SU1591814A3

SU1591814A3 - Способ получения рекомбинантного ^-интерферона

Info

Publication number: SU1591814A3
Application number: SU864027351A
Authority: SU
Inventors: Gerkhard Bodo; Ingrid Maurer-Fogi; Edgar Falkner; Silviya Yutta Lindner
Original assignee: Boehringer Ingelheim Int
Priority date: 1985-04-27
Filing date: 1986-04-25
Publication date: 1990-09-07
Also published as: JP2566919B2; FI861748L; ZA863108B; DE3515336A1; DE3689008D1; EP0203382B1; ES554372A0; IL78604A0; HU202883B; ATE94588T1; AU5677586A; JPS61282098A; FI861748A7; IL78604A; EP0203382A2; IE61444B1; CA1340281C; ES8707554A1; AU598460B2; FI861748A0

Description

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и касается получения рекомбинантного «/-интерферона. Цель изобретения - упрощение процесса. Способ заключается в том, что проводят . гомогенизацию 8-9-часовой культуры Изобретение относится к биотехнологии и медицине, касается получения высокочистого, неиммуногенного рекомбинантного интерферона и может быть использовано в медицине и ветеринарии.

Целью изобретения является упрощение процесса.

Исследование различных ферментивных образований показывает, что состав смесей, содержащих интерферон, изменяется в зависимости от условий ферментации. В частности, количество

2

биомассы Е.сЫь, содержащей кодирующую «к-интерферон ДНК-плазмиду рЕКЗЗ, центрифугирование при 4^сС и 3000 об/мин в течение 1 ч, добавляют к экстракту сульфат аммония до 65%-ного насыщения с последующим отделением образовавшегося 'осадка, добавляют к надосадочной жидкости хлористый натрий и доводят рН до 7,5 с последующим центрифугированием в указанных условиях и диализом. Проводят двукратную хроматографию в спаренных колоннах на целлюлозе в первой колонне и связанном с носителем моноклональном антителе ЕВ 1-1 во второй колонне с элюцией связанного интерферона лимонной кислотой в этиленгликоле, доводят элюат до рН 4,5,. проводят хроматографию на катионите надосадочной жидкости с последующей элюцией слабым солевым градиентом с добавкой 0,5 М ацетата аммония, выделяют «/-интерферон лиофилизацией элюата.

(с

сл

ς©·

00

Иаи*.

компонента 1 -метионин-интерферона-а/, почти отделяющегося компонента, изменяется с продолжительностью ферментации: метионин— интерферон— ύί образовывается лишь после 8-9 ч ферментации.

Таким образом, в результате обрыва процесса ферментации через определенное время получают Препараты интерферона, которые не содержат метионининтерферон.

Особенностью способа является использование "тандемной" хроматогра-

1591814

Лии, т.е. комбинации из ПЕЛЕ-целлюлоз ной колонки и подсоединенной к ней иммуноаффинной колонки с высокоспецифичным, моноклональным антителом. Ионообменная колонка служит для уда- $ ления труднорастворимых составных частей пробы от антител колонны.

Для колонки с антителами моноклональный, очищенный, полученный из асцитной жидкости мыши анти-интерферон1дС наносят на. ВгСП-активизованную сефарозу 4В (фирма Фармация) в качестве носителя.

Испытание на интерферон, определение протеина и НРЬС анализ на обращенной фазе показывают, что в результате этой очистки получают 60-90% чистого интерферона-ο/. Наряду с олигомерной формой собранный интерферон содержит 2θ восстановленные формы со свободными 8Н-группами, димеры, тримеры, тетрамеры и кенативные мономеры. Эти компоненты могут быть охарактеризованы биологически и иммунологически как ₂5 интерферон. Часть этих компонентов можно удалить путем осаждения при рН 4,5 (аммиаком). При этом, в частности, восстанавливаются имеющиеся компоненты. с восстановленными дисульфидными' мостиками, т.е. формы со свободными δΝ-группами (компоненты 5 и 6),.Анализ этого осадка показывает, что, монбмерный интерферон удаляется лишь в незначительном количестве. ,

