SK8902003A3 - Use of L-carnitine as stabilizing agent of proteins - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka technickej oblasti stabilizácie proteinov, najmä terapeutických účinkov stabilizácie proteinov.

Doterajší stav techniky

Pri vytváraní proteinov a polypeptidov, či už extrakciou alebo technikami biotechnológií rekombinantov, je problémom udržovanie správneho skladania proteínu tak, aby si udržal požadovanú aktivitu.

Neskladanie alebo nesprávne alebo inak modifikované skladania sa môžu vyskytovať z dôvodu technickej manipulácie alebo všeobecných procesných systémov pre vytváranie proteinov.

Ďalší problém pri spracovaní proteínových látok je daný zhlukovaním proteinov.

Stav techniky ponúka mnoho riešení. Niektoré z nich sú svojim charakterom chemické, čo znamená, že sú použité chemické činidlá, ako sú napríklad jednotlivé zmesi solí, hoci aj v pufrových roztokoch.

US 5 728 804, podľa výskumu Corporation Technologies, popisuje spôsob proteínovej renaturácie prostredníctvom bezdetergentných cyklodextrínov. US 5 563 057, podľa výskumu Wisconsin Alumni Research Foundation, iného než je cyklodextín, hovorí o použití určitých detergentov pre opätovné skladanie zle skladaných enzýmov.

US 5 874 075, podľa Amgen, popisuje komplexy proteinov : fosfolipidov užitočných pre stabilizáciu proteinov proti tepelne vyvolanému zhlukovaniu, denaturácii a strate aktivity.

US 5 756 672, podľa Genetech, uskutočňuje zlúčeninu zahrňujúcu polypeptid v určitom pufri. Tento pufor je vhodný pre opätovné skladanie nevhodne skladaných polypeptidov. Osobitné uskutočnenie je dané pre opätovné skladanie zle skladaného rastového faktoru I podobného inzulínu.

Vyššie uvedené spôsoby by mohli byť konvenčné, keďže sú tu použité ľahko dostupné chemické látky, napríklad soli medi alebo mangánu (US 5 756 672).

Opätovné preskladanie sa vyskytuje tiež prostredníctvom chromatografických technik, viď Altamirano, M.M. etal. Nat. Biotechnol. 1999 feb; 17(2): 187-91.

Objavenie chaperonínov otvorilo novú oblasť pre technológiu spracovania proteinov.

Chaperoníny, tiež známe ako proteiny tepelného šoku alebo HSP, sú prírodné proteiny vykazujúce biologickú úlohu pri skladaní proteinov. Viď extenzívny prehľad htpp://www-ermm.chcu.cam.ac.uk/000021015h.htm od Júlia C. Ranford, Anthony R.M. Coates a Brian Handerson.

Technicky sú chaperoníny intenzívne skúmané ako prostriedky pre členenie vyššie uvedeného problému stabilizácie proteinov a opätovného skladania.

Tento výskum vedie k novo objaveným chaperonínom a k ich použitiu pre stabilzáciu proteinov, viď napríklad US 5 428 131, podľa Yale University. Pre obraz chaperonínov u technického problému, ktorému čelí tento vynález, viď napríklad US 5 688 651 podľa RAMONT University; US 5 646 249, podľa U.S: Health Department; US 5 561 221 podľa Nippon Oil Company Limited, WO 00/20606 podľa Remain and Schirmbeck, JP 11266865 podľa Kaiyo Biotechnology Kenkyusho KK, WO 99/40435, podľa Netzer; JP 10327869 podľa Kaiyo Biotechnology Kenkyusho KK; WO 00/71723 podľa Roche Diagnostics; WO 00/55183 a WO 99/05163 podľa Medical Research Council.

Chaperoníny sú užitočné prostriedky pre stabilizáciu proteinov a opätovné skladanie, ale niektoré technické nedostatky prichádzajú pri ich použití. Keďže sú to proteiny, hoci majú sklon k zmene ako je tepelná, potrebujú tiež nejaký ochranný faktor.

V technickej oblasti stabilizácie proteinov je tento problém veľmi dôležitý pri príprave HSP vakcín rakoviny. Bolo pozorované, že imunogenicita daného antigénu je zachytená ďaleko účinnejšie, ak je prítomný v imúnnych bunkách v komplexe s HSP (Requena, J.M. et al., Ars-Pharm 1997, 38(2-3):191-208; Castelino, F. et al., J. Exp Med. 2000, 191(11):1957-1964). Zvlášť, imunitná odpoveď na rakovinu je podporená s HSP (t.j. HSP70 alebo gp96), ktoré sú viazané s antigénnym peptidom („špecifické antigénne identifikačné odtlačky“), z ktorých oboje sú získané z rakovinových buniek pacientov (Yedavelli Spet al Int. J. Mol. Med. 1999, 4(3):243248). Preto je dôležité mať stabilný a/alebo dobre chránený HSP pre vakcíny rakoviny.

Zaujímavo, niektoré chaperoníny, ako sú alfa-kryštalínové proteiny očnej šošovky, sú členmi malej rodiny proteinov tepelného šoku (sHSP). sHSP boli ukázané ako fungujúce v množstve rôznych procesov v rozmedzí od RNA stabilizácie po elastázovú inhibíciu a interakciu s cytoskeletom.

