SU1582990A3

SU1582990A3 - Способ получени трасформированных клеток двудольных растений

Info

Publication number: SU1582990A3
Application number: SU843701787A
Authority: SU
Inventors: Томас Фралей Роберт; Брус Хорш Роберт; Гэри Роджерс Стивн
Original assignee: Монсанто Компани (Фирма)
Priority date: 1983-01-17
Filing date: 1984-01-16
Publication date: 1990-07-30
Also published as: AU2436384A; EP0131620A4; JPS60500795A; EP0131620B1; WO1984002920A1; DE3484947D1; EP0131620A1; US8273954B1; AU559562B2

Abstract

Изобретение относитс к биотехнологии, в частности к генетической инженерии растений. Целью изобретени вл етс повышение выхода нормальных трансформированных растительных клеток. Способ заключаетс в том, что конструируют плазмиды PMON 41, PMON 113, PMON 109, расщепл ют их эндонуклеазами до образовани целевых фрагментов, лигируют полученные фрагменты с образованием промежуточного вектора PMON 120. Плазмиду PMON 128 (или любую другую плазмиду, полученную путем включени химерного гена PMON 120) ввод т в AGROBACTERIUM TU MEFACIENS,содержащие TI плазмиды. Контегративные плазмиды перенос т в растительные клетки, отбирают трансформированные растительные клетки и выращивают трансформанты на среде до образовани приростков.

Description

1

(21)3701787/30-13

(22)16.01.84

(31)458402

(32)17.01.83

(33)US

(46) 30.07.90. Бюл. № 28

(71)Монсанто Компани (US)

(72)Роберт Томас Фралей, Роберт Брус Хорш, Стивн Гэри Роджерс (US)

(53)575,224.2:577.2(088.8)

(56)Ti plasmids and Directed Genetic Engineering Molecular Biology of Plant Pumor, изд. G Kahl and G.S. Schell, 1982, p. 537-548.

(54)СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК ДВУДОЛЬНЫХ РАСТЕНИЙ

(57)Изобретение относитс к биотехно логии, в частности к генетической инженерии растений. Целью изобретени вл етс повышение выхода нормальных трансформированных растительных клеток , Способ заключаетс в том, что конструируют плазмиды рМОК 41, pMON 113, pMON 109, расщепл ют их эндонук- леазами до образовани целевых фрагментов , лигируют полученные фрагменты с образованием промежуточного вектора pMON 120. Плазмиду pMON 128 (или любую другую плазмиду, полученную путем включени химерного гена PMON120 ввод т в Agrobacterium tumefaciens, содержащие Ti плазмиды. Контегратив- ные плазмиды перенос т в растительные клетки, отбирают трансформированные растительные клетки и выращивают тран- трансформанты на среде до образовани приростков.

с

SS

(/)

Изобретение относитс к биотехнологии , в частности к генетической инженерии растений.

Целью изобретени вл етс повышение выхода нормальных трансформирован. ных растительных клеток.

Конструируют р д плазмид.

pMON 41, с правым краем Ti плазмиды нопалинового типа и 5 участком гена нопалинсинтазы (NOS), pMON l09 с 3 участком NOS гена, и селектируемым маркерным геном /Spc/Str/, который позвол ет осуществл ть селекцию клеток A. tumefaciens, содержащих коин- тегративные Ti плазмиды с химерическими генами, pMON 113, с участком ДНК, последовательность которой идентична последовательности в участке Т-ДНК Ti плазмиды октопинового типа.

Каждую плазмиду расщепл ют эндону- клеазами до получени целевого фрагмента . Лигируют полученные фрагменты и получают промежуточный вектор PMON 120.

Плазмида pMON 120 обладает следующими характеристиками.

Имеет три уникальных сайта рестрикции (Есо RI, Cla I, Hind III), реплицируетс в нормальных клетках Е. coli. Однако не реплицируетс в нормальных клетках Agrobacterium, без коинтеграции с другой плазмидой, например Ti плазмидой, котора реплицируетс в клетках Agrobacterium.

О

Несет маркерный генэ который ко- диурет фермент, придающий устойчивость к двум антибиотикам, спектино- мицину (Spc) и стрептомицину (Str). Этот ген, названный Spc/Str ген, экс- прессируетс в Е. и A. tumefa- ciena, но не в растительных клетках, не несет генов, которые кодируют устойчивость к ампициллину или тетра-ЦИКЛИНУа

Содержит последовательность, котора гомологична последовательности в участке Т-ДНК октотшнового типа Ti Гшазмиды.Ао tumefaciens. Эту последовательность называют левый внутренний гомологический (LIH) участок, Этот участок гомологичности промоти- рует акт скрещивани , в результате которого pMON 120 или така производна pMON 120, как pMON 128, образует коинтеграт с ТЈ плазмидой, если обе Плазмиды существуют внутри одной и той же клетки А. tumefaciens. По определению коинтегратигвна плазмида образуетс при простом акте скрещивани . Она содержит все последовательности ДНК, которые ранее существовали либо в Ti плазмиде, либо в плазми- де, полученной из pMON 120.

Содержит правьй крайний участок Т-ДНК нопалинового типа,, т.е. последовательность , котора способна функционировать , как один конец (дл удоб ства обозначаемый, как правьй край)

to

15

20

25

30

расщепл ют Hind III эндонуклеазой д получени различных фрагментов, вклю ча фрагмент размером 3,4 тыс, оснований , который обозначен как Hind 111-23 фрагмент. Этот фрагмент содер жит целиком NOS ген и правьй крайний участок Т-ДНК. Включают Hind III-23 фрагмент в плазмиду pBR 327. Получен ную плазмиду обозначают рНОМ 38 и расщепл ют ее, В результате получаю фрагмент размером 2,3 тыс. основани которьй содержит правый крайний уча сток нопалинового типа и 5 участок NOS гена (включа промоторный участок , 5-нетранслированньй участок и часть структурной последовательности Этот фрагмент размером 2,3 тыс. осно ваний включают в плазмиду pBR 327, которую заранее расщепл ют Hind III и Bam HI. Полученную плазмиду обозна чают рМОН 41.

Плазмида pMON 109 включает Spc/St селектируемый маркерный ген и 3 уча сток NOS гена до рМОМ 120. Ее конструируют следующим образом.

