SK6992000A3

SK6992000A3 - Compounds useful as competitive inhibitors of trypsin-like serine proteases, method for the preparation thereof, pharmaceutical compositions containing same and their use

Info

Publication number: SK6992000A3
Application number: SK699-2000A
Authority: SK
Inventors: Olle Karlsson; Marcel Linschoten; Jan-Erik Nystrom
Original assignee: Astrazeneca Ab
Priority date: 1997-12-05
Filing date: 1998-12-01
Publication date: 2001-02-12
Also published as: ID28008A; JP2001525394A; KR20010024676A; BR9813410A; US20010046981A1; IL136295A; NZ504528A; NO20002848D0; HUP0102681A2; AU748834B2; DE69818510T2; ATE250574T1; TR200001554T2; EE200000322A; HUP0102681A3; CN100379722C; CA2312431C; KR100587434B1; EP1036061B1; PL341047A1

Description

Zlúčeniny, ktorými sú kompetitívne inhibítory serínových proteáz podobných trypsínu, spôsoby ich prípravy, farmaceutické kompozície s ich obsahom a ich použitie

Oblasť technikv

Tento vynález sa týka farmaceutický využiteľných zlúčenín, predovšetkým kompetitívnych inhibítorov serínových proteáz podobných trypsínu, najmä trombínu, ich použitia ako liečiv, farmaceutických kompozícií, ktoré ich obsahujú a syntetických spôsobov ich prípravy.

Doterajší stav technikv

Koagulácia krvi je kľúčovým procesom týkajúcim sa ako hemostázy (t.j. zabráneniu straty krvi z poškodenej cievy) a trombózy (t.j. tvorbe krvných zrazenín v krvnej cieve, ktoré niekedy vedie k obštrukcii cievy).

Koagulácia je výsledkom komplexných sérií enzymatických reakcií. Jedným z primárnych krokov v týchto sériách reakcií je konverzia proenzýmu protrombínu na účinný enzým trombín.

Je známe, že trombín hrá ústrednú úlohu pri koagulácii. Aktivuje krvné doštičky, čo vedie k agregácii doštičiek, konverguje fibrinogén na monoméry fibrínu, ktoré spontánne polymerizujú na polyméry fibrínu, a aktivuje faktor XIII, ktorý naopak zosieťuje polyméry za vzniku nerozpustného fibrínu. Okrem toho, trombín aktivuje faktor V a faktor VIII, čo vedie k „pozitívnemu spätnému posunu“ tvorby trombínu z protrombínu.

Inhibíciou agregácie krvných doštičiek a tvorbou a zosieťovaním fibrínu, by sa teda dalo očakávať, že účinné inhibítory trombínu budú vykazovať antitrombotickú účinnosť. Okrem toho by sa dalo očakávať, že antitrombotická účinnosť bude zvyšovať účinnosť inhibície mechanizmu pozitívneho spätného posunu.

Počiatočnú prípravu inhibítorov s nízkou molekulovou hmotnosťou opísal Claesson v Blood Coagul. Fibrinol. (1994), 5,411.

Blombäck a kol. (v J. Clin. Lab. Invest. 24, dopi. 107, 59, (1969)) uvádzali inhibítory trombínu na báze aminokyselinových sledov umiestnených okolo štiepneho miesta Aa reťazca fibrinigénu. Z diskutovaných aminokyselinových sledov títo autori

-2naznačili, že tripeptídový sled Phe-Val-Arg (P9-P2-P1, v ďalšom uvádzaný ako sled

P3-P2-P1) by mohol byť najúčinnejším inhibítorom.

Trombínové inhibítory na báze dipeptidylových derivátov s α,ωaminoalkylguanidínom v P1-polohe sú známe z amerického patentu č. US 4,346,078 a medzinárodnej patentovej prihlášky WO 93/11152. Podobné, štruktúrne príbuzné dipeptidylové deriváty boli taktiež opísané. Napríklad, medzinárodná patentová prihláška WO 94/29336 opisuje zlúčeniny napríklad, s aminometylbenzamidínmi, cyklickými aminoalkylamidínmi a cyklickými aminoalkylguanidínmi v P1-polohe; európska patentová prihláška EP-A-0 648 780, opisuje zlúčeniny napríklad, s cyklickými aminoalkylguanidínmi v P1-polohe.

Trombínové inhibítory na báze peptidylových derivátov, ktoré taktiež obsahujú alkylaminoguanidíny (napríklad buď 3- alebo 4-aminometyl-1-aminopiperidín) v P1polohe sú známe z európskych patentových prihlášok EP-A-0 468 231, EP-A0 559 046 a EP-A-0 641 779.

Trombínové inhibítory na báze tripeptidylových derivátov s arginínaldehydom v P1-polohe boli najskôr opísané v európskej patentovej prihláške EP-A-0 185 390.

Pred nedávnom boli publikované peptidylové deriváty na báze arginínaldehydu, modifikované vP3-polohe. Napríklad, medzinárodná patentová prihláška WO 93/18060 opisuje hydroxykyseliny, európska patentová prihláška EPA-0 526 877 des-aminokyseliny a európska patentová prihláška EP-A-0 542 525 Ometylester kyseliny mandelovej v P3-polohe.

Inhibítory serínových proteáz (napríklad trombín) na báze elektrofilných ketónov v P1-polohe sú taktiež známe. Napríklad, európska patentová prihláška EPA-0 195 212 opisuje peptidyl-a-ketoestery a -amidy, európska patentová prihláška EP-A-0 362 002 fluóralkylamidketóny, európska patentová prihláška EP-A-0 364 344 α,β,δ-triketónové zlúčeniny a európska patentová prihláška EP-A-0 530 167 aalkoxyketónové deriváty arginínu v P1-polohe.

Ďalšie, štruktúrne odlišné, inhibítory serínových proteáz podobných trypsínu na báze derivátov arginínu C-terminálnej kyseliny bórnej a ich izotiouróniových analógov, sú známe z európskej patentovej prihlášky EP-A-0 293 881.

-3P.red nedávnom boli v európskej patentovej prihláške EP-A-0 669 317 a v medzinárodných patentových prihláška WO 95/35309, WO 95/23609, WO

94/29336, WO 97/02284, WO 97/46577, WO 98/06740 a WO 98/06741 publikované trombínové inhibítory na báze derivátov peptidylu a aminokyselín.

Avšak, pretrváva tu potreba účinných inhibítorov serínových proteáz podobných trypsínu, ako je trombín. Jestvuje predovšetkým potreba zlúčenín, ktoré sú jednak orálne biologicky dostupné ako aj selektívne pri inhibícii trombínu viac ako serínové proteázy. Dalo by sa očakávať, že zlúčeniny, ktoré vykazujú kompetitívnu inhibičnú účinnosť voči trombínu budú špecificky využiteľné ako antikoagulanty a tým využiteľné pri terapeutickom liečení trombóz a príbuzných ochorení.

Podstata vynálezu

Vynález sa týka zlúčenín všeobecného vzorca I,

CU'N—(CHJ-B v ktorom

R¹ predstavuje H, C(O)R¹¹, SiR¹²R¹³R¹⁴ alebo C^alkyl (pričom posledne uvedená skupina je prípadne substituovaná alebo ukončená jedným alebo viacerými substituentami zvolenými z OR¹⁵ alebo (CH2)_qR¹⁶);

R¹², R¹³ a R¹⁴ navzájom nezávisle od seba predstavujú H, fenyl alebo Ci-ealkyl;

R¹⁶ znamená C^alkyl, fenyl, OH, C(O)OR¹⁷ alebo C(O)N(H)R¹⁸;

R¹⁸ predstavuje H, Ci^alkyl alebo CH₂C(O)OR¹⁹;

R¹⁵ a R¹⁷ navzájom nezávisle od seba znamenajú H, C^alkyl alebo C7.9alkylfenyl;

R¹¹ a R¹⁹ navzájom nezávisle od seba predstavujú H alebo C₁.₄alkyl; a q znamená 0, 1 alebo 2;

-4R²

Rx a R³ navzájom nezávisle od seba znamenajú H, C^alkyl, cyklohexyl alebo fenyl;

predstavuje štruktúrny fragment vzorca lla, llb alebo llc, (CH₂),

R⁴

R⁵ pričom (lla) (llb) k, I a m predstavujú navzájom nezávisle od seba 0,1, 2, 3 alebo 4;

R⁴ a R⁵ navzájom nezávisle od seba znamenajú H, Si(Me)₃₁ 1- alebo 2-naftyl, polycyklickú uhľovodíkovú skupinu, CHR⁴¹R⁴² alebo C^alkyl (pričom posledne uvedená skupina je prípadne substituovaná jedným alebo viacerými halogénovými substituentami) alebo C₃.acykloalkyl, fenyl, metyléndioxyfenyl, benzodíoxanyl, benzofuranyl, dihydrobenzofuranyl, benzotíazolyl, benzoxazolyl, benzímidazolyl, kumaranoyl, kumarinyl alebo díhydrokumarinyl (pričom posledných dvanásť uvedených skupín môže byť prípadne substituovaných jedným alebo viacerými C^alkylovými skupinami (pričom posledne uvedená skupina môže byť prípadne substituovaná jedným alebo viacerými halogénovými substituentami), Ci. «alkoxylom, halogénom, hydroxylovou skupinou, kyanoskupinou, nítroskupinou, SO₂NH_2i C(O)OH alebo N(H)R⁴³);

R⁴¹ a R⁴² navzájom nezávisle od seba predstavujú cyklohexyl alebo fenyl;

R⁶ a R⁷ navzájom nezávisle od seba predstavujú H, C^alkyl, C₃.₈cykloalkyl, fenyl (pričom posledná uvedená skupina môže byť prípadne substituovaná jedným alebo viacerými CMalkylovými skupinami (pričom posledne uvedená skupina môže byť prípadne substituovaná jedným alebo viacerými halogénovými substituentami), CMalkoxylom, halogénom, hydroxylovou skupinou, kyanoskupinou, nitroskupinou, SO₂NH₂, C(O)OH alebo N(H)R⁴⁴) alebo spolu s atómom uhlíka, ku ktorému sú viazané, tvoria C₃.a-cykloalkylový kruh;

-5R⁴³ a R⁴⁴ navzájom nezávisle od seba predstavujú H alebo C(O)R⁴⁵; a

R⁴⁵ znamená H, Ci^alkyl alebo C^alkoxy;

Y predstavuje CH₂, (CH₂)_2> CH=CH, (CH₂)₃, CH₂CH=CH alebo CH=CHCH₂, pričom posledné tri skupiny sú prípadne substituované Ci^alkylom, metylénom, oxoskupinou alebo hydroxylovou skupinou;

n znamená 0,1,2, 3 alebo 4; a

B predstavuje štruktúrny fragment vzorca IVa, IVb, IVc alebo IVd,

X¹ X², X³ a X⁴ navzájom nezávisle od seba predstavujú CH, N alebo N-O;

X⁵ a X⁶ navzájom nezávisle od seba znamenajú jednoduchú väzbu alebo CH₂;

Jeden z X⁷, X⁸ a X⁹ predstavuje S, O alebo NH a druhé dva navzájom nezávisle od seba znamenajú -CH=, =CH-, -N=, =N-, -N(O)= alebo =N(O)-;

R³¹ vo všetkým prípadoch znamená jeden alebo viac ľubovoľných substituentov zvolených zo skupiny zahrňujúcej halogén, Ci^alkyl, C_Malkoxy alebo -O-(CH₂)_P-C(O)N(R³²)(R³³);

p predstavuje 0, 1, 2, 3 alebo 4; a

R³² a R³³ znamenajú navzájom nezávisle od seba H, Ci_6alkyl alebo C3.7cykloalky;

alebo ich farmaceutický prijateľných solí.

