SU1146002A1 - Способ количественного определени фибриногена в плазме крови - Google Patents

Abstract

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИБРИНОГЕНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ, включающий свертьтание фибриногена плазмы коагулирующий агентом с последующим количественным определением скоагулированного фибриногена , отличающийс  тем, что, с целью повьгазени  точности способа, определ ют как свертьгааемый, так и несвертьшаемый тромбином фибриногены , а в качестве коагулирующего агента используют  д многочешуйчатой эфы (Echis multisguamatus).

Description

Изобретение относитс  к медицине, в частности к лабораторной диагностике нарушений свертываемости крови.

Известен способ определени  концентрации фибриногена в плазме крови путем высаливани  сульфатом аммони  с последукедим измедением коагул та фотокалориметрическим или спектрофотометрическим методом 1.

Однако данный способ не обеспечивает селективного определени  фибриногена из-за частичного осаждени  других белков плазмы.

Наиболее близким к изобретению по техничесаой сущности и достигаемому результату  вл етс  способ количественного определени  содержани  фибриногена в плазме, включающий свертывание фибриногена естественным ферментом тромбином, который обладает специфическим воздействием только на фибриноген и Не коагулирует другие белки, с поСледукщим фотокалориметрическим определением скоагулированного белка после его гидролиза 2 .

Недостатками известного способа,  вл ютс  невозможность определени  ТОЙ части фибриногена, котора  утратила способность свертыватьс  тромбином , а также трудность сбора без потер) слабоконсолидированных сгустков, образующихс  при синдроме диссеминированного внутрисосудистого свертывани  крови и других видах патологии.

Цель изобретени  - повьшение точности способа.

Поставленна  цель достигаетс  тем что согласно способу количественного определени  фибриногена в плазме крови , включающему свёртывание фибриногена плазмы коагулирующим агентом с последующим количественнь1м определением скоагулированного фибриногена, определ ют как свертываемьй, так и несвертываемый тромбином фибриногены а в качестве коагулирзпмцего агента используют  д многочешуйчатой эфы

(Echis raultisguamatus).

-.-iПример 1. КО,2 мл цитратно плазмы добавл ют 4,8 мл мединалового буфера (рН 7,4), инкубируют смесь при в течение 5 мин, затем добал ют 0,1 мл рабочего раствора iiiHoroчешуйчатой зфы (1-1(J -5.-10 мг/мл) перемешивают содержимое пробирки стел ной палочкой и инкубируют 10 мин

при . Затем сгусток, образовавшийс  в пробирке, извлекают, промывают в холодном растворе NaCl, сушат, отжима  на фильтровальной бумаге, и перенос т в пробирку с 0,2 мл 0,1М раствора КаОН. Пробирку помещаю на 10 мин в кип щую вод ную баню до растворени  сгустка, затем в .пробирк ввод т 6 мл 12,5%-ного раствора и 1 мл 0,1М раствора CuSO , перемешивают 10 мин, добавл ют 1 мл раствора Фолина-Чикалто, разбавленного 1:2 дистиллированной водой и чере 30. мин определ ют оптическую плотнос раствора на фотоэлектрокалориметре с красным фильтром. По привой разведений очшг1енного фибриногена показатели оптической плотности перевод т количество фибриногена, г/л.

Яд змеи эфы многочешуйчатой (Echis multisguamatus), облада  гемокоагулирующим действием, отличаетс  от тромбина следующими свойствами: его действие не блокируетс  гепарином и комплексом антитромбин Ш-гепарин, он коагулирует так называемьй заблокированный или тромбинорезистетньй фибриноген, т.е. фибриноген , вход щий в фибрин-мономерные комплексы.

Пример 2. Сравнительное определение концентрации фибриногена тромбином и  дом многочешуйчатой эфы при блокировании коагул ции гепарино

Исследовани  на смешанной нормальной плазме (источник фибриногена).