Плазмиду pMON 38 расщепл ют Rsa I в результате чего получают тупые кон цы, как указано: 5 -С TAG, CAT G,

Выдел ют фрагмент размером 1,1 ты оснований и расщепл ют Bam HI до получени фрагментов размером 720 и 400 пар оснований, каждый из которых имеет один тупой Rsa конец и липкий Bam HI конец. Эти фрагменты добавл Т-ДНК последовательности, котора пе-35 ют к двунитевой ДНК из фага М13тр8,

ренесена из Ti плазмиды и включена в хромосому растительной клетки в процессе трансформации клетки при помощи A. tumefaciens.

которую расщепл ют Stna I (котора да ет тупые концы) и Bam HI. Полученную смесь лигируют, трансформируют в клетки, Рекомбинантные фаги ДНК, коНесет ген,(включа промотор), кото 40 торые содержат фрагмент размером

рый кодирует экспрессию фермента, но- палинсин тазы (NOS), Будучи введен в растительную клетку NOS фермент катализирует продуцирование нопалина, типа опина,4

Часть коинтегративной Ti плазмиды (модифицированный участок Т-ДНК) вклю чаетс в растительный геном, т.е. только часть полученной из pMON 120 плаз- миды включаетс fe растительный геном. 5 Эта часть начинаетс с крайнего участка Т-ДНК и простираетс в одном направлении только до участка гомологичности .

Размер плазмиды pMON 120 составл ет около 8 тыс. оснований.

Нопалинового типа Ti плазмиду, обозначенную как pTi 137 плазмиду,

o

5

0

5

0

расщепл ют Hind III эндонуклеазой до получени различных фрагментов, включа фрагмент размером 3,4 тыс, оснований , который обозначен как Hind 111-23 фрагмент. Этот фрагмент содержит целиком NOS ген и правьй крайний участок Т-ДНК. Включают Hind III-23 фрагмент в плазмиду pBR 327. Полученную плазмиду обозначают рНОМ 38 и расщепл ют ее, В результате получают фрагмент размером 2,3 тыс. оснований, которьй содержит правый крайний сток нопалинового типа и 5 участок NOS гена (включа промоторный участок , 5-нетранслированньй участок и часть структурной последовательности). Этот фрагмент размером 2,3 тыс. оснований включают в плазмиду pBR 327, которую заранее расщепл ют Hind III и Bam HI. Полученную плазмиду обозначают рМОН 41.

Плазмида pMON 109 включает Spc/Str селектируемый маркерный ген и 3 участок NOS гена до рМОМ 120. Ее конструируют следующим образом.

Плазмиду pMON 38 расщепл ют Rsa I, в результате чего получают тупые концы , как указано: 5 -С TAG, CAT G,

Выдел ют фрагмент размером 1,1 тыс. оснований и расщепл ют Bam HI до получени фрагментов размером 720 и 400 пар оснований, каждый из которых имеет один тупой Rsa конец и липкий Bam HI конец. Эти фрагменты добавл 5 ют к двунитевой ДНК из фага М13тр8,

которую расщепл ют Stna I (котора дает тупые концы) и Bam HI. Полученную смесь лигируют, трансформируют в клетки, Рекомбинантные фаги ДНК, которые содержат фрагмент размером

720 пар, идентифицируют размером . вставки Bam HI-Sma 1„

Один из этих фагов обозначают как М-4. Фрагмент размером 720 пар оснований содержит 3 -нетранслированный участок (включа сигнал поли-аденили- ровани ) NOS гена и 3 участок структурной последовательности NOS гена, Фрагмент размером 720 пар оснований окружена в М-4 Eco RI и Pst I сайта- ми расщеплени , которые присутствуют в М13 шр8 ДНК.

Бактериальный транспозон Тп 7, как известно содержит Spc/Str ген, упом нутый ранее. Тп 7 транспозон содержит также ген, который вызывает у клеток хоз ина устойчивость к антибиотику триметоприму. Точное расположение и ориентаци Spc/Str гена и гена устойчивости к триметоприму в Тп 7 неизвестны. Транспозон Тп 7 выдел ют из штамма A. tumefaciens, в котором Тп 7 был включен з участок Hind III-23 плазмиды pTi T37,

Плаэмиду pGV 3106 расщепл ют Hind III и фрагменты клонируют в pBR 327 плазмиды, расщепленную Hind III; Полученные плазмиды включают в

Е, coli клетки, отбирают клетки, которые были устойчивы к ампициллину (благодар pBR 327 гену) и устойчивы к триметоприму (благодар гену Тп 7). Плазмиду, полученную из одной колонии , обозначают как pMON 31. В этой плазмиде содержитс вставка 6 тыс. оснований Hind III. Вставка содержала ген Spc/Str - устойчивости и ген устойчивости к триметоприму из Тп 7, и 3 участок гена NOS (который попал из pTi T37 плазмиды).

Размер плазмиды pMON 31 уменьшают дважды. Вначале уменьшение размера производ т за счет расщеплени плазмиды Eco P.I, удал ют фрагмент размером 850 пар оснований и осуществл ют заново сшивку крупного фрагмента. Полученную плазмиду обозначают как рМОК 53, выдел ют из трансформированных клеток, выбранных по их устойчивости к ампициллину и стрептомицину. Устойчивость к триметоприму не определ ют , Размер плазмиды pMON 53 уменьшают путем расщеплени плазмиды Cla I и удалени фрагмента размером 2 тыс. пар оснований и сшивки заново крупного фрагмента. Полученную плазмиду размером 5,2 тыс. оснований обозначают как pMON . Эта плазмида содержит Spc/Str ген.

Плазмиду pMON 54 расщепл ют Eco RI и Pst I и выдел ют фрагмент размером 4,8 тыс. оснований, содержащих Spc/Str ген. М-4 ДНК расщепл ют Eco RI и Pst I и выдел ют фрагмент размером 740 пар оснований, содержащий NOS нетранслированный участок. Эти фрагменты сшивают вместе до образовани pMON 64. Плазмиду с нужной ориентацией идентифицируют путем расщеплени Eco RI и Bam HI. Их обозначают как pMON 109.

Плазмида pMON 113 содержит участок гомологичности с pMON 120, который позвол ет pMON 120 образовывать коин- тегритивную плазмиду, если она присутствует в A, tumefaciens вместе с

o

5

0

Ti плазмидой. Участок гомологичности выбирают из Ti плазмиды октопинового -- типа. 3 Ti плазмиде он расположен вблизи левого Т-ДНК крайнего участка, внутри Т-ДНК участка Ti плазмиды. Этот участок гомологичности обозначают как левый внутренний участок гомологичности (LIH).

