SK281559B6

SK281559B6 - Kombinácia atovakvonu s proguanilom, jej použitie a farmaceutický prostriedok

Info

Publication number: SK281559B6
Application number: SK570-95A
Authority: SK
Inventors: Winston Edward Gutteridge; David Brian Ashton Hutchinson; Victoria Susan Latter; Mary Pudney
Original assignee: The Wellcome Foundation Limited
Priority date: 1992-11-26
Filing date: 1993-11-25
Publication date: 2001-05-10
Also published as: HUT71346A; US5998449A; BG99656A; RO119280B1; GR3033745T3; CA2150234C; EP0670719A1; OA10352A; CN1091632A; TW253835B; PT670719E; ATE191340T1; CZ289692B6; CN1087935C; UA45948C2; US6166046A; PL174323B1; JP3768231B2; GB9224739D0; HK1004468A1

Abstract

Opisuje sa kombinácia atovakvonu a proguanilu, jej použitie pri ošetrovaní a profylaxii parazitických infekcií, ako protozoálnych parazitických infekcií, napr. malárie a toxoplazmózy a infekcií spôsobených Pneumocystis carinii, ďalej ich použitia na výrobu liečiva na ošetrovanie a/alebo profylaxiu takýchto infekcií. Kombinácie sa môžu zvyčajne podávať v jedinom farmaceutickom prostriedku. Výhodne sa atovakvon a proguanil podávajú v potenciačnom pomere, takže pôsobia v synergii.ŕ

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka syncrgických kombinácií 2-/4-(4-chlórfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinónu (atovakvonu) a proguanilu, ktoré majú antiparazitickú aktivitu. Tento vynález sa predovšetkým týka farmaceutických prostriedkov, ktoré obsahujú takúto kombináciu, ich použitia pri ošetrovaní protozoálnych parazitických infekcií, ako je malária a toxoplazmóza a ich použitia pri ošetrovaní infekcií spôsobených Pneumocystis carinii.

antagonistické a ktoré nevyžadujú komplexný dávkovací režim.

Patent EP 0362996 sa týka použitia známych a nových naftochinónových zlúčenín na liečenie a profylaxiu infekcie spôsobenej Pneumocystis carinii, a na výrobu liečiva na liečenie a profylaxiu tejto infekcie.

Patent EP 0401875 sa týka novej kombinácie antiprotozoálnej naftochinónovej zlúčeniny 2-(4-(min-chloro-fenyl)cyklohxyl)-3-hydroxy-l,4-naftochinón a 4-pyridinol alebo ich alkanolový ester.

Doterajší stav techniky

Zlúčenina 2-/4-(4-chlórfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-1,4-naftochinón (atovakvon) bola už skôr opísaná, napr. v Európskom patentovom spise č. 123 238, ktorý sa týka 2-substituovaných 3-hydroxy-l,4-naftochinónov všeobecného vzorca (I)

v ktorom

R¹ znamená atóm vodíka a

R² je zvolený z alkoxyskupiny s 1 až 6 atómami uhlíka, arylalkoxyskupiny, alkarylovej skupiny s 1 až 6 atómami uhlíka v alkylovej časti a 1 až 6 atómami uhlíka v alkoxylovej časti, fenylu substituovaného jednou alebo dvomi skupinami zvolenými z atómu halogénu a alkylovej skupiny s 1 až 6 atómami uhlíka, ďalej atómu halogénu a perhalogénalkylovej skupiny s 1 až 6 atómami uhlíka alebo

R¹ a R² znamenajú obidva alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka alebo fenylovú skupinu a n znamená nulu alebo číslo 1 a ich fyziologicky prijateľných solí. Uvádza sa, že tieto zlúčeniny majú antiprotozoálnu aktivitu. Predovšetkým zlúčenina všeobecného vzorca (I), v ktorej n predstavuje nulu, je uvedená ako zlúčenina aktívna proti parazitu spôsobujúcemu maláriu u ľudí, Plasmodium falciparum a tiež proti druhom Eimeria, ako je Eimeria tenella a Eimeria acervulina, ktoré sú organizmami spôsobujúcimi kokcidiózu. Ďalej sa uvádza, že zlúčeniny všeobecného vzorca (I), v ktorom n predstavuje číslo 1, majú byť aktívne proti protozoám kmeňa Theileria, predovšetkým Theileria annulata a Theileria parva. Medzi zlúčeninami predovšetkým uvedenými a doloženými v príkladoch je zlúčenina všeobecného vzorca (I), v ktorom n predstavuje nulu, R¹ znamená atóm vodíka a R² predstavuje 4-chlórfenyl, tzv. atovakvon.

Proguanil je dobre známa liečivá látka na profylaxiu malárie, ale nie na jej liečenie. Táto látka je jedným z najbezpečnejších liečivých látok pôsobiacich proti malárii a môže sa podávať malým deťom a tehotným ženám. K uvedenej zlúčenine je však rezistentný Plasmodium falciparum, predovšetkým v juhovýchodnej Ázii a táto rezistencia vytvára vzrastajúci problém.

