SK702019A3

SK702019A3 - Príprava farmaceutickej aktívnej látky lipstatín s použitím produkčného mikroorganizmu Streptomyces toxytricini NRL

Info

Publication number: SK702019A3
Application number: SK702019A
Authority: SK
Inventors: Ing. Kluková Jana
Original assignee: Biotika A.S.
Priority date: 2019-06-13
Filing date: 2019-06-13
Publication date: 2021-01-13

Abstract

Vynález sa týka biotechnologickej prípravy lipstatínu pomocou mikroorganizmu Streptomyces toxytricini.

Description

S K 70-2019 Α3

Oblasť techniky

Výnález sa týka biotechnologickej prípravy farmaceutický aktívnej látky’ lipstatín s použitím produkčného mikroorganizmu Streptomyces toxytricini NRL.

Doterajší stav techniky

Základnou stavebnou jednotkou lipstatínu je β-laktámový kruh nesúci dva alifatické zvyšky dlhých mastných kyselín so 6 až 14 atómami uhlíka. Jeden z postranných reťazcov obsahuje dve dvojité väzby a jednu hyd rovy skupinu, ktorá je esterifikovaná ako N-formyl-leucín. Katalytickou hydrogenáciou lipstatínu je možné získať tetrahydrolipstatín (orlistat).

Orlistat s molekulovou hmotnosťou 495,74 g/mol, je aktívna látka na redukciu telesnej hmotnosti. Pôsobí na mieste štiepenia tukov, t. j. v žalúdku a tenkom čreve. Svojim účinkom blokuje pankreatický enzým zvaný hpáza, čím bráni absorpcii tukov z potravy až do jednej tretiny. Tento fenomén sa využíva pri liečbe obezity a môže slúžiť aj ako prevencia voči hyperlipémii a artérioskleróze.

Produkčný mikroorganizmus: Streptomyces toxytricini NRL

Publikované patenty a informácie, týkajúce sa oblasti fermentácie lipstatínu biosyntézou pomocou kmeňa Streptomyces toxytricini sú nasledovné:

1. Taxonómiu bakteriálnych kmeňov Streptomyces species popisuje International Streptomyces Project v Journal of Fermentation Technology Vol 2, p.52,1974.

2. Kmeň Streptonyces toxytricini Preobrazhenskaya & Sveshnikova je popísaný v Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8 thEdition, page811.

3. Mutagenesis ofthe lipstatín producer Streptomyces toxytricini ATCC 19813.

Autori publikácie (Luthra U., Kumar H. A Dubey R. C., Journal of Biotechnology Letters, ISSN: 09767045 & E-ISSN: 0976-7053, Volume 4, Issue 1, 2013, pp.-68-71.) popisujú spôsoby mutagenézy pomocou UV žiarenia a chemického mutagénu N-methyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidine (NTG). 20 kolónu produkčného kmeňa Streptonyces toxytricini ATCC 19813 po pôsobení mutagénov bolo vy izolovaných a otestovaných na produkciu lipstatínu. Po UVzásahu bola dosiahnutá produkcia 2,34 mg/g apo pôsobeníNTGboladosiahnutá produkcia 2,88 mg/g lipstatínu za 264 hodín kultivácie.

4. Weibel et al. popisuje fermentačný proces lipstatínu (Journal of Antibiotics Vol XL,No.8 pp.10861091)

5. E. Hochuh popisuje chemickú štruktúru lipstatínu (Journal of Antibiotics Vol XL,No.8 pp.1081 1085).

6. Médium optimization of lipstatín from Streptomyces toxytricini ATCC 19813 by shake flask study

Autori publikácie (Umesh Luthra a Dubey R. C., International Journal of Micribiology Research, ISSN: 0975-5276 & E-ISSN: 0975-9174, Volume 4, Issue 7, 2012, pp.-266-269) popisujú vplyv zloženia média na produkciu lipstatínu produkčným kmeňom Streptonyces toxytricini ATCC 19813 v bankovej kultivácn. Najvyššiu produkciu lipstatínu dosiahli na médiu obsahujúcom 22,5 g/1 glycerol, 35 g/1 sójovej múky, 15 g/1 sójového oleja, 25 g/1 sójového lecitínu a 0,5 g/1 PPG pri pH 7,2, teplote 28 °C a miešaní 220 rpm. Výťažnosť sa pohybovalav rozmedzí 0,097 až 0,885 g/1 lipstatínu.

