SU1200853A3 - Способ конструировани гибридной плазмиды,содержащей генетический код термостойкой альфа-амилазы - Google Patents

Abstract

СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ ГИБРИДНОЙ 1ШАЗМИДЫ, СОДЕРЖАЩЕЙ ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД ТЕРМОСТОЙКОЙ АЛЬФА-AMfflAЗЫ , включающий гидролиз донорной ДНК эндонуклеазой дл  получени  линейной последовательности ДНК с кодирующим альфа-амилазу геном, гидролиз эндонуклеазой редипиентного вектора дл  получени  второй линейной последовательности ДНК соединение линейных последовательностей ДНК с помощью ДНК-лигазы, причем в качестве донор- ной ДНК Используют природные или гибридные плазмиды из штаммов Bacillus stearothermohilus .АТСС № 31195, 31196, 31197, 31198, 31199, 31783, а в качестве реципиентного вектора используют плазмиду, выбранную из группы плазмид, включаюi , щих pBR 322, pBR 325, pWL 625, и рС 194, из эндонуклеаз используют (Л эндонуклеазу Hind III, а из ДНК-ли- с: газ - ДНК-лигазу фага Т., ь

Description

Изобретение относитс  к генетнче кой инженерии, а именно к получению г-мкроорганизмов, содержапшх генети- ческиГ код фермента термостойкой ал ь фа амил азы. Пример 1. Получение плазМИД , содержащих гены альфа-амилазы, стойких к антибиотику. Вс  ДНК, содержаща  гены альфаамилазы выдел етс  из леток штамма Bacillus stearotherraophilus АТСС № 31783 с помощью известного метода Бернса и Томаса. В соответст вии с предлагаемым способом клетки i-yi:no; M,inivioi(:H в смеси 50 мМ хлоргидрата тр ..с (оксиме1ил) аминометана (трис-НС1;, 0,6 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК) и 25%-ног pacib.jpa сахарозы стандартного сол ного цитрата при рН 8,0. Кроме того, клетки обрабатываютс  лизоцимом (2 мг/мл) в течение 1 ч при 0°С перед лизисом. Плазмида pBR 322 ДНК, фермент ограничени  Hind III и ДНК лигаза фага Т4 получены из лаборачорий Исследовательского центра в Бета еде, Мэриленд, . Смесь 7,5/и г от всей ДНК штамма Вас. stcajothermophilus фермент ограничени  Hind III и 10 /U г альбуми на сывороткибыка в 100 ju л раствора который содержит 50 мМ NaCl, 6 мМ при рН 7,5 и 6 мМ MgQ , инкубирую при 37С в течение Г 30 НИН. 2,2 щг ДНК-плазмиды pBR 322 и 7 единиц (Е) Hind Ш вывариваютс  в 20 m л того же раствора в течение 1 ч при 37 С, Анализ ДНК на агарово геле показывает, что процесс вывар ваш-1  закончен. Затем 6,75/иг обработанной ДНК Вас. stearothermophilus и l. обработанной ДНК pBR 322 смешиваютс ь 0,3 мл раствора, содержащего 6,6 Трио-НС 1 (рН 7,6), 6,6 мМ Mga2 , 10 мМ дитиотрейтола и 0,067 мМ триф сфата аденозина(АТП), и комбинируютс  с использованием 0,28 единиц ДНК-лигазы фага Т. Анализ на агаровых гел х ДНК после лигации показывает , что лигаци  завершена и оставшихс  линейных молекул ДНК рВ 322 не обнаружено. Пример 2. Трансформаци  плазмид, содержащих гены альфа-амилазы и маркер, стойкий к воздействи антибиотика, в К, Coli. 53 Культура Е. со 1 i RH. , полученна  в виде штамма PRC 399 из Центра видов плазмид. Медицинский центр Университета в Стэнформе, Калифорни , выращиваетс  .в среде, содержащей г/л;; триптон 10,0; экстракт дрожжей 5,0 хлорид натри  5,Оглюкоза ,0. Культура выращиваетс  в пробирке в течение ночи при . Затем она разбавл етс  9 част ми такой же среды и инкубируетс  при 37°С еще в течение 135 мин при энергичном перемешивании. Клетки собираютс  центрифуг1-1рованием и промываютс  0,1 М холодным раствором NaCl. Собранные клетки E.coli обрабатываютс  перед трансформацией в соответствии с известной процедурой, предложенной Козном и др. Половина ДНК, которую подверга ют лигации (получена в примере 1) переноситс  в клетки Е. со 1i RRI, Клетки культивируютс  на пластинках, содержащих ту же среду, на которой выраш 1вались клетки E.coli, за тем исключением, что среда содержит ампициллин с концентрацией 50 Л( г/мл. В результате получают только клетки E.coli, содержащие плазмиду pBR 322 ( с генами, отвечающими за стойкость к ампициллину). В качестве средства дл  определени  числа клеток, содержаш,их реконбинированнуш ДНК клетки, стойкие к ампициллину, анализируютс  на стойкость к тетрациклину. Так как введение фрагмента ДНК в участок рассечени  фермента Hind III штамма pBR 322 в общем случае дезактивирует ген плазмиды, отвечающий за стойкость к тетрациклину, величина чувствительности к тетрациклину дает число клеток , содержащих рекомбинирова гную ДНК, имеющихс  в попул ции клеток, Трансформаци  дает 3,6 х Ю клеток, стойких к ампициллину, на миллиметр и 3,0 X 10 1слеток, стойких к тетрациклину , на миллиметр. Следовательно, примерно 16% клеток чувствительны к тетрациклину, что указывает на содержание в них плазьшд с рекомби- натной ДНК. Пример 3. Выделение колоний E.coli, синтезирующих альфа-ами- лазу. . Приготавливаетс  среда того же состава, что использовавша с  дл  выращивани  E.coli, за тем исключе- нием, что добавл ю1 15 г/л агара плюс ампициллин ( г/мл). Эта с;ре- да помещаетс  на 130 пластинок Петри и на нее прививаетс  разбавленна  трансформированна  культура Е.