ДНК, имеют в своих N-концах остаток метионина, получающийс из инициирующего кодона (АТС),

Определение С-концевой аминокислотной последовательности.

С-Концевую аминокислотную последовательность рЧ-ФНО определ ют ферментативным способом с использованием карбоксипептидазо

рЧ-ФНО расщепл ют карбоксипептида- дой-А и карбоксипептидазой Y при мол рных соотношени х фермента ксубстра. ту равных соответственно 1 : 25 и 1 : 1000, Свободные аминокислоты, выделившиес из С-окончани рЧ-ФНО в результате двойного отщеплени , иденти- фицируют на аминокислотном микроана- :лизаторе через соответствующие интервалы времени от 2 до 180 мин после расщеплени о

Устанавливают, что С-концева аминокислотна .последовательность рЧ-ФНО вл етс следующей:

Tyr-Phe-Cly-Ile-Ile-Ala-Ieu-СООН ,

Разложение рЧ-ФНО трипсином.

500 мкг рЧ-ФНО разлагают с помощью 20 мкг ТРСК-обработанного трипе при- комнатной температуре в течение 3 ч.

Разложенный продукт подвергают препаративному иэоэлектрофокусирующему гель-электрофорезу. Белки окрашивают Кумасси бриллиантовым голубым, В от- дельном опыте гель нарезают полосками шириной 3 мм и нарезан№1й гель вымачивают в 20 мМ трис-НС1 (рН ) буфере дл элгоировани белка.

В результате устанавливают, что продукт разложени элюируемый из вырезанного гел , соответствующего зоне рН приблизительно на 0,3 более низкого , чем изоэлектрическа точка рЧ-ФНО обладает цитотоксической активностью.

В результате устанавливают, что частична аминокислотна последовательность продукта разложени вл етс следующей:

N-концева : .JIHj -Thr-Pro-Ser-Asp-

С-концева ; --Ile-Ala-Leu-COOH.

Как показьшает аминокислотна последовательность , продукт разложени представл ет собой полипептид, полу- чившшс в результате, отщеплени четы рех К-коицевых аминокислот (Ser-Ser- -Ser-Arg) от рЧ-ФНО, и обладает указанной выше цитотоксической активностью . Это означает, что по крайней мере четыре N-концевые аминокислоты в не играют существенной роли в его биологической активности.

Биологическа активность.

Цитотоксическа активность по отношению к мышиной клетке L-Mo Образец (О,1 мл) серийно развод т указанной ниже средой и по Oj1 мл суспензии мышиных клеток L-M (100000 клеток на 1 мл) добавл ют в каждую лунку многолуночной пластинки. Используют минимальную питательную , среду Eagle, содержащую 1% эмбриональной бычьей сьторотки. Пластинку инкубируют при ЗТ С в течение 8 ч Б пол 1ностью влажной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. После инкубировани прибавл ют 20 мкл 25%-ного глyтapaльдeг щa дл фиксировани жизнеспособных клеток. После фиксирова- -ш пластинку тгромывают и сушат. Пос- ле этого дл окрашивани фиксирован- ных клеток прибавл ют 0,1 мл 0,05%- ного раствора метиленового голубого. Избыток метиленового голубого отмываю и пластинки сушат. Метиленовый голу-

бой, св завпмйс с фиксированными клетками, элюируют 200 мкл 0,36 н. НС1 и измер ют его поглощение при 665 им. Поглощение пропорционально

Q 5

Q

5 О

Q 5

5

числу жизнеспособных клеток. Концентрацию биологической актив ности требующуюс дл умерщвлени 50% клеток L-M, определ ют как 1 ед./мл. Цито- токсическую активность по отношению к клеткам L-M, определенную в указанных вьш1е услови х, выражают как единицы (LM) дл того, чтобы отличать от цитотоксической активности по отношению к мьш1иным клеткам L-929 как клеткам-мишен мо

Определ ют содержание белка„

В результате устанавливают, что рЧ-ФНО имеет удельную активность, равную 2-10 единиц (LM) и более на 1 мг белка.

Противоопухолевое действие на саркому Meth А, трансплантированную мышам о

Противоопухолевое действие на мышей с саркомой Meth А оценивают следукщим образом.

Машам BALB/C массой около 23 г внутрикожно трансплантируют 200000 -клеток саркомы Meth А в- кожу брюшины и через 7 дней отбирают мышей, у которых опухоль имела 6-7 мм в диаметре . На седьмой день после трансплантации опухоли рЧ-ФНО ввод т в массу опухоли или внутривенно., Содержание эндотоксина в рецептуре рЧ-ФНО меньше, чем 0,01 нг на 1-10 единиц (LM) цитотоксической активности.

Устанавливают, что при введении в массу опухоли некроз опухолевого трансплантата наблюдаетс у всех мьтей, которым ввели рЧ-ФНО в дозах 110, 3-10 и1-10 единиц (LM) на мьш1ь в те- чание 24 ч после инъекции, и опухоль полностью регрессирует в размере 3/5, 5/5 и 5/5 соответственно при каждой указанной вьш1е дозе. При внутрчвен- ном введении некроз наблюдают у всех мьццей, получивших инъекцию рЧ-ФНО в дозе З Ю и 1-Ю единиц (LM) на мышь, и дол полной регрессии составл ет соответственно 3/5 и 4/5.

Ингибиру цее действие рЧ-ФНО на рост клеток опухоли человека in vitro. , Ингибирующее действие рЧ-ФНО на рост клеток опухоли человека и нор- мапьных клеток оценивают in vitro в следующих услови х. Клетки опухоли человека или нормальные клетки высеивают в количестве 10000 клеток на лунку R 1 мл минимальной питательной среды Eagle, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, с использованием пластинки с 24 лунками. Добавл ют рЧ-ФНО в результирующей концентрации 1 OU единиц (ЬМ)/мл и затем культивируют при 37°С в течение 4 дней в полностью влажной атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода. За 4 дн до окончани культивировани в каждую лунку прибавл ют 1 мкл Н-тимидина. После культивировани клетки промыва- |п ют фосфатным солевым буфером и лизи- руют с помощью 0,5%-ного додецилсуль- фата натри . Количество Н-тимидина, введенное в клетки, определ ют, изме-. р радиоактивность лизата. 5

Ингибирующее действие в виде доли йнгибировани роста, рассчитьтаемой по следующему уравнению:

Дол йнгибировани роста (%) (а - Ь)(а -100), где а и b представило

л ют собой радиоактивность, введенную в клетки соответственно при отсутствии рЧ-ФНО и в гфисутствии рЧ-ФНО,

Результаты, сведенные в табл., 8, показывают, что рЧ-ФНО существенно ингибирует рост клеток опухоли человека , но не вли ет на нормальные клетки. Это наблюдение показьшает, что рЧ-ФНО селективно атакует опухолевые клетки.

/

иммунологические свойства, Раствор рЧ-ФНО (100 единиц (ЬМ)/мп) смешивают с равным объемом разбавленного в 100 раз очищенного антитела против кроличьего ФИО. После инкубиг о- вани при 37°С в течение 2 ч измер ют цитотоксическую активность реакционной смеси.

Таблица -I-I

-ТСА GCT ТСТ CGG GCC СТО AGT GAC AAG СТА GCC САС СТА GTA GCA ААС CCG САА SAG GGC CAG СТС CAG TGG CTG AGC CAG

; .«

GCG ААС GCC CTG CTG GCC ААС GGC ATG СТС ACG GAC ААС CAG CTG GTG GTG CCG GAC GGG CTG ТАС СТС АТС ТАС ТСС CAG СТС ТТС AGC GGT САА GGC TGC CGC ТСС GTG СТС СТС ACT САС ACT GTC AGC CGC GCC GTC ТСС ТАС CCG ААС AAG GTC ААС СТС ТСТ GCC АТС AAG AGC ССС TGC САС GAG АСС ССС GAG GAG GCT GAG ССС ATG TGG ТAC GAG CCC АТС ТАС CTG GGC GGC TTC C7iG TTG GAG AAG GGT GAC CGG CTC ACC GAG GTC AAC CAG CCT GAG TAC CTG CTT GCC GAG TCC GGG CAG GTC TAC TTT АТС ATT GCC CTG-(3)

Табжца 1-2

Ala Ser Arg Ala Leu Ser Asp Lys Pro Ala His Val Val Ala Asn Pro Gin Val Gly Gin Leu Gin Trp Leu Ser Gin Arg Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Het Lys Thr Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ala Gly Leu Tyr Leu lie Tyr Ser Gin Val

5161476516

. Продолжение табл1тцы 1

Leu Phe Ser Gly Gin Gly Cys Arg Ser Tyr Val Leu Leu Thr His Thr Val Ser Arg Phe Ala Val Set Tyr Pro Asn Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala He Lys Ser Pro Cys His Arg Glu Thr Pro Glu Glu Ala Glu Pro Met Ala Trp Tyr Glu Pro He Tyr Leu Gly, Gly Val Phe Gin Leu Gla Lys Gly Asp Arg Leu Ser Thr Glu Val Asn Gin Pro Glu Tyr Leu Asp Leu Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly He He Ala Leu

Таблица 2-1

(5)-AGC ACT GAG AGT АТС АТС CGG GAC GTC GAG CTG GCG GAG GGG CCG CTC CCC AAG AAG GCA GQG GGG CCC CAG GGC TCC AAG CGC TGC CTC TGC CTC AGC CTC TTC TCT TTC CTG CTC GTG GCT GGA .GCC ACC ACG CTC TTC TGC CTG CAC TTC AGG GTG АТС GGC CCT C.AG GAG G/VA GAG CAG TCC CCA AAC AAC CTC CAT СТА GTC AAC CCT GTG GCC CAG ATG GTC ACC CTC AGA TCA GCT TCT CGG GCC CTG AGT GAC AAG CCT СТА GCC CAC GTA GTA GCA AAC CCG CAA GTG GAG GGC CAG CTC CAG TGG CTG AGC CAG CGT GCG AAC GCC CTG CTG GCC AAC GGC ATG AAG CTC ACG GAC AAC CAG CTG GTG GTG CCG GCC GAC GGG CTG TAC CTC АТС TAC TCC CAG GTT CTC TTC AGC GGT CAA GGC TGC CGC TCC TAC GTG CTC CTC ACT CAC ACT GTC AGC CGC TTC GCC GTC TCC TAC CCG AAC AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC АТС AAG AGC CCC TGC CAC CGG GAG ACC CCC GAG GAG GCT GAG CCC ATG GCC TGG TAC GAG CCC АТС TAC.CTG GGC GGC GTC TTC CAG TTG GAG AAG GGT GAC CGG CTC AGC ACC GAG GTC AAC CAG CCT GAG TAC CTG GAC CTT GCC GAG TCC GGG CAG GTC TAC TTT GGG АТС ATT GCC CTG-(34

1614763 и

..Табжца 2-2

Thr Glu Ser MetHeArgAsp Val Glu

Ala Glu Gly ProLeuProLys Lys Ala

Gly Pro Gin GlySerLysArg Cys Leu

Leu Ser Leu PheSerPheLeu Leu Val

Gly Ala Thr ThrLeuPheCys Leu Leu

Phe Arg Val HeGlyProGin Glu Glu

Gin Ser Pro AsnAsnLeuHis Leu Val

Pro Val Ala GinMetValThr Leu Arg

Ala Ser Arg AlaLeuSerAsp Lys Pro

Ala His Val ValAlaAsnPro Gin Val

Gly Gin Leu GinTrpLeuSer Gin Arg

Asn. Ala Leu LeuAlaAsnGly Met Lys

Thr Asp Asn GinLeuValVal Pro Ala

Gly Leu Tyr LeuHeTyrSer Gin Val

Phe Ser Gly GinGlyCysArg Ser Tyr

Leu Leu Thr HisThrValSer Arg Phe

Val Ser Tyr ProAsnLysVal Asn Leu

Ser Ala He LysSerProCys His Airg

Thr Pro Glu GluAlaGluPro Met Ala

Tyr Glu Pro HeTyrLeuGly Gly Val

Gin Leu Glu LysGlyAsp Arg Leu Ser

Glu Va.l Asn GinProGluTyr Leu Asp

Ala Glu Ser GlyGinValTyr Phe Gly , He Ala Leu

10 20 30

GGGGGGGGGGGGGGGCCCTCTGGAGAGAGCGdCATGAGCACTGAGAGTATGATCCGGGAC

CCCCCCCCCCCCCCCGGGAGACCTCTCTlCGCGGTACTCG GACTCTCATACTAGGCCCTG

70 80 90 100 110 120

GTCGAGCTGGCGGAGGGGCCGCTCCCCAAGAAGGCAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAAGCGCJ CAGCTCGACCGCCTCCCCGGCGAGGGGTTCTTCCGTCCCCCCGGGGTCCCGAGGTtiCGCG

. .« ч ,

Haell 130 140 150 160 170. 180

TGCCTCTGCCTCAGCCTCTTCTCTTTCCTGCTCGTGGCTGGAGCCACCACGCTCTTCTGC ACGGAGACGGAGTCGGAGAAGAGAAAGGACGAGCACCGACCTCGGTGGTGCGAGAAGACG

, Еабдаца.