7. US Patent 4,598,089 a EP 0129748 Process forpreparing leucine deriváte and pharmaceutical composition formed therefore

Patent sa týka N-fomylleucínových derivátov, ktoré inhibujú pankreatickú lipázu a ktoré môžu byť použité na kontrolu a prevenciu obezity. Tieto deriváty môžu byť produkované kultiváciou mikroorganizmu Streptomyces toxytricini NRRL 15443. Produkčné médium ako hlavné uhlíkaté zdroje obsahuje zmes zemiakového škrobu, glukózy , ribózy. a glycerínu. Ako zdroj dusíka uvádza peptón, sójovú múku a síran amónny. Počas kultivácie produkčného stupňa sa udržiava kultivačná teplota 28 °C, vzdušnenie 1 vvm a miešanie 150 rpm.

8. EP 0 803 576 BI Process forthe productionof lipstatín and tetrahydrolipstatín

Patent popisuje nový príkrmový proces fermentácie lipstatínu, ktorý pozostáva z rastovej fázy, v ktorej sa v kultivačnom médiu so zložením podľa US Patent 4,598,089, obsahujúcom voľné tuky a oleje, zdroje uhlíka a dusíka a anorganické soli anaeróbnou kultiváciou pomnoží produkčný kmeň v dostatočnom množstve, a potom sa začne prikrmovať kyselinou linolovou prípadne spolu s kyselinou kaprylovou a ich estermia soľami a N-formyl-L-leucínom s výhodou leucínom, pričom sa tvorí lipstatín. Výťažnosť fermentácie je nízka, pretože obe kyseliny sú toxické.

9. US2002/0110873 Al Process for the productionoflipstatín andtetrahydrolipstatín

Patent uvádza produkciu lipstatínu 9 106 mg/1 za 184 hodín kultivácie, za podmienok popísaných v patente EP 0 803 576 BI a s použitím mutantného kmeňa R 4569, odvodeného od kmeňa Streptonyces toxytricini NRRL 15443 s vyššou produkciou lipstatínu.

S K 70-2019 Α3

10. US 2003/10138919 A1 a WO 03/048335 A2 Fermentation process for lipstatin and method of extracting lipstatin Írom a fermentation broth

Patent popisuje prípravu fermentačného média obsahujúceho lipstatin produkujúci kmeň, ktorí využíva olej a asimilovateľný zdroj uhlíka, pričom sa olej a uhlíkatý zdroj dávkuje v pomere, ktorý je optimálny pre produkciu lipstatínu a zároveň sa fermentačné médium prikrmuje emulgačným činidlom (Lecitín, Triton X-100, Brij 35 S), čím sa udržuje optimálna viskozita kultivačného média a optimálna hodnota pH počas fermentačného procesu. Bankovou kultiváciou v produkčnom médiu obsahujúcom sójovú a bavlníkovú múku, glycerín ako uhlíkatý substrát, polypropylénglykol ako odpeňovač a emulzifikátor lecitín sa dosiahla výťažnosť 1,700 až 1,800 mg/1 lipstatínu za 144-168 hodín. V meradle 4 litrov fermentačného média sa dosahuje produkcia lipstatínu s rovnakou technológiou 1,500 až 1,600 mg/1 za 144 až 168 hodín kultivácie.

11. WO 2004/003212 A1 Novel process forthe productionofpancreatic lipase inhibitor

Patent popisuje prípravu lipstatínu na pevnej substrátovej matici s maximálnou produkciou lipstatínu 1 486 mg/kg substrátu.

12. EP 1 860 194 A1 a WO2007134836 Fermentative production of lipstatin

Predložený vynález opisuje spôsob, ktorý umožňuje výrobu lipstatínu s vysokou výťažnosťou a čistotou. Podľa EP 1 860 194 sa v bankovej kultivácn na presne definovanom kultivačnom médiu za aeróbnych podmienok pri 28 °C dosahuje výťažnosť 67 až 556 mg/1 a v 150 1 laboratórnom fermentore 1575 mg/1 lipstatínu za 185 hodín kultivácie pri 27 °C, miešaní 330 rpm a vzdušnení 50 Fmin., koncentrácia rozpusteného kyslíka sa udržiavala od 24. hk na hodnote okolo 1 %. Od 20. hk sa prikrmovalo kyselinou linolovou, jej koncentrácia sa udržiavala na 0,3 %. Podľa WO2007134836 sa v 150 1 laboratórnom fermentore dosiahla výťažnosť lipstatínu 4 773 mg/1 za 136 hodín kultivácie.

13. WO 2010000839 a EP 2 141 236 A1 Process for productionof lipstatin and microorgamsms therefore

Tento vynález opisuje prípravu mutantných alebo rekombinovaných mikroorganizmov rodu Streptomyces a ich použitie vofermentácu lipstatínu.

