SU1267231A1

SU1267231A1 - Проточный цитофлуориметр-сортировщик клеток

Info

Publication number: SU1267231A1
Application number: SU843815912A
Authority: SU
Inventors: Валерий Всеволодович Зенин; Александр Николаевич Третьяков
Original assignee: Ленинградский Институт Ядерной Физики Им.Б.П.Константинова; Институт Цитологии Ан Ссср
Priority date: 1984-11-21
Filing date: 1984-11-21
Publication date: 1986-10-30

Abstract

Изобретение относитс к области технической физики, а именно, к аналитической микрофлуориметрии. Целью изобретени вл етс увеличение чувствительности и точности измерений флуоресценции проточным цитометром-сортировщиком клеток.Устройство состоит из узла эпивозбуждени и сёора флуоресценции. Проточна камера снабжена гидродинамической фокусировкой суспензии клеток. Вход проточной камеры выполнен в виде капилл ра. Узел эпивозбуждени i и сбора флуоресценции содержит высокотемпературный иммерсионный объ (Л ектив . Ось капилл ра расположена в поле зрени микрообъектива. 3 ил. to О) 00

Description

Изобретение относится к технической физике, а именно к аналитической микрофлуориметрии, в частности к приборам для биологии и медицины, и наиболее эффективно может 5 быть использовано для скоростного анализа флуоресценции и автоматической сортировки клеток и клеточных органелл, отличающихся по флуоресцентным характеристикам. ¹⁰

Цель изобретения - увеличение чувствительности и точности измерений флуоресценции проточным цитофлуориметром-сортировщиком клеток.

На фиг, 1 представлена схема про- ¹⁵точного цитофЛуориметра-сортировщика клеток, содержащая источник света 1, коллектор 2, светофильтр 3 для выделения света возбуждения, светоделительную интерференционную пластинку 4, иммерсионный микрообъектив 5 (1, 2, 4, 5·- узлы эпи-возбуждения и сбора флуоресценции) проточную камеру 6 с гидродинамической фокуси- ₂₅ровкой, капилляр 7, светофильтр 8 для выделения света флуоресценции, фотоэлектронный умножитель 9 для выделения света флуоресценции, фотоэлектронный умножитель 9 (ФЭУ), сис- тему анализа и управления сортиров- ³⁰кой кцеток 10, пьезоэлектрический преобразователь 11, систему сбора и разделения клеток., содержащую отклоняющие пластины 12, резервуар 13 сбора клеток. 35 ' На фиг. 2 представлены результаты анализа суспензии лимфоцитов мыши, окрашенных ДНК специфичным флуоресцентным красителем.

Пик В получен при анализе суспензии в стеклянном капилляре через объектив 90*1,25 с масляной иммерсией, а пик А - на той же суспензии клеток, но в режиме анализа в струе 45 в воздухе: эпи-возбуждение и сбор флуоресценции происходили через объектив 40*0,65 в струе в' воздухе при выходе последней цз капилляра..Остальные условия анализа в обоих слу- 50 чаях были одинаковыми. C.V. - коэффициент вариации интенсивности флуоресценции.

На фиг. 3 представлены гистограммы распределения суспензии культуры клеток глиомы человека по содержанию ДНК (по оси абсцисс - интенсивность флуоресценции клеток (отн. ед»)’, по оси ординат - количество клеток).

Гистограмма А получена на исходной суспензии клеток, подвергнутой сортировке. Гистограммы Б и В представляют распределение клеток по содержанию ДНК в суспензиях, полученных в результате сортировки клеток исходной суспензии на фракции, соответствующие по содержанию ДНК пикам 1 и 2.

Изобретение осуществляется следующим образом.

Свет от источника света 1 собирается коллектором 2, проходит через светофильтр 3, служащий для выделения возбуждающего света, и направляется интерференционной светоделительной пластинкой 4 в иммерсионный микрообъектив 5. Исследуемая суспензия кле· ток, предварительно окрашенных флуоресцентным красителем, вытекает из проточной камеры 6 через стеклянный капилляр 7, ось которого расположена в поле зрения иммерсионного микрообъектива 5. Возбуждающий свет вызывает флуоресценцию клеток,свет которой собирается микрообъективом 5, проходит через светофильтр для выделения флуоресценции 8 и поступает на ФЭУ 9. Сигналы флуоресценции клеток преобразуются в электрические импульсы и подаются в систему анализа и управления сортировкой 10.

На выходе капилляра 7 формируется*, струя в воздухе, несущая клетки. Пьезоэлектрический преобразователь 1 1, механически связанный с проточной камерой 6, разбивает струю на капли. После появления клетки с интересующими флуоресцентными параметрами система анализа и управления сортировкой 10 вырабатывает прямоугольный импульс, задержанный по времени рт момента регистрации данной клетки на время, необходимое ей для достижения точки разбиения струи на капли. В течение импульса образуется 4-5 капель, в одной из которых находится клетка, которую надо отсортировать. Импульс заряжает струю, и в результате отделяющиеся капли оказываются заряженными, и, двигаясь между отклоняющими пластинами 1 2„ в постоянном электрическом поле, от•клоняются и попадают в резервудр 13 55 для сбора клеток.

