SK287787B6 - Použitie L-karnitínu ako stabilizačného činidla proteínov - Google Patents
Použitie L-karnitínu ako stabilizačného činidla proteínov Download PDFInfo
- Publication number
- SK287787B6 SK287787B6 SK890-2003A SK8902003A SK287787B6 SK 287787 B6 SK287787 B6 SK 287787B6 SK 8902003 A SK8902003 A SK 8902003A SK 287787 B6 SK287787 B6 SK 287787B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- carnitine
- crystalline
- lenses
- proteins
- protein
- Prior art date
Links
- PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-N (R)-carnitine Chemical compound C[N+](C)(C)C[C@H](O)CC([O-])=O PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-N 0.000 title claims abstract description 58
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 41
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 title 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 9
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 claims description 9
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 claims description 8
- 108010007908 alpha-Crystallins Proteins 0.000 abstract description 4
- 241000219739 Lens Species 0.000 description 58
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 38
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 26
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 16
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 13
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 10
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 10
- 108050001186 Chaperonin Cpn60 Proteins 0.000 description 9
- 102000052603 Chaperonins Human genes 0.000 description 9
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 8
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 8
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 8
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 230000029983 protein stabilization Effects 0.000 description 8
- 102000014824 Crystallins Human genes 0.000 description 7
- 108010064003 Crystallins Proteins 0.000 description 7
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 230000036252 glycation Effects 0.000 description 7
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 6
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 5
- 229960004203 carnitine Drugs 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- RDHQFKQIGNGIED-MRVPVSSYSA-N O-acetyl-L-carnitine Chemical compound CC(=O)O[C@H](CC([O-])=O)C[N+](C)(C)C RDHQFKQIGNGIED-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 4
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000007362 alpha-Crystallins Human genes 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 229960004756 ethanol Drugs 0.000 description 3
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010007749 Cataract diabetic Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 2
- RDHQFKQIGNGIED-QMMMGPOBSA-N O-acetyl-D-carnitine Chemical compound CC(=O)O[C@@H](CC([O-])=O)C[N+](C)(C)C RDHQFKQIGNGIED-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001009 acetylcarnitine Drugs 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 2
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 2
- 230000001876 chaperonelike Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 201000007025 diabetic cataract Diseases 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- ZNOLGFHPUIJIMJ-UHFFFAOYSA-N fenitrothion Chemical compound COP(=S)(OC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C)=C1 ZNOLGFHPUIJIMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 glycophosphate Chemical compound 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 2
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 2
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 2
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N taurine Chemical compound NCCS(O)(=O)=O XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JDIIGWSSTNUWGK-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazol-3-ium;chloride Chemical compound [Cl-].[NH2+]1C=CN=C1 JDIIGWSSTNUWGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FZIPCQLKPTZZIM-UHFFFAOYSA-N 2-oxidanylpropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O FZIPCQLKPTZZIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HPGXYQZKIMWRAM-UHFFFAOYSA-N 4-ethylmorpholin-4-ium;acetate Chemical compound CC(O)=O.CCN1CCOCC1 HPGXYQZKIMWRAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 description 1
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 description 1
- 102000000496 Carboxypeptidases A Human genes 0.000 description 1
- 108010080937 Carboxypeptidases A Proteins 0.000 description 1
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- LNLLNTMHVMIMOG-YUMQZZPRSA-N Gamma-glutamyl-Lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O LNLLNTMHVMIMOG-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010063907 Glutathione Reductase Proteins 0.000 description 1
- 102100036442 Glutathione reductase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000014647 Lens culinaris subsp culinaris Nutrition 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002151 Microfilament Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010040897 Microfilament Proteins Proteins 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021839 RNA stabilization Effects 0.000 description 1
- 230000002292 Radical scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000000397 acetylating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008236 biological pathway Effects 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000021235 carbamoylation Effects 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000010001 cellular homeostasis Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 229940097362 cyclodextrins Drugs 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 229940061607 dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 1
- 230000001516 effect on protein Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 238000005188 flotation Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000008642 heat stress Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034626 isopeptide cross-linking Effects 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 150000004668 long chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 150000002696 manganese Chemical class 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 231100000783 metal toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229940045641 monobasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- PXQPEWDEAKTCGB-UHFFFAOYSA-N orotic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(=O)NC(=O)N1 PXQPEWDEAKTCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 description 1
- WLJNZVDCPSBLRP-UHFFFAOYSA-N pamoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC=3C4=CC=CC=C4C=C(C=3O)C(=O)O)=C(O)C(C(O)=O)=CC2=C1 WLJNZVDCPSBLRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009894 physiological stress Effects 0.000 description 1
- 229920000131 polyvinylidene Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008263 repair mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000011833 salt mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012106 screening analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M sodium dimethylarsinate Chemical compound [Na+].C[As](C)([O-])=O IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 229940066528 trichloroacetate Drugs 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/13—Amines
- A61K31/14—Quaternary ammonium compounds, e.g. edrophonium, choline
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
- A61K31/205—Amine addition salts of organic acids; Inner quaternary ammonium salts, e.g. betaine, carnitine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Je opísané použitie L-karnitínu a jeho solí na zachovanie aktivity zmeneného chaperónového proteínu alfa-kryštalínu.
Description
Vynález sa týka technickej oblasti stabilizácie proteínov, najmä terapeutických účinkov stabilizácie proteínov.
Doterajší stav techniky
Pri vytváraní proteínov a polypeptidov, či už extrakciou, alebo technikami biotechnológií rekombinantov, je problémom udržovanie správneho skladania proteínu tak, aby si udržal požadovanú aktivitu.
Neskladanie alebo nesprávne alebo inak modifikované skladania sa môžu vyskytovať z dôvodu technickej manipulácie alebo všeobecných procesných systémov pre vytváranie proteínov.
Ďalší problém pri spracovaní proteínových látok je daný zhlukovaním proteínov.
Stav techniky ponúka mnoho riešení. Niektoré z nich sú svojím charakterom chemické, čo znamená, že sú použité chemické činidlá, ako sú napríklad jednotlivé zmesi solí, hoci aj v pufrových roztokoch.
US 5 728 804, podľa výskumu Corporation Technologies, opisuje spôsob proteínovej renaturácie prostredníctvom bezdetergentných cyklodextrínov. US 5 563 057, podľa výskumu Wisconsin Alumni Research Foundation, iného než je cyklodextín, hovorí o použití určitých detergentov pre opätovné skladanie zle skladaných enzýmov.
US 5 874 075, podľa Amgen, opisuje komplexy proteínov : fosfolipidov užitočných na stabilizáciu proteínov proti tepelne vyvolanému zhlukovaniu, denaturácii a strate aktivity.
US 5 756 672, podľa Genetech, opisuje zlúčeninu zahŕňajúcu polypeptid v určitom pufri. Tento pufor je vhodný pre opätovné skladanie nevhodne skladaných polypeptidov. Osobitné uskutočnenie je dané pre opätovné skladanie zle skladaného rastového faktora I podobného inzulínu.
Uvedené spôsoby by mohli byť konvenčné, keďže sú tu použité ľahko dostupné chemické látky, napríklad soli medi alebo mangánu (US 5 756 672).
Opätovné preskladanie sa vyskytuje tiež prostredníctvom chromatografických techník, pozri Altamirano, M.M. et al. Nat. Biotechnol. 1999 feb; 17(2): 187-91.