-6Zlúčeniny vzorca I môžu vykazovať tautomerizmus. Všetky tauomérne formy a ich zmesi sú zahrnuté do rozsahu tohto vynálezu.

Zlúčeniny vzorca I môžu tiež obsahovať jeden alebo viac asymetrických atómov uhlíka a môžu teda vykazovať optickú izomériu a/alebo diastereoizomériu. Všetky diastereoizoméry sa môžu oddeliť s použitím konvenčných postupov, napríklad chromatografie alebo trakčnej kryštalizácie. Rozličné stereoizoméry sa môžu izolovať rozdelením racemickej alebo inej zmesi zlúčenín s použitím konvenčných postupov, napríklad frakčnej metód kryštalizácie alebo HPLC. Alternatívne sa požadované optické izoméry môžu pripraviť reakciou vhodných opticky aktívnych východiskových materiálov pri podmienkach, ktoré nespôsobujú racemizáciu alebo epimerizáciu, alebo derivatizáciou, napríklad s homochirálnou kyselinou s následným oddelením diastereoizomérnych derivátov pomocou konvenčných postupov (napríklad HPLC, chromatografia na silikagéle). Všetky stereoizoméry sú zahrnuté do rozsahu vynálezu.

Alkylové skupiny, ktoré môžu predstavovať R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶, R¹⁷, R¹⁸, R¹⁹, R³¹, R³², R³³ a R⁴⁵, a ktorými môžu byť substituované R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ a Y; alkoxylové skupiny, ktoré môžu predstavovať R³¹a R⁴⁵ a ktorými môžu byť substituované R⁴, R⁵, R⁶ a R⁷; cykloalkylové skupiny, ktoré môžu predstavovať R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R³², R³³, R⁴¹ a R⁴²; a alkylfenylové skupiny, ktoré môžu predstavovať R¹⁵ a R¹⁷ môžu byť lineárne alebo rozvetvené a môžu byť nasýtené alebo nenasýtené. Alkylénové skupiny reprezentované skupinami -ÍCH₂)k-, -(CH₂)r,-(CH2)m-.-(CH₂)n-,-(CH₂)p- a -(CH₂)_q- v zlúčeninách vzorca I, môžu byť lineárne alebo rozvetvené a môžu byť nasýtené alebo nenasýtené.

Halogénové skupiny, ktoré môžu predstavovať R³¹, ktorými môžu byť substituované R⁴, R⁵, R⁶ a R⁷ a ktorými môžu byť substituované substituenty na R⁴, R⁵, R⁶ a R⁷, zahrňujú fluór, chlór, bróm a jód.

V štruktúrnych fragmentoch vzorcov lla, llb a llc bodky indikujú atóm uhlíka, ktorý je viazaný k -C(O)- skupine a atóm uhlíka, ktorý nesie substituenty -OR¹, R² a R³ v zlúčenine vzorca I (na vylúčenie pochybností, nie je tu žiadny ďalší atóm vodíka naviazaný na takto označený uhlíkový atóm).

-7Vlnovková čiara na väzbe fragmentov IVa, IVb, IVc a IVd označuje polohu väzby fragmentov. Na vylúčenie pochybností, ak je (sú) prítomný jeden alebo viaceré zo substituentov R³¹, tento (tieto) nahradzuje (nahradzujú) jeden alebo viac vodíkových atómov v skupinách CH, CH2 a/alebo NH v príslušných kruhoch.

Odborník skúsený v odbore si bude vedomý toho, že v štruktúrnom fragmente IVd musia byť v päťčlennom kruhu prítomné dve dvojité väzby, pričom poloha týchto dvojitých väzieb bude závisieť od toho, či X⁷, X⁸ a X⁹ predstavujú S, O alebo NH.

Zoznam skratiek je uvedený na konci tohto opisu.

Výhodné zlúčeniny podľa vynálezu zahrňujú také zlúčeniny, v ktorých ak B predstavuje štruktúrny fragment vzorca IVa (v ktorom X¹, X², X³ a X⁴ všetky znamenajú CH) alebo štruktúrny fragment vzorca IVb alebo štruktúrny fragment vzorca IVc, R³¹ predstavuje jeden alebo viac substituentov zvolených zo skupiny zahrňujúcej halogén, C^alkyl alebo C^alkoxy alebo -O-(CH₂)_P-C(O)N(R³¹)(R³³) (t.j. substituent(y) nie je/sú ľubovoľné).

Výhodné zlúčeniny podľa vynálezu zahrňujú také zlúčeniny, v ktorých B predstavuje štruktúrny fragment vzorca IVa.

Zlúčeniny vzorca I, v ktorom fragment

O

N je v S-konfigurácii, sú výhodné. Vlnovkové čiary na atóme dusíka a uhlíka vo vyššie uvedenom fragmente označujú polohu väzby fragmentu.

Výhodné zlúčeniny vzorca I zahrňujú zlúčeniny z príkladov 1 a 2.

Príprava

Vynález sa tiež týka spôsobu prípravy zlúčenín vzorca I, ktorý zahrňuje (a) väzbu zlúčeniny vzorca V,

ΟΗ

v ktorom R¹, R², R³ a R_x sú definované vyššie, so zlúčeninou vzorca VI,

(CH₂)~B v ktorom Y, n a B sú definované vyššie, napríklad v prítomnosti väzbového systému (napríklad oxalylchloridu v DMF, EDC, DCC, HBTU alebo TBTU), vhodnej zásady (napríklad pyridínu, DMAP, TEA alebo DIPEA) a vhodného organického rozpúšťadla (napríklad dichlórmetánu, acetonitrilu alebo DMF);

(b) väzbu zlúčeniny vzorca VII,

N Y

CT OH v ktorom R¹, R², R³, R_x a Y sú definované vyššie, so zlúčeninou vzorca VIII, H₂N-(CH₂)_n-B pričom n a B sú definované vyššie, napríklad v prítomnosti väzbového systému napríklad oxalylchloridu v DMF, EDC, DCC, HBTU alebo TBTU), vhodnej zásady (napríklad pyridínu, DMAP, TEA alebo DIPEA) a vhodného organického rozpúšťadla (napríklad dichlórmetánu, acetonitrilu alebo DMF);

(c) pre zlúčeniny vzorca I, v ktorom B predstavuje štruktúrny fragment vzorca

IVa, IVb alebo IVc, reakciou zlúčeniny vzorca IX,

-y-

RO R*

cr'hj—(ch₂)—b¹ v ktorom B¹ predstavuje štruktúrny fragment vzorca IVa¹, IVb¹ alebo IVc¹

Y.

y pričom R^y predstavuje C^alkyl a R¹, R², R³, R_x,

R³¹ sú definované vyššie, s plynným amoniakom, napríklad pri laboratórnej teplote v prítomnosti vhodného organického rozpúšťadla (napríklad metanol alebo etanol);

n, X¹, X², X³, X⁴ , X⁵, X⁶ a (d) pre zlúčeniny vzorca I, v ktorom B predstavuje štruktúrny fragment IVa, IVb alebo IVc, redukciou zlúčeniny vzorca X

° ^N—(CH₂) —B² v ktorom B² predstavuje štruktúrny fragment vzorca IVa², IVb² alebo IVc²

a R¹, R², R³, Rx, Y, n, X¹, X², X³, X⁴, X⁵, X⁶ a R³¹ sú definované vyššie, v prítomnosti vhodného redukčného činidla (napríklad katalytickou hydrogenáciou v prítomnosti napríklad Pd/C alebo TiCI3) a vhodného organického rozpúšťadla; alebo (e) pre zlúčeniny vzorca I, v ktorom X¹, X², X³, X⁴, X⁷, X⁸ a/alebo X⁹predstavujú N-O, oxidáciou zodpovedajúcej zlúčeniny vzorca I, v ktorom X¹, X², X³, X⁴, X⁷, X⁸ a/alebo X⁹ (ako je príslušné) predstavuje N, napríklad pri podmienkach, ktoré sú dobre známe pre odborníkov v odbore.

Zlúčeniny vzorca I, v ktorom B predstavuje štruktúrny fragment vzorca IVd sa môžu pripraviť analogicky k vyššie uvedeným postupom alebo, alternatívne, analogicky k postupom , ktoré sú opísané v medzinárodných patentových prihláškach WO 95/23605 a WO 98/06741.

Zlúčeniny vzorca V sú komerčne dostupné, sú dobre známe v literatúre, alebo sú dostupné s použitím známych postupov. Napríklad, zlúčenina vzorca V sa môže pripraviť hydrolýzou zlúčeniny vzorca XI,

kde R znamená Ci^alkyl alebo Ci-3alkylfenyl a R¹, R², R³ a R_x, sú definované vyššie, napríklad pri laboratórnej teplote v prítomnosti vhodnej zásady (napríklad hydroxidu Iítneho) a vhodného rozpúšťadla (napríklad THF a/alebo vody).

-11 Zlúčeniny vzorca VI sa môžu pripraviť reakciou zlúčeniny vzorca XII,

H—N

kde Y je definované vyššie, so zlúčeninou vzorca VIII, definovanou vyššie, napríklad pri podmienkach , ako sú opísané pre syntézu zlúčenín vzorca I (kroky (a! a (b) spôsobu).

Zlúčeniny vzorca VII sa dajú jednoducho získať s použitím známych postupov.

Napríklad, zlúčeniny vzorca VII sa môžu pripraviť reakciou zlúčeniny vzorca V, definovaného vyššie, so zlúčeninou vzorca XII, definovaného vyššie, napríklad pri podmienkach ako sú opísané vyššie pre syntézu zlúčenín vzorca I (kroky (a) a (b) spôsobu).

Zlúčeniny vzorca IX sa môžu pripraviť s použitím známych postupov.

Napríklad, zlúčeniny vzorca IX, v ktorom B¹ predstavuje štruktúrny fragment vzorca

IVa¹ alebo IVc¹ sa môžu pripraviť reakciou zlúčeniny vzorca XIII,

pričom B³ predstavuje štruktúrny fragment vzorca IVa³ alebo IVc³,

A’.V.V.W/

CN

-12a R¹, R², R³, Rx, Y, n, X¹, X², X³, X⁴ a R³¹ sú definované vyššie, s plynným chlorovodíkom a Ci^alkylalkoholom, napríklad pri laboratórnej alebo nižšej teplote.