Прибор изготовлен на базе люминесцентного микроскопа МЛ-2, В качестве источника возбуждающего света •применена ртутная лампа сверхвысокого давления ДРШ-250-2, питаемая от источника постоянного тока ИП-16М. Возбуждение и сбор флуоресценции производится через микрообъектив 90» *1,25 с масляной иммерсией. Выход j проточной камеры выполнен в виде цилиндрического капилляра. Для данного микрообъектива использован капилляр с внутренним около 150 мкм и наружным около 450 мкм диаметром. Флу- 10 оресценция клеток регистрируется с помощью фотоэлектронного умножителя ФЭУ-118.

Система амплитудного анализа и управления сортировкой содержит мно- 15 гоканальный амплитудный анализатор АИ-1024-95, блок формирования задержки зарядного импульса, ультразвуковой генератор для питания пьезоэлектрического преобразователя и источни~20 ка высокого напряжения, подаваемого на отклоняющие пластины. В качестве резервуара для сбдра клеток применены центрифужные пробирки объемом 5 мл. Проточная камера, отклоняющие 25 пластины и резервуар для сбора клеток крепятся на предметном столике микроскопа. Выведение объектива на ось капилляра производится с помощью препаратоводителя.

На данном проточно^ цитофлуориметре-сортировщике клеток было оценено увеличение чувствительности предлагаемого устройства по сравнению с прототипом. На фиг. 2 показаны резуль- . таты анализа суспензии лимфоцитов мыши, окрашенных ДНК - специфичным красителем. Пик Б получен при возбуждении и сборе флуоресценции через микрообъектив 90*1,25 с масляной. _Аиммерсией в капилляре. Пик А получен на той же суспензии клеток, но в режиме анализа в струе в воздухе, сходным с режимом, примененным в прототипе: эпи-возбуждение и сбор флуорес ценции происходили через суховоздушный микрообъектив 40»0,65 (в прототипе 32*0,60) в струе в воздухе при выходе последней из капилляра. Остальные условия эксперимента в обоих случаях одинаковы. Сравнение величин сигналов флуоресценции и коэффициентов вариации, рассчитанных для пиков А и Б (фиг, 2), показало, что чувствительность предлагаемого устройства приблизительно в 9 раз выше по сравнению с чувствительностью прототипа при одновременном увеличении точности анализа, определяемой по коэффициенту вариации приблизительно в 3,5 раза.

На проточном цитометре-сортировщике клеток была проведена сортировка суспензии клеток по содержанию ДНК (фиг. 3). Чистота отсортированных фракций (Б, В) составила 932.