со 1i, полученна  в примере 2. Эти пластинки дают в среднем 113 колоний на плас1ину. Колонии выращивают до тех пор,, пока они не достигают в диаметр примерно 1-2 мм, а затем копируют на пластинах с крахмальной средой следу ющего состава, г/л: 6; КН2РО 3, NaCl 0,5; 1; экстракт дрожжей 1, пептон 10; агар 15; крахмал Линтнера 10. После выращивани  в течение 3 ч . на пластинки, покрытые средой, содержащей крахмал добавл етс  бактериофаг Т - АТСС № 11303-В4. Дл  высвобождени  всех внутриклеточных ферментов используетс  примерно 1х. х10 Т на каждую пластинку. После выращивани  в течение ночи и лизи- ровани  на пластинки наноситс  2,5%- ный йодный раствор Люгол  с целью обнаружени  всех прозрачных зон, об- раз.овавшихс  под действием активност амилазы. Из примерно 15 000 содержащихс  колоний 18 колоний образуют прозрачные зоны, что указывает на присутствие амилазы. Колонии, про вл ющие активность амилазы, подвергают копированию на пластинках, -и при этом вновь про вл етс  активность амилазы однако только после добавлени  бакте риофага Т4 к лизированным клеткам. Этот факт указывает на то, что амила за получена внутри клеток. Последующие эксперименты показали, что D-цик лосерин  вл етс  эффективным дл  получени  лизированных клеток, если этот препарат добавл етс  в среду с концентрацией 600 г/мл. Штамм Е.соИ RRI, содержащий вектор плазмиды pBR 322 с геном амилазы известен как АТСС № 31789. Пример 4. Трансформаци  плазмид, содержащих гены альфа-амила зы и маркер, стойкий к антибиотику, в штамме Е.соИ С600, АТСС № 23724. Выращиваетс  культура E.coli С600 АТСС №23724, клетки собираютс  и по готавливаютс  к трансформации в соот ветствии с примером 2. Выращиваетс  п ть различных клонов амилазы, полученных как описано в примере 3, и рекомбинатные плазмид выдел ютс:  ггри помощи счлндартной пропроцедуры осветлени  лизата Клевелла и Хелински. Частично очищенна  ЦНК плазмиды суспендируетс  в смеси 10 мМ грпс -НС1 и 1,0 мМ ЭЛТК с рН 7,5 ггеред перенесением в клетки E.coli, обработанные- СаС, Эту ДНК подвергают анализу, устанавлива , что она стерильна. Таким образом, никаких колоний, синтезирующих амилазу, не может по вл тьс  из-за копировани  клеток, введенных вместе с ДНК. Трансформирова 1ные клетки выращиваютс  на среде, содержащей ампициллин с тем, чтобы продолжали расти только клетки, содержащие плазмиды. При проверке колоний на активность амилазы устанавливают 100%-ную коррел цию между присутствием плазмид и активностью амилазы. Это указывает на то, что ДНК плазмиды трансформирует оба штамма E.coli-и превращает их в продуцентов амилазы. Таким образом, это не зависит от штамма, но требует дл  своего осуществлени  рекомбинатную плазмиду. Штамм E.coli С600, содержащий вектор плазмиды pBR 322 с геном амилазы, известен как АТСС № 31 788. Пример 5. Термостойкость альфа-ам шазы. Четыре амилазных клона, полученных как описано в примере 3, и одна контрольна  культура E.coli RRI выращиваютс  в 15 мл среды, описанной в примере 2. Клетки раствор ютс  добавлением D-циклосерина, а затем остатки клеток удал ютс .центрифугированием . В жидкость, расположенную на поверхности, добавл ют ацетат натри  и хлорид кальци  с тем, чтобы получить концентрацию в 50 мМ и 2,5 мМ соответственно, рН доводитс  до 6,0. Растворы фермента помещают в пробирки с завинчивающимис  колпачками , соединенными с лентой из тефлона . Рас1воры анализируют на активность аьшлазы, а затем выдерживают при 90 С в течение 45 мин. Активность амилазы определ ют скоростью гидролиза крахмала, котора  про вл етс  в скорости снижени  способности окрашивать йод, измер емой спектрофотометрически в соответствии с известной процедурой Б.У. Смита и Дж.Г.Роу. Контрольный штамм E.coli не обладает активностью амилазы. С целью получени  стандартов термостой-