Haell 40 50 60

1 0200210220230240

CTGCTGCACTTCAGGGTGATCG.GCCCTCAGGAGGAAGAGCAGTCCCCAAACAACCTCCAT GACGACGTGAAGTCCCACTAGCCGGGAGTCCTCCTTCTCGTCAGGGGTTTGTTGGAGGTA

250 260270280 |AvaI2-90300

STftSTHfi;i5SSTSTS5SES ™ TCAcicTCAGATCAGCTT4cGGGCCCTGAGTGAC

:GGGACTCACTG

GATCAGTTGGGACACCGGGTCTACCAGTGGGAGTCTAGTCGAAGAGCC

310 . 320 330 340 350 360

SSSSS C GTGGAGGGCCAGCTCCAGTGGCTGAGC TTCGGAGATCGGGTGCATCATCGTTTGGGCGTTCACCTCCCGGTCGAGGTCACCGACTCG

370 380 390 400 410 420

CAGCGTGCGAACGCCCTGCTGGCCAACGGCATGAAGCTCACGGACAACCAGCTGGTGGTG GTCGCACGGTTGGGGGACGACCGGTTGCCGTACTTCGAGTGCCTGTTGGTCGACCACCAC

430 440 450 460 470 . 480

CCGGCCGACGGGCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTTCTCTTCAGCGGTCAAGGCTGCCGC GGGCGGCTGCCCGACATGGAGTAGATGAGGGTCCAAGAGAAGTCGCCAGTTCCGACGGCG

490 500 510 520 530 540

TSSTiSS T CGCTTCGCCGtCTCCTACCCGAACAAGGTC AGGATGCACGAGGAGTGAGTGTGACAGTCGGCGAAGCGGCAGAGGATGGGCTTGTTCCAG

550 560 570 580 , 590 600

f SSSTSSr CC GACCclcCGAGGAGGCTGAGCCC iTGGAGGAGAGACGGTAGTTCTCGGGGACGGTGGCCCTCTGGGGGCljCCTCCGACTCGGG

610 620 . 630 640

Aval

650 660

..I t -x/- J J

ATGGCCTGGTACGAGCCCATCTACCTGGGCGGCGTCTTCCAGTTGGAGAAGGGTGACCGG TACCGGACCATGCTCGGGTAGATGGACCCGCCGCAGAAGGTCAACCTCTTCCCACTGGCC

, 680 690 700 710 720

CTCAGCACCGAGGTCAACCAGCCTGAGTACCTGGACCTTGCCGAGTCCGGGCAGGTCTAG GAGTCGTGGCTCCAGTTGGTCGGACTCATGGACCTGGAACGGCTqAGGCCCGTCCAGATG

730 740 750 . 760 770 780

TTTGGGATCATTGCCCTGTGAGGGGACTGACCACCACTCCTCCCCCTCTGCCACCCCAGC AAACCCTAGTAACGGGACACTCCCCTGACTGGTGGTGAGGAGGGGGAGAGGGTGGGGTCG

790 800

CCCCTCACTCTGGGCGCCCTCAG GGGGAGTGAGACCCGCGGGAGTC

Продолжение табл.3

:GGGACTCACTG

Aval

650 660

t -x/- J J

1614765

Таблица

GACCCACGG

-30-20-10-1

I

СТССАСССТСТСТССССТООЛЛЛССАСАСС

1 10 20 . ЗО I I I I

ATGAGCACTGAAAGCATGATCCGGGACGTG HetSerThrGluSerKetlleArgAspVal

40 50 60

GAGCTGGCCGAGGAGGCGCTCCCCAAGAAG GluLeuAlaGluGluAlaLeuProLysLys

70 80 90

ACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGC ThrGlyGlyProGlnGlySerArgArgCys

100 110 120

TTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATC LeuPheLeuSerLeuPheSerPheLeuIle

130 140 150

GTGGCAGGCGCCACCACGCTCTTCTGCCTG ValAlaGlyAlaThrThrLeuPheCysLeu

160 170 180

CTGCACTTTGGAGTGATCGGCCCCCAGAGG LeuHisPheGlyVallleGlyProGlnArg

190 200 210 I I t

GAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATC GliiGluPheProArgAspLeuSerLeuIle

220 230 240

AGCCCTCTGGCCCAGGCAGTCAGApCATCT SerProLeuAlaGlnAlaValArgSerSer

250 260 270

TCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCC SerArgThrProSerAspLysProValAla

280 290 300

CATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGG HisValValAlaAsnProGlnAlaGluGly

310 320 330

CAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAAT GlnLeuGlnTrpLeuAsnArgArgAlaAsn

340 350 360

GCCCTCCTGGGCAATGGCGTGGAGCTGAGA AlaLeuLeuAlaAsnGlyVaXGluLeuArg

231614765

Продолжение та

370380390

GATAACGAGCTGGTGGTGCCATCAG/ GGGC AspAsnGlnLeuValValProSerGltiGly

400 410 420

CTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTC LeQTryLeuIleTyrSerGlnValLeuPhe

430 440 450

AAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTG LysGlyGlnGlyCysProSerThrHisVal

460 470 480

CTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCC LeuLeuThrHisThrlleSerArglleAla

490 500 510

GTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTC ValSerTyrGlnThrLysValAsnLeuLeu

520 530 540

TCTGCCATCAAGAGCCCCTCCCAGAGGGAG SerAlalleLysSerProCysGlnArgGlu

550 560 570

ACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGG ThrProGluGlyAlaGluAlaLysProTrp

580 590 600

TATGAGCCCATGTATCTGGGAGGGGTCTTC TyrGluProIleTyrLeuGlyGlyValPhe

610 620 . 630

CAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCT GlnLeuGluLysGlyAspArgLeuSerAla

640 650 660

GAGATCAATCGGCCCGACTATCTCGACTTT GlullcAsnArgProAspTyrLeuAspPhe.

670 680 690

GCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATC AlaGluSerGlyGlnValTyrPheGlylle

700 710 720

ATTGCCCTGfrGAGGAGGACGAACATCCAAC lleAlaLo j)

730740

CTTCCCAAACGCCTCCCCTGC

WGAGCACTG/i ЛТСЛССАСТО

GAGCTGGCCGAGG .VqGpGCTCCCCAAGAAG

;AGCTGGCGGAGG

:GCTCCCCAAGAAG

bfflllCCTCAGCCTCTTCT

Ш

:CTCAGCCTCTTCTCritrTCCTGldrC

150

GTGGd C

GTGG

CyGCACTT CTGCACTT

.GAAGAqШ1ССС

GAAGACSCAGfflGCCC

ДГСЙСЮСС СГСДЙССС

qrGGCCCAGj(

GJTGGCCCAGJ TGGTCJ

AGATCA AGATCJ

ft ТУ Ф ГР РГГЗД Д

ri «LN JL X 4 J. v v:arVr

У гртогг1Л тл Л Л. J. i. С X CUvjVj

CTTCTCG{G(

ClpAGGQGCAGCTCC

jAGGQC CAGCTCCAGTGGCTGAGbgAG

GA KG

ЗЛТ ACCAGCTGGTGGTGCdA 3AC ACCAGCTGGTGGTGCC

Таблица 5

/i

Ж

Qq TGЛTCCGGGACG IG GIV TGATCCGGGACG1C

:GCTCCCCAAGAAG

Ш

TTCCT

CritrTCCT

3CCACCACGCTCTTCTGCCTG 3CCACCACGCTCTTCTGCCTG

;TGATCGGCCCCpAGlAi

;TGATCGGCCC IICAGJG

CCCOGAGTGACAAG :CCI|GAGTGACAAG

Ш

ITAGCAAACCdTCAA TAGCAAACCCKCAA

27

G CCTCTTCAlAq G JT

::TCTTC/feriG(3ccAAGGCTGcqcjc стсттсл)афф рдАосстссф|с

АСССЙГ

GTGCTCCTCACCpACAQCATCAGC

fnf f y-J-rJj i V 4 « .ГЧ -« - „

TGCTCCTCAQllCACACTGTCAGC

CGqApCGCCGTCTCCTACq fel

CGqrlrcGCCGTCTCCTAca:b/

540

ACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTG C AACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGC

570

CWGA

GGAGACCCCJb GGGGGCTGAQG

CAiCфGGAGACCCqqЗAGGAGGCTGAGф

600

JQCCTGGTA TCA GCCCATCTA/TCTGGdA .fifllqG{CCTGGT/j AGCCCATCTA|qCTG C

630

FjiJ

TCTTCCAGOTGGAGAAGGGTGACCGA iTCTTCCAGJIJTCGAGAAGGGTGACCGJG

660

:TCAGCP :rcAG

21

SAOTfTTGCCGAGTOTlGGGCAGGTCTAC i 4S15CCGAGT CJGGGCAGGTCTA,C

TTTGGGATCATTGCCCTGTGA TTTGGGATCATTGCCCTGTGA

Примечание. Верхние строчки; последовательность оснований,

кодирующа человеческий ФНО- 1предшественник.

Нижтое-строчки: последовательность оснований, кодирующа кроличий ФНО-пред- шествеьник.

Области, заключенные в пр моугольник, вл ютс

гомологичным участком.

Обозначение показывает удаление кодона.

Обозначение ххх показывает обрывающий кодон.

1614765

Прололжение табл.5

420

28

510

A

:AAGGTC :AAGGTC

29

Met Ser The Glu Ser 5йt He Ser Thr GIU Ser Met He

Leu Leu

Ala Ala

Glu Glu

Thr Ala

Gly Gly Pro Gin Gly Ser Gly Gly Pro Gin Gly Ser

Phe Cys

E

eu Ser Leu Phe Ser eu Ser Leu Phe Ser

Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe Cys Leu Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe Cys Leu

Gl Glu

i

Gin

Phe Ser

He Ser Val Asn

Arg Ser Ser

Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Arg Ala Asn Ala Leu Lou Ala Asn Gly

I

sp Asn Gin Leu sp Asn Gin Leu

1614765

30

Таблица б 10

Arg Asp Val Arg Asp Val

Glu Ala Gly Pro

Leu Pro Lys Lys .eu Pro Ly.s Lys

Arg Lys

Лгд Cys rg Cys

Phe Leuj He Phe Leg leu

Arg Asp

Asn Asn

Leii Ser Led His

LeiP Leu

Ala

Val Thr

Val Leu

Thr Pro Ala Leu

Ser Asp Lys Ser Asp Lys

110

Asn Arg Ser Gin

120

Val Met

130

Val Proj Val Val Pro

31

предшественник человеческого ФИО, Нижние строчки: предшественник кроличьего ФИО. Участки, обведенные пр моугольником, вл ютс гомологичным участком. Обозначение показывает удаление аминокислоты.

16i4765. |2

Продолжение табл.6

140

33

мочевого пузыр 1 (АТСС CRL 1500) карцинома

молочной железы (АТСС CRL 1543) остеогенна саркома (АТСС CCL 218) аденокарци .нома толстой кишки (АТСС НТВ 22) аденокарцинома молочной железы (АТСС CRL 1440) почечна

лейомибластома 1 (АТСС CRL 1469) эпителоидна карцинома (АТСС CCL 2) эпителоидна

карцинома

161А765

Таблица

34

7.

Таблица 8

49 97 47 37 69 98 59 31

1614765

Таблица

10 20 30 GGGGGGGGGGGGGGGCCCTCTGGAGAGAGC 40 50 60

GCCATGAGCACTGAGAGTATGATCCGGGAC MetSerThrGluSerHetlleArgAsp

70 80 90 I I I

GTCGAGCTGGCGGAGGGGCCGCTCCCCAAG ValGluLeuAlaGluGlyProLeuProLys100 110 120 I I (

AAGGCAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAAGCGC LysAlaGlyGlyProGlnGlySerLysArg

130 140 150 t I I

TGCCTCTGCCTCAGCCTCTTCTCTTTCCTG CysLeuCysLeuSerLeuPheSerPheLeu

160 170 180

CTCGTGGCTGGAGCCACCACGCTCTTCTGC LeuValAlaGlyAlaThrThrLeuPheCys

190 200 210

CTGCTGCACTTCAGGGTGATCGGCCCTCAG LeuLeuHisPheArgVallleGlyProGln

220 230 240

GAGGAAGAGCAGTCCCCAAACAACCTCCAT GlUGluGluGlnSerProAsnAsnLeuHis

250 260 270

CTAGTCAACCCTGTGGCCCAGATGGTCACC LeuValAsnProValAlaGlnMetValThr

280 290 300

CTCAGATCAGCTTCTCGGGCCCTGAGTGAC LeuArgSerAlaSerArgAlaLeuSerAsp

310 320 330

AAGCCTCTAGCCCACGTAGTAGCAAACCCG LysProLeuAlaHisValValAlaAsn Pro

340 350 360

CAAGTGGAGGGCCAGCTCCAGTGGCTGAGC GlnValGluGlyGlnLeuGlnTrpLeuSer

370 380 390

CAGCGTGCGAACGCCCTGCTGGCCAACGGC GlnArgAlaAsnAlaLeuLcuAlaAsnGly

I61A76538

iIIKlЛ(:I,кeниe табл.9

400 410 420 I t

ATGAAGCTCACGGACAACCAGCTGGTGGTG MetLysLeuThrAspAsnGinLeuValVal

430 440 450

CCOGCCGACGGGCTGTACCTCATCTACTCC ProAlaAspGlyLeuTyrLeuIleTytSer

460 470 480

CAGGTTCTCTTCAGCGGTCAAGGCTGCCGC GlnValLeuPheSerGlyGlnGlyCysArg

490 500 510

I TCCTACGTGCTCCTCACTCACACTGTCAGC SerTyrValLeuLeuThrHisThrValSer

520 530 540 t t

CGCTTCGCCGTGTGCTACCCGAACAAGGTC ArgPheAlaValSerTyrProAsnLysVal

550 560 570 I I I

AACCTCCTCTCTGGCATCAAGAGCCCCTGG AsnLeuLeuSerAlalleLysSerProCys

580 590 600

CACCGGGAGACCGCCGAGGAGGCTGAGCCC TiisArgGluThrProGluGluAlaGluPro

610 620 630 I II

ATGGCCTGGTACGAGGCCATCTACGTGGGC MetAlaTrpTyrGluProIleTyrLeuGly.

