SK281956B6

SK281956B6 - Spôsob prípravy racemických alfa-substituovaných 4-metyltiomaslových kyselín

Info

Publication number: SK281956B6
Application number: SK376-97A
Authority: SK
Inventors: Olivier Favre-Bulle; Marie-Claude Bontoux; Denis Largeau; Andr� Ariagno
Original assignee: Rhone-Poulenc Nutrition Animale
Priority date: 1994-09-22
Filing date: 1995-09-19
Publication date: 2001-09-11
Also published as: PL319298A1; ES2126313T3; HUT77079A; SK37697A3; DE69506430D1; DK0782629T3; BR9509176A; CA2200100A1; PL180871B1; RU2144959C1; EP0782629A1; KR100398595B1; DE69506430T2; CN1077599C; ATE174059T1; UA48953C2; NZ292559A; US5814497A; FI971198A7; WO1996009403A1

Abstract

Opisuje sa spôsob prípravy uvedených kyselín enzymatickou hydrolýzou 4-metyltiobutyronitrilu pomocou nitrilázy mikroorganizmov Alcaligenes faecalis, Rhodococcus sp. HT 29-7 alebo Gordona terrae.ŕ

Description

Vynález sa týka použitia nitrilázy ako hydrolýzového katalyzátora na hydrolýzu nitrilovej skupiny na karboxylovú skupinu. Vynález sa presnejšie týka použitia nitrilázy zvolenej z množiny zahrnujúcej nitrilázy mikroorganizmov rodu Alealigenes faecalis uloženého pod číslom ATCC8750, Rhodococcus sp. HT 29-7 uloženého pod číslom FERM BP-3857 a Gordona terrae MA-1 uloženého pod číslom FERM BP-4535.

Doterajší stav techniky

Nitriláza z Alealigenes faecalis je opísaná napríklad v európskom patente EP 348901 a v japonskom patente JP 03 224 496, pričom obidva tieto patenty patria spoločnosti Asahi. V týchto patentových dokumentoch a najmä v európskom patentovom dokumente je opísané použitie nitrilázy na prípravu opticky aktívnych kyselín z racemických nitrilov. Výhodnými východiskovými nitrilmi sú a-substituované nitrily, ktoré majú alkylový reťazec obsahujúci výhodne 1 až 3 uhlíkové atómy alebo aromatickú skupinu. Príklad 11 uvedeného európskeho patentu opisuje hydrolýzu racemického nitrilu kyseliny mandľovej pôsobením mikroorganizmu Alealigenes faecalis, pričom kyselina R-(-)-mandľová sa získa v enantiomémom prebytku 91 %. Európsky patent 486289 a jeho americký ekvivalent, patent US 5 326 702 spoločnosti Nitto Chemical opisujú použitie mikroorganizmu Alealigenes sp. BC35-2 (FERM č. 11265 alebo FERM-BP-3318) na hydrolýzu nitrilu kyseliny mandľovej v prítomnosti siričitanu, pričom kyselina mandľová sa v tomto prípade získa v enantiomémom prebytku 98 %.

Patent JP 04 341 185 spoločnosti Asahi ešte opisuje prípravu a použitie nitrilázy z Alealigenes faecalis ATCC 8750 na riešenie problémov prípravy opticky čistých zlúčením z ich racemických nitrilov. Enantioselektívna nitriláza opísaná v uvedenom japonskom patente je schopná preferenčne hydrolyzovať ďalej uvedený 2-hydroxynitril so všeobecným vzorcom (I) na kyselinu 2-hydroxykarboxylovú s nasledujúcim všeobecným vzorcom (II)

OH R-C-CN (I) i H

OH • I

R—C—COOH(ll) H pričom v uvedených všeobecných vzorcoch (I) a (II) R znamená arylovú skupinu, ktorá je prípadne substituovaná, alebo prípadne substituovanú heterocyklickú skupinu. V uvedenom patente je uvedené, že hydrolýza nitrilu kyseliny mandľovej umožňuje získať kyselinu R-(-)-mandľovú v enantiomémom prebytku 100 %. V príklade 5 je uvedené, že uvedená nitriláza môže sa použiť na hydrolýzu alifatických nitrilov, akými sú napríklad valeronitril, akrylonitril, 2-halogénpropionitrily a chlóracetonitril. Pokiaľ ide o enantioselektivitu tejto hydrolýzy, týkajúcej sa alifatických nitrilov majúcich asymetrické centrum, nie je tu uvedené nič presné.