Для окончательной очистки примени- 3$ ют ГРЬС-аппаратуру фирмы Фармация с ΜΟΝΟ-3-колонкой типа НК10/10 (катионообменник), в которую вносят до 60 мг белка. Этот колоночный материал ·, представляет собой ионообменник высо- ¹кой проницаемости, с отличным разделительным действием и большим преимуществом, заключающимся в том, что, несмотря на относйтельно большие количества восстанавливаемого протеина,

.окончательная очистка длится лишь несколько часов, при этом используют стерилизованные буферные растворы и процесс ведут при комнатной темпера- _ туре. '

•Полученное после осаждения прозрачнре образование наносят на колонку. Особое значение при разделении ГРЬС имеет применяемый буфер. Он должен элюировать компоненты интерферона и после этого легко удаляться. Этими свойствами обладает применяемый аммоний-ацетатный буфер, который элюирует интерферон по градиентной программе., Интерферон элюируют в виде острого пика со слабо выраженными плечами. Как "плечевую" фракцию, так и более поздно элюированные компоненты отделяют от основного пика чистого интерферона. Пик чистого интерферона собирают и из'него берут аликвотные части для НРЬС-анализа, 303-гель электрофореза, определения протеина, испытания на интерферон и определе-’ ния эндотоксина.

С помощью хроматографии разделяют практически все компоненты *от главного пика и получают гомогенный интерферон, который при гель-проникающей НРЬС показывает содержание мономера свыше 99%. Обращенная фаза НРЬС показывает лишь около 1% ненативного мономера, хроматофокусировка - 2,5% ненативного мономера. ·

ΜΟΝΟ-5-колонку перед повторным применением промывают 0,5 М ПаС1+0,1 М Να-фосфата, рН=.8,0, для удаления адсорбированных примесей. Сохраняют ее в 25%-ном этаноле.

Летучий буфер можно полностью удалить' путём лиофилизации. Для это|го собранный интерферон порциями по 2 мп помещают в автоклави-_ рованные лио-ампулы (объемом 8 мл), соответственно в ампулу помещают 1 8 мг чистого интерферона. Ампулы после этого закрывают предварительно промытыми и выдерживающими давление лиопробками и охлаждают до -20°С. Лиофилизацию осуществляют при -10°С и вакууме· менее -1 мм рт.ст. После удаления буферного раствора температуру повышают до 25°С и лиофилизируют 1 ч. Вакуум сбрасывают и пробки сразу крепко прижимаются. Снабженные алю-зажима— ми ампулы хранят непосредственно после этого в хрлодидьнике или при -20°С.

В результате осуществления ферментации (относительно кратковременной) вместе с известным способом впервые стало возможно получать интерферон, который по содержанию цнтерферона более 98%, а также в отношении гомогенности, считая на различные компоненты интерферона, более чем на 95% состоит из нативного мономерного интерферона-о(.

Эта высокая степень чистоты и гомогенности позволяет получить интерферон, свободный оу солей и составных

частей буферного раствора, в твердой

6

⁵ 15918

форме. Поэтому появилась возможность хранить ^-интерферон более месяца без стабилизаторов, что для хранения, отправки и для воздействия как лекарства имеет особое значение по сравнению с всегда стабилизированными альбумином интерферонами. Даже после 11 мес хранения при 4°С состав интерферона не ухудшается.

Π р и м е р 1 (исходное Е.соХх; интерферон-с/ Арг; 28°С).

251 г кислотно-осажденной биомассы, которую хранят при 20°С, вносят в 2500 мл 1%-ной уксусной кислоты, перемешивают в течение 0,5 ч на ледяной бане и дважды в течение 1 мин гомогенизируют с помощью ультразвука типа 45/6. Полиэтиленимин добавляют до конечной концентрации 0,25%, устанавливают значение рН 10 добавлением 5 н. ИаОН и перемешивают 2 ч на ледяной бане, непосредственно после этого значения рН добавлением 5н.

НС1 устанавливают 7,50.

Центрифугируют в течение 1 ч в центрифуге СНггзС 66С. При 4°С и 3000 об/мин получают прозрачный сырой экстракт в количестве 2540 мл с содержанием интерферона 17,1x10Ι.Ε. и с содержанием протеина 5830 мг, из чего рассчитывают удельную активность, равную 3,21x10^ Ι.Ε./мг протеина. Сульфат аммония добавляют до 65%-ного насыщения (430 г/л экстракта) . Исходное хранят в течение ночи . при 4-8°С, и образовавшийся осадок в течение 1 ч центрифугируют ца центрифуге Ϊ2-21 ΗίβΤίδρεβά, ротор ΙΑ при 4°С, 1000*0 об/мин. Прозрачный раствор (3120 мл) содержит 0,7% полученного в сыром экстракте интерферона (120х хЮ* Ι.Ε.) .