AlfaA-kryštalín sa nachádza primárne v očnej šošovke, vo veľmi malých hladinách bol zistený v iných tkanivách, pričom alfaB-kryštalín je teraz známy ako v podstate všade sa vyskytujúci v organizme (Haley, D.A. et al., J. Mol. Biol. 1998, 277:27-35). Biologický význam alfaB-kryštalínu je zvýraznený jeho zvýšenými hladinami pri ischémii srdca a v mozgu pacientov so sklerózou multiplex, Alzheimerovou chorobou a neurologickými ochoreniami. V zhode s klasifikáciou ako HSP bolo ukázané, že alfaB-kryštalín je vyvolaný škálou fyziologických stresov vrátane tepla, osmotického tlaku a toxicity kovov. Biologický význam alfaA-kryštalínu v očnej šošovke je zvýraznený jeho účinným potláčaním a nekontrolovaným zhlukovaním poškodených proteinov.

Ako sa zdá z vyššie uvedených príkladov, stabilizácia chaperonínov, buď pre ich použitie alebo pre ich stabilizáciu pri týchto patologických stavoch, v ktorých sú tieto zmenené, je veľmi dôležitá v oblasti medicíny.

Podstata vynálezu

Teraz bolo zistené, že L-carnitín má prekvapujúci efekt pri stabilizácii proteinov a zvlášť priaznivý aspekt pre oblasť medicíny, L-carnitím má prekvapujúci efekt pri ochrannej aktivite chaperónov, táto ochranná aktivita je vykazovaná prostredníctvom stabilizačného efektu L-carnitínu smerom k chaperónovej aktivite.

Potom je cieľom predkladaného vynálezu použitie L-carintínu alebo jeho soli na stabilizáciu proteinov, zvlášť ako pomocného faktora pri ochrannej aktivite chaperónov.

V jednom prednostnom uskutočnení predkladaného vynálezu je L-carnitín použitý v terapeutickej oblasti na chránenie aktivity zmenených chaperónových proteinov.

V spojení s prvým prednostným uskutočnením je L-carnitín použitý na prípravu lieku na liečbu ochorení v dôsledku zmenených chaperónových proteinov.

V druhom prednostnom uskutočnení predkladaného vynálezu je L-carnitín použitý na prípravu lieku na liečbu ochorení na báze zmenenej aktivity alfakryštalinového proteínu, konkrétnejšie alfaA- a / alebo alfaB-kryštalínu. Ochorenia, ktoré môžu byť liečené, sú napríklad ischemické srdce a mozog pacientov so sklerózou multiplex, Alzheimerovou chorobou a inými neurologickými ochoreniami.

V treťom uskutočnení ochorením je oftalmologické postihnutie, kde α-kryštalín je zmenený chaperónový protein. V špecifickom aspekte sa predkladaný vynález používa pri liečbe katarakty, s vylúčením katarakty diabetického pôvodu.

Cieľom predkladaného vynálezu sú tiež proteiny, najmä chaperoníny, ako je

HSP, stabilizované prostredníctvom L-carnitínu.

V súlade s tým, ďalšími cieľmi predkladaného vynálezu sú použitie L-carnitínu alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli na prípravu lieku na liečbu katarakty nediabetického pôvodu.

Špecifickým cieľom predkladaného vynálezu je oftalmologický prípravok obsahujúci vhodné množstvo L-carnitínu alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli. Tento oftalmologický prípravok môže prípadne obsahovať ďalšiu aktívnu zložku užitočnú na liečbu katarakty nediabetického pôvodu.

Vyššie uvedené ciele predkladaného vynálezu budú zobrazené podrobne tiež prostredníctvom príkladov.

Podrobný popis vynálezu

Za farmaceutický prijateľnú soľ L-carnitínu sa pokladá soľ, organická alebo anorganická, vhodná pre použitie v oblasti humánnej alebo veterinárnej medicíny. Vo všeobecnej oblasti stabilzácie proteínov môže byť použitá akákoľvek soľ s podmienkou, že je kompatibilná so špecifickou aplikáciou.

Príklady farmakologicky prijateľných solí L-carnitínu, ale bez obmedzenia sa len na nasledujúce, sú chlorid, bromid, jodid, aspartát, kyselina asparágová, citrát kyselina citrónová, vínnan, kyselina vínna, fosforečnan, kyselina fosforečná, fumarát, kyselina fumárová, glykofosforečňan, laktát, maleát, kyselina maleinová, mukát, orotát, šťavelan, kyselina štavelová, síran, kyselina sírová, trichlóracetát, trifluóracetát, metánsulfonát, pamoát a kyselina pamoová.

Prednostné uskutočnenia vynálezu

Očná šošovka je priehľadný orgán vytvorený vysoko koncentrovanou a vysoko usporiadanou matricou štruktúrnych proteínov nazvaných „kryštalíny“, ktoré sú pravdepodobne najdlhšie žijúcimi proteinmi organizmu (Wistow, G., a Piatigorsky, J. (1988), Ann. Rev. Bioechem, 57, 479-504; Blomendal, H. (1982), Biochem. 12, 1-38; Bettelheim, F.A. (1985), The Ocular Lens Structure, Function, and Pathology, (Maisel, H. ed.) strany 265-300, Marcel Dekker, Inc., New York; Tardieu, A., a Delay,

M. (1988), Ann. Rev. Biophys. Chem. 17, 47-70).

Posttränslačné modifikácie šošovkového kryštalínu, v dôsledku veku alebo ochorenia ako je diabetes, môže vyústiť do konformačných zmien a zhlukovania týchto proteínov a viesť k nepriehľadnosti a k vytvoreniu katarakty (Harding, D. (1981), Molecular and Cellular Biology of the Eye Lens (Bloemendal, H., ed;) strany 327-365, John Willey and Sons, New York). Hoci mechanizmy vytvorenia katarakty nie sú dobre poznané, oxidácia šošovkových proteínov je spojená s kataraktou u cicavcov (Francis, P.J. (1999), Trends in Genetics 15, 191-196).

