SK5712001A3 - Pharmaceutical composition - Google Patents
Pharmaceutical composition Download PDFInfo
- Publication number
- SK5712001A3 SK5712001A3 SK571-2001A SK5712001A SK5712001A3 SK 5712001 A3 SK5712001 A3 SK 5712001A3 SK 5712001 A SK5712001 A SK 5712001A SK 5712001 A3 SK5712001 A3 SK 5712001A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- sequence
- dna
- fragment
- pharmaceutical composition
- muc
- Prior art date
Links
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 102
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims abstract 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 110
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 46
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 38
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 38
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 36
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 claims description 12
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 claims description 11
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 6
- 101000946191 Galerina sp Laccase-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 21
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 12
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 11
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 40
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 38
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 28
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 description 26
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 23
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 15
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 10
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 4
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 3
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 3
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 102000007298 Mucin-1 Human genes 0.000 description 3
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000012406 Carcinoembryonic Antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 2
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940022007 naked DNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- BZSALXKCVOJCJJ-IPEMHBBOSA-N (4s)-4-[[(2s)-2-acetamido-3-methylbutanoyl]amino]-5-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s,3r)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[2-[[(2s)-1-amino-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy Chemical compound CC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCC)C(=O)N[C@@H](CCCC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(N)=O)CC1=CC=CC=C1 BZSALXKCVOJCJJ-IPEMHBBOSA-N 0.000 description 1
- WALUVDCNGPQPOD-UHFFFAOYSA-M 2,3-di(tetradecoxy)propyl-(2-hydroxyethyl)-dimethylazanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCO)OCCCCCCCCCCCCCC WALUVDCNGPQPOD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003682 DNA packaging effect Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100346929 Homo sapiens MUC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101710177504 Kit ligand Proteins 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101100335081 Mus musculus Flt3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108700010674 N-acetylVal-Nle(7,8)- allatotropin (5-13) Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102100029812 Protein S100-A12 Human genes 0.000 description 1
- 101710110949 Protein S100-A12 Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101100373202 Rattus norvegicus Cx3cl1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 101100226904 Unknown prokaryotic organism FCS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002607 hemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 102000057860 human MUC1 Human genes 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 229940043263 traditional drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4727—Mucins, e.g. human intestinal mucin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001136—Cytokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Farmaceutický prostriedok
Oblasť vynálezu
Vynález sa týka skupiny DNA plazmidových konštruktov obsahujúcich sekvencie fragmentov kódujúcich humánny MUC-1 a skupiny DNA plazmidov, v ktorých je pred samotnými fragmentárni sekvencia kódujúca proteín pozostávajúci z humánneho ubiquitínu fúzovaného s bakteriálnym Lacl fragmentom. Vynález sa ďalej týka aj ich použitia ako DNA protinádorových vakcín.
Doterajší stav techniky
Vynález poskytuje protinádorovú terapiu založenú na indukcii alebo aktivácii imunitnej odpovede schopnej spôsobiť odvrhnutie nádoru. Platnosť takejto myšlienky je demonštrovaná prvými klinickými výsledkami; napríklad pacienti liečení vírusovou vakcínou obsahujúcou sekvencie kódujúce karcinoembryonický antigén (CEA) demonštrovali aktiváciu imunitného systému proti tomuto antigénu (Tsang KY a ďalší, J. Natl. Cancer. Inst. 87: 982,1995).
Aktivácia imunitnej protinádorovej odpovede je dosiahnuteľná prostredníctvom štyroch odlišných prístupov:
a) Ex vivo zámerné pozmenenie pacientových nádorových buniek, aby boli imunogénnejšie a vhodné ako vakcína;
b) Ex vivo zámerné pozmenenie pacientových nádorových buniek, aby sa vopred aktivovala in vitro imunitná odpoveď;
c) Inokulácia DNA kódujúcej antigény asociované s nádorom, ktorá je nahá alebo obalená v lipozómoch alebo začlenená do vírusových častíc (retrovírusových, vaccinia vírusových, adenovírusových atď.);
d) Ošetrenie s rekombinantnými alebo syntetickými rozpustnými nádorovými antigénmi konjugovanými alebo zmiešanými s adjuvansami.
Prvé dva prístupy pozostávajú zo zámerného menenia každej jednotlivej pacientovej bunky a sú limitované v tom, že sú nevyhnutne špecifické pre každého
-2pacienta, zatiaľ čo cieľom ďalších dvoch prístupov je získať produkty porovnateľné s tradičným liečivom.
Nové vakcinačné metódy odrážajú vývoj nových technológií. Súčasné informácie pochádzajúce z experimentovania z nahými DNA vakcínami, ktoré indukujú buď perzistnenú protilátkovú, alebo bunkovú imunitnú odpoveď, spôsobujú, že tradičné proteínové podjednotkové vakcíny pozostávajúce z určitých špecifických peptidov, ktoré indukujú lymfocytovú populáciu, zastarávajú. Intramuskulárne alebo intradermálne injektované proteíny kódované nahou DNA indukujú cytotoxický špecifickú odpoveď ako aj pomocnú odpoveď. Táto silná kombinácia je veľmi účinná, ale mechanizmus tohto podriaďovacieho procesu nie je ešte stále úplne objasnený. Svalové bunky exprimujú MHC antigény triedy I len v malých hladinách a zjavne neexprimujú antigény triedy II alebo ko-stimulučné molekuly. Z toho vyplýva, že je nepravdepodobné, že by transfekované svalové bunky samé o sebe hrali dôležitú úlohu v nástupe imunitnej odpovede. Súčasné údaje ukazujú, že antigén prezentujúce bunky (APC), ako napríklad makrofágy alebo dendritické bunky, hrajú základnú úlohu pri zachytení myocytom uvoľneného antigénu a v následnom spracovaní a prezentovaní zodpovedajúcich peptidov v kontexte molekúl triedy I a II, a tak indukujú aktiváciu CD8+ buniek s cytotoxickou aktivitou, ako aj aktiváciu CD4+ buniek spolupracujúcich s B lymfocytami na vyvolaní protilátkovej odpovede (Corr M a ďalší, J. Exp. Med. 184: 1555, 1996) (Tighe, H. a ďalší, Immunology Today 19:89,1998).
Navyše je známe, že použitie cytokínov zlepšuje terapeutický účinok odvodený od imunizácie s DNA. Cytokíny sa môžu podávať vo forme exogénnych proteínov, ako bolo publikované v Irvine a ďalší, J. Immunol. 156: 238, 1996. Alternatívny prístup je reprezentovaný súčasnou inokuláciou tak plazmidu kódujúceho nádorový antigén, ako aj plazmidu kódujúceho želateľný cytokín, čím sa umožní, aby bol cytokín produkovaný in situ (Kim J J a ďalší, Immunol 158: 816,1997).
Účinný imunizačný prístup podľa predloženého vynálezu je založený na použití DNA vektorov ako vakcín proti MUC-1 humánnemu antigénu alebo polymorfnému epiteliálnemu mucínu (PEM), ktorý je nadmerne exprimovaný v nádorových bunkách. MUC-1 je eptiteliálny luminálny povrchový glykoproteín (Patton S. a ďalší, BBA 1241:407, 1995). V procese transformácie buniek stráca • f t ' r
-3tento glykoproteín apikálnu lokalizáciu a jeho úroveň expresie dramaticky rastie. Proteínová funkcia pozostáva z ochrany lumínálnych povrchov, napríklad v prsných žľazách, vaječníkoch, endometriu, hrubom čreve, žalúdku, pankrease, močovom mechúre, obličkách, atď. Publikovalo sa, že defekt v glykozylácii spôsobuje, že MUC-1 asociovaný s nádorovými bunkami je antigénovo odlišný od MUC-1 asociovaného z normálnymi bunkami. Tento fenomén je spôsobený tým, že MUC-1 odhaľuje antigénové epitopy, ktoré sú normálne maskované sacharidovými zvyškami v MUC-1 exprimovanom normálnymi bunkami. Táto vlastnosť robí nádorový MUC-1 veľmi zaujímavým z hľadiska indukcie nádorovo špecifickej protilátkovej odpovede (Apostolopoulos V. a ďalší, Crit. Rev. Immunol. 14:293,1994).
Predmetom je vakcinácia, ktorej cieľom je indukcia imunitných odpovedí voči nádorovým bunkám exprimujúcim MUC1 vo vysokých hladinách, pričom zároveň ostávajú chránené normálne epitely s nízkou expresiou. DNA vakcinácia je založená na vstupe génu alebo jeho častí do vnútra tela buniek, po ktorom nasleduje transkripcia a translácia inzertovanej sekvencie a tým vnútrobunková syntéza zodpovedajúceho polypeptidu. Dôležitou výhodou tohto systému je, že neosyntetizovaný protein sa prirodzene spracúva vo vnútri bunky a produkované peptidy sú asociované s molekulami hlavného histokompatibilného komplexu triedy I (MHC-I). MHC/peptidové komplexy sa preto prirodzene exportujú na bunkový povrch, kde môžu byť rozoznávané CD8+ cytotoxickými bunkami imunitného systému. Len polypeptidy syntetizované vo vnútri bunky sa potom spracovávajú a prezentujú v spojení s MHC molekulami triedy I, a využívajú tak jediný mechanizmus na stimuláciu špecifickej cytotoxickej odpovede. Vakcinačné systémy založené na podávaní proteínu alebo peptidu sú zvyčajne účinnejšie na stimuláciu protilátkovej imunitnej odpovede, ktorá sa doteraz ukázala ako neúčinná pri odvrhovaní nádorových buniek. Súčasné génové terapeutické techniky sú založené na zbaľovaní DNA v rekombinantných vírusových vektoroch (retrovírusových a adenovírusových). Podávanie nahej DNA je výhodnejšie s ohľadom na účinnosť a bezpečnosť v porovnaní s vírusovými vektorovými terapiami. (Kumar V a Sercarz E. Náture Med. 2: 857, 1996; McDonnel WM a ďalší, New England J. of Med. 334: 42, 1996). V skutočnosti nahá DNA nie je schopná ani sa duplikovať, ani integrovať do
-4hostiteľskej tkanivovej DNA, a neindukuje imunitnú odpoveď voči vírusovým proteínom.
V súčasnosti bolo publikované použitie ubiquitínu na zosilnenie spracovania neo-syntetizovaného proteínu, a tým na indukciu cytotoxických lymfocytov (Rodriguez F. a ďalší, J. Virology 71: 8497, 1997). Predtým bolo publikované použitie ubiquitínu na generovanie proteínov s N-koncovou aminokyselinou, čo ich robilo nestabilnými a tým náchylnými na degradáciu vo väčšom rozsahu (Bechmair
A. a ďalší, Science 234: 179, 1986). Vyššia nestabilita týchto proteínov bola následne spojená so zosilneným vnútrobunkovým spracovaním a prezentáciou modelových proteínov prostredníctvom MHC-1 (Grant E. P. a ďalší, J. Immunol. 155: 3750,1995) (Wu Y a Kipps T.J., J. Immunol. 159: 6037,1997).