Tento text tiež uvádza, že nitriláza z Alealigenes faecalis má optimálnu účinnosť pri hodnote pH v rozsahu od 6,5 do 8,0, pričom teplota musí byť pri použití uvedeného enzýmu podľa tohto odkazu vždy nižšia ako 45 °C.

Ukázalo sa úplne prekvapivo, že uvedený enzým z Alealigenes faecalis ATCC 8750 v prípade, keď je použitý na hydrolýzu 4-metyltio-2-hydroxybutyronitrilu, realizuje uvedenú hydrolýzu bez akejkoľvek selektivity, pokiaľ ide o optickú čistotu. Tento enzým hydrolyzuje uvedený nitril za vzniku racemickej zmesi obidvoch kyselín a to bez akejkoľvek prevahy jedného či drahého z izomérov.

Nitriláza z Rhodococcus sp. HT 29-7 uložená pod číslom FERM BP-3857 je opísaná napríklad v európskom patente EP 610 049 a americkom patente US 5 296 373, pričom oba tieto patenty patria spoločnosti Nitto.

V týchto patentoch a najmä v americkom patente je opísané použitie nitrilázy na prípravu opticky aktívnych kyselín z racemických nitrilov nesúcich fenylovú skupinu. Všetky východiskové nitrily obsahujú aromatickú skupinu, pričom v podstate ide o hydrolýzu nitrilu kyseliny mandľovej alebo jeho derivátov substituovaných na aromatickom jadre. Príklad 1 amerického patentu US 5 296 373 opisuje hydrolýzu racemického nitrilu kyseliny mandľovej pôsobením Rhodocoddus sp. HT 29-7, pri ktorej sa získa kyselina R-(-)-mandľová v enantiomémom prebytku 100 %. Príklad 2 opisuje hydrolýzu derivátov nitrilu kyseliny mandľovej substituovaných na jadre, pričom i v tomto prípade je enantiomémy prebytok získanej kyseliny mandľovej 100 %. Taktiež je tomu i v prípade, keď sa vykonáva hydrolýza nitrilov benzaldehydu.

Európsky patent 610 049 spoločnosti Nitto Chemical opisuje použitie mikroorganizmu Rhodococcus sp. HT 29-7 (FERM BP-3857), Alealigenes sp. BC35-2 (FERM BP-3318) alebo Brevibacteríum acetylicum IAM 1790 na hydrolýzu α-hydroxynitrilov substituovaných v polohe gama aromatickým jadrom za vzniku opticky aktívnej a-hydroxykarboxylovej kyseliny substituovanej fenylovou skupinou. Kyseliny získané s použitím Rhodococcus sp. HT 29-7 majú vždy premenlivý enantiomémy prebytok, ktorý je v každom konkrétnom prípade závislý od východiskového nitrilu a od prítomnosti alebo neprítomnosti kyseliny fosforečnej (hodnota pH nastavená na asi 8,2).

Ukázalo sa úplne prekvapivo, že uvedený enzým v prípade, keď je použitý na hydrolýzu 4-metyltio-2-hydroxy-butyronitrilu, realizuje túto hydrolýzu bez akejkoľvek selektivity z hľadiska enantiomémej čistoty. Tento enzým hydrolyzuje uvedený nitril za vzniku racemickej zmesi obidvoch kyselín bez akejkoľvek prevahy jedného či druhého z izomérov.

Nitriláza z Gordona terrae MA-1 uloženého pod číslom FERM BP-4335 je opísaná v európskom patente 0 610 048 na hydrolýzu nitrilov nesúcich v polohe gama fenylovú skupinu a v polohe alfa hydroxy-skupinu na zodpovedajúcu opticky aktívnu kyselinu. Enantiomémy prebytok sa vo všetkých príkladoch pohybuje medzi 92 a 100%.