Šošovka prechádza hlavným oxidačným tlakom, pretože je stále vystavená svetlu a oxidantom (Varma, S.D., et al. (1984), Curr. Eye Res. 3, 35-57, Spector, A. (1995), FASEB J. 9, 1173-1182; Taylor, A., and Davies, K.J. (1987), Free Radic. Biol. Med. 3, 371-377; Zigman, S. (1981), Mechanisms of Cataract Formation in the Human Lens (Ducan, G., ed.) strany 117-149, Academic press, New York; I. Dillon,

J. (1985), The Ocular Lens Structure, Function, and Pathology, Maisel, H. ed, Marcel Dekker, Inc., New York). Oxidačné modifikácie zahrňujú selektívnu oxidáciu špecifických aminokyselín, ktorá má za následok zmeny náboja, degradácie proteínov, priečnej väzby proteínov a nerozpustnosti, a zvýšenie tryptofánovej fluorescencie (Spector, A., and Gamer, W.H. (1981), Exp. Eye Res. 33, 673-681 Andley, U.P. (1987), Photochem, Photobiol. 46, 1057-1066 Davies, K.J.A., et al., (1987), J. Biol. Chem. 262, 9914-9920 Augusteyn, R.C. (1981), Mechanisms of Cataract Formation in the Human Lens (Ducan, G., ed.) strany 72-115, Academic Press, London Zigler, J.S. Jr. et al., (1989), Free Radic. Biol. Med. 7, 499-505). Následne boli rozvinuté antioxidačné systémy a opravné mechanizmy, aby opačne pôsobili ako efekty oxidantov. Prvá línia obrany proti oxidačnému tlaku je vytvorená antioxidantmi zachytávajúcimi radikály, ktoré redukujú oxidačné napadnutie. Napríklad, glutatión (GSH) a taurín, ktoré sú oba vysoko zastúpené v tkanive očnej šošovky, vykazujú ochranné efekty u in vitro modelov diabetickej katarakty (Richard, R.C. et al., (1998), Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217, 397-407, Jones, R.A.V. and Hothersall, J.S. (1999), Exp. Eye. Res. 69, 291-300). Ďalej, α-kryštalín, ktorý vytvára až do 50% celkovej proteínovej hmoty šošovky cicavcov pôsobí ako molekulový chaperón, ktorý zabraňuje teplom vyvolanému zhlukovaniu mnohých proteínov a je potrebný na renaturáciu chemicky denaturovaných proteínov (Jones,

R.A.V. and Hothersall, J.S. (1999), Exp. Eye Res. 69, 291-300). Kľúčový element α-kryštalínovej funkcie je jeho schopnosť zabrániť nenormálny spojeniam proteinov pomocou viazania na prechodne vystavené hydrofóbne proteínové povrchy (van den Ussel, P.R. et al. (1996), Opthalmic Res. 28, 39-43). Pretože α-kryštalín zabraňuje ultrafialovému žiareniu aj voľnými radikálmi vyvolanému zhlukovanoiu proteinov in vitro (Groenen, P.J. et al. (1994) Eur. J. Biochem. 225, 1-19, Andley, U.P. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 31252-31261; Lee, J.S. et al. (1997) J. Protein Chem. 16, 283-289; Kramps, J.A. et al. (1978), Biochem. Viophys. Acta 533, 487-495; van Kleef, F.S.M., et al. (1976), Eur. J. Biochem. 66, 477-483 Smulders, R.H.P.H. et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 29060-29066), môže ochraňovať aj šošovkové proteiny od fotooxidačných zmien in vivo.

US patent č. 5 037 851 vydaný 6.8.1991 s prioritou 15.11.1988 v mene tohto istého právneho zástupcu ako u predkladaného vynálezu, nárokuje terapeutický spôsob liečby katarakty, ktorý obsahuje podávanie subjektu majúcemu kataraktu orálne alebo parentálne 1000 až 2000 mg/deň acetyl-D-carnitínu alebo ekvivalentného množstva jednej z jeho farmaceutický prijateľných solí. Poznanie tohto patentu je obmedzené na acetyl-D-carnitín.

Vynálezca predkladaného vynálezu a jeho kolegovia predtým ukázali, že u experimentálneho diabetu zvierat zníženie carnitínu v šošovke a všade sa vyskytujúcej molekule obsiahnutej v mnohých biologických cestách, je v začiatku dôležité a selektívny prípad sa snáď vzťahuje na vytvorenie katarakty (Pesotto, P, et al., (1997) Exp. Eye Res. 64, 195-201). V tomto dokumente je objavené ako je pri diabetických stavoch strata L-carnitínu v šošovke a hladiny carnitínu v iných tkanivách oka sa zdajú byť v podstate nezasiahnuté. Autori uzavierajú, že úloha L-carnitínu v šošovke je stále nejasná, ale jeho strata sa môže týkať vzniku katarakty. V tejto referencii je dobré odporučenie použiť acetyl-carnitín dávajúci dobrý dôvod pre očakávanie úspechu na zabránenie vzniku katarakty farmakologickým pôsobením, ako bolo ukázané u aspirínu. Dôvod očakávania priaznivého pôsobenia pomocou acetyl-carnitínu z pohľadu dobre známeho pôsobenia aspirínu je v tom, že obe zlúčeniny majú acetylačné vlastnosti, ktoré pri svojej premene sú zodpovedné za ochranu šošvkových proteinov.

Popri svojej primárnej funkcii ako nosiča mastných kyselín s dlhým reťazcom z cytoplazmy na miesta β-oxidácie, sa predpokladá, že L-carnitín by mohol slúžiť aj na udržovanie bunkovej homeostázy.