K0(,:-il-: Н КС)НТрОЛ1 ПЫЙ ЛИЗЛТ Е . СО 1 1

доба л кпч;  очищенные амилазы из 5ас , ;-. l-oarothermophilus АТСС № 31783 ,, v-MVii, П i г, полученной от г}ирмы Сигма Кемнкэл Ко,, Сент-Луис, Миссури , под наименотзаннем Сигма А6380 и термамил терьюстойка  альфа- амнлачу, полученна  из Лабораторий Ново Инк., Уилтон, Конн,

Резу-пьтаты испытаний приведены в i4i6js, .

Амилаза, синтезированна  клонами, столь же термостойка , как и фермент , синтезированный донором В. ste- V 1Г1 Г:;}1кП-1з , Она сравнима по ге.)( t: ныпускаемо про- Mi.iuj.U-HHOc; Ifj-c чермостойкой альфа-ами- .чазоГ) теТрамилом и превосходит по герМ/стойкости ал)зфа-амилазу , котора ( мппезируетс  в промышленных масштабах культурой В. subtilis,

Гидролизаты, полученные в резуль- чате обработки крахмалом каждой из амилаз анализируютс  при помощи тонкослойной хроматографни с тем, чтобы установить количество сахаров с низким молекул рным весом. Относи- 1 ельное количество сахаров с HHSKHN молекул рным весом, образовавшихс  Б результате воздействи  амилаз, синтезированных клонаь-ш E.coli, аналогично тем количествам сахаров, которые получены при воздействии извест1й11х альфа-амилаз , использовавшихс  в качестве ко трольнь х.