Zlúčeniny vzorca X sa môžu pripraviť pomocou známych postupov. Napríklad, zlúčeniny vzorca X, v ktorom B² predstavuje štruktúrny fragment vzorca IVa² alebo IVc² sa môžu pripraviť reakciou zlúčeniny vzorca XIII, ktorý je definovaný vyššie, • s plynným chlorovodíkom a metanolom, napríklad pri laboratórnej alebo nižšej teplote, a následnou reakciou s hydroxylamínom alebo jeho halogenovodíkovou soľou, napríklad pri laboratórnej alebo blízkej teplote, v prítomnosti vhodnej zásady (napríklad TEA) a vo vhodnom rozpúšťadle (napríklad MeOH).

Zlúčeniny vzorca XI, v ktorom R¹ a R³ obidva znamenajú H, sa môžu pripraviť redukciou zlúčeniny vzorca XIV,

OR

Q kde R, Rx a R sú definované vyššie, napríklad pri teplote nižšej ako laboratórna teplota (napríklad pri teplote medzi -70 °C a -5 °C) v prítomnosti vhodného redukčného činidla (napríklad tetrahydroboritanu sodného) a vhodného organického rozpúšťadla (napríklad MeOH alebo EtOH).

Zlúčeniny vzorca XI, v ktorom R¹ predstavuje H a R³ znamená CMalkyl, cyklohexyl alebo fenyl, sa môžu pripraviť reakciou zlúčeniny vzorca XIV, ktorý je definovaný vyššie, s organokovovým činidlom vzorca XV

R^3aM (XV1, pričom R^3a predstavuje C^alkyl, cykloalkyl alebo fenyl, M znamená Li alebo MgHal a Hal znamená Cl, Br alebo J, pri podmienkach, ktoré sú pre odborníkov v odbore dobre známe, v prítomnosti vhodného organického rozpúšťadla (napríklad THF).

Zlúčeniny vzorca XI, v ktorom R¹ predstavuje H, sa môžu tiež pripraviť reakciou zlúčeniny vzorca XVI,

RO-C(O)-R_XH (XVI), kde R a R_x sú definované vyššie, so zlúčeninou vzorca XVII,

- 13R²-C(O)-R³ (xvii) pričom R² a R³ sú definované vyššie, pri podmienkach, ktoré sú pre odborníkov v odbore známe.

Zlúčeniny vzorca XI, v ktorom R¹, R² a R³ všetky znamenajú H, R_x predstavuje štruktúrny fragment vzorca lla, ako je definovaný vyššie, v ktorom ani k ani I nepredstavuje 0, sa môžu pripraviť redukciou zlúčeniny vzorca XVIII,

OR

XVIII pričom R_xa predstavuje štruktúrny fragment vzorca lla, ako je definovaný vyššie, v ktorom ani k ani I nepredstavuje 0, a R má vyššie definovaný význam, v prítomnosti vhodného redukčného činidla (napríklad boránu) v prítomnosti vhodného organického rozpúšťadla (napríklad THF).

Zlúčeniny vzorca XIII sa môžu pripraviť väzbou zlúčeniny vzorca VII, ktorá je definovaná vyššie, so zlúčeninou vzorca XIX,

H₂N-(CH₂)_n-B³ (XIX), pričom n a B³ sú definované vyššie, napríklad pri podmienkach ako sú opísané vyššie pre syntézu zlúčenín vzorca I (kroky (a) a (b) spôsobu).

i

Zlúčeniny vzorca XIV sú buď známe z, alebo sa môžu pripraviť analogicky k postupom opísaným v J. Org. Chem., 54. 3831 (1989).

Zlúčeniny vzorca XVIII sú dobre známe z literatúry alebo sa môžu pripraviť s použitím známych postupov, napríklad reakciou vhodného derivátu kyseliny malónovej s alkylačným činidlom vzorca XX,

RxaL (xx), v ktorom L znamená odstupujúcu skupinu (napríklad halogén (Cl, Br, J) alebo tozyl) a R_xa je definovaný vyššie, napríklad v prítomnosti vhodnej zásady (napríklad hydridu sodného alebo etoxidu sodného) a vhodného organického rozpúšťadla.

Zlúčeniny vzorca VIII, XII, XV, XVI, XVII, XIX a XX a ich deriváty sú komerčne dostupné, sú známe z literatúry alebo sa môžu získať buď analogicky s tam

-14opísanými postupmi alebo pomocou bežných syntetických postupov, v súlade so štandardnými postupmi, z ľahko dostupných východiskových materiálov s použitím vhodných reakčných činidiel a reakčných podmienok.

Substituenty na, inter alia, fenylových skupinách obsiahnuté v zlúčeninách vzorcov I, V, VI, VII, IX, X, XI, XIII, XIV, XVI, XVIII, XIX a XX sa môžu interne konvertovať s použitím štandardných postupov.

Zlúčeniny vzorca I sa môžu izolovať zo svojich reakčných zmesí s použitím konvenčných postupov.

Odborníci v odbore si budú vedomí toho, že vo vyššie opísanom spôsobe sa môže prejaviť potreba chrániť funkčné skupiny medziproduktov chrániacimi skupinami

Funkčné skupiny, ktoré je vhodné chrániť, zahrňujú hydroxyskupinu, aminoskupinu a karboxylovú skupinu. Vhodnými chrániacimi skupinami pre hydroxyskupinu sú trialkylsilylová alebo diarylalkylsilylová skupina (napríklad tercbutyldimetylsilyl, terc-butyldifenylsÍlyl alebo trimetylsilyl) a tetrahydropyranyl. Vhodné chrániace skupiny pre karboxylovú kyselinu zahrňujú Ci^alkyl alebo benzylestery. Vhodné chrániace skupiny pre aminoskupinu, amidinoskupinu a guanidinoskupinu zahrňujú terc-butoxykarbonyl alebo benzyloxykarbonyl. Amidínové a guanidínové dusíky môžu byť buď mono- alebo di-chránené.

Chránenie a odstránenie chrániacich skupín z funkčných skupín sa môže uskutočniť pred alebo po kopulačnej reakcii.

Napríklad, zlúčeniny vzorca I sa môžu pripraviť spôsobom zahrňujúcim kopuláciu N-acylovanej aminokyseliny alebo N-chránenej aminokyseliny. Ak sa použije N-chránená aminokyselina, acylová skupina sa môže pridať po kopulácii a odstránenie chrániacej skupiny z atómu dusíka sa môže podľa toho potom uskutočňovať s použitím štandardných postupov.

Chrániace skupiny sa môžu odstrániť v súlade s postupmi, ktoré sú pre odborníkov v odbore dobre známe ale ako je opísané vyššie.

Použitie chrániacich skupín je komplexne opísané v „Protective Groups in Organic Chemistry“, vydal J. W. F. McOmie, Plénum Press (1973) a „Protective

- 15Groups in Organic Synthesis“ 2^nd Edition, T W Greene & P. G. M. Wutz, WileyInterscience (1991).

Niektoré chránené deriváty zlúčenín vzorca I, ktoré sa môžu pripraviť pred konečným stupňom odstránenia chrániacich skupín za vzniku zlúčenín vzorca I, sú nové.

Vynález sa ďalej týka zlúčenín vzorca la,

v ktorom B^a predstavuje štruktúrny fragment vzorca IVe, IVf, IVg alebo IVh

ď-/

NHD² /,V.4?i'<V

	R³’
X⁶

(IVe) (iVfj (iVg) (iVh), kde D¹ a D² navzájom nezávisle od seba predstavujú v každom prípade H, OH, OR^a, OC(O)R^b, OC(O)OR^C, C(O)OR^d, C(O)R^e, a R^a, R^b, R^c, R^d a R^e, navzájom nezávisle od seba predstavujú Ob^alkyl, (pričom posledne uvedená skupina je prípadne prerušená kyslíkom a/alebo substituovaná halogénom), fenyl, naftyl, C-|. 3alkylfenyl, (pričom posledné tri uvedené skupiny sú substituované CMalkylom, Ci. 4alkoxylom, nitroskupinou alebo halogénom) alebo -(C(R^f)(R⁹))2OC(O)C(R^h), kde R^f, R⁹ a R^h predstavujú navzájom nezávisle od seba H alebo C^alkyl, a R¹, R², R³, Rx, Y, n, X¹, X², X³, X⁴, X⁵, X⁶, X⁷, X⁸, X⁹ a R³¹ sú definované vyššie, alebo ich farmaceutický prijateľné soli, pod podmienkou, že D¹ a D² neznamenajú obidva H.

-16Alkylové skupiny, ktoré môžu predstavovať R^a, R^b, R^c, R^d, R^e, R^f, R⁹, a R^h, a ktorými môžu byť substituované R^a, R^b, R^c, R^d a R®, môžu byť lineárne alebo rozvetvené, môžu byť nasýtené alebo nenasýtené a môžu byť cyklické, acyklické alebo čiastočne cyklické/acyklické. Alkoxylové skupiny, ktorými môžu byť substituované R^a, R^b, R^c, R^d a R^e; môžu byť lineárne alebo rozvetvené, môžu byť nasýtené alebo nenasýtené a môžu byť cyklické, acyklické alebo čiastočne cyklické/acyklické. Alkylová časť alkylfenylových skupín, ktoré môžu predstavovať R^a, R^b, R^c, R^d a R®„ môžu byť lineárne alebo rozvetvené a môžu byť nasýtené alebo nenasýtené.

Halogénové skupiny, ktorými môžu byť substituované R^a, R^b, R^c, R^d a R®, zahrňujú fluór, chlór, bróm a jód.

Vlnovková čiara na väzbe vo fragmentoch IVe, IVf, IVg a IVh označuje polohu väzby fragmentov.

Výhodné zlúčeniny vzorca la zahrňujú také zlúčeniny, v ktorých D² predstavuje H a D¹ znamená OH, OCH₃, OC(O)R^b, alebo C(O)OR^d, pričom R^b a R^d sú definované vyššie.

Štruktúrne preferencie uvedené vyššie pre zlúčeniny vzorca I platia tiež pre zlúčeniny vzorca la.

Zlúčeniny vzorca la sa môžu pripraviť priamo zo zlúčenín vzorca I s použitím postupov, ktoré sú pre odborníkov v odbore dobre známe. Napríklad, zlúčeniny la, v ktorých B^a predstavuje štruktúrny fragment vzorca IVe, IVf alebo IVg a v ktorých D¹alebo D² znamenajú OH, sa môžu pripraviť ako je opísané vyššie pre zlúčeniny vzorca X, alebo s použitím analogických postupov.