14. US2011014664 A1 Fermentation Process for Higher Yreld Coefficient of Lipase-Inhibitor with Respectto Consumed Fatty Acid

Tento vynález opisuje spôsob výroby inhibítorov lipázy prostredníctvomzlepšeného fermentačného procesu, ktorý sa vyznačuje kombináciou príkrmov kyselinou linolovou alebo jej esterov a ich solia omega 9 mastných kyselín, výhodne kyseliny olejovej a/alebo jej derivátov v priebehu fermentácie, čo má za následok zlepšenie výťažku lipstatínu. Za podmienok, popísaných v patente sa dosiahla výťažnosť 8±1 g/1 lipstatínu za 240 hodín kultivácie.

15. CN102268466 (A) Method for fermentation production of lipstatin and culture médium components thereof

V tomto patente sa popisuje spôsob fermentácie lipstatínu. Sú v ňom popísané základné kroky prípravy šikmých agarov, inokula a fermentačného procesu, v ktorom sa ako hlavné zdroje uhlíka a dusíka používajú sójovámúka aglycerol.

16. CN 102827892 (A) Lipstatin productionprocess

V patente je popísaný proces výroby lipstatínu pomocou kmeňa Streptomyces toxytricini. v ktorom sa na prípravu kultivačných médií používa deionizovaná voda, pôda obsahuje glycerol, sójový šrot, lecitín, slnečnicový olej, síran horečnatý,uhličitan vápenatý.

17. CN102876745 (A) Method forproduction of lipstatin through fermentation

Patent popisuje proces výroby lipstatínu pomocou kyslíkových vektorov, obsahujúcich hemoglobín, mety Isilikónový olej alebo tetraflórmetán. Vo fermentácn sa dosahuje o 15 % vy ššia produkcia lipstatínu.

18. CN102965407 (A) Production process ofLipstatin

Špeciálnym zložením kultivačného média, ktoré obsahuje sójovú múku, slnečnicový olej a glycerol ako zdroje dusíka a uhlíka a špeciálnym vedením fermentácie a procesu purifikácie sa vyrobí lipstatin vysokej čistoty.

19. CN103131739 (A) Production process forpreparing lipstatin

V patente je popísaný spôsob výroby lipstatínu, ktorý zahŕňa tieto kroky: príprava inokula, produkčný stupeň a proces purifikácie vyfermentovaného produktu. Kultivačné médium obsahuje glycerol, sójovú múku, lecitín a sójový olej ako hlavné zdroje uhlíka a dusíka.

20. CN103320481 (A) Regulation andcontrolof microbial metabolism of Streptomyces toxytricini

Patent popisuje prípravu lipstatínu prostredníctvom regulácie a kontroly fermentačného procesu s produkčným kmeňom Streptomyces toxytricini. Po 24 až 36 hodinách kultivácie sa rozpustený kyslík v pôde udržiava na hodnote 20 až 30 %.

21. CN 103468603 (A) Streptomyces toxytricini and applications of streptomyces toxytricini in preparation of lipstatin

V patente je popísaný kmeň Streptomyces toxytricini ST - 5423, ktorý je uložený v Čínskej národnej zbierke kmeňov. Patent tiež popisuje spôsob prípravy lipstatínu pomocou tohto kmeňa.

S K 70-2019 Α3

22. CN103555610 (A) Streptomyces toxytricini for high yield of lipstatin and fermentation médium thereof

Patent popisuje kmeň Streptomyces toxytricini. ktorý je schopný s vysokou účinnosťou utilizovať tuk a poskytuje vysokú výťažnosť lipstatínu.

23. CN103820510 (A) Method for producing lipstatin through microbial fermentation and culture médium

V patente popísaný spôsob vedenia fermentácie zahŕňa tieto kroky: prídavok iónov horčíka, kobaltu a zinku do kultivačného média a prídavok kyseliny n-kaprylovej v štvrtý a šiesty deň fermentácie. Fermentácia prebieha 150 až 180 hodín pri teplote 28 °C a miešaní 220 rpm Podľa patentu vhodnou kombináciou prekurzora a kovových iónov možno výrazne zvýšiť výťažnosť lipstatínu.

24. CN103834700 (A) Composition for fermentation process of lipstatin

Zmydelnením slnečnicového oleja sa získa soľ, obsahujúca kyselinu linolovú, ktorá je o 50 % lacnejšia, ako bežná komerčná. Táto soľ sa použije vo fermentácu lipstatínu, pričom výťažnosť sa zvýši o 12 až 18 %. Za 180 hodín kultivácie sa dosiahla produkcia 7,9 g/1 lipstatínu.

25. CN103937847 (A) Method for fermentation productionof lipstatin

Podľa predloženého patentu sa namiesto kyseliny linolovej používa na príkrmy zmes mastných kyselín: kyselina stearová, olejová, linolová a palmitová v určitom pomere. Výťažnosť fermentácie sa zvýšila o 6 až 16 % a za 170 hodín kultivácie savyprodukovalo 7,8 g/1 lipstatínu.