Zverejnené bolo použitie jednotkových konštruktov obsahujúcich DNA fragmenty kódujúce čiastočný antigén (influenza vírusový nukleoproteín), ktoré majú pri DNA vakcinácii vyššiu antigénovú prezentačnú účinnosť ako analógy s celými antigénovými sekvenciami (Anton L. C. a ďalší, J. Immunol. 158: 2535, 1997). Navyše spracovanie vnútrobunkových proteínov a prezentácia zodpovedajúcich peptidov MHC proteínmi triedy I podlieha vo fyziologických podmienkach mechanizmu imunologického dohľadu. Pre daný proteín a špecifický MHC kontext existujú peptidové fragmenty nazývané dominanty (tzn. prevládajúce nad subdominantami alebo kryptami), ktoré nie sú schopné generovať žiadnu imunitnú odpoveď pretože sú rozoznávané ako vlastné. V súlade s predmetom predloženého vynálezu sa teraz zistilo, že prístup, ktorého cieľom je podporiť prezentáciu nedominantného epitopu podávaním zmesi antigénových proteínových fragmentov je schopný vyvolať prekvapujúcu cytotoxickú imunitnú odpoveď.
Teraz sa zistilo, že DNA molekuly, ktoré kódujú fragmenty proteínu nadmerne exprimovaného v nádorových bunkách, sa môžu pohodlne používať na indukciu antigén-špecifickej protinádorovej imunitnej odpovede.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje jeden alebo viac fragmentov DNA kódujúcej mucínový (MUC-1) proteín.
-5Prostriedky podľa vynálezu obsahujú výhodnej najmenej dva DNA fragmenty mucínu (MUC-1) alebo iného proteínu nadmerne exprimovaného v nádorových bunkách.
Prostriedky podľa vynálezu výhodne obsahujú najmenej štyri fragmenty, každý z dĺžkou od 200 do 700 nukleotidov, pričom každá sekvencia je radená hneď vedľa susednej sekvencie a môžu sa aj čiastočne prekrývať približne 50 až približne 150 nukleotidmi na 3' a/alebo 5* konci so susednou sekvenciou.
Pred DNA fragmentárni podľa vynálezu môže byť na 5' konci zaradená aj DNA sekvencia kódujúca ubiquitín a môže tam byť aj Lad časť Escherichia coli.
Vynález sa týka aj nových DNA fragmentov a použitia vyššie definovaných mucín-1 fragmentov v medicínskych a protinádorových vakcinačných prípravkoch.
Pripravila sa zásoba DNA plazmidov, ktoré v eukaryotických bunkách kódujú fragmenty MUC-1 humánneho proteínového antigénu. Konštrukty sú založené na cicavčom expresnom vektore označovanom ako pMRS30, opísanom na obrázku 13 a už nárokovanom v prihláške vynálezu WO95/11982, a obsahujú čiastočné sekvencie MUC-1 cDNA zverejnené v EMBL databáze pod prístupovým číslom J05581. MUC-1 kódujúca DNA sa rozdelila na fragmenty tak, aby každý fragment reprezentoval diskrétnu časť čiastočne sa prekrývajúcu so susednou časťou. Podávanie zmesi takýchto plazmidov môže spôsobiť, že odlišné plazmidy transfekujú odlišné APC bunky v mieste podania. Preto takéto bunky produkujú a spracovávajú diskrétne časti MUC-1 proteínu, čo vedie ku vzniku príbuzných peptidov. V takýchto podmienkach môže dôjsť aj ku prezentácii subdominantných a kryptických peptidov v spojení s MHC molekulami triedy I, čím sa môže generovať cytotoxická imunitná odpoveď.
Takže predložený vynález sa týka použitia skupiny štyroch konštruktov (obrázky 1 až 4) obsahujúcich MUC-1 cDNA čiastočné fragmenty v zmesi obsahujúcej najmenej dva z nich a skupiny štyroch konštruktov (obrázky 7 až 10) obsahujúcich MUC-1 cDNA čiastočné fragmenty, pred ktorými sa nachádza DNA kódujúca proteínovú sekvenciu obsahujúcu ubiquitínovú a Escherichia coli Lac I časť (obrázok 6), ktoré sa používajú oddelene alebo v zmesi, ktorá obsahuje najmenej dva z nich.
-6Predložený vynález sa týka aj použitia konštruktu (obrázok 5) obsahujúceho takmer kompletnú sekvenciu MUC-1 cDNA a konštruktu (obrázok 11) obsahujúceho takmer kompletnú sekvenciu MUC-1 cDNA, pred ktorou je DNA kódujúca proteínovú sekvenciu obsahujúcu ubiquitínovú a Escherichia coli Lac I časť.
Zmes štyroch konštruktov obsahujúcich čiastočné fragmenty MUC-1 cDNA a zmes štyroch konštruktov obsahujúcich čiastočné fragmenty MUC-1 cDNA, pred ktorou sa nachádza DNA kódujúca proteínovú sekvenciu obsahujúcu ubiquitínovú a Escherichia coli Lac I časť, predstavuje výhodné uskutočnenie predloženého vynálezu.
Konštrukty podľa predloženého vynálezu môžu byť použité na protinádorovú liečbu pacientov postihnutých nádormi, ktoré sa vyznačujú vysokou MUC-1 expresiou.
Konštrukty opísané v predloženom vynáleze sa získali nasledovne.
V prípade prvej série konštruktov sa fragmenty MUC-1 DNA získali RT-PCR z BT200 bunkovej línie alebo čiastočnou chemickou syntézou DNA. Takéto fragmenty sa potom klonovali do pMRS30 expresného vektora a overili sa sekvenovaním.
V prípade druhej série konštruktov sa fragmenty získali z prvej série konštruktov PCR re-amplifikáciou. Tieto fragmenty sa potom fúzovali s DNA kódujúcou ubiquitín (získanou prostredníctvom RT-PCR z MCF7 bunkovej líniovej mRNA) a s čiastočnou lacl sekvenciou (získanou prostredníctvom PCR z komerčného vektora pGEX). Takto získané DNA sekvencie sa potom klonovali do pMRS30 expresného vektora a overili sa sekvenovaním. Na zamýšľané terapeutické alebo profylaktické použitia sú fragmenty alebo konštrukty podľa vynálezu vhodne formulované použitím nosičov a metód, ktoré boli predným využívané v nahých DNA vakcínach, ako je opísané napríklad v The Immunologist, 1994, 2:1; WO 90/11092, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986, 83, 9551; US 5580859; Immunology today 19 (1998), 89-97; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993), 11478-11482; Nat. Med. 3 (1997), 526-532; Vaccine 12 (1994), 1495-1498; DNA Celí. Biol. 12 (1993), 777-783. Dávky budú stanovované na základe klinických a farmakologicko-toxikologických testov. Vo všeobecnosti sa dá povedať, že budú
-7obsahovať medzi 0,005 gg/kg a 5 pg/kg zmesi fragmentov. Prostriedok podľa vynálezu môže obsahovať aj cytokín alebo cytokín kódujúci plazmid.
Vynález bude ďalej ilustrovaný prostredníctvom nasledujúcich príkladov.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1
Nukleotidová DNA sekvencia (so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou) začlenená do Xbal miesta pMRS166 expresného vektora. Táto DNA obsahuje sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 136-339 EMBL sekvencie J05581, ktorej predchádza translačný štartovací kodón, ATG, a po nej nasledujú dva translačné stop kodóny, TGA a TAA. Takže kódovaný polypeptid obsahuje metionín nasledovaný aminokyselinami kódovanými 136-339 fragmentom EMBL sekvencie J05581.
Obrázok 2
Nukleotidová DNA sekvencia (so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou) začlenená do Xbal miesta pMRS30 expresného vektora, čím vznikol pMRS169 expresný vektor. Táto DNA obsahuje sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 205-720 EMBL sekvencie J05581, ktorej predchádza translačný štartovací kodón, ATG, a po nej nasledujú dva translačné stop kodóny, TGA a TAA. Takže kódovaný polypeptid obsahuje metionín nasledovaný aminokyselinami kódovanými 205-720 fragmentom EMBL sekvencie J05581.
Obrázok 3
Nukleotidová DNA sekvencia (so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou) začlenená do Xbal miesta pMRS30 expresného vektora, čim vznikol pMRS168 expresný vektor. Táto DNA obsahuje sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 631-1275 EMBL sekvencie J05581, ktorej predchádza translačný štartovací kodón, ATG, a po nej nasledujú dva translačné stop kodóny, TGA a TAA. Takže kódovaný polypeptid obsahuje metionín nasledovaný aminokyselinami kódovanými 631-1275 fragmentom EMBL sekvencie J05581.
-8Obrázok 4
Nukleotidová DNA sekvencia (so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou) začlenená do Xbal miesta pMRS30 expresného vektora, čím vznikol pMRS167 expresný vektor. Táto DNA obsahuje sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 1222-1497 EMBL sekvencie J05581, ktorej predchádza translačný štartovací kodón, ATG, a po nej nasledujú dva translačné stop kodóny, TGA a TAA. Takže kódovaný polypeptid obsahuje metionin nasledovaný aminokyselinami kódovanými 1222-1497 fragmentom EMBL sekvencie J05581.
Obrázok 5
Nukleotidová DNA sekvencia (so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou) začlenená do Xbal miesta pMRS30 expresného vektora, čím vznikol pMRS175 expresný vektor. Táto DNA obsahuje sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 136-1497 EMBL sekvencie J05581, ktorej predchádza translačný štartovací kodón, ATG, a po nej nasledujú dva translačné stop kodóny, TGA a TAA. Takže kódovaný polypeptid obsahuje metionin nasledovaný aminokyselinami kódovanými 136-1497 fragmentom EMBL sekvencie J05581.
Obrázok 6
Nukleotidová DNA sekvencia (so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou) označená ako UBILacl. Kódovaný polypeptid zahŕňa ubiquitínovú sekvenciu fúzovanú s čiastočnou sekvenciou bakteriálneho proteínu betagalaktozidázy, ako je opísané v Chau V. a ďalší, Science 243:1576,1989.
Obrázok 7
Nukleotidová DNA sekvencia (so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou) začlenená do Xbal miesta expresného vektora pMRS30, čím vznikol pMRS171 expresný vektor. Táto DNA obsahuje sekvenciu označenú ako UBILacl (pozri obr. 6) fúzovanú so sekvenciou zodpovedajúcou nukleotidom 136-339 EMBL sekvencie J05581, po ktorej nasledujú dva translačné stop kodóny, TGA a TAA. Takže kódovaný polypeptid obsahuje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na
-9obrázku 6 fúzovanú so sekvenciou zahŕňajúcou aminokyseliny kódované fragmentom 136-339 EMBL sekvencie J05581.