Осадок вносят в 0,01 М ЫаСХ и перемешивают при 4-8°С в течение 2 ч, устанавливают значение рН 7,50 добавлением 5н. ЫаОН и центрифугируют до получения прозрачного раствора. Прозрачный раствор диализируют с помощью патрона диализа (ЫерЬгозз АХХецго, фирма Органон техника) по отношению 0,01 М ЫаСХ до 390 м осмол/л. Содержание интерферона составляет 13,Зх х10^э Ι.Ε. '(=77,6%)..

Диализат непосредственно после этого хроматографируют (тандемная хроматография) . Для предварительной колонки применяют 125 г ПЕ 52 целлюлозного порошка фирмы Ватман в тркс-ЫаСХбуфере, рН 7,5, 0,025 моль трис-НС1+ +0,2 моль ЫаСХ, что соответствчет 0,5 г колоночного материала/г биомассы. Для аффинной колонки применяют соединенный с Вг-СЫ-активированной сефарозой 4В (фирма Фармация) моноклональный анти-интерферон-1дС (ΕΒΙ I).

Ιθ Готовый коленчатый материал хранят в фосфатно-буферном растворе поваренной соли (РВ8) с азидом натрия при

4-8^рС. Перед применением колонку с антителами промывают раствором 0,1 И ^5 лимонной кислоты в 25%-ном этилгликоле и непосредственно после этого отмывают до нейтральной реакции РВ8. На грамм биомассы в случае колонки с антителами необходим объем колонки 0,220 1,0 мл. Диализированный раствор интерферона сначала прокачивают через обе колонки (предварительную колонку и колонку с антителами) и элюат контролируют измерением экстинкции при 280 нм. После нанесения раствора интерферона промывают трис-ЫаСХ-буфером, рН 7,5 до тех пор, пока количество протеина в элюате не снизится до 1/20 начального количества. Непосредственно после этого колонку с антителами отсоединяют от предварительной колонки и одну промывают трисЫаСХ-буфером, рН 7,5.

Элюирование интерферона, присоединенного к антителам, осуществляют ·

0,1 М лимонной кислотой в 25%-ном этиленгликоле, причем экстракцию алюа* та осуществляют снова при 280 нм. Пик протеина, содержащий интерферон, собирают. Получают 16,8 мл элюата с содержанием интерферона 12,3x10^ Ι.Ε. (-71,9%). .Общее количество протеина составляет 54,4 кг, из чего рассчитывают удельную "активность, равную 22,6x10⁴ Ι.Ε./мг протеина.

Для дальнейшей очистки элюат добавлением аммиака доводят до значения рН 4,5 и образовавшийся осадок отделяют. Прозрачный раствор (18,3 мл) содержит 46,3 мг протеина и 11,8х х10^ Ι.Ε. интерферона, считая на сырой протеин. Это соответствует выходу 69% (255x10⁴ Ι.Ε./мг протеина).

Для окончательной очистки применяют РРЬС-аппаратуру фирмы Фармация с ΜΟΝΟ-8-колонкой, типц НК 10/10 (катионообменник).

Полученный после осаждения прозрачный раствор вносят в колонку, ко7

8

15918'

торую предварительно промывают 0,1 М буфером - ацетатом аммония, рН 4,5-5,0, и промывают до тех пор, пока экстинкция при 280 мм не возвратится к исход->ному значению. Элюирование адсорбированного интерферона осуществляют с малым солевым градиентом в результате примешивания 0,5 М буфера - ацетата аммония, рН 4,5-5,0. Интерферон зд .элюируют в виде острого пика. "Плечевую” фракцию (К-3) и позднее элюированные компоненты (К5-К7) отделяют от главного пика чистого интерферона.