26. CN104630301 (A) Method forproducing lipstatin by virtue of fermentation

Patent popisuje výrobu lipstatínu fermentačným spôsobom pomocou kmeňa Streptomyces toxytricini. Namiesto kyseliny linolovej a leucínu sa v 50. hodine kultivácie začne prikrmovať ľanovým olejom, čím sa zlepší využitie živín z kultivačného média. V 130. hodine kultivácie sa teplota fermentácie zníži z 28° na 27 °C, čím môže byť fermentačný proces predĺžený o 20 až 30 hodín a v kombinácu s príkrmom ľanovým olejom sa zvýši produkcia lipstatínu. Za 200 hodín kultivácie bola dosiahnutá výťažnosť 9,3 g/1 lipstatínu.

Podstata vynálezu

Výnález sa týka biotechnologickej prípravy lipstatínu pomocou kmeňa Streptomyces toxytricini NRL bez použitia emulgátora v produkčnej pôde a s použitím prekurzorov, ktorými sú kyselina linolová a L-Leucín. Kmeň Streptomyces toxytricini NRL produkuje lipstatin v koncentrácii 3,0 až 4,0 g/kg fermentačnej pôdy za 150 až 180 hodín kultivácie v produkčnom médiu pri 28 °C za použitia jednostupňového inokula.

Kultivácia kmeňa Streptomyces toxytricini NRL, využívaného pri fermentačnom procese, prebieha v troch krokoch:

L Sporulácia kultúry

2. Inokulačný stupeň

3. Produkčný stupeň

Sporulácia kultúry

Pre kvalitu inokula je dôležitá dobrá sporulácia. V priebehu 5 až 10 dní pri 28 °C je kultúra vyspomlovaná, kolónie sú okrúhle, mierne vypuklé až zvrásnené, vzdušné mycéliumje hnedoružovej farby s bielou zónou na okraji kolónie, s veľkosťou kolónu cca 5 až 10 mm. Na sporuláciu kultúry sa používa sporulačná pôda s nasledovným zložením dextrín 4 g/1, kvasničný extrakt 4 g/1, mált extrakt 10 g/1, CaCO3 2 g/1, agar 20 g/1 a destilovanávoda do 1 000 ml

Inokulačný stupeň

Spóry kmeňa Streptomyces toxytricini NRL sa použijú na očkovanie 100 ml inokulačnej pôdy v 500 ml Erlenmayerových bankách. Kultivácia vegetatívneho inokula prebieha na rotačnom trepacom stroji pri teplote 28 °C a otáčkach od 180 do 250 rpm 24 až 26 hodín. Kvalitné inokulum sa vyznačuje nasledovnými vlastnosťami:

- mikroskopický obraz - pelety malé, rozvláknené

- sediment biomasy 14 až 16 %

Inokulačné médium obsahuje sójovú múku 10 g/1, glycerín 10 g/1, kvasničný extrakt 5 g/1 a pitnú vodu do 1 000 ml.

Produkčný stupeň

a.) V laboratórnom meradle sa na testovanie a výber produkčné najlepších izolátov produkčného mikroorganizmu Streptomyces toxytricini NRL používa produkčné médium nasledovného zloženia: sójová múka 48 g/1, práškový com-steep 1 až 2 g/1, glycerín 30 g/1, CaCO3 5g/l, kvasničný extrakt 1 g/1, metylester sójového oleja 20 g/1, MgSO4.7H2O 0,05 g/1, MnSO4.4H2O 0,04 g/1 a pitná voda do 1 000 nú. Vegetatívne ino

S K 70-2019 Α3 kulum pripravené v Erlenmayerových bankách sa do produkčného stupňa preočkuje v množstve 1 % až 5 %. Produkčné médium obsahuje ako prekurzor lipstatínu netoxický metylester sójového oleja oproti kyseline linolovej, ktorej koncentrácia nad 1 g/1 pôsobí toxicky na produkčný mikroorganizmus. V24. hodine kultivácie sa do baničky pridáva prikrm od 0,7 do 0,9 ml 8 % L-leucínu a od 0,5 do 0,7 ml 25 % glycerínu. Kultivácia prebieha pri kultivačnej teplote 28 °C pri otáčkach od 180 do 250 rpm72 hodín s produkciou lipstatínu 0,35 až 0,58 g/kg.

b.) Pre poloprevádzkovú prípravu lipstatínu s produkčným mikroorganizmom Streptomyces toxytricini NRL sa používa produkčné médium nasledovného zloženia: sójová múka od 48 do 58 g/1, práškový comsteep od 1 do 2 g/1, glycerín 50 g/1, kvasničný extrakt 1 g/1, CaCO3 5 g/1, KH2PO4 od 0,1 do 0,2 g/1, MgSO4.7H2O 0,3 g/1, FeSO4.7H2O 0,03 g/1, MnSO4.4H2O 0,04 g/1, ZnSO4.7H2O 0,005g/l, sójový olej 9,2 g/1, odpeňovač Slovanik 1 g/1.