Alternatívne, zlúčeniny vzorca la, v ktorých B^a predstavuje štruktúrny fragment vzorca IVe, IVf alebo IVg a v ktorých D¹ alebo D² znamenajú OH alebo OR^a, pričom

R^a je definované vyššie, sa môžu pripraviť zo zlúčenín vzorca XIII, definovaných vyššie, reakciou so zlúčeninou vzorca XXI,

H₂NOR^a1 (XXI) _f

-17kde R^a1 predstavuje H alebo R^a, pričom R^a má vyššie definovaný význam, napríklad pri teplote medzi 40 a 60 °C, v prítomnosti vhodnej zásady (napríklad TEA) a vhodného organického rozpúšťadla (napríklad THF, CH₃CN, DMF alebo DMSO).

Zlúčeniny vzorca la sa môžu alternatívne pripraviť cez ďalšie chránené deriváty vzorca la, v súlade s postupmi, ktoré sú dobre známe pre odborníkov v odbore. Napríklad, zlúčeniny vzorca la, v ktorých D¹ alebo D² predstavuje OC(O)OR^c, kde R^c je definované vyššie, sa môžu pripraviť reakciou zodpovedajúcej zlúčeniny vzorca la, v ktorej D¹ alebo D² (zodpovedajúco) predstavujú OH, so zlúčeninou vzorca XXII,

R^CC(O)-O-C(O)R^C (xxn), pričom R^c je definované vyššie, napríklad pri laboratórnej teplote v prítomnosti vhodnej zásady (napríklad TEA, pyridínu alebo DMAP) a vhodného organického rozpúšťadla. Okrem toho, zlúčenina vzorca la, v ktorej D¹ alebo D² predstavuje OH, sa môže pripraviť reakciou zodpovedajúcej zlúčeniny vzorca la, v ktorej D¹ alebo D²(zodpovedajúco) predstavuje COOR^d, kde R^d je definované vyššie, s hydroxylamínom (alebo jeho halogenovodíkovou soľou), napríklad pri teplote 40 °C, v prítomnosti vhodnej zásady (napríklad TEA) a vhodného organického rozpúšťadla (napríklad THF).

Zlúčeniny vzorcov XXI a XXII sú komerčne dostupné, sú dobre známe z literatúry alebo sa dajú pripraviť s použitím známych postupov.

Odborníci v odbore si budú vedomí toho, že hoci takto chránené deriváty zlúčenín vzorca I (napríklad zlúčeniny vzorca la) samotné nemusia vykazovať farmakologickú účinnosť, môžu sa podávať parenterálne alebo orálne a potom sa metabolizovať v tele za vzniku zlúčenín podľa vynálezu, ktoré sú farmakologicky účinné. Takéto deriváty môžu byť teda opísané ako „prekurzory“. Všetky prekurzory zlúčenín vzorca I sú zahrnuté do rozsahu vynálezu.

Chránené deriváty zlúčenín vzorca I, ktoré sú predovšetkým využiteľné ako prekurzory, zahrňujú zlúčeniny vzorca la.

Okrem toho, niektoré zlúčeniny vzorca I môžu pôsobiť ako prekurzory iných zlúčenín vzorca I.

-18Zlúčeniny vzorca I, ich farmaceutický prijateľné soli, tautoméry a stereoizoméry ako aj ich prekurzory (vrátane zlúčenín vzorca la, ktoré sú prekurzormi zlúčenín vzorca I) sa v ďalšom uvádzajú spoločne ako „zlúčeniny podľa vynálezu“.

Odborníci skúsení odbore si budú vedomí toho, že aby sa získali zlúčeniny podľa vynálezu, a v niektorých prípadoch vyhovujúcejším spôsobom, jednotlivé kroky spôsobu uvedené vyššie sa môžu uskutočniť v rozličnom poradí a/alebo jednotlivé reakcie sa môžu uskutočniť pri rozličných stupňoch celkového postupu práce (t.j. substituenty sa môžu pridať k a/alebo chemická transformácia sa môže uskutočniť na základe odlišných medziproduktov, ako sú medziprodukty spájané s vyššie uvedenými jednotlivými reakciami). Toto bude závisieť okrem iného na faktoroch, ako je povaha ďalších funkčných skupín prítomných v príslušnom substráte, dostupnosť kľúčových medziproduktov a stratégia chrániacich skupín (ak sú prítomné), ktoré bude potrebné prijať. Jednoznačne, použitý typ chemickej reakcie bude ovplyvňovať výber reakčného činidla, ktoré sa použije v uvedených krokoch syntézy, potrebu a typ chrániacich skupín, ktoré sa použijú a postupnosť uskutočnenia syntéz.

Liečebné a farmaceutické použitie

Zlúčeniny podľa vynálezu sú využiteľné, pretože vykazujú farmakologickú účinnosť. Sú preto indikované ako liečivá.

Podľa ďalšieho aspektu vynálezu sa teda poskytujú zlúčeniny podľa vynálezu na použitie ako liečivá.

Zlúčeniny podľa vynálezu sú predovšetkým účinnými inhibítormi trypsínu podobných proteáz, najmä trombínu, buď samotné alebo, v prípade prekurzorov, po podaní cicavcom, vrátane človeka, napríklad ako je uvedené v nižšie opísaných testoch.

Očakáva sa teda, že zlúčeniny podľa vynálezu budú využiteľné pri takých stavoch, kde sa vyžaduje inhibícia trombínu.

Zlúčeniny podľa vynálezu sú teda indikované pri liečení alebo profýlaxii trombózy a nadmernej zrážanlivosti v krvi a tkanivách zvierat, vrátane človeka.

Je známe, že nadmerná zrážanlivosť môže viesť k trombo-embolickým ochoreniam. Stavy spojené s nadmernou zrážanlivosťou a trombo-embolickými

-19ochoreniami, ktoré je možné spomenúť, zahrňujú aktivovanú proteínovú C rezistenciu, ako je faktor V-mutácie (faktor V Leiden) a vrodený alebo získaný deficit antitrombínu III, proteínu C, proteínu S, heparínového kofaktora II. Ďalšie stavy, o ktorých je známe, že sú spojené s nadmernou zrážanlivosťou a trombo-embolickými ochoreniami zahrňujú cirkulujúce antifosfolipidové protilátky (Lupus anticoagulant), homocysteinémiu, heparínom vyvolanú trombocytopéniu a poruchy fibrinolýzy. Zlúčeniny podľa vynálezu sú teda indikované jednak na terapeutické a/alebo profylaktické liečenie týchto stavov.

Zlúčeniny podľa vynálezu sú ďalej indikované na liečenie stavov, pri ktorých sa vyskytuje nežiadúci nadbytok trombínu bez príznakov nadmernej zrážanlivosti, napríklad pri neurodegeneratívnych ochoreniach, ako je Alzheimerova choroba.

Špecifické chorobné stavy, ktoré možno spomenúť, zahrňujú terapeutickú a/alebo profylaktickú liečbu venóznej trombózy a pulmonálneho embolizmu, arteriálnej trombózy (napríklad infarkt myokardu, nestabilná angína, mŕtvica na základe trombózy a periferálna arteriálna trombóza) a systémový embolizmus, zvyčajne zapríčinený srdcovou predsieňou počas arteriálnej fibrilácie alebo ľavou srdcovou komorou po transmurálnom infarkte myokardu.

Okrem toho sa predpokladá, že zlúčeniny podľa vynálezu budú využiteľné pri profylaxii a reoklúzii (t.j. trombóze) po trombolýze, perkutánnej transluminálnej angioplastii (PTA) a koronárnom bypasových operáciách; prevencii retrombózy po mikrochirurgii a všeobecne vaskulámej chirurgii.

Ďalšie indikácie zahrňujú terapeutickú a/alebo profylaktickú liečbu roztrúsenej intravaskulámej koagulácie spôsobenej baktériami, mnohonásobnou traumou, intoxikáciou alebo inými mechanizmami; antikoagulačnú liečbu, ak je krv v kontakte s cudzími povrchmi v tele, ako sú vaskulárne štepy, vaskulárne stenty, vaskulárne katétre, mechanické a biologické protetické ventily alebo akékoľvek iné liečebné zariadenia; antikoagulačná liečba, ak je krv v kontakte s liečebnými zariadeniami mimo tela, ako je napríklad počas kardiovaskulárnej chirurgie pri použití prístroja srdce - pľúca alebo pri hemodialýze.

Okrem týchto účinkov na koagulačný proces, trombín je známy tým, že aktivuje veľké množstvo buniek (ako sú neurofily, fibroblasty, endoteliálne bunky a

-20bunky hladkého svalstva). Preto sa zlúčeniny podľa vynálezu môžu použiť tiež na terapeutickú a/alebo profylaktickú liečbu iodopatického syndrómu a syndrómu respiračnej nedostatočnosti dospelých, pulmonálnej fibrózy s následnou liečbou radiáciou alebo chemoterapiou, septického šoku, septikémiou, zápalových odoziev, ktoré zahrňujú, ale nie sú obmedzené na edém, akútnu alebo chronickú aterosklerózu, ako je koronárne arteriáine ochorenie, cerebrálne arteriálne ochorenie, periferálne arteriálne ochorenie, reperfúzne poškodenie a restenóza po perkutánnej transluminálnej angioplastii (PTA).

Zlúčeniny podľa vynálezu, ktoré inhibujú trypsin a/alebo trombín môžu byť využiteľné tiež pri liečbe pankreatitídy.

Vynález sa tiež týka spôsobu liečby stavov, pri ktorých sa vyžaduje alebo je vhodná inhibícia trombínu, pričom tento spôsob zahrňuje podávanie terapeuticky účinného množstva zlúčeniny podľa vynálezu alebo jej farmaceutický prijateľnej soli, osobe trpiacej alebo náchylnej na takýto stav.

Zlúčeniny podľa vynálezu sa budú spravidla podávať orálne, intravenózne, subkutánne bukálne, rektálne, dermálne, nasálne, tracheálne, bronchiálne, akýmkoľvek parenterálnym spôsobom alebo pomocou inhalácie, vo forme farmaceutického prípravku, obsahujúceho účinnú zložku buď vo forme voľnej zásady alebo farmaceutický prijateľnej netoxickej adičnej soli organickej alebo anorganickej kyseliny, vo farmaceutický prijateľnej dávkovej forme. V závislosti od ochorenia a pacienta, ktorý sa má liečiť a od spôsobu podávania, kompozície sa môžu podávať v rozličných dávkach.

Zlúčeniny podľa vynálezu sa môžu tiež kombinovať a/alebo podávať spoločne s inými antitrombotickými činidlami s odlišným mechanizmom účinku, ako sú činidlá proti zrážaniu krvných doštičiek, kyselina acetylsalicylová, tickopidín, clopidogrel, receptory tromboxánu a/alebo inhibítory syntetázy, antagonisty fibrinogénneho receptora, prostacyklínové mimetické inhibítory a inhibítory fosfodiesterázy a antagonisty ADP-receptora (P₂T).