Objavenie chaperonínov otvorilo novú oblasť pre technológiu spracovania proteínov.
Chaperoníny, tiež známe ako proteíny tepelného šoku alebo HSP, sú prírodné proteíny majúce biologickú úlohu pri skladaní proteínov. Pozri extenzívny prehľad htpp://www-ermm.chcu.cam.ac.uk/000021015h.htm od Júlia C. Ranford, Anthony R.M. Coates a Brian Handerson.
Technicky sú chaperoníny intenzívne skúmané ako prostriedky na členenie uvedeného problému stabilizácie proteínov a opätovného skladania.
Tento výskum vedie k novo objaveným chaperonínom a k ich použitiu pre stabilizáciu proteínov, pozri napríklad US 5 428 131, podľa Yale University. Pre obraz chaperonínov pri technickom probléme, ktorému čelí tento vynález, pozri napríklad US 5 688 651 podľa RAMONT University; US 5 646 249, podľa U.S: Health Department; US 5 561 221 podľa Nippon Oil Company Limited, WO 00/20606 podľa Remain and Schirmbeck, JP 11266865 podľa Kaiyo Biotechnology Kenkyusho KK, WO 99/40435, podľa Netzer; JP 10327869 podľa Kaiyo Biotechnology Kenkyusho KK; WO 00/71723 podľa Roche Diagnostics; WO 00/55183 a WO 99/05163 podľa Medical Research Council.
Chaperoníny sú užitočné prostriedky pre stabilizáciu proteínov a opätovné skladanie, ale niektoré technické nedostatky prichádzajú pri ich použití. Keďže sú to proteíny, hoci majú sklon k zmene, ako je tepelná, potrebujú tiež nejaký ochranný faktor.
V technickej oblasti stabilizácie proteínov je tento problém veľmi dôležitý pri príprave HSP vakcín rakoviny. Bolo pozorované, že imunogenicita daného antigénu je zachytená ďaleko účinnejšie, ak je prítomný v imúnnych bunkách v komplexe s HSP (Requena, J.M. et al., Ars-Pharm 1997, 38(2-3): 191-208; Castelino, F. et al., J. Exp Med. 2000, 191(11):1957-1964). Zvlášť, imunitná odpoveď na rakovinu je podporená s HSP (t. j. HSP70 alebo gp96), ktoré sú viazané s antigénnym peptidom („špecifické antigénne identifikačné odtlačky“), z ktorých oboje sú získané z rakovinových buniek pacientov (Yedavelli Spet al Int. J. Mol. Med. 1999, 4(3):243-248). Preto je dôležité mať stabilný a/alebo dobre chránený HSP pre vakcíny rakoviny.
Zaujímavo, niektoré chaperoníny, ako sú alfa-kryštalínové proteíny očnej šošovky, sú členmi malej rodiny proteínov tepelného šoku (sHSP). sHSP boli ukázané ako fungujúce v množstve rôznych procesov v rozmedzí od RNA stabilizácie po elastázovú inhibíciu a interakciu s cytoskeletom.
AlfaA-kryštalín sa nachádza primáme v očnej šošovke, vo veľmi malých hladinách bol zistený v iných tkanivách, pričom alfaB-kryštalín je teraz známy ako v podstate všade sa vyskytujúci v organizme (Haley, D.A. et al., J. Mol. Biol. 1998, 277:27-35). Biologický význam alfaB-kryštalínu je zvýraznený jeho zvýšenými hladinami pri ischémii srdca a v mozgu pacientov so sklerózou multiplex, Alzheimerovou chorobou a neurologickými ochoreniami. V zhode s klasifikáciou ako HSP bolo ukázané, že alfaB-kryštalín je vyvolaný škálou fyziologických stresov vrátane tepla, osmotického tlaku a toxicity kovov. Biologický význam alfaA2
-kryštalínu v očnej šošovke je zvýraznený jeho účinným potláčaním a nekontrolovaným zhlukovaním poškodených proteínov.
Ako sa zdá z uvedených príkladov, stabilizácia chaperonínov, buď pre ich použitie, alebo pre ich stabilizáciu pri týchto patologických stavoch, v ktorých sú tieto zmenené, je veľmi dôležitá v oblasti medicíny.
Podstata vynálezu
Teraz bolo zistené, že L-kamitín má prekvapujúci efekt pri stabilizácii proteínov a zvlášť priaznivý aspekt pre oblasť medicíny, L-kamitín má prekvapujúci efekt pri ochrannej aktivite chaperónov, táto ochranná aktivita je vykazovaná prostredníctvom stabilizačného efektu L-kamitínu smerom k chaperónovej aktivite.
Potom je cieľom predkladaného vynálezu použitie L-karintínu alebo jeho soli na stabilizáciu proteínov, zvlášť ako pomocného faktora pri ochrannej aktivite chaperónov.
V jednom prednostnom uskutočnení predkladaného vynálezu je L-kamitín použitý v terapeutickej oblasti na chránenie aktivity zmenených chaperónových proteínov.
V spojení s prvým prednostným uskutočnením je L-kamitín použitý na prípravu lieku na liečbu ochorení v dôsledku zmenených chaperónových proteínov.
V druhom prednostnom uskutočnení predkladaného vynálezu je L-kamitín použitý na prípravu lieku na liečbu ochorení na báze zmenenej aktivity alfa-kryštalínového proteínu, konkrétnejšie alfaA- a/alebo alfaB-kryštalínu. Ochorenia, ktoré môžu byť liečené, sú napríklad ischemické srdce a mozog pacientov so sklerózou multiplex, Alzheimerovou chorobou a inými neurologickými ochoreniami. V treťom uskutočnení ochorením je oftalmologické postihnutie, kde α-kryštalín je zmenený chaperónový protein. V špecifickom aspekte sa predkladaný vynález používa pri liečbe katarakty, s vylúčením katarakty diabetického pôvodu.
Cieľom predkladaného vynálezu sú tiež proteíny, najmä chaperoníny, ako je HSP, stabilizované prostredníctvom L-kamitínu.
V súlade s tým, ďalšími cieľmi predkladaného vynálezu sú použitia L-kamitínu alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli na prípravu lieku na liečbu katarakty nediabetického pôvodu.
Špecifickým cieľom predkladaného vynálezu je oftalmologický prípravok obsahujúci vhodné množstvo L-kamitínu alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli. Tento oftalmologický prípravok môže prípadne obsahovať ďalšiu aktívnu zložku užitočnú na liečbu katarakty nediabetického pôvodu.
Uvedené ciele predkladaného vynálezu budú zobrazené podrobne tiež prostredníctvom príkladov. Podrobný opis vynálezu
Za farmaceutický prijateľnú soľ L-kamitínu sa pokladá soľ, organická alebo anorganická, vhodná pre použitie v oblasti humánnej alebo veterinárnej medicíny. Vo všeobecnej oblasti stabilizácie proteínov môže byť použitá akákoľvek soľ s podmienkou, že je kompatibilná so špecifickou aplikáciou.