Участок гомологичности получают из любого типа плазмиды, способной трансформировать растительные клетки. Конструируют промежуточный вектор, который может образовывать коинтег- ративную плазмиду с тем типом плазмиды , из которой был получен участок гомологичности.

Получают Е. coli культуру с pBR - производной плазмидой, содержащей Ват-8 фрагмент Ti плазмиды октопино- вого типа. Ват-8 фрагмент размером 7,5 тыс. оснований содержит левый крайний участок и LIH участок Ti плазмиды. Ват-8 фрагмент включают в

плазмиду pBR 327, которую расщепл ют Bam HI.

Плазмиду pMON 90 расщепл ют Bgl II и фрагмент размером 2,6 тыс. основа- нии, который содержит участок LIH, но

0 не содержит левый крайний участок, выдел ют. Фрагмент размером 2,6 тыс, оснований обрабатывают полимеразой Кленова дл превращени липких концов в тупые концы и полученный фрагмент

с расщепл ют Hind III до получени фраг- мента размером 1,6 тыс. оснований (целевой фрагмент) и фрагмента размером 1 тыс. оснований. Оба фрагмента смешивают с pBR 322 плазмидой, которую

0 заранее расщепл ют Pvn II и Hind III, Полученную смесь смешивают и включают в клетки Е. coli. Клетки отбирают на устойчивость к ампициллину и провод т поиск Sma J сайта, который находитс

5 во фрагменте размером 1,6 тыс. оснований и которого нет во фрагменте раз-i мером 1 тыс. оснований. Колонию с целевой плазмидой идентифицируют и плаз МИДУ из этой колонии обозначают

0 PMCN 113,

Плазмиду pMON 41 расщепл ют Pvn I и Ват I и выдел ют фрагмент 1,5 тыс , оснований, содержащий правый крайний участок нопалинового типа и 5 участок NOS гена. Плазмиду pMON 109 расщепл ют Bam HI и Eco RI и выдел ют фрагмент 3,4 тыс. оснований, содержащий ген Spc/st и З1 участок гена NOS, Плаэмиду pMON 113 расщепл ют Pvn I и Eco RI

и выдел ют фрагмент размером 3,1 тыс. оснований, содержащий участок LIH.

Эти три фрагмента смешивают вместе и сшивают до образовани рМОМ 120, Культуру бактерий Е« coli, содержащую pMON 120, депонируют в Американской коллекции типовых культур под № 39263,

Способ применени рМОЫ 120.

Плазмида рМОМ 120 имеет три уникальных сайта расщеплени (Eco RI, Cla I и Hind III), которые пригодны дл включени любого необходимого гена . Эти сайты расщеплени расположены в участке рМОМ 120, который должен быть включен в растительный геном, так что включенный ген также будет включен в растительный геном.

Конструируют различные химерные гены, которые способны к экспрессии .бактериальных п олипсптидов и полипеп- ,тидов млекопитающихс в растительные клетки.

, Конструируют химерный ген, который (включает следующие ДНК последовательности ,

Промоторный участок и 5 нетрансли рованный участок, полученный из гена нопалинсинтазы (MOS), Структурную последовательность , полученную из гена неомицинфосфотрансферазы II (NPT П). 3 нетранслированный участок, полу- ченньй из гена NOS.

Этот химерный NOS-NPT II-NOS ген выдел ют на ДНК фрагменте, содержащем Eco RI концы. Включают его в Eco RI сайт плазмиды pMCN 120 и полученные плазмиды (с вставками химерическох о гена противоположной ориентацией) обозначают как pMON 128 и pMON 129 Плазмида 129 имеет две копии химерного гена. Каждую плазмиду исполь-. зуют дл трансформации растительных клеток. Культуру Е. coli, содержаш,ую pMON 128, депонируют в Американскую коллекцию типовых культур, Этой культуре был присвоен регистрационный

номер 39264. i

Плазмиду pMON 128 (или любую другую плазмиду, полученную путем вклю-. чени целевого гена в pMON 120) ввод т в микроорганизм, который содержит Ti плазмиду октопинового типа (или другую подход щую плазмиду)„ Подход щие микроорганизмы включают A, tume- faciens и A, rhirogenes, которые содержат Ti. или Hi плазмиды.

Плазмиду вставл ют в микроорганизм трансформации или конъюгацией с клет

5

0

5

0

5

0

5

0

5

ками, которые содержат pMON 128 или другие плазмиды, Плазмида, така как pMON 128 имеет участок, который гомологичен последовательности в Ti плаз- миде. Этот участок LIH гомологичности позвол ет осуществл ть единичный акт скрещивани , в результате которого рМСМ 128 и Ti плазмида октопинового типа объедин ютс с образованием коин тегративной плазмиды. Обычно это происходит с клеткой A, tumefaciens после того, как pMON 128 бывает включена в клетку. В другом варианте коинтегра- тивную плазмиду создают в клетке другого типа или in vitro, включают в A. tumefaciens или клетку другого типа , котора способна перенести коинте- гративную плазмиду в растительные клетки.

Плазмиду, такую как рМОМ 128, объедин ют с Ti плазмидой с получением коинтегративной плазмиды 6, Культуру A. tumefaciens GV 3111, содержащую коинтегративную плазмиду, полученную из рМОМ 128 и Ti плазмиды дикого типа pTi B653,депонируют в Американской коллекции типовых культур и присваивают регистрационный номер 39266,

Если коинтегративную Ti плазмиду включают в растительную клетку, то в растительный геном может войти любой из двух участков ДНК, Т-ДНК,участок 14 или Т-ДНК 16,

Разрабатывают альтернативный способ , в котором избегают необходимости отдел ть опухолевые клетки от неопухолевых клеток, Выдел ют некоторые мутантные штаммы A, tumefaciens, которые неспособны вызывать заболевание верхушечной галловой опухоли. Такие штаммы обычно называют безоружные Ti плазмиды. Ti или Ri плазмиды могут быть обезоружены в результате одного или более типов мутаций.