Ukázalo sa úplne prekvapivo, že uvedený enzým z Gordona terrae MA-41 uloženého pod číslom FERM BP-4535 v prípade, že je použitý na hydrolýzu 4-metyltio-2-hydroxybutyronitrilu, realizuje túto hydrolýzu bez akejkoľvek selektivity z hľadiska enantiomémej čistoty. Tento enzým hydrolyzuje uvedený nitril za vzniku racemickej zmesi obidvoch kyselín bez akejkoľvek prevahy jedného či druhého z izomérov.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je teda spôsob prípravy racemických α-substituovaných kyselín 4-metyltiomaslových hydrolýzou racemických α-substituovaných 4-metyltiobutyronitrilov pôsobením nitrilázy jedného z nasledujúcich mikroorganizmov: Alcaligenes faecalis uloženého pod číslom ATCC 8750, Rhodococcus sp. HT 29-7 uloženého pod číslom FERM BP-3857 a Gordona terrae MA-1 uloženého pod číslom FERM BP-4535.

V rámci vynálezu sa môže mikroorganizmus použiť sám osebe alebo imobilizovaný na osebe známych nosičoch.

Inak sa môže genetická informácia, ktorá kóduje uvedený enzým, transfekovať z rodičovského mikroorganizmu (akým je A. faecalis ATCC 8750...) do mikroorganizmu, akým je Bacillus subtilis.

Variantné uskutočnenie spôsobu podľa vynálezu spočíva v tom, že sa namiesto mikroorganizmu použije v zodpovedajúcom množstve jeho voľný alebo imobilizovaný enzým, ktorý je úplne alebo čiastočne vyčistený.

Z α-substituovaných 4-metyltiobutyronitrilov je výhodné použiť 4-metyltio-2-hydroxybutyronitril, ktorý umožňuje pripraviť hydroxy-analóg racemického metionínu. Táto technológia prípravy derivátov metionínu umožňuje eliminovať tvorbu minerálnych vedľajších produktov vo veľkom množstve, ktorých likvidácia je čím ďalej tým viac namáhavejšia vzhľadom na ochranu životného prostredia.

Uvedené enzýmy majú v rámci vynálezu nitrilačnú účinnosť v oblasti pH v rozsahu od 4 do 11, pričom optimálnu účinnosť majú v rozsahu pH od 5 do 9. Ich optimálna aplikačná teplota sa pohybuje medzi 30 a 60 °C, pričom je však výhodné použiť teplotu medzi 30 a 50 °C.

Výhodne sa pracuje s koncentráciou nitrilu vo východiskovom roztoku pohybujúcou sa medzi 20 a 400 molmi na liter, výhodne medzi 50 a 200 molmi na liter. Koncentrácia amónnej soli získanej kyseliny má len veľmi malý vplyv na účinnosť enzýmu v prípade, že je nižšia ako 2 moly na liter a keď výhodne leží v rozsahu medzi 0,1 a 1,5 molu na liter.

V nasledujúcej časti opisu bude vynález bližšie objasnený pomocou konkrétnych príkladov jeho uskutočnenia, pričom tieto príklady majú iba ilustračný charakter a nijako neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne vymedzený formuláciou definície patentových nárokov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Mikroorganizmus Alcaligenes faecalis ATCC 8750 sa

kultivuje v nasledujúcom prostredí:
octan amónny	10 g/1
kvasničný extrakt	5 g/1
peptón	5 g/1
K₂HPO₄	5 g/1
MgSO₄.7H₂O	0,2 g/1
FeSO₄.7H₂O	30 mg/1
NaCl	lg/1
benzonitril	0,5 g/1
pH 7,2.

Kultivácia sa vykonáva pri teplote 30 °C v Erlenmeyerových bankách s obsahom 2 litre, obsahujúcich 600 ml uvedeného kultivačného prostredia. Všetok podiel sa mieša pri 150 otáčkach za minútu počas 30 minút. Izoluje sa bunkový pevný podiel , ktorý sa premyje roztokom chloridu sodného s koncentráciou 9 g/1 a potom zmrazí.