Príklady farmakologicky prijateľných solí L-kamitínu, ale bez obmedzenia sa len na nasledujúce, sú chlorid, bromid, jodid, aspartát, kyselina asparágová, citrát kyselina citrónová, vínnan, kyselina vínna, fosforečnan, kyselina fosforečná, fumarát, kyselina fumarová, glykofosforečnan, laktát, maleát, kyselina maleínová, mukát, orotát, šťaveľan, kyselina štaveľová, síran, kyselina sírová, trichlóracetát, trifluóracetát, metánsulfonát, pamoát a kyselina pamoová.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Očná šošovka je priehľadný orgán vytvorený vysoko koncentrovanou a vysoko usporiadanou matricou štruktúrnych proteínov nazvaných „kryštalíny“, ktoré sú pravdepodobne najdlhšie žijúcimi proteínmi organizmu (Wistow, G., a Piatigorsky, J. (1988), Ann. Rev. Bioechem, 57, 479-504; Blomendal, H. (1982), Biochem. 12, 1-38; Bettelheim, F.A. (1985), The Ocular Lens Structure, Function, and Pathology, (Maisel, H. ed.) strany 265-300, Marcel Dekker, Inc., New York; Tardieu, A., a Delay, M. (1988), Ann. Rev. Biophys. Chem. 17, 47-70).
Posttranslačné modifikácie šošovkového kryštalínu, v dôsledku veku alebo ochorenia ako je diabetes, môže vyústiť do konformačných zmien a zhlukovania týchto proteínov a viesť k nepriehľadnosti a k vytvoreniu katarakty (Harding, D. (1981), Molecular and Cellular Biology of the Eye Lens (Bloemendal, H., ed;) strany 327-365, John Willey and Sons, New York). Hoci mechanizmy vytvorenia katarakty nie sú dobre poznané, oxidácia šošovkových proteínov ie spojená s kataraktou u cicavcov (Francis, P.J. (1999), Trends in Genetics 15, 191-196).
Šošovka prechádza hlavným oxidačným tlakom, pretože je stále vystavená svetlu a oxidantom (Varma, S.D., et al. (1984), Curr. Eye Res. 3, 35-57, Spector, A. (1995), FASEB J. 9, 1173-1182; Taylor, A., and Davies, K.J. (1987), Free Radic. Biol. Med. 3, 371-377; Zigman, S. (1981), Mechanisms of Cataract Formation in the Human Lens (Ducan, G., ed.) strany 117-149, Academic press, New York; I. Dillon, J. (1985), The Ocular Lens Structure, Function, and Pathology, Maisel, H. ed, Marcel Dekker, Inc., New York). Oxidačné modifikácie zahŕňajú selektívnu oxidáciu špecifických aminokyselín, ktorá má za následok zmeny náboja, degradácie proteínov, priečnej väzby proteínov a nerozpustnosti, a zvýšenie tryptofánovej fluorescencie (Spector, A., and Gamer, W.H. (1981), Exp. Eye Res. 33, 673-681 Andley, U.P. (1987), Photochem, Photobiol. 46, 1057-1066 Davies, K.J.A., et al., (1987), J. Biol. Chem. 262, 9914-9920 Augusteyn, R.C. (1981), Mechanisms of Cataract Formation in the Human Lens (Ducan, G., ed.) strany 72-115, Academic Press, London Zigler, J.S. Jr. et al., (1989), Free Radic. Biol. Med. 7, 499-505). Následne boli rozvinuté antioxidačné systémy a opravné mechanizmy, aby opačne pôsobili ako efekty oxidantov. Prvá línia obrany proti oxidačnému tlaku je vytvorená antioxidantmi zachytávajúcimi radikály, ktoré redukujú oxidačné napadnutie. Napríklad, glutatión (GSH) a taurín, ktoré sú oba vysoko zastúpené v tkanive očnej šošovky, majú ochranné efekty pri in vitro modeloch diabetickej katarakty (Richard, R.C. et al., (1998), Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217, 397-407, Jones, R.A.V. and Hothersall, J.S. (1999), Exp. Eye. Res. 69, 291-300). Ďalej, a-kryštalín, ktorý vytvára až do 50 % celkovej proteínovej hmoty šošovky cicavcov, pôsobí ako molekulový chaperón, ktorý zabraňuje teplom vyvolanému zhlukovaniu mnohých proteínov a je potrebný na renaturáciu chemicky denaturovaných proteínov (Jones, R.A.V. and Hothersall, J.S. (1999), Exp. Eye Res. 69, 291-300). Kľúčový element α-kryštalínovej funkcie je jeho schopnosť zabrániť nenormálnym spojeniam proteínov pomocou viazania na prechodne vystavené hydrofóbne proteínové povrchy (van den Ussel, P.R. et al. (1996), Opthalmic Res. 28, 39-43). Pretože α-kryštalín zabraňuje ultrafialovému žiareniu aj voľnými radikálmi vyvolanému zhlukovaniu proteínov in vitro (Groenen, P.J. et al. (1994) Eur. J. Biochem. 225, 1-19, Andley, U.P. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 31252-31261; Lee, J.S. et al. (1997) J. Proteín Chem. 16, 283-289; Kramps, J.A. et al. (1978), Biochem. Viophys. Acta 533, 487-495; van Kleef, F.S.M., et al. (1976), Eur. J. Biochem. 66,477-483 Smulders, R.H.P.H. et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 29060-29066), môže ochraňovať aj šošovkové proteíny od fotooxidačných zmien in vivo.
US patent č. 5 037 851 vydaný 6.8.1991 s prioritou 15.11.1988 v mene tohto istého právneho zástupcu ako pri predkladanom vynáleze, nárokuje terapeutický spôsob liečby katarakty, ktorý obsahuje podávanie subjektu majúcemu kataraktu orálne alebo parentálne 1000 až 2000 mg/deň acetyl-D-kamitínu alebo ekvivalentného množstva jednej z jeho farmaceutický prijateľných solí. Poznanie tohto patentu je obmedzené na acetyl-D-kamitín.
Vynálezca predkladaného vynálezu a jeho kolegovia predtým ukázali, že pri experimentálnom diabete zvierat zníženie kamitínu v šošovke a všade sa vyskytujúcej molekule obsiahnutej v mnohých biologických cestách je v začiatku dôležité a selektívny prípad sa snáď vzťahuje na vytvorenie katarakty (Pesotto, P, et al., (1997) Exp. Eye Res. 64, 195-201). V tomto dokumente je objavené, ako je pri diabetických stavoch strata L-kamitínu v šošovke a hladiny kamitínu v iných tkanivách oka sa zdajú byť v podstate nezasiahnuté. Autori uzavierajú, že úloha L-kamitínu v šošovke je stále nejasná, ale jeho strata sa môže týkať vzniku katarakty. V tejto referencii je dobré odporučenie použiť acetyl-kamitín dávajúci dobrý dôvod pre očakávanie úspechu na zabránenie vzniku katarakty farmakologickým pôsobením, ako bolo ukázané pri aspiríne. Dôvod očakávania priaznivého pôsobenia pomocou acetyl-kamitínu z pohľadu dobre známeho pôsobenia aspirínu je v tom, že obe zlúčeniny majú acetylačné vlastnosti, ktoré pri svojej premene sú zodpovedné za ochranu šošovkových proteínov.
Popri svojej primárnej funkcii ako nosiča mastných kyselín s dlhým reťazcom z cytoplazmy na miesta β-oxidácie sa predpokladá, že L-kamitín by mohol slúžiť aj na udržovanie bunkovej homeostázy.