Obrázok 8
Nukleotidová DNA sekvencia (so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou) začlenená do Xbal miesta expresného vektora pMRS30, čím vznikol pMRS174 expresný vektor. Táto DNA obsahuje sekvenciu označenú ako UBILacI (pozri obr. 6) fúzovanú so sekvenciou čiastočne zodpovedajúcou nukleotidom 205720 EMBL sekvencie J05581, po ktorej nasledujú dva translačné stop kodóny, TGA a TAA. Takže kódovaný polypeptid obsahuje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obrázku 6 fúzovanú so sekvenciou zahŕňajúcou aminokyseliny kódované fragmentom 205-720 EMBL sekvencie J05581.
Obrázok 9
Nukleotidová DNA sekvencia (so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou) začlenená do Xbal miesta expresného vektora pMRS30, čím vznikol pMRS173 expresný vektor. Táto DNA obsahuje sekvenciu označenú ako UBILacI (pozri obr. 6) fúzovanú so sekvenciou čiastočne zodpovedajúcou nukleotidom 6311275 EMBL sekvencie J05581, po ktorej nasledujú dva translačné stop kodóny, TGA a TAA. Takže kódovaný polypeptid obsahuje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obrázku 6 fúzovanú so sekvenciou zahŕňajúcou aminokyseliny kódované fragmentom 631-1275 EMBL sekvencie J05581.
Obrázok 10
Nukleotidová DNA sekvencia (so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou) začlenená do Xbal miesta expresného vektora pMRS30, čím vznikol pMRS172 expresný vektor. Táto DNA obsahuje sekvenciu označenú ako UBILacI (pozri obr. 6) fúzovanú so sekvenciou čiastočne zodpovedajúcou nukleotidom 12221497 EMBL sekvencie J05581, po ktorej nasledujú dva translačné stop kodóny, TGA a TAA. Takže kódovaný polypeptid obsahuje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obrázku 6 fúzovanú so sekvenciou zahŕňajúcou aminokyseliny kódované fragmentom 1222-1497 EMBL sekvencie J05581.
-10Obrázok 11
Nukleotidová DNA sekvencia (so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou) začlenená do Xbal miesta expresného vektora pMRS30, čím vznikol pMRS176 expresný vektor. Táto DNA obsahuje sekvenciu označenú ako UBILacI (pozri obr. 6) fúzovanú so sekvenciou čiastočne zodpovedajúcou nukleotidom 1361497 EMBL sekvencie J05581, po ktorej nasledujú dva translačné stop kodóny, TGA a TAA. Takže kódovaný polypeptid obsahuje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obrázku 6 fúzovanú so sekvenciou zahŕňajúcou aminokyseliny kódované fragmentom 136-1497 EMBL sekvencie J05581.
Obrázok 12
Elektroforetická analýza na 1% agarózovom géli v 1xTBE. mRNA extrahovaná z CHO, CD34+ dentritických buniek, respektíve dentritických buniek z PBMC, transfekovaných s pMRS169, a podrobených RT-PCR reakcii buď s (dráhy 4, 8, 12), alebo bez (dráhy 5, 9, 13) reverznej transkriptázy. Marker molekulovej hmotnosti DNA (dráha 1); interné negatívne kontroly (dráhy 2, 6); interné pozitívne kontroly (dráhy 3, 7,10,11); pozitívna kontrola z Promega kitu (dráha 14).
Obrázok 13
Nukleotidová sekvencia pMRS30 expresného vektora. 1-1862 oblasť zodpovedá Accl (poloha 504) - BamHI (poloha 3369) oblasti pSV2CAT vektora (EMBL M77788); 2862-3721 oblasť obsahuje humánny cytomegalovírusový promótor (zosiľovač humánneho cytomegalovírusového hlavného okamžite-skorého génu); 3722-4905 oblasť obsahuje niekoľko klonovacích miest vrátane Xbal (poloha 3727) a spracovávací signál králičieho beta-globínového génu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Konštrukcia plazmidu pMRS166
-11 ΒΤ20 nádorové bunky (ATCC HTB-19) sa kultivovali v Eagles MEM doplnenom s 10% fetálnym hovädzím sérom. Desať miliónov buniek sa trypsinizovalo, premylo s PBS a extrahovala sa mRNA.
Alikvota tejto RNA sa podrobila RT-PCR (reverzná transkriptázová polymerázová reťazová reakcia) reakcii v prítomnosti nasledujúcich syntetických oligonukleotidov:
Vil (5' GATCTCTAGAATGACAGGTTCTGGTCATGCAAGC 3')
V4 (5' GATCTCTAGAAAGCTTATCAACCTGAAGCTGGTTCCGTGGC 3')
Vyprodukovaný DNA fragment, purifikovaný a poštiepený s reštrikčným enzýmom Xbal, sa klonoval do pMRS30 expresného vektora, ktorý obsahuje humánny cytomegalovírusový promótor a beta-globínový polyadenylačný signál, ako je nárokované v patente č. WO9511982. Výsledný pMRS166 vektor obsahuje DNA fragment zahŕňajúci ATG kodón, sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 136339 EMBL sekvencie J05581 a dva stop kodóny, TGA a TAA.
Tento fragment je znázornený na obrázku 1.
Príklad 2
Konštrukcia plazmidu pMRS169
Alikvota RNA, získaná ako bolo uvedené v príklade 1, sa podrobila RT-PCR v prítomnosti nasledujúcich syntetických oligonukleotidov:
VI2 (5' GATCTCTAGAATGGTGCCCAGCTCTACTGAGAAGAATGC 3')
VI5 (5' GGCGGTGGAGCCCGGGGCTGGCTTGT 3’)
Vyprodukovaný DNA fragment, purifikovaný a poštiepený s reštrikčnými enzýmami Smal a Xbal, sa fúzoval, prostredníctvom Smal reštrikčného miesta, do DNA fragmentu, ktorý bol celý synteticky skonštruovaný a obsahuje sekvenciu čiastočne zodpovedajúcu nukleotidom 457-720 EMBL sekvencie J05581 a dva stop kodóny, TGA a TAA. Celý fragment sa potom klonoval do Xbal miesta pMRS30 expresného vektora. Výsledný pMRS169 vektor obsahuje DNA fragment zahŕňajúci ATG kodón, sekvenciu čiastočne zodpovedajúcu nukleotidom 205-720 EMBL sekvencie J05581 a dva stop kodóny, TGA a TAA.
Tento fragment je znázornený na obrázku 2.
-12Príklad 3
Konštrukcia plazmidu pMRS168
Alikvota RNA, získaná ako bolo uvedené v príklade 1, sa amplifikovala prostredníctvom RT-PCR v prítomnosti nasledujúcich syntetických oligonukleotidov:
VI3 (5' GATCTCTAGAATGGGCTCAGCTTCTACTCTGGTGCACAACGGC 3')
V8 (5' GATCTCTAGAAAGCTTATCACAAGGCAATGAGATAGACAATGGCC 3')
Vyprodukovaný DNA fragment, purifikovaný a poštiepený s reštrikčným enzýmom Xbal, sa klonoval do pMRS30 expresného vektora. Výsledný pMRS168 vektor obsahuje DNA fragment zahŕňajúci ATG kodón, sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 631-1275 EMBL sekvencie J05581 a dva stop kodóny, TGA a TAA.
Tento fragment je znázornený na obrázku 3.
Príklad 4
Konštrukcia plazmidu pMRS167
Alikvota RNA, získaná ako bolo uvedené v príklade 1, sa podrobila RT-PCR reakcii v prítomnosti nasledujúcich syntetických oligonukleotidov:
VI4 (51 GATCTCTAGAATGCTGGTGCTGGTCTGTGTTCTGGTTGCGC 3')
VI0 (5' GATCTCTAGAAAGCTTATCACAAGTTGGCAGAAGTGGCTGC 3') Vyprodukovaný DNA fragment, purifikovaný a poštiepený s reštrikčným enzýmom Xbal, sa klonoval do pMRS30 expresného vektora. Výsledný pMRS167 vektor obsahuje DNA fragment zahŕňajúci ATG kodón, sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 1222-1497 EMBL sekvencie J05581 a dva stop kodóny, TGA a TAA.
Tento fragment je znázornený na obrázku 4.
Príklad 5
Konštrukcia plazmidu pMRS175
Plazmidy pMRS166, 169, 168, 167 sa podrobili PCR reakcii v prítomnosti nasledujúcich nukleotidových párov.
V11 (pozri príklad 1)
-13V18 (5' AACCTGAAGCTGGTTCCGTGGC 3') prepMRS166
V19 (5' GTGCCCAGCTGTACTGAGAAGAATGC 3')
V20 (5' GCTGGGAATTGAGAATGGAGTGCTCTTGC 3') prepMRS169
V21 (51 GGCTCAGCTTCTACTCTGGTGCACAACGGC 31)
V22 (5' CAAGGCAATGAGATAGACAATGGCC 3') prepMRS168
V23 (5' CTGGTGCTGGTCTGTGTTCTGGTTGCG 3')
V10 (pozri príklad 4) pre pMRS167
Štyri DNA fragmenty získané v príslušných PCR reakciách sa zmiešali v ekvimolárnych množstvách a podrobili sa PCR reakcii v prítomnosti V11 a V10 oligonukleotidov.
Vyprodukovaný DNA fragment, purifikovaný a poštiepený Xbal reštrikčným enzýmom, sa klonoval do pMRS30 expresného vektora. Výsledný pMRS175 vektor obsahuje DNA fragment zahŕňajúci ATG kodón, sekvenciu čiastočne zodpovedajúcu nukleotidom 136-1497 EMBL sekvencie J05581 a dva stop kodóny TGA a TAA.
Príklad 6
Konštrukcia plazmidu pMRS171
MCF7 nádorové bunky (ATCC HTB-22) sa kultivovali v Eagles MEM doplnenom 10% fetálnym teľacím sérom. Desať miliónov buniek sa trypsinizovalo, premylo sa s PBS a extrahovala sa mRNA.
Alikvota RNA sa podrobila RT-PCR v prítomnosti nasledujúcich syntetických oligonukleotidov:
UBlup (5' GATCTCTAGAATGCAGATCTTCGTGAAGACCCTGACTGGT 3')
UBIdown (5 ' TCACCAGCGAGACGGGCAACAGCCATGCACCACTACCGTGCCTCCCACCTCTG AGACGGAGCACCAGG 3')
Výsledkom reakcie je DNA fragment označovaný ako fragment 1.
DNA z pGEX11T (Pharmacia) sa podrobila PCR reakcii v prítomnosti nasledujúcich syntetických oligonukleotidov:
-14Laclup (5' CCTCCGTCTCAGAGGTGGGAGGCACGGTAGTGGTGCATGGCTGTTGCCCGTCTCGCTGGTGAAAAG 3')
Lacldown (5’ gatcggatcctcgggaaacctgtcgtgccagctgc 31)
Výsledkom tejto reakcie je DNA fragment označovaný ako fragment 2.