Swamy-Mruthinti, S., a carter, A.L: (1999), Exp Eye Res 69, 109-115 ukázali, že L-carnitín je in vitro neefektívny pri glykácii šošovkových kryštalínov, pričom acetyl-Lcarnitín a acetyl-salicylová kyselina znižovali glykáciu krystalínu. Tieto uvažovania vysvetľujú prečo hladiny L-carnitínu v rôznych tkanivách zvierat vždy nekorelujú s energetickými požiadavkami tkanív alebo lipidovým metabolizmom. Napríklad, očné šošovky, cievami neprekrvované tkanivo, ktorého hlavným zdrojom energie je glukóza absorbovaná z zrakových tekutín, má vyššie koncentrácie L-camitínu než iné očné časti (Pessoto, P. et al (1994) J. Ocul. Pharmacol. 10, 643-651).

Tento vynález v súlade s tým uvažuje použitie L-carnitínu a jeho farmakologicky prijateľných soli na prípravu oftalmologického farmaceutického prípravku na terapeutickú liečbu katarakty, najmä katarakty nediabetického pôvodu. V praxi, terapeuticky účinné množstvo L-carnitínu alebo ekvivalentné množstvo jednej z jeho farmakologicky prijateľných solí je podávané do oka, prípadne s obsahom ďalšej aktívnej zložky užitočnej na liečbu katarakty nediabetického pôvodu.

Prednostne je prípravok vo forme očných kvapiek. Očné kvapky sú aplikované v rozsahu terapeutickej potreby, ako to určí odborník a závisí na podmienkach pacienta, vážnosti ochorenia a iných faktoroch, ktoré zváži odborník. Napríklad môžu byť vhodné , 2-3 kvapky 3-4-krát denne.

Prípravky pre očné kvapky obsahujú obvyklý sterilný izotonický roztok. Výber vhodných excipientov je v rámci schopností bežného odborníka vo farmakologickej technológii. Napríklad, pre excipienty sa použije chlorid sodný, dibázický fosforečnan sodný monobázický fosforečnan sodný, benzalkóniumchlorid a etylakohol. Prípravok je doplnený na správny objem destilovanou vodou.

Príklady

Materiály a spôsoby Kultúra orgánu šošovky

Potkany Sprague-Dawley vo veku štyri mesiace boli anestetikované 5 mg/kg xylazínu a 65 mg/kg ketamínu a bola im odrezaná hlava. Okamžite potom boli oči vybrané, extrahované a umiestnené do 2 ml modifikovaného TC-199 média. Integrita očnej šošovky bola stanovená meraním proteínu vyluhovaného do média kultúry po

30-60 minútach; poškodené očné šošovky boli odhodené. Jedna očná šošovka z každého páru bola umiestnená do média kultúra bez H2O2 a použitá ako kontrolná. Po 24 hodinách sa kontrolované šošovky nelíšili od čerstvo vybratých šošoviek v žiadnom z parametrov hodnotených v tejto štúdii. Kontrolované šošovky z každého páru boli umiestnené v médiu a po uvedení do rovnováhy s 5% CO₂ pri 37°C boli vystavené 500 μΜ HO v neprítomnosti alebo prítomnosti 300 μΜ L-carnitínu. Po 24 hodinách inkubácie, boli zaznamenané morfologické charakteristiky a zmeny a očné šošovky boli fotografované. Inkubované šošovky boli prepláchnuté soľným roztokom, vysiate na filtračnom papieri, odvážené a potom ihneď spracované na biochemickú analýzu. Na determinovanie vytekania laktát dehydrogenázy (LDH) boli šošovky inkubované jednotlivo v každom rozdielnom médiu a médium bolo zozbierané denne a uchované na LDH analýzu.

Extrakcia šošovkových proteinov

Odpúzdrené šošovky boli homogenizované roztieracou tyčinkou na jedno použitie a potom boli vibrované ultrazvukom (20 mM HEPES, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM ditiotreitol, 450 mM NaCi, 25% glycerol, 0,5 μΜ/ml leupeptín, 0,5 μg/ml protinín, 0,5 mM fenylmetánsulfonylfluorid) na ľade. Podiely homogenátu z každej z inkubovaných šošoviek boli odobraté na analýzu GSH a L-carnitínu. Zvyšok bol centrifugovaný po dobu 25 minút pri 20 000 otáčkach na separovanie supernatantu z peliet. Peleta bola premytá s 1,0 ml pufru a vysušená pod dusíkom. Táto frakcia bola označená ako „vo vode nerozpustná“ frakcia. Frakcia supernatantu bola dialyzovaná dvakrát voči 3 ml 0,025 mol/l fosforečného pufru, pH 7,4 po dobu 48 hodín a lyofilizovaná. Táto frakcia bola označená ako „vo vode rozpustná“ frakcia. Vo vode rozpustná a vo vode nerozpustná frakcia bola odlipidovaná s 3,0 ml chloroform : metanol (2 :1) po dobu 16 hodín pri trasení, po ktorom nasledovalo centrifugovanie pri 2000 otáčkach po dobu 5 minút.

Po tom, ako bolo organické rozpúšťadlo odobraté, bol zvyšok upravený s 2,0 ml dietyléteru, ponechaný stáť po dobu 5 minút a potom bol centrifugovaný pri 2000 otáčkach po dobu 5 minút. Peleta bola vysušená na vzduchu a uložená pri 4°C v sušičke.