Swamy-Mruthinti, S., a carter, A.L: (1999), Exp Eye Res 69, 109-115 ukázali, že L-kamitín je in vitro neefektívny pri glykácii šošovkových kryštalínov, pričom acetyl-L-kamitín a acetyl-salicylová kyselina znižovali glykáciu kryštalínu. Tieto uvažovania vysvetľujú, prečo hladiny L-kamitínu v rôznych tkanivách zvierat vždy nekorelujú s energetickými požiadavkami tkanív alebo lipidovým metabolizmom. Napríklad, očné šošovky, cievami neprekrvované tkanivo, ktorého hlavným zdrojom energie je glukóza absorbovaná zo zrakových tekutín, má vyššie koncentrácie L-kamitínu než iné očné časti (Pessoto, P. et al (1994) J. Ocul. Pharmacol. 10, 643-651).
Tento vynález v súlade s tým uvažuje o použití L-kamitínu a jeho farmakologicky prijateľných solí na prípravu oftalmologického farmaceutického prípravku na terapeutickú liečbu katarakty, najmä katarakty nediabetického pôvodu. V praxi, terapeuticky účinné množstvo L-kamitínu alebo ekvivalentné množstvo jednej z jeho farmakologicky prijateľných solí je podávané do oka, prípadne s obsahom ďalšej aktívnej zložky užitočnej na liečbu katarakty nediabetického pôvodu.
Prednostne je prípravok vo forme očných kvapiek. Očné kvapky sú aplikované v rozsahu terapeutickej potreby, ako to určí odborník a závisí od podmienok pacienta, vážnosti ochorenia a iných faktorov, ktoré zváži odborník. Napríklad môžu byť vhodné 2 - 3 kvapky 3 - 4-krát denne.
Prípravky pre očné kvapky obsahujú obvyklý sterilný izotonický roztok. Výber vhodných excipientov je v rámci schopností bežného odborníka vo farmakologickej technológii. Napríklad, pre excipienty sa použije chlorid sodný, dibázický fosforečnan sodný monobázický fosforečnan sodný, benzalkóniumchlorid a etylalkohol. Prípravok je doplnený na správny objem destilovanou vodou.
Príklady
Materiály a spôsoby
Kultúra orgánu šošovky
Potkany Sprague-Dawley vo veku štyri mesiace boli anestetikované 5 mg/kg xylazínu a 65 mg/kg ketamínu a bola im odrezaná hlava. Okamžite potom boli oči vybrané, extrahované a umiestnené do 2 ml modifikovaného TC-199 média. Integrita očnej šošovky bola stanovená meraním proteínu vylúhovaného do média kultúry po 30 - 60 minútach; poškodené očné šošovky boli odhodené. Jedna očná šošovka z každého páru bola umiestnená do média kultúra bez H2O2 a použitá ako kontrolná. Po 24 hodinách sa kontrolované šošovky nelíšili od čerstvo vybratých šošoviek v žiadnom z parametrov hodnotených v tejto štúdii. Kontrolované šošovky z každého páru boli umiestnené v médiu a po uvedení do rovnováhy s 5 % CO2 pri 37 °C boli vystavené 500 μΜ H2O2 v neprítomnosti alebo prítomnosti 300 μΜ L-kamitínu. Po 24 hodinách inkubácie boli zaznamenané morfologické charakteristiky a zmeny a očné šošovky boli fotografované. Inkubované šošovky boli prepláchnuté soľným roztokom, vysiate na filtračnom papieri, odvážené a potom ihneď spracované na biochemickú analýzu. Na determinovanie vytekania laktát dehydrogenázy (LDH) boli šošovky inkubované jednotlivo v každom rozdielnom médiu a médium bolo zozbierané denne a uchované na LDH analýzu. Extrakcia šošovkových proteínov
Odpuzdrené šošovky boli homogenizované roztieracou tyčinkou na jedno použitie a potom boli vibrované ultrazvukom (20 mM HEPES, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM ditiotreitol, 450 mM NaCi, 25 % glycerol, 0,5 μΜ/ml leupeptín, 0,5 μg/ml protinín, 0,5 mM fenylmetánsulfonylfluorid) na ľade. Podiely homogenátu z každej z inkubovaných šošoviek boli odobraté na analýzu GSH a L-kamitínu. Zvyšok bol centrifugovaný počas 25 minút pri 20 000 otáčkach na separovanie supematantu z peliet. Peleta bola premytá s 1,0 ml pufra a vysušená pod dusíkom. Táto frakcia bola označená ako „vo vode nerozpustná“ frakcia. Frakcia supematantu bola dialyzovaná dvakrát proti 3 ml 0,025 mol/1 fosforečného pufra, pH 7,4 počas 48 hodín a lyofilizovaná. Táto frakcia bola označená ako „vo vode rozpustná“ frakcia. Vo vode rozpustná a vo vode nerozpustná frakcia bola odlipidovaná s 3,0 ml chloroform : metanol (2 : 1) počas 16 hodín pri trasení, po ktorom nasledovalo centrifugovanie pri 2000 otáčkach počas 5 minút.
Po tom, ako bolo organické rozpúšťadlo odobraté, bol zvyšok upravený s 2,0 ml dietyléteru, ponechaný stáť počas 5 minút a potom bol centrifugovaný pri 2000 otáčkach počas 5 minút. Peleta bola vysušená na vzduchu a uložená pri 4 °C v sušičke.
Príprava kryštalínov
Vo vode rozpustné kryštalínové frakcie boli izolované preparatívnou chromatografiou s gélovým prestupom Sephacryl S-300-HR, ako už popísal (Smulders, R.H.P.H. et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 29060-29066, de Jong, et al. (1974), Eur. J. Biochem. 48, 271-276). Stručne, rozpustný protein bol aplikovaný na 100 x 1,5 cm stĺpec a rozvinutý rovnomerne s fosforečným pufrom. Celkové frakcie z kontrolných a H2O2 ± L-karnitínom liečených šošoviek boli koncentrované ultrafiltráciou v Diaflovom prístroji a ich čistota bola kontrolovaná pomocou SDS-PAGE, urobeného podľa Laemmli použitím Bio-Rad Mini-Protea II System. Proteínové koncentrácie boli merané s Bradfordfordou súpravou proteínových vzoriek.
Westtem analýza nasávania
Celkový homogenát šošovky bol aplikovaný použitím na 4 - 20 % gradient dodecylsíran sodných (SDS) gélov použitím tricínových pufrov a potom prenesený na polyvinylidéndifluridové membrány. Westtem nasávanie bolo vykonané, ako je popísané niekde inde (Kim, S.Y. et al. (1995), J. Invest. Dermatol. 104, 211-217). Koncentrácia protilátok bola 5 pg/ml pri primárnej protilátke (anti-y-glutamyl-e-lyzín-izopeptid) a 0,1 pg/ml pri sekundárnej protilátke. Nasávanie bolo potom rozvinuté zvýšenou chemiluminiscenciou (Pierce, Miláno, Taliansko). Následne sa rysovali pásy veľmi vysokej molekulovej hmotnosti, vylúhované do SDS pufra obsahujúceho Tricín, oslobodené od SDS extrakciou iónového páru (Konigsberg, W.H., a Henderson, L. (1983) Proc. Natl. Sci. USA 80, 2467-2471) a podrobené analýze aminokyselín.