Полученные результаты показывают, что ген термостойкого фермента, по- лучеиньш из крайне термофильных организмов , хорошо копируетс  в мезо- фильном бактериальном хоз ине и дает термостойкий ферментный продукт, Таким образом, установлено, что ген из крайне гермофильных бактерий можно копировать в мезофильных бактери х с использованием методов рекомбина - ных ДИК. Кроме того, синтез активного термостойкого фермента осуществл етс  при нормальных мезофильных тег-пгературах (приблизительно 20-40 С1

Пример 6. Выделение естественно встречающихс  плазмид, содержащих гены альфа-амилазы.

Вс  ДНК выдел етс  из клеток Вас. stearothermohilus АТСС № 31783, как описано в примере 1, ДНК плазмиды отдел етс  от всей ДНК при помощи ультрацентрифугировани  с использованием хлорида цези , этидийбромкда и

известной проце; 1,у1зы, П 1 д11ожрипой Р. Рэдлос1х}1ом , У.Бау)ром и Л-к . Р/и о градом .

Тот факт, что ilHlv rvruii гпазмиды содержит Го.н альфа-амилазы, установлен следующим образог-, ЛИК гтлазмиды рассекаетс  при помсмцн ферг- ента рестрикпии i-.itid как и в ре 1 . Тиюны получают путем ,сни  этой ДНК в Е, col: агиалогично примерам 1-3. Апа.чиз фепот1-П1а CTOIIKOсти к четрацик.гппгу пшсазал, что 3,3% клеток чувств1 тельиы к- тетрациклину и, следовательно, содержат клонированную ДНК. Поосеиванне клеток отгюсителыю актигзности альфамилазы показало, что 0,42% или примерно одна из ка}:{Д15Гх восьг-и клеток, содержащих клоннронаппую ЛНК, имеет ген амилазы. Рассечение плазмлд) В. Б1еаго1:пеГ1Г;О :)1 Низ при помоки Kind ITT дает )ie фрагменты ДИК, которые раздел ютс  n;.i восемь легко обнар г;клвае1-ых полек: при электрофореза па агаропсь; геле. Частота клонировапи  куска а;- илазы (I/B) равна приблизите.плк) ол-атдаемой , если одна из восьь  преобладающих полос содержит геп амплазы. Анализ таких полос плазмиды показывает , что о,дпа из полос соста1 л ет примерно 3,6 Мд, т.е. это TITT же размер, что и клонггровапные куски ДНК, которые получень при апа.лизе плазмида примера 1 ,

Этот экспериьепт показьп.иает, что по крайней мере один геп ;и1ьф 1амилазы расположен на естествснпо встречающейс  плазмиде в используемом штамме В. stea-rotTiermcTihilns,

Пример 7. Получение и выделение штаммов Е , со 1 i , с:одержаи, различные гибридные плазмиды.

А, Культура производ щих амилазу E.coli, выделенна  как описано в примере 3, АТСС № 31 789, выращиваес  в течение ночи в среде, используемой в примере 2, ДНК плазмидгл усилваетс  при noMOiiiii известной процедуры Клевелла Д.Б. с использованием хло)амфеникола на миллиь етр. Дл  усилени  используетс  следующа  среда, г/лТ Ha iiJ-Q,, 6,0; 3,0 NaCl 0,5; . 1 ,0, ,казеиновые аминоки слоты 5,0, глюко з а 2,0, CaClj 2 0,015, -/П 0,246, витамин Б, 0,001.