Zlúčeniny podľa vynálezu sa môžu ďalej kombinovať a/alebo podávať spoločne s trombolytickými činidlami ako je tkanivový plazminogénny aktivátor (prirodzený, rekombinantný alebo modifikovaný!, streptokináza, urokináza,

-21 prourokináza, anizoylovaný plazminogén-streptokinázový aktivátorový komplex (APSAC), živočíšne plazminogénne aktivátory slinných žliaz a podobne, pri liečení trombotických ochorení, predovšetkým infarktu myokardu.

Vynález sa ďalej týka farmaceutického prípravku, ktorý obsahuje zlúčeninu podľa vynálezu, v zmesi s farmaceutický prijateľnou pomocnou látkou, riedidlom, alebo nosičom.

Vhodné denné dávky zlúčenín podľa vynálezu pri terapeutickej liečbe ľudí predstavujú približne 0,001 až 100 mg/kg telesnej hmotnosti pri perorálnom podávaní a 0,001 až 50 mg/kg telesnej hmotnosti pri parenerálnom podávaní.

Zlúčeniny podľa vynálezu sú výhodné v tom, že môžu byť účinnejšie, menej toxické, vykazujú dlhšiu dobu účinku, majú širšie rozsah účinnosti, sú silnejšie, vytvárajú menej vedľajších účinkov, ľahšie sa absorbujú alebo môžu vykazovať ďalšie užitočné farmakologické vlastnosti, nad rámec zlúčenín známych z doterajšieho stavu techniky.

Biologické testy

Test A

Stanovenie doby zrážanlivosti trombínu (TT)

Ľudský trombín (T 6769, Sigma Chem. Co.) v tlmivom roztoku, pH 7,4, 100 μΙ, roztok inhibítora, 100 μΙ, sa inkubovali počas jednej minúty. Potom sa pridala usadená normálna citrátovaná ľudská plazma, 100 μΙ, a doba zrážanlivosti sa merala v automatickom zariadení (KC 10, Amelumg).

Doba zrážanlivosti v sekundách sa graficky vyniesla oproti koncentrácii inhibítora a interpoláciu sa stanovil IC50TT.

IC50TT je koncentrácia inhibítora v teste, ktorý zdvojnásobuje dobu zrážanlivosti trombínu v ľudskej plazme.

Test B

Stanovenie inhibície trombínu s chromogénnou automatickou skúškou

-22Účinnosť inhibítora trombínu sa merala pomocou chromogénnej substrátovej metódy v Plato 3300 automatickom mikroplatňovom procesore (Rasys AG, CH-8634 Hombrechtikon, Švajčiarsko), s použitím 96- IC50TT. jamkových mikrotitračných doštičiek s polovičným objemom (Costar, Chambridge, MA, USA; Cat. No. 3690). Zásobné roztoky testovanej látky v DMSO (72 μΙ; 1 mmol/l) sa postupne zriedili v pomere 1 : 3 (24 + 48 μΙ) s DMSO, čím sa získalo desať rozličných koncentrácií, ktoré sa analyzovali ako skúšobné vzorky. 2 μΙ testovanej vzorky sa zriedilo so 124 μΙ experimentálneho pufra, pridalo sa 12 μΙ chromogénneho roztoku substrátu ((S2366, Chromogenix, Molndal, Švédsko) v experimentálnom pufŕe a napokon 12 μΙ roztoku α-trombínu, (ľudský a-trombín, Sigma Chem. Co.) oboje v experimentálnom pufre, a vzorky sa zmiešali. Finálne koncentrácie vzoriek boli: testovaná látka 0,00068 až 13,3gmol/l, S-2366 0,30 mmol/L, a-trombín 0,020 NIH U/ml. Prírastok lineárnej absorbancie počas 40 minút inkubácie pri teplote 37 °C sa použil na výpočet percenta inhibície testovaných vzoriek, v porovnaní so vzorkou naslepo bez inhibítora. ICso-automatická hodnota, zodpovedajúca koncentrácii inhibítora, ktorá vykazovala 50 % inhibície účinnosti trombínu sa vypočítala z log dávky oproti % krivky inhibície.

TestC

Stanovenie inhibičnej konštanty K, pre ľudský trombín

Stanovenia K, sa uskutočnili s použitím chromogénnej substrátovej metódy, uskutočňovaním pri teplote 37 °C na Cobas Bio centrifúgnom analyzátore (Roche, Basel, Švajčiarsko). Reziduálna enzymatická aktivita po inkubácii ľudského atrombínu pri rozličných koncentráciách testovanej zlúčeniny sa stanovila pri troch rozdielnych koncentráciách substrátu a merala sa ako zmena optickej absorbancie pri vlnovej dĺžke 405 nm.

Testované roztoky zlúčenín (100 μΙ; bežne v pufre alebo vo fýziologickom roztoku obsahujúcom BSA 10 g/l) sa zmiešali s 200 μΙ ľudského α-trombínu (Sigma

Chem. Co.) v experimentálnom pufre (0,05 mol/l Tris-HCI, pH 7,4, iónová sila 0,15 adjustované s NaCI) obsahujúcom BSA (10 g/l) a analyzovali sa ako vzorky Cobas

Bio. 60 μΙ vzorka, spolu s 20 μΙ vody sa pridala k 320 μΙ substrátuS-2238 (Chromogenix AB, Molndal, Švédsko) v experimentálnom pufre a monitorovali sa

-23zmeny absorbancie (ΔΑ/min). Finálne koncentrácie S-2238 boli 16, 24 a 50 μπιοΙ/Ι a trombínu 0,125 NIH U/ml.

Ustálený stav reakčnej rýchlosti sa použil na zostrojenie Dixonových diagramov, t.j. diagramov koncentrácie inhibítora v porovnaní s 1/(ÁA/min). Pre reverzibilné kompetitívne inhibítory dátové body pre rozdielne koncentrácie substrátu typicky tvoria priamky, ktoré sa pretínajú pri x = - Kí.

Test D

Stanovenie aktivovaného času parciálneho tromboplastínu (APTT)

ATPP sa stanovil v usadenej normálnej ľudskej citrátovanej plazme s reakčným činidlom PTT automated 5, vyrobenej firmou Stago. K plazme sa pridali inhibítory (10 μΙ roztoku inhibítora ku 90 μΙ plazmy) a následne sa pridalo reakčné činidlo a roztok chloridu vápenatého a APTT sa stanovilo v zmesi pomocou koagulačného analyzátora KC10 (Amelumg) podľa inštrukcií výrobcu reakčného činidla. Doba zrážanlivosti v sekundách sa graficky vyniesla oproti koncentrácii inhibítora v plazme IC50ATPP sa stanovilo interpoláciou.

IC50ATPP sa definuje ako koncentrácia inhibítora v ľudskej plazme, ktorá zdvojnásobuje aktivovaný čas parciálneho tromboplastínu.

Test E

Stanovenie trombínového času ex vivo

Inhibícia trombínu po orálnom alebo parenterálnom podaní zlúčenín vzorca I a la, rozpustených v zmesi etanol: Soiutol™: voda (5:5: 90) sa testovala na potkanoch pri plnom vedomí, ktorým sa jeden alebo dva dni pred experimentom zaviedol katéter na odoberanie vzoriek krvi z krčnej artérie. V deň experimentu sa vzorky krvi odobrali v presne určených časoch po podaní zlúčeniny do skúmaviek z umelej hmoty obsahujúcich 1 diel roztoku citrátu sodného (0,13 mol na liter) a 9 dielov krvi. Skúmavky sa centrifúgovali, čím sa získala usadená plazma doštičiek. Plazma sa použila na stanovenie trombínového času, ako je opísané nižšie.

Citrátovaná plazma potkanov, 25 μΙ, sa zriedila s fyziologickým roztokom,

0,9 %, 25 μΙ, a koagulácia plazmy sa iniciovala pridaním ľudského trombínu (T 6769,

-24Sigma Chem. Co., USA) vtlmivom roztoku, pH 7,4, 25 μΙ. Doba zrážanlivosti sa merala v automatickom zariadení (KC 10A-micro, Amelumg, Nemecko).

Ak sa podávala zlúčenina vzorca la, koncentrácie vhodného účinného inhibítora trombínu vzorca I v plazme potkanov sa stanovili s použitím štandardných kriviek, pri porovnaní trombínového času v usadenej citrátovej plazme potkanov ku známym koncentráciám zodpovedajúceho „účinného“ trombínového inhibítora rozpusteného vo fyziologickom roztoku.

Na základe stanovených koncentrácií účinného trombínového inhibítora vzorca I v plazme (čo predpokladá, že prolongácia trombínového času je spôsobená vyššie uvedenou zlúčeninou) u potkanov, oblasť pod krivkou koncentrácia v plazme čas po orálnom a/alebo parenterálom podaní zodpovedajúcej zlúčeniny vzorca la sa vypočítala (AUCpd) s použitím lichobežníkového pravidla a extrapoláciou dát do nekonečna.

Biologická dostupnosť účinného trombínového inhibítora vzorca I po orálnom alebo parenterálnom podaní zlúčeniny vzorca la sa vypočítala ako je uvedené nižšie:

[(AUCpd/dávka)/(AUCúčinný,parenterálne/dávka] x 100 kde AUC účinný, parenterálne predstavuje AUC získané po parenterálnom podávaní zodpovedajúceho účinného inhibítora trombínu vzorca I potkanom pri vedomí, ako je opísané vyššie.

Test F

Stanovenie trombínového času v moči ex vivo

Množstvo účinného inhibítora trombínu vzorca I, ktoré sa vylúčilo v moči po orálnom alebo parenterálnom podávaní zlúčenín podľa vynálezu, rozpustených v zmesi etanol: Solutol™: voda (5:5: 90), sa stanovilo určením trombínového času v moči ex vivo (pri predpoklade, že prolongácia trombínového času je spôsobená vyššie uvedenou zlúčeninou).

Potkany pri vedomí sa umiestnili do metabolických klietok, umožnilo sa separované odoberanie moču a výkalov, počas 24 hodín nasledujúcich po orálnom podávaní zlúčenín podľa vynálezu. Trombínový čas sa stanovil v zhromaždenom moči ako je opísané nižšie.

-25Usadená normálna citrátovaná ľudská plazma (100 μΙ) sa inkubovala skoncentrovaným močom potkanov, alebo s jeho roztokom, ktorý sa zriedil s fýziologickým roztokom, počas jednej minúty. Koagulácia plazmy sa potom iniciovala podávaním ľudského trombinu (T 6769, Sigma Chem. Co.) v roztoku pufra (pH 7,4; 100 μΙ). Doba zrážanlivosti sa merala v automatickom zariadení (KC 10; Amelumg).