Claims

Изобретение относитс к технической физике, а именно к аналитической микрофлуориметрии, в частности к приборам дл биологии и медицины , и наиболее эффективно может быть использова{ о дл скоростного анализа флуоресценции и автоматической сортировки клеток и клеточных органелл, отличаюпщхс по флуоресцентным характеристикам. Цель изобретени - увеличение чувствительности и точности измерений флуоресценции проточным дитофлуориметром-сортировщиком клеток. Иа фиг, 1 представлена схема про точного цитофтГуориметра-сортировщика клеток, содержаща источник света 1, коллектор 2, светофильтр 3 дл выделени света возбуждени , светоделительную интерференционную пластинку 4, иммерсионный микрообъектив 5 (1, 2, 4, 5.- узлы эпи-возбуждени и сбора флуоресценции) проточную камеру 6 с гидродинамической фокусировкой , капилл р 7, светофильтр 8 дл выделени света флуоресценции, фотоэлектронный умножитель 9 дл выделени света йшуоресценции, фотоэлектронный умножитель 9 (ФЭУ), сиетему анализа и управлени сортировкой кдеток 10, пьезоэлектрический преобразователь 11, систему сбора и -разделени клеток., содержащу о отклон ющие пластины 12, резервуар 13 сбора клеток, На фиг. 2 представлены результат анализа суспензии лимфоцитов мьши, окращенных ДНК специфичным флуоресцентным красителем, Пик В получен при анализе суспен зии в стекл нном капилл ре через объектив ,25 с масл ной иммерси ей, а пик А - на той же суспензии клеток, но в режиме анализа в струе в воздухе: эпи-возбуждейие и сбор флуоресценции происходили через объ ектив АО «0,65 в струе В воздухе при выходе последней цз капилл ра.Остальные услови анализа в обоих сл ча х быпи одинаковыми. C.V, - коэффициент вариации интенсивности флуоресценции . На фиг. 3 представлены гистограм мы распределени суспензии культуры клеток глиомы человека по содержани ДНК (по оси абсцисс - интенсивность флуоресценции клеток (отн. ед.О, п оси ординат количество клеток). Гистограмма А получена на исходной суспензии клеток, подвергнутой сортировке. Гистограммь В и В представл ют расцределение клеток по содержанию ДНК в суспензи х, полученных в результате сортировки клеток исходной суспензии на фракции, соответствующие по содержанию ДНК пикам 1 и 2, Изобретение осуществл етс следующим образом. Свет от источника свега 1 собираетс коллектором 2, проходит через светофильтр 3, служащий дл выделени возбуждающего света, и направл етс интерференционной светоделительной плactинкoй 4 в иммерсионный микрообъектив 5, Исследу€;ма суспензи клеток , предварительно окрашенных флуоресцентным краситепем, вытекает из проточной камеры 6 lepea стекл нный капилл р 7, ось которого расположена в поле зрени иммерсионного микрообъектива 5. Возбуждающий свет вызывает флуоресценцию клеток,свет которой собираетс микрообъективом 5, проходит через светофильтр дл выделени флуоресценции 8 и поступает на ФЭУ 9, Сигналы флуоресценции клеток преобразуютс в электрические импульсы и подаютс в систему анализа и управлени сортировкой 10, На выходе капилл ра 7 формируетс%стру в воздухе, несуща клетки. Пьезоэлектрический преобразователь 11, механически св занный с проточной камерой 6, разбивает струю на капли. После по влени клетки с интересующими флуоресцентными параметрами система анализа и управлени сортировкой 10 вырабатьгоает пр моугольный импульс, задержанный по времени от момента регистрации данной о клетки на врем , необходимое ей дл достижени точки разбиени струи на капли. В течение импульса образуетс 4-5 капель, в одной из которых находитс клетка, которую надо отсортировать . Импульс зар жает струю, и в результате отдел ющиес капли оказьшаютс зар женными, и, двига сь между отклон ющими пластинами 1 2, в посто нном электрическом поле, отклон ютс и попадают в резервудр 13 дл сбора клеток. Прибор изготовлен на базе люминесцентного микроскопа МЛ-2, В качестве источника возбуждающего света применена ртутна лампа сверхвысокого давлени ДРШ-250-2, питаема от источника посто нного тока , Воз буждение и сбор флуоресценции производитс через микрообъектив 90 1,25 с масл ной иммерсией. Выход проточной камеры выполнен в виде цилиндрического капилл ра. Дл данного микрообъектива использован капилл р с внутренним около 150 мкм и наружным около 450 мкм диаметром, Флуоресценци клеток регистрируетс с помощью фотоэлектронного умно}кител ФЭУ-118. Система амплитудного анализа и управлени сортировкой содержит многоканальный амплитудный анализатор АИ-1024-95, блок формировани задерж ки зар дного импульса, ультразвуковой генератор дл питани пьезоэлектрического преобразовател и источни ка высокого напр жени , подаваемого на отклон ющие пластины. В качестве резервуара дл сббра клеток применены центрифужные пробирки объемом 5 мл. Проточна камера, отклон ющие пластины и резервуар дл сбора клеток креп тс на предметном столике микроскопа. Выведение объектива на ось капилл ра производитс с помощью препаратоводител , На данном проточноь цитофлуоримет ре-сортировщике клеток было оценено увеличение чувствительности предлага емого устройства по сравнению с прототипом . На фиг, 2 показаны результаты анализа суспензии лимфоцитов мыши, окрашенных ДНК - специфичным красителем. Пик Б получен при возбуж дении и сборе флуоресценции через микрообъектив 90 1,25 с масл ной, иммерсией в капилл ре. Пик-А получен на той же суспензии клеток, но в режиме анализа в струе в воздухе, сход ным с режимом, примененным в прототи пе: эпи-возбуждение и сбор флуоресценции происходили через суховоздушный микрообъектив 40«0,65 (в прототипе 32x0,60) в струе в воздухе при выходе последней из капилл ра. Остальные услови эксперимента в обоих случа х одинаковы. Сравнение ве- личин сигналов флуоресценции и коэффициентов вариации, рассчитанных дл пиков А и Б (фиг, 2), показало, что чувствительность предлагаемого устройства приблизительно в 9 раз выше по сравнение с чувствительностью прототипа при одновременном увеличении точности анализа, определ емой по коэффициенту вариации приблизительно в 3,5 раза. На проточном цитометре-сортировщике клеток была проведена сортировка суспензии клеток по содержанию ДНК (фиг, 3). Чистота отсортированных фракций (Б, в) составила 93%, Формула изобретени. Проточный цитос1Шурриметр-сортиров-: щик клеток, содерлсащий узел эпивозбуждени и сбора флуоресценции, на выходе которого установлен микрообъектив , проточную камеру с гидродинамической фокусировкой суспензии клеток , корпус которой механически св зан с пьезоэлектрическим преобразователем , систему анализа и управлени сортировкой клеток, причем.на выходе камеры установлена система сбора и разделени клеток, отличающийс тем, что, с целью увеличени чувствительности и точности измерений флуоресценции, выход проточной камеры вьшолнен в виде капилл ра , ось которого расположена в поле зрени мшсрообъектива, выполненного , иммерсионным и высокоапертурным .

V

ifex

Z

n

Vut.f

ctr

-

IхЗ

-I ,J

Кол-60 клеток

фиг.З

Интенсивность (p i/opeci(€Hmtu(omN,eff)