Produkčné médium sa očkuje vegetatívnym inokulo m, pripraveným v Erlenmeyerových bankách v množstve od 3 % do 5 %. Kultivácia prebieha za aseptických podmienok pri kultivačnej teplote 28 °C od 150 do 180 hodín, za pretlaku 60 kPa, vzdušnenia od 0,6 do 1 vvm a miešania od 300 do 650 rpm Hodnota pH počas kultivácie je udržiavaná v rozsahu od 6,5 do 7,5, s 28 %-ným roztokom hydroxidu sodného alebo 20 %ným roztokom kyseliny sírovej. Hladina rozpusteného kyslíka v pôde sa počas fermentácie udržiava na hodnotách 40 - 50 % nasýtenia. Výhodou kultivácie s kmeňom Streptomyces toxytricini NRL je, že vylúčením emulgačného činidla zo základného zloženia produkčného média sa zlepšuje prestup kyslíka k bunkám producenta.

Od 25 hodiny kultivácie sa začína dávkovať 50 %-ný roztok glycerínu ako zdroj uhlíka. Pri stagnácii sedimentu sa rýchlosť dávkovania glycerínu zvyšuje o 0,025 až0,125 g/hod/lmédia.

Pri syntéze lipstatínu sa ako prekurzor pre tvorbu lipstatínu používa kyselina linolová a L-leucín. Koncentrácia kyseliny linolovej sa dávkovaním udržiava v rozmedzí 0,1 až 0,3 g/1 fermentačnej pôdy. Začiatok dávkovania kyseliny linolovej a L-Leucínu je na konci rastovej fázy v 34. hodine kultivácie, ktorá sa vyznačuje utilizáciou počiatočného uhlíkatého zdroja sprevádzanou zvýšenou koncentráciou rozpustného kyslíka vo fermentačnej pôde. Kyselina linolová a L-Leucín sa dávkujú kontinuálne v pomere 1:0,8.

Uvedený postup vedenia fermentačného procesu s produkčným kmeňom Streptomyces toxytricini NRL v objemoch do 70 1 fermentačnej pôdy obvykle trvá 150 až 180 hodín. Dosiahnuté výťažnosti lipstatínu sú na úrovni 3 až 4 g/kg fermentačnej pôdy, stanovené metódou HPLC.

Popis kmeňa: Kmeň Streptomyces toxytricini NRL

Morfológia: - substrátové mycélium kmeňa Streptomyces toxytricini NRL na sporulačnej pôde je tmavohnedej farby, vzdušné mycélium hnedo-ružovej farby. Jednotlivé kolónie kmeňa Streptomyces toxytricini sú okrúhle, mieme vypuklé až zvrásnené, hnedo-ružovej farby s bielou zónou na okraji kolónie, s priemerom 5 až 10 mm za 5 - 10 dní kultivácie v termostate pri 28 °C. Optimálne pH kultivácie: od 6 do 8

Utilizácia uhlíkatého substrátu: dobre utilizuje glycerín, glukózu, dextrín, slabšie utilizuje sacharózu, laktózu

Optimálna teplota kultivácie: 28 ± 1 °C

Prekurzory: Kyselina linolová, L-Leucín, metylester sójového oleja

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad č. 1

a) Príprava sporového materiálu

Sporová suspenzia kmeňa Streptomyces toxytricini NRL sa nanesie na sporulačnú pôdu nasledovného zloženia: dextrín 4g/l, kvasničný extrakt 4 g/1, mált extrakt 10 g/1, CaCO3 2 g/1, agar 20 g/1 a destilovaná voda do 1 000 ml. Kmeň sakultivuje pri 28 °C, 5 až 10 dní.

b) inokulačný stupeň

Spóry kmeňa Streptomyces toxytricini NRL sa použijú na očkovanie 100 ml inokulačnej pôdy v 500 ml Erlenmayerových bankách. Zloženie inokulačnej pôdy je nasledovné: sójová múka 10 g/1, glycerín 10 g/1, kvasničný extrakt 5 g/1, pitná voda do 1 000 nú. Inokulum sa kultivuje na rotačnom trepacom stroji pri 28 °C a otáčkach 250 rpm 24 hodín. Pripravené vegetatívne inokulum sa použije na očkovanie produkčného stupňa, c) produkčný stupeň

Vegetatívne inokulum pripravené v Erlenmayerových bankách sa preočkuje v množstve 2 % do 60 nú produkčného média v Erlenmayerových bankách nasledovného zloženia: sójová múka 48 g/1, glycerín 30 g/1, CaCO3 5g/l, kvasničný extrakt 1 g/1, metylester sójového oleja 20 g/1, MgSO4.7H2O 0,05 g/1, MnSO4.4H2O 0,04 g/1 a pitná voda do 1 000 nú. Produkčné médium sa sterilizuje 30 minút pri 121 °C.