Meranie priečnej väzby izopeptidov vo vode rozpustných proteínoch
Vo vode rozpustné proteíny boli suspendované v 0,2 M N-etylmorfolínacetáte (pH 8,1). Podiel (10 %) bol použitý na determinovanie množstva celkového proteínu. Vzorky boli vylúhované sekvenčnou adíciou proteolytických enzýmov (kolagenáza, pronáza, aminopeptidáza, karboxypeptidáza A, karboxypeptidáza B a kar5 boxypeptidáza y), priamo do reakčnej zmesi pri 37 °C v prítomnosti 0,02 % azidu sodného. Po vylúhovaní enzýmov bola voľná priečna väzba N-(y-glutamyl)lyzín izopeptidu opätovne rozpustená pomocou HPLC a bolo determinované množstvo analýzou aminokyselín (Hohl, D., et al (1991), J. Biol. Chem. 266, 6626-6636). V uvedenej súprave experimentov bol obsah izopeptidu šošoviek stanovený bez predchádzajúcej extrakcie.
Tryptofánová fluorescencia
Tryptofánová fluorescencia straty proteínu, indikátor tryptofánovej oxidácie, sa zdá byť markerom kryštalínovej integrity. Preto sme merali tryptofánovú fluorescenciu v šošovkovom kryštalíne (Perkin-Elmer 65040 spektrofotometer) podľa už popísaného spôsobu (Jones, R.H.V., a Hothersall, J.S. (1993), Exp. Eye Res. 57, 783-790). Excitácia vlnovej dĺžky bola situovaná do stanovená na 295 nm a fluorescenčná emisia bola zistená pri 330 nm.
Vyhodnotenie molekulovej chaperónovej aktivity a-kryštalínov zo šošoviek kontrolných a in vitro liečených potkanov
Boli vykonané nasledujúce experimenty v podstate ako už boli opísané niekde inde (Horwitz, J. (1992) Proc. Natl. Sci. USA 89, 10449-10453). Chaperónom podobná aktivita α-kryštalínu zo šošoviek kontrolných a H2O2 ± L-kamitín liečených potkanov bola stanovená štúdiami tepelnej denaturácie. Miera, do ktorej nemodifíkovaná alebo modifikovaná preparácia α-kryštalínu chránila pL-kryštalín (použitý ako terčový proteín) z teplom vyvolanej denaturácie a zhlukovania, bola stanovená nasledovne: 100 pg alebo 200 pg a-kryštalínu bolo pridané k 200 pg pL-kryštalínu v 1,5 ml kyvete a doplnené na konečný objem 1 ml s 50 mM fosforečného pufta, pH 7,0. Kyveta bola umiestnená v teplotu regulovanom bunkovom držiaku pripojenom k UV spektra fotometru. Rozptyl svetla v dôsledku denaturácie proteínov a zhlukovanie boli monitorované pri 360 nm absorbancii u 3000 otáčkami pri 55 °C a u 1800 otáčok pri 58 °C.
Zostava stredných vlákien a kvantitatívny rozbor obsahujúci a-kryštalíny
Kvantitatívny rozbor sedimentácie, ktorý navrhol Nicholl a Quinlan (Nicholl, I.D. a Quinlan, R.A. (1994), EMBO J. 13, 945-953) bol použitý na stanovenie α-kryštalínom vyvolanej inhibície zostavy stredného vlákna. Čistená vláknitá kyslá pôda z prasaťa: na tieto štúdie bol použitý proteín (GFAP); bol čistený od prasacej miechy pomocou nervovej flotácie, ako už bolo popísané (Pemg, M.D., et al. (1999), J. Celí Sci. 112, 2099-2112, MacLean-Fletcher, S., and Pollard, T.D. (1980), Biochem. Biophys. Res. Commun. 96, 18-27). Kvantitatívny rozbor vytvorenia gélu založený na spôsobe použitom na monitorovaní aktín viažucej proteínovej aktivite pomocou viskozimetrie padajúcej guľôčky (Pemg, M.D., et al (1999), J Celí Sci,. 112, 2099-2112). α-Kryštalíny boli zmiešané s GFAP v 8 M močovine, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA, 25 mM 2-merkaptoetanole a potom po krokoch dialyzované v 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 25 mM 2-merkaptoetanole. Zostava GFAP stredných vlákien v prítomnosti alebo neprítomnosti α-kryštalínu bola vyvolaná pridaním 20-násobne koncentrovaného pufra za vzniku výslednej koncentrácie 100 mM imidazol-HCl, pH 6,8, 0,5 mM DTT. 100 pl podiel vzorky bol zavedený do sklenej skúmavky a použitý na kvantitatívnu analýzu viskozity. Skúmavka bola potom ponorená do 37 °C vodného kúpeľa na 1 hodinu a potom sa urobil rozbor vzorky vytvorenia gélu. Balón bol potom umiestnený do skúmavky a bola monitorovaná schopnosť roztoku podopierať balón.
Mikroskopické preskúmanie očnej šošovky
Po 24 hodinách s alebo bez H2O2 v prítomnosti alebo neprítomnosti L-kamitínu boli očné šošovky podrobené štandardným postupom pre histologickú analýzu. Pre optickú mikroskopiu boli šošovky odobraté z média kultúry, ponorené vo fixačnom (neutrálnom pufrovom formalíne), dehydrované v etanole, čistené v xyléne a uložené v parafínovom vosku pre sekcionovanie. Pre rozborevú elektrónovú mikroskopiu boli šošovky fixované ponorením počas aspoň 24 hodín pri izbovej teplote v roztoku 2,5 % glutaraldehydu a 6 % sacharózy, pufrovanej na pH 7,2 s 50 mM kakodylátom sodným. Vzorky boli dehydratované pomocou postupného radu etanolu, kritický bod vysušený použitím CO2, upevnený na hliníkové paličky, pokovovaním potiahnuté zlatom a preskúmané s Leica Stereoscan 440 mikroskopom pri 3 - 7 kV stupňujúcom sa napätí.
Pre prenosovú elektrónovú mikroskopiu boli šošovky fixované ako bolo opísané pre postup rozborovej elektrónovej mikroskopie, potom fixované v OsO4, pufrované s 150 mM fosforečnanu sodno-draselného (pH 7,4), uložené, sekcionované a napustené farbou pre elektrónovú mikroskopiu. Boli preskúmané v JEOL 100B elektrónovom mikroskope.
Výsledky
Zmeny v morfológii šošovky
Po 24 hodinách inkubácie šošovky inkubované bez H2O2 (kontrolné šošovky) si zachovali svoju priehľadnosť, ale tie, ktoré boli vystavené 500 mM H2O2, sa stali jednotne zahmlenými cez vonkajšiu kortikálnu oblasť a boli nafúknuté. Ako ukazuje tabuľka 1, na konci inkubácie boli s H2O2 liečené šošovky výrazne ťažšie než kontrolné šošovky (47 ± 0,2 mg oproti 25 ± 0,1 mg). Neboli rozdiely v hmotnosti medzi kontrolnými šošovkami a šošovkami liečenými s L-kamitínom aj H2O2. Šošovky liečené s H2O2 samotným sa stali nepriehľadnými, pričom šošovky liečené s L-karnitínom a H2O2 ostali priehľadné. Optická a elektrónová mikroskopia ukázala, že bunkový tvar bol nezmenený a že bunky vlákien boli pri kontrolných šošovkách neporušené a pri šošovkách liečených s L-kamitínom a H2O2. Pri šošovkách vystavených H2O2 samotnému bola pozorovaná tvorba balónu, skvapalnenie a rôzne stupne nafúknutia.