DNA fragmenty 1 a 2, získané v príslušných PCR reakciách, sa zmiešali v ekvimolárnych množstvách a podrobili sa PCR reakcii v prítomnosti UBlup a Lacldown oligonukleotidov.
Vyprodukovaný DNA fragment, purifikovaný a poštiepený s reštrikčnými enzýmami Xbal a BamHI, sa klonoval do komerčného plazmidu pUC18. Výsledný pMRS156 vektor obsahuje DNA fragment zahŕňajúci sekvenciu, ktorá kóduje ubiquitín fúzovaný so sekvenciou kódujúcou bakteriálnu beta-galaktozidázovú časť. Tento fragment, označovaný ako UBILacI, je znázornený na obrázku 6.
DNA plazmidu pMRS166 sa podrobila PCR reakcii v prítomnosti nasledujúcich syntetických oligonukleotidov:
V3 (5' GATCGGATCCACAGGTTCTGGTCATGCAAGC 3')
V4 (pozri príklad 1)
Vyprodukovaný DNA fragment, purifikovaný a poštiepený s reštrikčnými enzýmami Xbal a BamHI, sa fúzoval ligáciou do dvoch BamHI miest UBILacI fragmentu odvodeného od pMRS156 plazmidu. Výsledný fragment sa klonoval do pMRS30 expresného vektora. Výsledný pMRS171 vektor obsahuje DNA fragment zahŕňajúci UBILacI sekvenciu, sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 136-339 EMBL sekvencie J05581 a dva stop kodóny, TGA a TAA. Tento fragment je znázornený na obrázku 7.
Príklad 7
Konštrukcia plazmidu pMRS174
DNA plazmidu pMRS169 sa podrobila PCR reakcii v prítomnosti nasledujúcich syntetických oligonukleotidov:
V5 (5' GATCGGATCCGTGCCCAGCTCTACTGAGAAGAATGC 3')
V6 (5 ' GATCTCTAGAAAGCTTATCAGCTGGGAATTGAGAATGGAGTGCTCTTGC 3 1 )
-15Vyprodukovaný DNA fragment, purifikovaný a poštiepený s reštrikčnými enzýmami Xbal a BamHI, sa fúzoval ligáciou do dvoch BamHI miest UBILacI fragmentu odvodeného od pMRS156 plazmidu. Výsledný fragment sa klonoval do pMRS30 expresného vektora. Výsledný pMRS174 vektor obsahuje DNA fragment zahŕňajúci UBILacI sekvenciu, sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 205-720 EMBL sekvencie J05581 a dva stop kodóny, TGA a TAA. Tento fragment je znázornený na obrázku 8.
Príklad 8
Konštrukcia plazmidu pMRS173
DNA plazmidu pMRS168 sa podrobila PCR reakcii v prítomnosti nasledujúcich syntetických oligonukleotidov:
V7 (5' GATCGGATCCGGCTCAGCTTCTACTCTGGTGCACAACGGC 3')
V8 (pozri príklad 3)
Vyprodukovaný DNA fragment, purifikovaný a poštiepený s reštrikčnými enzýmami Xbal a BamHI, sa fúzoval ligáciou do dvoch BamHI miest UBILacI fragmentu odvodeného od pMRS156 plazmidu. Výsledný fragment sa klonoval do pMRS30 expresného vektora. Výsledný pMRS173 vektor obsahuje DNA fragment zahŕňajúci UBILacI sekvenciu, sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 631-1275 EMBL sekvencie J05581 a dva stop kodóny, TGA a TAA. Tento fragment je znázornený na obrázku 9.
Príklad 8
Konštrukcia plazmidu pMRS172
DNA plazmidu pMRS167 sa podrobila PCR reakcii v prítomnosti nasledujúcich syntetických oligonukleotidov:
V9 (5' GATCGGATCCCTGGTGCTGGTCTGTGTTCTGGTTGCGC 3')
V10 (pozri príklad 4)
Vyprodukovaný DNA fragment, purifikovaný a poštiepený s reštrikčnými enzýmami Xbal a BamHI, sa fúzoval ligáciou do dvoch BamHI miest UBILacI
-16fragmentu odvodeného od pMRS156 plazmidu. Výsledný fragment sa klonoval do pMRS30 expresného vektora. Výsledný pMRS172 vektor obsahuje DNA fragment zahŕňajúci UBILacI sekvenciu, sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 1222-1497 EMBL sekvencie J05581 a dva stop kodóny, TGA a TAA. Tento fragment je znázornený na obrázku 10.
Príklad 10
Konštrukcia plazmidu pMRS176
DNA plazmidu pMRS167 sa podrobila PCR reakcii v prítomnosti nasledujúcich syntetických oligonukleotidov:
V3 (pozri príklad 6)
V10 (pozri príklad 4)
Vyprodukovaný DNA fragment, purifikovaný a poštiepený s reštrikčnými enzýmami Xbal a BamHI, sa fúzoval ligáciou do dvoch BamHI miest UBILacI fragmentu odvodeného od pMRS156 plazmidu. Výsledný fragment sa klonoval do pMRS30 expresného vektora. Výsledný pMRS176 vektor obsahuje DNA fragment zahŕňajúci UBILacI sekvenciu, sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidom 136-1497 EMBL sekvencie J05581 a dva stop kodóny, TGA a TAA. Tento fragment je znázornený na obrázku 11.
Príklad 11
Transformácia eukaryotických buniek a testovanie transkripcie
CHO bunky (vaječníkové bunky čínskeho škrečka) sa kultivovali v alfa MEM doplnenom s ribonukleotidmi a deoxyribonukleotidmi v čase transfekcie.
Dendritické bunky sa získali z CD34+ hemopoetických prekurzorov kultivovaných v IMDM bez séra, ktoré bolo doplnené s GM-CSF, IL4, SCF, Flt3 a TNFalfa. Po 7 dňoch sa získaná populácia buniek transfekovala.
Dendritické bunky sa získali z monocytov izolovaných z PBMC (periférne krvné mononukleárne bunky), kultivovali sa v RPMI doplnenom s FCS, GM-CSF a IL-4. Po 7 dňoch sa získaná populácia buniek transfekovala.
-17V každom prípade sa transfekovalo približne milión buniek s jedným z plazmidov uvedených v príkladoch 1 až 10. Transfekcia sa uskutočňovala použitím 3 pg plazmidovej DNA a 4 μί DMRIE (Gibco) lipofekciou.
Po 24 hodinách sa bunky zozbierali, premyli s PBS a lyžovali sa, aby sa extrahovala mRNA.
Alikvota mRNA sa podrobila RT-PCR reakcii v prítomnosti oligonukleotidového páru špecifického pre transfekovaný DNA plazmid.
Tento experiment sa uskutočňoval pre každý plazmid uvedený v príkladoch 1 až 10 použitím nasledujúcich oligonukleotidových párov: V11/V4 pre pMRS166, V12/V6 pre pMRS169, V13/V8 pre pMRS168, V4/V10 pre pMRS167, V4ZV10 pre PMRS175, UBIup/V4 pre pMRS171, UBIup/V6 pre pMRS174, UBIup/V8 pre pMRS173, UBIup/V10 pre pMRS172, V14/V10 pre pMRS176.
Ako reprezentatívny príklad znázorňuje obrázok 12 elektroforetickú analýzu DNA fragmentov získaných prostredníctvom RT-PCR z mRNA troch bunkových populácií transfekovaných plazmidom pMRS169. V tomto prípade bol použitý oligonukleotidový pár V12/V6.
Príklad 12
Výsledky in vivo štúdií
Pri in vivo štúdiách sa používali zmesi štyroch fragmentov a pMRS30 plazmid (vektor bez inzertu používaný ako negatívna kontrola). Aby sa otestovalo či nastala imunizácia, používal sa ELISA test na dokázanie špecifických antigénov voči humánnemu mucínu.
In vivo štúdie sa uskutočňovali použitím transgénnych C57BL myší s humánnym MUC1. V dôsledku toho predstavoval v týchto zvieratách MUC1 proteín vlastný proteín. Využívaný vakcinačný režim pozostával z 3 intradermálnych (do chrbtovej časti, 50 pg DNA do každej strany) podaní ( v dňoch 0, 14, 28) 100 pg plazmidovej DNA. 14 dní po poslednom podaní sa zvieratá usmrtili a ich séra boli testované na obsah anti-humánnych mucínových protilátok.
Testované fragmentové zmesi, predmet predloženého vynálezu, stimulovali v ošetrených zvieratách dobrú imunitnú odpoveď.
r -18Na druhej strane sa uskutočňovali aj vakcinačné experimenty so 60aminokyselinovým peptidom zodpovedajúcim 20 aminokyselinám uvedeným na obrázku 2 od polohy 86 po polohu 105, ktoré sa tri krát opakovali (tento peptid sa označuje 3xTR).
Tieto dve vakcinácie sa líšia v type vyvolanej protilátkovej odpovede. Protilátkové titračné výsledky sú oveľa vyššie pri vakcinácii s 3xTR. Navyše zaznamenané IgG subtypy sú v prospech najmä humorálnej (protilátkovej) odpovede v prípade vakcinácie s 3xTR, a v prospech bunkovej odpovede (cytotoxickej) v prípade vakcinácie s DNA. Na protinádorovú terapiu je principiálne výhodná cytotoxická imunitná odpoveď. Keďže sa experimenty uskutočňovali v transgénnych myšiach, pre ktoré bol humánny mucín vlastný, môžeme predpokladať podobnú odpoveď u ľudí. Táto odpoveď by mohla oprávňovať použitie zlúčenín podľa predloženého vynálezu ako DNA vakcín na liečbu humánnych nádorov, v ktorých je nadmerne exprimovaný MUC1.
r r r r p r
-19Zoznam sekvencií <110> Menarini Ricerche S.p.A.
