SU1651787A3 - Способ получени полипептида, обладающего свойствами фактора высвобождени гормона роста - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биохи- мии, а именно синтезу полипептидов, стимулирующих высвобождение гипофиз ..ого гормона роста у животных. Цель изобретени  - упрощение способа. Способ заключаетс  в том, что проводит твердофазный синтез пептида формулы H-Tyr-Ala-Asp-Ala-ILe-Phe-Ser- -Ser-Ala-Туг-Arg-Arg-Leu-Leu-Ala- -Gln-Leu-Ala-Ser-Arg-Arg-Leu-Leu- -Gln-Glu-Leu-Leu-A a-Arp,-v, гле v -представл ет собой ОН или Н группу путем соединени  ВОС-замещенных аминокислот с подложкой из смоль:. Дл  образовани  пептида провод т последовательно блокирование и деблокирование боковой цепи, причем дл  блокировани  выбирают защитную группу в зависимости от аминокислоты на конце боковой цепи. Отщепление -защитныхi групп и отрыв полипептида от смолы провод т смесью 1,5 мл анизола, 0S5 мл метилэтилсульфида и 15 мл фтористого водорода в расчете на 1 г системы пептид-смола в течение 0,5 ч /при 0-20° С. (Л

Description

Изобретение относитс  к биохимии, а именно к синтезу пептидов, оказывающих вли ние на функцию гипофиза у людей и животных, главным образом к пептидам, стимулирующим высвобождение гормона роста гипофизом.

Целью изобретени   вл етс  упрощение способа,,

Такие пептиды могут быть синтезированы твердофазным методом.

Способ заключаетс  в том, что лабильные группы боковой цепи различных

аминокислотных фрагментов защищают с помощью подход щих защитных групп, которые преп тствуют протеканию на данном участке химической реакции до тех пор, пока защитна  группа не буг. дет полностью удалена. Традиционным приемом  вл етс  защита альфа- аминогруппы аминокислоты или фрагмента во врем  реакции системы по карбоксильной группе, после осуществл ют селективное удаление альфа-аминозащитной группы дл  про

ы

J1

ведени  последующих реакций, в соответствии с этим получают промежуточные соединени , которое включают ами нокислотные остатки, расположенные в требуемой последовательности в пептидной цепи, где к соответствующим остаткам присоединены защитные груп- пы боковой цепи, где ВОС трет-бу- тилоксикарбонил; МВПА - смола;

ОБ21 - эфиро-образующа  защищающа  группа дл  карбоксильной группы, та ка  как Asp или Glu; Bzl - бензилв гидроксилзащищающа  группа дл  Serj Хап - защищающа  группа дл  амидо- группы, такой как ксантил; TOS - защитна  группа дл  имидазольного азота

Пример 1„ Синтез пептида Ser 7, 8, 19 Ala 9, 15, 18, 28, Arg 12, 21, Leu 13,26, 27 - hGRF (1-29)- NIi2, отвечающего формуле H-Tyr-Ala, Asp-Ala- Ile-Piie S er-S er-Ala-Туг-Arg- -Arg-Leu-Leu-Ala-Glu-Leu-Ala-Ser- -Arg-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-Leu-Leu-

-Ala-Arg-NIL, осуществл ют ступенчато с использованием Beckman 990 пептидного синтеза на смоле МВНА. имею щей интервал замещени  0,35- 0,5 ммоль/г смолы Соединение ВОС- Aig (TOS) со смолой осуществл ют по общей методике, описанной в патенте США К 4292313 (Vale), с использованием КР в среде ДМФ при 60°С в тече- ние 24 ч при перемешивании В результате достигают замещение, равного 0,35 ммоль Arg на 1 г смолы

После деблокировани  и нейтрализации пептидную цепь постадийно выстраивают на смоле Деблокирование нейтрализацию и добавление каждой аминокислоты осуществл ют в соответсвии с общей методикой. Все используе мые растворители тщательно дегазирую путем продувки инертным газом, напри мер гелием или азотом, с тем, чтобы обеспечить отсутствие кислорода

Деблокирование провод т в соответствии с режимом А, мин:

60% ТФА/20% этандитиолЮ

60% ТФА/2% этандитиол15

1РА/1% этандитиол0,5

Et3N (10%) в CHgClfc0,5

МеОН0,5

Et3N (10%) в CHgClj,0,5

МеОН (дважды)0,5

CHZC12 (дважды)0,5

Операции сочетани  провод т в соо ветствии с режимом В, мин:

,«

2Q 5

™

.

