SU1669981A1 - Рекомбинантна плазмидна ДНК рRД 6 - источник зонда дл тестировани представителей рода FRaNcISeLLa, штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК рRД 6 - источник зонда дл тестировани представителей рода FRaNcISeLLa - Google Patents
Рекомбинантна плазмидна ДНК рRД 6 - источник зонда дл тестировани представителей рода FRaNcISeLLa, штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК рRД 6 - источник зонда дл тестировани представителей рода FRaNcISeLLa Download PDFInfo
- Publication number
- SU1669981A1 SU1669981A1 SU894644591A SU4644591A SU1669981A1 SU 1669981 A1 SU1669981 A1 SU 1669981A1 SU 894644591 A SU894644591 A SU 894644591A SU 4644591 A SU4644591 A SU 4644591A SU 1669981 A1 SU1669981 A1 SU 1669981A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- probe
- source
- recombinant plasmid
- dna
- strain
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title abstract description 7
- 241000589601 Francisella Species 0.000 title abstract description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 abstract description 9
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 abstract description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 abstract description 5
- 241000894007 species Species 0.000 abstract description 5
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 abstract description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 3
- 241000589602 Francisella tularensis Species 0.000 abstract description 2
- 229940118764 francisella tularensis Drugs 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 2
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 abstract 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 2
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000007064 DNA hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к медицинской микробиологии, генетической инженерии, биотехнологии и может быть использовано дл обнаружени представителей рода FRANCISELLA методом молекул рной гибридизации. Цель изобретени - создание штамма E. COLI, содержащего рекомбинантную плазмиду с фрагментом ДНК, комплиментарным видоспецифическому участку хромосомной ДНК FRANCISELLA TULARENSIS. Плазмида вл етс источником зонда дл обнаружени франсисел. Сконструирован штамм путем введени в E. COLI JM 103 с помощью генетической трансформации искусственно полученной рекомбинантной плазмиды PRD 6 с фрагментом ДНК, комплементарным видоспецифическому участку хромосомальной ДНК тул ремийного микроба. Плазмида вл етс источником ДНК-зонда дл обнаружени франсисел. Штамм депонирован в Музее живых культур Всесоюзного научно-исследовательского противочумного института "Микроб" под номером E. COLIJM 103PRD 6 КМ 7. 1 табл.
Description
Изобретение относитс к медицинской микробиологии, генетической инженерии , биотехнологии и может быть использовано дл обнаружени представителей рода Francisella методом молекул рной гибридизации.
Цель изобретени - создание штамма Е. coli, содержащего рекомбинантную плазмиду с фрагментом ДНК, комплементарным видоспецифическому участку хромосомаль- ной ДНК Francisella tularensls. Плазмида вл етс источником ДНК-зонда дл обнаружени франсисел.
Дл достижени поставленной цели конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pRD6, содержащую репликон вектора pUC19, по Есо Rl-сайту которого встроен фрагмент
ДНК длиной 790 п.о., комплементарный специфическому участку хромосомальной ДНК Francisella tularensis. Плазмида неконьюга- тивна, амплифицируетс при добавлении в среду хлорамфеникола.
Рекомбинантна плазмида pRD6 длиной 3476 п.о., содержит целый репликон вектора pUC19 длиной 2680 п.о.,по Есо Rl- сайту которого встроен фрагмент ДНК длиной 790 п.о. (имеющий 3 сайта расщеплени по Alul и один сайт по Cfol), комплементарный специфическому участку хромосомальной ДНК Francisella tularensls.
ДНК-зонд синтезируетс в процессе репликации рекомбинантной плазмиды за счет репликона pUC19.
(
О
ю чэ
00
Штамм-продуцент зонда получают трансформацией Е. coli IM103 плазмидой pRD6. Рекомбинантна плазмида выдел етс из продуцента на стационарной фазе роста с выходом 2-3 мг/мл.
Штамм-продуцент плэзмиды pRD6 E. coll IM103 pRD6 KM характеризуетс следующими признаками.
Морфологические. Клетки штамма в мазках 18-часовых культур имеют вид грамот- рицательных коротких полиморфных палочек размером 1-2хО,3-0,5 мкм. Неподвижны. На LB-arape в течение 18 ч при 37°С образуют колонии серовато-белого цвета. В бульоне через 18 ч вызывают помутнение среды, образуют на дне осадок. Устойчивы к ампициллину (100 мкг/мл) и стрептомицину (100 мкг/мл).