<120> Farmaceutický prostriedok obsahujúci fragmenty DNA kódujúcej antigénny proteín, ktorý má protinádorový účinok <130> 5653MEUR <140>
<141>
<150> MI98A002330 <151> 1998-10-30 <160> 35 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 213 <212> DNA <213> ľudská <400> 1
| accacaggtt | ccggtcatgc | aagccccacc | ccacctggag | aaaacgagac | ttcccctacc | 60 |
| cacagaagtt | cagtgcccag | ccccactcag | aagaatcctg | tgactacgac | cagcaacgta | 120 |
| ccc:ccagcc | acagccccgg | tccagcctcc | tccaccactc | acgcacagga | tcccactccg | 180 |
| gccccggcca | cggaaccagc | tccaggccga | taa | 213 |
<210>2 <211 >525
| <212> DNA <213>ľudská | ||||||
| <400> 2 | ||||||
| a;cgcgccca | gccccactga | gaagaatgcc | gcgaccacga | ccagcagcgc | accctccagc | 60 |
| cacagccccg | gctcajgcccc | ccccaccacc | cagggacagc | acgtcacccc | ggccccggcc | 120 |
| acggaaccac | cctcacgtcc | agctgccacc | tggggacagg | atgccacctc | ggccccaccc | ISO |
| accaggccag | ccccgggccc | caccaccccg | ccagcccacg | acgccacctc | agccccggac | 240 |
| aacaagccag | ccccgggaag | caccgctcca | ccagcacacg | gcatcacctc | gcccccgcat | 300 |
| accaggccgg | ccccaagtag | caccgccccc | cccgcccatg | ccgtcacatc | tgccccggac | 360 |
| aacaggcccg | caccgcgcag | cacagcaccg | Ccagtacaca | acgttactag | tgccccaggc | 420 |
| cczgccagcg | gcccagcccc | tactccagcg | cacaacggca | cctccgcgcg | cccgaccaca | 480 |
| accccagcga | gcaagagcac | cccaccctca | attcccagct | gataa | S25 |
<210>3 <211 >654 <212> DNA <213> ľudská <400> 3
| atgggcccag | ctcctacccc | ggtccacaac | cgcacctctg | ccagggctac | cacaacccca | 60 |
| gccagcaaga | gcactccatt | ctcaattccc | agccaccact | ctgatactcc | taccaccctt | 120 |
| gccagccata | gcaccaagac | tgatgccagt | agcactcacc | atagcacggt | acctcctctc | 180 |
| acctccccca | atcacagcac | ttctccccag | ttgtctactg | gcgtctcttt | ccttttcctg | 240 |
| tcttttcaca | tctcaaacct | ccagtctaat | tcctctctgg | aagatcccag | caccgactac | 300 |
| taccaagagc | tgcagagaga | catttctgaa | atgtttttgc | agatttataa | acaagggggc | 360 |
| ttcctgggcc | tcCccaatat | taagttcacg | ccaggatctg | tggtggtaca | attgactctg | 420 |
| gccctccgag | aaggtaccat | caatgtccac | gacgtggaga | cacagttcaa | tcaatataaa | 430 |
| acgaaagcag | cctctcgata | taacctgacg | atctcagacg | tcagcgtgag | tgatgtgcca | 540 |
| cccccttcct | ctgcccagtc | tggggceggg | gtgccaggct | gggccatcgc | gctgctggtg | 600 |
| cccgtccetg | ttctgattgc | cctggccatt | gtctatctca | ttgccttccg | ataa | 654 |
r r r e
-21 <210>4 <211 >285 <212> DNA <213> ľudská <400>4
| atccccgegc | tgcccCgtgC | tctggttgcg | ctcgccattg | tctatctcat | tgccttcgct | 60 |
| gcccgtcagG | gccgccgaaa | gaactacggg | cacccggaca | tctttccagc | ccgggatacc | 120 |
| caccatccca | cgagcgagta | ccccacctac | cacacccacg | ggcgctatgt | gccccctagc | 180 |
| agcaccgatc | gcacccccta | tgagaaagct | tctgcaggta | atggtggcag | cagcctctct | 240 |
| Cacacaaacc | cagcagccgc | agccacctct | gccaacttgt | oataa | 235 |
| <210>5 <211> 1371 | |||||
| <212> DNA | |||||
| <213> ľudská | |||||
| <400> 5 | |||||
| atgacaggcc cccgtcacgc | aagccctacc | ccaggtcgag | aaaaggagac | ctcggccacc | 60 |
| cacagaagcc c ag —gcccag | ccccaccgag | aagaacgccg | ccagcacgac | cagcaccgca | 120 |
| c:ccccac;c acagccccgg | cccacgcccc | cccaccaccc | acggacagga | cgccaccctg | 180 |
| gcccccgcca cggaaccagc | cccaggctca | gctgccaccc | ggggacagga | tcecaccccg | 240 |
| gtcccagtca ccaggccagc | cctgggctcc | accaccccac | cagcccacga | cgccacctca | 300 |
| cccccggaca acaagccagc | cccgggaagt | accgccccac | cagcacacgg | cgctacctcg | 360 |
| cccccggaca ccaggccgcc | cccaggtagc | accgcccctc | ccgcccatcc | tcccacatcc | 420 |
| cccccggaca acaggcccgc | atcgcgcagc | acagcaccgc | cagcacacaa | cgttactact | 480 |
| eccccagccc ccgccagcgg | cccagcctct | actccggccc | acaacggcac | ccccgcgcgc | 540 |
| gccaccacaa ccccacccag | caagaccact | ccatcctcaa | tccccaccca | ccactcccat | 500 |
| actcctacca czz.^zzzzz | ctataccatt | aacaccgact | ct=ct=cc=t | tcaccatagc | í □: |
| a:=::a:::c | ctccaaccac | acaacííc'c | zzzs.=zzzzc | taccggggcc | . 2 v |
| tctctctctt cctccccctc | tcacatttca | aacctccact | ttaattcctc | tccggaagat | 7SC |
| cccaccaccg accaccacca | agacctgcag | acagacactt | ctgaaatgtt | tttgcacatt | 840 |
| tataaacaac ccagttttct | gcccctctcc | aacactaact | tcaggccagg | atctgcggtc | 900 |
| gcacaatcaa ctcccgcctC | ccgagaaggt | accatcaacc | tccacgacgc | ggagacacag | 960 |
r r
| cccaaccacc | ataaaaccca | accagcctct | ccaCataacc | tgacgatccc | acaccccagc | 1020 |
| gcgagccacg | tcccattCcc | tttcCctgcc | cagCctggcg | cCgggctgcc | acgctggggc | 1080 |
| atcgcgccgc | tcgcgctggc | ccgcgttccg | cccgcgccgg | ccattgccca | tcccattgcc | 1140 |
| ccggccgccc | gtcagcgccg | ccgaaagaac | tacgggcagc | tggacatctc | tccagcccgg | 1200 |
| gacaccCacc | atcctatcag | cgagtacccc | acctaccaca | cccaCcggcg | ctatgtgccc | 1260 |
| cccagcagca | ccgaccgcag | cccccatgag | aaggttcccg | caggtaaccg | cggcagcagc | 1320 |
| cccccecaca | caaacccagc | agtggcagcc | acttctgcca | actcgcgata | a | 1371 |
<210>6 <211 >369 <212> DNA <213> ľudská <400> 6
| atgcagatct | tcgtgaagac | cctgactggc | aacaccaCca | cCcCccaagC | ggagccgagC | 60 |
| gacaccaccg | agaacgccaa | ggcaaagacc | caagacaacg | aaggcacccc | CccCcaccag | 120 |
| cagaggccca | tcCCCgcagg | caagcagccg | gaacaCgccc | gcacccCCCc | cgaccacaac | ISO |
| atccagaaag | agcccacccc | gcacccggcg | ccccgcccca | gagccccgac | gcacggcagc | 240 |
| cccgcatggc | tgecccccgt | ctcgcccgcg | aaaagaaaaa | ccaccccggc | gcccaacacc | 300 |
| caaaccgccc | ctcccccccc | gccggccgac | tcaccaaccc | agcccccacg | acacgCCCcc | 360 |
| cgaggaccc | 369 |
<210>7 <211 >579 <212> DNA <213> ľudská <400> 7 atgcagaccc tcgcgaagac cccgacccgc aagaccacca cccccgaagc ggagccgagC 60 gacaccaccg agaatgccaa ggcaaagacc caagacaacg aaggcacccc ccccgaccag 120 cagaggccca cccccccagg caagcagccg gaagaccgcc gcaccccccc Cgaccacaac 130 acccagaaac agcccacccc gcaccccccg ccccccccca gaggcccgag gcacggcagc 240
-23SS^Scacggc cgccccccgc cccgccggcg aaaagaaaaa ceaccccggc ccccaacacg 300 caaaccgccc ccecccgcgc gccggccgac ccaccaacgc agccggcacg acaggccccc 360 caaggaccca caggccccgg ccacgcaagc Cccaccccag ccggagaaaa ggagacttcg 420 gccacccaga gaagcccacc ccccagcccc accgagaaga acgccgcgag cacgaccacc 480 agcgcacccc ccagccacag ccccggccca ggccccccca ccacccagca acacgacccc 540 accccggccc cggccacgga accagcccca agccgacaa 579 <210>8 <211 >891 <212> DNA <213> ľudská <400> 8
| aCccagaCcC | ccgcgaagac | cccgaccggc | aagaccatca | ctctcgaagC | ggagccgagC | 60 |
| gacaccactg | agaacgccaa | ggcaaagacc | caaaacaagg | aaggcatccc | tčctgaccag | 120 |
| cagaggccca | cccttgcagg | caagcagcCg | gaagaCcgcc | gcactctttc | CgacCacaac | 180 |
| acccagaaag | agcccacccc | ccacccggcg | ccccgcccca | gaggcgggag | gcacggcagt | 240 |
| ggcgcacggc | cgCtgcccgc | cccgccggcg | aaaagaaaaa | ccaccctggc | gcccaatacg | 300 |
| caaaccgccc | ctccccacgc | gccggccgac | tcactaacgc | agccggcacg | acacgccccc | 360 |
| cgaggatccg | tgcccagctc | tacegacaag | aaCgctgcga | gCaCgaccac | caccgtacCc | 420 |
| cccagccaca | gccccggctc | aggctcctcc | accacccagg | gacaggatgc | cactctcccc | 480 |
| ccggccacgg | aaccagcccc | aggctcagcC | cccacccggg | gacaccaCgC | caccCcggtc | 540 |
| ccagccacca | ggccagcccC | cggctccacc | accccgccag | cccaccatgt | caccccagcc | 600 |
| ccggacaaca | agccagcccc | gggaagcacc | cccccaccag | cacacggcgC | taccccggcC | 660 |
| ccggatacca | ccccggcccc | aggtagcacc | gccccccccg | cccacggcgC | cacatctgcc | 720 |
| ccggacaaca | cgcctgcaCt | cggcagcaca | gcaccgccag | cacacaacgc | caccacCgcc | 780 |
| CcaggcCccg | ctagcggctc | agcccccacc | ccggcgcaca | acggcaccCc | cgcgcgcgcg | 840 |
| accacaaccc | cagcgagcaa | gagcacccca | ttcecaattc | ccagctgata | a | e9i |
<210> 9 <211> 1020 <212> DNA <213> ľudská
-24+ r r f “ e Iť e r r r · <
r r - r- e i - t <400>9
| atgcagatct | tcgtgaagac | cctgactcgt | aagaccatca | ctctcaaagt | cgacccgagt | 60 |
| cacaccattg | agaatgtcaa | ggcaaagatc | caagacaagg | aaggcatccc | Ccctcaccag | 120 |
| cagaggctca | tctttgcagg | caagcagcca | gaagatcgcc | ccactctttc | tgactacaac | ISO |
| atccagaaag | agtccaccct | gcacctggtg | ctccgtctca | gagctcggag | gcacggtagt | 240 |