После того, как рЫОМ 128 включают в A. tumefaciens клетки, нужный акт скрещивани будет происходить в определенных участках клетки. Клетки, которые содержат коинтегративные плазмиды (независимо от того, вирулентные или обезоруженные) отбирают от других клеток, в которых скрещивание не происходит , следующим образом. Плазмида рМОМ 120 и ее производные содержат маркерный ген (Spc/str), который экс- прессируетс в A. tumefaciens. Однако эти плазмиды не реплицируютс в A. tu4 mefaciens. Поэтому spc/str маркерный

ген не наследуетс стабильно в A. tu- mefaciens, если только включенна плазмида не объединитс с другой пла- змидой, котора может реплицироватьс в A. tumefaciens. Наиболее веро тной такой комбинацией за счет участка гомологичное™ вл етс коинтеграци с Ti плазмидой. Клетки A. tumefaciens , которые содержат такую коинтег- ративную плазмиду, идентифицируют и отбирают при выращивании клеток на среде, содержащей либо Spc, либо str, либо оба вместе.

Возможен вариант, когда коинтегра- тивна Ti плазмида претерпевает по - следовательный акт скрещивани , в котором два участка L1H будут рекомби- нироватьс . Такой акт нежелателен, так как он может привести к делению ДНК между LIH участками, содержащей химерический ген. Однако это повиди- мому не приводит к серьезным затруднени м по двум причинам. Во-первых, такой акт повидимому происходит с от- носительно невысокой веро тностью, примерно около . Во-вторых, плазмиду рМОМ 120 и ее производные конструируют таким образом, что селектируемый маркерный ген (spc/str) рас- положен в области ДНК, котора будет исключена при акте скрещивани . Поэтому селективные услови , которые используютс дл идентификации и . культивировани клеток Agrobacterium, содержащих коинтегративные плазмиды, должны быть достаточно жесткими дл того, чтобы убить поколени клеток, которые претерпевают последующий акт скрещивани ,, который исключает химерический ген из Ti плазмиды.

Только один из LIH участков в ко- интегративной Ti плазмиде будет включен в растительный геном.

Эта важна особенность определ ет- с конструкцией рМОК 120 и именно она отличает эту коинтегративную плазмиду от нежелательных коинтегративных плазмид, которые получали ранее, - Участок IF; который расположен вне Т-ДНК крайних участков, не будет включен в растительный геном. Это . приводит по крайней двум важным преимуществам. Во-первых, наличие двух участков Т.Н., включенных в расти- тельный геном, может привести к актам скрещивани , которые приведут к потере включенных генов- в трансформиро -- : ванные клетки и их потомство. Во-вто

0

, 5 д

5 Q „

5

0

рых, наличие двух участков ДНК гомо-ч логичности может значительно затруднить попытки анализа ДНК вставок в растительный геном.

Клетки A. tumefaciens, которые содержат коинтегративные Ti плазмиды с химерическими генами, идентифицируют и выдел ют. Коинтегративные плазмиды включают в растительные клетки, которые подлежат трансформированию, под- вергают контактированию с ферментами, которые удал ют клеточные стенки. Это превращает растительные клетки в протопласты , которые представл ют собой жизнеспособные клетки, окруженные мембранами. Эти ферменты удал ют и протопласты начинают регенерировать материал клеточных стенок. В подхо- 1 д щий момент времени клетки A. tumefaciens (которые содержат коинтегр а- тивные Ti плазмиды с химерическими генами) смешивают с растительными про топластами. Эти клетки совместно .- культивируют в течение промежутка времени, который позвол ет A. tumefaciens инфицировать растительные клетки . После соответствующего периода совместного культивировани клетки A. tumefaciens убивают и продолжаетс рост растительных клеток.

Трансформированные растительные клетки отбирают различными способами, в зависимости от типа гена (генов), которые были включены в растительный

геном, i

Пример 1. Конструирование плазмиды pMON 41.

Используют культуру Е. coli, содержащую pBR 325 плазмиду с Hind III- 23 фрагментом pTi T37, включенным по Hind III сайту. 10 мкг плазмиды из этого клона расщепл ют 10 ед. Hind III эндонуклеазы в течение 1 ч при 37°С. Фрагмент 3,4 тыс. оснований Hind III- 23 выдел ют адсорбцией на стекл нных шариках после отделени от других Hind III фрагментов электрофорезом на 0,8%-ном агарозном геле. Выделенный 3,4 тыс. оснований Hind JII фрагмент (1,0 мкг) смешивают с 1,0 мкг плазмиды pBR 327 ДНК, которую заранее расщепл ют Hind III эндонуклеазой (2 ед., 1 ч, 37 С) и щелочной фосфа- тазой теленка (0,2 ед., 1 ч, 37°С), депротеивизируют фенолом, осаждают этанолом и повторно суспендируют в 10 мкл ТЕ (10 мМ трис НС1, рН 8 г, 1 мМ ЭДТА). Одну единицу Т4 ДНК лигазы добавл ют к фрагментированной смеси . Одну единицу определ ют, как концентрацию , достаточную дл получени более чем 90% циркул ризации одного микрограмма Hind III линеаризованной pBR 327 плазмиды за 5 мин при 22°С„ Смешанные фрагменты помещают в полный объем 15 мкл 25 мМ трис НС1 рН 8, 10 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреитола, 200 мкМ спер мидина НС1 и 0,75 мМ АТР (лигазный буфер).

Полученную смесь инкубируют при 22°С в течение 3 ч, а затем смешивают с клетками Е, coli С 600 гее А56, которые получают трансформацией путем обработки СаС12. Дл отбора трансформированные клетки распредел ют на ZB пластины с твердой средой, содержащие ампициллин при 200 мкг/мл. После инку бировани при 3.7 °С в течение 16 ч получают несколько сотен клонов. Плаз- мидные мини-препараты выдел ют из 24 клонов и полученные аликвоты плазмид- ной ДНК (0,1 мкг) расщепл ют Hind III

дл того, чтобы продемонстрировать наличие 3,4 тыс. оснований Hind III фрагмента, Однако из плазмид демонстрируют ожидаемую структуру и обозначают pMON 38, ....