640 650 660

GGCGTCTTCCAGTTGGAGAAGGGTGACCGG GlyValPheGlnLeuGluLysGlyAspArg

670 680 . 690

CTCAGCACCGAGGTCAACCAGCCTGAGTAC LeuSerThrGluValAsnGlnProGluTyr

700 710 720

CTGGACCTTGCCGAGTCCGGGCAGGTCTAC LeuAspLeuAlaGluSerGlyGlnValTyr

730 740 750

TTTGGGATCATTGCCCTGTGAGGGGACTGA PhcGlyllelleAlaLeu

760 770 780 CCACCACTCCTCCCCCTCTCCCACCCCAGC

790 800 CCCCTCACTCTGGGCGCGCTCAG

Получение и-РНК ФИО из человеческих альвеол рных макрофагов.

Человеческие альвеол рные макрофаги собирают бронхо-альвеол рным промыванием с помощью фосфатного солевого буфера. Альвеол рные макрофаги, 6,3-10 клеток, суспендируют в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональ- ной бычьей сыворотки, и высевают в чашки Петри (диаметром 8 см) при концентрации клеток клеток на чашку . Их предварительно культивируют при 37 С в полностью влажной атмосфере , содержащей 5% углекислого газа, Через 1 ч культивировани эндотоксин (липополисахарид, полученный из E.coli), ТРА (форбол-12-миристат-13- -ацетат) и циклогексимид (ингибитор синтеза белка) добавл ют в чашки та- киК образом, чтобы их результирующие концентрации стали равны 10 мкг/мл, 10; нг/мл и 1 мкг/мл соответственно. После этого культивирование продолжают проводить еще в течение 4-4,5 ч (общее врем 5-5,4 ч). Культуральную среду удал ют отсасыванием, и макрофаги , адгезированные к чашкам, лизи- pyjoT и гомогенизируют в 5 М гуанидил- тиЬцианатном растворе, содержащем 0,6% Ы-лауроилсаркозината натри и 6 мМ 1щтрата натри . Гомогенизат заг- py;kaK T в 5,7 М раствор хлорида цези , содержащий 0,1 М ЭДТУК, -и центрифугируют в течение 20 ч при 26500 об/мин с использованием ультрацептрифуги с получением общей фракции РНК в форме гранул. Гранулы раствор ют в небольшом количестве 7 М раствора мочевины, содержащего 0,35 М NaCl, 20 мМ трйс-НС (рИ 7,4) и 20 мМ ЭДТУК, и выдел ют осаждением из этанола. Получаю 159 хасг общей РНК,

Фракцию общей РНК раствор ют в 1 14Л Ю гЖ трис-HCl (рН 7,4), буфера., содержащего 1 мМ ЭДТУК (обозначаетс как ТЗ-раствор), и раствор нагревают при в течение 5 мин. Добавл ют раствор хлористого натри до результирующей концентрации 0,5 М, и раствор нанос т на колонку с олиго(лТ)-целлюравновесное состо ние по отношению к ТЭ-раствору, содержащему 0,5 М хлорис6 мкг поли(А)-и-РНК раствор ют 40 мкл буфгра 50 мМ трис-НС (рН8, содержащего 10 мМ MgClg, 10 мМ дит

тый натрий, Поли(А)-и-РНК элюируют из 55 треитола, 4 мМ пирофосфата натри .

колонки с помощью ТЭ-раствора и полу- чагот 8 М1СГ „

Поли(А)-и-РНК раствор ют в концентрации 1,-9 нг/нл в дистиллирован1 ,25 мМ каждого из трех дезоксириб нуклеотидтрифосфатов, дГТФ, дАТФ и дТТФ, 0,5 мМ дЦТФ, 167 нМ альфа-дЦТФ (удельна радиоактивность

ной воде и раствор инъектируют в ооци- ты Xenopus laevis в дозе приблизительно . 50 нл на оои;ит способом микроинъекции . Дес ть ооцитов инкубируют в 100 мкл среды Barth при 22°С в течение 24 ч. Ооциты гомогенизируют и центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант подвергают анализу на ФИО-активность определением ци- тотоксической активности по отношекгю к клеткам : L-929 мыши.

Способ измерени цитотоксической активности по отношению к клеткам

L-929 вл етс следующим.

Образец (О,1 мл) серийно разбавл ют указанной ниже средой и в каждую лунку пластинки с 96 лунками прибавл ют О,1 мл суспензии клеток L-929

( клеток/мл), содержащей актино- мицин D (2 мкг/мл). Используют минимальную питательную среду Eagle, содержащую 1% эмбриональной бычьей сыворотки . Пластинку инкубируют при

38,5°С в течение 18 ч в полностью . влажной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа,

Методики определени числа жизне- способных клеток L-929 и оценки биологической активности вл ютс такими же, как методики анализа на цитотокси- ческую активность с использованием . клеток L-M в качестве клеток-мишеней, Цитотоксическую активность по отношению к клеткам L-929, определенную в указанных выше услови х, выражают как единицы (L-929) дп того, чтобы отличать ее от цитотоксической активности по отношению к мышиным клеткам L-M,

Супернатант, полученньй так, как описано выше, обладает цитотоксичас- кой активностью 6,6 единиц (L-929) на 1 мл. Это указьюает на то, что образец поли(А)-и-РНК содержит и-РНК ФИО,

Синтез к-ДНК,

Комплементарную ДНК синтезируют с 50 использованием полученной поли(А)-и- -РИК в качестве матрицы,

6 мкг поли(А)-и-РНК раствор ют в 40 мкл буфгра 50 мМ трис-НС (рН8,3), содержащего 10 мМ MgClg, 10 мМ дитио5 треитола, 4 мМ пирофосфата натри .

треитола, 4 мМ пирофосфата натри .

1,25 мМ каждого из трех дезоксирибо- нуклеотидтрифосфатов, дГТФ, дАТФ и дТТФ, 0,5 мМ дЦТФ, 167 нМ альфа Р- -дЦТФ (удельна радиоактивность

3000 Ci (NtMonb), - 4 мкг олиго (дТ) и 120 единиц обратной транскрнптазы, полученной из врфуса птичьего миело- бластоза птиц (ВШ-i), и инкубируют при 43 С в течение 30 мин. После этого реакцию останавливают прибавлением ЭДТУК. Реакционную смесь экстрагируют смесью фенол - хлороформ (1:1) и к водной фазе прибавл ют ацетат аммони до результирующей концентрации 2,5 М. Результирующий гибрид к-ДНК-и- -РНК выдел ют из водной фазы осаждением из этанола Осадок гибрида к-ДНКри-РНК раствор ют в 10 мкл 20 мМ буфе-15 динени к окончанию дкк-ДНК (за исра трис-НС1 (рН 7,5), содержащего 5 Mf

MgClj, 10 мМ сульфата аммони , 100 мМ

хлористого кали , 0,15 мМ бетаникотинамидаденйндинуклеотида , 5 мкг

бычьего сывороточного альбумина,

0,04 мМ каждого из четырех дезоксирибон5пслеотидтрифосфатов , дГГФ, дАТФ,

дТТФ и дЦТФ, 0,9 ед, рибонуклеазы Н.

;Е. со11 и 23 ед. ДНК-полимеразы I,

ключением того, что он содержит 80 единиц терминальной дезоксинуклеоти- дилтрансферазы и Н-дГТФ вместо Р-дЦТФ) и инкубируют при 374 в те 20 чение 20 мин, осуществл присоедине ние приблизительно 10-15 остатков де зоаксигуанидиновой кислоты (дГ) к 3 -окончани м. Реакционную смесь экс р агируют смесью фенол -хлороформ и ДН

|Е, coli, и инкубируют при 12 С в тече-25 pBR 322, оканчивающуюс олиго(дГ),

35

ние 60 мин, а затем еще в течение 60 мин при 22°С дл синтеза дик-ДНК. Реакцию останавливают прибавлением ЭДТУК, ДНК-ДНК экстрагируют смесью фенол - хлороформ и выдел ют осаждением 30 из этанола.

Получение к-ДНК с олиго(дЦ)-окончанием

ДНК-ДНК раствор ют в 100 мкл 100 мМ буферного раствора какодилата натри (рН 7,2), содержащего 2 мМ СоС1д, 0,2 мМ дитиотреитола, 0,1 мМ альфа- Р-дЦТФ (удельна радиоактивность 3 Ci (ммоль) и 10 единиц терминальной дезоксинуклеотидилтрансфера- 40 зы, и инкубируют при в течение 30 мин дл достижени присоединени окончаний олиго (дЦ) к 3-окончани м ДНК-ДНК,

Реакцию останавливают прибавлением 45 ЭДТУК ДНК-ДНК,оканчивающуюс олиго(дЦ) ,

экстрагируют смесью фенол - хлороформ и выдел ют осаждением из этанола ДНК-ДНК,оканчивающуюс олиго(дЦ),

раствор ют в 10 мМ буфере трис-НС1 50 СрН 7,4), содержащем 1 мМ ЭДТУК и 100 мМ хлористьм натрий, с получением результирующей концентрации днк-ДНК, оканчивающейс олиго(дЦ), равной 2 мкг на 1 мл

выдел ют из водной фазы осаждением этанолом. Результирующую ДНК pBR 322 с присоединенными окончани ми раство р ют в том же буфере, какой был использован дл растворени олиго(дЦ)- концевой ДНК-ДНК таким образом, чтоб результирующа концентраци ДНК pBR 322 с присоединенными окончани ми бы ла равна 20 мкг/мл.

Конструирование рекомбинантных плазмид,

120 мкл раствора олиго(дЦ)-концевой к-ДНК смешивают с равным объемом раствора олиго (дГ)-концевойДНК pBR32 и смесь инкубируют последовательно при 65 °С в течение 5 ют и при 57 с в течение 120 мин дл достижени ренатурации и конструировани рекомбинантных плазмид.

Отбор организмов-хоз ев,

С помощью полученных выше рекомби нантных плазмид трансформируют штамм E.coli X 1776.

E,coli X 1766 культивируют при 37°С в 20 МП Ь-бульоиа (состав: 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого натри

и 1 г глюкозы

55

на 1 л; рН 7,2),содержащего 100 мкг/м диаминопимелиновой кислоты и 40 мкг/мл тимилина, до тех пор, пока мутность, измер ема при 600 им, не достигнет 0,5. Ктетки собирают центрифугированием при , гфомыпают 10 мл- 10 мМ буфера трис-ИС1 (рН 7,3), содержащег

Получение ДНК pBR 322, оканчивающейс олиго (дГ) .

10 мкг ДНК pBR 322 раствор ют в 100 мкл 20 MiM буфера трис-НС1 (рН

7,4), содержащего 10 мМ хлористсгс магни , 50 мМ сульфата аммони и ; 10 кг бычьего сывороточного альбумина , и прибавл ют 15 рестрикць- онной эндонуклеазы Pst I, Смесь инкубируют при 37°С в течение 1 ч. После окончани реакции реакционную смесь экстрагируют смесью фенол - хлороформ и результирующую ДНК выдел ют из водной фазы осаждением из этанола, Полученную ДНК раствор ют в 200 мкл такого же буферного раствора, кото- рьй был использован выше, дл присоединени к окончанию дкк-ДНК (за исключением того, что он содержит 80 единиц терминальной дезоксинуклеоти- дилтрансферазы и Н-дГТФ вместо Р-дЦТФ) и инкубируют при 374 в те- чение 20 мин, осуществл присоединение приблизительно 10-15 остатков де- зоаксигуанидиновой кислоты (дГ) к 3 -окончани м. Реакционную смесь экст- р агируют смесью фенол -хлороформ и ДНКpBR 322, оканчивающуюс олиго(дГ),

5

0

5

0

выдел ют из водной фазы осаждением этанолом. Результирующую ДНК pBR 322 с присоединенными окончани ми раствор ют в том же буфере, какой был использован дл растворени олиго(дЦ)- концевой ДНК-ДНК таким образом, чтобы результирующа концентраци ДНК pBR 322 с присоединенными окончани ми была равна 20 мкг/мл.

Конструирование рекомбинантных плазмид,

120 мкл раствора олиго(дЦ)-концевой к-ДНК смешивают с равным объемом раствора олиго (дГ)-концевойДНК pBR322 и смесь инкубируют последовательно при 65 °С в течение 5 ют и при 57 с в течение 120 мин дл достижени ренатурации и конструировани рекомбинантных плазмид.

Отбор организмов-хоз ев,

С помощью полученных выше рекомбинантных плазмид трансформируют штамм E.coli X 1776.