S cieľom boja proti rezistencii liečivej látky sa stáva zvyčajnou praxou používať kombinácie väčšieho počtu než jednej látky pôsobiacej proti malárii, buď súčasne alebo postupne. Veľa takýchto kombinácií však pôsobí antagonistický, čo má za výsledok menej účinné ošetrenie a dávkovacie režimy sú často komplikované so vzrastajúcou pravdepodobnosťou zlyhania u pacientov pri kompletnom ošetrení. Preto je predmetom tohto vynálezu poskytnúť kombináciu liečivých látok pôsobiacich proti malárii, ktoré nie sú

Podstata vynálezu

Nedávno sa s prekvapením zistilo, že kombinovaním, buď súčasným alebo následným, atovakvonu predstavovaného v tomto opise vzorcom (II)

a proguanilu, sa dosahuje potenciácia antiparazitického a predovšetkým antimalarického účinku. Okrem toho sa potenciónovaná kombinácia zlúčeniny vzorca (II) a proguanilu môže jednoducho predkladať v jedinom farmaceutickom prostriedku.

Podstatou tohto vynálezu je kombinácia 2-/4-(4-chlórfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinónu a proguanilu, kde pomer proguanilu k 2-/4-(4-chlórfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinónu je v rozsahu od 1 :1 do 1 :3. Vhodný pomer vedúci k potenciách je 2:5.

Pomer vedúci k potenciách, ktorý sa môže úspešne používať na ošetrovanie malárie vrátane pôsobenia na kmene malárie rezistentnej k hydroxynaftochinónu jc v rozsahu od 1 : 0,1 do 1 : 100 proguanilu k atovakvonu.

Ďalším znakom tohto vynálezu je kombinácia kde 2-/4-(4-chlórfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinón je vo forme trans izoméru alebo zmesi cis a trans izoméru, v ktorej trans izomér prevláda.

Je potrebné si uvedomiť, že zlúčenina vzorca (II) môže existovať ako cis alebo ako trans izomér, tzn., že môže byť cis alebo trans substituovaná naftochinónovým jadrom a chlórfenylovou skupinou. Tak cis izoméry, ako i trans izoméry a ich zmesi v ľubovoľnom pomere sa môžu používať podľa tohto vynálezu. Zo všeobecného hľadiska, pokiaľ zlúčenina je vo forme zmesi izomérov, trans izomér bude prítomný v množstve okolo 50 % alebo bude prevažujúcim izomérom, ale použitie zmesi, v ktorej prevažuje cis izomér, je tiež zahrnuté do rozsahu tohto vynálezu. Zvláštny pomer izomérov sa môže meniť podľa potreby, zvyčajné zmesi však tvoria zmesi, v ktorých pomer izomérov cis a izoméru trans je približne 1:1,40 : 60 a 5 : 95. Na použitie podľa tohto vynálezu je výhodný trans izomér zlúčeniny vzorca (II) alebo zmes jej cis a trans izoméru, obsahujúca aspoň 95 %, napr. 99 % trans izoméru.

Kombinácia sa ďalej môže použiť na ošetrenie a/alebo profylaxii protozoálnej parazitickej infekcie, napr. malárie alebo toxoplazmózy, alebo infekcie spôsobenej Pneumocystis carinii u cicavcov vrátane človeka. Pri ošetrení sa podáva účinné množstvo atovakvonu alebo jeho fyziologicky prijateľnej soli a súčasne alebo postupne sa podáva účinné množstvo proguanilu.

Ďalším znakom podľa vynálezu je použitie kombinácie na výrobu liečiva na ošetrovanie a/alebo profylaxiu protozoálnej parazitickej infekcie, napr. malárie alebo toxoplaz

SK 281559 Β6 mózy, alebo infekcie spôsobenej Pneumocystis carinii u cicavcov.

Vynález poskytuje atovakvon na použitie pri výrobe liečiva, na buď súčasné alebo následné podávanie s proguanilom, na ošetrovanie a/alebo profylaxiu protozoálnej parazitickej infekcie, napr. malárie alebo toxoplazmózy alebo infekcie spôsobenej Pneumocystis carinii u cicavcov vrátane človeka.

Výhodne sa zlúčenina vzorca (II) a proguanil podávajú súčasne. Najvýhodnejšie sa zlúčenina vzorca (II) a proguanil podávajú v pomere vedúcom k potenciách.

Výraz „pomer vedúci k potenciách“ sa tu používa na označenie, že atovakvon a proguanil sú prítomné v takomto pomere, že antiparazitická aktivita kombinácie je väčšia ako buď aktivita samotného atovakvonu alebo aktivita samotného proguanilu alebo prídavná aktivita, ktorá by sa dala predpovedať pre kombináciu založenú na aktivitách jednotlivých zložiek. Tak jednotlivé zložky pôsobia synergicky v určenej kombinácii, kde sú prítomné v pomere vedúcom k potenciách.

Vynález ďalej poskytuje farmaceutický prostriedok, ktorý zahrnuje uvedenú kombináciu spoločne s jednou alebo väčším počtom jej farmaceutický prijateľných nosných látok.

Farmaceutický prostriedok výhodne obsahuje 500 mg 2-/4-(4-chlórfenyl)cyklohexy 1/-3 -hydroxy-1,4-naftochinónu a 200 mg proguanilu.

Hydroxyskupina atovakvonu môže tvoriť soli s vhodnými bázami. Fyziologicky prijateľné soli atovakvonu zahŕňajú soli anorganických báz, ako soli alkalických kovov (napr. sodíka alebo draslíka) a soli alkalických zemín (napr. vápnika), soli organických báz, napr. fenyletylbenzylamínu, dibenzyletyléndiamínu, etanolamínu a dietanolamínu a soli aminokyselín, napr. lyzínu a arginínu.

