SU1298203A1

SU1298203A1 - Cryoprotector

Info

Publication number: SU1298203A1
Application number: SU853929038A
Authority: SU
Inventors: Мария Иосифовна Шраго; Людмила Анатольевна Ханина; Светлана Владимировна Кощий; Сергей Юрьевич Бидный; Вячеслав Федорович Карташов; Виктор Кузьмич Мазалов; Петр Александрович Пустовойт; Антонина Михайловна Компаниец; Александра Викторовна Николенко; Елена Георгиевна Атовмян; Лилия Зиликовна Верховская; Владимир Михайлович Гучок
Original assignee: Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР
Priority date: 1985-07-12
Filing date: 1985-07-12
Publication date: 1987-03-23

Abstract

Изобретение касаетс криобиологии и может быть использовано при низкотемпературном консервировании биологических объектов, в частности клеток крови, костного мозга и перевиваемых клеточных культур. Целью изобретени вл етс повьшение степени защиты биологических объектов при их низкотемпературном консервировании с использованием ы-монометилового эфира глицерина (ММЭГ) в качестве крио- протектора. Тромбоциты донорской крови помещают в криозацитные среды (в виде 10%-ных растворов в плазме) ММЭГ и глицерина (в качестве сравнени ). Замораживание осуществл ют со скоростью 10 град/мин до минус с по- следук цим погружением в жидкий азот. Деконсервирование провод т путем отогрева на вод ной бане при . При использовании в качестве криопротек- тора ММЭГ сохран етс на 40Z больше клеток, чем в случае применени глицерина , при этом их ретрактильна активность на 20Z выше. 3 .табл. (Л сThe invention relates to cryobiology and can be used for low-temperature preservation of biological objects, in particular blood cells, bone marrow and transplanted cell cultures. The aim of the invention is to increase the degree of protection of biological objects during their low-temperature preservation using glycerol monomethyl ether (MEMEG) as a cryoprotector. Donor blood platelets are placed in cryosacid media (in the form of 10% plasma solutions) of MMEG and glycerol (as a comparison). Freezing is carried out at a rate of 10 K / min to minus with subsequent immersion in liquid nitrogen. Deconservation was carried out by heating in a water bath at. When used as a cryoprotector, MMEG is retained 40Z more cells than in the case of glycerin, while their retractable activity is 20Z higher. 3 .table (L with

Description

Изобретение относитс к криобиологии и может быть использовано при низкoтe fflepaтypнoм консервировании биологических объектов, в частности клеток крови, костного мозга и перевиваемых клеточных культур.The invention relates to cryobiology and can be used for low-level fontrap conservation of biological objects, in particular blood cells, bone marrow and transplanted cell cultures.

Целью изобретени вл етс повьше- ние степени защиты биологических объектов при их низкотемпературном консервировании .The aim of the invention is to increase the degree of protection of biological objects during their low-temperature preservation.

Эта цель достигаетс п:рименением Л-монометилового эфира глицерина (ШЭГ) формулы This goal is achieved by using the L-monomethyl ether of glycerin (SEG) of the formula

сн. - сн - сн „sn. - Sn - Sn „

( он( he

он оси.he axis.

в качестве криопротектора.as a cryoprotectant.

По международной классификации (1961 г.) данное соединение имеет название З-метокси-1,2-пропандиол. 20According to the international classification (1961), this compound is called Z-methoxy-1,2-propandiol. 20

Пример 1. Тромбоциты выдел ют из донорской крови методом дифференцированного центрифугировани .Крио- защитные среды готов т в виде 10%-ныхExample 1. Platelets are isolated from donated blood by the method of differential centrifugation. Cryoprotective media are prepared in the form of 10%

Замораживание осуществл ют по двз этапной программе: со скоростью I 1 град/мин до минус , вьщержка 3 мин при минус , далее до минус со скоростью 10 град/мин с после дующим погружением в жидкий азот. После I5 сут хранени при азотнойThe freezing is carried out according to the internal program: at a rate of I 1 deg / min to minus, at 3 min at minus, then at minus at a rate of 10 deg / min, followed by immersion in liquid nitrogen. After I5 days storage at nitrogen

,температуре минус 196°С отогрев проf/ ..™ вод т на вод ной бане при АО-С до, temperature minus 196 ° С, heating of prof / .. ™ water in a water bath at AO-С to

исчезновени твердой фазы.disappearance of the solid phase.

К тромбоконцентрату, содержащему 2 10 клеток/мл, добавл ют медленно криозащитные растворы в соотнощении 1:1, так, что конечна концентраци глицерина и ММЭГ быпа 5%.зоTo a thromboconcentrate containing 2 10 cells / ml, slowly add cryoprotective solutions in a ratio of 1: 1, so that the final concentration of glycerin and MMEG is 5%.