35

40

0

5

ДСС1

ВОС-аминокислота50-90

МеОН-(дважды)0,5

СНгС1г (дважды)0,5

Ас20 (ЗМ) в СН2С1г15,0

.0,5

heOH0,5

CHgClg. (дважды)0,5

Описанные операции свод тс  к следующему: 1-2 ммоль ВОС-защищенной аминокислоты в среде хлористого метилена используют на 1 г смолы, до- бавл ют 1 экв, 1,0 М раствора ДСС1 в хлористом метилене в течение 2 ч В том случае, когда сочетанию подвергают BOC-Arg (TOS), используют смесь 50% ДМФ и хлористого метилена. В качестве защитной группы гидроксила боковой цепи Ser и Thr используют бензиловый эфир. Амидогруппу Asn и Gin защищают с помощью Хап в том случае, когда примен ют ДСС сочетание , это  вл етс  предпочтительным

n-Нитрофениловый эфир (ONp) можно использовать дл  активации карбоксильного конца Asn или Gin и, например , BOQ-Asn (ONp) можно подвергать конъюгированию в течение ночи с использованием 1 экв. HOBt в 50%-ной смеси ДМФ и хлористого метилена, и в этом случае ДСС не добавл ют. Дл  боковой цепи Lys в качестве защитной группы используют 2-хлор-бензилокси- карбонил (2C1-Z)0 Tos используют дл  защиты гуанидиногруппы Arg, а также имидазольного азота His, а карбоксильную группу боковой цепи Glu или Asp защищают с помощью OBZ1. Феноль- ную гидроксильную группу Туг защищают 2,6-дихлорбензилом (ДСВ). К концу синтеза получают следующую композицию: BOC-Tyr (x )-Ala-Asp(X2)- -Ala-Ile-Phe-Ser-(X3)-Ser-(X3)-Ala- - Ту г (X ) -Arg (X f)-Arg (Xr)-Leu-Leu- (X4)-Leu-Ala-Ser(X3)-Arg(X)- -Arg(X)-Leu-Leu-Gln-(X4)-Glu(Xe)- -Leu- Leu-Ala-Arg (X )-X , где X - ДСВ; Хг - OBZ1; X - Bzl, X - Xan; TOS; X - подложку - HN-смолы

Xan полностью или частично удал ют обработкой ТФА, используемой дл  деблокировани  а-амино защитной группы.

51

Дл  расщеплени  и сн ти  защитнай группы с системы пептид-смола послед нкю обрабатывают 1,5 мл анизола, 0,5 мл метилэтилсульфида и 15 мл фтористого водорода в расчете на } г системы пептид смол а в течение 0,5 ч при -20°С и в течение 0,5 ч при 0°С. Йосле удалени  HF в высоком вакууме оставшуюс  систему пептид-смола попеременно промывают сухим диэтиловым эфиром и хлороформом и затем пептид экстрагируют дегазированной 2Ы уксусной кислотой и отдел ют от смолы фильтрацией.

Затем отщепленный и лишенный защитной группы пептид раствор ют в 0-5%-ном растворе уксусной кислоты и подвергают очистке, котора  может включать стадию фильтрации через мелкозернистый гель Сефдцекс С-50

Затем пептид подвергают дополнительной очистке методом препаративной или полупрепаративной жидкостной хроматографии при высоком давлении (HPIC). Состав хроматографич - ских фракций тщательно регулируют с помощью HPIC и сливают лишь те фракции, которые имеют достаточную чистоту. Обессоливание очищенных фракций независимо проверенных на частоту достигаетс  с использованием градиента в 0,1%-ной ТФА. Затем центральный разрез подвергают лиофилиза- ции с образованием желаемого пептида имеющего чистоту выше 98%