Koncentrácie účinného inhibítora trombinu vzorca I v moči potkanov sa stanovili s použitím štandardných kriviek, pri porovnaní trombínového času v usadenej citrátovej ľudskej plazme ku známym koncentráciám vyššie uvedeného účinného trombínového inhibítora rozpusteného v koncentrovanom moči potkanov (alebo v jeho roztoku zriedeného fyziologickým roztokom). Vynásobením celkovej tvorby moču potkanov v priebehu 24 hodinového obdobia stanovenou priemernou koncentráciou vyššie uvedeného účinného inhibítora v moči sa dalo vypočítať celkové množstvo účinného inhibítora vylúčeného v moči (MNOŽSTVOpd).

Biologická dostupnosť účinného inhibítora trombinu vzorca I po orálnom alebo parenterálnom podávaní prekurzora sa vypočítala ako je uvedené nižšie:

[(MNOŽSTVOpd/dávka)/( MNOŽSTVOúčinný.parenterálne/dávka] x 100 pričom MNOŽSTVO účinný, parenterálne predstavuje množstvo vylúčené v moči po parenterálnom podávaní zodpovedajúceho účinného inhibítora trombinu vzorca I potkanom pri vedomí, ako je opísané vyššie.

Vynález je ďalej znázornený pomocou nasledujúcich príkladov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Všeobecné postupy

Hmotnostné spektrá sa zaznamenali na Finnigan MAT TSQ 700 trojitom štvorpólovom hmotnostnom spektrometre vybavenom elektro-rozprašovacím medzičlánkom (FAB-MS) a VG Platform II hmotnostný spektrometer vybavený elektro-rozprašovacím medzičlánkom (LC-MS). ’H NMR a ¹³C NMR merania sa uskutočnili na BRUKER ACP 300 a Varian UNITY plus 400, 500 a 600 spektrometroch pracujúcich pri ¹H frekvenciách 300,13, 399,96, 499,82 a 599,94 MHz a pri ¹³C frekvenciách 75,46, 100,58, 125,69 a 150,88 MHz. Preparatívna HPLC

-26sa uskutočnila na kolónach s reverznou fázou (250 mm, 20 alebo 50 mm; 5 až 7 μΜ fázou Chromasil C8) s prietokovými rýchlosťami od 10 do 50 ml/min. s použitím UV detektora (240 až 290 nm).

Príklad 1 (2,5-diMeO)Ph-(S)- alebo (R)-CH(CH₂OH)-CO-Pro-Pab(2-CI) x HOAc *

(i) 4-Azidometyl-3-chlórbenzonitril t

Zmes 8,0 g (0,035 mol) 4-brómmetyl-3-chlórbenzonitrilu (J. Pharm. Sci., (1996) 75, 410), 2,7 g (0,042 mol) azidu sodného, 1,2 g (3,4 mol) hydrogensíranu tetrabutylamónia, 0,30 g (3,4 mol) hydrogenuhličitanu sodného, 7 ml vody a 20 ml toluénu sa intenzívne miešalo počas 3 dní. Fázy sa oddelili a vodná vrstva sa trikrát extrahovala s éterom. Spojené organická fáza sa premyla vodou, vysušila nad síranom sodným a odparila, pričom sa získalo 6,7 g (100 %) zlúčeniny uvedenej v podnázve.

¹H-NMR (300 MHz; CDCI₃): δ 4,60 (s, 2H), 7,57 (d, 1H), 7,61 (m, 1H), 7,70 (d, 1H).

(ii) 4-Aminometyl-3-chlórbenzonitril

4-Azidometyl-3-chlórbenzonitril (1,0 g; 5,2 mmol; z kroku (i) uvedeného vyššie) sa rozpustil v 9 ml vody a 1 ml etanolu. Pridal sa trifenylfosfín (1,5 g) a zmes sa miešala cez noc. Etanol sa odparil a zvyšok sa rozdelil medzi 1 M HCI a benzén. Vodná vrstva sa niekoľkokrát extrahovala s benzénom a potom sa vymrazila. » Výťažok amínhydrochloridu predstavoval 0,54 g (51 %).

¹H-NMR (400 MHz; D₂O) HCI soľ: δ 4,42 (s, 2H), 7,69 (d, 1 H), 7,81 (dd, 1H), 7,98 (d, 1 H).

(iii) Etylester kyseliny (R,S)-3-hydroxy-2-(2,5-dimetoxyfenyl)propiónovej

K roztoku etylesteru kyseliny 3-oxo-2-(2,5-dimetoxyfenyl)propiónovej (7,6 g;

mmol; pripravenej podľa spôsobu opísaného v J. Ogr. Chem. 54, 3831 (1989)) v etanole sa pridal NaBH₄ (2 ekvivalenty) pri teplote -15 °C. Po miešaní počas 2 hodín pri teplote -15 °C a počas 4 hodín pri teplote - 5 °C sa pridala voda, reakčná zmes sa zahustila a výsledný zvyšok sa extrahoval s etylacetátom. Organická fáza sa

-27premyla so soľankou, vysušila (MgSO4) a zahustila, čím sa získala zlúčenina uvedená v podnázve. Výťažok predstavoval 7,7 g (100 %).

(iv) (2,5-diMeO)Ph-(R,S)CH(CH₂OH)-COOH

Etylester z kroku (iii) uvedeného vyššie (7,4 g; 29 mmol) sa rozpustil v zmesi THF : voda (1:1). Pridal sa LiOH x H₂O (2 ekvivalenty) a reakčná zmes sa miešala počas 2 hodín pri laboratórnej teplote. Reakčná zmes sa zahustila a extrahovala sa s CH₂CI₂. Vodná fáza sa okyslila (pH 2) s HCI (2 M) a trikrát sa extrahovala sCH₂CI₂. Organické fáza sa spojili, vysušili (Na₂SO₄) a zahustili, čím sa získala zlúčenina uvedená v podnázve. Výťažok predstavoval 5,4 g (82 %).

’H-NMR (400 MHz; CDCI₃): δ 6,89 (d, 1H), 6,85 (d, 1H), 6,78 (dd, 1H), 4,86 (široký, 2H), 4,14 (dd, 1H), 3,98 (dd, 1H), 3,78 (s, 3H), 3,72 (s, 3H), 3,67 (dd, 1H).

(v) (2,5-diMeO)Ph-(R,S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-OBn

1,8 ml (9,6 mmol) diizopropyletylamínu sa pridalo k ľadom chladenej zmesi 0,50 g (2,2 mmol) (2,5-diMeO)Ph-(R,S)CH(CH₂OH)-COOH (z kroku (iv) uvedeného vyššie), 0,58 g (2,4 mmol) H-Pro-OBn a 0,77 g (2,4 mmol) TBTU v 10 ml DMF. Zmes sa miešala pri laboratórnej teplote cez noc a potom sa vliala do 1 M HCI a dvakrát sa extrahovala so zmesou etylacetát : toluén (1 : 1). Spojené organické vrstvy sa premyli s NaHCCh (aq.) a vodou, vysušili (Na₂SO₄) a odparili. Produkt bol čistý a použil sa priamo v nasledujúcom kroku. Výťažok: 0,91 g (100 %).

¹H-NMR (500 MHz; CDCI3) diastereoizomérna zmes: δ 1,8 - 2,3 (m, 4H), 3,0 3,1 (m, 1H), 3,18 (m, 1H, diastereoizomér), 3,34 (m, 1H, diastereoizomér), 3,46, (m, 1H, diastereoizomér), 3,65 - 3,7 (m, 1 H), 3,75 - 3,9 (m, 7H, z toho 4 singlety pri 3,77, 3,80, 3,85 a 3,87 ppm), 3,95 -4,05 (m, 1H), 4,39 (m, 1H, diastereoizomér), 4,46 (m, 1H, diastereoizomér), 4,58 (m, 1H, diastereoizomér), 4,63 (m, 1H, diastereoizomér),

5,18 (d, 1H, diastereoizomér), 5,26 (s, 1H, diastereoizomér), 5,32 (d, 1H, diastereoizomér), 5,37 (s, 1H, diastereoizomér), 6,8 - 7,0 (m, 3H), 7,2 - 7,5 (m, 5H).

(vi) (2,5-diMeO)Ph-(R,S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-OH (2,5-diMeO)Ph-(R,S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-OBn (0,91 g; 2,2 mmol; z kroku (v) uvedeného vyššie) sa hydrogenoval počas 2 hodín pri atmosférickom tlaku nad mg 10 % Pd/c v 25 mi etanolu. Zmes sa prefiltrovala cez celit a odparila sa, čím sa získalo 0,71 g (100 %) zlúčeniny uvedenej v podnázve.

¹H-NMR (500 MHz; CDCI3) diastereoizomérna zmes: δ 1,8 - 2,3 (m, 4H), 3,02 (m, 1H, diastereoizomér), 3,15 (m, 1H, diastereoizomér), 3,47 (m, 1H, diastereoizomér), 3,7 - 3,8 (m, 5H, z toho ďalší diastereoizomér zodpovedajúci 3,47 a dva singlety pri 3,74 a 3,76 ppm), 3,83 - 3,85 (m, 3H), 4,0 - 4,1 (m, 1H), 4,38 (m, 1H, diastereoizomér), 4,50 (m, 1H, diastereoizomér), 4,56 (m, 1H, diastereoizomér), 4,63 (m, 1H, diastereoizomér), 6,8 - 6,9 (m, 3H).

(vii) (2,5-diMeO)Ph-(R a S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-NHCH₂-Ph(2-CI,4-CN)

0,76 ml (4,4 mmol) diizopropyletylamínu sa pridalo k ľadovo chladnej zmesi 0,35 g (1,1 mmol) (2,5-diMeO)Ph-(R,S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-OH (z kroku (vi) uvedeného vyššie, 0,22 g (1,1 mmol) 4-aminometyl-3-chlórbenzonitrilu (z kroku (ii) uvedeného vyššie) a 0,35 g (1,1 mmol) TBTU v 10 ml DMF. Zmes sa miešala pri laboratórnej teplote počas dvoch dní, vliala sa do 1 M HCI a dvakrát sa extrahovala so zmesou etylacetát: toluén (1:1). Spojené organické vrstvy sa premyli s NaHCO₃(aq.) a vodou, vysušili sa (Na₂SO4) a odparili. Surový produkt sa prečistil bleskovou chromatografiou na silikagéle so zmesou EtOAc : MeOH (99 : 1) ako elučným činidlom. Diastereoizoméry sa oddelili. Celkový výťažok: 0,48 g (94 %). Východiskový diastereoizomér (A) sa izoloval vo výťažku 0,22 g.

Diastereoizomér A ¹H-NMR (400 MHz; CDCI3): δ 1,7 - 2,1 (m, 3H), 2,34 (m, 1H), 2,90 (m, 1H), 3,12 (m, 1H), 3,61 (m, 1H), 3,73 - 3,8 (m, 4H, z toho jeden singlet pri 3,75), 3,82 (s, 3H), 4,01 (m, 1H), 4,44 (m, 1H), 4,56 (m, 1H), 4,65 (m, 1H), 6,75-6,85 (m, 3H), 7,53 (d, 1H), 7,56 (dd, 1H), 7,65 (d, 1H), 7,68 (m, 1H).