и 1 г глюкозы

5

на 1 л; рН 7,2),содержащего 100 мкг/мл диаминопимелиновой кислоты и 40 мкг/мл тимилина, до тех пор, пока мутность, измер ема при 600 им, не достигнет . 0,5. Ктетки собирают центрифугированием при , гфомыпают 10 мл- 10 мМ буфера трис-ИС1 (рН 7,3), содержащего

50 мМ хлористый кальций. Клетки снова суспеьщируют в 2 мл того же буферного раствора и оставл ют сто ть при в течение 5 мин К 0,2 мл суспензии прибавл ют О,1 мл раствора рекомби- нантных плазмид. Смесь оставл ют сто ть при в течение 15 NOTH и затем вьщерживают при 42°С в течение 2 м н, Затем гфибавл ют 0,5 мл L-бульона с добавками, провод т культивирование при встр хивании в течение 1 ч. Отбирают аликвоту культуры, нанос т на пластинку агара с L-бульоном, содержащим добавки, содержащую тетрациклин в концентрации 15 мкгУмп, и культивиру- ют при ЗУс в течение приблизительно 12 ч. Набор к-ДПК получают отбором трансформированных клеток, устойчивых к-тетрациклину,

Клонирование к-ДИК человеческого ФНОо

Трансформированные клетки, включаю щие в себ рекомбинант ные плазмиды, содержащие к-ДНК, кодирующую полипептид человеческого ФНО, отбирают из набора к-ДНК гибридизационным анали- зом с использованием фрагментов ДНК, полученных из клонированной к-ДНК, ко дирующей кроличий ФНО, в качестве пробы.

к-ДНК, кодирующую кроличий ФНО, выдел ют из рекомбинантной плазмиды рК TNF 802, Последовательность оснований представлена в табл. 3. Расщеп- л ют- рестрикционной эндонуклеазой Na I или Нае И, Отщепленные фрагменты ДНК выдел ют осаждением из эта- нола. Их подвергают электрофорезу на полиакриламидном геле дл вьщелени целевых фрагментов ДНК.

Фрагмент ДНК (299 ПоО.), соответ ствующий основани м от 285 до 583, ка показано в табл. 3, получают расщеп- лением рестрикционной эндонуклеазой Ava I (обозначают как Ava 1-фрагмент) даугой фрагмент ДНК (88 п.о,), соответствующий основани м от 33 до 120, как показано в табл. 3, получают расщеплением с помощью рестрикционной эндонуклеазы Нае II (обозначают как Нае 11-фрагмент). Ava 1-фрагмент и Нае 11-фрагмент мет т радиоактивной меткой Р. Эти меченшш фрагменты ДНК используют в качестве пробы дл проверки набора к-ДНК и отбора трансформированных клеток, имеющих плаз- М1аду, содержащую к-ДНК, кодиругадую

полипептид человеческого ФНО, коло- нар ным гибридизационным анализом в соответствии с методикой Hanahan и Meselson.

лу

с использованием Р-меченного Ava 1-фрагмента в качестве пробы при первом отборе из приблизительно 20000 клонов выбирают 43 клона. Кроме того, эти 43 выбранных клона подвергают второму отбору с использова

32.

нием Р-меченного Нае 11-фрагмента в качестве пробы.

С помощью этих анализов отбирают 6 клонов, имеющих ; екомбинантные плазмиды , сильно гибридизующиес к-ДНК, с помощью обоих фрагментов к-ДНК кроличьего ФНО.

Экспресси .

Выдел ют ДНК рекомбинантной плазмиды из 6 трансформированных организмов , а именно: плазмиды № pHTNF 1, pHTNF 4, pHTNF 5, pHTNF 13, pHTNF 22 и pHTNF 26 соответственно, Каждую из рекомбинантных плазмид ввод т в Е.со- 11 НВ101 дл получени трансформированных организмов, содержащих реком- бинантные плазмиды.

Трансформированные клетки культивируют в 50 мл LB-бульоне (состав: 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г хлористого натри на 1 л; рН 7,5) до тех пор, пока мутност культуры, измер ема при 600 им, не достигнет приблизительно 0,8.. После этого собирают приблизительно 3-5 х10 клеток. Клетки лизируют с неболь модификаци ми методики Клетки суспендируют в 1 мл 50 мМ буфера трис-НС1 (рН 8,0), содержащего 0,1% лизоцима и 30 мМ NaCl. После выстаивани в течение 30 мин в лед ной воде клетки подвергают лизису шестикратным замораживанием-размораживанием. Клеточные остатки у дал ют центрифугированием и получают просветленный лизат. Лизат, полученньй из каждого трансформированного организма, подвергают анализу на цитотоксическую активность по отношению к клеткам L-929.

Было установлено, что лизат, полученный из трансформированного организма , содержащего ттазкипу pHTNF 13, имеет цитотоксическуш активность 186,1 единицы (Ъ-929)/мл.

Определение последовательности оснований в клонированной к-ДНК.

Рекомбинантную плазмиду pHTNF 13 выдел ют так, как описано выше. .

мидную ДНК расщепл ют с помоа;ыо ре- стрикционной эидонуклеазы Pst I и выдел ют клонированную к-ДНК, введенную в вектор. После этого фрагмент клонированной к-ДНК расщепл ют различными рестрикционными эндонуклеазами, и последовательности оснований, результирующих 16 фрагментов, определ ют, по, методике Maxam-Gilbert с использованием клеток L-929 в качестве клеток- мишеней. Кроличий плазменньй ФНО предварительно разбавл ют фосфатным солевым буфером и разбавленный раствор используют в качестве контрольного образца ФНО. Как показывают представленные результаты (см. табл. 10), цито- токсическа активность полипептида - человеческого ФНО не нейтрализуетс - антителом.

Таблица 10

бразец

Антитело против кроличьего , плазменного ФНО

Цитоток- сичёска активность единиц (L-929)/мл

25

30

35

Лизат из тран- Не добавл - 186,1

сформированное лось

го организма,

содержащего

плазмиду

pHTNF 13 Добавл лось 191,0

КрОЛИЧ Ш

плазменный

РНОНе добавл лось 572,3

Добавл лось СО,1

Цитотоксическа активность показа-- на как активность в растворе первоначального образца, используемом дл испытани . П р и м ё р 5.

Получение полипептида человеческо- го ФНО в Escherichia coli,-

Экспресси под контролем промотора tac.

Клонированную к-ДНК выдел ют из рекомбинантной плазмиды pHTNF 13. 50 к-ДНК затем расщепл ют с помощью ре- стрикционной эндонуклеазы Есо R I дл отщеплени части некодирующего участка ниже участка, кодирующего ФНО. Ре- зультирующи фрагмент ДНК (приблизи- 55 тельно 1,1. т,п.о.) ввод т в больший фрагмент ДНК, полученный из плазмиды pBR 322, расщеплением рестрикционными

15

20

л

25

30

5

0 5

эндoнyклeaзa rи Pst I и Есо R 1и коц- струируют рекомбинантную плазмиду, вютючающую в себ к-ДНК ФНО и ген устойчивости к тетратдиклин у, называе- мьй рНТ 113.

к-ДНК, выделенную из рНТ 113, расщепл ют рестрикционными эндонуклеазами Ava I и Hind III и результирующий фрагмент ДНК (578 п.о.), включающий в себ большую часть участка, кд- дирующего полный полипептид человеческого ФНО (называемый ЧФНО-фрагмент), выдел ют с помощью электрофореза на полиакриламидном геле.

Фрагмент ДНК, включающий в себ участок промотора tac, выдел ют сле- дующим образом. Плазмидпую ДНК (300 мкг/pDR 540) раствор ют в 2 мл 10 MiM буфера трис-НС1 (рН 7,5), содержащего 50 мМ NaCl, 6 мМ MgCl2 и б мМ 2-меркаптоэтанол, и расщепл ют рестрикционными эндонуклеазами Есо R I .и Вага HI инкубированием при 37°С в течение 60 мин. Посл е добаБленк хло- .ристого натри до результирующей концентрации 0,3 М отщепленные фрагмен- ты ДНК вьщел ют из этанола, Фрагмент ДНК, включакоций в себ участок промотор . tac, выдел ют электрофорезом на полиакрилашздном геле с выходом 8,3 мкг.

Фрагмент промотора tac св зывают с химически синтезированным олигоде- зоксирибонуклеотидным адаптором, представленным следующе формулой:

5 -GATCCATGTCATCTTCTCGAACC 3 -GTACAGTAGAAGAGCTT;;GGGCT

Этот адаптор включает в себ инициирующий кодон ATG и последовательность оснований, соответствующую . 5 -концевой части последовательности оснований, кодирующей полный полипептид человеческого ФНО, и имеет Ват HI- и Ava I -когезивные концы. Результирующий фрагмент ДНК назьшают tac - промотор-адапторным фрагментом.

Отдельно больший фрагмент ДНК (приблизительно 4,3 т.п.о.), включающий в себ ген устойчивости к ампицил- лину (называемый фрагментом pBR 322-Амп вырезают из плазмиды pBR 322 расщеплением рестрикционны ш эндонуклеазами Hind III и Есо R I и вьщел ют гель-электрофорезом с использованием агарозы (0,7%) с низкой тe mepaтypoй разм гчени .

1 мкг ЧФНО-фрагме)та и 6 мкг фрагмента pBR 322-/-1мп раствор ют в 66 мМ

буфере трис-HCl (рН 7,6), содержащем 6,6 мМ хпористьй магний, и инкубируют при 55 с в течение 10 мин. После этого прибавл ют АТФ и дитиотреитол, соответственно до концентраций 1 и 10 мМ, прибавл ют 168 единиц Т ДНК-ли- га зы и смесь инкубируют при 22°С в течение 120 мин. Результирующий фрагмент ДНК вьщел ют экстракцией фено; лом и получают приблизительно 4 мкг. Фрагмент ДНК (0,8 мкг) св зывают с tac-промотор-адапторным фрагментом (0,3 мкг) в тех же услови х, как описано выше, за исключением того, что . используют 63 единицы Т ДИК-лигазы.

, Реакционную смесь разбавл ют в 6 раз

: дистиллированной водой и смеет-твают с

равным объемом суспензии клеток

lE.coli IM103/P-1i, обработанной каль- 20 просветленньй лизат.

Трансформированный 1М103/рНТТ26 культиви ночи в бульоне LB при

с (0,5 мп) высевают в 5 она LB и дополнительн при 37°С в течение 1 прибавл ют изопропилтозид до результирующ

10 1 мМ и культивировани в течение 4 ч. Клетки пензируют в 1 мл 50 м ( рН 8,0), содержащего и 30 мМ NaCl, и oc-j ав

15 в течение 30 мин. шесть раз повтор ют з смеси сухой лед - эта живание при , кле удал ют центрифугиров

: цием--оледующим образом. Смесь после- I довательно инкубируют в лед ной воде ; в течение 20 мин, при с течение ; 1 мин и при комнатной температуре в течение 10 мин и прибавл ют бульон LB. Смесь встр хиаают при 37°С в течение 60 ьмн. Аликвоту результирующей клеточной .суспензии нанос т на LB-araЛизат имеет цитотоксическую активность , равную 99000 единиц (Ь-929)/мл.- Эта цитотоксическа активность не нейтрализуетс антителом против кро- 25 личьего плазменного ФНО, Это подтверждает тот факт, что полипептид человеческого ФНО иммунологически не пересекаетс с кроличьим плазменным ФИО, Экспресси под контролем промоторазлагают рестрикционными эндонукле- азами Ava I и Sal I дл расщеплени на 3 фрагмента (размером приблировые пластинки, содержащие ампициллин в концентрации 25 мкг/мл, и куль- ЗО ра trp.

тивирук Т в течение ночи при 37ос, От- Рекомбинантную плазмиду рНТ 113 бирают колонии, устойчивые к ампициллину .

Один из трансформированных организмов , способный вырабатьшать полипеп- зительно 0,8, 1,3 и 2,6 к.п.о.). Фраг- тид человеческого ФНО, бып назван мент 1,3 к.п.о. - ДНК, включающий в ММ103/рИТТ26„себ большую часть участка, кодирующего полный полипептид человеческого

Обработанные кальцием ютетки E.coli фно и часть гена устойчивости к тет- IM103 получают следующим образом, д рациклину вьщел ют (обозначают как Клетки E.coli IM103 высенают в Ava I - Sal I-фрагмент) Ava I - Sal I- cH и культивируют при 37°С в течение фрагмент св зьшают со следующим, хи- ночи. 1 мл результирующей культуры мически синтезированным олигодезокси- высевают в 100 мл LB-бульона н.допол- рибонуклеотидным адаптором. Этот адап- нительно культивируют при 27°С до тех тор обозначают как адаптор 1 пор, пока мутность культуры, опреде- 5 -CGATATGTCATCTTCTCGAACC, л ема при 650 нм, не достигнет 0,6, 3 - j:ATACAGTAGAAGACCTTGGGGCT После выстаивани в течение 30 мин в лед ной воде клетки собирают центрифу- Результируюп ий фрагмент ДНК обозначает как ЧФНО-адапторный фрагмент. 50

гированием и суспендируют в 50 мл. 50 мМ раствора хлористого кальци ,, после чего вьщерживают при 0°С в течение 60 мин,Клетки собирают центрифугированием и снова суспендируют в 10 мл 50 мМ раствора хлористого кальци , содержащего 20% глицерина, и эту суспензию используют в качестве обработанной кальцием суспензии клеток E.coli IM103.