ДН( плазмиды затем выдел етс  при помощи сталдартного метода осветлени  лизата Клевелла и Хелинс- ки. Изолированные плазмиды подвергаютс  очистке при помощи этидийбро МИДа, CsCl методом примера 6, а затем при. помощи экстрагировани  изопропанолом и глубокого диализа в 10 мМтрис -НС1 плюс 1 мМ ЭДТК с рН 7,5..

Культура E.coli RRT, PRC 399, содержаща  3,9 Мд, плазмида рВР 325 выращиваетс , а ДНК плазмиды усиливаетс , вьщел етс  и подвергаетс  очистке указанным методом.

ДНК двух полученных плазмид рассекаютс  ферментом рестрикции Hind III. Растворы рассеченных плазмид смешиваютс  и подвергаютс  лигации при О С в течение 18 ч с использо- ван.ием общей процедуры примера 1 ,

ДНК после лигации переноситс  в E.coli RRI при помощи метода, описанного в примере 2. Клетки разбавл ютс  и нанос тс  на агаровые пластинки, содержащие хлорамфеникол с концентрацией 20шг/мл, В результате этой процедуры получают клетки E.coli, содержащие только плазмиду рВН 325 (с генами, отвечаюк1ими за стойкость к хлорамфениколу). Коло- 1даи клеток, которые при этом получают , просеивают на активность амилазы при помощи метода, описанного в примере 3дл  растворени  клеток используетс  1)-циклосерин.

Рекомбинакгна  ДНК плазмиды из трех колоний, которые обладают активностью амилазы и про вл ют стойкость к хлорамфениколу5 экстрагиру- етс  осветлением лиэата, описанным в примере 4, Выделение рекомбинатных плазмид на агаровых гел х показало , что они имеют ожидаемый размер дл  комбинации плазмиды рВ 325 плюс 3,6 Мд фрагмента, содержащего ген амилазы. Воздействие на плазмиду ферментом Hind TIT дает 3,6 Мд фрагмента и линейную форму плазмиды pBR 325. Это говорит о том, что ген амилазы может повторно копировас  на различных векторах, рВН 325, не тер   своей активности по синтез амилазы. Полученный штамм E.coli известен как АТСС № 31 792,

Б. Гибридна  плазмида, стойка  хлорамфениколу и ампициллину, полученна  в части А, используетс  в качестве донора фрагмента ДНК, которьш содержит ген альфа-амилазы. Этот фрагмент соедин етс  с 10 Мд плазмиды вектора BpWL 625 указанным в части А ме/одом. Плазмида pV/L 625 описана У.Гоебелем и др. Она может быть выделена из культуры штамма E.coli АТСС № 31787 при помощи процедуры выделени  плазмиды, использованной в части А. Этот вектор надел ют стойкостью к антибиотикам, ампициллину и канамицину. Введение ДНК в pWL 625 в область Hind ITT разрушает стойкость к канамицину.

Клетки E.coli RRI которые трансформированы введением рекомбинатной ДНК, выращиваютс  на агаровых пластинках , содержащих ампициллин. Те колонии, которые обладают стойкостью к ампициллину, но не обладают стойкостью к хлорамфениколу из-за присутстви  pBR 325, и про вл ют акт ивност амилазы отбираютс  дл  анализа. ДНК плазмиды выдел ютс  из колоний. Анализ на агаровых гел х перед и после воздействи  фермента Hind TIT показал, что фрагмент ДНК, содержавш ген амилазы, копируетс  на плазмиде pWL 625 и дает новую плазмиду. Штамм E.coli, содержащий такую гибридную

плазмиду известен как АТСС № 31791.

%

Пример 8. Трансформаци  двух различных гибридных плазмид в одном штамме E.coli.