Koncentrácie L-kamitínu a GSH pri kontrolných a H2O2 liečených šošovkách
Pri experimentálnych podmienkach nebol výrazný rozdiel v koncentráciách L-kamitínu a GSH pri kontrolných šošovkách, pričom liečba s 500 mM H2O2 spôsobila prudký pokles hladín GSH a L-kamitínu (tabuľka 1). Pridanie L-kamitínu (300 mM) do inkubačného média šošovky pred liečbou s H2O2 nezabránilo strate GSH, ale udržalo koncentráciu kamitínu takmer na hladine zodpovedajúcej kontrolným šošovkám. Na determinovanie či zníženie GSH a L-kamitínu súviselo s poškodením šošovky, sme merali únik LDH do média. Ako sa očakávalo, po liečbe s H2O2 bolo zníženie hladín GSH a L-kamitínu sprevádzané výrazným zvýšením LDH v supematantoch, určujúc, že vyčerpanie týchto faktorov bolo určite spojené s poškodením šošovky. Na determinovanie ochranného efektu L-karnitínu sme inkubovali šošovky v médiu kultúry obsahujúcom 300 mM molekuly. Ako sa očakávalo, koncentrácia GSH v šošovkách liečených s L-karnitínom a H2O2 sa znížila na asi rovnakú hladinu ako v šošovkách vystavených H2O2 samotnému, ale koncentrácia LDH v médiu z šošovky liečenej s L-kamitínom a H2O2 bola podobná tej, ktorá bola pozorovaná pri kontrolných šošovkách. Toto indikuje, že L-kamitín môže vydržať túto koncentráciu H2O2.
Znovuzískanie proteínov s vysokou molekulovou hmotnosťou v nerozpustných vo vode šošovkových frakciách obsahujúcich izopeptidovú priečnu väzbu
Vo vode nerozpustné proteíny tvorili iba 5 % celkových proteínov pri kontrolných šošovkách, ale boli zvýšené na 41 % celkových proteínov pri šošovkách liečených s H2O2 (tabuľka 1). Koncentrácie vo vode nerozpustných proteínov v šošovkách liečených s L-kamitínom a H2O2 boli rovnaké, ako tie, ktoré boli pozorované pri kontrolných šošovkách.
Chaperónom podobná funkcia a-kryštalínov
Vlastnosti chaperónov z čisteného vo vode rozpustného α-kryštalínu boli determinované rozborom zhlukovania kryštalínu (terčový proteín). Charakteristicky sa βι -kryštalíny zhlukujú pri stúpajúcej teplote. Adícia α-kryštalínu buď zabraňuje, alebo znižuje teplom vyvolanému zhlukovaniu β [ -kryštalínu, ktorý je meraný rozptylom svetla pri 360 nm. Keďže pomer a a β determinuje stupeň ochrany proti teplom vyvolanému zhlukovaniu, použili sme 100 pg alebo 200 pg α-kryštalínu a 200 pg βν-ΐα^ΐαΐήπι. Ako sa očakávalo, a-kryštalín z kontrolných šošoviek vykazoval chaperónovú aktivitu. Po inkubácii s H2O2 bolo výrazné zníženie v kapacite α-kryštalínu na zabránenie teplom vyvolanému zhlukovaniu pL-kryštalínu, pričom prítomnosť L-kamitínu v šošovkovej inkubačnej zmesi zabránila tomuto nefatícnemu efektu.
Rozbor vzorky vytvorenia gélu
Keďže stredné vlákna, ako je GFAP, sú fyziologický terč α-kryštalínov, testovali sme chaperónovú aktivitu α-kryštalínu použitím viskozimetrie padajúceho balóna pri rozbore vzorky vytvorenia gélu (MacLeanFletcher, S., a Pollard, T.D., (1980), Biochem. Biophys. Res. Commun. 96, 18-27).
GFAP je príslušný terč v dôsledku vlastnosti α-kryštalínu nezhlukovať GFAP cytoplazmové inklúzie. V neprítomnosti α-kryštalínu GFAP vytvára proteínový gél, ktorý nesie balón použitý v teste viskozity. Na determinovanie, či liečba s H2O2, ktorá pôsobila na kapacitu šošovkového α-kryštalínu a premšila GFAP siete, bol pridaný k rozboru vzorky vytvorenia gélu α-kryštalín z kontrolných alebo z H2O2 ± L-kamitínom liečených šošoviek. a-Kryštalín z kontrolných šošoviek úplne inhiboval vytvorenie a udržovanie GFAP gélu pri rozbore viskozity vzorky, pričom α-kryštalín zo šošoviek liečených s H2O2 samotných nepôsobil na vytvorenie gélu. Popritom, α-kryštalín zo šošoviek liečených s L-kamitínom aj H2O2 blokoval GFAP vytvorenie gélu do tej istej miery ako α-kryštalín z kontrolných šošoviek.
Merania tryptofánovej fluorescencie
Tryptofánová fluorescencia bola meraná v α-kryštalínových frakciách z kontrolných a liečených šošoviek na identifikovanie konformačných zmien. Pri α-kryštalíne z H2O2 liečených šošoviek bola 2,7-násobná strata tryptofánovej fluorescencie; znovu, L-kamitín obnovil základnú hodnotu.
Šošovky vystavené L-karnitínu a oxidačnému stresu ostali priehľadné. Hoci vynálezcovia tohto vynálezu nechcú byť viazaní akoukoľvek teóriou, ochranný efekt L-kamitínu nie je ľahko vysvetlený, L-kamitín sám osebe nie je známy ako vykazujúci antioxidačnú aktivitu (Arduini, A., et al. (1992), J. Biol. Chem. 267, 12673-81). Ani L-kamitín nezachránil vyčerpanie GSH, ktoré znamená, že priaznivý efekt nebol sprostredkovaný zvýšením GSH prostredníctvom napríklad anaplerotického efektu na NADPH, kofaktora enzýmu glutatión reduktáza (Pemg, M.D., (1999), J. Biol. Chem. 47, 33235-33243, Wuensch, S.A., a ray, P.D. (1997), Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 118, 599-605). Skôr skutočnosť, že únik LDH do média nebol zvýšený pri šošovkách liečených s L-kamitínom a vystavených oxidačnému stresu, indikuje, že molekula môže udržať integritu šošovky. Tu ukazujeme, že chaperónová aktivita α-kryštalínu šošovky je znížená prostredníctvom in vitro oxidačného stresu, a poskytuje podpom pre návrh, že šošovkové proteíny podrobené oxidačnému poškodeniu si udržujú vysoký stupeň posttranslačných modifikácií (Cherian, M., a Abraham, E.C., (1995), Biochem. Biophys. Res. Commun. 212, 184-189). L-Kamitín nielen redukoval zvýšené posttranslačné modifikácie šošovkových proteínov, ale tiež poskytol výraznú ochranu proti zníženej chaperónovej aktivite a-kryštalínu. α-Kryštalín ukázal, že potlačuje zhlukovanie denaturovaných proteínov v štúdiách, v ktorých zmesi tepelnému stresu vystavených β-kryštalínov slúžili ako substrát (Kramps, J.A., et al., (1978), Biochem. Biophys. Acta 533, 487-495). Bolo ukázané, že oxidačný stres porušuje chaperónovú aktivitu α-kryštalínov, ktorá je rozhodujúca pre udržovanie priehľadnosti šošoviek (Zigler, J.S. Jr. et al., (1989), free Radic. Biol. Med. 7, 499-505; Richard R.C. et al., (1998), Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217, 397-407). Potom, L-kamitín priaznivo ovplyvňuje priehľadnosť šošovky pôsobením priamo na a-kryštalín.