55

Отдельно фрагмент ДНК (35 п,о,), включающ Ш в себ часть участка промотора trp, отрезают от пд змиды pDR 720/P-L расщеплением рестрикционными эндонуклеазами Есо R I и Нра. I, и фрагмент ДНК св зьшают с химически синтезированным адаптором, имеющим следующую формулу:

Трансформированный организм 1М103/рНТТ26 культивируют в течение ночи в бульоне LB при 37 С, Культуру

(0,5 мп) высевают в 5 мл свежего бульона LB и дополнительно культивируют при 37°С в течение 1 ч. После этого прибавл ют изопропилбета-Б-тиогалак- тозид до результирующей концентрации

1 мМ и культивирование продолжают еще в течение 4 ч. Клетки собирают к суспензируют в 1 мл 50 мМ буфера трис-НС (рН 8,0), содержащего 0,1% лизоцима и 30 мМ NaCl, и oc-j авл ют сто ть при

в течение 30 мин. После этого шесть раз повтор ют замораживание в смеси сухой лед - этанол и размораживание при , клеточные остатки удал ют центрифугированием и получают

Лизат имеет цитотоксическую активность , равную 99000 единиц (Ь-929)/мл.- Эта цитотоксическа активность не нейтрализуетс антителом против кро- личьего плазменного ФНО, Это подтверждает тот факт, что полипептид человеческого ФНО иммунологически не пересекаетс с кроличьим плазменным ФИО, Экспресси под контролем промотора trp.

разлагают рестрикционными эндонукле- азами Ava I и Sal I дл расщеплени на 3 фрагмента (размером прибли Рекомбинантную плазмиду рНТ 113

зительно 0,8, 1,3 и 2,6 к.п.о.). Фраг мент 1,3 к.п.о. - ДНК, включающий в себ большую часть участка, кодирующе

5 -AACTAGTAC(;CMGTT(;ACGTAAAAAGGGTMT 3 -TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTTTTCCCATTAG

Св занный фpaгмe fт ДНК обозначают как фрагмент промотора trp, -

Плазмиду pBR 322 расщепл ют рест- рикционными эндонуклеазамн Есо R I и Sal I и выдел ют больший фрагмент ДНК (приблизительно 3,7 к.п.о.). Последовательным св зыванием этих трех фраг- ментов ДНК, фрагмента ЧФНО-адаптора, фрагмента промотора trp и большего фрагмента pBR 322 конструируют экспрессивную плазмиду pHTR 91. Экспрес сивную плазмиду ввод т в клетки E.coli НВ101 способом, и один из трансформированных организмов назьша- ют HBIOI/pHTR 91,TpaHcmopNMpOBaHHHM организм НВ101/рНТР 91 культивируют в течение ночи при 37°С в модифицированной среде М-9 (состав: О, 7% 1 2Н20; 0,3% 0,05% NaCl; 0,1% 2 мг/мл витамина 0,5% казамино- вой кислоты, 1 мМ О,1 мМ CaClg и 0,5% глюкозы). Культуру (0,05 мл) высевают в 5 мл той же самой среды и культивируют при 37°С в течение 1 ч. После этого прибавл ют 3-бета-индол- акриловую кислоту др результирующей концентрации 20 мкг/мл и культивирование продолжают в течение 4 ч. Клетки собирают и обрабатьшают по описанной методике и получают просветленный лизат.

Лизат имеет цитотоксическую активность 1,01-10 единиц (L-929) на 1 -мл.

Экспресси под контролем промото- гра phoS.

Полученный фрагмент Ava I - Sal I, св зывают с химически синтезированным рлигодезоксирибонуклеотидным адапто- jpoM, имею1 щм следующую последователь- йость:

5 -САТССАТСТСАТСТТСТССААСС

З -СТлСАСТАСААСАССТТССССССТ

Св занный фраг мент ДНК расщепл ют рестрикционной эндонуклеазой Ват Н I и получают фрагмент ДНК, имеющий на обоих окончани х когезивные концы Вага Н I (обозначают как фрагмент ЧФНО-Тет Вага Н I).

Отдельно плазмиду pSN 5182, содержащую ген phoS,; расщепл ют реет- рикционной эндонуклеазой НрА I и Есо R I и получают фрагмент ДНК (приблизительно 4 к.п.о.), включающий

0

5

5 5

О

0

и себ участок промотора phos и пос- ледовательность Shine-Dalgarno, rtoc- ледовательность ДНК, кодир тощую сиг- нальньш пептид и N-конце вую часть св зывающего фосфат белка, а также ген устойчивости к тетрациклину.

Этот фрагмент ДНК обозначают как фрагмент Нра I - Есо R,I, Фрагмент Нра I - Есо R I св зывают с химически синтезированным олигодезоксирибонук- леотидом-св зьшателем, имеющим следующую последовательность: 5 -CCCGGATCCGOG -3 -GGGCCTAGGCCC После этого св занный фрагмент ДНК расщепл ют рестрикционной эндо- . луклеазой Ват Н 1. Результирующий фрагмент ДНК (приблизительно 3,6 к.По о,), имеющий когезивные концы Вага Н I на обоих окончани х, обозначают как фрагмент промотор Phos Вага Н I, Тет,

Фрагмент ИФНО-Тет, Ват Н I св зывают с фрагментом промотор Phos - Вага Н I, Тет и конструируют экспрессивную плазмиду дл получени полипептида человеческого ФНО, св занного со св зывающем фосфат белком, которую называют pHTS 115, Экспрессивную плазмиду ввод т в E.coli HB-IOI по вышеописанной методике.

Одним из трансформированных организмов (HB101/PHTS 115) культивируют в 5 мл среды TG (состав: 120 мМ буфер трис-НС1, рН 7,4, содержапщй 0,2% глюкозы, 80 мМ NaCl, 20 мМ КС1, 20 1.Ш , 3 мМ Ma., 1 мМ MgCi,, 0,2 мМ СаС, 200 нМ FeCl, 20 мг/л лейцина, 20 мг/л пролина и 10 мг/л витамина В), в которой при-, сутствует КН 14)4 в концентрации 0,64 мМ, при 37°С в течение 20 ч, при встр хивании. Клетки собирают центрифугированием , - снова суспендируют в 2 мл среды TG, содержащей в концентрации 0,064 мМ, и культивируют при в течение 6 ч. Клетки собирают центрифугированием и промьшают 1 мл 10 мМ буфера трис-НС1 (рИ 7,2), содержащего 30 мМ NaCl. После этого их снова суспендируют в 0,2 m 33 мМ буфера ТРИС-НС1 (рН 7,2) и смешивают с равным объемом 33 мМ буфера трис- НС1 (рН 7-, 2), содержащего О, 1 мМ ЭДТУК и 40% сахарозы. После инкубировани при 37°С в течение 10 мин, клетки собирают, снова суспендируют в 0,4 мл охла 51;екиого 0,5 мМ раствора

MgCl, и оставл ют сто ть в лед ной воде в течение 10 мин при периодическом встр хивании. Клеточные остатк удал ют центрифугированием и получа- ют просветленный экстракт (далее обозначаетс как периплазмический экстракт ) .

Периплазмический экстракт имеет 1щтотоксйческую активность 1,3440 единиц (L-929) на 1 мл.

Молекул рный вес полипептида, имеющего цитотоксическую активность, определенный электрофорезом на полиак- риламидном геле (12,5%) с додецилсуль фатом натри , равенJ9000 дапьтон, это свидетельствует о том, что полипептид получаетс в виде соединенного белка.

Экспресси под контролем промотора PhoS.

Рекомбинантную плазмидную ДНК (pHTNF 13) расщепл ют рестрикционной :эндонуклеазой Pst I дл вырезывани .1 фрагмента ДНК (приблизительно 1,2 т,п.о.), включающего в себ к-ДНК человеческого ФИО. Фрагмент ДНК далее расщепл ют рестрикционной эвдонукле- азой ВЬе 1 и получают фрагмент ДНК .(приблизительно 0,9 т.п.о.; далее 060Означаетс как фрагмент ВЬе I - Pst I) 6 мкг фрагмента ВЬе I - Pst I раствор ют в 80 мкл 20 мМ буфера (рН 8,0), содержащего i2 мМ СаС, 12 мМ MgCl., 0,2 М NaCl, 1 мМ ЭДТУК и 0,02 единицы экзопуклёазы Bal 31, и инкубируют при 30°С в течение 30 мин дл отщеплени приблизительно 50 - .150 пар оснований с ка дого конца фрагмента ДНК. Затем концы фрагмента снова наращивают инкубированием при 37 С в течение 60 мин с 10 единицами ДНК-полимеразы I.E.coli (большой фрагмент ) в присутствии кащого из четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, дГТФ, дАТФ, дЦТФ и дТТФ, вз тых в концентрации Oj1 мМ, и 50 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина. Фрагмент ДНК с нарощенными концами расщепл ют рестрикционной эндонуклеазой ECO R I и результирующий фрагмент ДНК (приблизительно 750 и.о., имеющий тупой конец и Есо R I - лепкий конац выделЕют с выходом приблизительно 3 мкг (обозначают как Bal 31 - Есо R 1-фрагмент).

Bal 31 - Есо R 1-фрагмент св зывают с фрагментом Нра I - Есо R I

г JQ

з

20

25 30 Q Q

5

(приблизительно 4 т.п.о.), полученным из pSN 5182, и конструируют экспрессивную плазмиду, содержащую участок промотора phoS, последовательность Shine-Dalgano, последовательность ДНК, кодирующую сигнальный пептид и N- концевую часть св зьшающего фосфат белка, и последовательность ДНК, ко- дируюгцую полньй полипептид человеческого ФНО и часть его пoлипeптидa-пpe ;- шественника.

Экспрессивную плазмиду называют pHTS 37 и ввод т ее в E.coli НВ101 с получением трансформированного организма , который называют HBIOI/pHTS 37. Трансформированный организм НВ101/ /pHTS 37 культивируют и периплазмический экстракт получают-в тех же услови х .

Полученный периплазмический экстракт имеет цитотоксическую активность, равную 4,93 «10 единиц (L-929) на 1 мл.

Экстракт подвергают электрофорезу на полиакриламидном геле (12,5%) с додецилсульфатом натри . Электрофорез провод т при 35 В в течение 12 ч с использованием трис-глицинового (рН 8,3) буфера, содержащего 0,1% доде- цилсульфата натри . Белок окрашивают Кумасси бриллиантовым голубым. Две полосы белка, не наблюдавшиес в экстракте E.coli НВ101, наблюдают в положени х , соответствующих 22000 и 16500 дальтон. Отдельно гель нарезают на кусочки шириной 2 мм и калздый кусочек гел встр хивают в минимальной питательной среде Eagle, содержащей 1% зародьшевой бычьей сыворотки, при в течение ночи дл элюировани белка из гел . Карвдый элюат используют дл определени цитотоксической активности по отношению к мьш1иным клеткам L-929. В результате устанавливают, что сильна цитотоксическа активность наблюдаетс в элюате, полученном из гел , вырезанного из положени , соответствующего белку, окрашиваемому Кумасси бриллиантовым голубым , и имеющему установленный молекул рный вес, равньй 16500 дальтон.

Исход из структуры экспрессивной гшазмиды pHTS 37, делают вывод о том, что полипептид человеческого ФНО, получаемый в трансформированном организме , должен представл ть собой сли- тьш белок, включающий в себ часть св зывающего фосфат белка и полипеп

ТИД человеческого ФИО с частью его предгаественпика. Теоретический моле- кул рньй вес слитого белка рассчитан и равен приблизительно 23000 дальтон Молекул рньй вес полного нолипептида человеческого ФИО равен 17097 дальто Это исследование свидетельствует о том, что получаемый слитый белок может быть превращен в полный полипептид человеческого ФИО в клетке-хоз ине путем ограниченного гидролиза, возможно по специфическому участку (Arg-Ser), соедин юп ему полный псли- 1пептид человеческого ФИО с частью его предшественника о

Если периплазмический экстракт инкубируют с 5 мкг/мп трипсина при 37 С в течение 1 ч и реакщонную смес подвергают электрофорезу на полиакрил амидном геле с додецилсульфатом натри в описанных выше услови х, то наблюдают белковую полосу, соответствующую молекул рному весу около 22000 дальтон, котора представл ет собой слитьй белок, исчезающий при расщепл ющем действии трипсина,

П р и м е р 7, Получение модифицированного полипептида человеческого ФИО.

Экспрессивную плазмиду рНТ RD 4, содержащую ДНК,- кодирующую полипептид получающийс в результате отщеплени четырех аминокислот из N-окончани полного полипептида человеческого ФИО, конструируют таким же образом, как и экспрессивную плазмиду pHTR 91, за исключением того, что вместо адап- тора 1 используют следующий синтетический адаптор: 5 -CGATATGACC З -TATACTGGGGCT

С помощью этого синтетического адаптора последовательность оснований за которой следует инициирующий ко- дон (ATG), кодирует аминокислотную последовательность, состо щую из 151 аминокислотного остатка, вл ющейс результатом отщеплени четырех аминокислот (Ser-Ser-Ser-Arg) от N-окончани полного полипептида человеческого ФИО.