Zlúčenina vzorca (II) môže tiež existovať v tautomémej forme, v ktorej hydroxyskupina poskytuje svoj protón jednej z oxoskupín a použitie takýchto tautomémych foriem je zahrnuté do rozsahu tohto vynálezu. Predpokladá sa však, že stabilnou formou je forma, ktorá je znázornená vzorcom (II).

Množstvo kombinácie atovakvonu a proguanilu vyžadované nato, aby bolo účinné ako antiparazitický prostriedok, sa bude samozrejme meniť a nakoniec bude závisieť od rozhodnutia praktického alebo veterinárneho lekára. Okolnosti, ktoré je potrebné vziať do úvahy, zahŕňajú cestu podania a povahu prostriedku, telesnú hmotnosť cicavca, vek a všeobecný stav, povahu a vážnosť choroby určenej na ošetrovanie. Zo všeobecného hľadiska, vhodná účinná dávka na podávanie človeku, určená na ošetrovanie malárie, je v rozsahu od 2,0 do 30 mg proguanilu na kilogram telesnej hmotnosti za deň a od 0,5 do 30 mg atovakvonu na kilogram telesnej hmotnosti za deň, napr. od 3 do 20 mg proguanilu na kilogram telesnej hmotnosti za deň a od 1 do 20 mg atovakvonu na kilogram telesnej hmotnosti za deň, predovšetkým od 5 do 15 mg proguanilu na kilogram telesnej hmotnosti za deň a od 3 do 15 mg atovakvonu na kilogram telesnej hmotnosti za deň.

Vhodná účinná dávka na podávanie človeku, určená na profylaxiu malárie, je v rozsahu od 3 do 20 mg na kilogram telesnej hmotnosti za týždeň tak pri proguanile, ako i pri atovakvone.

Malo by sa vziať do úvahy, že uvedené dávky sú vypočítané pre liečivé látky samotné.

Využiteľnosť

Na použitie podľa tohto vynálezu sa kombinácia atovakvonu a proguanilu výhodne predkladá ako farmaceutický prostriedok.

Farmaceutické prostriedky zahŕňajú aktívne látky (tzn. kombináciu atovakvonu a proguanilu) spolu s jednou alebo väčším počtom jeho farmaceutický prijateľných nosných látok a prípadne inými terapeutickými a/alebo profylaktickými zložkami. Nosná látka alebo nosné látky musia byť prijateľné v tom zmysle, že sú znášanlivé s inými zložkami prostriedku a nemajú zhubný vplyv na svojho príjemcu.

Preto tento vplyv poskytuje farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje kombináciu atovakvonu a proguanilu spoločne s jednou alebo väčším počtom ich farmaceutický prijateľných nosných látok.

Kombinácia atovakvonu a proguanilu môže byť zvyčajne prítomná ako farmaceutický prostriedok vo forme dávkovej jednotky. Zvyčajná formulácia dávkovej jednotky obsahuje aktívne látky v množstve, ktoré zodpovedá od 10 mg do 3 g každej aktívnej látky, napr. od 50 mg do 3 g každej aktívnej látky. Zvyčajné dávkové jednotky môžu obsahovať napr. 500 mg atovakvonu a 200 mg proguanilu alebo 500 mg atovakvonu a 500 mg proguanilu.

Farmaceutické prostriedky zahŕňajú prostriedky vhodné na orálne, lokálne (vrátane dermálneho, bukálneho a sublinguálneho), rektálne a parenterálne (vrátane subkutánneho, intradermálneho, intramuskulámeho a intravenózneho) podanie, taktiež ako na podanie nasogastrickou trubicou. Pokiaľ je to vhodné, prostriedok môže byť bežne prítomný v oddelených dávkových jednotkách a môže sa vyrobiť ľubovoľným spôsobom dobre známym v oblasti farmácie. Všetky spôsoby zahŕňajú stupeň uvedenia aktívnej látky do styku s kvapalnými nosnými látkami alebo jemne rozomletými tuhými látkami, prípadne obidvoma týmito typmi nosných látok a potom, pokiaľ je to potrebné, tvarovanie produktu na požadovaný prostriedok.

Farmaceutické prostriedky vhodné na orálne podávanie, v ktorých nosná látka je tuhá, sú najvýhodnejšie prítomné ako formulácia v dávkovej jednotke, ako je bolus, kapsula alebo tableta, obsahujúca vždy vopred stanovené množstvo aktívnych látok. Tableta môže byť zhotovená lisovaním alebo odlievaním, prípadne s jednou alebo väčším počtom pomocných látok. Lisované tablety sa môžu vyrábať lisovaním na vhodnom stroji, účinných látok vo voľne tečúcej forme, ako prášku alebo granúl, prípadne zmiešaných so spojivom, mastivom, inertným riedidlom, klzavou látkou, povrchovo aktívnou látkou alebo dispergačným činidlom. Odlievané tablety sa môžu zhotovovať odlievaním s využitím inertného kvapalného riedidla. Tablety sa môžu prípadne poťahovať a pokiaľ sú nepotiahnuté, môžu sa vybaviť zárezom. Kapsuly sa môžu vyrábať naplnením aktívnych látok, buď samotných alebo v zmesi s jednou alebo väčším počtom pomocných látok do obalov kapsuly a potom uzavrieť zvyčajným spôsobom. Kašety (kapsuly na liek) sú analogické kapsuliam, v ktorých sú aktívne látky spolu s pomocnou látkou alebo pomocnými látkami uzavreté v obale z ryžového papiera. Kombinácie zlúčeniny vzorca (II) s proguanilom sa môžu tiež spracovávať na dispergovateľné granuly, ktoré sa môžu napr. suspendovať vo vode pred podaním alebo rozprášiť na potravu. Granuly sa môžu tiež baliť napr. do sašetov (vačkov na liek). Prostriedky vhodné na orálne podanie, v ktorých nosná látka je kvapalná, môžu byť prítomné ako roztok alebo ako suspenzia vo vodnej kvapaline alebo nevodnej kvapaline alebo ako emulzia oleja vo vode.