Культуральные признаки и физиолого- биохимические.Нуждаетс в пролине.тиами- не. Штамм ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, арабинозу, галактозу , маннозу, Не ферментирует лактозу. Ли- зируетс кишечными фагами Т и Avir. Клетки штамма авирулентны дл белых мышей и морских свинок при подкожном, аэрозольном и енутриконъюнктивальном заражении.
Получение плазмиды pRD6 и штамма IM103 pRD6 KM иллюстрируетс следующими примерами.
П р и м е р 1. Конструирование плазмиды pRD6.
Хромосомальную ДНК тул ремийного микроба выдел ют методом щелочного лизиса с последующей обработкой фенолом и осаждением ДНК этанолом
1 мкг вектора pUC 19 гидролизуют ре- стриктазой EcoRI (5 ед.) в течение 1 ч при 37°С в буфере, содержащем 50 мМ трис- HCI. рН 8,0, 10 мМ MgCl2, 50 мМ NaCI. Полноту гидролиза контролируют электрофорезом аликвоты (1 /10 ч.) рестрикционной смеси в 0,8%-ном агарозном геле. Реакцию останавливают при 70°С (10 мин) и ДНК осаждают из 0,3 М ацетата натри (рН 4,8) этанолом, Хромосомальную ДНК тул ремийного микроба гидролизуют EcoRI аналогично (3-4 мкг). Плазмидную и хромосо- мальную ДНК лигируют в 50 мкл буфера (50 мМ трис-HCI, рН 7,6, 10 мМ МдС1г. 0,5 мМ АТФ, 5 мМ ДДТ) в течение 10 ч при 10°С ДНК-лигазой (фаза Т4), Реакцию контролируют электрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле (1/10 ч.). Таким же количеством лигазной смеси трансформируют штамм Е. coll IM 103.
Выбор штамма обусловлен тем, что в присутствии pUC 19 он способен синтезировать фермент / -галактозидазу за счет комплементации дефектного хромосомального гена N-концевым фрагментом гена, наход щегос на плазмиде. Эта способность штамма не про вл етс в присутствии рекомбинантной плазмиды со встроенным по EcoRI сайту фрагментом ДНК, длина которого не кратна трем, вследствие сдвига рамки считывани / -галактозидазы. Клоны с такими рекомби- нантными плазмидами, не обладающие / галактозидазной активностью, могут быть отобраны на индикаторной среде с хромо- генным субстратом X-gal по отсутствию голубой окраски.
Клетки культуры E.coll IM 103, трансформированные лигазной смесью, высеивают на чашки с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина, 40 мкг/мл X-gal и 240 мкг/мл индуктора-галактозидазы ИПТГ (изо- пропил- /S-D-тиогалактопиранозида). Через
14-20 ч при 37°С на чашках вырастают голубые и белые колонии трансформантов.
Из отобранных белых рекомбинантных клонов выдел ют плазмидную ДНК, которую затем анализируют рестриктазами.
П р и м е р2.
1.Получение штамма-продуцента плазмиды pRD6.
Плазмидой pRDG трансформируют штамм Е. coli IM 103, в результате чего пол- учают продуцент плазмиды pRD6. Плазмидную ДНК выдел ют из 500 мл стационарной культуры штамма Е. coli IM 103 pRD6 методом Бирнбойма и Доли.
2.Получение радиоактивного зонда дл видоспецифического определени франсисел .
Дл получени зонда 10 мкг плазмид-- ной ДНК гидролизуют в объеме 100 мкл ре- стриктазой EcoRI (20 ед.) в течение 1 ч при
37иС в буфере, содержащем 50 мМ трис- HCI, рН 8,0, 10 мМ MgCb, 100 мМ NaCI. Полноту гидролиза плазмидной ДНК провер ют электрофорезом аликвоты рестрикционной смеси в 0,8%-ном агарозном геле. К
гидролизату добавл ют 3 мкм с удельной активностью 3000 кл/ммоль, по 2 мкл dTTP, dGTP с концентрацией 5 мМ/мл и 1 мкм (5-7 ед.) фрагмент Кленова ДНК- полимеразы 1. Смесь инкубируют при
комнатной температуре 5-10 мин и после добавлени 20 мкл 50%-ного глицерина с красител ми раздел ют электрофорезом в 5%-ном полиакриламидном геле. Положение вырезанного из плазмиды фрагмента
ДНК определ ют авторадиографией гел в течение 20-40 мин. Меченый фрагмент вырезают и элюируют из гел 0,3 М ацетатом натри в течение 2 ч при 65°С. ДНК осаждают добавлением к элюату 10 мкг т-РНК-носител и 2,5 объемов 96%-ного этанола. Осадок раствор ют в 100 мкл дистиллированной воды и используют в качестве зонда при гибридизации колоний после 5-минутного прогревани при 100°С.