Реактивы: смешанна  нормальна  плазма с 3,5 г/л фибриногена; источник антитромбина Ш-дефибринированна  плазма (плазма, проинкубированна  пр 56°С и течение 5 мин); раствор тромбина активностью в 20-5 с; рабочий раствор  да; разведени  гепарина 0,1-1,0 ед/мл. 1

Проводитс  параллельное определение концентрации фибриногена известным и предлагаемым способами при различных уровн х гепаринизации испытуемых образцов плазмы.

Результаты проведенных исследований представлены в табл. К

Из табл. 1 видно, что ни фоне гепаринизации количество фибриногена, свертьгоаеМого тромбином, прогрессивно снижаетс , начина  с концентрации гепарина 0,3-0,4 ед/мл, а при 0,6 ед/мл не определ етс  в -св зи с полным блокированием свертывани . В

отличие от этого, при использовании в качестве коагулирущего агента  па Echis muktiseuamatus. гепаринизаци  не вли ет на количественное определение фибриногена в тех дозах, которые полностью блокируют естественную коагул цию.

Такиг образом, предлагаемый метод позвол ет определ ть концентрацию фибриногена в плазме даже при очень интенсивной гепаринизации больных, дающей полную несвертьтаемость крови

Исследовани  на растворе очищенного фибриногена.

Реактивы: раствор очищенного фибриногена, содержащий 94% свертываемого белка (по Лоури) в концентрации 4,0 г/л; источник антитромбина Ш-дефибринированна  плазма; раствор тромбина, активностью с; рабочий раствор  да эфы; разведени  гепарина 0,1-1,0 ед/мл.

Параллельное определение концентрации фибриногена производитс  известным и предлагаемый способами при разных уровн х гепаринизации (табл. 2

Из табл. 2 видно, что при коагул ции тромбином гепарин вызывает уменьшение количества определ емого фибриногена, тогда как с помощью  да вы вл етс  весь введенный в систему фибриноген (4,0 г/л). I

Пример 3. Сравнительное

определение содержани  фибриногена при свертьшании тромбином (известным ,способом) и  дом змеи Echis multisguamatus (предлагаемым способом) у больных с синдромом-диссеминированного внутрисосудистого свертывани  крови (ДВС-синдромом).

У этих больных вы вилось более или менее выраженное блокирование фибриногена в фибрин-мономерных комплексах, что устанавливалось определением продуктов деградации

фибриногена в плазме, а таЛже по положительным результатам этаноловог и протамин-сульфатного тестов. Конт{зольные исследовани  проводились на плазме здоровых людей. В двух опытнь группах было 35 больных, в контрольной группе - 20 здоровьгх людей. Первую опытную группу составили больные с ДВС-синдррмами в фазе гипокоагул ции (20 человек), во вторую опытную группу (15 человек) вопти больные с ДВС-синдромами с полной несвертываемостью крови.

Результаты проведенных исследоваНИИ представлены в табл. 3.

Из табл. 3 видно, что у здоровых людей определ етс  примерно одинаковое количество фибриногена при свертывании тромбином (известный метод) и  дом эфы (предлагаемый метод). В отличие от этого у больных с помощью  да эфы вы вилось достоверно больше количество фибриногена, чем при свер тывании тромбином. После коагул ции тромбином и удалени  образовавшихс  сгустков при дополнительном введении  да Echis multisguamatus образовалс  второй сгусток из тромбинрезистентного фибриногена. В разных случа х количество такого заблокированного фибриногена составило в среднем 1,27-0,78 г/л, т.е. достигало значительных величин. При исследовании больных в фазе полной несвертываемкости тромбином вызвать коагул цию плазмы не удавалось, а  д эфы вызывал формирование плотного консолидированного фибринового сгустка. Проведение этанолового теста после свертывани  тромбином вы вл ло фибрин-мономерные комплексы у больны с ДВС-синдромом в 80% случаев. В отличие от этого, после свертывани   дом эфы этаноловый тест всегда отрицательный , что говорит об осаждени заблокированного фибриногена и фибрин-мономерных комплексов этим коагулирующим агентом.