Замораживание осуществл ют со скоростью 10 град/мин до минус с последующим погружением в жидкий азот. Деконсервирование провод т путем отогрева н а вод ной бане при 37 С.Freezing is carried out at a rate of 10 K / min to minus, followed by immersion in liquid nitrogen. Deconservation was carried out by heating in a water bath at 37 C.

3535

Жизнеспособность клеток костного мозга определ ют по методу Шрека. Результаты представлены в табл,2.Bone marrow cell viability is determined by the Shrek method. The results are presented in Table 2.

В табл. 2 приведены сравнительные данные по криозащитной активности ММЭГ и глицерина при различной конечной концентрации криопротекторов в расчете на исходную концентрацию кле- 2-10In tab. 2 shows comparative data on the cryoprotective activity of MMEG and glycerol at different final concentration of cryoprotectants calculated on the initial concentration of glue - 2-10

Из табл. 1 видно, что при использовании в качестве криопротектора ММЭГ сохран етс на 40% больше клеFrom tab. 1, it can be seen that when used as a cryoprotectant, the MEMG retains 40% more adhesive

ток, чем в случае применени глицерина , при этом их ретрактильна активность на 20% вьше.current than in the case of the use of glycerol, while their retractable activity is 20% higher.

Пример 2. Клеточную взвесьExample 2. Cell suspension

костного мозга развод т в соотношении 1:1 с МЮГ-и глицерином, приготовленными на дистиллированной воде до конечной концентрации криопротекто- ров 5; 7,5; 15%.bone marrow was diluted in a 1: 1 ratio with MYGH and glycerol prepared in distilled water to a final concentration of cryoprotectants 5; 7.5; 15%.

Концентраци клеток, определенна в камере Гор ева, составл ет 2,06 хThe cell concentration determined in the Gorev chamber is 2.06 x

X Ю КЛ/МЛ.X Yu KL / ML.

После 15-минутной эквилибрации клеточную взвесь разливают по 1,5 мл в полиэтиленовые контейнеры и запаивают .After a 15-minute equilibration, the cell suspension is poured into 1.5 ml polyethylene containers and sealed.

Замораживание осуществл ют по двз этапной программе: со скоростью I 1 град/мин до минус , вьщержка 3 мин при минус , далее до минус со скоростью 10 град/мин с последующим погружением в жидкий азот. После I5 сут хранени при азотнойThe freezing is carried out according to the internal program: at a rate of I 1 deg / min to minus, hold for 3 min at minus, then to minus at a speed of 10 deg / min, followed by immersion in liquid nitrogen. After I5 days storage at nitrogen

зоzo

3535

11400 273 166404580 18120 500 57% 83% 91%11400 273 166404580 18120 500 57% 83% 91%

4920±150 112201440 14300+470 25% 56% 71%4920 ± 150 112201440 14300 + 470 25% 56% 71%

Из табл. 2 видно, что при использовании в качестве криопротектора ММЭГ жизнеспособных клеток на 20-30% больше, чем в случае применени глицерина .From tab. 2 that when using viable cells as a cryoprotectant of MEGA is 20-30% more than in the case of glycerin.

Равноценный криозащитньш эффект достигаетс применением более низкихAn equal cryoprotective effect is achieved by using lower

312312

концентраций предлагаемого криопро- тектора. Так, 80% жизнеспособных кле ток, костного мозга цосле замораживани можно получить применением 7,5%- ным раствором МЮГ. тогда как такой же эффект сохранности достигаетс применением 15%-ного раствора глицерина .concentrations of the proposed cryoprotectant. Thus, 80% of the viable cells of the bone marrow during freezing can be obtained by using 7.5% solution of MUG. while the same preservation effect is achieved by using a 15% glycerol solution.

Сравнительное исследование крио- защитной активности глицерина и ММЭГ бьто проведено на перевиваемой культуре клеток почки теленка (ПТ).A comparative study of the cryoprotective activity of glycerin and MMEG was performed on a transplanted calf kidney (PT) cell culture.

Пример 3. Сформировавшийс монослой клеток перевиваемой линии почки теленка в хорошем морфологичес ком состо нии снимают со стекла смесью растворов версена и трипсина в соотношении 9:1. Клеточную взвесь собирают в один сосуд, измер ют ее объем, берут пробу дл подсчета кон- центрации клеток в камере Гор ева.Example 3. A formed monolayer of cells of a transplanted calf kidney line in good morphological condition is removed from the glass with a mixture of solutions of versen and trypsin in a ratio of 9: 1. The cell suspension is collected in one vessel, its volume is measured, and a sample is taken to calculate the concentration of cells in the Gorev chamber.