Príprava kryštalínov

Vo vode rozpustné kryštalínové frakcie boli izolované preparativnou chromatografiou s gelovým prestupom Sephacryl S-300-HR, ako už popísal (Smulders, R.H.P.H. et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 29060-29066, de Jong, et al. (1974), Eur. J. Biochem. 48, 271-276). Stručne, rozpustný protein bol aplikovaný na 100 x 1,5 cm stĺpec a rozvinutý rovnomerne s fosforečným pufrom. Celkové frakcie z kontrolných a H2O2 ± L-carnitínom liečených šošoviek boli koncentrované ultrafiltráciou v Diaflovom prístroji a ich čistota bola kontrolovaná pomocou SDSPAGE, urobeného podľa Laemmli použitím Bio-Rad Mini-Protea II Systém. Proteínové koncentrácie boli merané s Bradfordfordou sadou proteínových vzoriek.

Westtem analýza sania

Celkový homogenát šošovky bol aplikovaný použitím na 4-20% gradient dodecylsíran sodných (SDS) gélov použitím tricínových pufrov a potom prenesený na polyvinylidéndifluridové membrány. Westtern sanie bolo vykonané ako je popísané niekde inde (Kim, S.Y. et al. (1995), J. Invest. Dermatol. 104, 211-217). Koncentrácia protilátok bola 5 pg/ml u primárnej protilátky (anti-y-glutamyl-s-lyzín-izopeptid) a 0,1 p.g/ml u sekundárnej protilátky. Sanie bolo potom rozvinuté zvýšenou chemiluminiscenciou (Pierce, Miláno, Taliansko). Následne, sa rysovali pásy veľmi vysokej molekulovej hmotnosti, vyluhované do SDS pufra obsahujúceho Tricín, oslobodené od SDS extrakciou iónového páru (Konigsberg, W.H., a Henderson, L. (1983) Proc. Natl. Sci. USA 80, 2467-2471) a podrobené analýze aminokyselín.

Meranie priečnej väzby izopeptidov vo vode rozpustných proteinoch

Vo vode rozpustné proteiny boli suspendované v 0,2 M N-etylmorfolinacetáte (pH 8,1). Podiel (10%) bol použitý na determinovanie množstva celkového proteinu. Vzorky boli vyluhované sekvenčnou adíciou proteolytických enzýmov (kolagenáza, pronáza, aminopeptidáza, karboxypeptidáza A, karboxypeptidáza B a karboxypeptidáza y), priamo do reakčnej zmesi pri 37°C v prítomnosti 0,02% azidu sodného. Po vylúhovaní enzýmov bola voľná priečna väzba N-(y-glutamyl)lyzín izopeptidu opätovne rozpustená pomocou HPLC a bolo determinované množstvo analýzou aminokyselín (Hohl, D., et al (1991), J. Biol. Chem. 266, 6626-6636).

V uvedenej sade experimentov bol obsah izopeptidu šošoviek stanovený bez predchádzajúcej extrakcie.

Tryptofánová fluorescencia

Tryptofáná fluorescencia straty proteínu, indikátor tryptofánovej oxidácie, sa zdá byť byť markerom kryštalínovej integrity. Preto sme merali tryptofánovú fluorescenciu v šošovkovom kryštalíne (Perkin-Elmer 650-40 spektrofotometer) podľa už popísaného spôsobu (Jones, R.H.V., a Hothersall, J.S. (1993), Exp. Eye Res. 57, 783-790). Excitácia vlnovej dĺžky bola situovaná do stanovená na 295 nm a fluorescenčná emisia bola zistená pri 330 nm.

Vyhodnotenie molekulovej chaperónovej aktivity α-kryštalínov zo šošoviek kontrolných a in vitro liečených potkanov

Boli vykonané nasledujúce experimenty v podstate ako už boli popísané niekde inde (Horwitz, J. (1992) Proc. Natl. Sci. USA 89, 10449-10453). Chaperónom podobná aktivita α-kryštalínu z šošoviek kontrolných a H2O2 ± L-carnitín liečených potkanov bola stanovená štúdiami tepelnej denaturácie. Miera, do ktorej nemodifikovaná alebo modifikovaná preparácia α-kryštalínu chránila p_L-kryštalín (použitý ako terčový protein) z teplom vyvolanej denaturácie a zhlukovania, bola stanovená nasledovne: 100 pg alebo 200 pg α-kryštalínu bolo pridané k 200 pg βι_kryštalínu v 1,5 ml kyvete a doplnené na konečný objem 1 ml s 50 mM fosforečného pufru, pH 7,0. Kyveta bola umiestnená v teplotu regulovanom bunkovom držiaku pripojenom k UV spektrofotometru. Rozptyl svetla v dôsledku denaturácie proteínov a zhlukovanie boli monitorované pri 360 nm absorbancii u 3000 otáčkami pri 55°C a u 1800 otáčok pri 58°C.

Zostava stredných vlákien a kvantitatívny rozbor obsahujúci a-kryštalíny

Kvantitatívny rozbor sedimentácie, ktorý navrhol Nicholl a Quinlan (Nicholl, I.D. a Quinlan, R.A. (1994), EMBO J. 13, 945-953) bol použitý na stanovenie akryštalínom vyvolanej inhibície zostavy stredného vlákna. Čistená vláknitá kyslá pôda z prasaťa: na tieto štúdie bol použitý protein (GFAP); bol čistený od prasačej miechy pomocou nervovej flotácie, ako už bolo popísané (Pemg, M.D., et al. (1999), J. Celí Sci. 112, 2099-2112, MacLean-Fletcher, S., and Pollard, T.D. (1980), Biochem.