Выращиваетс  ппамм E.coli, синтезирующий амилазу, полученный в примере 7Б; затем он подготавливаетс  дл  трансформации при помощи-процедуры примера 2. Очищенна  плазмида полученна  в примере 7А, трансформируетс  в этих клетках. При выращивании полученных на агаровых пластинах содержащих хлорамфеникол, все колонии про вили активность амилазы. ДНК плазмиды вьщел ют из одной из колоний и анализируют на агаровых гел х. Установлено, что присутствуют обе Гибридных плазмиды, описанные в примере 7А и 7Б. Этот эксперимент показывает , что культура E.coli может продолжать расти и содержать одновременно две различные гибридные плазмиды, содержащие гены альфаамилазы . Стабильность в течение продолжительности времени этой комбинации не определ лась. Штамм E.coli, содержащий эти две гибридных плазмиды, известен как АТСС № 31790 I p и м e p 9. Граигформппи  r Jia4Nni;i, содерЖгПцих гчиы а ьфа-амилазы и маркер, cTOtiKHX к антибиотику в пггаммо И, ;Г.;11Пт.. Л. Получение донора ДНК, Гибридна  нллзмида, полученна  в примере 7К, используетс  в качест донора фрагмента ДНК, который содер жит ген ал,фа-а п1ла ы. Он экстрагируетс  при помощи процедуры ocBej.-ie ни  лизата Клеве.чла и Хелински, ДНК этой плазмиды рассекае1с  ферментом рестрикции Kind TIT. lloлyчeF нь й про дукт смешиваетс  с небольшим коли- чесугвом бромида зтиди  и выдел етс  с использованием известного метода градиента сахарозы, предпожешюго Эл-Гьюли и Хелли} гом, 3,6 Мд фрагмен содбржащий ген альфа-амида;.ы, дважд экстрагируетс  н-бутиловым спирчом,, осаждаетс  равным объемом изодроцпдового спирта и с успендируетс  в см си 10 м-М т рис плюс 1 мМ ЭДТК с рН о 7,8, выдерживаетс  при -20 С перед использованием. Б, Получение вектора (nepeHOC4HK Штамм р., subtil.is, полученньй из Генетического центра хранени  бацил Факультета микробиологии Университета штата Oraiio под названием штам № 1Е17, содержащий 2,0 Мд цлазмиды рС 9А, который содержит ген, выдел ющийс  стойкостью и хлорамфеникол наноситс  полосами на пластину, содержащую триптический соевьш агар Дифко, цодученный из лабораторий Дифко, Детройт, Мичит ан и 50 п г/мл хдорамфеникола. Далее клетки прививаютс  на 150 мл бульона Пенассе  (Дифко) в 1-литровой колбе и выра- щиваютс  в течение ночи при 37 С пр встр хивании. Клетки гранулируютс  и вновь суспендирую с  в 10 мл протопластного буфера 25% сахарозы, 0,1 М Nad - 0,05 М трисНС при рН 7,5 и 0,05 М ЭДТК при рН 8,3), 5 мг монтежю белого лизоцима (Сигм Кемикэл Компани) добавл етс  на 30 мин при 37С, Затем энергично перемешиваютс 13 мл 2%-ного раствора додецилсульфата натри  в 0,7 М NaCl, а затем 2,5 мл 5 М раствора NaCl, Смесь охлаждаетс  в лед ной воде и центрифугируетс  с; ускорением 12 1000 X g в течение 20 мин. ДНК осаждаетс  равным объемом изопропилоЕОго спирта. Твердый остаток вьщерживаетс  в лед ной воде в течение 60 ч. чатем с:обирастс  цеитрифу ир1)ваннем и суспеггдиругч с.  в раствор, содержащий 0,01 М тоне хлоргидрата и 0,001 М ЭДТК при рП 7,5, ДНК плазмиды выдел етс  при помощи ул1-трацентрифугироваии , с использованием бромида эт-иди , CsCl методом Радлоффа и др, 2 Мд плазмиды обрабат 1ваетс  экстрагированием изо- цропиловым спиртом и глубоким диализом в 10 мМ трис плюс 1 мМ ЭДТК при рН 7,5, В. Получение гибридной плазмиды, 2 Мд-вектор части Б рассекаетс  при помощи фермен1-а рестрикции Hind 11 и смешиваетс  с 3,6 Мд фрагмента ДНК части А, Концентраци  вектора и донорной ДНК 5 и 17,01 г/мл соответственно , Дигаци  ос .уще.стпл е с  как и в примере 1, Отсутствие каких-либо линейных 3,6 Мд-фрагментов после лнгации (этот факт устанав::иваетс  при помощи электрофореза на агаровом геле) указывает на то, что лигади  завершена. Г, Трансформаци  гибридной плазмиды в В, subtilis. Культура В, subtilis, АТСС № 31735, котора  не содержит гена амилазы, выращиваетс  в течение ночи на дластинке, содержащей агар на основе триптоза крови (Дифко и 1 %-ный раствор растворимого крахмала. На пластинку добавл етс  2 мл среды дл  выращивани  следующего состава, %: CNH 0,2V К2НР04 1,4; 0,6; цитрат натри  2Й О 0,1; М) 1-. 