Пик чистого интерферона собирают и иэ него отбирают аликвоты для НРЬС-анализа, 8Ь5-гель-электрофореза, определения протеина, теста на Интерферон . и определения эндотоКсичностч. В"плечевой" фракции (9,1 мп) обнаруживаю·!· 20 всего 4,1 щг протеина, содержание интерферона составляет 1,33x109 Ι.Ε. (7,7%). Отсюда получают 324x10* Ϊ.Έ./

/мг протеина. Основной сбор 9,8 мл · содержит 5;18х10^ Ι..Ε. (30>3%) чистого интерферона и всего 16,1 мг протеина, отсюда удельная активность^ составляет 322x10^ Ι.Ε./мг протеина.

</-Интерферон порциями максимально по 2 мл помещают в автоклавные лиоампулы (объем 8 мл), что соответствует количеству интерферона в ампуле • 1 - 8 мг чистого интерферона. Ампулы затем закрывают предварительно промытыми и автоклавированными лио-пробками и охлаждают до -20°С. Лиофилизацию осуществляют при -10°С и вакууме менее 1 мм рт.ст. После удаления буферного’ раствора температуру увеличивают до 25^еС и продолжают лиофилизировать 1ч. Вакуум сбрасывают и пробки сразу плотно закрывают. Снабженные алю-зажимами ампулы непосредственно после этого хранят в холодильнике или .при -20^&0.

Пр им е р 2. Соединение ΕΒΙ 1-антитела с СИВТ-активированной сефарозой 4 В.

ΕΒΙ-Ι антитела сначала растворяют в 0,5 М ЫаС1/0,2 М ПаНСО_ь, рН 8,4 (как можно меньше буферного раствора) и по отношению к буферу диализируют раствор до тех пор, пока во внешнем растворе с хлоридом бария нельзя обнаружить сульфат-ионы, Необходимо сразу же полностью удалить сульфат аммония, так как аммоний-ионы мешают дальнейшему присоединению к носителю. Концентрацию протеина устанавливают после этого 5 мг/мл добавлением буферного раствора. Для нанесения используют в качестве· носителя СИВг-активированную сефарозу 4 В (Фармация). Ее предварительно промывают.. На каждые 25 мг ΕΒΙ-Ι-антитела применяют 1 г активированной сефарозы. Соединение осуществляют в указанном буфере (рН 8,4) при комнатной температуре в течение 2 ч. После этого ΕΒΙ-1-сЪфарозу по предписанию отсасывают на фильтре и промывают. В фильтрате не остается более 5% используемого.ΕΒΙ-1-антитела. Готовая ΕΒΙ-Ι-сефароза хранится в РВ5-абзиде в холодильнике.

Claims

Формула изобретения

Способ получения рекомбинатного οί-интерферона, предусматривающий суспендирование исходной биомассы Е.соН в буферном растворе, проведение процесса дезинтеграции ее в оптимальных 25 условиях, отделение целевой фракции супернатанта в центробежном поле при 4^&С, добавление в нее.сульфата аммония до 65% насыщения с последующим отделением и перерастворением осадка, 30 диализом и двукратной хроматографической очисткой на ионообменной целлюлозе, а затем на иммуносорбенте, содержащем иммобилизованные антитела, и катионите с элюцией с использовани25 ем ацетата аммония и выделением целевого продукта, отличающийс я тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве биомассы Е.соН используют 8-9-часовую культуру штамма 4θ НВ 101, содержащую кодирующую οί-интерферон ДНК-плазмиду рЕК 33, при этом дезинтеграцию биомассы проводят при рН 7,5 - 10,0 в присутствии 0,10,25%-ного полиэтиленамина ΡΕΙ-600,

45 перерастворение осадка осуществляют в 0,0ί М растворе хлористого.натрия, диализ ведут до получения раствора с осмолярностью 390-430 м осмол/л, в качестве ионообменной целлюлозы ис5θ пользуют диэтиламиноэтил-целлюлозу, затем ведут хроматографическую очистку на иммуносорбенте, содержащем иммобилизованные моноклональные антитела мыши к οί-интерферону с мол.м.

55_: 150000 Да, при этом элюцию связанного

с/антителами интерферона осуществляют

^1 раствором лимонной кислоты в

>25%-ном растворе, этиленгликоля, в-,

элюате доводят рН до 4,5 раствором

9 159Ϊ81Α ю

аммиака, отделяют образовавшийся оса- гидрофильных сульфатсодержащих полидок, а в качестве Катионита использу- меров с последующим выделением целеют сорбент -на основе монодисперсных вого продукта лиофилизацией.