a- aj β-kryštalíny sú na N-zakončení acetylované. Použitím analýzy skríningu nasávania škvŕn spojenej s hmotnostnou spektrofotometriou Takemoto et al. uskutočnili dôkaz, že metatión a-kryštalínu, ktorý je N-acetylovaný na konci, môže byť oxidovaný na metatiónsulfoxid in vivo (Sims, N.R., et al., (2000), Brain Res. Mol. Brain Res. 77, 176-184). Táto oxidácia metatiónu s N-zakončením, ktoré je odkryté na vonkajšku polypeptidu, môže negatívne vplývať na funkciu proteínu. Popri acetylácii na NH-zakončení sú podrobené acetylácii aminoskupiny lyzínových (Lys) rezíduí. Všetkých sedem kravských Lys rezíduí (α-kryštalín) reagujú s aspirínom, miera acetylácie sa mení od 10 % pri lys 88, najmenej reaktívny, do 60 % pri Lys 166, najviac reaktívny (Takemoto, L. et al., (1992), Curr. Eye Res. 11, 651-655; Rao, G.N. et al., (1985), Biochem. Biophys. Res. Commun. 129, 1125-1127). Aspirín inhibuje glykáciu aj karbamoyláciu prostredníctvom acetylácie Rezíduí Lys (Hasan, A. et al., (1993), Exp. Eye Res. 57, 29-35; Cromptonm, Rixon, K.C., and Harding, J.J. (1985) Exp. Eye Res. 40, 297-311; Rao, G.N., and Cotlier, E. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 151, 991-996; Huby, R., and Harding, J.J. (1988) Exp. Eye Res. 47, 53-59; Ajiboye, R., and Harding D. (1989), Exp Eye Res. 49, 31-41; Blakytin, R., and Harding, J.J. (1992), Exp. Eye Res. 54, 509-518). Nedávno bolo ukázané, že acetyl-L-kamitín inhibuje glykáciu (α-kryštalínu vo väčšej miere než iné kryštalíny, prostredníctvom acetylácie potenciálnych miest glykácie (Groenen, P.J., et al., (1993), Biochem. J. 295, 399404). Glykácia sa zdá oveľa škodlivejšia než acetylácia v dôsledku toho, že pri sieťovaní proteínov a pri výraznom znížení chaperónovej aktivity α-kryštalínu sú obsiahnuté len produkty glykácie (Groenen, P.J. et al., (1993), Biochem. J. 295, 399-404, Blakytin, R., and Harding, J.J. (1992), Exp. Eye Res. 54, 509-518).
Tabuľka 1
Zmeny niektorých biochemických parametrov pri kontrolných šošovkách a pri H2O2 ± L-kamitínom liečených šošovkách
| Hmotnosť šošovky (mg) | Vo vode nerozpustný proteín ( %) | Glutatión (pmol/g hmotn.hmotn.) | Voľný karnitín (nmol/g hmotn.hmotn.) | Acetylkamitín (nmol/g hmotn. hmotn.) | LDH (jednotky/ml upraveného média) | Celkový kamitín (nmol/g hmotn.hmotn.) | |
| Kontrolné | 25 ±0,1 | 5± 1,1 | 4,87± 0,23 | 156 ±3 | 29 ± 1 | NZ | 187 ±5 |
| h2o2 | 47 ± 0,2* | 41 ± 1,9* | 2,44 ± 0,69* | 27 ±2* | 6± 1* | 53 ±6 | 36 ±3* |
| H2O2 + Lkamitín | 27 ± 0,9 | 5 ±2,0 | 2,71 ±0,73* | 151 ±2 | 37 ±2** | NZ | 189 ±2 |
• P<0,001, **P<0,005, NZ: nezistiteľné
Claims (3)
1. Použitie L-kamitínu a jeho solí na zachovanie aktivity zmeneného chaperónového proteínu a-kryštalínu.
5
2. Použitie podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že týmto α-kryštalínom je alfaA-kryštalín.
3. Použitie podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že týmto α-kryštalínom je alfaB-kryštalín.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/IT2000/000520 WO2002048190A1 (en) | 2000-12-15 | 2000-12-15 | Use of l-carnitine as stabilizing agent of proteins |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK8902003A3 SK8902003A3 (en) | 2003-12-02 |
| SK287787B6 true SK287787B6 (sk) | 2011-09-05 |
Family
ID=11133601
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK890-2003A SK287787B6 (sk) | 2000-12-15 | 2000-12-15 | Použitie L-karnitínu ako stabilizačného činidla proteínov |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7833977B2 (sk) |
| EP (1) | EP1341813B1 (sk) |
| AT (1) | ATE339445T1 (sk) |
| AU (1) | AU2001223953A1 (sk) |
| CA (1) | CA2434911C (sk) |
| CY (1) | CY1106235T1 (sk) |
| DE (1) | DE60030787T2 (sk) |
| DK (1) | DK1341813T3 (sk) |
| ES (1) | ES2272351T3 (sk) |
| HU (1) | HU230002B1 (sk) |
| MX (1) | MXPA03006266A (sk) |
| PL (1) | PL199984B1 (sk) |
| PT (1) | PT1341813E (sk) |
| SK (1) | SK287787B6 (sk) |
| WO (1) | WO2002048190A1 (sk) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU6124201A (en) | 2000-05-03 | 2001-11-12 | Expressive Constructs Inc | A method and device for improving protein stability and solubility |
| SK287787B6 (sk) | 2000-12-15 | 2011-09-05 | Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. | Použitie L-karnitínu ako stabilizačného činidla proteínov |
| WO2005004894A2 (en) * | 2003-05-12 | 2005-01-20 | Expressive Constructs, Inc. | Methods for increasing cell and tissue viability |
| EP2512492A1 (en) * | 2009-12-14 | 2012-10-24 | University of Massachusetts | Methods of inhibiting cataracts and presbyopia |
| US20200140500A1 (en) * | 2012-07-17 | 2020-05-07 | The Regents Of The University Of Michigan | High throughput methods, protein inhibitors, and uses thereof |
| BR112015023348B1 (pt) | 2013-03-14 | 2023-04-25 | The University Of Massachusetts | Composição oftálmica |
| PE20181070A1 (es) | 2015-11-13 | 2018-07-04 | Univ Massachusetts | Moleculas bifuncionales que contienen peg para uso en la inhibicion de cataratas y presbicia |
| CN119258202A (zh) * | 2023-07-05 | 2025-01-07 | 重庆誉颜制药有限公司 | 一种肉毒毒素蛋白组合物及其应用 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1235153B (it) * | 1988-11-15 | 1992-06-22 | Sigma Tau Ind Farmaceuti | Uso dell'acetil l-carnitina nel trattamento terapeutico della cataratta e composizioni farmaceutiche utili in tale trattamento |
| US20040058015A1 (en) | 2000-06-01 | 2004-03-25 | Yuanjin Tao | Compositions and methods for treating eye discomfort and eye disease |
| SK287787B6 (sk) | 2000-12-15 | 2011-09-05 | Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. | Použitie L-karnitínu ako stabilizačného činidla proteínov |
| ITRM20010294A1 (it) | 2001-05-29 | 2002-11-29 | Sigma Tau Ind Farmaceuti | Uso della acetil l-carnetina in associazione con la biotina per il trattamento di pazienti affetti da diabete mellito di tipo ii insulino re |