0,12; глюкоза 0,5; казеиновые аьшнокислоты (Дифко 0,02 Г,-триптофан 0,005, Примерно 0,1 мл суспензии клеток, полученной таким образом, добавл етс  в 10 мл той же среды :в 250 мд колбе и инкубируетс  при 37°С энергичном церемешивании в течение А ч. Затем 1 мл культуры юбавд етс  в 9 мл предварительно нагретой среды дд  трансформации при 37 С и инкубирование при встр хивании продолжаетс  в течение 90 м к. Среда дл  трансформации  вл етс  той же, что и среда дл  роста, за тем исключением, что она содержит 0,01%-ный раствор казеиновых аминокислот и 0,0005%-ный раствор L-трицтофана, В 0,25 мп культуры клеток с плотностью примерно 1х10 кл ток/мл добавл е1с  5/ц л раствора гибридной плазмиды части В, содержащей 0, плазмиды. Смесь энергично встр хиваетс  при 37°С в течение 30 мин. разбавл етс  равным объемом бульона Пенассе  (Дифко) и встр хиваетс  при еще в течение 90 мин Порци  клеток в 0,1 мл наноситс  на пластинки, содержащие агар на основе ,триптона крови (Дифко , %-ный раствор растворимого крахмала и хлорамфенила, В качестве контрольных проб клетки B.-subtilis без плазмиды и клетки В. subtilis с вектором плаз- МИДЫ рС194 нанос тс  на ту же среду. Ни одной колонии не было отмечено на пластинках, где клетки не содер- жали добавл емые плазмиды. Три колонии отмечены на пластинках, где клетки содержали плазмиду рС194, но ни одна из колоний не про вила активности амилазы, Одна колони  отмечена на пластинках , на которые нанесены клетки, содержащие гибридную плазмиду ДНК част В. Она дала прозрачную зону при воздействии паров йода,Это указывает на то, что клетки синтезируют внеклеточный фрагмент амилазы. Оказалось, что клетки требуют присутстви  хлора феникола дл  стабильности. Эта культура известна под названием АТСС № 31786. Проба ДР1К колонии, содержащей амилазу , вьщел етс  при помощи электро™ фореза на агаровом геле. Отмечена полоса плазмиды в примерно 5,6 Мд. Это соответствует размеру гибридной плазмиды из части В. t Очищенную гибридную плазмиду рассекают ферментом рестрикдии Hind III и подвергают электрофорезу на агаровом геле. В результате получают два фрагмента примерно 2,0 и 3,6 Мд, Они соответствуют размерам донорной ДНК части А и ДНК вектора части Б. D. Трансформаци  гибридной плаз- МИДЫ во втором штамме В. subtilis. Гидридна  плазмида, содержаща  ген амилазы, выдел етс  из клеток ко лонии, синтезирующей амилазу, из части В, при помощи процедуры, котора  использовалась дл  выделени  плазмир рС194 в части Б, Выделенна  гибридна плазмида трансформируетс  в другом амилаза-oтpицaтeльнo i штамме В. subtilis (штамм № 1А289) , полученном из Генетического центра хранени  бацилл, факультета микробиологии, Университета штата Огайо,Трансфор 12 3 маци  осуществл етс  при помощи известного метода сли ни  фотопласта, предложенного С.Чангом и С.Н,Козном, В результате выращивани  клеток на часпластинках методом, описанным в ти Г, зафиксировано примерно х10 кблоний/мл на пластинках, не содержащих хлорамфеникола. Зафиксировано также примерно -1x10 колоний/мл на пластинках, содержапшх хлорамфеникол . При помощи испытани  крахмал - йод, установлено, что все эти колонии содержат амилазу. Такие, содержащие амилазу В. subtilis известны под названием АТСС № 31784. Пример 10, Термостойкость альфа-амилазы, синтезированной штаммом В. subtilis, содержащим гибридную плазмиду. Клетки В, subtilis, содержателе гибридную плазмиду, из примера 9Д, АТСС № 31784, выращиваютс  в 1 л среды в 2,8-литровой колбе Фернбаха с использованием среды следующего состава , %: кукурузный крахмал 9,0, кукурузньп насыщенный ликер 6,OJ ауто- зилат дрожжей (примекс-154, полученный из лабораторий Амбер Джуно Висконсин ) О,35; ( 1,0; 0,1; 0,06; МпС,,-4F20 0,05; кукурузное масло 1,0; термамил О.,05 Е/мп. Среда выдерживаетс  в автоклаве в течение 30 мин при температуре , котора  разрушает активность термамила, а затем охлаждаетс  до комнатной температуры. Далее, в среду перед прививкой культуры клеток добавл етс  0,01 мг хлорамфеникола на миллилитр. Бульон центрифугируетс  и термостойкость испытываетс  с использованием разбавленной пробы верхнего сло  жидкости и общей процедуры примера 5, Дл  сравнени  измер ют также термостойкость амилазы культур В. stearothermophilus,В, subtilis , а также известной амилазы термамил в среде дл  инкубировани , содержащей 50 мМ ацетата натри  и 2,5 мМ CaCJ2(3TO амилазы, использо- вавщиесЯ дл  сравнени  в примере 5, Результаты испытаний приведены в табл. 2, В этом испытании амилазы, синтезированна  клоном Б. subtilis АТСС № 31 784, обладает не меньшей термостойкостью , чем фермент, синтезиро-