| ggtgcatggc | tgttgcccgt | ctcgccggtc | aaaagaaaaa | ccaccctggc | gcccaatacg | 300 |
| caaaccgcct | ctccccgcgc | gttcgccgat | tcattaatgc | agctagcacg | acaggtttcc | 360 |
| ccaggatccg | gctcagcttc | tactccggcc | cacaacggca | cctctgccag | ggccaccaca | 420 |
| accccagcca | ccaagagcac | tccactctca | acccccagcc | accactctga | tacccctacc | 480 |
| acccttccca | cccatagcac | caagactgat | cccagcagca | cccaccatag | cacagtacct | 540 |
| cctctcacct | cccccaatca | cagcacttct | ccccacctgc | ccactggggc | ccctttctct | 600 |
| ttCCtgtCtt | ttcacatttc | SaäCZZCCä^ | tttaattcct | ctctggaaga | tc:cagca:c | 650 |
| gactactacc | aaaagctgca | gagagacacc | tctgaaatgt | ttttccagac | ttataaacaa | 720 |
| gggggttttc | tcgccctctc | caacactaag | ttcaagccag | gatctgcggt | cgtacaattg | 780 |
| actctggcct | cccgagaagc | taccatcaat | gtccaccacg | cggagacaca | gctcaaccag | 840 |
| tataaaacgg | aagcagcctc | tcgatacaac | ctaacgatcc | cagacgtcag | cgcgagtgat | 900 |
| gtgccatttc | ctttctctgc | ccagcccgcg | cctgcggccc | caggcCcggg | catcgcgccg | 960 |
| ctggcgctgg | tccgtgctcc | ggccccgctg | gccacccccc | atctcaccgc | cctgtgataa | 1020 |
<210> 10 <211 >651 <212> DNA <213> ľudská
| <400> 10 | ||||||
| atgcagatct | tcgtgaagac | cctgactcgt | aagaccatca | ctctccaact | cgacccgagt | 60 |
| cacaccaccg | agaatgtcaa | ggcaaagatc | caagacaagg | aaggcatccc | tcctcaccag | 120 |
| cagaggctca | tctctgcagg | caagcacctg | gaagatggcc | ccactctttc | tgactacaac | 180 |
| atccagaaag | agtccaccct | ccacccggtg | ctccgtctca | caggtgggag | gcacggtagt | 240 |
| ggtgcatggc | tgttgcccgt | ctcgccggta | aaaagaaaaa | ccaccctggc | gcccaatacg | 300 |
| caaaccgcct | ctccccgcgc | gttggccaat | tcattaatgc | agctggcacg | acaggtttcc | 360 |
| cgaggatccc | tggtgecggt | ccccgttctg | gttgcgctcg | ccattgtcta | tctcattgcc | 420 |
| ttggctgtct | gtcagtgccg | ccgaaagaac | taccgccagc | tggacatctt | tccagcccgg | 480 |
| catacctacc | accctatgag | cgagcacccc | acctaccaca | cccacgagcg | ctatgtgccc | 540 |
| cctaccagta | ccgatcctag | cccctataag | aacctttctg | cacctaatcc | tcacaccacc | 600 C 5 1 |
| caaacccag»- | agtggcagcc | acctccgcca | a |
<210> 11 <211> 1737 <212> DNA <213> ľudská r ·-25<400> 11
| atgcagacct | tcgtgaagac | cctgactggt | aagaccatca | ctctcgaagt | cgagccgagt | 60 |
| cacaccattg | agaatgccaa | cgcaaagatc | caagacaagg | aagccatccc | tcctgaccag | 120 |
| cagaggctca | tctttgcagg | caagcagccg | caagatggcc | gcaccccctc | tgaccacaac | 180 |
| atccagaaag | agcccacccc | gcacctggcg | ccccgcccca | gacgcgggag | gcacggcagt | 240 |
| ggcgcatcgc | tgtcgcccgt | cccgctggcg | aaaagaaaaa | ccaccctccc | gcccaatacg | 300 |
| caaaccgcct | ctccccacgc | cctggccgat | tcattaatge | agccggcacg | acaggcttcc | 360 |
| cgaggaccca | caggccccgg | ccacgcaagc | tccaccccag | ctcgagaaaa | ggagacttcg | 420 |
| gccacccaga | gaagttcagt | gcccagcccc | actgagaaga | acgctgtgag | CaCcaccacc | 430 |
| agcgcacccc | ccagccacag | ccccggttca | gccccctcca | ccactcaggg | acacgatctc | 540 |
| accctgcccc | cggccacgga | accagcccca | ggttcagcĽg | ccacccgggg | acaggacgcc | 600 |
| accccggtcc | cagccaccag | gccagccccg | ggccccacca | ccccgccagc | ccacgacgcc | 660 |
| accccagccc | cagacaacaa | cccagccccg | ggaagcaccg | ccccaccagc | acacggcgcc | 720 |
| accccggccc | cggacaccag | gccggcccca | ggcagtaccg | ccccccccgc | ccacggcgtc | 780 |
| acatccgccc | cggacaacac | ccctgcaccg | ggtagcacag | caccgccagc | acacaacgct | 840 |
| accagtgccc | caggccccgc | cagccgctca | gcccccaccc | cggcgcacaa | cggcaccccc | 900 |
| gcgcgcgcga | ccacaa'cccc | accgagcaag | agcaccccac | ccccaatccc | cagccaccac | 960 |
| tctgatactc | ceaccaccct | tgccagccat | agcaccaaga | ccgacgccáa | tagcactcac | 1020 |
| cacagcacgg | cacctccccc | cacccccccc | aaccacagca | ccccccccca | gccgcctacc | 1080 |
| gcggcccctc | ccccttccct | gtctctccac | ačtccaaacc | tccagtttaa | tccccctctg | 1140 |
| gaagatccca | gcaccgacta | ccaccaagag | ccgcagagag | acatccctga | aatgcctccg | 1200 |
| cagatccata | aacaagggcg | ccccctgggc | c:c;ccaata | ttaagttcag | cccaggatct | 1250 |
| gcggcggcac | aa:cgac::c | cgccccccga | gaaggcacca | ccaacgccca | cgacgcgcag | 1320 |
| acacagttca | atcagtataa | aacggaagca | gcctcccgat | ataacctgac | gateteagae | 13S0 |
| etcagcgtga | gcgatgtgcc | atttccctcc | tctgcccagt | ctggggctgg | agcgccsggc | 1440 |
| tggcgcatcg | cgctgctggt | gctggtctgt | gttctggttg | cgctggccat | tgtctatctc | 1500 |
| attgccttgg | ccgtctgtca | gtgccgccga | aagaactacg | ggcagctgga | catctttcca | 1560 |
| gcccgggata | cctaccatcc | tatgagcgag | taccccacct | accacaccca | tcggcgctat | 1620 |
| gcccccccta | gcactaccga | ccgcagcccc | tatcagaagg | tttctgcagc | taatcgtgcc | 1680 |
| agcagcccct | cttacacaaa | cccaccagtg | gcagccacct | ctgccaactt | gtcataa | 1737 |
<210> 12 <211 >4905 <212> DNA <213> ľudská <400> 12
| ccaggaagct | cctctgtgtc | ctcataaacc | ctaacctcct | ctacttgaga | cgacattcca | 60 |
| accataggct | gcccatccac | cctctgtgtc | ctcctgctaa | ttaggtcact | taacaaaaac | 120 |
| caaactgggt | agggcttttt | cacacaccgc | tttctaaggg | taattttaaa | atatctggga | 130 |
| agccccttcc | actgctgcgt | tccagaactg | ttcgtaaaca | gcccacaaat | gtcaacagca | 240 |
| gaaacataca | agctgtcagc | tttgcacaag | ggcccaacac | cctgctcatc | aagaagcact | 300 |
| ccggttgctc | tgttagtaat | gtccaaaaca | ggaggcacat | tttccccacc | tctgtaggtt | 360 |
| ccaaaatatc | tagtgttttc | atttttactt | cgatcaggaa | cccagcactc | cactcgataa | 420 |
| geattatcct | tatccaaaac | agccttgtcg | tcagcgtcca | tctgctgact | gtcaactata | 4S0 |
| ccattttttg | gggttacagt | ttgagcagga | tatttggtcc | tgtagtctgc | taacacaccc | 540 |
| tccagctcca | aaggttcccc | accaacacca | aaaaaacgaa | aatttgaccc | ttcaatggct | 600 |
| ttcccagcac | caccctcatg | agtcttttgt | gtccccgaat | gcaagtetaa | catagcagtc | 660 |
| accccaataa | cctcagtttt | aacagcaaca | gccccccaca | tcaaaatact | tccacacgtt | 720 |
| aactcctcat | ttaaattacc | caaaggaatt | cttgaagacg | aaagggccec | gtcatacgcc | 7S0 |
| tattttcata | ggtcaatgtc | atgataataa | tggcttctta | gacgtcaggt | gccacetttc | 840 |
| cgggaaatgt | ccgcggaacc | cctatttgtt | tatttttcta | aatacattca | aatatgtatc | 900 |
| cgctcatgag | acaataaccc | tgataaatgc | ttcaataata | tcgaaaaagg | aagageatca | 960 |
| g t a t LcScCä | tctccgtgtc | gcccttactc | cccttcccgc | ggcatettgc | cttcctgttt | 1020 |
| ttcctcaccc | agaaacgctg | ccgaaagtaa | aagacgccga | agaecagetg | cgtgcacgag | 1030 |
| tgggttacat | cgaactggat | cccaacagcg | gtaagatcct | tgagagtttt | cgccccgaag | 1140 |
| aacgttttcc | aatgatgagc | acttttaaag | ttcccccatg | tggcgcggta | Ctatcccgtc | 1200 |
| tccacgccgg | gcaagagcaa | cccggccgcc | gcacacacca | ttctcagaat | gacttggttg | 1260 |
| agtactcacc | agtcacagaa | aagcatctta | cggatggcat | gacagtaaga | gaattatcca | 1320 |
| gtgctgccac | aaccatgagc | gataacactg | cggccaacct | actcccgaca | accatcggag | 1380 |
| gacccaacga | gctaaccgct | tctctgcaca | acatcgggga | tcatgcaact | cgccttgatc | 1440 |
| gttgggaacc | ggagctgaat | gaagccatac | caaacgacga | gcgtgaeacc | acgatccctg | 1SC0 |
| cagcaatggc | aacaaccttg | cgcaaactat | taaccgccga | actactcact | ctaccctccc | 15 = 0 |
| ggcaacaatt | aatagactgg | atggaggcgg | acaaacctgc | aagaccactt | ctgcgcccgg | 1620 |
| cccttcccgc | cggccggtct | attgctgata | aacctgcagc | cggtgagcgt | ccctctcgcc | 1630 |
| gtatcattgc | agcaccaggg | ccagatcgca | agccctcccg | tatcgcagtc | atctacacga | 1740 |
| cggggagcca | ggcaactatg | gatcaacgaa | atagacagat | egetgagata | ggtgcctcac | 1800 |
| tgattaacca | ttggtaactg | tcagaccaag | tttactcata | tatactttag | attgattcaa | 1860 |
| aacctcattt | ttaatttaaa | aggatccagg | egaagatcct | tctcgataat | cccatgacca | 1920 |
| aaatccctca | acgtgagcct | tccctccact | caccgtcaga | ccccgtagaa | aagatcaaag | 1930 |
| catcttcttg | cttctccccg | taatctcctg | cctgcaaaca | aaaaaaccac | 2 04 0 | |
| cgctaccacc | ttgccggatc | aagagcxacc: | ccgaacgtaa | M _ w w | ||
| ccggccccag | cagag=gcäc | azaccaaa.a | c-gccctzcc- | 21í: | ||
| accacttcaa | gaactcccca | ccaccgccca | cat^acctcgc | cctgccaatc | c^gcuäcc&g | 222C |
| tggctgctgc | cagtggcgat | aactcgtgtc | ttacccggct | cgactcaaga | cgatagttac | 2260 |
| cggataaggc | gcagcgctcg | ggctgaacgg | cgggetegtg | cacacagccc | agcttggagc | 2340 |