Biophys. Res. Commun. 96, 18-27). Kvantitatívny rozbor vytvorenia gélu založený na spôsobe použitom na monitorovaní aktín viažúcej proteínovej aktivite pomocou viskozimetrie padajúcej guličky (Pemg, M.D., et al (1999), J Celí Sci,. 112, 20992112). α-kryštalíny boli zmiešané s GFAP v 8 M močovine, 20 mM Tris-HCI, pH 8,0, 5 mM EDTA, 25 mM 2-merkaptoetanole a potom po krokoch dialyzované v 10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 25 mM 2-merkaptoetanole. Zostava GFAP strednýchvlíkien v prítomnosti alebo neprítomnosti α-kryštalínu bola vyvolaná pridaním 20-násobne koncentrovaného pufru za vzniku výslednej koncentrácie 100 mM imidazol-HCI, pH 6,8, 0,5 mM DTT. 100 μΙ podiel vzorky bol zavedený do sklenej skúmavky a použitý na kvantitatívnu analýzu viskozity. Skúmavka bola potom ponorená do 37°C vodného kúpeľa na 1 hodinu a potom sa urobil rozbor vzorky vytvorenia gélu. Balón bol potom umiestnený do skúmavky a bola monitorovaná schopnosť roztoku podopierať balón.

Mikroskopické preskúmanie očnej šošovky

Po 24 hodinách s alebo bez H2O2 v prítomnosti alebo neprítomnosti L-carnitínu, boli očné šošovky podrobené štandardným postupom pre histologickú analýzu. Pre optickú mikroskopiu boli šošovky odobraté z média kultúry, ponorené vo fixačnom (neutrálnom pufrovom formalíne), dehydrované v etanole, čistené v xyléne a uložené v parafínovom vosku pre sekcionovanie. Pre rozborovú elektrónovej mikroskopie boli šošovky fixované ponorením po dobu aspoň 24 hodín pri izbovej teplote v roztoku 2,5% glutaraldehydu a 6% sacharózy, pufrovanej na pH 7,2 s 50 mM kakodylátom sodným. Vzorky boli dehydratované pomocou postupného radu etanolu, kritický bod vysušený použitím CO₂, upevnený na hliníkové paličky, pokovovaním potiahnuté zlatom a preskúmané s Leica Stereoscan 440 mikroskopom pri 3-7 kV stupňujúcom sa napätí.

Pre prenosovú elektrónovú mikroskopiu boli šošovky fixované ako bolo popísané vyššie pre postup rozborovej elektrónovej mikroskopie, potom fixované v OsO₄, pufrované s 150 mM fosforečnanu sodno-draselného (pH 7,4), uložené, sekcionované a napustené farbou pre elektrónovú mikroskopiu. Boli preskúmané v JEOL 100B elektrónovom mikroskope.

Výsledky

Zmeny v morfológii šošovky

Po 24 hodinách inkubácie šošovky inkubované bez H2O2 (kontrolné šošovky) si zachovali svoju priehľadnosť, ale tie, ktoré boli vystavené 500 mM H2O2 sa stali jednotne zahmlenými cez vonkajšiu kortikálnu oblasť a boli nafúknuté. Ako ukazuje Tabuľka 1, na konci inkubácie boli s H2O2 liečené šošovky výrazne ťažšie než kontrolné šošovky (47 ± 0,2 mg oproti 25 ± 0,1 mg). Neboli rozdiely v hmotnosti medzi kontrolnými šošovkami a šošovkami liečenými s L-carnitínom aj H2O2. Šošovky liečené s H₂O₂ samotným sa stali nepriehľadnými, pričom šošovky liečené s L-carnitínom a H2O2 ostali priehľadné. Optická a elektrónová mikroskopia ukázala, že bunkový tvar bol nezmenený a že bunky vlákien boli u kontrolných šošoviek neporušené a u šošoviek liečených s L-carnitínom a H2O2. U šošoviek vystavených H2O2 samotnému bola pozorovaná tvorba balónu, skvapalnenie a rôzne stupne nafúknutia.

Koncentrácie L-camitínu a GSH u kontrolných a H₂O2 liečených šošoviek

Pri experimentálnych podmienkach nebol výrazný rozdiel v koncentráciách L-carnitínu a GSH u kontrolných šošoviek, pričom liečba s 500 mM H2O2 spôsobila prudký pokles hladín GSH a L-carnitínu (Tabuľka 1). Pridanie L-carnitínu (300 mM) do inkubačného média šošovky pred liečbou s H2O2 nezabránilo strate GSH, ale udržalo koncentráciu carnitínu takmer na hladine zodpovedajúcej kontrolným šošovkám. Na determinovanie, či zníženie GSH a L-carnitínu súviselo s poškodením šošovky, sme merali únik LDH do média. Ako sa očakávalo, po liečbe s H2O2 bolo zníženie hladín GSH a L-carnitínu sprevádzané výrazným zvýšením LDH v supernatantoch, určujúc, že vyčerpanie týchto faktorov bolo určite spojené s poškodením šošovky. Na determinovanie ochranného efektu L-carnitínu sme inkubovali šošovky v médiu kultúry obsahujúcom 300 mM molekuly. Ako sa očakávalo, koncentrácia GSH v šošovkách liečených s L-carnitínom a H2O2 sa znížila na asi rovnakú hladinu ako v šošovkách vystavených HO samotnému, ale koncentrácia LDH v médiu z šošovky liečenej s L-carnitínom a HO bola podobná tej, ktorá bola pozorovaná u kontrolných šošoviek. Toto indikuje, že L-carnitín môže vydržať túto koncentráciu H2O2.

Znovuzískanie proteinov s vysokou molekulovou hmotnosťou v nerozpustných vo vode šošovkových frakciách obsahujúcich izopeptidovú priečnu väzbu

Vo vode nerozpustné proteiny tvorili iba 5% celkových proteinov u kontrolných šošoviek, ale boli zvýšené na 41% celkových proteinov u šošoviek liečených s H₂O₂ (Tabuľka 1). Koncentrácie vo vode nerozpustných proteinov v šošovkách liečených s L-carnitínom a HO boli rovnaké, ako tie, ktoré boli pozorované u kontrolných šošoviek.