Пример 2. Синтез пептида, имеющего ту же последовательность аминокислотных остатков, но в виде свободной кислоты, т.е. Ser 7,8,19, Ala 9,15,18,28, Arg 12,21, Leu 13, 26,27 - GPF (, отвечающего формуле:

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Ser-Ser -Ala-Tyr-Arg-Arg-Leu-Leu-Ala-Gln- -Leu-Ala-Ser-Arg-Arg-Leu-Leu-Glu- -Glu-Leu-Leu-Ala-Arg-OH, провод т ступенчатым методом с использованием пептидного синтезатора Beckman 990 на хлорметилированной смоле, имеющей интервал замещени  0,35-0,5 ммоль/г смолы.. Соединение ВОС-Arg (TOS) со смолой провод т согласно общей методике, использу  в качестве растворител  хлористый метилен , в течение 2 ч при перемешивании , добавл ют 1 экв. 2М раствора ДСС1 в хлористом метилене. В результате достигают степень замещени 

87

пор дка 0,35 ммоль Arg на г смолы, Остальные операции синтеза, включаю щие расщепление, сн тие защитной группы и очистку, провод т согласно

примеру 1.

В соответствии с анализом, выполненным методом тонкослойной хроматографии и HPIC, установлено, что

получен практически чистый пептид нового типа.

X1 может представл ть собой подход щую защитную группу дл  феноль- ной гидроксильной группы тирозина

(Туг), например, такую как тетрагид- ропнранил, трет-бутил, тритил, Bzl, CBz, -CBz и 2,6-дихлорбензил (ДСВ). Предпочтительной защитной группой  вл етс  2,6-дихлорбензил

X может представл ть собой водород, что означает отсутствие защитной группы в боковой цепи аминокислотного остатка в этом положении. Xz представл ет собой водород или подход -

щую эфирообрузующую защитную группу дл  карбоксильной группы аспаргина (Asp) или глутамина (Glu), такую как бензил (OBzI), 2,6-дихлорбензил, метил или этил

X может представл ть собой подход щую защитную группу дл  гидро- ксильном группы треонина (Tlir) или серила (Ser), например Bzl, 2,6-ди- хлорбензил и CBz. Предпочтительной

защитной группой  вл етс  Bzl,

X может представл ть собой водород , что (тодразумевает отсутствие защитной группы на гидроксильной группе. X представл ет собой водород

или подход щую защитную группу дл  амидогруппы боковой цепи Ash или глицина (Gin). Предпочтительно, така  группа представл ет собой ксан- тил (Хап).

5 X представл ет собой подход щую защитную группу дл  гуаниднно-группы аргинина (Arg), такую как нитро-TOS, CBz, адамантилоксикарбонил, а также ВОС или водород.

Выбор группы дл  защиты аминогруппы боковой цепи не имеет решающего значени  за исключением того, что обычно выбирают такую группу, котора  не удал етс  в ходе операции

по сн тию защитной группы у аминогрупп в ходе синтеза. Однако дл  некоторых аминокислот,, например гисти- дина (His), обычно нет необходимости в защите после завершени  соединени 

и в этом случае защитные группы мо- гут быть одинаковыми

X представл ет собой подход щую защитную группу дл  С-терминальной карбоксильной группы или представл е собой  корную св зь, используемую в твердофазном синтезе дл  при сое дине ни  к подложке из твердой смолы, или представл ет собой des-X1 в том слу- чае, когда осуществл ют амидирование Arg остатка по С-окончанию, В том случае, когда используетс  така  под ложка из твердой смолы, она рассмат- риваетс  как защитна  группа и, соот- ветствующие защитные группы такого типа могут быть выбраны из следую щих систем: О-СН -синтетическа  подложка, -Ш-бензгидриламин (ВНА)- синтетическа  подложка, или -NH-napa метилбензгидриламин (МВНА) - синтетическа  подложка В том случае, когда на С-окончании желательно на- личие незамещенной амидной группы используют ВНА или МВНА, поскольку расщепление непосредственно приво- дит к образованию амидной группы.