Prostriedky na orálne podanie zahŕňajú dávkové formy s riadeným uvoľňovaním, napr. tablety, v ktorých aktívne

SK 281559 Β6 látky sú spracované do vhodného základu umožňujúceho riadené uvoľňovanie alebo potiahnuté filmom, ktorý vhodne riadi uvoľňovanie. Takéto prostriedky môžu byť predovšetkým vhodné na profylaktické použitie.

Účinné látky sa môžu tiež upraviť na roztok alebo suspenziu, ktoré sú vhodné na podanie nasogastrickou trubicou.

Farmaceutické prostriedky vhodné na rektálne podávanie, v ktorých nosná látka je tuhá, sú najčastejšie prítomné ako dávkové jednotky vo forme čapíkov. Medzi vhodné nosné látky sa zahŕňa kakaové maslo a iné látky zvyčajne používané v odbore. Čapíky sa môžu zvyčajne vyrábať zmiešaním kombinácie aktívnych látok so zmäknutou alebo roztavenou nosnou látkou alebo nosnými látkami, potom rýchlym ochladením a tvarovaním vo formách.

Farmaceutické prostriedky vhodné na parenterálne podávanie zahŕňajú sterilné roztoky alebo suspenzie kombinácie účinných látok, obsiahnuté vo vodných alebo olejových pomocných prostriedkoch. Injikovateľné preparáty môžu byť prispôsobené na podávanie ako dávková injekcia alebo na kontinuálnu infúziu. Takéto prostriedky sú zvyčajne prítomné v zásobníkoch s jedinou dávkou alebo väčším počtom dávok, ktoré sú uzavreté po zavedení prostriedku až do vyžadovaného použitia. Podľa iného riešenia aktívnej látky môžu byť v práškovej forme a prostriedok sa vytvorí pred použitím s vhodnou pomocnou látkou ako sterilnou vodou zbavenou pyrogénnych látok.

Kombinácia atovakvonu a proguanilu sa môže tiež spracovať na dlhodobo pôsobiaci depotný prostriedok, ktorý sa môže podávať intramuskulámou injekciou alebo implantáciou, napr. subkutánne alebo intramuskuláme. Depotné prostriedky môžu obsahovať napr. vhodné polyméme alebo hydrofóbne materiály alebo ionexové živice. Takéto dlhodobo pôsobiace prostriedky sú predovšetkým vhodné na profylaktické použitie.

Malo by sa uznať, žc okrem uvedených nosných látok farmaceutické prostriedky na rôzne cesty podania opísané môžu podľa potreby zahŕňať jednu alebo väčší počet ďalších nosných látok, ako sú riedidlá, pufre, ochucovadlá, spojivá, povrchovo aktívne látky, zahusťovadlá, mastivá, konzervačné prostriedky (vrátane antioxidantov) a pod. a látky zahrnuté s cieľom získať prostriedok izotonický s krvou zamýšľaného príjemcu.

Prostriedky vhodné na veterinárne použitie zahŕňajú prostriedky upravené na orálne alebo parenterálne podanie a na podanie do bachora.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Spôsoby výroby atovakvonu sú opísané v európskom patentovom spise č. 123 238 a jeden zvláštny spôsob, ktorý je opísaný v EP 0362996, je ilustrovaný v príklade 1.

Príklad 1

Spôsob výroby 2-/trans-4-(4-chlórfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-1,4-naftochinónu

a) Spôsob výroby kyseliny 4-(4-chlórfenyl)cyklohexán-l-karboxylovej g acetylchloridu a 60 g jemne rozomletého práškového chloridu hlinitého sa mieša spolu so 120 ml sulfidu uhličitého a potom ochladí na teplotu -50 °C v kúpeli z oxidu uhličitého a oxitolu. Do reakčnej zmesi sa počas 10 minút prikvapká 30 g cyklohexénu, ktorý bol vopred ochladený na teplotu -50 °C, pričom teplota reakčnej zmesi sa udržuje pod -20 °C. Zmes sa mieša pri reakčnej teplote -50 °C počas ďalších 60 minút a rozpúšťadlo sa potom de kantuje, aby zostal gumovitý oranžový komplex. Do tohto komplexu sa pridá malé množstvo chlórbenzénu, akonáhle sa látka zahreje na teplotu miestnosti. Potom sa pridá zvyšok chlórbenzénu (celkovo 300 ml), takto získaný roztok sa zahrieva na teplotu 40 °C počas 3 hodín za miešania, vyleje na zmes ľadu a koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej a oranžová vrstva sa oddelí, premyje 2-molárnou kyselinou chlorovodíkovou, 2-molámym roztokom hydroxidu sodného a vodou, vysuší sa bezvodým síranom sodným a odparí dosucha. Získaná látka sa destiluje pri zníženom tlaku, frakcia vriaca pri teplote 140 až 154 “C/13,3 Pa sa zachytí, zriedi rovnakým množstvom petroléteru (pri teplote varu 40 až 60 °C) a ochladí na teplotu -6 °C. Reakčnou zmesou sa prebubláva nepretržitý prúd plynného dusíka a zachytí sa oddelená bezfarebná tuhá látka.