П р и м е р 4. Практическое использование предлагаемого способа определени  содержани  фибриногена в плазме крови на больных.

Больна  К.Н., 25 лет. Диагноз: беременность 29 недель, внутриутробна  гибель плода, ДВС-синдром, маточное кровотечение несвертьшающейс  кровью.

Результаты лабораторного исследовани  системы гемостаза: аутокоагу- л ционньй тест на 10-й мин 35 с: каолин-кефалиновое врем  свертывани  87 с (контроль 45 с); протромбиновое врем  42 с (контроль 17); тромбиновое врем  73 с (контроль 20 с); этаноловый тест - положительный.

Содержание фибриногена при коагул ции тромбином составило 0,70 г/л.

Сделано заключение о выраженной гипофибриногенемии. Определение  дом эфы вы вило 2,5 г/л фибриногена Таким образом, с помощью  да вы ви$

.лось значительное количество фибриногена , не свертьшающегос  тромбином )в св зи с чем сделано заключение об отсутствии истинной гипофибриногенемии .и наличии в плазме большого количества заблокированного фибриногена , количество которого составило по подсчету 2,5 г/л - 0,7 г/л 1,8 г/л. Этаноловый тест после коагул ции тромбином оставалс  положительным , а после коагул ции  дом эфы становилс  отрицательным. Это позволило назначить адекватное лечение.

Больной К.С., 23 г. Диагноз; состо ние после операции по поводу аневризмы ветви легочной артерии, ДВС-синдром, массивное кровотечение из послеоперационного шва., син ки на теле.

Результаты лабораторного исследовани  системы гемостаза: аутокоагул ционный тест на 10-й мин -.17 с; каолин-кефалиновое врем  свертывани  50 с (контроль 45 с); протромбиновое врем  25 с (контроль 18 с); тромбиновое врем  23 с (контроль 15 с); этаноловый тест положительный; при свертывании тромбином сформировалс  некачественньш мелкозернистьй сгусток, отжать и высушить которьш не удалось,  дом эфы определено 3,5 г/л фибриноГена. Сделан вывод о массивном внутрисосудистом свертывании крови с образованием фибрин-мономерных комплексов и бло- кированием в них фибриногена. А60026

Больной Р.А., 45 лет. Диагноз: ос.трый недифференцированньш лейкоз, ДВС-синдром, кровоизли ние в мозг с гемипарезом, желудочное кровотечение. 5 Син ки на теле, макрогематури .

I

Результаты лабораторного иЬследовани  системы гемостаза: аутокоагул ционный тест на 10-й мин нет свертьшани ; каолин-кефалиновое врем  свертывани  - нет свертывани  (контроль 50 с); проторомбиновое врем  75 с (контроль 18 с); тромбиновое врем  110 с (контроль 15 с);

15 этаноловый тест положительный; фибриноген при свертывании тромбином составил 0,5 г/л, при коагул ции  дом эфы 4,5 г/л. Количество заблокированного фибриногена составило

20. 4,5-0,5 4,0 г/л. Назначенное лечение , соответствующее фазе ДВС-синдрома .

Предложенный способ обеспечивает повышение точности определени  концентрации фибриногена в плазме за счет коагул ции как всертываемого, так и несвертываемого тромбином (тромбино-резистентно го) фибриногенов , что имеет важное значение в диагностике массивного тромбоза, диссеминированного внутрисосудистог свертывани - крови, дифференциации этих состо ний с гипергепаринемией, что весьма важно дл  диагностики и лечени .

Скоагулированный тромбином 3,5 3,5 3,0 2,2 1,3 Скоагулировэнный  дом многочешуйчатой эфы 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 Нет свертывани  3,5 3,5 3,5 3,5 3,5

Claims (1)

1. СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИБРИНОГЕНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ, включающий свертывание фибриногена плазмы коагулирующий агентом с последующим количественным определением скоагулированного фибриногена, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, определяют как свертываемый, так и несвертываемый тромбином фибриногены, а в качестве коагулирующего агента используют яд многочешуйчатой эфы (Echis multisguamatus).