Экспрессивную плазмиду pHTRD4 ввод т в E.coli НВ101, и тpaнcфop шpoвaн ный организм культивируют в течение ночи при 37°С ц модифицированной ере- де М-9. Культуру (0,05 мл) высевают в 5 МП той ке самой среды и культивируют при в течение 1 ч. После

O

5

0

5

0

5

5 ../

0

этого прибавл ют 3-бета-1 ндолакрило- БУЮ кислоту в результир пощей концент- рации 20 мкг/мп и культивирование продолжают Б течение ночи. Клетки собирают центрифугированием и обрабатывают по той же самой методике, как описано в примере 2, и получают просветлен- ньш лизат.

Лизат цитотокспческую активность 1,1-10 единиц (L-929) на 1 мл.

П р и м е р 8. Получение полипеп- Т1-1да-предшественника человеческого ФИО в Escherichia coli,

Экспрессивную плазмиду pHTR рЗ, содержащую к-ДНК, кодирующую поли- пептид-предгаественник человеческого ФИО, конструируют следующим образом. Клонированную к-ДНК вьщел ют из ре- комбинантной плазмиды рНТ 113 двойным расщеплением рестрикционными эндо- нуклеазами Pst I и Hind III, и фрагмент к-ДНК затем дополнительно час- тично расщепл ют рестрикционкой звдо- нуклеазой Agi AI с получением фрагмента ДНК (приблизительно 820 п.о.), включающего в себ последовательность оснований, кодирующую большую часть полипептида-предшественника. Результирующий фрагмент ДНК св зьшают схимически синтезированным олигодезоксири- бонуютеотидным фрагментом, имеющим следующую формулу: 5 -CGATATGAGCA 3 -ТАТАС

Св занный фрагмент ДНК называют фрагментом Рге-ФНО.

Отдельно фрагмент ДНК, содержащий часть участка промотора trp, вырезают PI3 плазмиды pUR 720 расщеплением рестрикционной эрщонуклеазой Есо R I и Ира I, и фрагмент ДНК св зывают со следующим химически синтезирован-. / ньв-i адаптор ом

.CTAGTACGC/:AGTTCACGTAAAAAGGGTAAT 3 -TT(;ATCATGCGTTCAAGTGCATTTTTCCCATTAGC

Результирующий фрагмент ДНК св зы- вают с фрагментом Рге-ФНО и св зан- ньй фрагмент ДНК объедин ют с фрагментом ДНК (приблизительно 4,3 т.п.о.), имею111;им ген устойчивости к ампициллину , выделенньй из плазмиды pBR 322 расщеплением рестрикщшнными эндо- нуклеазами Есо К 1 и Hind III.

Экспрессивную n- ia Mn/ty pHTR РЗ конструируют по пыкк .оппсаниой методике и ввод т в К.coli. НВ101, и тран-- сформированный орт .-игплм культивируют

в течение ночи при в модифицированной среде М-9, Культуру (0,05мл) высевают в 5 мл той же самой среды и культивируют при 37 С в течение 1ч. После этого прибавл ют 3-бета-индол- акриловую кислоту с получением результирующей концентрации 20 мкг/мл и культивирование продолжают в течение ночи. Клетки собирают центрифугирова- |Q нием, получают просветленный ,

Лизат имеет цитотоксическую активность , равную 1,8-10 единиц (L-929) на 1 мл о

II р им ер 9, Получение и очистка 15 гаеописанную операцию повтор ют, Элюполипептида человеческого ФИО.

Получение в Escherichia cell.

Трансформированньш организм НВ101/ /рНТ 91 используют дл получени полиаты , имеющие цитотоксическую активность , объедин ют и концентрируют с помощью ультрафильтрации так, как опи сано выше. И, наконец, концентрат напептида человеческого ФИО. Трансформи-2о нос т на колонку (0,7x25 см) с BiOGel Р-6;-(B10-RAD) и обессоливают.

Результирующий обессоленньй образец , имеюрщй цитотоксическую а;ктив- ность, вл етс однородным с точки 25 зрени электрофоретического анализа

|рованньм организм культивируют в Tei (чение ночи при З7 с в е)ульоне LB; содержащем тетрациклин в концентрации ,12,5 «кг/мпо Культуру высевают в 10 объемов модифицированнот; среды

М-9 и культивируют при 37°С в течение 1 ч. После прибавле1ш 3-бета-индол- акриловой кислоты в результирующей концентращи 20 мкг/мл тсультивирова- ние продолжают в течение 4 ч. Клетки ЗО собирают, обрабатьгоают и получают пр О- светленный лизат. Лизат используют дп очистки полипептида челрвеческо- . го ФИО.

. , 35

Очистка ; полипептида человеческого ФИО.

Полипептид человеческого ФИО очи- щают из лизата по следующей методике. В колонку (5x20 см), набитую DEAE-Sep-40 harose CL 6В, предварительно приведенную в состо ние равновеси относи- TejibHO 20 мМ буфера трис-НС1 (рН 7,8), ввод т 1030 мл лизата. Колонку промывают 3 л того же. самого буфера, а 45 затем элюируют линейньп градиентом Nad от нул до 0,3 М в том же самом буфере со скоростью потока, равной 133 МП/ч. Элюат фракционируют по ф1 акна полиакрйламидном геле с дод сульфатом натри , и его исполь качестве очищенного полипептид веческого ФИО дл проведени а

Пример 10. Способ полу лиофилизованного полипептида ч ческого ФИО.

Раствор очищенного полипепт ловеческого ФИО используют дл чени лиофилизованного полипеп человеческого ФИО.

10 мл раствора очищенного п тида человеческого ФИО, имеюще тотоксическую активность 2, ниц (LM) смешивают с 0,1 объем NaCl, содержащего 10% человече сывороточного альбумина и 20% нита. После доведени рН раств 6,8 результирующий раствор сте ют фильтрованием через мембран roflow. По 5 мл стерильного р ра помещают в стекл нные сосуд офильно высуржвают. Каждый сос держит по 10 единиц (LM) очищ

ци м 10 мл. Фракции, обладающие цито- 50 °™пептида человеческого ФИО.

токсической активностью, собирают и объедин ют,

Вьделение цитотоксической активности на этой стадии составл ет 53%, удельна активность повышаетс приблизительно в 9 раз.

Соединенные активные фракции обессоливают и концентрируют до 1/10 объеПример 11. Получение к кроличьего ФИО.

Получение и-РНК ФИО из крол альвеол рных макрофагов.

Кроликам (массой приблизител 2,5 кг) внутривенно ввод т мер кие клетки Propioni bacterium в дозе 100 мг на кролика, и чер дней кроликов забивают. Легкие

ма ультрафильтрацией с помощью Diaflo - с использованием мембраны УМ10.

Концентрат подвергают препаративному изоэлектрофокусирующему гель-электрофорезу . Аликвоту концентрата нанос т на пластинку из полиакриламидно- го гел (0,2x10x10 см) с градиентом рН от 5,6 до 6,1, созданном с помощью Imraobiline. Электрофорез провод т при напр жении 2400 В в течение 16 ч при . Гель нарезают на куски шириной 10 мм и белок элюируют с помощью 20 мМ буфера трис-НС1 (рН 7,8), Выаты , имеющие цитотоксическую активность , объедин ют и концентрируют с помощью ультрафильтрации так, как описано выше. И, наконец, концентрат нана полиакрйламидном геле с додецил- сульфатом натри , и его используют в качестве очищенного полипептида человеческого ФИО дл проведени анализа.

Пример 10. Способ получени лиофилизованного полипептида человеческого ФИО.

Раствор очищенного полипептида человеческого ФИО используют дл получени лиофилизованного полипептида человеческого ФИО.

10 мл раствора очищенного полипептида человеческого ФИО, имеющего цитотоксическую активность 2, единиц (LM) смешивают с 0,1 объема 8% NaCl, содержащего 10% человеческого сывороточного альбумина и 20% D-ман- нита. После доведени рН раствора до 6,8 результирующий раствор стерилизуют фильтрованием через мембрану Mic- roflow. По 5 мл стерильного раствора помещают в стекл нные сосуды и ли- офильно высуржвают. Каждый сосуд содержит по 10 единиц (LM) очищенного

°™пептида человеческого ФИО.

Пример 11. Получение к-ДНК кроличьего ФИО.

Получение и-РНК ФИО из кроличьих альвеол рных макрофагов.

Кроликам (массой приблизительно 2,5 кг) внутривенно ввод т мертвые су- кие клетки Propioni bacterium acnes в дозе 100 мг на кролика, и через 8 дней кроликов забивают. Легкие нес57

колько раз промывают фосфатным солевым буфером через трубку, введеннуто в трахею животного, и собирают альвеол рные макрофаги, Из 12 кроликов получают приблизительно З Ю альвеол рных макрофагов,

Альвеол рные макрофаги суспендируют в среде R РМ1-164О, ,содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, и высевают в чашки Петри (диаметром 8 см) с плотностью клеток клеток на чашку. Их предварительно культивируют при 37 С в полностью влажной атмосфере, содержаще 5% двуокиси углерода . После предварительного культивировани , проведенного в течение 1 ч, эндотоксин (липополисахарид, полученный из E.coli), ТРА (форбол- -12-миристат-13-ацетат) и циклогек- симид (ингибитор синтеза белка) прибавл ют , таким образом, чтобы их результирующие концентрации были равны соответственно 10 мкг/мл, 10 нг/мл и 1 , Культивирование продолжают еще в течение 4-4,5 ч (общее ррем культивировани 5-5,5 ч), культураль- ную среду удал ют отсасыванием, и макрофаги , адгезированные к чашкам, ли- :аируют и гомогенизируют в 5 М растворе гуанидил-цианата содержащем. 0,6% N-лауроилсакрозината натри и 6 мМ цитрата натри .Гомогенизат вьшивают в 5,7 М раствор хлорида цези , содержащий 0,1 М ЭДТУК,. и центрифугируют в течение 20 ч при 26500 об/мин с использованием ультрацентрифуги, с получением фракции общей РНК в виде гранул . Гранулы раствор ют в небольшом количестве 7 М раствора мочевины, содержащего 0,35 М NaCl, 20 мМ трис-НС1 (рН 7,4) и 20 мМ ЭДТУК, и выдел ют осаждением из этанола. Из 12 кроликов получают 5,2 кг общей РНК. .

Фракцию общей РНК раствор ют в 2 мл раствора ТЭ, раствор нагревают при 65 С в течение 5 мин. Добавл ют раствор NaCl до результирующей концентра- 1ЩИ 0,5 М, и раствор нанос т на колонку с олиго(дТ)-целлюлозой, предварительно приведенной в равновесие по отношению к ТЭ-раствору, содержащему 0,5 М NaCl. Поли(А)-и-РНК элюируют из колонки с помощью ТЭ-раствора с выходом 314 мкг. Результирующий поли(А)- -и-РНК подверга от электрофорезу на агарозном геле (концентраци гел 1%, в присутствии 6 М мочевины, рИ 4), и фракционируют на 7 фракций в соответ

1476558

ствии с молекул рными размерами, Поли (Л)-и-РНК выдап ют и каждого фрак ционироБанного гел , расплавл его

г при 70 С в течение 10 мин с последующей последовательной экстракцией фенолом и хлороформом и осаждением из этанола . Содержание и-РИК кроличьего ФИО в поли(А)-и-РНК, выделенной из каждой

Q фрающи, определ ют и-РНК-трансл ци- онным анализом с использовагашм ооци- тов Xenopus leavis,

Более высокую концентрацию и-РНК кроличьего ФНО выдел ют из фракции,

15 соответствующей молекул рному размеру 1,6-2,7 к в (сокращенно называют обогащенной и-РНК кроличьего ФНО),

Фракцию, обогащенную и-РНК кроличьего ФНО, полученн то таким образом,

20 используют в последующих экспериментах .

Синтез к-ДНК.

к-ДПК синтезируют в следующих услови х . 4 мкг фракции обогащенной..и-РНК

25 кроличьего ФНО раствор ют в 100 мкл 50 мМ буфера трис-НС1 (рН 8,3), содержащего 10 мМ MgCl2, 70 мМ КС1, 1 мМ дитиотреитол, 0,5 мМ концентрацию каждого из следующих дезоксирибонуклео30 тидтрифосфатов: дТТФ, дЦТФ, дАТФ и дПГФ (дСТФ мет т , удельна активность 4,440 распадов в минуту нананомоль ), 3 мкг олиго(дТ).;(2-л8 единиц обратной транскриптазы, полу ,, ченной из вируса птичьего миелоблас- тоза, и инкубируют при 43°С в тече1ше 90 ьин. После этого реакцию останавливают прибавлением , Результирующий гибрид к-ДНК-и-РНК экст рагй40 РУют смесью фенол - хлороформ (1:1) и выдел ют из водной фазы осаждением из этанола Матрицу и-РНК удал ют обработкой щелочью при 65-70 С. Синтетическую одн-ДНК вьздел ют осажде45-нием из этанола.