Chaperónom podobná funkcia a-kryštalínov

Vlastnosti chaperónov z čisteného vo vode rozpustného α-kryštalínu boli determinované rozborom zhlukovania kryštalínu (terčový protein). Charakteristicky sa p_L-kryštalíny zhlukujú pri stúpajúcej teplote. Adícia α-kryštalínovu buď zabraňuje alebo znižuje teplom vyvolanému zhlukovaniu p_L-kryštalínu, ktorý je meraný rozptylom svetla pri 360 nm. Keďže pomer a a β determinuje stupeň ochrany proti teplom vyvolanému zhlukovaniu, použili sme 100 pg alebo 200 pg α-kryštalínu a 200 pg p_L-kryštalínu. Ako sa očakávalo, α-kryštalín z kontrolných šošoviek vykazoval chaperónovú aktivitu. Po inkubácii s HO bolo výrazné zníženie v kapacite akryštalinu na zabránenie teplom vyvolanému zhlukovaniu PL-kryštalínu, pričom prítomnosť L-carnitínu v šošovkovej inkubačnej zmesi zabránila tomuto nefatícnemu efektu.

Rozbor vzorky vytvorenia gélu

Keďže stredné vlákna, ako je GFAP, sú fyziologický terč α-kryštalínov, testovali sme chaperónovú aktivitu α-kryštalínu použitím viskozimetrie padajúceho balóna pri rozbore vzorky vytvorenia gélu (MacLean-Fletcher, S., a Pollard, T.D., (1980), Biochem. Biophys. Res. Commun. 96, 18-27).

GFAP je príslušný terč v dôsledku vlastnosti α-kryštalínu nezhlukovať GFAP cytoplazmové inklúzie. V neprítomnosti α-kryštalínu GFAP vytvára proteínový gel, ktorý nesie balón použitý v teste viskozity. Na determinovanie, či liečba s H₂O₂, ktorá pôsobila na kapacitu šošovkového α-kryštalínu a prerušila GFAP siete, bol pridaný k rozboru vzorky vytvorenia gélu α-kryštalín z kontrolných alebo z H₂O₂ ± Lcarnitínom liečených šošoviek, α-kryštalín z kontrolných šošoviek úplne inhiboval vytvorenie a udržovanie GFAP gélu pri rozbore viskozity vzorky , pričom a-kryštalín zo šošoviek liečených s H2O2 samotných nepôsobil na vytvorenie gélu. Popri tom, akryštalín zo šošoviek liečených s L-carnitínom aj H2O2 blokoval GFAP vytvorenie gélu do tej istej miery ako α-kryštalín z kontrolných šošoviek.

Merania tryptofánovej fluorescencie

Tryptofánová fluorescencia bola meraná v α-kryštalínových frakciách z kontrokných a liečených šošoviek na identifikovanie konformačných zmien. Pri akryštalíne z H₂O₂ liečených šošoviek bola 2,7-násobná strata tryptofánovej fluorescencie; znovu, L-carnitín obnovil základnú hodnotu.

Šošovky vystavené L-carnitínu a oxidačnému stresu ostali priehľadné. Hoci vynálezcovia tohto vynálezu nechcú byť viazaní akoukoľvek teóriou, ochranný efekt L-carnitínu nie je ľahko vysvetlený, L-carnitín sám osebe nie je známy ako vykazujúci antioxidačnú aktiviu (Arduini, A., et al. (1992) , J. Biol. Chem. 267, 12673-81). Ani Lcarnitín nezachránil vyčerpanie GSH , ktoré znamená, že priaznivý efekt nebol sprostredkovaný zvýšením GSH prostredníctvom napríklad anaplerotického efektu na NADPH, kofaktoru enzýmu glutatión reduktáza (Pemg, M.D., (1999), J. Biol. Chem. 47, 33235-33243, Wuensch, S.A., a ray, P.D. (1997), Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 118, 599-605). Skôr skutočnosť, že únik LDH do média nebol zvýšený u šošoviek liečených s L-carnitínom a vystavených oxidačnému stresu, indikuje, že molekula môže udržať integritu šošovky. Tu ukazujeme, že chaperónová aktivita α-kryštalínu šošovky je znížená prostredníctvom in vitro oxidačného stresu, a poskytuje podporu pre návrh, že šošovkové proteíny sú podrobené oxidačnému poškodeniu si udržujú vysoký stupeň posttranslačných modifikácií (Cherian, M., a Abraham, E.C., (1995), Biochem. Biophys. Res. Commun. 212, 184-189). L-carnitín nielen redukoval zvýšené posttranslačné modifikácie šošovkových proteinov, ale tiež poskytol výraznú ochranu proti zníženej chaperónovej aktivite a-kryštalínu. α-kryštalín ukázal, že potlačuje zhlukovanie denaturovaných proteinov v štúdiách, v ktorých zmesi tepelnému stresu vystavených β-kryštalínov slúžili ako substrát (Kramps, J.A., et al., (1978), Biochem. Biophys. Acta 533, 487-495). Bolo ukázané, že oxidačný stres porušuje chaperónovú aktivitu akryštalínov, ktorá je rozhodujúca pre udržovanie priehľadnosti šošoviek (Zigler, J.S. Jr. et al., (1989), free Radic. Biol. Med. 7, 499-505; Richard R.C. et al., (1998), Proc.