3. Использование зонда дл гибридизации колоний разных видов микроорганизмов .
Клетки разных видов микроорганизмов нанос т на нитроцеллюлозные фильтры СЫНПОР с помощью стекл нных палочек.
Лизис клеток и гибридизацию при 65°С с зондом провод т следующим образом.
Фильтры с нанесенными на них колони ми помещают на фильтровальную бумагу, смоченную 0,5 н. NaOH,n выдерживают 5- 10 мин при комнатной температуре. Дл нейтрализации фильтры помещают на фильтровальную бумагу (10 мин), пропитанную раствором 0.2 М трис-HCI (рН 7,5), 1 М NaCI. После5 мин просушивани на воздухофильтры погружают на 15 мин в раствор, содержащий 300 мМ NaCI, 25 мМ Na2HP04, 50 мМ ЭДТА (р 6,8). Затем фильтры высушивают при 80° в течение 2 ч.
Провод т гибридизацию. Высушенные фильтры помещают на 1-2 ч в раствор дл предгибридизации, состо щий из б х SSC, 02% SDS, 5 х Denchardt, 100 мкг/мл ДНК из спермы лосос (однократный раствор SSC: 150 мМ NaCI, 15 мМ цитрата натри ; однократный Denchardt фикол 0.01 %, бычий сывороточный альбумин 0,01 %,поливинилпирролидон
0,01%). Из этого раствора фильтры перенос т в раствор дл гибридизации, состо щий из 4 х SSC, 0,2% SDS, 2 х Denchardt,100 мкг/мл ДНК лосос , к которому добавлен 1
мкг меченого зонда. Гибридизацию провод т при 65°С в течение 16 ч. Затем фильтры отмывают 2 раза по 30 мин при 65°С раствором , содержащим 2 х SSC, 0,2% SDS, и высушивают при 65°С. После авторадиографии
фильтров регистрируют те штаммы, которые гибридизуютс с зондом.
Результаты гибридизации приведены в таблице.
Как видно из таблицы, с зондом гибридизуютс только представители рода Franclsella, что позвол ет использовать зонд дл видоспецифического определени фран- сисел.
Claims (2)
1. Рекомбинантна плазмидна ДНК
pRD6 - источник зонда дл тестировани бактерий рода Franclsella размером 3476 п.о. и содержаща ДНК вектора pUC 19, размером 2686 п.о.; EcoRI-EcoRI-фрагмент
ДНК хромосомы F, tuiarensls штамма 10/15 размером 790 п.о.; сайты рестрикции: 3 сайта расщеплени по Alul и однин сайт по Cfol; генетические маркеры: атрг-устойчивость к ампициллину.
2. Штамм бактерий Escherichla coll KM 7. содержащий рекомбинантную плазмид- ную ДНК pRD6 - источник зонда дл тестировани бактерий рода Franclsella.
Frannsflta c.novicida
ichi a col
Г, i г (; i n i л p с ч т i к
С ГЧ1-ИЯ psciidotnbercu l
( . ГЧ1П13 «nn-rticulllic.l
(irsini.i k r i ч г гпчеп t i i
О. гsinn viuiTmrttin
V.cl nl,.r,.