Do roztoku 6,2 g hydroxidu sodného v 42 ml vody sa pri teplote 0 °C pridá 2,8 ml brómu. 3,1 g substituovaného hexahydroacetofenónu získaného sa rozpustí v 15 ml dioxánu a potom sa pridá studený roztok brómnanu, pričom reakčná zmes sa udržuje pri teplote pod 20 °C. Reakčná zmes sa mieša pri teplote miestnosti počas 6 hodín a potom nechá stáť cez noc. Aby sa dosiahol rozklad prebytočného brómnanu, pridá sa dvojsíričitan sodný, zmes sa ochladí a potom okyslí. Tak sa získa bezfarebná tuhá látka. Táto tuhá látka sa odfiltruje, premyje vodou, vysuší a rekryštalizuje z etanolu. Získa sa kyselina 4-(4-chlórfenyl)cyklohexán-l-karboxylová, ktorá má teplotu topenia 254 °C až 256 °C.

b) Spôsob výroby 2-/4-(4-chlórfenyl)cyklohexyl/-3-chlór-1,4-naftochinónu

Zmes 3,95 g (0,02 mol) 2-chlór-l,4-naftochinónu, 4,9 g (0,02 mol) kyseliny 4-(4-chlórfenyl)cyklohexán-l-karboxylovej a 1,05 g (0,0062 mol) práškového dusičnanu strieborného sa varí pod spätným chladičom počas intenzívneho miešania v 40 ml acetonitrilu. Do reakčnej zmesi sa prikvapká počas 1 hodiny roztok 12,0 g (0,0525 mol) persíranu amónneho v 50 ml vody. Zmes sa varí pod spätným chladičom počas 3 hodín, potom sa chladí ľadom počas 30 minút a po tomto čase sa filtruje a výsledná lepkavá tuhá hmota sa dvakrát extrahuje vriacim chloroformom, na odstránenie anorganickej látky. Chloroform sa odparí a získa sa približne 2,7 g žltohnedej tuhej látky. Táto látka sa rozpustí v 40 ml vriaceho acetonitrilu a malé množstvo nerozpustnej látky sa odstráni filtráciou. Po ochladení sa zlúčenina uvedená v nadpise oddelí ako žlté kryštály s hmotnosťou 550 mg, ktoré majú teplotu topenia 172 až 175 °C. NMR spektrálna analýza: dH (S₆-DMSO): 8,05 (2H, multiplet, β-naftyl), 7,85 (2H, multiplet, a-naftyl), 7,30 (4H, s, PhH), 3,30 (1H, široký triplet, CH), 2,67 (1H, široký triplet, CH), 1,2 - 2,4 (8H, multiplet, 4 x CH₂) ppm.

c) Spôsob výroby 2-/4-(4-chlórfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-1,4-naftochinónu

Produkt zo stupňa b) sa suspenduje v 10 ml vriaceho metanolu a počas 15 minút sa do získanej suspenzie prikvapká roztok 0,55 g hydroxidu draselného v 5,5 ml vody. Zmes sa varí pod spätným chladičom, až sa vytvorí tmavočervený roztok (po približne 6 hodinách), keď sa opatrne prikvapkajú 2 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej. Zmes sa ochladí a filtruje a tuhý zvyšok sa dôkladne premyje vodou. Vodné premývacie lúhy sa znovu okyslia a filtrujú. Spojené tuhé zvyšky (s hmotnosťou 500 mg), ktoré majú teplotu topenia 200 až 209 °C, sa rekryštalizujú z acetonitrilu a získa sa zlúčenina uvedená v nadpise, ako trans izomér s hmotnosťou 300 mg, ktorý má teplotu topenia 216 až219 °C.

SK 281559 Β6

Príklad 2

Ďalej uvedené príklady ilustrujú zvyčajné farmaceutické prostriedky, ktoré sa môžu používať podľa tohto vynálezu.

A: Tableta potiahnutá filmom

Jadro:

zlúčenina z príkladu 1 500 mg hydrochlorid proguanilu 200 mg mikrokryštalická celulóza (Avicel PH 101) 13 0 mg hydroxypropylcelulóza Lo-sub (LHPC,

LH11) 99mg nátriumglykolát škrobu (Eplotab) 30mg povidón K30 36mg stearát horečnatý 5mg hmotnosť na zlisovanie 1000 mg

Povlak:

disperzia polyméru 20mg (hydroxypropylmetylcelulóza a oxid titaničitý s polyetylénglykolom 400 a farbivom)

Liečivé látky pôsobiace proti malárii sa testujú rozpustené vo vode, v 95 % etanole alebo v dimetylsulfoxide. Liečivé látky sú pritom rozpustené vo vode zriedené 95 % etanolom v pomere 1 : 1 s tým, že liečivé látky rozpustené v etanole sa riedia vodou v pomere 1:1. Roztoky liečivej látky sa potom riedia kultivačným prostredím, ktoré obsahuje 10% ľudského séra, na počiatočnej dvadsaťnásobnej až päťdesiatnásobnej koncentrácii odhadnutých hodnôt IC₅₀. Liečivé látky sa testujú a ich roztoky sú uvedené d’aM

Leštidlo:

polyetylénglykol 8000 2 mg celková hmotnosť 1022 mg

B: Tableta potiahnutá disperzným filmom

Jadro:

zlúčenina z príkladu 1 500 mg hydrochlorid proguanilu 200 mg mikrokryštalická celulóza (Avicel PH 101) 100 mg hydroxypropylcelulóza Lo-sub (LHPC,