Твердофазный синтез начинаетс  С С-терминального конца пептида путем конъюгации защищенной а-амино- кислоты с подход щей смолой Такой исходный материал может быть получен путем присоединени  а-амино-защищенной аминокислоты посредством эфирной св зи к хлорметилированной смоле или гидроксиметилированной смоле, или посредством амидной св - зи к ВНА смоле или МВНА смоле.

С-Терминальна  аминокислота, защищенна  ВОС и TOS, может быть вна- чале конъюгирована с хлорметилиро- ванной смолой или с ВНА или МВНА смолой. После коньюгации ВОС-защищенной аминокислоты с подложкой из смолы а-амино-защищающую группу уда- л ют, например, путем использовани  трифторуксусной кислоты (TFA) в среде хлористого метилена или только TFA. Сн тие защитной группы провод т при температуре от 0°С до комнатной температуры.

Кажда  защищенна  аминокислота или аминокислотна  последовательност вводитс  в твердофазньй реактор в, примерно четырехкратном или более высоком избытке и коньюгирование может осуществл тьс  в среде, представл ющей соиоч смесь диметилформамлда (ДМФ) и (1:П или каждое из

д 15 20 25

30 $

40 45

50

5

указанных веществ в отдельности„ В тех случа х, когда имеет место неполное коньюгирование, операцию повтор ют до удалени  а-аминозащитной группы перед присоединением следующей аминокислоты. Степень протекани  реакции сочетани  на каждой стадии синтеза, если реакцию провод т вручную , предпочтительно регистрируетс  нингидриновой реакцией,, Реакции сочетани  могут проводитьс  в автоматическом режиме, например, в Бекманов- ском автоматическом синтезаторе 990.

После завершени  желаемой последовательности аминокислот промежуточный пептид может быть удален с подложки из смолы в результате обработки таким реагентом, как жидкий фтористый водород , который не только отщепл ет пептид от смолы, но также отщепл ет все оставшиес  защитные группы боковой цепи Х X2-, X э, X4, Xs, а также а- амин защитнук группу, с получением амидированного пептида. ВОС-защищающую группу удал ют вначале с использованием системы трифторуксусна   кислота - этачдитиол до отшеплени  пептида от смолы с помощью HF. При использовании дл  расщеплени  фтористого водорода в реакционный сосуд в качестве акцепторов ввод т анизол и метилэтилсульфид

Claims (2)

1. Формула изобретени 

   Способ получени  полипептида, обладающего свойствами фактора высвобождени  гормона роста, БКЛКГ чающий очистку конечного продукта, отлич ающий с  тем, что, с целью упрощени  способа, осуществл ют твердофазный синтез пептида фо рмулы

   H-Tyr-Ala-Ala-Ile-Phe-Ser-Ser-Ala- -Туr-Arg-Arg-Leu-Leu-Ala-Gin-Leu- -Ala-Ser-Arg-Arg-Leur Leu-Gin-Glu- -Leu-Leu-Ala-Arg-Y, где Y - ОН или Н -группа, путем соединени  ВОС-защищенных ами нокислот с МВНА или хлорметилированной смолой дл  образовани  пептида, имеющего одну защитную группу ВОС; -Туг(Х)-Ala-Asp(X2)-Ala-Ile-Phe- -Seir(X3)-Ser(X)-Ala-Tyr(X )-Arg(Xr)- -Arg(X5)-Leu-Leu-Ala-Gln(X4)-Leu- -Ala-Ser(X5)-Arg(X5)-Arg(Xf)-Leu- -Leu-Gln(X4)-Glu(X)-Leu-Leu-Ala- -Arg(Xr)-X9,

   9 1651787Ю

   где X, - 2,6-лихлорбензил,групп и отрывом пептида от полимер
2. 2. OBzl;ного носител  с помощью смеси, со

   Xj - Bzl;держащей 1.5 мл анизола, 0,5 мл ме

   X 4- ап тилэтилсульфида и 15 мл фтористого

   Xf ЮЗ; водорода в расчете на I г системы

   Х - св зь с полимерным носите- пептид - смола в течение 0,5 ч при

   лем,. с последующим отщеплением защитных