V 24. hodine kultivácie sa do banky pridá prikrm 0,8 nú 8 % leucínu a 0,6 nú 25 % glycerínu. Po 72 hodinách kultivácie na rotačnom trepacom stroji pri 28 °C a otáčkach 250 rpm sa stanoví obsah lipstatínu metódou HPLC, ktorého koncentrácia za uvedených podmienok dosahuje hodnoty 0,577 g/kg fermentačnej pôdy.

S K 70-2019 Α3

Príklad č. 2

a) inokulačný stupeň

Spóry kmeňa Streptomyces toxytricini NRL, pripravené podľa príkladu č. 1, sa použijú na očkovanie 100 ml inokulačnej pôdy v 500 ml Erlenmayerových bankách. Zloženie inokulačnej pôdy je nasledovné: sójová múka 10 g/1, glycerín 10 g/1, kvasničný extrakt 5 g/1, pitná voda do 1 000 ml. Inokulum sa kultivuje rotačnom trepacom stroji pri 28 °C a otáčkach 250 rpm 25 hodín. Pripravené vegetatívne inokulum sa použije na očkovanie produkčného stupňa, b) produkčný stupeň

Vegetatívne inokulum pripravené v Erlenmayerových bankách sa preočkuje v množstve 3 % do 60 ml produkčného média v Erlenmayerových bankách nasledovného zloženia: sójová múka 50 g/1, práškový comsteep 1 g/1, glycerín 30 g/1, CaCO3 5g/l, kvasničný extrakt 1 g/1, metylester sójového oleja 20 g/1, MgSO4.7H2O 0,05 g/L MnSO4.4H2O 0,04 g/1 a pitná voda do 1 000 ml. Produkčné médium sa sterilizuje 30 minút pri 120 °C.

V 24. hodine kultivácie sa do banky pridá príkrm 0,8 ml 8 % leucínu a 0,6 ml 25 % glycerínu. Po 72 hodinách kultivácie na rotačnom trepacom stroji pri 28 °C a otáčkach 250 rpm sa stanoví obsah lipstatínu metódou HPLC, ktorého koncentrácia za uvedených podmienok dosahuje hodnoty 0,485 g/kg fermentačnej pôdy.

Príklad č. 3

a) inokulačný stupeň

Spóry kmeňa Streptomyces toxytricini NRL, pripravené podľa príkladu č. 1, sa použijú na očkovanie 100 ml inokulačnej pôdy v 500 ml Erlenmayerových bankách. Zloženie inokulačnej pôdy je nasledovné: sójová múka 10 g/L glycerín 10 g/1, kvasničný extrakt 5 g/L pitná voda do 1 000 ml. Inokulum sa kultivuje na rotačnom trepacom stroji pri 28 °C a otáčkach 250 rpm 24 hodín. Pripravené vegetatívne inokulum sa použije na očkovanie produkčného stupňa, b) produkčný stupeň

Vegetatívne inokulum pripravené v Erlenmayerových bankách sa preočkuje v množstve 4,0 % do produkčného stupňa v 70 1 fermentačnom tančíku s objemom 40 1 produkčnej pôdy nasledovného zloženia: sójová múka 48 g/1, práškový com-steep 1 g/L glycerín 50 g/1, kvasničný extrakt 1 g/1, CaCO3 5 g/L KH2PO4 0,2 g/1, MgSO4.7H2O 0,3 g/1, FeSO4.7H2O 0,03 g/1, MnSO4.4H2O 0,04 g/1, ZnSO4.7H2O 0,005g/l, sójový olej 9,2 g/1, odpeňovač Slovanik 1 g/1. V priebehu kultivácie sa udržiavajú optimálne kultivačné podmienky. Koncentrácia nasýteného kyslíka v pôde sa udržiava na hodnote 45 % nasýtenia vzdušnením od 0,6 do 1,0 vvm, pretlakom 60 kPa, miešaním od 300 do 650 rpm a pri teplote 28 °C. Optimálne pH v priebehu kultivácie sa udržiava na hodnotách od 6,8 do 7,2 s 28 %-ným roztokom NaOH alebo 20 %-ným roztokom H2SO4. Od 25. hodiny kultivácie sa začína prikrmovať roztokom glycerínu rýchlosťou 0,75 g/hod/ 1 média. Pri stagnácn sedimentu sa dávkovanie glycerínu zvýši o 0,125 g/hod/ 1 kultivačného média. Kyselina linolová a L-Leucín sa začínajú dávkovať od 34. hodiny kultivácie v pomere 1 : 0,8. V priebehu kultivácie sa príkrmami udržiava optimálna koncentrácia kyseliny linolovej na hodnotách od 0,10 do 0,20 g/1. Kultivácia je ukončená, keď dochádza k stagnácn produkcie lipstatínu a nedochádza k utilizácn kyseliny linolovej. Za popísaných kultivačných podmienok na kultivačnom médiu uvedeného zloženia sa dosiahla produkcia lipstatínu 4,0 g/kg fermentačnej pôdy za 177 hodín kultivácie.