Soc. Exp. Biol. Med. 217, 397-407). Potom, L-carnitín priaznivo ovplyvňuje priehľadnosť šošovky pôsobením priamo na a-kryštalín.

a- aj β-kryštalíny sú na N-zakončení acetylované. Použitím analýzy screeningu sania škvŕn spojenej s hmotnostnou spektrofotometriou Takernoto et al. uskutočnili dôkaz , že metatión α-kryštalínu, ktorý je N-acetylovaný na konci, môže byť oxidovaný na metatiónsulfoxid in vivo (Sims, N.R., et al., (2000), Brain Res. Mol. Brain Res. 77, 176-184). Táto oxidácia metatiónu s N-zakončením, ktoré je odkryté na vonkajšku polypeptidu, môže negatívne vplývať na funkciu proteínu. Popri acetylácii na NH-zakončení sú podrobené acetylácii aminoskupiny lyzínových (Lys) rezíduí. Všetkých sedem kravských Lys rezíduí (α-kryštalín) reagujú s aspirínom, miera acetylácie sa mení od 10% u lys 88, najmenej reaktívny, do 60% u Lys 166, najviac reaktívny (Takernoto, L. et al., (1992), Curr. Eye Res. 11, 651-655; Rao, G.N. et al., (1985), Biochem. Biophys. Res. Commun. 129, 1125-1127). Aspirín inhibuje glykáciu aj karbamoyláciu prostredníctvom acetylácie Rezíduí Lys (Hasan, A. et al., (1993), Exp. Eye Res. 57, 29-35; Cromptonm, Rixon, K.C., and Harding, J.J. (1985) Exp. Eye Res. 40, 297-311; Rao, G.N., and Cotlier, E. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 151, 991-996; Huby, R., and Harding, J.J. (1988) Exp. Eye Res. 47, 53-59; Ajiboye, R., and Harding D. (1989), Exp Eye Res. 49, 31-41; Blakytin, R., and Harding, J.J. (1992), Exp. Eye Res. 54, 509-518). Nedávno bolo ukázané, že acetyl-L-carnitín inhibuje glykáciu (a-kryštalínu vo väčšej miere než iné kryštalíny, prostredníctvom acetylácie potenciálnych miest glykácie (Groenen, P.J., et al., (1993), Biochem. J. 295, 399-404). Glykácia sa zdá oveľa škodlivejšia než acetylácia v dôsledku toho, že pri sieťovaní proteinov a pri výraznom znížení chaperónovej aktivity α-kryštalínu sú obsiahnuté len produkty glykácie (Groenen, P.J. et al., (1993), Biochem. J. 295, 399-404, Blakytin, R., and Harding, J.J. (1992), Exp. Eye Res. 54, 509-518).

Tabuľka 1

Zmeny niektorých biochemických parametrov u kontrolných šošoviek a u HO ± L-carnitínom liečených šošoviek

	Hmotnosť šošovky (mg)	Vo vode nerozpustný protein (%)	Glutatión (pmol/g hmot.-hmot.)	Voľný carnitín (nmol/g hmôt.-hmôt.)	Acetylcarnitin (nmol/g hmot.-hmot.)	LDH (jednotky/ml upraveného média)	Celkový carnitín (nmol/g hmot.-hmot.)
Kontrolné	25 ±0,1	5± 1,1	4,87± 0,23	156 ±3	29 ± 1	NZ	187 ±5
H2O2	47 ±0,2*	41 ± 1,9*	2,44 ± 0,69*	27 ±2*	6±1*	53 ±6	36 ±3*
H2O2 + Lcarnitín	27 ±0,9	5 ±2,0	2,71 ± 0,73*	151 ±2	37 ± 2**	NZ	189 ±2

P<0,001, **P<0,005, NZ: nezistiteľné

Claims (17)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použitie L-carnitínu alebo jeho soli na stabilizáciu proteinov.
2. 2. Použitie Ľ-carnitínu alebo jeho soli ako pomocného faktoru pri chránení chaperónovej aktivity chaperonínov.
3. 3. Použitie L-carnitínu a jeho solí na zachovanie aktivity zmenených chaperónových proteinov.
4. 4. Použitie podľa nároku 3, kde α-kryštalínom je zmenený chaperónový protein.
5. 5. Použitie podľa nároku 4, kde týmto α-kryštalínom je alfaA-kryštalín.
6. 6. Použitie podľa nároku 4, kde týmto α-kryštalínom je alfaB-kryštalín.
7. 7. Použitie podľa nároku 2, kde tieto chaperoníny sú proteiny tepelného šoku.
8. 8. Použitie podľa nároku 7, kde tieto proteiny tepelného šoku sú použité vo vakcíne, najmä vo vakcíne rakoviny.
9. 9. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, kde soľ L-carnitínu je farmaceutický prijateľná.
10. 10. Použitie L-carnitínu alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli na prípravu lieku pre liečbu ochorení založených na zmenenom stave chaperónových proteinov.
11. 11. Použitie podľa nároku 10, kde α-kryštalínom je zmenený chaperónový protein.
12. 12. Použitie podľa nároku 11, kde týmto α-kryštalínom je alfaA-kryštalín.
13. 13. Použitie podľa nároku 11, kde týmto α-kryštalínom je alfaB-kryštalín.
14. 14. Použitie L-carnitínu alebo jeho farmaceutickej soli pre prípravu lieku na liečbu katarakty.
15. 15. Použitie L-carnitínu alebo jeho farmaceutickej soli pre prípravu lieku na liečbu katarakty nediabetického pôvodu.
16. 16.Oftalmologický prípravok obsahujúci vhodné množstvo L-carnitínu alebo jeho farmaceutickej soli.
17. 17. Prípravok podľa nároku 16, prípadne obsahujúci ďalšiu aktívnu zložku užitočnú na liečbu katarakty nediabetického pôvodu.