Psemlum rt,i ч Teruglru 4H
Рачгourpl1 a mulcocida
К 1 t-Ьч | f | 1 РПР11П1ОМ i Л
ItucKlm Pruituc vulgaris subcllis Ч i 1 1 a parncyphi Si i , 1 I i ( v-rm cri i llriu i I l.i Ti I itmsis llriif t 11 т a jo rt us
14 I
2f
И
2:
s
2
13 i 2
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU894644591A SU1669981A1 (ru) | 1989-01-07 | 1989-01-07 | Рекомбинантна плазмидна ДНК рRД 6 - источник зонда дл тестировани представителей рода FRaNcISeLLa, штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК рRД 6 - источник зонда дл тестировани представителей рода FRaNcISeLLa |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU894644591A SU1669981A1 (ru) | 1989-01-07 | 1989-01-07 | Рекомбинантна плазмидна ДНК рRД 6 - источник зонда дл тестировани представителей рода FRaNcISeLLa, штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК рRД 6 - источник зонда дл тестировани представителей рода FRaNcISeLLa |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU1669981A1 true SU1669981A1 (ru) | 1991-08-15 |
Family
ID=21426053
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU894644591A SU1669981A1 (ru) | 1989-01-07 | 1989-01-07 | Рекомбинантна плазмидна ДНК рRД 6 - источник зонда дл тестировани представителей рода FRaNcISeLLa, штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК рRД 6 - источник зонда дл тестировани представителей рода FRaNcISeLLa |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| SU (1) | SU1669981A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997011195A1 (en) * | 1995-09-22 | 1997-03-27 | The Secretary Of State For Defence | Detection of francisella tularensis using oligonucleotide probes |
-
1989
- 1989-01-07 SU SU894644591A patent/SU1669981A1/ru active
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997011195A1 (en) * | 1995-09-22 | 1997-03-27 | The Secretary Of State For Defence | Detection of francisella tularensis using oligonucleotide probes |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Clewell et al. | Streptococcus faecalis sex pheromone (cAM373) also produced by Staphylococcus aureus and identification of a conjugative transposon (Tn918) | |
| US5443951A (en) | Species-specific oligonucleotides for bifidobacteria and a method of detection using the same | |
| Csonka et al. | Infection of Salmonella typhimurium with coliphage Mu d1 (Apr lac): construction of pyr:: lac gene fusions | |
| Murphy et al. | Evidence that the regulation of diphtheria toxin production is directed at the level of transcription | |
| Cohen et al. | Regulation of two extracellular proteases of Neurospora crassa by induction and by carbon-nitrogen and sulfur-metabolite repression | |
| US4673638A (en) | Method for detection and isolation of a microorganism | |
| FI79139B (fi) | Foerfarande foer klonande av en gen, som kodar foer ett vaermebestaendigt -amylas, in i escherichia coli och bacillus subtilis. | |
| JP2001508305A (ja) | ブドウ球菌を選択的に検出するための増殖培地 | |
| US5681716A (en) | Nucleic acid sequences from Salmonella typhi for in vitro diagnosis in foodstuffs | |
| JPS63269979A (ja) | 巨大菌からのグルコース・デヒドロゲナーゼの調製方法 | |
| SU1669981A1 (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК рRД 6 - источник зонда дл тестировани представителей рода FRaNcISeLLa, штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК рRД 6 - источник зонда дл тестировани представителей рода FRaNcISeLLa | |
| Sanzey et al. | Methods for identification of recombinants of phage lambda. | |
| Lobb et al. | Rapid plasmid analysis for identification of Edwardsiella ictaluri from infected channel catfish (Ictalurus punctatus) | |
| JP2879698B2 (ja) | 大腸菌群検出用培地 | |
| EP0108303A1 (en) | Method for detection and isolation of a microorganism | |
| US4753876A (en) | Marker genes in pseudomonad bacteria | |
| US5772996A (en) | Pharmaceutical compositions containing superoxide dismutase from Bacillus Stearothermophilus and Bacillus Caldotenax | |
| CA2419254A1 (en) | Compositions and methods for detecting target microorganisms in a sample | |
| Biel et al. | Mutations in the ilvY gene of Escherichia coli K-12 that cause constitutive expression of ilvC | |
| JPH06233687A (ja) | 組換えｄｎａ | |
| SU1615181A1 (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК рЕК-7-ДНК-зонд дл идентификации штаммов чумного микроба, несущих плазмиду пестициногенности, способ ее конструировани и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент ДНК-зонда дл идентификации штаммов чумного микроба, несущих плазмиду пестициногенности | |
| SU1677059A1 (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК pRD 100 - источник зонда дл идентификации возбудител чумы, способ ее конструировани и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент рекомбинантной плазмиды pRD 100 | |
| US4948735A (en) | System for release of proteins from microbe cells | |
| RU2037520C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк pzat1, используемая для получения днк-зонда, с помощью которого идентифицируют токсигенные штаммы возбудителя сибирской язвы, способ конструирования рекомбинантной плазмидной днк pzat1 и штамм бактерий escherichia coli, используемый для получения рекомбинантной плазмидной днк pzat1 и днк-зонда, с помощью которого идентифицируют токсигенные штаммы возбудителя сибирской язвы | |
| US7553946B2 (en) | Promoters |