Príklad č. 4

Vegetatívne inokulum pripravené v Erlenmayerových bankách podľa príkladu č. 3 a) sa preočkuje v množstve 4,5 % do produkčného stupňa v 70 1 fermentačnom tančíku s objemom 40 1 produkčnej pôdy nasledovného zloženia: sójová múka 48 g/1, práškový com-steep 1 g/1, glycerín 50 g/1, kvasničný extrakt 1 g/L CaCO3 5 g/1, KH2PO4 0,2 g/1, MgSO4.7H2O 0,3 g/1, FeSO4.7H2O 0,03 g/1, MnSO4.4H2O 0,04 g/1, ZnSO4.7H2O 0,005g/l, sójový olej 9,2 g/1, odpeňovač Slovanik 1 g/1. V priebehu kultivácie sa udržiavajú optimálne kultivačné podmienky. Koncentrácia nasýteného kyslíka v pôde sa udržiava na hodnote 45 % nasýtenia vzdušnením od 0,6 do Ι,θ wm, pretlakom 60 kPa, miešaním od 300 do 650 rpm a pri teplote 28 °C. Optimálne pH v priebehu kultivácie sa udržiava na hodnotách od 6,8 do 7,2 s 28 %-ným roztokom NaOH alebo 20 %-ným roztokom H2SO4. Od 25. hodiny kultivácie sa začína prikrmovať roztokom glycerínu rýchlosťou 0,75 g/hod/1 média. Pri stagnácn sedimentu sa dávkovanie glycerínu zvýši o 0,125 g/hod/1 kultivačného média. Kyselina linolová a L-Leucín sa začínajú dávkovať od 34. hodiny kultivácie v pomere 1 : 0,8. Vpriebehu kultivácie sa príkrmami udržiava optimálna koncentrácia kyseliny linolovej na hodnotách od 0,15 do 0,20 g/1. Kultivácia je ukončená, keď dochádza k stagnácn produkcie lipstatínu a nedochádza k utilizácn kyseliny linolovej. Za popísaných kultivačných podmienok na kultivačnom médiu uvedeného zloženia sa dosiahla produkcia lipstatínu 3,46 g/kg fermentačnej pôdy za 150 hodín kultivácie.

S K 70-2019 Α3

Príklad č. 5

Vegetatívne inokulum pripravené v Erlenmayerových bankách podľa príkladu č.3 a) sa preočkuje v množstve 4,5 % do produkčného stupňa v 70 1 ľermentačnom tančíku s objemom 40 1 produkčnej pôdy nasledovného zloženia: sójová múka 58 g/1, práškový com-steep 1 g/1, glycerín 50 g/1, kvasničný extrakt 1 g/1, CaCO3 5 g/1, KH2PO4 0,2 g/1, MgSO4.7H2O 0,3 g/1, FeSO4.7H2O 0,03 g/1, MnSO4.4H2O 0,04 g/1, ZnSO4.7H2O 0,005 g/1, sójový olej 9,2 g/1, odpeňovač Slovanik 1 g/1. V priebehu kultivácie sa udržiavajú optimálne kultivačné podmienky. Koncentrácia nasýteného kyslíka v pôde sa udržiava na hodnote 45 % nasýtenia, vzdušnením od 0,6 do 1,0 vvm, pretlakom 60 kPa, miešaním od 300 do 650 rpm a pri teplote 28 °C. Optimálne pH v priebehu kultivácie sa udržiava na hodnotách od 6,8 do 7,2 s 28 %-ným roztokom NaOH alebo 20%-ným roztokom H2SO4. Od 25. hodiny kultivácie sa začína prikrmovať roztokom glycerínu rýchlosťou 0,75 g/hod/1 média. Pri stagnácu sedimentu sa dávkovanie glycerínu zvýši o 0,125 g/hod/1 kultivačného média. Kyselina linolová a L-leucín sa začínajú dávkovať od 34. hodiny kultivácie v pomere 1 : 0,8. Vpriebehu kultivácie sa príkrmami udržiava optimálna koncentrácia kyseliny linolovej na hodnotách od 0,15 do 0,20 g/1. Kultivácia je ukončená, keď dochádza k stagnácn produkcie lipstatínu a nedochádza k utilizácn ky seliny linolovej. Za popísaných kultivačných podmienok na kultivačnom médiu uvedeného zloženia sa dosiahla produkcia lipstatínu 3,9 g/kg ľermentačnej pôdy za 165 hodín kultivácie.