(viii) (2,5-diMeO)Ph-(R alebo S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-NHCH₂-Ph(2-CI,4-C(NH)OMe) (2,5-diMeO)Ph-(R alebo S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-NHCH₂-Ph(2-CI,4-CN) (0,22 g; 0,74 mmol; diastereoizomér z kroku (vii) uvedenom vyššie) sa rozpustil v 25 ml metanolu nasýteného plynným chlorovodíkom a vložil sa na dva dni do chladničky. Odparením sa získal surový materiál, ktorý sa použil v nasledujúcom kroku bez ďalšieho čistenia.

MS (M + 1)⁺ 504 (ix) (2,5-diMeO)Ph-(R alebo S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-Pab(2-CI) x HOAc

-29Polovica surového materiálu z kroku (viii) uvedeného vyššie sa rozpustila v 25 ml metanolu nasýteného s amoniakom a nechala sa stáť pri laboratórnej teplote počas päť dní. Rozpúšťadlo sa odparilo a zvyšok sa prečistil preparativnou HPLC so zmesou CH3CN : 0,1 M NH₄OAc (30 : 70). Sušenie vymrazením zvody poskytlo 9 mg (7 %) požadovaného produktu.

¹H-NMR (400 MHz; D₃O) rotaméry: δ 1,8 - 2,4 (m, 7H, z toho jeden singlet pri 1,93 ppm), 3,35 (m, 1H), 3,63 (m, 1H), 3,7 - 3,9 (m, 8H, ztoho singlety pri 3,80, 3,81 a 3,86 ppm (rotaméry)), 4,05 (m, 1H), 4,4 - 4,65 (m, 3H), 6,82 (d, 1H, hlavný rotamér), 6,86 (d, 1H, minoritný rotamér), 6,95 - 7,05 (m, 1H), 7,08 (d, 1H, hlavný rotamér), 7,23 (d, 1H, minoritný rotamér), 7,59 (d, 1H), 7,63 (dd, 1H, minoritný rotamér), 7,73 (dd, 1H, hlavný rotamér), 7,82 (d, 1H, minoritný rotamér), 7,98 (d, 1H, hlavný rotamér).

¹³C-NMR (100 MHz, D₂O) karbonylové a amidinové uhlíky: δ 176,2, 174,6, 166,7.

Príklad 2 (2,5-diMeO)Ph-(R alebo S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-Pab(2-Me) x HOAc (i) 3-Metyl-4-vinylbenzonitril

0,75 g (0,65 mmol) tetrakis(trifenylfosfín)paládíum(0) sa pridalo k roztoku 5,1 g (0,026 mol) 4-bróm-3-metylbenzonitirlu a 8,3 g (0,026 mol) vinyltributylcínu v 250 ml toluénu pod argónom a reakčná zmes sa zahrievala pod refluxom cez noc. Zmes sa prefiltrovala cez vrstvu celitu a odparila sa. Zvyšok sa prečistil bleskovou chromatografiou na silikagéle so zmesou heptán : EtOAc (1:1) ako elučným činidlom. Výťažok: 4,0 g (100 %).

¹H-NMR (300 MHz; CDCI₃): δ 2,36 (s, 3H), 5,46 (d, 1H), 5,73 (d, 1H), 6,90 (dd, 1H), 7,4-7,5 (m, 2H), 7,52 (d, 1H).

(ii) 4-Hydroxymetyl-3-metylbenzonitril

3-Metyl-4-vinylbenzonitril (0,40 g; 2,8 mmol; z kroku (i) uvedeného vyššie) sa rozpustil v 50 ,l metanolu a ochladil sa na teplotu -70 °C. Nechal sa prebublávať ozón (2 ekvivalenty) a potom sa pridalo 0,20 g (5,3 mmol) tetrahydroboritanu sodného a 5 ml vody a chladiaci kúpeľ sa odložil. Po 4 hodinách sa metanol odparil

-30a zvyšok sa rozdelil medzi 1 M HCI a éter. Vodná vrstva sa dvakrát extrahovala s éterom a spojená organická fáza sa premyla vodou, vysušila (Na₂SO₄) a odparila, čím sa získalo 0,37 g (90 %) požadovaného produktu, ktorý s a použil v nasledujúcom kroku bez ďalšieho čistenia.

¹H-NMR (400 MHz; CDCI₃): δ 2,29 (s, 3H), 3,07 (široký, 1H), 4,69 (s, 2H), 7,37 (s, 1H), 7,45 (d, 1 H), 7,53 (d, 1 H).

(iii) 4-Metánsulfonyloxy-3-metylbenzonitril

1,2 g (0,010 mol) metylsulfonylchloridu sa po kvapkách pridalo k roztoku 1,5 g (0,010 mol) 4-hydroxymetyl-3-metylbenzonitrilu (z kroku (ii) uvedeného vyššie) a 1,0 g (0,010 mol) trietylamínu v 50 ml metylénchloridu pri teplote 0 °C. Reakčná zmes sa miešala pri laboratórnej teplote počas 3 hodín, premyla sa s 1 M HCI, vodou, vysušila (Na₂SO₄) a odparila. Výťažok: 2,1 g (91 %).

¹H-NMR (300 MHz; CDCI₃): δ 2,41 (s, 3H), 3,03 (s, 3H), 5,28 (s, 2H), 7,4 - 7,6 (m, 3H).

(iv) 4-Azidometyl-3-metylbenzonitril

1,0 g (0,015 mol) azidu sodného a10 ml vody sa pridalo k roztoku 2,1 g (9,3 mmol) 4-metánsulfonyloxy-3-metylbenzonitrilu (z kroku (iii) uvedeného vyššie) v 20 ml DMF. Reakčná zmes sa miešala počas 1,5 hodín pri laboratórnej teplote, vliala sa do 200 ml vody a trikrát sa extrahovala s éterom. Spojené organické fázy sa premyli niekoľkokrát vodou, vysušili sa (Na₂SO₄) a odparili. Výťažok: 1,4 g (87 %).

’H-NMR (300 MHz; CDCI3): δ 2,39 (s, 3H), 4,40 (s, 2H), 7,40 (d, 1H), 7,45 -

7,55 (m, 2H).

(v) 4-Aminometyl-3-metylbenzonitril

Zlúčenina uvedená v podnázve sa pripravila podľa spôsobu opísaného v príklade 1(ii) uvedenom vyššie z 1,4 g (8,1 mmol) 4-azidometyl-3-metylbenzonitrilu (z kroku (iv) uvedeného vyššie) a 2,3 g(9,0 mmol) trifenylfosfínu v 18 ml etanolu a 2 ml vody. Výťažok: 0,60 g (znečistený trifenylfosfínoxidom: stanovený skutočný výťažok: 0,36 g (28 %)).

-31 ^-NMR (300 MHz; CDCI₃): δ 2,38 (s, 3H), 3,90 (bs, 2H), 7,3 - 7,4 (m, 3H) zatienený trifenylfosfínoxidom.

(vi) (2,5-diMeO)Ph-(R a S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-NHCH₂-Ph(2-Me,4-CN)

Zlúčenina uvedená v podnázve sa pripravila podľa spôsobu opísaného v príklade 1(vii) uvedenom vyššie z 0,37 g (1,2 mmol) (2,5-diMeO)Ph(R,S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-OH (pozri príklad 1(vi) uvedený vyššie), 0,42 g 4aminometyl-3-metylbenzonitrilu (z kroku (v) uvedeného vyššie; stanovený obsah čistého materiálu: 0,25 g (1,7 mmol), 0,38 g (1,2 mmol) TBTU a 0,62 g (4,8 mmol) diizopropyletylamínu v 10 ml DMF. Surový produkt sa prečistil bleskovou chromatografiou na silikagéle so zmesou EtOAc : acetón (9:1) ako elučným činidlom. Dva diastereoizoméry sa oddelili. Celkový výťažok: 0,58 g znečistených trifenylfosfínoxidom; stanovený skutočný výťažok: 0,45 g (87 %). Prvým eluovaným izolovaným diastereoizomérom bol A diastereoizomér.

Diasteroizomér A (výťažok: 0,30 g; znečistený trifenylfosfínoxidom; stanovený skutočný výťažok: 0,20 g) ¹H-NMR (600 MHz; CDCI3): δ 1,7 - 2,1 (m, 3H), 2,3 - 2,35 (m, 4H, z toho jeden singlet pri 2,32 ppm), 3,1 - 3,2 (m, 1H), 3,65 (m, 1H), 3,7 - 3,8 (m, 4H, z toho jeden singlet pri 3,73 ppm), 3,80 (s, 3H), 3,98 (m, 1H), 4,4 - 4,5 (m, 3H), 4,65 (m, 1H), 6,7 - 6,9 (m, 3H), 7,37 (d, 1H), 7,41 (s, 1H), zostávajúce aromatické signály zatienené trifenylfosfínoxidom.

(vii) (2,5-diMeO)Ph-(R alebo S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-NHCH₂-Ph(2-Me,4-C(NH)OMe) (2,5-diMeO)Ph-(R alebo S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-NHCH₂-Ph(2-Me,4-CN) (0,30 g; stanovený obsah čistého materiálu: 0,20 g (0,44 mmol); diastereoizomér z kroku (vi) uvedeného vyššie) sa rozpustil v 25 ml metanolu nasýteného s plynným chlorovodíkom a nechal sa stáť pri laboratórnej teplote cez noc. Odparenie poskytlo surový materiál, ktorý sa použil bez ďalšieho čistenia. Podľa TLC (EtOAc : acetón; 9:1) neobsahoval žiaden východiskový materiál.

(viii) (2,5-diMeO)Ph-(R alebo S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-Pab(2-Me)(OH)

Surový produkt z kroku (vii) uvedeného vyššie sa rozpustil v 10 ml metanolu a pridalo sa 0,14 g (2,0 mmol) hydroxylamínhydrochloridu a 0,40 g (4,0 mmol) trietylamínu. Zmes sa nechala stáť pri laboratórnej teplote počas dvoch dní.

-32Odparením a bleskovou chromatografiou na silikagéle so zmesou CH₂CI₂ : MeOH (9 :1) sa získalo 0,13 g (60 %) požadovanej zlúčeniny.

¹H-NMR (600 MHz; CDCI₃): δ 1,80 (m, 1H), 1,93 (m, 1H), 2,08 (m, 1H), 2,20 (s, 3H), 2,27 (m, 1H), 3,22 (m, 1H), 3,65 - 3,8 (m, 5H, z toho jeden singlet pri 3,74 ppm), 3,80 (s, 3H), 4,06 (m, 1H), 4,32 (dd, 1H), 4,38 (dd, 1H), 4,51 (m, 1H), 4,71 (m, 1H), 4,93 (široký, 2H), 6,78 (dd, 1H), 6,81 (d, 1H), 6,85 (d, 1 H), 7,08 (d, 1H), 7,16 (d, 1H) 7,20 (s, 1H), 7,81 (bt, 1H).