ДНК получают с помощью тритон Х-10 лизиса и градиента CsCl, 50 мкг MON 38 ДНК расщепл ют Hind III и Bam HI (50.,ед. кажда , 2ч, 37°С), и Hind Ill- Bam HI фрагмент размером 2,3 тыс. оснований выдел ют. Выделенный фрагмент (1 мкг) смешивают с 1 мкг фрагмента Hind Ill-Bam HI размером 2,9 тыс, оснований pBR 327 вектора. После лиги ровани (Т4 ДНК лигаза, 2 ед.) и трансформации Е. coli клеток получают 50 ампицилинустойчивьк колоний. ДНК из двенадцати плазмидных мини-препара тов расщепл ют Hind III и Bam HI дл установлени наличи фрагмента размером 2,3 тыс, оснований. Одну плаз- мзаду нужной структуры выбирают и обозначают pMON 41,

Пример 2. Тридцать мкг плазмиды pHON 38 расщепл ют Psa I (30 ед. 2 ч, 37°С) и 1100 пар оснований Rsal) фрагмент выдел ют после разделени электрофорезом на агарозиом геле, использу метод стекл нных шариков, Raa I - Rsa I фрагмент 1100 пар осно- ваний (1 мкг) расщепл ют 2 ед. Ваш HI эндонуклеазы и Bam HI инактивируют нагреванием. Эту ДНК смешивают с 0,2 мкг фага М13мр8 RF ДНК,, который

0

5

0

0 5

предварительно расщепл ют Sma Bam HI (каждой по 2 ед. 1 ч, и 0,2 ед. тел чей щелочной фосфатазы) После сшивки со 100 ед. Т4 ДНК лигазы и трансформации Е. coli J Й101 клеток , трансформированные клетки смешивают с м гким агаром и высевают в чашки в услови х, которые позвол ют

идентифицировать рекомбинантный фаг. Отобрали двенадцать клеток, продуцирующих рекомбинантные фаги,и получают мини-препарат RF плазмид, RF ДНК расщепл ют Ват НГ и Sma I дл доказательства наличи Rsa I - Bam HI фрагмента размером 720 пар оснований. Одну из рекомбинантных RF ДНК, несущую . нужный фрагмент, обозначают М13 мр8 М-4.

Пример 3. Двадцать мкг плазмиды pGV 3106 расщепл ют Hind III эндонуклеазой (20 ед., 2 ч, 37°С) и смешивают с 2 мкг pBR 327 расщепленной Hind III, После лигировани (Т

5 ДНК лигаза, 2 ед,) и трансформации Е. coli клеток, как описано ранее получают одну колонию, устойчивую к триметоприму (100 мкг/мл) и ампициллину . Обработка плазмидной ДНК из этой клетки демонстрирует наличие Hind III фрагмента размером 6 тыс. оснований. Эту плазмиду обозначают рМОМ 31,

Плазмиду pMON 31 расщепл ют Eco RI эндонуклеазой (1 ед., 1 ч, 37 С), Эн- донуклеазу инактивируют нагреванием (10 мин, 70°С), Плазмидный фрагмент размером 8,5 тыс. оснований рецирку- лируют в реакции лигировани 100 мкл (Т4 ДНК лигаза, 1 ед.) и используют дл трансформации клеток Е. coli с отбором устойчивых к ампициллину и стрептомицину (25 мкг/мл) колоний, Плазмидный мини-препарат ДНК из шести клонов расщепл ют Eco RI дл определени потери фрагмента 850 пар- оснований. Одну плазмиду, у которой не было Eco RI фрагмента 850 пар оснований обозначают рМОМ 53, Эту плаз, миду ввод т в Е. coli GM42 дам-клетки (Balectal, 1979) описанной трансформацией .

Плазмиду рМОМ 53 (0,5 мкг) из мини-препарата , полученного из клеток, расщепл ют Cla I и рециркулируют в разбавленном растворе. После трансформации Е. coli CM42 клеток и отбора устойчивых к ампициллину и спекти- номицину (50 мкг/мл) клонов, получают

5

п тьдес т колоний. Расщепление плаз- мидных мини-препаратов ДНК из шести колоний показывает, что во всех отсутствует фрагмент размером 2 тыс. оснований Cla I. Одну из этих плазмид обозначают рМОЫ 54. Получают плазмид- ную ДНК.

Плазмиду pMON 54 ДНК (20 мкг) расщепл ют Eco RI и Pst I эндонуклеаза- JQ ми (20 ед. каждого, 2 ч, 37 С) и фраг мент размером 4,8 тыс, оснований очищают на агарозном геле, использу мембраны NA-45,

Очищенный фрагмент размером te 4,в тыс. оснований (0,5 мкг) смешивают 0,3 мкг фрагмента размером 740 пар оснований Eco RI - Pst I, полученного из М13мр8 М-4 RF ДНК, которую очищают, использу мембрану JQ NA-45. После лигировани (Т4 ДНК ли- газа, 2 ед.), трансформации Е. coli GM42 дам-клеток, и отбора клеток, устойчивых к спектиномицину, получают 20 колоний, Плазмидный мини-пре- 25 парат ДНК, полученный из 12 клонов, расщепл ют Pst I и Eco RI дл демонстрации наличи фрагмента 740 пар оснований . Одну плазмиду, несущую этот фрагмент обозначают рМОМ 64. -JQ

ДНК (0,5 мкг) pMON 64 расщепл ют Cla I (1 ед., 1 ч, 37°С), затем Cla I инактивируют нагреванием и фрагмент заново присоедин ют Т4 ДНК лигазой (1 ед.). После трансформации и отбора клеток, устойчивых к спектиномицину, получают мини-препарат из 12 колоний, ДНК расщепл ют Bam HI и Eco RI дл определени ориентации фрагмента 2 тыс. оснований Cla I, Половина клонов содержит Cla I фрагмент в обратной ориентации нежели в pMON 64. Одну из этих плазмид обозначают pMON 109.

Пример 4, Принимают плазмиду pNW 31C - 8,29С. Плазмида несет pTi A6 7,5 тыс. оснований Ват 8 фрагмент , Ват-8 фрагмент выдел ют из 50 мкг Bam HI - расщепленной плазми- ды pNW 31C - 8 290, использу NA-45 мембрану. Очищенный Ват-8 фрагмент размером 7,5 тыс. оснований (1,0 мкг) смешивают с 0,5 мкг pBR 327 векторной ДНК, которую предварительно расщепл ют эндонуклеазой Bam HI (2 едО так и 0,2 ед, щелочной Лосфатазы теленка в течение 1 ч при 37ffC, полученную смесь депротейвизируют и повторно суспендируют . Смешанные фрагменты обрабатывают Т4 лигазой (2 ед,), исполь35

40

55

Q

e Q 5 Q

5

0

5

зуют дл трансформации Е, coli C600 ГЕСА клеток, отбирают колонии, устойчивые к ампициллину. Мини-препарат дл получени плазмидной ДНК выдел ют из двенадцати этих клонов, ДНК расщепл ют с Bam HI дл foro, чтобы продемонстрировать наличие pBR 327 вектора и Ёат-8 фрагментов размером

7.5тыс. оснований. Одну из плазмид, в которой имелись оба эти фрагмента, обозначают рМОМ 90.