LH11) 83mg nátriumglykolát škrobu (Eplotab) 40mg povidón K30 20mg stearát horečnatý 5mg dokusát sodný 1mg kremičitan horečnato-hlinitý (Veegum F) 50 mg sodná soľ sacharínu 1mg hmotnosť po zlisovaní 1000 mg

Povlak:

disperzia polyméru 10mg (hydroxypropylmetylcelulóza a oxid titaničitý s polyetylénglykolom 400 a farbivom

Liečivá látka	Počiatočné rozpúšťadlo	Prostredie
zlúčenina z príkladu 1	DMSO	1640
chinín	etanol - voda	1640
chlorochín	voda - etanol	1640
meflochín	etanol - voda	1640
primachín	etanol - voda	1640
artesunát	etanol - voda	1640
PM443	DMSO	1640
tetracyklín	DMSO	1640
norfloxacín	DMSO	1640
ciprofloxacín	DMSO	1640
proguanil	etanol - voda	Lo-folát
cykloguanil	etanol - voda	Lo-folát
pyrimetamín	DMSO	Lo-folát
trimetoprím	DMSO	Lo-folát
sulfametoxazol	DMSO	Lo-folát
dapsón	DMSO	Lo-folát
klopidol	DMSO	Lo-folát
allopurinol	etanol - voda	Lo-folát
PS-15	DMSO	Lo-folát
WR99210	DMSO	Lo-folát

Leštidlo: polyetylénglykol 80002 mg celková hmotnosť 1012 mg

Výsledky biologických testov

Príklad 3

Porovnanie interakcie liečivých látok v kombináciách zlúčeniny z príkladu 1 s inými látkami pôsobiacimi proti malárii

Štúdie senzitivity liečivej látky in vitro sa uskutočňujú s použitím poloautomatizovaného technického postupu, ktorý opísal Desjardins (Desjardins a kol., Antimalarial Agents and Chemoterapy 16(6), 710- 718 /1979/). Antimalarijná aktivita v tomto systéme sa stanovuje inhibíciou rádiologický označeného hypoxanitínu vpraveného do parazitov pri stupňujúcich sa koncentráciách liečivej látky.

Na účely štúdia kombinácie liečivých látok sa roztoky j liečivej látky pri počiatočných koncentráciách kombinujú v rôznych pomeroch (1: 5,1 :2,2 :1 a 5 :1). Roztoky liečivej látky a kombinácie sa potom vnesú na mikrotitračnú platňu s 96 jamkami, aby sa získali dva rady zlúčeniny z príkladu 1. Tým je kombinovaná liečivá látka a sú štyri kombinácie dvoch liečivých látok. Séria riedenia liečivej látky v pomere 1 : 3 s prostredím sa naplní do mikrotitračnej platne s 96 jamkami s použitím pipety s 12 kanálikmi. Na ohodnotenie sa liečivé látky klasifikujú ako inhibitory reduktázy kyseliny dihydrolistovej (DHFR), pričom sa použije modifikované kultúrne prostredie, ktoré obsahuje iba fyziologické koncentrácie kyseliny listovej a PABA.

Zvyšné biologické procedúry sa uskutočňujú podľa technického postupu opísaného Desjardinom s tým rozdielom, že sa použijú tri kmene Plasmodium falciparum (multidrogovo rezistentný kloň W-2, drogovo senzitívny, ale k meflochínu rezistentný kloň D-6 a C2B izolát rezistentný k zlúčenine z príkladu 1) a inkubácia sa predĺži počas 72 hodín.

Jednotlivé hodnoty IC₅₀ sa vypočítajú s použitím programu „MINSQ“ od Micromath Scientific Software. Každá súprava párových hodnôt sa preloží hyperbolickou tangenciálnou fimkciou s použitím postupu podľa Desjardinsa.

Hodnoty IC₅₀ boli normalizované stanovením hodnôt 1 k IC₅₀ pre zlúčeninu z príkladu 1 a pre inú liečivú látku, ktorá bola kombinovaná s proporciálne normalizovanými hodnotami pre každý pomer dvoch liečivých látok, ktoré sa študujú. Izobologram sa zostrojí zaradením hodnôt do rovnice:

Y^l-tXAXi+e^l-XM, v ktorom

Y; znamená hodnotu IC₅o pre zlúčeninu z príkladu 1, pokiaľ je kombinovaná s inou liečivou látkou,

SK 281559 Β6

Xi znamená hodnotu IC50 pre inú liečivú látku, pokiaľ je kombinovaná so zlúčeninou z príkladu 1 a

I znamená parameter interakcie ukazujúcej stupeň reverzie.

Hodnoty I sa vypočítajú pre každú kombináciu. Kladné hodnoty I ukazujú na synergickú kombináciu, negatívne hodnoty sú ukazovateľom antagonizmu a I rovnajúce sa nule ukazuje na aditívne interakcie.