Pracovné podmienky na hydrolýzu butyronitrilu:

4-metyltio-2-hydroxybutyronitril 50 mM bunky 5 mg/ml fosfátový pufor 200 mM teplota 30 °C čas 4 hodiny.

Kinetická štúdia hydrolýzy 4-metyltio-2-hydroxybutyronitrílu ukazuje, že dochádza k lineárnej produkcii 2,8 pmolu hydroxy-analógu metionínu za hodinu a na miligram bunkovej sušiny. Enantiomémy prebytok získanej kyseliny, ktorý bol stanovený kvapalinovou chromatografiou, sa rovná 0 % pri výťažku kyseliny 80 %.

Príklad 2

Sledovaním kinetiky produkcie hydroxy-analógu metionínu počas 180 hodín s použitím voľných buniek sa vyhodnotí stabilita enzýmu.

Použijú sa nasledujúce pracovné podmienky:

4-metyltio-2-hydroxybutyronitril 100 mM bunky 10 mg/ml

300 mM fosfátový pufor 5 ml teplota 25 °C

Nitril sa pridáva postupne v množstve 100 mmolov vždy po jeho vyčerpaní. Tvorba zodpovedajúcej kyseliny je zrejmá z nasledujúcej tabuľky I:

čas	Vytvorená kyselina (nnoly/litce)	Účinnosť (pmoly/h.ng bunkovej suSiny)
0	0	0
2 h	39	1/7
17 h	230	1/3
24 h	3L2	1,7
47 h	468	1/2
70 h	556	0/4
172 h	860	0,6
180 h	940	0,6

Východisková účinnosť sa rovná 2 pmolom/h.mg bunkovej sušiny. Tento príklad demonštruje stabilitu enzýmu i napriek vysokej koncentrácii kyseliny (0,9 molu hydroxy-analógu metionínu).

Príklad 3

V nasledujúcich podmienkach sa tiež stanovila stabilita enzýmu v závislosti od množstva substrátu a od množstva vytvorenej kyseliny.

Stabilita enzýmu v závislosti od množstva substrátu Nitril pozri nasledujúca tabuľka bunky 10mg/ml

300 mM fosfátový pufor, pH 7,05 ml teplota25 °C čas 1 hodina

Koncentrácia nitrilu (nM)	Účinnosť (pmoly/h.mg bunkovej sušiny)
50	2
100	2
150	2
200	2
500	0

čas	Účinnosť (pmoly/h.mg bun.suš.)	RR im
0	0	1
0,5	150	3
1	171	5
21,5	150	69
24,8	150	77
29	150	87

Stabilita enzýmu v závislosti od množstva vytvorenej kyseliny

Pracovné podmienky:

nitril50 mM bunky 2,5 mg/ml

100 mM fosfátový pufor, pH 7,01 ml teplota30 °C čas 2 hodiny

Koncentrácia	Účinnosť (paoly/h.mg bunkovej sušiny!
0	3,2
100	4,5
200	3,8
300	4,1
400	4
500	4
600	3,4
700	2,8

Príklad 4

Purifikácia nitrilázy

Bunky Alcaligenes faecalis sa kultivujú 24 hodín pri teplote 30 °C v kultivačnom prostredí opísanom v príklade 1. Po odstredení kultúry sa bunková peleta vyberie pufŕom s pH 7,5 (25 mM Tris-HCl, 10 % (hm./obj.) glycerolu). Získaná bunková suspenzia sa spracuje ultrazvukom, a potom odstredí na účely získania surového extraktu. Tento surový extrakt sa potom spracuje síranom amónnym až so 30 % nasýtenia. Získaná zrazenina sa resuspenduje v pufri s pH 7,5, a potom dialyzuje proti 2 litrom rovnakého pufra v priebehu noci. Získaný roztok sa potom zavedie na stĺpec anexovej živice Q Sephadex Fast Flow HR 26/10, ktorá bola predtým uvedená do rovnovážneho stavu pufŕom s pH 7,5. Aktívny podiel sa potom eluuje s použitím elučného gradientu od 0 do 1 M NaCl. Aktívne frakcie sa potom zavedú na anexovú živicu Mono Q HR R/R, ktorá bola predbežne uvedená do rovnovážneho stavu pufŕom s pH 7,5. Nitriláza sa eluuje pomocou elučného gradientu 0 až 1 M NaCl. Nakoniec sa frakcie majúce účinnosť zlúčia, potom sa pridá 1 M síranu amónneho. Tento roztok sa potom zavedie na hydrofóbny interakčný stĺpec živice Phenyl sepharose HR 5/5, ktorá bola predbežne uvedená do rovnovážneho stavu pufŕom s pH 7,5, ku ktorému bol pridaný 1 M síranu amónneho.