25 мкг pMON 90 ДНК расщепл ют Bgl II (25 ед., 2 ч, 37°С) и Bgl II фрагмент размером 2,6 тыс. оснований очищают, использу NA-45 мембрану. Дл создани тупых концов фрагмент (2 мкг) повторно суспендируют в Юмкл 50 мМ МаС1, 6,6 мМ Трис-HCl рН 8,

6.6мМ MgCl2 и 0,5 мМ дитиотритола (буфер Кленова), 4 деоксинуклеозидтри фосфатазы (dATP, dTTP, dCTP и dCTP) добавл ют до конечной концентрации

1 мМ и добавл ют одну единицу большого (Ьрагмента Кленова ДНК полимеразы 1 Е. coli. После инкубировани в течение 20 мин при 22°С, полимеразу Кленова инактивируют нагреванием и добавл ют 10 ед. Hind III. Расщепление Hind III провод т в течение 1 ч при 37°С и затем фермент инактивируют нагреванием. Добавл ют тупые фрагменты Hind III - Bgl II (1 мкг) к 0,25 мкг Hind III - Pvu II фрагменту размером 2,2 тыс, оснований pBR 322, который получают путем расщеплени Hind III и Pvu II, и затем обработки щелочной фосфатазой теленка. После лигировани с использованием 100 ед, Т4 ДНК лига- зы, трансформации Е. coli ZE392 клеток и отбора устойчивых к ампициллину колоний, получают дев тнадцать колоний. Плазмидные мини-препараты получают из двенадцати колоний и расщепл ют Hind III дл определени размера рекомбинантной плазмиды и Sma I дл определени правильности включени фрагмента. Одну плазмиду с правильной структурой обозначают pMON113.

Пример 5. Двадцать мкг плаэ- миды pMON 109 расщепл ют Eco RI и Bam HI (по 20 ед. каждой, 2ч, ) и Bam HI - Eco RI фрагмент размером 3,4 тыс. оснований очищают, использу NA-45 мембрану, 20 мкг плазмиды/ рМОМ 41 расщепл ют Bam HI и Pvu I | (20 каждой, 2 ч, 37°С) и Ват HI - Pvu I фрагмент размером 1,5 тыс. осto

15

20

25

незнаний очищают, использу NA-45 мем1 брану.

20 мкг pMON 113 ДНК расщепл ют Pvu I и Eco RI (по 2 ед„ каждой, 2 ч, 37°С) и Pvu I - Eco RI фрагмент размером 3,1 тыс. оснований очищают, использу NA-45 мембрану. Дл сборки плазмиды рМОМ 120 Eco RI - Pvu I фрагмент размером 3,1 тыс, оснований рМОМ 113 (1,5 мкг) смешивают с 1,5 мкг фрагмента Eco RI - Bam HI размером 3,4 тыс. оснований из pMON 109. После обработки Т4 пигазой (3 ед.) в течение 16 ч при 10°С ли- газу инактивируют нагреванием (1рмин 70°С) и добавл ют 5 еде Bam HI, Расщепление продолжают в течение 30 мин при 37 С и в это врем Bam KI эндону- клеазу инактивируют нагреванием как и ранее. Затем-0,75 мкг Pvu I -Bam HI фрагмента размером 1,5 тыс, оснований из pMON 41 добавл ют вместе с Т4 ДНК лигазой (2 ед.) и свежим АТР до конечной концентрации 0,75 мМ. Окончательное взаимодействие с лигазой провод т в течение 4 ч при и смесь используют дл трансформации Е. coli ZE 392 клеток с последующим отбором клеток, устойчивых к спекти- номицину, как описано ранее, Плазмид- ные мини-препараты из двенадцати из нескольких тыс ч колоний скриниругот дл получени плазмид размером приблизительно 8 тыс, оснований, содер- дащих одиночные сайты Bam HI и Eco RI, Одну плазмиду, котора имела нужную структуру, обозначают pMON120, pMON 120 ДНК получают аналогично примеру 1.

Культуру Е. coli, содержащую pMON 120, депонируют в Американской коллекции типовых культур и присваивают регистрационный номер 39263,

Пример 6. Плазмида pMON 75 содержит химерический NOS-NPTII-NOS ген. Эту плазмиду и pMON 128 расщепл ют Eco RI и очищают фрагмент размером 1,5 тыс, оснований, содержащий NOS-MPTII-NOS-ген.

. .50

Плазмиду рМОК 120 расщепл ют Eco R1

и обрабатывают щелочной фосфатазой теленка. После фенольной депротеини- зации и осаждени этанолом Eco RI, отщепленную pMON 120, линейную ДНК смешивают с 0,5 мкг размером 1,5 тыс, оснований Eco RI химерическим генным фрагментом pMON 75 или 76. Получен- ную смесь обрабатывают 2 ед. Т4 ДНК

30

35

40

45

5

0

5

0

5

0

5

лигазы в течение 1 ч при 220С„ После трансформации Е. coli клеток и отбора колоний, устойчивых к спектиноми- цину (50 мкг/мл), вы вл ют несколько тыс ч колоний. Шесть из них отбирают, выращивают и готов т плазмидные мини- препараты, Плазмидные ДНК расщепл ют Eco RI дл проверки на включение химерического гена размером 1,5 тыс. оснований и Bam HI дл определени ориентации включени . Bam HI расщепление показало, что в плазмиде рМОМ 128 химерический ген транскрибируетс 1 Ј том же самом направлении, что и интактный нопалинсинтазный ген рМОМ 120. Культуру Е. coli, содержа--.- щую pMON 128, депонируют в Американской коллекции типовых культур и присваивают регистрационный номер 39264. Ориентаци вставки в pMON 129 противоположна ориентации в pMON 128 по вление дополнительного фрагмента Bam HI размером 1,5 тыс, оснований Bam HI при расщеплении плазмиды pMON 129, свидетельствует о том, что плазмида pKON 129 несет тандем дупликацией хи, мерического NOS-NPT II-NOS гена.