Осадок одн-ДНК раствор ют в 40 мкл 0,1 М буфера HepeS (рН 6,9), содержащего каждый из четырех дезоксири- бонуклеотидтрифосфатов, дАТФ, дТТФ,50 дГТФ и дЦТФ, в концентрации 0,5 , 70 мМ КС1, 5 мМ MgCl, 1,5 Ш 2-мер- каптоэтанол и 8 единиц E,coli ДИК-пс- лимеразы 1 (большой фрагмент)и инкубируют при 15 С в течение 20 ч дл

ГС синтеза днп-ДНК. Реакцию останавливают прибавлением додецилсульфата нат- ри . днп-ДНК экстрагируют смесью фе- НОЛ - хлороформ и вьщел ют осаждегшем из этанола.

Результирунлцую днк-ДИК раствор ют в ЮО мкл 50 мМ раствора ацетата натри (рН 4,5), содержащего 1 мМ ZnSO, 200 мМ NaCl, 0,5% глицерин и 0,5 единшц- нуклеазы S1, и инкубируют при в течение 20 мин дл расщеплени структуры. Реакцию останавливают прибавлением ЭДТУК, Реакционную смесь экстрагируют смесью фенол - хлороформ, а затем диэтиловым эфиром , днп-ДНК выдел ют осаждением из этанола.

Получение олиго(дЦ)-концевой к-ДНК, Полученную выше днк-ДНК раствор ют в 100 мкп буфера 130 мМ какодилат натри -30 мМ трис-HSl (рН 6,8), содержащего 1 мМ CoCl, 0,1 мМ дитиотреи- тол, 0,2 мкг поли (А), 0,1 мМ Н-дЦТФ (удельна активность 5400 распадов в минуту на пикамб71ь) и 10 единиц кон- цевой дезоаксинуклеотидилтрансферазы, И инкубируют при 3 течение 20 мин дл присоединени концов оли- го(дЦ) к 3-концам днк-ДНК. Реаки 1ю останавливают прибавлением ЭДТУК. Реакционную смесь экстрагируют смесью фенол- хлороформ и затем диэтиловым эфиром, и 6лиго(дЦ)-концевую днп-ДНК выдел ют осаждением из этанола . Олиго(дЦ)-концевую днп-ДНК раствор ют в 10 1 буфере трис-НС1 (рН 7.,4), содержащем 1 мМ ЭДТУК и 100 мМ NaCl, таким образом, чтобы концентраци олиго(дЦ)-концевой днп-ДНК была равна 0,2 мкг/мп.

Получение олиго(дГ)-концевой ДНК ттазшщы pBR 322 (10 мкг).

Раствор ют в 100 мкл 20 мМ буфера трис-НС1 (рН 7,4), содержащего 10 мМ MgCl, 50 мМ (КНц.) и 10 мкг бычьего сывороточного aльбy шнa, и гфибавл ют 15 единиц рестрикционной эндонуклеазы Pst I. Смесь инкубируют рри 37 С в течение 1 ч. После прекра- , щени реакции реакционную смесь экст- рагируют смесью фенол - хлороформ, и результирующую ДНК выдел ют из водной фазы осаждением из этанола. Полученную ДНК раствор ют в 200 мкл того же самого реакционного буфера, которьш использовалс вьше, дл присоединени к концам днп-ДНК (за исключением того , что он содержит 80 единиц концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы и Н-Д1ТФ вместо Н-дЦТФ) и инкубируют при в течение 20 мин дл присоединени к концу приблизительно 10-15 остатков дГ, Реакционную смесь

0

5

экстрагируют смесью фенол - хлороформ и олиго(дГ)-концевую ДНК плазмиды pBR 322 выдел ют из водной фазы осаждением этанолом. Результирующую концевую плазмидную ДНК раствор ют в том же буфере, которьш использовалс дп растворени олиго(дЦ)-концевой днк- ДНК, таким образом, чтобы концентраци концевой плазмидной ДНК была равна 2 мкг/мл.

Конструирование рекомбинантной п-лазмиды.

50 мкл раствора олиго(дЦ)-концевой 5 к-ДНК смешивают с Ю мкл раствора оли- го(дГ)-концевой ДНК pBR 322, и смесь последовательно инкубируют при 65 с в течение 10 мин, при в течение 120 мрп1, при 45°С в течение 60 мин, при 35°С в течение 60 мин и при комнатной температуре в течение 60 мин дл достижени св зьгоани и конструировани рекомбинантнсй плазмиды.

Отбор трансформированных организмов .

Штамм E.coli X 1776 трансформируют с помощью полученной выше рекомбинантной плазмиды.

0 E.coli Х 1776 культивируют при в 20 мл бульона L, содержащего 100 мкг/мл диаминопимелиновой кислоты и 40 мкг/мп тимидина, до тех пор, пока мутнСсть, измер ема при 600 mji, не достигнет 0,5. Клетки собирают центрифугированием при и промывают 10 ivM буфером трис-НС1 (рН 7,3), содержащим 50 мМ СаС. Клетки снова суспендируют в 2 мп того же самого буфера и оставл ют сто ть при в течение 5 мин. К 0,2 МП суспензии прибавл ют О, 1- мл полученного выще раствора рекомбинантной плазмиды. Смесь оставл ют сто ть при в течение

5 15 мин и затем вьщерживают в течение 2 мин при . После этого прибавл ют 0,5 мл использованного выше бульона L с добавками и культивирование при встр хивании провод т в течение

Q 1 ч. Отбирают аликвоту культуры и нанос т ее на пластинку агара с содержащим добавки бульоном L, содержащую 15 мкг/мл тетрахщклина, и культивируют при в течение приблизительно

г 12ч, Отбирают трансфор1 нрованные ор5

0

ганизмы, устойчивые к тетрациклину, которые используют в качестве набора к-ДНК,

Гибридизационньй анализ.

Анализ с помощью гнбрндиза хии колонии пров.од т с использованием Р-ме- ченной пробы к-ДНК дл выбора в набор к-ДИК тех трансформированных организмов , которые имеют плазмиду, содержащую к-ДНК, кодир тощую кроличий ФИО. Индуктивные плюс и минус пробы Р-меченной опк-ДНК синтезируют по методике, описанной ранее, с исг пользованием н-РНК, полученной из индуктивных плюс и минус альвеол рных макрофагов, за ис1слючением того, что используют Р-дЦТФ с высокой удельной радиоактивностью, В этом испытании отбирают колонии трансформированных организмов, содержа:щих рекомби- нантные плазмиды, сильно гибридизуе- мые индуктивной плюс-пробой, но не гибридизуемые индуктивной минус-пробой . Из 20000 колоний выбирают 50 колоний .

20 из выбранных 50 колоний подвергают затем и-РНК-гибридизационно-рет- рансл ционному анализу. Плазмидную ДНК экстрагируют из каждого трансформированного организма и фиксируют на нитроцеллюлозных фильтрах после термической денатурации. К фильтру прибавл ют фракцию поли(А)-и-РНК, содер- ЗО жащую и-РНК кроличьего ФИО, и провод т инкубирование при 50°С в течение 3 ч дл достижени гибридизации. Гиб- ридизованную и-РНК выдел ют и ввод т в ооциты дл определешш того, представл ет ли собой вьщелепна и-РНК и-РНК кроличьего ФИО, В результате этого испытани обнарулшвают три колонии , имеющие плазмиды, содержащие

161476562

ЗОЙ Pst I и их размеры определ ют эле ктрофорезом на полиакриламид|юм геле . Отбирают 17 колоний трансформированных организмов, содержащих вставки к-ДНК размером не менее 1 к.п.о. Из трансфорш1роваиного организма, содержащего к-ДНК наибольшего размера (.трансформированньй организм 5Q i X 1 776/pR TNF 802; плазмида pRTNF 802) выдел ют клонированную к-ДНК и - ее последовательность оснований определ ют описываемым ниже способом.

Определение последовательности ос- (5 пований клонированной к-ДНК,

Трансформированньш организм A1776/PR TNF 802 культивируют в буль- one L, содержащем диаминопимелиновую

1ШСЛОТУ и тимидин. Клетки обрабатыва- 20 ют и получают плазмидную ДНК. ную ДНК расщепл ют рестрикционной эн- донуклеазой Pst I, очищают и получают клонированную к-ДНК. Фрагмент клонированной к-ДНК расщепл ют затем раз- 25 личными рестрикционными эвдонуклеаза-

35

ми, определ ют последовательности оснований фрагментов, отщепленных подхо- д гарми рестрикционными эндонуклеавами .

Определенна последовательность оснований представлена,в табл. 9. Установлено , что последовательность оснований с 277 по 738 основание вл етс участком, кодирующим полньй кроличий ФИО, в соответствии с Н-концевыьш и С-концевыми аминокислотными последовательност ми ФНО, очищенного из кроли- 4efi плазмы. Предполагаетс , что основани с 34 по 276 вл ютс последовак ДНК, сильно гибридизуемую с помощью дп тельностью оснований, кодирующих полии-РНК кроличьего ФНО. Фрагменты к-ДНК получают из плазмиды, содержащей К-ДНК наибольшего размера (около 750 п.о.), расщеплением с помощью рестрикционной эндонуклеазы Dde I, и используют в качестве пробы дл дальнейшего отбора. Эти фрагменты ДНК мет т Р.С использованием этих проб набор к-ДНК отбирают анализом на гиб45

пептид, необходимый дл образовани предшественника кроличьего ФНО.

Пример Т2. Вьщеление и очистка кроличьего плазменного ФНО.

Кроликам (массой тела 2,5-3,0 кг) внутривенной иньекцией ввод т по 50 мг умерщвленных сухих клеток Рго- pionibacterium acnes. Спуст 8 дней

- .-п- X ---.. iiu. д „v кролику внутривенной инъекцией ввод т

ридизацию колоний колонии трансформи-50 ° эндотоксина (липополисахарованных организмов, имеюнщх плазми-Р ВДа, полученного из E.coli). Через

ды, содержащие к-ДНК, сршьно гибриди- 2 ч из каждого кролика отбирают кровь

зуемую меченными пробами. В этом ис- сердечной пункцией. Кровь смешипытании положитачьный результат даетвают со 100 единицами гепарината кат- 98 колоний из приблизительно 60000 ко-55 Р центрифугируют при

лоний. Вьщел ютпрекомбинантнуга плаз-5000 об./мин в течение 30 мш при охмидную ДНК и вставки к-ДНК вырезаютлаждении, удал кпетхш крови и нераиз этих рекомбинантных плазмид рас-створимые соединени . От 400 кроликов

щеплением рестрикционной эндонуклеа-получают 24 л плазмы.

-

ЗО

61476562

ЗОЙ Pst I и их размеры определ ют электрофорезом на полиакриламид|юм геле . Отбирают 17 колоний трансформированных организмов, содержащих вставки к-ДНК размером не менее 1 к.п.о. Из трансфорш1роваиного организма, содержащего к-ДНК наибольшего размера (.трансформированньй организм 5Q i X 1 776/pR TNF 802; плазмида pRTNF 802) , выдел ют клонированную к-ДНК и - ее последовательность оснований определ ют описываемым ниже способом.

35

Определенна последовательность оснований представлена,в табл. 9. Установлено , что последовательность оснований с 277 по 738 основание вл етс участком, кодирующим полньй кроличий ФИО, в соответствии с Н-концевыьш и С-концевыми аминокислотными последовательност ми ФНО, очищенного из кроли- 4efi плазмы. Предполагаетс , что основани с 34 по 276 вл ютс последовадп тельностью оснований, кодирующих полительностью оснований, кодирующих поли

631

к 24 л плазмы прибавл ют ЭДТУК (;24 г) и 240 г цеолита, и смесь пере еиивают в течение 1 ч, после чего последовательно фильтруют через;три фильтра с размерами пор 3, 1 и 0,2 мкм.

; К 24 л фильтрата прибавл ют 12 л d,04 М буфера трис-НС1 (рН 7,8) и cJMecb нанос т на колонку (27x45 см) d DEAE-Sepharose CL-бВ, уравновешен- против 0,04 М буфера трис-НС1 (|рН 7,8), содержащего 0,1 М ЫаС1,Пос . Л|е этого колонку промывают 75 л буфе р трис-НС (рН 7,8), содержащего Oi, 1 М NaCl и затем 50 л 0,04 М и бу- фЬра трис-НС (рН 7,8), содержащего 0|, 15 М NaCl, после чего элюируют Oj,04 М буфером трис-НС (рН 7,2), со- д ржардим 0,18 М NaC, Элюат фракционируют на фракции по 8 л, и собирают фракции, обладающие цитотоксической а)ктивностью. Активные фракции объеди- HJ5iOT и разбавл ют равным объемом буфера трис-НС (рН 7,8). Раз- б вленньш раствор нанос т на колонку (|lGx13 см) с DEAE-Sepharose-CL-6B.Ko- л|5нку промьшают 1 л 0,04 М буфера т|)ис-НС (рН 7,8), содержащего 0,1 М ЩС, и затем элюируют 5 л 0,04 М бу- трис-НС (рН 7,2), содержащего М NaC. Элюат фракционир пот на фракции по 250 мп и фракции, облада- Ю1(ще и 1тотоксической активностью, со- CijipaioT и объедин ют,

i Активную фракцию нагревают при 6lj) С в тече1ше 30 мин и быстро охлаж- дфот до 4 С. Холодный раствор концентрируют ультрафильтрацией,

Результирующий концентрат нанос т Ы колонку (5x80 см) с Sephacry S-200, У1)авновешенную против 0,005 М фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 0,1 М NaC, и элюируют тем же са- KbjM буфером. Элюат фракционируют на фракции по 40 мл, и активные фракции собирают, объедин ют и концентрируют У4ьтрафильтра1щей,

Концентрат активной фракции, полученный гель-Фильтрацией, нанос т на колонку с Zn -халатной сефарозой, ка|к это описано ниже. Колонку (1,6х х2|0 см) наполн ют хелатной сефарозой (сИола с фиксированной иминодиуксус- нс1й кислотой), промывают 120 мл раст- acjja хлорида цинка (1 мг/мл) и уравновешивают по отношению к 0,05 М фосфатному бусреру (рН 7,4), содержащему 0,1 М NaC, После этого в колонку вво

476564

д т концентрат, полученный на предыдущей стадии, и провод т элюиро-вание тем же самым буфером. Собирают фрак- ции, не адсорбирующиес на колонке. Цитотоксическа активность почти полностью выдел етс в этих фракци х.