Gélovou filtráciou sa Stanovi molekulová hmotnosť proteínu. Je asi 260 kDa. Na géli SDS-PAGE možno pozorovať jediný pás s 43 kDA (čistota 95 %).

Kinetika hydrolýzy 4-metyltio-2-hydroxybutyronitrilu na hydroxy-analóg metionínu pôsobením nitrilázy mikroorganizmu A. faecalis je lineárna.

Príklad 5

Vplyv hodnoty pH

Pracovné podmienky: nitril proteín

100 mM acetátový pufor s pH 4 až 5

100 mM fosfátový pufor s pH 6 až 7

100 mM Tris-HCl-pufor s pH 8 až 9

100 mM boritanový pufor s pH 10 až 11 teplota čas mM pg/ml ml °C + až 2 hodiny.

PH	Účinnosť (μΛοΙν/h. (umoly/h.mg proteínu)
4	45
10	67
20	140
30	272
40	419
50	570
60	333

Porovnávací príklad s použitím nitrilu kyseliny mandľovej

Pracovné podmienky:

nitril kyseliny mandľovej 7mM proteín 5pg/ml

100 mM fosfátový pufor, pH 7,0 1ml teplota 30“C

čas (min.)	Účinnosť (paoly/h.mg proteinu)	ee
15	1000	1
60	1030	1

Purifikovaná nitriláza je teda enantioselektívna pre nitril kyseliny mandľovej, ale nie pre 4-metyltio-2-hydroxybutyronitril.

Príklad 7

Hydrolýza 4-metyltio-2-hydroxybutyronitrilu s použitím mikroorganizmu Rhodococcus HT 29-7 FERM BP-3857.

Mikroorganizmus Rhodococcus sp. HT 29-7 FERM BP-3857 sa kultivuje v nasledujúcom kultivačnom prostredí:

SK 281956 Β6

glycerol	20 g/1
kvasničný extrakt (Difco)	3 g/1
KH₂PO₄	1 g/1
Na₂HPO₄.12H₂O	4,4 g/1
Na₂SO₄	2,8 g/1
MgCl₂.6H₂O	0,85 g/1
CaCl₂.2H₂O	0,05 g/1
MnSO₄.H₂O	0,033 g/1
FeSO₄.7H₂O	0,013 g/1
ZnSO₄.7H₂O	0,005 g/1
benzonitril	0,5 g/1
pH 7,5.

Príklad 9

Stabilita enzýmu v závislosti od množstva vytvorenej kyseliny

Pracovné podmienky: 4-metyltio-2-hydroxybutyronitrillOOmM optická hustota pri 660 nm15

100 mM fosfátový pufor, pH 7,01 ml teplota30 °C čas 6 hodín.

Kultivácia sa vykonáva pri teplote 30 °C v Erlenmeyerových bankách s obsahom 2 litre, obsahujúcich 600 ml kultivačného prostredia. Všetok podiel sa mieša pri 150 otáčkach za minútu počas 140 hodín. Bunková peleta sa izoluje, premyje vodným roztokom NaCl s koncentráciou 9 g/1, a potom zmrazí.

Vplyv hodnoty pH na hydrolýzu

Pracovné podmienky:

4-metyltio-2.hydroxybutyronitril 100 mM optická hustota pri 660 nm

100 mM acetátový pufor s pH 4 až 5

100 mM fosfátový pufor s pH 6,0 až 7,0 1 ml

100 mM Tris-HCl-pufor s pH 8,0 až 9,0

100 mM boritanový pufor s pH 10,0 až 11,0 teplota 30 °C čas 10 hodín.