Výsledky sú uvedené v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Liečivá látka kombinovaná so zlúčeninou z príkladu 1	W-2	I D-2	C2B
chinín	-1,36
chlorochín	-1,84	-1,40
meflochin	-1,19
tetracyklín	1,27	1,11	0,02, -0,8
primachin	-0,79
kyselina artesunová		-0,18
PM443		-1,28
norfloxacín	1,02
ciprofloxacín	-1,22
pyrimetamin	0,36		-0,48
trimetoprim	1,27		0,58
proguanil	2,43 ; 2,88	2,56	2,56
cykloguanil	2,21	1,66	0,13;-0,73
allopurinol	1,14	0,43
PS-15	l,77;0,65;l,97	-0,74
WR99210	0,02
sulŕámetoxazol	2,75
dapsón	-0,39
klopidol	2,38;2,65	0,73

Výsledky ukazujú, že kombinácia 2-/4-(4-chlórfenyl)-cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinónu a proguanilu prejavuje oveľa dôkladnejšiu potenciáciu v porovnaní s inými kombináciami testovaných liečivých látok, predovšetkým proti kmeňu C2B rezistentnému k hydroxynaftochinónu.

Optimálny pomer kombinácie s proguanilom sa stanoví pre každý z troch kmeňov malárie, určením pomeru hodnoty IC50 proguanilu k hodnote TC₅o zlúčeniny vzorca (II). Výsledky sú uvedené v tabuľke 2 ďalej.

Tabuľka 2

	W-2	D-6	C2B
proguanil: zlúčenina všeobecného vzorca (I)	920: 1 2473 : 1	4038 : 1	0,2:1

Príklad 4

Porovnanie antitoxoplazmovej aktivity in vivo zlúčeniny z príkladu 1, proguanilu a ich kombinácií

Aktivity zlúčenín a kombinácií sa skúšajú na myšom modele T. gondii s použitím zvyšujúceho sa času na uhynutie a percenta prežitia pri myšiach ako meradlá aktivity liečivej látky.

Skupiny 10 myší kmeňa CBA/CA s hmotnosťou 20 g sa infikujú 6 cystami kmeňa C56 T. gondii orálne zavedenou žalúdočnou sondou. Ošetrovanie liečivou látkou sa začne o 3 dni neskôr a pokračuje počas 10 dní. Všetky liečivé látky sa podávajú orálne zavedenou žalúdočnou sondou. Skúšajú sa ďalej uvedené skupiny látok:

kontrolné stanovenie atovakvon @ 10 mg/kg atovakvon @ 25 mg/kg proguanil @ 25 mg/kg atovakvon @ 10 mg/kg a proguanil 25 mg/kg atovakvon @ 25 mg/kg a proguanil 25 mg/kg

Všetky zvieratá sa skúšajú dvakrát denne počas 30 dní a každé uhynutie sa zaznamená.

Výsledky sú uvedené v tabuľkách 3 a 4.

Tabuľka 3

Stredný čas do uhynutia (dni)

	atovakvon
proguanil	mg/kg	0	10	25
0	140	20,1	24,1
25	9,0	18,4	29,3

Tabuľka 4 % prežitia

	atovakvon
proguanil	mg/kg	0	10	25
0	10,1	10,1	10,0
25	0,0	0,0	80,0

Stredný čas trvania do uhynutia kontrolných myší je 14 dní, s iba jediným prežívajúcim zvieraťom (10 %). (Toto zviera nemuselo dostať infekciu v dôsledku nízkej hodnoty použitého inokula). Atovakvon samotný zvyšuje toto prežitie na 20,1 dňa pri dávke 10 mg/kg a na 24,1 dňa pri dávke 25 mg/kg, v obidvoch prípadoch s jediným prežitím (10%). Proguanil, napriek svojej zaznamenanej vysokej bezpečnosti u človeka, je toxický pre myši. Pri dávke 25 mg/kg proguanil prejavuje známky toxicity a znižuje stredný čas na uhynutie na 9 dní so žiadnym prežitím. Kombinácia 10 mg/kg atovakvonu s 25 mg/kg proguanilu poskytuje stredný čas prežitia 18,4 dňa. Kombinácia 25 mg/kg atovakvonu s 25 mg/kg proguanilu poskytuje zvýšený čas prežitia, napriek toxicite proguanilu a 80 % myší prežíva v porovnaní s minimálnym prežívaním 10 % myší, ktoré obdržali samotný atovakvon.

Príklad 5

Porovnanie antitoxoplazmových aktivít in vitro zlúčeniny z príkladu 1, proguanilu a ich kombinácií

Štúdie senzitivity liečivej látky in vitro sa uskutočňujú s použitím poloautomatizovaného technického postupu, založeného na postupe používanom pre maláriu (Desjardins a kol., Antimalarial Agents and Chemotherapy 16Í6), 710 - 718 /1979/), s tým rozdielom, že sa použije selektívne vpravenie ³[H]-uracilu T. gondii. Antitoxoplazmová aktivita v tomto systéme sa stanovuje inhibíciou pohlcovania rádiologický označeného uracilu v parazitoch pri stupňujúcich sa koncentráciách liečivých látok.