Активные фракции, полученные на предыдулдей стадии,концентрируют и на-. 10 нос т на колонку (1,5хУО см) с Togo- pear HW-55, полностью уравновешеннуга по отношению к 0,005 М и фосфатному Ьуферу (рН 7,4), содержащему 0,15 М NaC. Колонку элюируют тем же самым 15 буфером и собирают активные фракции. Этот образец представл ет собой очищенный кроличий плазменньй ФНО.

Пример 13.

Опредедение N-концевой и С-конце- 20 вой аминокислотных последовательностей кроличьего плазменного ФНО.

Очищенный кроличий ФНО используют да определени N-концевой и С-конце- вой аминокислотных последовательнос- 25 тей.

N-Концевую аминокислотную последовательность определ ют разложением по способу Эдмана Результирующие фе- нилтиогидантоинаминокислоты идентифи- 30 цируют жидкостной хроматографией высокого давле ш с использованием колонки Lorbax ODS.

С-Концевую аминокислотную поЬледо- ваТельность определ ют ферментативным способом с использованием карбоксипеп- тидаз. Очищенньш кроличий плазменный ФНО расщепл ют карбоксипептидазами А и Y при мол рном соотношении фермента к субстрату, равном соответственно 0 1:25 и 1:1000, Свободные аминокислоты , выдел ющиес из С-окончани кроличьего плазменного ФНО в результате двойного отщеплени , индентифицируют с помощью аминокислотного микро анали- 5 затора через соответствующие интервалы 2-180 мин после отщеплени .

Было последовательно установлено, что N-концевые и С-кокцевые аминокис- лотные последовательности кроличьего 0 плазменного ФНО вл ютс следующими

N-окончание: 8ег-А а-8ег-Аг§-А ат... С-окончание:... - Val-Tyr-Phee-C y- -I e- e-A a-Ieu

П р и М е р 14. Получение антитела против кроличьего плазменного ФНО.

Раствор ФНО, содержащий 1,9.10 единиц (L-929) очищенного кроличьего плазменного ФНО, эмульгируют с равным

объемом полного стимул тора С-рейнда, и эмульсию ввод т подкожкой И117.акцией в спину морских свинок в нескольких местах, КИБОТНЫХ иммуш зуют такш-i же способом через 1,3 и 6 недель. Кроме того, через 8 недель такое же количество очищенного кроличьего плазменного ФИО ввод т внутрибрюпашной инъектщей вместе с гелем гидроокиси алюьшни . Цельную кровь отбирают сердечной пункцией через 9 недель после первой иммунизации, центрифугируют .и.- получают антисыворотку, содержащую ан- тителз: против кроличьего плазменного ФНО.

Антисыворотку пропускают через колонку с Sepharose 4В, снабженную сывороточными белковыми компонентами нормальных кроликов. Провод операцию раза, получают очищенные антите- Аа, специфические по отношению к кро- личьему плазменному ФНО. Иммуноэле10

лючающийс в том, что осу:чествл ю1 культивирование чаповеческих макрофа РОВ вместе с липополисахаридом, полу ченным из Kscherichia coli и форбол- -12-ыиристат-13-ацетатом в присутствии циклогексимида, вьщеление из мак potparoB-фракции, содержаще мРНК фак тора некроза опухоли человека с использованием колонки с олиго(дТ)-цел люлозой, синтез на фракции мРНК одпс нитевой кДНК с использованием обратной транскриптазы, полученной из вир са миелобластоза птиц, в присутствии дГТФ, , дТТФ, дЦТФ, превращение в дйунитевую : кДНК с использованием ДНК-полимеразы I и рибонуклеазы Н, п лученных из E .coli, ,в присутствии дГТФ, дАТФ, дТДТФ, дТТФ, получение 20 двунитевой кДНК с олиго(дЦ)-хвостом при помощи концево дезоксинулеотид трансферазы в присутствии дЦТФ, обр tjoTKy плазмиды pBR 322 эндонуклеазой рестрикции Pst I и добавление оли 15

ктрофорез и методики двойной диффузии 25 то(дГ)-хвостов к расщепленной Pst I

через гель подтверждают, что это антитело образует одну полосу осадка с очищенным кроличьим плазменным ФНО,

Этот раствор антитела, разбавленный приблизительно в 60000 раз, обладает ЗО способностью нейтрализовать 50% от 500 единиц (L-929) . цито токсической активности кроличьего плазменного ФНО, а разбавленный в 1000 раз может полностью нейтрализовать 50 единиц (LM) , цитотоксической активности кроличьего плазменного ФИО,

ДНК плазмнды pBR 322 с использовани концевой дезоксинуклеотидилтрансфер зы в присутствии дГТФ, объединение двунитевой кДНК с олиго(дЦ)-хвостам с расщепленной Pst I ДНК pBR 322 с олигоСдГ)-хвостами, трансформацию п лученными рекомбинантными плазмидам штамма бактерий Escherichia сй11Х1 и отделение клонов, включающих реко бинантную плазм1-щу pHTN F-13, гибри дизацией с применением в качестве з да фрагментов Ava I или Нае II ре комбинантной плазмиды pRTN F802, ко дирующей фактор некроза опухоли кро лика, причем плазмида pPTN F-13, ко дирующа фактор некроза опухоли, вк чает следующую нуклеотидную и-амино кислотную последовательность;

Claims

Формула изобретени

Способ получени рекомбинантной плазмидной ДНК pHTN 713, кодирующей фактор некроза опухоли человека, зак-,

1102030

ATGAdCACTGAAACCATGATCCGGGACGTG HetScrThcGluSqrHehllcArgAspyal

40 I

50 I

60 I

GAGCTGGCCGAGGAGGCGCTCCCCAAGAAG GlbLcuAlaGluGluAIaLcuProLysLys

80

90

70

ACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGC ThrGlyGlyProGlnGlySerArgArgCys

0

лючающийс в том, что осу:чествл ю1 культивирование чаповеческих макрофаг РОВ вместе с липополисахаридом, полученным из Kscherichia coli и форбол- -12-ыиристат-13-ацетатом в присутствии циклогексимида, вьщеление из мак- potparoB-фракции, содержаще мРНК фактора некроза опухоли человека с использованием колонки с олиго(дТ)-целлюлозой , синтез на фракции мРНК одпс- нитевой кДНК с использованием обратной транскриптазы, полученной из вируса миелобластоза птиц, в присутствии дГТФ, , дТТФ, дЦТФ, превращение в дйунитевую : кДНК с использованием ДНК-полимеразы I и рибонуклеазы Н, полученных из E .coli, ,в присутствии дГТФ, дАТФ, дТДТФ, дТТФ, получение 20 двунитевой кДНК с олиго(дЦ)-хвостом при помощи концево дезоксинулеотид ш- трансферазы в присутствии дЦТФ, обра- tjoTKy плазмиды pBR 322 эндонуклеазой рестрикции Pst I и добавление оли5

о(дГ)-хвостов к расщепленной Pst I

ДНК плазмнды pBR 322 с использованием концевой дезоксинуклеотидилтрансфера- зы в присутствии дГТФ, объединение двунитевой кДНК с олиго(дЦ)-хвостами с расщепленной Pst I ДНК pBR 322 с олигоСдГ)-хвостами, трансформацию полученными рекомбинантными плазмидами штамма бактерий Escherichia сй11Х1776 и отделение клонов, включающих реком- бинантную плазм1-щу pHTN F-13, гибридизацией с применением в качестве зонда фрагментов Ava I или Нае II рекомбинантной плазмиды pRTN F802, кодирующей фактор некроза опухоли кролика , причем плазмида pPTN F-13, кодирующа фактор некроза опухоли, включает следующую нуклеотидную и-аминокислотную последовательность;

50 I

60 I

80

90

161476568

100 110 120

I

TTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATC LcuPheLeuSerLeoPheSerPheLeulle

130 140 ISO

GTGGCAGGCGCCДОСACG СTCTTCTGCCTG

ValAlaGlyAlaThrThrLcuPheCysLeu

160 170 180

« I) I

CTGCACTrrnGACTGATCGGCCCCCAGAGG LounicPhcGlyVnlllcGlyProGlnArg

190 . 200 210

. GAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATC GluGluPhcProArgAspLouSerLcuIle

220 230 240

AGCCCTCTGGCCCAGGCAGTCAGAtrCATCT SerProLcuAlaGlnTilaVdlArgSerScr

250 260 . 270

TCTCGAJVCCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCC ScrAirgThrProScrAspLysProValAla

280 290 300

CATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGG HisValValAlaAsnProGlnAlaGluGly

310 320 330

CAGCTCCAGTGGCTGAj-VCCGCCGGGCCAAT GlnLeuGlnTrpLeuAsnArgArgAlaAsn

34(Г 350,360

GCCCTCCTGGCCAA7GGCGTGGAGCTGAGA lilaLeuLeuAlaAsi lyValGluLeuAtg

370 300 390

GATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGXCGGC AspAsnGlnLeuValValProSerGluGly

400 410 420

CTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTC LeuT yLeulleTyBSerGlnValLcuPhe

430 440 450

AAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTG LysGlyGlnGlyCysProSerThrHisVal

4GO 470 4ПО

CTCCTCACCCACACCATCAGCGGCATCGCC LeuLeuThrHisThiTlleSerArglleAla

161476570

490 500 510 I . I

GTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTC ValSerTyrGlnThrLysValAsnLeuLou

520 530 540 t

TCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAG SerAlalleLyGSerProCysGlnArgGlu

550 560 570 I

ACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGG

ThrProGluGlyAlaGluAl«itysProTrp

580 590 600 - « I TATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTC TyrGluProIlcTyrLcuGlyGlyValPhc

610 G20 630

CAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCT GlnLcuGluLysGlyAspArgLcuSerAl.a

. 640 650 660

I GAGATCAATCGGCCCGACTATCTCGACTTT GlulleAsnArgProAspTyrLeuAspPhe

670 680 690 I I . I

CCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGG.GATC AlaGluSerGlyGlnValTyrPheGlyllc

ATTGCCCTG IIcAlaLcu

40 50 60

« « . GAGCTGGCCGAGGACGCGCTCCCC/vAGAAG GluLeuAlaGluGluAlaLeuProLysLys

70 80 90

ACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGC ThrGlyGlyProGlnGlyScrArgArgCys

. 100 110 120

IrTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATC LeuPhcLcuScrLcnPheSerPheLeuIle

130 140 150

GTGGCAGGCGCCACCACGCTCTTCTGCCTG ValAlaGlyAlaThrThtLeuPheCysLeu

16.0 170 180

CTGCACTTTGGAGTGATCGGCCCCCAGAGG LcuHisPhcGlyVallleGlyProGlnArg

1614765

190 . 200 210

GAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATC GluGluPhcPrbArgAspLcuScirLcuIle

220 230 240

AGCCCTCTGGCCCAGGCAGTCAGATCATCT ScrProLcuAlaGlnAlaValArgScrSer

250 260 270

TCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCC ScrArgThrrroScrA jpI.ynrroVnlAla

200290300

. CATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGG HisValValAlaAsnProGlnAlaGluGly

310 320 330

CAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAAT GlnLcuGlnTrpLcuAsnArgArgAlaAcn

340 350 -360

GCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGA AlaLcuLeuAlaAsnGlyValGluLcuArg

1 370 300 390

GATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGC AspAsnGlnLcuValValProScrG luGly

400 410 420

CTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTC LeuTryLcuIleTyoSerGlnValLouPhe

430 440 450

AAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTG LysGlyGlnGlyCysProSerThrHisVal

460 470 480

CTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCC LeuLcuThrHisThrlleSerArglleAla

490 500 510

GTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTC ValSerTyrGlnThrLysValAsnLcuL u

520 530 540

TCTGCCATCAAGAGCCCGTGCCAGAGGGAG SecAlallcLysSerProCysGlnArgGlu

550 5GO 570 I

ACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAUCCCTGG ThrProGluGlyAlaGluAlnLycProTrp

5ПО 590 COO

I TATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTC TyrGluProIleTyrLeuGlyGlyValPhe

31b1a7h5

,610 620 630

CAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCT GlnLcuGluLysGlyAspArgLeuSorAla

.640 650 660

GAGATCAATCGGCCCG ACTATCTCGACTTT GluIlcAsnArgProAspTyrLcuAspPhe

670 . 6QO 690

GCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATC AlaGluSerGlyGlnValTyrPheGlylle

ATTGCCCTG IleMaLeu