Priemyselná využiteľnosť

Biotechnologickým procesom, ktorý je predmetom vynálezu, s použitím produkčného mikroorganizmu Streptomyces toxytricini NRL, sa môže vyrobiť farmaceutický aktívna látka lipstatín, ktorej hydrogenáciou v procese izolácie dochádza k premene lipstatínu na orlistat (tetrahydrolipstatín), ktorý sa úspešne využíva pri liečbe obezity, kardiovaskulárnych ochorení, znižovania vysokého krvného tlaku, znižovania cholesterolu alebo hečbe cukrovky typu

Claims

S K 70-2019 Α3

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob kultivácie produkčného rnikroorganizrnu Streptomyces toxytricini NRL, vyznačujúci sa tým, že sa dosahuje výťažnosť lipstatínu v rozpätí 3 až 4 g na 1 kg fermentačnej pôdy za 150 až 180 hodín kultivácie stanovených metódou HPLC pri teplote 28 °C, pretlaku 60 kPa, a vzdušnenia v rozmedzí od 0,6 do 1,0 vvm vo fermentore s miešaním od 300 do 650 rpm, pričom sa udržiava hodnota pH v rozmedzí 6,5 až 7,5 s 28 % roztokom NaOH alebo 20 % roztokom H2SO4.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že produkčné médium neobsahuje emulgačné činidlo.
3. Spôsob podľa nároku la 2, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultiváciu kmeňa Streptomyces toxytricini NRL v produkčnej pôde, obsahujúcej ako zdroj uhlíka glycerín a sójový olej, ako zdroj dusíka sójovú múku 48 g/1 až 58 g/1, kvasničný extrakt a práškový com-steep, minerálne látky, dihydrofosforečnan draselný a uhličitan vápenatý mikromletý.
4. Spôsob podľa nároku 1, 2a 3, vyznačujúci sa tým, že sa ako zdroj uhlíka prikrmuje od 25. hodiny kultivácie 50 % roztokom glycerínu.
5. Spôsob podľa nároku 1, 2, 3a 4, vyznačujúci sa tým, že kultivácia sa vykonáva príkrmovou technológiou, kde sa ako prekurzorpre tvorbu lipstatínu od 34. hodiny kultivácie dávkuje kyselinalinolová a L-leucín v pomere 1:0,8.
6. Spôsob podľa nároku 1, 2, 3, 4a 5, vyznačujúci sa tým, že sa koncentrácia kyseliny linolovej v priebehu ľermentácie príkrmami udržiava v rozmedzí 0,1 až 0,3 g/1 fermentačnej pôdy.
7. Spôsob podľa nároku 1, 2, 3, 4, 5a 6, vyznačujúci sa tým, že počas fermentácie sa intenzita miešania a vzdušnenia reguluje tak, aby bola zabezpečená saturácia rozpusteného kyslíka v pôde v rozpätí 40 až 50 %.
8. Spôsob podľa nároku 1, 2, 3, 4, 5, 6a 7, vyznačujúci sa tým, že fermentačná pôda sa naočkuje vegetatívnyminokulom v množstve od 3 do 5 % objemu fermentačnej pôdy.
9. Spôsob podľa nároku 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 a 8, v y z n a č u j ú c i sa tým, že na testovanie a výber izolátov sa používa pôda, obsahujúca ako zdroj uhlíka glycerín a sójový olej, ako zdroj dusíka sójovú múku, kvasničný extrakt a práškový com-steep, ako prekurzor tvorby lipstatínu metylester sójového oleja, minerálne látky a uhličitan vápenatý mikromletý.
10. Spôsob podľa nároku 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 a 9, vyznačujúci sa tým, že sa produkčné banky v 24. hodine kultivácie prikrmujú 8 % L-leucínom ako prekurzorom lipstatínu v množstve od 07 do 0,9 ml a 25 % roztokom glycerínu ako zdrojom uhlíka v množstve od 0,5 do 0,7 nú, pri teplote 28 °C a miešaní 180 až 250 rpm Za uvedených podmienok sa dosahuje koncentrácia lipstatínu, stanovená metódou HPLC od 0,35 do 0,58 g/kg fermentačného média.

Koniec dokumentu