Пример 7. Плазмиду pMON 128 перенос т в хлорамфениколустойчивый Agrobacterium tumefaciens штамм GV 3111-C58C1, несущий Ti плазмиду pTi B65 3 , использу методику скрещивани на пластине трех родителей , следующим образом. мл культуры Е. coli несущей pMON 128,, смешивают с 0,2 мл культуры Е, coli штамма НВ101, несущего pRK 2013 плазмиду и 0,2 мл GV 311 клеток. Полученную смесь клеток культивируют в бульоне Луриа (LB), помещенном на LB пластину , и инкубируют в течение 16-24 ч при 30 С, чтобы дать возможность осуществитьс переносу плазмиды и образованию коинтегративных плазмид, Клет ки повторно суспендируют в 3 мл 10 мМ MgSO q. и затем 0,2 мл аликвотной части распредел ют на LB пластине, содержащей 25 мкг/мл хлорамфеникола и по 100 мкг/мл спектиномицин и стрептомицина . После инкубировани в течение 48 ч при 30 С получают приблизительно 10 колоний. Выбирают одну колонию и выращивают при Зр°С в LB среде. со держащей хлорамфеникол, спектиномицин и стрептомицин в указанных выше концентраци х,

Готов т отдельный тип коинтеграти- вной плазмиды дл использовани в

контрольном эксперименте путем включени pMON 120 в клетки A, tumefaciens и отбора клеток с коинтегративными плазмидами, использу спектиномицин и стрептомицин. Аналогично pMON 120 эти плазмиды не содержат химерический NOS-NPT-II-NOS ген.

Пример 8. Растворы, которые

используют при культивировании растительных клеток,

За вители использовали следующие

астворы в расчете на 1л.

Смесь ферментов15

Целлюлизин5 г

Макерозим0,7 г

Ампициллин0,4

КН2Р0427,2 мг

КМ0310120

СаС12

MgS( 7 Н2 О KI

CuS04- 5 Н20 Маннитол MS9 MS соли Сахароза Витамины В5 Маннитол

Фитогормоны Бензиладенин (РА) 2,4-Д

S - ES MS соли Сахароза Витамины В5

1,48 г 246 мг 0,16 мг 0,025 for 110 г25

4,3

30,0 г 1 мл 90,0 г

30

0,5 мг 1 мг 4,3 г 30 г 1 мл

35

Маннитол 30 г

Карбенициллин10 мг

Фитогормоны Индолуксусна

кислота0,1 мг

SO MS соли4,3 г

Сахароза30,0 г

Витамины В51 мл Питательна среда пластин

MS соли.4,3 г

Сахароза30,0 г

Витамины В51 мл

Маннитол30,0 г

Фитогормоны

ВА0,5 мг

S 2C MS соли4,3 г

Сахароза30 г

Витамины В51 мл

Фитогормоны Хлорфеноксиуксусна

кислота2 мг

S 104 MS соли4,3 г

Сахароза30,0 г

Витамины В51 мл

s

10

15

20

25

30

35

40

45

50

5

Фитогормоны

ВА0,1 мг

NAA1 мг

MS 11 MS соли4,3 г

Сахароза30,0 г

Витамины В51 мл

Фитогормоны Зеатин1 мг

Источники витамина В5 Миоинозитол100 г

Тиамин НС110 г

Никотинова

кислота1 г

-, Пиродоксин НС11 г

Промывочный состав MS соли0,43 г

Сахароза 171,2 г

PVP - 4040,0 г

MS соли поступают в виде предварительной смеси в виде сухого порошка .

Пример 9, Растени петуньи Митчелла выращивают в камерах роста с двум или трем группами флуоресцентных ламп и двум группами ламп накаливани (около 5000 лк). Темпе- ратуру поддерживают посто нной при 21°С и освещают растени в течение 12 ч в день. Растени выращивают в смеси 50/50 вермикулита и РМ о смеси Растени поливают раз в день питательным раствором Хогланда. Ткани берут с темно-зеленых растений с компактным кустистым ростом. Листь стерилизуют в растворе 10%-ной коммерческой хлорной извести и небольшого количества детергента Tween 20 в течение 20 мин с периодическим помешиванием . Листь смачивают; два или три раза в дистиллированной воде. Из листьев вырезают тонкие полоски (около 1 мм) перпендикул рно основной жилке„ Полоски помещают в смесь ферментов, вз тых в отношении около 1 г ткани на 10 мл ферментов. Чашки герметизируют парапленкой и инкубируют в темнот или в слабом рассе нном свете при этом непрерывно осторожно перемешивают (около 40 об/мин) на роторном шейкере. Инкубирование с ферментами обычно провод т в течение ночи, т.е. около 16-20 ч.

Расщепленную смесь сеют через сита 68, 74 и 88 меш дл удалени крупных осколков и лиственного материала. Фильтрат центрифугируют при 70 - 100 g в течение 5 мин до образовани конгломератов протопластов. Надосадоч-

ную жидкость декантируют и хлопь осторожно повторно суспендируют в промы вочном растворе, Эту суспензию выпивают в скл нки Бэбкока. Скл нки за- полн ют на 2-3 см над основанием горлышка . 1 мл растительной среды MS9 осторожно помещают слоем поверх промывочного раствора.

Скл нки Бэбкока сбалансируют и цен трифугируют при 500-1000 об/мин в течение 10-2D мин. Протопласты образуют компактную полоску в горлышке у поверхности раздела. Эту полоску извлекают пипеткой, прин в предосторожно- сти, чтобы не прихватить излишек раствора . Протопласты разбавл ют MS9. В этот момент протопласты промывают MS9 или разбавл ют дл культивировани без промывки.

Протопласты суспендируют в MS9 среде до 5 х 10 на мл и помещают в Т-75 колбы по 6 мл в колбу. Колбу инкубируют на уровне поверхности при слабом рассе нном свете или в темно- те при 26-28°С, На третий день после удалени ферментов из тканей листа в каждую колбу добавл ют MSO (среду, котора не содержала маннитола), использу количество, равное половине Исходного объема. То же количество среды MSO добавл ют снова на 4 день. Это снижает концентрацию маннитола до около 0,33 М после первого разбавлени и до около 0,25 М после второ- го разбавлени .