PH	Výťažok kyseliny (*)
4	0
5	100
β	100
7	100
8	100
9	100
10	20
11	0

Príklad 8

Vplyv koncentrácie substrátu

V nasledujúcich podmienkach bola tiež stanovená stabilita enzýmu v závislosti od množstva substrátu.

Pracovné podmienky:

4-metyltio-2-hydroxybutyronitril optická hustota pri 660 nm

300 mM fosfátový pufor, pH 7,0 teplota čas pozri nasledujúca tabuľka ml °C hodiny.

Koncentrácia kyseliny	Výťažok kyseliny m-
0	100
200	100
400	100
600	100
800	100
1000	100

Príklad 10

Enantiomémy prebytok

Pracovné podmienky: 4-mctyltio-2-hydroxybutyronitril optická hustota pri 660 nm 100 mM fosfátový pufor, pH 7,0 teplota

140 mM 14 °C

Inkubačný čas (h)	Výťážok kyseliny (%)	Optická čistota
2	15	0
6	50	0
24	100	D.

Štúdium kinetiky hydrolýzy 4-metyltio-2-hydroxybutyronitrilu ukazuje lineárnu produkciu hydroxy-analógu metionínu za hodinu a na mg bunkovej sušiny. Enantiomémy prebytok vytvorenej kyseliny sa meral kvapalinovou chromatografiou, pričom sa stanovilo, že je 0 % pre výťažok kyseliny meniacej sa medzi 15 a 100 %.

Príklad 11

Vplyv teploty

Pracovné podmienky: 4-metyltio-2-hydroxybutyronitril 100 mM optická hustota pri 660 nm 15

100 mM fosfátový pufor, pH 7,0 1 ml teplota pozri tabuľka čas 6 hodín.

Koncentrácia nitrilu	Výťažok kyseliny
(aM)	(»)
50	90
100	44
200	22
300	10
400	0
500	0

Teplota (^eC)	Výťažok kyseliny {♦>
10	70
20	100
30	100
40	100
50	31
60	15

SK 281956 Β6

Príklad 12

Hydrolýza4-metyltio-2-aminobutyronitrilu

Pracovné podmienky: 4-metyltio-2-hydroxybutyronitril 23mM optická hustota pri 660 nm15

100 mM fosfátový pufor, pH 7,01 ml teplota30 °C

čas	Výťažok JcyseLiny	Enantiosémy
(h)	(D	prebytok kyseliny
0/5	40	nestanovený
1	51	0,12
1	62	nestanovený
5	78	0,15

Príklad 13

Na kultiváciu mikroorganizmu Gordona terrae MA-1

(FERM BP-4535) sa použije kultivačné prostredie, ktoré
má nasledujúce zloženie:
glycerol	10 g/1
kvasničný extrakt	0,4 g/1
K₂HPO₄	6,8 g/1
Na₂HPO₄.12H₂O	7,1 g/1
Na₂SO₄	2,8 g/1
MgCl₂.6H₂O	0,4 g/1
CaCl₂.2H₂O	40mg/l
MnSo₄.H₂0	4 mg/ml
FeClj	0,6 mg/1
ZnSO₄	0,3 mg/1
benzonitril	0,5 g/1
pH 7,2.
Účinnosť enzýmu

Kultivované bunky sa po premytí uvedú do styku s hydroxymetyltiobutyronitrilom na stanovenia ich účinnosti.

Pracovné podmienky:

nitril 23 mM bunky 6,8 g/1

100 mM fosfátový pufor teplota 35 °C pH 7,0

Hydrolýza AMTP-kyánhydrínu s použitím mikroorganizmu Gordona terrae MA-1

		T
	'Z
/	— r— Ĺ -
ŕ

12 3*56

Čas (h)

Kinetika hydrolýzy hydroxymetyltiobutyronitrilu má lineárny charakter. Počiatočná rýchlosť je 12 mmolov/h.g bunkovej sušiny.

Príklad 14

Vplyv koncentrácie AMTP-kyánhydrínu na účinnosť nitriláz.

Výsledky stanovenia vplyvu východiskovej nitrilázy sú uvedené v nasledujúcej tabuľke.