| US6923960B2 (en) | 2001-10-03 | 2005-08-02 | Vsl Pharmaceuticals Inc. | Antioxidant combination composition and use thereof |
| WO2006121421A2 (en) | 2004-01-14 | 2006-11-16 | Robert Ritch | Methods and formulations for treating glaucoma |
| ITRM20040327A1 (it) | 2004-07-01 | 2004-10-01 | Sigma Tau Ind Farmaceuti | Uso della acetil l-carnitina per la preparazione di un medicamento per il trattamento del dolore neuropatico in pazienti diabetici. |
| US8569366B2 (en) | 2005-04-26 | 2013-10-29 | Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. | Acetyl L-carnitine for prevention of painful peripheral neuropathy in patients with type 2 diabetes |
-
2000
- 2000-12-15 SK SK890-2003A patent/SK287787B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-12-15 US US10/470,999 patent/US7833977B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-15 PL PL367204A patent/PL199984B1/pl unknown
- 2000-12-15 HU HU0400737A patent/HU230002B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-12-15 DK DK00987614T patent/DK1341813T3/da active
- 2000-12-15 DE DE60030787T patent/DE60030787T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-15 AU AU2001223953A patent/AU2001223953A1/en not_active Abandoned
- 2000-12-15 CA CA002434911A patent/CA2434911C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-15 WO PCT/IT2000/000520 patent/WO2002048190A1/en not_active Ceased
- 2000-12-15 EP EP00987614A patent/EP1341813B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-15 PT PT00987614T patent/PT1341813E/pt unknown
- 2000-12-15 AT AT00987614T patent/ATE339445T1/de active
- 2000-12-15 MX MXPA03006266A patent/MXPA03006266A/es active IP Right Grant
- 2000-12-15 ES ES00987614T patent/ES2272351T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-11-03 CY CY20061101592T patent/CY1106235T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2434911A1 (en) | 2002-06-20 |
| HUP0400737A2 (hu) | 2004-07-28 |
| PT1341813E (pt) | 2007-01-31 |
| CY1106235T1 (el) | 2011-06-08 |
| DE60030787D1 (de) | 2006-10-26 |
| EP1341813B1 (en) | 2006-09-13 |
| SK8902003A3 (en) | 2003-12-02 |
| ES2272351T3 (es) | 2007-05-01 |
| US20040120967A1 (en) | 2004-06-24 |
| DK1341813T3 (da) | 2007-01-15 |
| US7833977B2 (en) | 2010-11-16 |
| ATE339445T1 (de) | 2006-10-15 |
| PL367204A1 (en) | 2005-02-21 |
| HUP0400737A3 (en) | 2013-06-28 |
| CA2434911C (en) | 2009-12-08 |
| HU230002B1 (en) | 2015-04-28 |
| EP1341813A1 (en) | 2003-09-10 |
| AU2001223953A1 (en) | 2002-06-24 |
| DE60030787T2 (de) | 2007-09-13 |
| WO2002048190A1 (en) | 2002-06-20 |
| PL199984B1 (pl) | 2008-11-28 |
| MXPA03006266A (es) | 2004-06-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Meehan et al. | Amyloid fibril formation by lens crystallin proteins and its implications for cataract formation | |
| Trelstad et al. | Isolation of two distinct collagens from chick cartilage | |
| Andley et al. | The R116C mutation in αA-crystallin diminishes its protective ability against stress-induced lens epithelial cell apoptosis | |
| Currie et al. | Characterization of the synthesis and accumulation of a 71-kilodalton protein induced in rat tissues after hyperthermia | |
| Moura et al. | The close interplay of nitro-oxidative stress, advanced glycation end products and inflammation in inflammatory bowel diseases | |
| Attanasio et al. | Protective effects of L-and D-carnosine on α-crystallin amyloid fibril formation: implications for cataract disease | |
| Prajapati et al. | Myricetin inhibits amyloid fibril formation of globular proteins by stabilizing the native structures | |
| Cao et al. | Effects of L-carnitine on high glucose-induced oxidative stress in retinal ganglion cells | |
| KR100864380B1 (ko) | 두뇌기능 향상과 뇌신경계 질환 예방 또는 치료용 펩타이드 | |
| Pasquali-Ronchetti et al. | Pseudoxanthoma elasticum: biochemical and ultrastructural studies | |
| Peluso et al. | Carnitine protects the molecular chaperone activity of lens α‐crystallin and decreases the posttranslational protein modifications induced by oxidative stress | |
| SK287787B6 (sk) | Použitie L-karnitínu ako stabilizačného činidla proteínov | |
| Castino et al. | Autophagy is a prosurvival mechanism in cells expressing an autosomal dominant familial neurohypophyseal diabetes insipidus mutant vasopressin transgene | |
| Ghosh et al. | Crowded milieu prevents fibrillation of hen egg white lysozyme with retention of enzymatic activity | |
| Khalifa et al. | Cyanidin 3-rutinoside defibrillated bovine serum albumin under the glycation-promoting conditions: A study with multispectral, microstructural, and computational analysis | |
| Shun-Shin et al. | Morphologic characteristics and chemical composition of Christmas tree cataract. | |
| RU2627769C1 (ru) | 9-Бензил-2-бифенилимидазо[1,2-а]бензимидазол и его фармацевтически приемлемые соли, проявляющие свойства разрушителей поперечных сшивок гликированных белков | |
| Raju et al. | Role of αA-crystallin-derived αA66-80 peptide in guinea pig lens crystallin aggregation and insolubilization | |
| EP3156064B1 (en) | Application of yb-1 protein and fragments thereof for preparing medicinal agents in treating alzheimer's disease | |
| EP0610481A1 (en) | Extraction of collagen | |
| US20090227488A1 (en) | Class of bioactive glycoprotein | |
| CZ20031891A3 (cs) | Použití L-karnitinu jako stabilizátoru proteinů | |
| Babizhayev | Potentiation of intraocular absorption and drug metabolism of N-acetylcarnosine lubricant eye drops: drug interaction with sight threatening lipid peroxides in the treatment for age-related eye diseases | |
| Williams | Studies on azide, caeruloplasmin and copper in relation to Wilson's disease | |
| Parkhomenko et al. | APPLICATION OF FLUORESCENT POTENTIAL-SENSITIVE PROBES FOR THE STUDY OF LIVING BLOOD AND MARROW CELLS |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees |
Effective date: 20161215 |