1312008531

ванный культурой-донором В. stearo-.альфа-амилазой, термамилом и превьгthermophilus . Она сравнима по термо-шает по термостойкости альфа-амиластойкости с известной термостойкой

зу в. subtilis.

Таблица

E.coli (контрольна )

Контрольна  +oi-амилаз а

В. stearothermophilus

Таблица

Claims (1)

1. СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ ГИБРИДНОЙ ПЛАЗМИДЫ, СОДЕРЖАЩЕЙ ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД ТЕРМОСТОЙКОЙ 'АЛЬФА-АМИЛАЗЫ, · включающий гидролиз донорной ДНК эндонуклеазой для получения линейной . последовательности ДНК с кодирующим альфа-амилазу геном, гидролиз эндонуклеазой реципие.нтного вектора для получения второй линейной последовательности ДНК, соединение линейных последовательностей ДНК с помощью ДНК-лигазы, причем в качестве донорной ДНК используют природные или гибридные плазмиды из штаммов Bacillus stearothermohilus .АТСС № 31195, 31196, 31197, 31198, 31199, 31783, а в качестве реципиентного вектора используют плазмиду, выбранную из группы плазмид, включающих рВП 322, pBR 325, pWL· 625, и рС 194, из эндонуклеаз используют эндонуклеазу Hind III, а из ДНК-лигаз — ДНК—лигазу фага Т₄._ >