К суспензии клеток в соотношении 1:1 при посто нном перемешивании добавл ют 20 или 10%-ный раствор ММЭГ или 20%-ный раствор глицерина пита- тельной среде, содержащей: 0,5%-ный гидролизат лактальбумина на растворе Хенкса 45%; среда 199 45%; сьшоротка крупного рогатого скота 10%; канами- цина сульфат 100 мкг/мл. Концентра- 1ЩЯ клеток составл ет 2,110 мл.To a suspension of cells in a 1: 1 ratio, with constant stirring, a 20 or 10% solution of MMEG or a 20% solution of glycerol is added to a nutrient medium containing: 0.5% lactalbumin hydrolyzate on Hanks solution 45%; Wednesday 199 45%; cattle shortening 10%; kanamycin sulfate 100 µg / ml. The concentration of 1SCH cells is 2.110 ml.

Затем клеточную суспензию разливают в полиэтиленовые ампулы по 1,5 мл и запаивают.Then the cell suspension is poured into 1.5 ml polyethylene ampoules and sealed.

Эквилибрацию клеток с криозащитной средой бсуществл ют в течение 1,5 ч при . Охлаждение провод т в программном замораживателе: на первом этапе со скоростью 1 град/мин до минус , на втором - 5 град/мин до мину 70 С, после чего ампулы с суспензией клеток помещают на хранение в жидкий .азот (минус 196°С).Cell equilibration with a cryoprotective medium was carried out for 1.5 h at. Cooling is carried out in a software freezer: at the first stage, at a speed of 1 deg / min to minus, at the second — 5 deg / min to a minus 70 С, after which the ampoules with a cell suspension are placed in storage in liquid nitrogen (minus 196 ° С) .

После 20-дневного хранени осуществл ют деконсервацию клеток путем отогрева на вод ной бане при 37 С. Размороженные клетки перенос т в культу- ральные флаконы, добавл питательную среду до посевной концентрации клеток (2,). Культивирование осуществл ют при 37 °С, производ чеВНИШИ Заказ 857/24 Тираж 372After 20 days of storage, cell deconservation is carried out by warming in a water bath at 37 ° C. Thawed cells are transferred to culture vials, adding nutrient medium to the inoculum concentration of cells (2). The cultivation is carried out at 37 ° C, produced in the order Order 857/24 Circulation 372

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектна , 4Random polygons pr-tie, Uzhgorod, st. Project, 4

3434

ре одни сутки замену среды дл удалени криопротектора.One day replacement of the medium to remove the cryoprotectant.

Сохранность клеток оценивают методом суправитального окрашивани 0,2%-ным раствором трипанового синего , а также по динамике и характеру формировани моносло .Cell integrity is assessed by the method of supravital staining with a 0.2% trypan blue solution, as well as by the dynamics and nature of the monolayer formation.

Концентраци клеток культуры ПТ и их жизнеспособность в суспензии, подвергнутой криоконсервации под защитой глицерина и МЮГ, приведена в табл.3.The concentration of PT culture cells and their viability in the suspension subjected to cryopreservation under the protection of glycerin and MUG are given in Table 3.

ТаблицаЗTable3

Глицерин 10 16,2±1,2 74,0+2,2 10 17,6±0,6 75,011,4 ММЭГ 5 18,0±1,6 82,0±1,1Glycerin 10 16.2 ± 1.2 74.0 + 2.2 10 17.6 ± 0.6 75,011.4 MEMEG 5 18.0 ± 1.6 82.0 ± 1.1

Р1з данных, представленных в табл. следует, что ММЭГ в меньшей, чем глицерин концентрации оказьшает более выраженный криозащитный эффект в отношении клеток перевиваемой культуры ПТ. P1z data presented in Table. it follows that MMEG in less than glycerin concentration exerts a more pronounced cryoprotective effect on cells of the transplantable PT culture.

По истечении 4 сут культивировани монослой клетками был выполнен на 100% поверхности культурального сосуда .After 4 days, monolayer cell culture was performed on 100% of the surface of the culture vessel.

Клетки имеют полигональную форму с хорошо выраженными границами, не тер ют способности пассироватьс . В течение 3 пассажей они без какшс-либо трудностей снимаютс со стекла и пересеиваютс .Cells have a polygonal shape with well-defined borders, they do not lose the ability to pass. Within 3 passages, they are removed from the glass without any difficulties and are subcultured.

Claims

From examples 1-3, it follows that the proposed cryoprotector MMEG has a higher degree of protection than glycerin, while it is less toxic. Invention Formula

The use of glycerol monomethyl ether as a cryoprotectant.

Subscription