Пример 10. На п тый день После выделени протопласта, п ти-се- мидневные табачные суспензионные Культуры табака (TXD клетки) разбав- л ют при необходимости MS2C средой до точки, когда 1 мл легко распредел етс по поверхности агарной среды В 100 х 15 мм чашках Петри, т.е. до 10-15% суспензии (вес/объем)„ Агар- ную среду получают, смешива 0,8%- ный агар со средой MS-ES, обрабатыва смесь в автоклаве и охлажда до тех пор, пока она не отвердилась в чашках. Один мл TXD суспензии распредел ют на питательной среде (25 мл), 8,5 см диск ватманской фильтровальной бумаги кладут на ТХД клетки и разглаживают . 7 см диска той же бумаги кладут в центр большего диска.

Отдельно аликвотные части культуры клеток A, tumefaciens клеток добавл ют в скл нки, которые содержат растительные клетки. Один набор аликвотных

g 0

5 0 ,

д

0

5

часуей содержит клетки с pMON 128 : Ti коинтегративными. плазмидами, содер, жащими химерические NOS-NPT II-MOS г е- гены. Другой набор аликвотных частей содержит клетки с pMON 120: Ti к оин- тегративными-плаэмидами, которые не содержат химерический NOS-APT II-NOS ген.

Бактерии добавл ют в скл нки при плотности 10 клеток/мл. 0,5 мл смеси клеток распредел ют в тонком слое на поверхности 7 см диска фильтроваль ной бумаги. Затем пластины герметизируют паропленкой или в пластиковых пакетах и инкубируют при пр мом флуоресцентном освещении не более чем по 5 пластин в стопке.

Через 7 дней колонии стали различимы . Через 14 дней 7 см диски с прилипшими к ним колони ми перенос т на новую MSO агарозную среду (без питающих клеток), содержащую 500 мкг/мл карбенициллина, а также 50 мкг/мл ка- намицинсульфата. Через две недели наблюдают интенсивно растущие зеленые колонии на пластинах, которые содержат растительные клетки, совместно культивированные с A. tumefaciens штаммами, содержащими коинтегратив- ную NOS-NPT II гшазмиду pMON 128. На пластинах не наблюдают трансформиро-1 ванные колонии, которые содержат растительные клетки, совместно культивированные с A, tumefaciens штаммами, содержащими коинтегративную плазмиду pMON 120. Канамицинустойчивые трансформанты сохран ют рост в культураль ной среде, содержащей канамицин. Экс перименты Саузерна подтверждают, что эти .клетки содержат химерический NOS- NPT II ген.

Оба набора трансформированных клеток (и третий набор клеток, которые были трансформированы таким же способом химерическим геном, кодирующим фермент NPT типа 1), исследуют на устойчивость к канамицину.

Пример 11, Трансформированные канамицинустойчивые колонии содержат как опухолевые, так и неопухолевые клетки. Отдел ют неопухолевые трансформированные клетки от опухолевых трансформированных клеток и осуществл ют регенерацию дифференцированных растительных тканей из неопухолевых клеток,

I;

Колонии выращивают на MS 104 ага- розной среде, содержащей 30 мкг/мл

канамицинсульфата и 500 мкг/мл карбе- нициллина, до тех пор, пока они не достигают около 1 см в диаметре, Опухолевые колонии, которые имеют несколько более бледный оттенок зеленого и вл ютс более рыхлыми нежели неопухолевые колонии, удал ют из MS 104 среды и помещают на MS 11 среду , содержащую 30 мкг/мл канамицина и 500 мкг/мл карбенициллина. По мере роста колоний те из них, которые были бледно-зелеными и имели рыхлую структуру, удал ют и выбрасывают.

MS11 среда, содержит зеатин, фито- гормон, который вызывает спонтанное образование ростков в неопухолевых кот лони х, Обнаруживают несколько рост10

15

Claims

Формула изобретени

Способ получени трансформированных клеток двудольных растений путем совместного культивировани раститель ной клетки и бактерий Agrobacterium tumefaciens, о. тличающийс тем, что, с целью ПОВЫШЕНИЯ выхода нормальных трансформированных растительных клеток, конструируют плазмиду pMON 128 путем включени в вектор рМОН 120 гена устойчивости к антибиотикам , внос т полученную плазмиду в штамм бактерий Agrobacterium tumefaciens GV 3111-C58 Cl/pTi B65 3 tra конъюгацией трех штаммов бактерий Escherichia coli/pMON 128, Escheric- hia coli HB 101 pRK 2013 и AgrobacteKOB , развивающихс из канамицинустой- 20 tumefaciens CV 3111, отбирают чивых колоний. Эти ростки выращиваютштамм бактерий A. tumefaciens с KdHHдо нужного размера и срезают острымтегративной плазмидой pMON 128:pTi

лезвием, а затем ввод т в агарознуюВ65 3 trac на селективной среде, сосреду без фитогормонов, например MSO, . держащей 25 мкг/мл хлорамфеникола и где они могли развить корни. При же- . 25 по 1р° мкг/мл спектиномицина и стреплании среду дополн ют нафталинуксус- ной кислотой дл того, чтобы вызвать образование корней. Растени выращивают до нужного размера в агарозной среде, а затем перенос т в почву. При правильном уходе растени растут до зрелости и дают семена.

Формула изобретени

Способ получени трансформированных клеток двудольных растений путем совместного культивировани раститель ной клетки и бактерий Agrobacterium tumefaciens, о. тличающийс тем, что, с целью ПОВЫШЕНИЯ выхода нормальных трансформированных растительных клеток, конструируют плазмиду pMON 128 путем включени в вектор рМОН 120 гена устойчивости к антибиотикам , внос т полученную плазмиду в штамм бактерий Agrobacterium tumefaciens GV 3111-C58 Cl/pTi B65 3 tra конъюгацией трех штаммов бактерий Escherichia coli/pMON 128, Escheric- hia coli HB 101 pRK 2013 и Agrobacteтомидина , ген устойчивости к антибиотикам ввод т в растительные клетки в результате совместного культивировани протопластов с бактери ми A. tumefaciens , содержащими коинтегратив- ную плазмиду, и отбирают трансформированные растительные клетки на селек тивной среде, содержащей соответствующий антибиотик.