Liečivé látky sa rozpustia v dimetylsulfoxide a zriedené roztoky sa pripravia s použitím kultúrneho prostredia obsahujúceho 3 % fetálneho teľacieho séra. Na účely štúdia kombinácie liečivých látok sa roztoky liečivej látky pri počiatočných koncentráciách kombinujú v rôznych pomeroch 1:1, 1 : 3 a 3 :1. Pripraví sa séria riedenia liečivej látky v pomere 1:2a kombinácií a použijú v dvojitých jamkách mikrotitračnej platne s 96 jamkami, kam sa vopred naočkovali bunky HeLa a RH kmeňa T. gonii. Liečivé látky sa pridajú dve hodiny po parazitovi a dosky sa inkubujú pri teplote 37 °C počas 24 hodín, keď sa pridá ³[H]-uracil a v inkubácii sa pokračuje ďalších 8 hodín. Skúška sa dokončí odstránením kvapaliny - supematantu, T. gonii obsahujúcej bunky sa narušia v SDS a označené proteíny sa vyzrážajú s TCA na filtračnej podložke. Začlenenie označeného podielu sa meria na β doskovom scintilačnom počítači. Percento inhibície začlenenia uracilu sa vypočíta pre zlúčeniny a kombinácie. Hodnoty IC₅₀ sa vypočítajú s použitím programu GS1. Hodnoty IC50 sú normalizované stanovením hodnôt 1 k IC50 pre zlúčeninu z príkladu 1 a pre proguanil s

SK 281559 Β6 normalizovanými hodnotami pre každý pomer dvoch liečivých látok, ktoré sa študujú. Izobologram sa zostrojí vynesením týchto normalizovaných hodnôt IC50 proti sebe. Potenciácia sa ukazuje pri hodnotách vyskytujúcich sa pod krivkou izobologramu, prídavný účinok hodnotami na krivke a antagonizmus hodnotami nad krivkou.

Dosky sa používajú trojmo a všetky hodnoty sa vynesú. Výsledky sú uvedené v tabuľke 5.

Tabuľka 5

Normalizované hodnoty IC₅₀

atovakvon	proguanil	potenciácia
0,559278	0,583893	nie
0,196689	0,614094	áno
0,729381	0,253691	áno
0,345238	0,527273	áno
0,130952	0,6	áno
0,233333	0,118182	áno
0,404959	0,451538	áno
0,229201	0,768462	áno
0,244904	0,091538	áno

Výsledky ukazujú, že kombinácia atovakvonu a proguanilu prejavuje potenciáciu in vitro proti T. gondii.

Príklad 6

Porovnanie antipneumocystózovej aktivity in vivo pri zlúčenine z príkladu 1, proguanilu a ich kombinácií

Aktivity zlúčenín a kombinácií sa skúšajú na SCID myšom modele Pneumocystis pneumonia.

Úroveň infekcie myší v každej skupine sa meria s použitím štandardných odtlačkových preparátov pľúc a imunofluorescenčných testov. Vyhodnotenie sa uskutočňuje pre každú myš, pritom 0 znamená bez infekcie a +4 predstavuje veľmi ťažkú infekciu.

Výsledky sú uvedené v tabuľke 6.

nyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinónu je v rozsahu od 1 : 1 do 1 : 3.

2. Kombinácia podľa nároku 1, vyznačuj úca sa t ý m , že pomer proguanilu k 2-/4-(4-chlórfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinónuje 2 :5.

3. Kombinácia podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúca sa tým, že 2-/4-(4-chlórfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naflochinón je vo forme trans izoméru alebo zmesi cis a trans izoméru, v ktorej trans izomér prevláda.

4. Kombinácia podľa niektorého z nárokov 1 až 3, na použitie na ošetrenie a/alebo profylaxii protozoálnej parazitickej infekcie alebo infekcie spôsobenej Pneumocystis carinii u cicavcov.

5. Použitie kombinácie podľa niektorého z nárokov 1 až 3, na výrobu liečiva na ošetrovanie a/alebo profylaxiu protozoálnej parazitickej infekcie alebo infekcie spôsobenej Pneumocystis carinii u cicavcov.

6. Použitie podľa nároku 5, kde protozoálna parazitická infekcia je malária.

7. Použitie podľa nároku 5, kde protozoálna parazitická infekcia je toxoplazmóza.

8. Použitie podľa nároku 5, kde infekcia je spôsobená Pneumocystis carinii.

9. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 5 až 8, kde atovakvon a proguanil sú podávané zároveň.

10. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje kombináciu podľa niektorého z nárokov 1 až 3 spoločne s jednou alebo väčším počtom ich farmaceutický prijateľných nosných látok.

11. Prostriedok podľa nároku 10, vo forme dávkovej jednotky, vyznačujúci sa tým, že obsahuje 500mg 2-/4-(4-chlórfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinónu a 200 mg proguanilu.

Koniec dokumentu

Tabuľka 6

Otetrenle	Vyhodnotenie	potet Infitova* nýcii/poCet skúšaných	stredná hod. ísmerodajná odchýlka	%z kontrolovaného stanovenia
0	+1	*3	+4	+4
neošetrená kontrola	0	0	0	2	7	10/10	3.70 ±0,14	100
atovakvon 50 mg/kg p. o. denne	0	0	5	5	0	10/10	2.50 ±0.16	88
atovakvon 25 mg/kg p. o. denne	0	0	1	7	2	10/10	3,1010,17	84
proguanil 25 mg/kg p. o. denne	0	0	0	2	8	10/10	3.8010,13	85
atovakvon a proguanH 50*25 mg/kg p.odenne	5	4	1	0	0	5/10	0,5010,21	14
atovakvon a proguanil 26*50 mg/kg p.odenne	1	0	4	4	0	8/9	2,2210.31	60

Pokiaľ sa dávkuje samotný atovakvon, vedie k zníženiu rozsahu infekcie. Proguanil samotný v dávke 25 mg/kg za deň je neúčinný pri profylaxii PCP pri SCID myšiach. Proguanil v kombinácii s atovakvonom prejavuje synergiu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Kombinácia 2-/4-(4-chlórfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinónu a proguanilu, vyznačujúca sa tým, že pomer proguanilu k 2-/4-(4-chlórfe-