| gaaccacci.a | caccgaactg | agatacctac | agegegaget | aegagaaagc | gccacacttc | 2400 |
| ccgaagcgag | aaaggcggac | aggtatccgg | taagcggcag | ggtcggaaca | ggagagegea | 2460 |
| cgagcgagct | tccaggggga | aacgcccgct | atctttatag | tcctgtcggg | tttccccacc | 2520 |
| tccgactcaa | gcgccgatct | ttgtgatgct | cgtcacgggg | gcggagccta | tcgaaaaacg | 2580 |
| ccagcaacgc | ggccttttca | ccgctcctgg | ccttctgctg | cccctttgct | cacatgttct | 2640 |
| ttcctgcctt | atcccctgat | tctgtggata | accgtattac | cccctttgag | tgagctgata | 2700 |
r * · r r r
| ccgctzcgcca | cagccgaacg | accgagcgca | gcgagccagt | gagcgaggaa | gcggaagagc | 2760 |
| gcccgacgcg | gcatcccctc | ctcacgcatc | tgtgcggcac | ttcacaccgc | atatcgcgca | 2820 |
| cccCcagtac | aacctgcGcc | gacgccgcat | £CCtä3CCCd | gtacacaatc | aatattcgcc | 23=0 |
| atcagccaCa | ttattcactg | gttatatagc | acaaaccaat | accggctatt | ggccatcgca | 2.-4 0 |
| tacgCtgtac | ccatatcata | acatgtacac | ttacaccggc | Ccacgtccaa | cattaccgcc | 3000 |
| acgccgacat | tgaccaccga | ctacctacca | acagcaazca | attacggcgt | cattagctca | 3060 |
| cagcccacac | accgagcccc | gcgccacaca | acccacggca | aacggcccgc | ctggccgacc | 3120 |
| gcccaacgac | ccccgcccac | tgacgtcaac | aatgacgcat | gcccccatag | taacgccaať | 3180 |
| agggacCCCc | caccgacgcc | aacgggcgga | gcacctacgg | taaactgccc | acttgccagt | 3240 |
| acaccaagcg | tatcacatgc | caagcacgcc | ccccatcgac | gtcaatgacc | gtaaatcgcc | 3300 |
| cccccagcac | tacgcccagc | acacgacctt | acgggaccct | cctacctgcc | agtacaccta | 3360 |
| cgcatcagtc | atcgctatta | ccatggtgat | gcggttCCgg | cagtacatca | atgggcgtgg | 3420 |
| acagcggcct | gactcacggc | catttccaag | tctccacccc | attgacgtca | atgggagctc | 3480 |
| gcrccggcac | caaaaCcaac | cagactCtcc | aaaatgtcgt | aacaactccg | ccccatcgac | 3540 |
| claaatgggc | cgcaggcgcg | tacggcggga | agtctatata | agcagagccc | ctttactgaa | 3500 |
| ccgccagacc | gcctggagac | gccatccacg | ccccccccac | ctccatagaa | gacaccggga | 3660 |
| ccgaCccagc | cCccgcggcc | gggaacggtg | catcggaacg | cggattcccc | ctgccaagaa | 3720 |
| agcccgccca | gaacccggga | gagctcctga | caacctcagg | gtgagtccgg | ccacccctga | 3780 |
| ccccccCCCc | ccctccacca | ttgcaaaatc | catgtcacac | cgagggegca | aagctttcag | 3840 |
| agzgccgccc | agaatggcaa | gatgcccctt | gcatcaccat | ggacccccac | gacaatctcg | 3900 |
| ccccccccac | cccccacccc | gctgacaacc | accgccccct | cttattttct | tcccaccccc | 3960 |
| cgcaaccccc | ccgttaaact | tcagcctgca | tccgcaacga | atttttaaat | tcacccccgt | 4020 |
| ccacccgcca | gattgtaagc | actctctcta | atcacccctc | tttcaacgca | accacggcat | 4080 |
| accacaccgc | accccagcac | agctttagag | aacaaccgtc | ataattaaat | gataaggtag | 4140 |
| aacacccccg | cacacaaacc | ccggccggcg | cggaaacacc | cccaccggca | gaaacaacta | 4200 |
| caccccggcc | accaccccgc | ccccccctcc | acggccacaa | tgatatacac | tgcccgagac | 4260 |
| gagcacaaaa | tactccgagc | ccaaaccggg | cccccccgct | aaccatgttc | acgcccccct | 4320 |
| c:::cccc:a | cagcccccgg | gcaacgtgcc | cgccgccccg | ccgcctcatc | attttgccaa | 4380 |
| agaacccacc | ccccaggcgc | aggctgccca | ccagaaggcg | gcggccggtg | Cgcccaacgc | 4440 |
| cccggcccac | aaacaccacc | aagacccccc | cccccccgcc | aaaaattatg | gagacaccat | 4500 |
| gaagcccccc | gagcatccga | cccccggcca | ataaaggaaa | tttatcttca | Ctgcaatagt | 4560 |
| gccccggaae | cccccgcgcc | ccccacccgg | aaggacacac | gcgagcgcaa | atcattcaaa | 4620 |
| acaccagaac | gagcacccgg | cccagagccc | ggcaacacac | gccacatgcc | ggccgccata | 4580 |
| aacaaacgcg | gctaCaaaga | ccccaccagt | atacgaaaca | cccccccgct | gcccactccc | 4740 |
| caccccacag | aaaacccccg | acccgagccc | acacccccct | tatactctgt | ttCccgctat | 4800 |
| aacaxcccxa | aaaccttcct | actagccaga | cctttcctcc | 4 3 60 |
<210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
r -28<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 13 gatcggatcc acaggttctg gtcatgcaag c 31 <210> 14 <211 >41 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 14 gatctctaga aagcttatca acctgaagct ggttccgtgg c 41 <210> 15 <211 >36 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 15 gatcggatcc gtgcccagct ctactgagaa gaatgc 36 <210> 16 <211 >49 <212> DNA <213> umelá sekvencia • r
-29<220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 16 gatctctaga aagcttatca gctgggaatt gagaatggag tgctcttgc 49 <210> 17 <211 >40 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 17 gatcggatcc ggctcagctt ctactctggt gcacaacggc 40 <210> 18 <211 >45 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 18 gatctctaga aagcttatca caaggcaatg agatagacaa tggcc 45 <210> 19 <211 >38 <212> DNA <213> umelá sekvencia
-30<220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 19 gatcggatcc ctggtgctgg tctgtgttct ggttgcgc 38 <210> 20 <211> 41 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 20 gatctctaga aagcttatca caagttggca gaagtggctg c 41 <210> 21 <211 >34 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 21 gatctctaga atgacaggtt ctggtcatgc aagc 34 <210> 22 <211 >39 <212> DNA <213> umelá sekvencia f ·
-31 <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 22 gatctctaga atggtgccca gctctactga gaagaatgc 39 <210> 23 <211 >43 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 23 gacctctaga atgggctcag cttctactct ggtgcacaac ggc 43 <210> 24 <211> 41 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 24 gatctctaga atgctggtgc tggtctgtgt tctggttgcg c 41 <210> 25 <211 >26 <212> DNA <213> umelá sekvencia
-32<220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 25 ggcggtggag cccggggctg gcttgt 26 <210> 26 <211 >22 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 26 aacctgaagc tggttccgtg gc 22 <210> 27 <211 >26 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 27 gtgcccagct ctactgagaa gaatgc 26 <210> 28 <211 >29 <212> DNA <213> umelá sekvencia
-33<220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 28 gctgggaatt gagaatggag tgctcttgc 29 <210> 29 <211 >30 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 29 ggctcagctt ctactctggt gcacaacggc 30 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 30 caaggcaatg agatagacaa tggcc 25 <210> 31 <211 >27 <212> DNA <213> umelá sekvencia
-34<220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 31 ctggtgctgg tctgtgttct ggttgcg 27 <210> 32 <211 >40 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 32 gatctctaga atgcagatct tcgtgaagac cctgactggt 40 <210> 33 <211 >68 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 33 tcaccagcga gacgggcaac agccatgcac cactaccgtg cctcccacct ctgagacgga 60 gcaccagg 68 <210> 34 <211 >66 <212> DNA <213> umelá sekvencia f r
-35r r r r f t r t* <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 34 cctccgtctc agaggtggga ggcacggtag tggtgcatgg ctgttgcccg tctcgctggt gaaaag <210> 35 <211 >35 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400 35 gatcggatcc tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgc
Claims (15)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Farmaceutický prostriedok, ktorý spolu s vhodnými excipientami a adjuvansami, obsahuje jeden alebo viac odlišných cicavčích expresných plazmidov, z ktorých každý zahŕňa sekvenciu kódujúcu odlišný fragment mucinového proteínu MUC-1, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že sekvencia:a) v prípade, že kóduje viac ako jeden MUC-1 fragment, je vybraná zo skupiny sekvencií, ktoré majú 200 až 700 nukleotidov, ktoré na seba nadväzujú, alebo sa prekrývajú v oblasti 50 až 150 nukleotidov na zodpovedajúcich 3' alebo 5’ koncoch, alebob) v prípade, že kóduje len jeden fragment, je to fragment uvedený na obrázku 5.
- 2. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že obsahuje najmenej dva odlišné plazmidy.
- 3. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že obsahuje najmenej tri odlišné plazmidy.
- 4. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že obsahuje najmenej štyri odlišné plazmidy.
- 5. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že obsahuje najmenej dva odlišné plazmidy, ktorých sekvencie kódujúce MUC-1 fragment sú vybrané zo sekvencií uvedených na obrázkoch 1, 2, 3 a 4.
- 6. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že obsahuje štyri odlišné plazmidy, ktorých sekvencie kódujúce MUC-1 fragment sú vybrané zo sekvencií uvedených na obrázkoch 1, 2, 3 a 4.
- 7. Farmaceutický prostriedok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že pred 5’ koncom sekvencie kódujúcej MUC-1 r · p »-37fragment sa nachádza sekvencia uvedená na obrázku 6, ktorá kóduje ubiquitín a Lacl časť Escherichia coli.
- 8. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že sekvencia nachádzajúca sa pred 5’ koncom sekvencie kódujúcej MUC-1 fragment, ktorá kóduje ubiquitín a Lacl časť z Escherichia coli, je vybraná zo sekvencií uvedených na obrázkoch 7, 8, 9 a 10.
- 9. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že obsahuje zmes odlišných plazmidov, z ktorých každý nesie konštrukty znázornené na obrázkoch 7, 8, 9 a 10.
- 10. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vy z n a č u j ú c i sa tým, že obsahuje konštrukt znázornený na obrázku 11.
- 11. Farmaceutický prostriedok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že sekvencia kódujúca MUC-1 fragment je začlenená do pMRS30 expresného vektora opísaného na obrázku 13.
- 12. Farmaceutický prostriedok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 11, vyznačujúci sa tým, že obsahuje aj cytokín alebo plazmid kódujúci cytokín.
- 13. Plazmid, ktorý sa skladá z pMRS30 expresného vektora znázorneného na obrázku 13, ktorý je fúzovaný so sekvenciou kódujúcou MUC-1 fragment, ktorá je vybraná zo sekvencií uvedených na obrázkoch 1,2, 3,4 a 5.
- 14. Plazmid, ktorý sa skladá z pMRS30 expresného vektora znázorneného na obrázku 13, ktorý je fúzovaný s konštruktom vybraným z konštruktov uvedených na obrázkoch 7,8, 9,10 a 11.-3815. DNA molekula vybraná z DNA molekúl uvedených na obrázkoch 7, 8, 9, 10a 11.
- 16. Použitie DNA molekuly podľa nároku 15 na výrobu lieku s protinádorovým účinkom.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT1998MI002330A IT1303683B1 (it) | 1998-10-30 | 1998-10-30 | Composizione farmaceutiche ad azione antitumorale contenente dnacodificante per frammenti di una proteina antigenica. |
| PCT/EP1999/007874 WO2000025827A2 (en) | 1998-10-30 | 1999-10-18 | Dna molecules encoding muc-1 and use thereof in tumor vaccination |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK5712001A3 true SK5712001A3 (en) | 2002-04-04 |
Family
ID=11380969
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK571-2001A SK5712001A3 (en) | 1998-10-30 | 1999-10-18 | Pharmaceutical composition |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1124956A2 (sk) |
| JP (1) | JP2002528519A (sk) |
| CN (1) | CN1324406A (sk) |
| AR (1) | AR020927A1 (sk) |
| AU (1) | AU1152200A (sk) |
| BG (1) | BG105458A (sk) |
| BR (1) | BR9914892A (sk) |
| CA (1) | CA2348745A1 (sk) |
| CO (1) | CO5231134A1 (sk) |
| CZ (1) | CZ20011521A3 (sk) |
| EA (1) | EA200100395A1 (sk) |
| HU (1) | HUP0103784A2 (sk) |
| IT (1) | IT1303683B1 (sk) |
| MX (1) | MXPA01004186A (sk) |
| PE (1) | PE20001287A1 (sk) |
| PL (1) | PL348156A1 (sk) |
| SK (1) | SK5712001A3 (sk) |
| TR (1) | TR200101141T2 (sk) |
| WO (1) | WO2000025827A2 (sk) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6548643B1 (en) | 1994-11-16 | 2003-04-15 | Austin Research Institute | Antigen carbohydrate compounds and their use in immunotherapy |
| JP2003533181A (ja) * | 2000-02-01 | 2003-11-11 | ジ・オースティン・リサーチ・インスティテュート | ムチン−１誘導抗原および免疫療法におけるその使用 |
| KR20030068536A (ko) * | 2000-09-11 | 2003-08-21 | 다나-파버 캔서 인스티튜트 | Ｍｕｃ1 세포외 도메인 및 이로부터 유래된 암 치료조성물과 방법 |
| CA2432276A1 (en) | 2000-12-22 | 2002-08-01 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Regulation of cell growth by muc1 |
| ES2345200T3 (es) * | 2003-03-24 | 2010-09-17 | The Scripps Research Institute | Vacunas de adn contra el crecimiento tumoral y procedimientos de utilizacion de las mismas. |
| US7696306B2 (en) * | 2003-07-11 | 2010-04-13 | Board of Agents of the University of Nebraska | Compositions and methods for preventing or treating cancer |
| US8129506B2 (en) | 2003-10-24 | 2012-03-06 | Genzyme Corporation | Modulation of the interaction of MUC1 with MUC1 ligands |
| US7972870B2 (en) | 2007-02-02 | 2011-07-05 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods and compositions relating to the regulation of MUC1 by HSF1 and STAT3 |
| US7871784B2 (en) | 2007-02-02 | 2011-01-18 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods and compositions relating to the regulation of apoptosis by MUC1 and BH3-containing proapoptotic proteins |
| CN106279435B (zh) * | 2016-08-16 | 2019-06-07 | 新乡医学院 | 靶向VEGF与mucin1的抗肿瘤疫苗、编码基因、表达载体、表达工程菌及应用 |
| CN113321724B (zh) * | 2021-03-24 | 2022-02-01 | 深圳市新靶向生物科技有限公司 | 一种与食道癌驱动基因突变相关的抗原肽及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1262545B (it) * | 1993-10-25 | 1996-07-02 | Menarini Ricerche Sud S P A A | Sistema di espressione per linee cellulari eucariotiche |
| CA2282300C (en) * | 1997-02-24 | 2011-08-02 | Therion Biologics Corporation | Recombinant pox virus for immunization against muc1 tumor-associated antigen |
-
1998
- 1998-10-30 IT IT1998MI002330A patent/IT1303683B1/it active
-
1999
- 1999-10-18 CA CA002348745A patent/CA2348745A1/en not_active Abandoned
- 1999-10-18 SK SK571-2001A patent/SK5712001A3/sk unknown
- 1999-10-18 WO PCT/EP1999/007874 patent/WO2000025827A2/en not_active Ceased
- 1999-10-18 CZ CZ20011521A patent/CZ20011521A3/cs unknown
- 1999-10-18 EP EP99971329A patent/EP1124956A2/en not_active Withdrawn
- 1999-10-18 BR BR9914892-7A patent/BR9914892A/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-10-18 MX MXPA01004186A patent/MXPA01004186A/es unknown
- 1999-10-18 PL PL99348156A patent/PL348156A1/xx unknown
- 1999-10-18 EA EA200100395A patent/EA200100395A1/ru unknown
- 1999-10-18 TR TR2001/01141T patent/TR200101141T2/xx unknown
- 1999-10-18 JP JP2000579265A patent/JP2002528519A/ja active Pending
- 1999-10-18 CN CN99812745A patent/CN1324406A/zh active Pending
- 1999-10-18 HU HU0103784A patent/HUP0103784A2/hu unknown
- 1999-10-18 AU AU11522/00A patent/AU1152200A/en not_active Abandoned
- 1999-10-21 AR ARP990105316A patent/AR020927A1/es unknown
- 1999-10-22 PE PE1999001068A patent/PE20001287A1/es not_active Application Discontinuation
- 1999-10-29 CO CO99068636A patent/CO5231134A1/es not_active Application Discontinuation
-
2001
- 2001-04-20 BG BG105458A patent/BG105458A/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PE20001287A1 (es) | 2000-12-07 |
| HUP0103784A2 (hu) | 2002-02-28 |
| ITMI982330A1 (it) | 2000-04-30 |
| EP1124956A2 (en) | 2001-08-22 |
| WO2000025827A3 (en) | 2000-08-10 |
| PL348156A1 (en) | 2002-05-06 |
| MXPA01004186A (es) | 2002-06-04 |
| CN1324406A (zh) | 2001-11-28 |
| JP2002528519A (ja) | 2002-09-03 |
| BG105458A (en) | 2002-06-28 |
| ITMI982330A0 (it) | 1998-10-30 |
| BR9914892A (pt) | 2001-07-17 |
| AR020927A1 (es) | 2002-06-05 |
| WO2000025827A2 (en) | 2000-05-11 |
| CZ20011521A3 (cs) | 2001-10-17 |
| EA200100395A1 (ru) | 2001-10-22 |
| TR200101141T2 (tr) | 2001-09-21 |
| AU1152200A (en) | 2000-05-22 |
| CO5231134A1 (es) | 2002-12-27 |
| IT1303683B1 (it) | 2001-02-23 |
| CA2348745A1 (en) | 2000-05-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7762750B2 (ja) | ネオ抗原およびその使用 | |
| JP7491965B2 (ja) | ネオ抗原およびその使用方法 | |
| JP7244462B2 (ja) | ネオ抗原ワクチンによる併用療法 | |
| US20070298051A1 (en) | Adjuvants Of Immune Response | |
| TW202513579A (zh) | 新抗原及其用途 | |
| CN111533812B (zh) | 针对sars-cov-2病毒的dna疫苗及其用途 | |
| KR20210005046A (ko) | T-세포 유도 백신 조성물의 조합물 및 이의 용도 | |
| JP7712919B2 (ja) | マルチドメインタンパク質ワクチン | |
| US20220233666A1 (en) | Cancer vaccine | |
| CN114269357A (zh) | 新抗原组合物及其用途 | |
| SK5712001A3 (en) | Pharmaceutical composition | |
| KR101810840B1 (ko) | 암의 예방 및 치료용 msi-특이적 프레임쉬프트 펩티드(fsp) | |
| WO2019101062A1 (zh) | 重组疫苗及其应用 | |
| JP2021535730A (ja) | 複数の部位メガロウイルス（ｃｍｖ）抗原の発現のためのｍｖａベクター及びその使用 | |
| CN115819613A (zh) | 基于msln前体蛋白构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用 | |
| US12427191B1 (en) | SARS-CoV-2 fusion protein vaccine/regimen | |
| JP7513303B2 (ja) | 腫瘍免疫増強剤、その調製方法および適用 | |
| US20230233656A1 (en) | Breast Cancer Vaccine | |
| RU2805196C2 (ru) | Неоантигены и их применение | |
| RU2773273C2 (ru) | Неоантигены и способы их использования | |
| HK40050847A (en) | Neoantigens and uses thereof | |
| HK1120722A1 (en) | The use of immunogenic composition in preparing a response and enhance the use of the reagent kit for immune responses | |
| HK1120722B (en) | The use of immunogenic composition in preparing a response and enhance the use of the reagent kit for immune responses |