Pracovné podmienky:

bunky 5,1 g/1

100 mM fosfátový pufor teplota 35 °C ph 7,0.

Sledovanie kinetiky bolo uskutočnené v časových úsekoch

0,5, l,2a3hodín

Koncentrácie nitrilu (bM)	Účinnosť (naoly/h.g bunkovej ôuáíny)
50	14
100	13
200	15
300	0
400	0

Až do koncentrácie nitrilu 200 mM sa účinnosť v závislosti od koncentrácie substrátu mení len veľmi málo.

Príklad 15

Vplyv koncentrácie hydroxy-analógu metionínu na účinnosť nitrilázy

V rámci tohto príkladu bol študovaný vplyv koncentrácie 4-hydroxy-2-metyltiobutanoátu amónneho na účinnosť nitrilázy.

Pracovné podmienky: bunky 5 g/1 nitril lOOmM

100 mM fosfátový pufor, pH 7,0 teplota 35 °C.

Koncentrácia karboxylátu amónneho sa mení medzi 0 a 1,5 M.

Koncentrácia kyseliny (mol/1)	Účinnosť (μιοοΙ/h.nLg bunkovej sušiny)
0	9,4
0,5	14
1	19
1,5	15

Koncentrácia 4-hydroxy-2-metyltiobutanoátu amónneho nijako neovplyvňuje východiskovú účinnosť kmeňa Gordona terrae HT 29-7.

Príklad 16

Vplyv hodnoty pH a teploty

Pracovné podmienky: nitril 100 mM bunky 7,5 g/1

100 mM acetátový pufor s pH 4 až 5

100 mM fosfátový pufor s pH 6 až 7

SK 281956 Β6

100 mM Tris-HCl-pufor s pH 8,9

100 mM boritanový pufor s pH 10 až 11 teplota 30 °C.

Sledovanie kinetiky bolo uskutočnené v časových úsekoch 1,2, 4 a 6 hodín.

6. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že sa koncentrácia α-substituovanej 4-metyltiomaslovej kyseliny v roztoku pohybuje medzi 10 a 2000 mmolmi, výhodne medzi 100 a 1500 mmolmi na liter.

PH	Účinnosť {nnaol/h.g bunkovej sušiny)
4	0,6
S	2,5
6	7, 9
7	9,6
e	15,3
9	18
10	5,7
11	11

Koniec dokumentu

Pri použitých pracovných podmienkach sa optimálne pH pohybuje v blízkosti pH 8 až 9.

Vplyv teploty na účinnosť nitrilázy mikroorganizmu Gordona terrae MA-1

Pracovné podmienky:

nitril lOmM bunky 7,5 g/1

100 mM fosfátový pufor, pH 7,0 sledovanie kinetiky v časovom úseku 1 hodiny.

Teplota	Účinnosť
(*C)	(Mnol/h.g bunkovej sušiny)
10	0,6
20	2,3
30	3,2
40	3,4
50	3,5
60	1,9

Optimálna teplota sa pohybuje v blízkosti 40 až 50 °C.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Spôsob prípravy racemických a-substituovaných 4-metyltiomaslových kyselín, vyznačujúci sa t ý m , že sa racemické α-substituované 4-metyltiobutyronitrily hydrolyzujú nitrilázou zvolenou z množiny zahrnujúcej nitrilázy mikroorganizmov Alcaligenes faecalis ATCC-8750, Rhodococcus sp. HT 29-7 FERM BP-3857 a Gordona terrae FERM BP-4535.

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že racemickým α-substituovaným 4-metyltiobutyronitrilomje4-metyltio-2-hydroxybutyronitril.

3. Spôsob podľa nároku 1, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že sa pH prostredia pohybuje medzi 4 a 11, výhodne medzi 5 a 9.

4. Spôsob podľa nároku 1, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že sa teplota hydrolýzy pohybuje medzi 30 a 60 °C, výhodne medzi 30 a 50 °C.

5. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že sa koncentrácia α-substituovaného 4-metyltiobutyronitrilu vo východiskovom roztoku pohybuje medzi 10 a 400 mmolmi, výhodne medzi 50 a 200 mmolmi na liter.