¹³C-NMR (100 MHz; CDCI₃) karbonylové a amidínové uhlíky: δ 174,7, 172,8, 154,9.

(ix) (2,5-diMeO)Ph-(R alebo S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-Pab(2-Me) (2,5-diMeO)Ph-(R alebo S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-Pab(2-Me)(OH) (65 mg; 0,13 mmol; z kroku (viii) uvedeného vyššie) sa rozpustil v 5 ml etanolu. Pridala sa HOAc (8 kvapiek z Pasteurovej pipety) a 40 mg 10 % Pd/C. reakčná zmes sa hydrogenovala pri atmosférickom tlaku počas dvoch dní. Reakčná zmes sa prefiltrovala cez celit a odparila sa. Zvyšok sa rozpustil vo vode, premyl sa s etylacetátom a vysušil vymrazením. Výťažok: 46 mg (65 %).

¹H-NMR (500 MHz; D₂O) rotaméry: δ 1,8 - 2,1 (m, 6H, z toho jeden singlet pri 1,92 ppm), 2,2 - 2,4 (m, 4H, z toho dva singlety pri 2,24 (minoritný rotamér) a 2,38 (hlavný rotamér), 3,35 (m, 1H, minoritný rotamér), 3,6 - 3,7 (m, 1H), 3,75 - 3,85 (m, 7H, z toho tri singlety pri 3,77, 3,79 a 3,84 ppm (rotaméry)), 4,0 - 4,1 (m, 1H), 4,4 -

4,5 (m, 3H), 4,8 (m, 1H čiastočne zatienené pikom HDO), 6,80 (d, 1H, hlavný rotamér), 6,85 (d, 1H, minoritný rotamér), 6,9 - 7,1 (m, 2H), 7,45 (d, 1H, hlavný rotamér), 7,51 (d, 1H, minoritný rotamér), 7,55-7,65 (m, 2H).

¹³C-NMR (75 MHz; D₂O) karbonylové a amidínové uhlíky: δ 175,4, 174,5 (minoritný), 174,2 (minoritný, 174,1,167,1.

Príklad 3

Titulné zlúčeniny z príkladov 1 a 2 sa testovali v teste A uvedenom vyššie a pre obidve sa zistilo, že vykazujú IC50TT hodnotu menej ako 0,3 μΜ.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Zlúčenina všeobecného vzorca I, v ktorom

R¹ predstavuje H, C(O)R¹¹, SiR¹²R¹³R¹⁴ alebo C^alkyl (pričom posledne uvedená skupina je prípadne substituovaná alebo ukončená jedným alebo viacerými substituentami zvolenými z OR¹⁵ alebo (CH₂)_qR¹⁶);

R¹²,R¹³ a R¹⁴ navzájom nezávisle od seba predstavujú H, fenyl alebo Ci.₆.alkyl;

R^1S znamená C^alkyl, fenyl, OH, C(O)OR¹⁷ alebo C(O)N(H)R¹⁸;

R¹⁸ predstavuje H, C^alkyl alebo CH₂C(O)OR¹⁹;

R¹⁵ a R¹⁷ navzájom nezávisle od seba znamenajú H, C^alkyl alebo C₇.₉alkylfenyl;

R¹¹ a R¹⁹ navzájom nezávisle od seba predstavujú H alebo C^alkyl; a q znamená 0,1 alebo 2;

R² a R³ navzájom nezávisle od seba znamenajú H, C^alkyl, cyklohexyl alebo fenyl;

R_x predstavuje štruktúrny fragment vzorca lla, llb alebo llc,

R⁴ R⁵ (ľa) (llb) Glej,

-35pričom k, I a m predstavujú navzájom nezávisle od seba 0,1,2,3 alebo 4;

R⁴ a R⁵ navzájom nezávisle od seba znamenajú H, Si(Me)3, 1- alebo 2-naftyl, polycyklickú uhľovodíkovú skupinu, CHR⁴¹R⁴² alebo Ci^alkyl (pričom posledne uvedená skupina je prípadne substituovaná jedným alebo viacerými halogénovými substituentami) alebo C^cykloalkyl, fenyl, metyléndioxyfenyl, benzodioxanyl, benzofuranyl, dihydrobenzo-furanyl, benzotiazolyl, benzoxazolyl, benzimidazolyl, kumaranoyl, kumarinyl alebo dihydrokumarinyl (pričom posledných dvanásť uvedených skupín môže byť prípadne substituovaných jedným alebo viacerými Ci. 4alkylovými skupinami (pričom posledne uvedená skupina môže byť prípadne substituovaná jedným alebo viacerými halogénovými substituentami), Ci. ₄alkoxylom, halogénom, hydroxylovou skupinou, kyanoskupinou, nitroskupinou, SO₂NH₂, C(O)OH alebo N(H)R⁴³);

R⁴¹ a R⁴² navzájom nezávisle od seba predstavujú cyklohexyl alebo fenyl;

R⁶ a R⁷ navzájom nezávisle od seba predstavujú H, Ci^alkyl, C3-ecykloalkyl, fenyl (pričom posledná uvedená skupina môže byť prípadne substituovaná jedným alebo viacerými CMalkylovými skupinami (pričom posledne uvedená skupina môže byť prípadne substituovaná jedným alebo viacerými halogénovými substituentami), CMalkoxylom, halogénom, hydroxylovou skupinou, kyanoskupinou, nitroskupinou, SO2NH2, C(O)OH alebo N(H)R⁴⁴) alebo spolu s atómom uhlíka, ku ktorému sú viazané, tvoria C3^cykloalkylový kruh;

R⁴³ a R⁴⁴ navzájom nezávisle od seba predstavujú H alebo C(O)R⁴⁵; a

R⁴⁵ znamená H, C^alkyl alebo C_Malkoxy;

Y predstavuje CH₂, (ΟΗ₂)₂₁ CH=CH, (CH₂)₃, CH₂CH=CH alebo CH=CHCH₂, pričom posledné tri skupiny sú prípadne substituované Ci^alkylom, mety lénom, oxoskupinou alebo hydroxylovou skupinou;

n znamená 0,1, 2, 3 alebo 4; a

B predstavuje štruktúrny fragment vzorca IVa, IVb, IVc alebo IVd,

- óô -

X¹ X², X³ a X⁴ navzájom nezávisle od seba predstavujú CH, N alebo N-O;

X⁵ a X⁶ navzájom nezávisle od seba znamenajú jednoduchú väzbu alebo CH₂;

jeden z X⁷, X⁸ a X⁹ predstavuje S, O alebo NH a druhé dva navzájom nezávisle od seba znamenajú -CH=, =CH-, -N=, =N-, -N(O)= alebo =N(O)-;

R³¹ vo všetkým prípadoch znamená jeden alebo viac ľubovoľných substituentov zvolených zo skupiny zahrňujúcej halogén, C^alkyl, C^.alkoxy alebo -O(CH₂)_P-C(O)N(R³²)(R³³);

p predstavuje 0,1, 2, 3 alebo 4; a

R³² a R³³ znamenajú navzájom nezávisle od seba H, Ci^alkyl alebo C3.7cykloalky;

alebo jej farmaceutický prijateľná soľ.
2. Zlúčenina vzorca I podľa nároku 1, kde ak B predstavuje štruktúrny fragment vzorca IVa (v ktorom X¹, X², X³ a X⁴ všetky znamenajú CH) alebo štruktúrny fragment vzorca IVb alebo štruktúrny fragment vzorca IVc, R³¹ predstavuje jeden alebo viac substituentov zvolených zo skupiny zahrňujúcej halogén, C^alkyl alebo C_walkoxy alebo -O-(CH₂)_P-C(O)N(R³¹)(R³³).
3. Zlúčenina vzorca I podľa nároku 1 alebo 2, kde B predstavuje štruktúrny fragment vzorca IVa.
4. Zlúčenina vzorca I podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov , kde fragment je v S-konfigurácii.
5. Zlúčenina vzorca la crN—(CH₂)„—B^a v ktorom B predstavuje štruktúrny fragment vzorca IVe, IVf, IVg alebo IVh kde D¹ a D² navzájom nezávisle od seba predstavujú v každom prípade H, OH, OR^a, OC(O)R^b, OC(O)OR^c, C(O)OR^d, C(O)R^e, a R^a, R^b, R^c, R^d a R^e, navzájom nezávisle od seba predstavujú Ci.₁₂alkyl, (pričom posledne uvedená skupina je prípadne prerušená kyslíkom a/alebo substituovaná halogénom), fenyl, naftyl, C1.3. alkylfenyl, (pričom posledné tri uvedené skupiny sú substituované Ci^alkylom, Ci.

4.alkoxylom, nitroskupinou alebo halogénom) alebo -(C(R^f)(R⁹))₂OC(O)C(R^h), kde R^f, R⁹ a R^h predstavujú navzájom nezávisle od seba H alebo alkyl, a R¹, R², R³. Rx, Y, n, X\ X², X³, X⁴, X⁵, X⁶, X⁷, X⁸, X⁹ a R³¹ sú definované vyššie, alebo ich farmaceutický prijateľné soli, pod podmienkou, že D¹ a D² neznamenajú obidva H.
6. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje zlúčeninu definovanú v ktoromkoľvek z predchádzajúcich nárokov, alebo jej farmaceutický prijateľnú soľ, v zmesi s farmaceutický prijateľnou pomocnou látkou, riedidlom alebo nosičom.
7. Zlúčenina podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, alebo jej farmaceutický prijateľná soľ, na použitie ako liečivo.
8. Zlúčenina podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, alebo jej farmaceutický

- prijateľná soľ, na použitie pri liečení stavov, pri ktorých sa vyžaduje alebo je vhodná inhibícia trombínu.
9. Zlúčenina podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, alebo jej farmaceutický prijateľná soľ, na použitie pri liečení trombózy.
10. Zlúčenina podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, alebo jej farmaceutický prijateľná soľ, na použitie ako antikoagulačné činidlo.
11. Použitie zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, alebo jej farmaceutický prijateľnej soli, ako účinnej zložky na výrobu lieku na liečenie stavov, pri ktorých sa požaduje alebo je vhodná inhibícia trombínu.
12. Použitie podľa nároku 11, pričom stavom je trombóza.
13. Použitie zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, alebo jej farmaceutický prijateľnej soli, ako účinnej zložky na výrobu antikoagulačného činidla.

»
14. Spôsob liečenia stavu, pri ktorom sa vyžaduje alebo je vhodná inhibícia trombínu, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podávanie terapeuticky účinného množstva zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, alebo jej farmaceutický prijateľnej soli, osobe, ktorá trpí alebo je náchylná na takýto stav.
15. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že stavom je trombóza.
16. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že stavom je nadmerná zrážanlivosť v krvi a tkanivách.
17. Použitie zlúčeniny podľa nároku 5 ako prekurzora.
18. Spôsob prípravy zlúčeniny vzorca I, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje