[go: up one dir, main page]

SK287932B6 - Magnetic glass particles, method for their preparation and uses thereof - Google Patents

Magnetic glass particles, method for their preparation and uses thereof Download PDF

Info

Publication number
SK287932B6
SK287932B6 SK664-2002A SK6642002A SK287932B6 SK 287932 B6 SK287932 B6 SK 287932B6 SK 6642002 A SK6642002 A SK 6642002A SK 287932 B6 SK287932 B6 SK 287932B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
magnetic
suspension
particles
mgp
nucleic acid
Prior art date
Application number
SK664-2002A
Other languages
English (en)
Other versions
SK6642002A3 (en
Inventor
Kurt Weindel
Michael Riedling
Albert Geiger
Original Assignee
Roche Diagnostics Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP00110165A external-priority patent/EP1154443A1/en
Application filed by Roche Diagnostics Gmbh filed Critical Roche Diagnostics Gmbh
Publication of SK6642002A3 publication Critical patent/SK6642002A3/sk
Publication of SK287932B6 publication Critical patent/SK287932B6/sk

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/005—Pretreatment specially adapted for magnetic separation
    • B03C1/01—Pretreatment specially adapted for magnetic separation by addition of magnetic adjuvants
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y25/00—Nanomagnetism, e.g. magnetoimpedance, anisotropic magnetoresistance, giant magnetoresistance or tunneling magnetoresistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03B—MANUFACTURE, SHAPING, OR SUPPLEMENTARY PROCESSES
    • C03B19/00—Other methods of shaping glass
    • C03B19/10—Forming beads
    • C03B19/1005—Forming solid beads
    • C03B19/106—Forming solid beads by chemical vapour deposition; by liquid phase reaction
    • C03B19/1065—Forming solid beads by chemical vapour deposition; by liquid phase reaction by liquid phase reactions, e.g. by means of a gel phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C1/00—Ingredients generally applicable to manufacture of glasses, glazes, or vitreous enamels
    • C03C1/006—Ingredients generally applicable to manufacture of glasses, glazes, or vitreous enamels to produce glass through wet route
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C12/00—Powdered glass; Bead compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C14/00—Glass compositions containing a non-glass component, e.g. compositions containing fibres, filaments, whiskers, platelets, or the like, dispersed in a glass matrix
    • C03C14/004—Glass compositions containing a non-glass component, e.g. compositions containing fibres, filaments, whiskers, platelets, or the like, dispersed in a glass matrix the non-glass component being in the form of particles or flakes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C3/00—Glass compositions
    • C03C3/04—Glass compositions containing silica
    • C03C3/076—Glass compositions containing silica with 40% to 90% silica, by weight
    • C03C3/089—Glass compositions containing silica with 40% to 90% silica, by weight containing boron
    • C03C3/091—Glass compositions containing silica with 40% to 90% silica, by weight containing boron containing aluminium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C3/00—Glass compositions
    • C03C3/04—Glass compositions containing silica
    • C03C3/076—Glass compositions containing silica with 40% to 90% silica, by weight
    • C03C3/089—Glass compositions containing silica with 40% to 90% silica, by weight containing boron
    • C03C3/091—Glass compositions containing silica with 40% to 90% silica, by weight containing boron containing aluminium
    • C03C3/093—Glass compositions containing silica with 40% to 90% silica, by weight containing boron containing aluminium containing zinc or zirconium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C23—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; CHEMICAL SURFACE TREATMENT; DIFFUSION TREATMENT OF METALLIC MATERIAL; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL; INHIBITING CORROSION OF METALLIC MATERIAL OR INCRUSTATION IN GENERAL
    • C23C—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; SURFACE TREATMENT OF METALLIC MATERIAL BY DIFFUSION INTO THE SURFACE, BY CHEMICAL CONVERSION OR SUBSTITUTION; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL
    • C23C26/00—Coating not provided for in groups C23C2/00 - C23C24/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C23—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; CHEMICAL SURFACE TREATMENT; DIFFUSION TREATMENT OF METALLIC MATERIAL; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL; INHIBITING CORROSION OF METALLIC MATERIAL OR INCRUSTATION IN GENERAL
    • C23C—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; SURFACE TREATMENT OF METALLIC MATERIAL BY DIFFUSION INTO THE SURFACE, BY CHEMICAL CONVERSION OR SUBSTITUTION; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL
    • C23C30/00—Coating with metallic material characterised only by the composition of the metallic material, i.e. not characterised by the coating process
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01F—MAGNETS; INDUCTANCES; TRANSFORMERS; SELECTION OF MATERIALS FOR THEIR MAGNETIC PROPERTIES
    • H01F1/00—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties
    • H01F1/0036—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties showing low dimensional magnetism, i.e. spin rearrangements due to a restriction of dimensions, e.g. showing giant magnetoresistivity
    • H01F1/0045—Zero dimensional, e.g. nanoparticles, soft nanoparticles for medical/biological use
    • H01F1/0054—Coated nanoparticles, e.g. nanoparticles coated with organic surfactant
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01F—MAGNETS; INDUCTANCES; TRANSFORMERS; SELECTION OF MATERIALS FOR THEIR MAGNETIC PROPERTIES
    • H01F1/00—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties
    • H01F1/0036—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties showing low dimensional magnetism, i.e. spin rearrangements due to a restriction of dimensions, e.g. showing giant magnetoresistivity
    • H01F1/0045—Zero dimensional, e.g. nanoparticles, soft nanoparticles for medical/biological use
    • H01F1/0063—Zero dimensional, e.g. nanoparticles, soft nanoparticles for medical/biological use in a non-magnetic matrix, e.g. granular solids
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01F—MAGNETS; INDUCTANCES; TRANSFORMERS; SELECTION OF MATERIALS FOR THEIR MAGNETIC PROPERTIES
    • H01F1/00—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties
    • H01F1/44—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties of magnetic liquids, e.g. ferrofluids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C2214/00—Nature of the non-vitreous component
    • C03C2214/08—Metals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
    • C03C2214/00—Nature of the non-vitreous component
    • C03C2214/32—Nature of the non-vitreous component comprising a sol-gel process
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/101—Taqman

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Geochemistry & Mineralogy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Power Engineering (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Metallurgy (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Glass Compositions (AREA)
  • Glass Melting And Manufacturing (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Hard Magnetic Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

This invention relates to magnetic particles of nano-size with glass surface, characterized in that the magnetic glass particles comprise at least one magnetic object with an average diameter between 5 and 500 nm. This invention also relates to the method of their preparation, for their suspension and their use for purification of DNA or RNA, particularly in automated procedures.

Description

Oblasť techniky
Tento vynález sa vzťahuje na magnetické v podstate guľovité, častice so skleneným povrchom. Tento vynález sa tiež vzťahuje na metódy ich prípravy, na ich suspenziám a na ich použitie na purifikáciu biologického materiálu, najmä v automatizovaných procesoch.
Veľa biologických materiálov, najmä nukleových kyselín, poskytne pri izolácii z ich normálneho prostredia výnimočné problémy. Na jednej strane sú veľmi často prítomné vo veľmi malých koncentráciách a na druhej strane sú často v prítomnosti mnohých iných pevných a rozpustných substancií, ktoré sťažujú izoláciu alebo meranie, najmä pri biologických analýzach.
Biošpecifické väzobné analýzy umožňujú detekciu špecifických analytov, napr. nukleových kyselín alebo špecifických vlastností analytov a hrajú dôležitú rolu na poli diagnostík a bioanalytík. Príklady sú hybridizačné analýzy, immuno analýzy a analýzy typu receptor-ligand.
Hybridizačné analýzy využívajú na molekulárnu detekciu analytov nukleových kyselín, napr. RNA a DNA, špecifické párovanie báz. Oligonukleotidové sondy s dĺžkou 18 až 20 nukleotidov tak môžu umožniť špecifické rozpoznanie vybranej sekvencie v ľudskom genóme. Iná analýza, ktorá využíva selektívnej väzby dvoch oligonukleotidových primérov, je polymerázová reťazová reakcia (polymerase chain reaction, PCR) opísaná v US 4 683 195. Táto metóda využíva v niekoľkých cykloch selektívnu amplifikáciu špecifickej oblasti nukleovej kyseliny termostabilnou polymerázou, až do detegovateľného množstva, za prítomnosti deoxynukleotidových trifosfátov.
Nukleové kyseliny sú pomerne komplexné analyty, ktoré sa musia normálne extrahovať z komplexnej zmesi pred tým, ako sa môžu použiť v testoch založených na sondách:
Existuje niekoľko metód na extrakciu nukleových kyselín:
- od sekvencie závislej alebo biošpecifickej metódy, ako napr.:
- afinitná chromatografia,
- hybridizácia k imobilizovaným sondám na guľôčkach,
- od sekvencie nezávislej alebo fýzikálno-chemickej metódy, ako napr.:
- extrakcia vodná fáza - vodná fáza s napr. chloroformom,
- precipitácia napr. čistým etanolom,
- extrakcia s filtračným papierom,
- extrakcia s činidlami tvoriacimi micely, ako cetyl-trimetylammónium-bromid,
- naväzovanie k imobilizovaným interkalačným farbivám, napr. derivátom akridínu,
- adsorpcia ku kremičitému gélu alebo dvojmocným zeminám (diatomic earths),
- adsorpcia k magnetickým skleneným časticiam (MGP) alebo organosilánovým časticiam pri chaotropných podmienkach.
V posledných rokoch sa navrhlo veľa procedúr a materiálov na izoláciu nukleových kyselín z ich prirodzeného prostredia, ktoré využívali ich naväzovanie na sklenené povrchy. Napríklad v Proc. Natl. Acad. USA 76, 615 - 691 (1979) je navrhnutý postup na naväzovanie nukleových kyselín v agarózových géloch na mleté flintové sklo v prítomnosti jodidu sodného.
V Anál. Biochem. 121, 382 - 387 (1982) je opísaná purifikácia plazmidovej DNA z baktérií na sklenenom prachu v prítomnosti chloristanu sodného (sodium perchlorate).
V DE-A 37 34 442 je opísaná izolácia jednopramennej DNA fágu M13 na vláknitých filtroch precipitáciou fágových častíc s využitím kyseliny octovej a lýza fágových častíc chloristanom. Nukleové kyseliny sa naviažu na filtre zo sklenených vlákien, omyjú a potom vymyjú Tris/EDTA pufrom s obsahom metanolu.
Podobná procedúra na purifikáciu DNA z fágov lambda je opísaná v Anál. Biochem. 175, 196 - 201 (1988).
Procedúra, známa už skoršie, vyvolá selektívnu väzbu nukleových kyselín na sklenený povrch v roztokoch chaotropných solí a oddelí nukleové kyseliny od kontaminujúcich prímesí, ako je agaróza, proteíny alebo bunkové zvyšky. K oddeleniu sklenených častíc od znečisťujúcich látok sa častice podľa doterajších postupov buď centrifúgujú, alebo sa tekutina prefiltruje cez sklenený vláknitý filter. To je ale obmedzujúci krok, ktorý zabraňuje použitiu tohto postupu na spracovanie veľkého počtu vzoriek.
Ukázalo sa, že magnetické častice pokryté skleneným povrchom ponúkajú na izoláciu biologických materiálov značné výhody. Keď sa nevystavili magnetické častice pôsobeniu magnetického poľa, je jedinou silou použiteľnou na sedimentáciu gravitácia. Pretrepaním roztoku sa môžu resuspendovať. Sedimentačná procedúra, ktorá nevyužíva magnetické pole, je pomalšia, ako imobilizácia biologických materiálov na časticiach. To platí najmä pre nukleové kyseliny. Magnetické častice sa môžu ľahko sústrediť na určitom mieste v roztoku pomocou magnetu. Roztok sa potom oddelí od častíc a teda tiež od prichytených biologických materiálov.
Použitie magnetických častíc na imobilizáciu nukleových kyselín po precipitácii, pridaním soli a etanolu, je opísané v Anál. Biochem. 201, 166 - 169 (1992) a v PCT GB 91/00212. V tomto postupe sa nukleové kyseliny aglutinujú spoločne s magnetickými časticami. Aglutinát sa oddelí od pôvodného roztoku aplikáciou magnetického poľa a premývacím krokom. Po jednom premytí sa nukleové kyseliny rozpustia v Tris pufri. Tento postup má ale nevýhodu v tom, že precipitácia nie je selektívna pre nukleové kyseliny. Dochádza tiež k aglutinácii radu pevných a rozpustených častíc. Výsledkom je, že sa táto procedúra nemôže použiť na odstránenie významného množstva inhibítorov špecifických enzymatických reakcií, ktoré sa môžu vyskytovať.
Na trhu je tiež magnetické porézne sklo, ktoré obsahuje v pórovitej, špeciálnej sklenej základnej hmote (matrix) magnetické častice a ktoré je pokryté vrstvou obsahujúcou streptavidín. Tento produkt sa môže použiť na izoláciu biologických materiálov, napr. proteínov alebo nukleových kyselín, ktoré sú modifikované v komplexnom prípravnom kroku tak, že sa viažu kovalentne na biotín. Zmagnetovateľné špecifické adsorbenty sa ukázali ako veľmi účinné a vhodné na automatickú prípravu vzorky. Na tieto účely sa môžu použiť ferimagnetické, feromagnetické a superparamagnetické pigmenty.
Čiastočky sú podľa odborníkov pevné materiály s malým priemerom. Takéto čiastočky sa často nazývajú pigmenty.
Tieto materiály, ktoré sú označené ako magnetické, sú priťahované k magnetu, tzn. napríklad feromagnetické alebo superparamagnetické materiály. Ako výhodný a preferovaný sa odborníkom javí supermagnetizmus (napr. US 5 928 958; US 5 925 573; EP 757 106). Sklené alebo organosilánové (organosilane) povrchy sú často na použitie v biošpecifických väzobných reakciách upravované, napr. US 5 928 958, US 5 898 071, US 5 925 573, EP 937 497, US 9 554 088 alebo US 4 910 148. Alebo sa môže sklený alebo organosilánový povrch upraviť rôznymi rozpúšťadlami alebo soľami na modifikáciu ich hydrofilnosti a/alebo ich elektropozitivity, napr. US 5 438 127.
Nederivatizované silanolové skupiny skla alebo silánového povrchu môžu byť, ale za vhodných reakčných podmienok opísaných v DE 195 20 964, DE 195 37 985, WO 96/41840, WO 96/41811, EP 757 106 alebo US 5 520 899 použité na adsorpciu pomocou čírych fyzikálno-chemických síl. Typicky sú magnetické jadrá alebo magnetické jadrové agregáty pokryté skleným povrchom, ktorý sa vytvorí kyselinou- alebo zásadou- katalyzovaným sol-gél procesom (by an acidor base- catalyzed sol-gel-process). Tieto častice sa nazývajú častice typu jadro-plášť (core-shell particles). Sklený obal má potom typickú hrúbku vrstvy (pozri napr. DE 195 20 964), kde veľkosť a tvar pigmentu (ktorý môže obsahovať okrem magnetických kovových oxidov tiež nemagnetické častice, ako napr. sľudu) určujú veľkosť a tvar produkovanej častice (pozri napr. DE 195 37 985 a zodpovedajúci WO 96/41811). Aby sa získala vysoká povrchová aktivita, používa sa sklený materiál s veľkou pórozitou (pozri napr. EP 757 106; WO 99/26605). Opísané sú ďalej zložené magnetické častice, napr. kremičitanom obalený oxid železitý obalený anorganickou kremennou hmotou z kremenných častíc (EP 757 106), alebo zmesi sklenených a kremenných gélov (mixtures of glass and silica gel) (WO 95/06652). Problém, ktorý by mal vyriešiť predkladaný vynález, sa môže vidieť ako poskytnutie magnetických sklených častíc so zlepšenými vlastnosťami na prípravu vzorky a na biologické analýzy, najmä v automatizovaných procesoch.
Nedostatok magnetických sklených častíc v súčasnom stave vývoja sa vyrieši výsledkami predkladaného vynálezu.
Cieľom vynálezu je poskytnúť zmes (composition) magnetických sklených častíc. Magnetické sklené častice (magnetis glass particles - MGPs) sú podľa predkladaného vynálezu pevné disperzie malých magnetických jadier v skle. MGP sú relatívne malé a sú v podstate guľovité. Nemagnetický jemný obsah zmesi MGP je veľmi nízky, vďaka metóde ich prípravy. To má ten účinok, že suspenzia MGP sedimentuje pomaly a môže tak byť výhodne využitá na postupy v molekulárnej biológii, ktoré sa môžu automatizovať. V jednej forme vynálezu sú poskytnuté zmesi a suspenzia MGP podľa predkladaného vynálezu. V inej forme vynálezu je poskytnutá metóda pre zmes MGP. V ešte ďalšej forme vynálezu je poskytnutá metóda na purifikáciu DNA alebo RNA, kde sa používajú MGP podľa predkladaného vynálezu.
Predmetom vynálezu je spôsob výroby zmesi magnetických sklených častíc, ktorého podstata spočíva v tom, že zahrnuje stupne
a) suspendovanie magnetických objektov s priemerom medzi 5 až 500 nm v sólu,
b) sušenie suspenzie rozprašovaním vo dvojdýzovej rozprašovacej sušiarni a,
c) slinovanie rozprašovaním vysušeného prášku.
Výhodne vstupná teplota dvojdýzovej rozprašovacej sušiarne je medzi 120 °C a 500 °C, výstupná teplota je zvolená podľa teploty varu sólu a rozprašovací tlak je aspoň rovnajúci sa aspoň 0,3 Mpa.
Výhodne vstupná teplota dvojdýzovej rozprašovacej sušiarne leží medzi 170 °C a 230 °C, výhodnejšie medzi 190 °C a 210 °C.
Výhodne rozprašovací tlak leží medzi 0,4 a 0,6 Mpa.
Výhodne soľ ako rozpúšťadlo obsahuje etanol.
Výhodne výstupná teplota leží medzi 50 °C a 300 °C.
Výhodne výstupná teplota leží medzi 90 °C a 100 °C.
Výhodne slinovacia teplota leží medzi 400 °C a 1200 °C, výhodne medzi 720 °C a 770 °C.
Predmetom vynálezu sú rovnako magnetické sklenené častice ziskateľné uvedeným spôsobom.
Predmetom vynálezu je rovnako zmes magnetických sklenených častíc získateľná uvedeným spôsobom, ktorá obsahuje aspoň jeden magnetický objekt so stredným priemerom medzi 5 a 500 nm, a ktorej podstata spočíva v tom, že polčas sedimentácie suspenzie zmesi v izopropanolu s obsahom 3 mg/ml (hmotn./obj.) je dlhší než 3 minúty.
Výhodne magnetický objekt má stredný priemer medzi 10 a 200 nm, výhodne medzi 15 a 50 nm.
Výhodne polčas sedimentácie je dlhší než 6 minút.
Výhodne magnetický objekt má stredný priemer 23 nm.
Výhodne pomer priemeru magnetického telieska k priemeru skleneného plášťa je menší než 1:10.
Výhodne magnetické sklenené častice majú stredný priemer medzi 0,5 pm a 5 pm.
Výhodne magnetické sklenené častice sú mikroporézne.
Výhodne porézny povrch magnetických sklenených častíc tvorí menej než 10 % celkového povrchu.
Výhodne magnetický objekt je superparamagnetický.
Výhodne magnetický objekt je ferimagnetický alebo feromagnetický.
Výhodne magnetický objekt obsahuje železo alebo oxid železa.
Výhodne oxidom železa je Fe3O4 alebo *y*Fe2O3.
Výhodne magnetické sklenené častice majú povrchovú plochu väčšiu než 4 m2/g.
Výhodne sklenené častice majú povrchovú plochu medzi 5 a 100 m2/g, výhodne v rozmedzí 10 až 50 m2/g, najvýhodnejšie v rozmedzí 15 až 30 m2/g.
Výhodne magnetické sklenené častice sú v podstate sférické.
Predmetom vynálezu je rovnako suspenzia, ktorej podstata spočíva v tom, že obsahuje uvedenú zmes magnetických častíc v kvapaline.
Výhodne kvapalina obsahuje alkohol.
Výhodne alkoholom je isopropanol alebo etanol.
Výhodne kvapalinou je pufrovaný vodný roztok.
Výhodne suspenzia dodatočne obsahuje DNA alebo RNA.
Výhodne suspenzia dodatočne obsahuje chaotropné činidlo.
Výhodne chaotropné činidlo je prítomné v koncentrácii medzi 2 a 8 mol/1, výhodnejšie medzi 4 a 6 mol/1.
Výhodne suspenzia obsahuje 5 až 60 mg/ml uvedenej kompozície.
Predmetom vynálezu je rovnako skúmavka obsahujúca uvedenú kompozíciu alebo uvedenú suspenziu.
Predmetom vynálezu je rovnako viaczložková súprava obsahujúca uvedenú skúmavku.
Výhodne súprava ďalej obsahuje premývací roztok alebo eluent.
Výhodne súprava obsahuje činidlá vhodné na čistenie nukleovej kyseliny.
Predmetom vynálezu je rovnako použitie uvedenej zmesi na prípravu suspenzie.
Výhodne sa suspenzia použije na čistenie nukleových kyselín.
Predmetom vynálezu je rovnako použitie uvedenej viaczložkovej súpravy na čistenie nukleových kyselín.
Predmetom vynálezu je rovnako spôsob izolácie biologického materiálu, ktorého podstata spočíva v tom, že obsahuje
a) privedenie vzorky, ktorá obsahuje biologický materiál v kvapaline, do kontaktu so zmesou podľa niektorého z nárokov 10 až 24, magnetickými sklenenými časticami podľa nároku 9 alebo suspenziami podľa niektorého z nárokov 25 až 32 za podmienok, pri ktorých sa biologický materiál viaže priamo na sklenený povrch, a
b) oddelenie biologického materiálu od kvapaliny.
Výhodne biologickým materiálom je nukleová kyselina.
Výhodne sa oddelenie uskutoční pomocou magnetu.
Výhodne magnetické častice nie sú predmagnetizované, keď sú privedené do kontaktu so vzorkou.
Výhodne je spôsob automatizovaný.
Výhodne je spôsob prevádzkovaný vo formáte vysokého presadenia.
Výhodne sa pri spôsobe odoberie zo zásobnej nádoby uvedená suspenzia a čiastkové objemy suspenzie sa pridajú do rôznych reakčných nádob.
Výhodne sa nukleová kyselina po čistení deteguje.
Výhodne sa nukleová kyselina deteguje po amplifikačnom stupni.
Výhodne sa nukleová kyselina deteguje spôsobom zahrnujúcim: a) uvedenie do kontaktu vzorky s oligonukleotidom obsahujúcim sekvenciu komplementárnu k oblasti cieľovej nukletidovej kyseliny a so značeným oligonukleotidom obsahujúcim sekvenciu komplementárnu k druhej oblasti toho istého vlákna sekvencie cieľovej nukleovej kyseliny, ale nezahrnujúcim sekvenciu nukleovej kyseliny definovanú prvým oligonukleotidom, na vytvorenie za hybridizačných podmienok zmesi duplexov, pričom tieto duplexy obsahujú cieľovú nukleovú kyselinu spojenú s prvým oligonukleotidom a so značeným oligonukleotidom tak, že 3'- koniec prvého oligonukleotidu je priľahlý ku 5'-koncu značeného nukleotidu;
b) udržanie zmesi zo stupňa a) s templat-dependentnou polymerázou nukleových kyselín majúcou 5'- a 3'-nukleázovou aktivitu za podmienok dostatočných na umožnenie 5'- a 3'-nukleázovej aktivite rozštiepiť pripojený značený oligonukleotid a uvoľniť značené fragmenty; a
c) detekciu a/alebo meranie signálu generovaného hydrolýzou značeného oligonukleotidu.
Spôsob podľa niektorého z nárokov 48 až 49, vyznačujúci sa tým, že detekcia sa uskutočňuje za prítomnosti blokujúceho oligonukleotidu.
Výhodne blokujúcim oligonukleotidom je aptamer.
Výhodne aptamer má sekvenciu SEQ ID NO:23.
Výhodne sa amplifikačná a detekčná reakcia uskutočňuje vo formáte homogénneho multiplexového stanovenia v roztoku na účely súčasnej detekcie viacpočetných cieľov.
Výhodne v priebehu aspoň 5 cyklov polymerázovej reťazovej reakcie je teplota nasadenia primérov menej ako 8 °C, výhodne menej ako 3 °C, nad disociačnou teplotou polymerázo-aptamérového komplexu.
MGP podľa predkladaného vynálezu sú sklenené kvapôčky, v ktorých sú rozptýlené veľmi malé, v ktorých sú rozptýlené veľmi malé, neagregujúce magnetické častice. Tieto častice, ktoré sa nazývajú ako magnetické, sú priťahované k magnetu, tzn. napríklad feromagnetické alebo superparamagnetické materiály. Preferované sú feromagnetické materiály, najmä ak neboli dosiaľ predmagnetizované. Predmagnetizovaním sa v tomto kontexte rozumie kontakt s magnetom, ktorý zvýši zvyškový magnetizmus (remanencia). Preferovanými magnetickými materiálmi sú železo alebo oxidy železa, ako napríklad magnetid (Fe3O4) alebo Fe2O3, prednostne y-Fe2O3. V zásade sa môžu použiť železitan bámatý, nikel, kobalt, zlatiny Al-Ni-Fe-Co, alebo iné feri alebo feromagnetiká (ferri or ferromagnetic). Magnetickými časticami môže byť napr. magnetický pigment. Veľkosť magnetických častíc je v nano rozsahu, tzn. podľa predkladaného vynálezu je priemer medzi 5 a 500 nm, lepšie medzi 10 a 200 nm a ešte lepšie medzi 15 a 50 nm. Vhodné magnetické pigmenty vyrába firma CERAC; majú stredný priemer 23 nm a skladajú sa z yFe2O3 (BET-povrch 50 m2/g, CERAC: P. O. Box 1178, Milwaukee, Wisconsin 53201 - 1178 USA; Article-No. 1-2012). Magnetické sklenené častice podľa predkladaného vynálezu sú ďalej charakterizované skutočnosťou, že MGP majú priemer častice medzi 0,5 a 5 pm, prednostne potom medzi 1 a 2 pm, čo sa určilo pomocou vysokorozlišovacieho rastrovacieho elektrónového mikroskopu, zatiaľ čo magnetické častice majú priemer medzi 5 až 500 nm, prednostne medzi 10 a 200 nm, alebo ešte lepšie medzi 15 a 50 nm, ako bolo uvedené. MGP predkladaného vynálezu sú teda ďalej charakterizované pomerom priemerov magnetického pigmentového jadra k magnetickej sklenej častici menším ako 1 k 10, ako sa určilo vysokorozlišovacou rastrovacou elektrónovou mikroskopiou. Vďaka týmto pomerom priemerov a tiež vďaka neprítomnosti akéhokoľvek inertného nosiča, ktorý by určoval tvar a veľkosť častíc, sú geometria MGP a počet začlenených magnetických častíc určených podmienkami výroby. MGP podľa predloženého vynálezu sú mikroporózne, ale majú vysoko štruktúrovaný a teda relatívne veľký povrch s viacej ako 6 m2/g. Magnetické sklené častice podľa predkladaného vynálezu majú prednostne povrch v rozsahu 5 až 100 m2/g, lepšie v rozsahu 5 až 90 m2/g, ešte lepšie v rozsahu 10 až 50 m2/g a najlepšie v rozsahu 15 až 30 m2/g. Tento povrch je zhruba dvojnásobný v zrovnaní s časticami opísanými v DE 195 37 985. To sa môže určiť metódou Braunauer-Emett-Teller s využitím automatického komerčného prístroja (pozri príklad 4). Diskusia tejto metódy, neformálne nazývanej BET metóda, je v práci S. Brauner. The Adsorbtion of Gases and Vapors, Vol. 1, Princeton University Press, 1943. Napríklad vzorka EJ0096.5R-01, o ktorú je prednostne záujem (pozri príklad 1 a tabuľky 1 až 3 pre prehľad výrobných parametrov), má BET-povrch 26,8525 m2/g, oblasť mikropóru 2,3058 m2/g a priemerný priemer póru 24,9132 nm. To znamená, že povrch póru je menej ako 10 % celkového povrchu a že magnetická sklená častica je mikroporózna.
Pórom sa myslí zárez (recess) vo vonkajšom povrchu častice. Povrch zasahuje tak ďaleko do častice, že zvislá línia vynesená v záreze na povrchu rozdelí časticu aspoň jeden raz v smere priľahlého prostredia častice. Navyše póry zasahujú do častice do hĺbky, ktorá je väčšia ako jeden polomer póru.
Pomalšia sedimentačná kinetika, väčší povrch a sférický tvar inhibujúci agregáciu sa prejaví v lepšom funkčnom správaní ako adsorbenta pri diagnóze nukleových kyselín (pozri príklad 3, 5 a 7), pri porovnaní s nemeckými návrhmi patentov DE 198 54 973.3, alebo DE 198 55 259.9. Toto kritérium sa môže kvantifikovať posunom cyklu, keď dôjde k prekročeniu nastaveného prahu (threshold cycle) v tzv. TaqMan® testoch, pomeru signál-pozadie, a štatisticky potvrdeným nižším detekčným limitom. Metódy na tento test sú uvedené v WO92/02638 a zodpovedajúcich US patentoch (US 5 210 015, US 5 804 375, US 5 487 972). Experimenty s rádioaktívnym sledovaním (pozri príklad 5.2) ukázali, že spôsob naväzovania pokiaľ ide o DNA a RNA bol ten istý, ako pri súčasnom referenčnom materiáli.
Produkčné parametre mali prekvapivo vplyv na výsledky experimentov s rádioaktívnym sledovaním. Ďalšou výhodou MGP typu predkladaného vynálezu je to, že neexistencia tenzie vo sklenej vrstve môže viesť kvôli vnútornej štruktúre k prasklinám počas procesu sušenia a zodpovedajúcim poškodením vo sklenom obale (dôkladný (solid) rozptyl malých magnetických jadier v sklenenej kvapke). To sa môže skúmať metódami tvorby obrazu (pozri príklad 3).
Inou formou predkladaného vynálezu je suspenzia magnetických častíc. Je to zrejmé odborníkom, ktorí pripravujú suspenzie pridávaním tekutiny ku zmesi MGP a premiešaním suspenzie do homogenity. Tekutina podľa predkladaného vynálezu môže zahrnovať akúkoľvek tekutinu, ktorá neovplyvní stabilitu magnetických častíc a môže sa použiť pre tvorbu homogénnej suspenzie.
Prednostne sa používajú tekutiny vhodné na procesy v molekulárnej biológii, najmä na procesy purifikácie deoxyribonukleovej kyseliny (DNA) alebo ribonukleovej kyseliny (RNA), ktoré využívajú za určitých podmienok naväzovania týchto látok na sklenené častice. Medzi preferované tekutiny patria alkoholy alebo akékoľvek ich zmesi s vodou alebo ketóny. Medzi alkoholy by podľa predkladaného vynálezu mali patriť predovšetkým primáme, sekundárne a terciáme alkoholy so všeobecným zložením R-OH, kde R znamená všeobecný vzorec -(-CH2)n-CH3, kde n > 0. Ale použité môžu byť aj iné alkoholy, ak sú vhodné na účely molekulárnej biológie, ako napríklad glycerol. Zvlášť vhodné sú izopropanol, etanol alebo ich zmesi s vodou, prednostne zmes 80 objemových častí izopropanolu a 20 objemových častí vody. V inej forme vynálezu tekutina obsahuje ketóny, ako napríklad acetón. V preferovanej forme vynálezu tieto suspenzie obsahujú medzi 5 a 60 mg/ml MGP. V inej forme vynálezu sú MGP suspendované vo vodných pufrovaných roztokoch, ktoré môžu prípadne obsahovať chaotropnú látku v koncentrácii medzi 2 a 8 mol/1, alebo lepšie medzi 4 a mol/1. Chaotropnými soľami môžu byť jodid sodný, chloristan sodný, guanidín tiokyanát, guanidín izotiokyanát, alebo guanidín hydrochlorid. Sú tiež možné iné zlúčeniny. Chaotropné činidlo podľa predkladaného vynálezu bude akákoľvek chemická látka, ktorá rozruší usporiadanú štruktúru kvapalnej vody a spôsobí naväzovanie DNA alebo RNA na MGP podľa predkladaného vynálezu, ak je táto látka v roztoku obsahujúcom DNA alebo RNA. Je to samozrejmé pre kvalifikovaného pracovníka pripravujúceho vhodné pufrované vodné roztoky. Pufrovacie systémy, ktoré sa môžu použiť na účely molekulárnej biológie, je možné nájsť napríklad v Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, Cold Spring Harbour University Press, New York, NY, USA. Preferovanými pufrovacími látkami sú Tris-hydroxymetylamín fosfát (TRIS), N-(2-hydroxyetyl)piperazín-N'(etánsulfónová kyselina) (HEPES), ich soli, alebo iné látky. Okrem toho môžu byť prítomné látky, ktoré upravujú iónovú silu roztoku, ako napríklad NaCl, KC1, alebo CaCl2, alebo ktoré sú komplexotvomými látkami kovových katiónov, ako napríklad etylén-diamín-tetra-octová kyselina (EDTA), alebo jej soli. Môže byť tiež prítomný biologický materiál známy odborníkom. V inej forme predkladaného vynálezu môže suspenzia MGP ďalej obsahovať DNA alebo RNA, prípadne v zmesi s proteínmi, mastnými kyselinami, sacharidmi a inými materiálmi biologického pôvodu. V inej forme predkladaného vynálezu môže tekutina obsahovať zmes jednej alebo viacej zložiek vybraných zo skupiny alkoholov, ketónov, vodných pufrovaných roztokov, chaotropných látok, látok modifikujúcich iónovú silu roztoku, komplexotvomých látok, biologický materiál, DNA alebo RNA, všetky s vlastnosťami opísanými skôr.
Pri inej forme vynálezu je poskytnutá skúmavka alebo reakčná nádoba obsahujúca suspenziu podľa predkladaného vynálezu. Skúmavka môže byť vyrobená z plastov, ale môže byť tiež časťou väčšej štruktúry, napríklad mikrotitračné doštičky v formáte s 96 alebo 384 jamkami. Ešte ďalšou poskytnutou formou vynálezu je skladovacia nádoba, ktorá obsahuje zmes magnetických častíc alebo ich suspenzie. Ďalšou poskytnutou formou vynálezu je súprava jednotlivých súčastí, ktorá obsahuje skladovaciu nádobu, ktorá obsahuje zmes magnetických sklených častíc alebo ich suspenzie podľa predkladaného vynálezu. Súprava sa môže použiť na purifikáciu DNA alebo RNA. Takéto súpravy známe odborníkom ďalej obsahujú výrobky z plastu, ktoré sa môžu použiť počas purifikačného procesu, napríklad mikrotitračné doštičky vo formáte s 96 alebo 384 jamkami, alebo obyčajné reakčné skúmavky, vyrábané napríklad firmou Eppendorf, Hamburg, Nemecko. Súprava môže ďalej obsahovať premývací roztok, ktorý je vhodný na premývaci krok magnetických sklených častíc, keď je na ne naviazaná DNA alebo RNA. Často je premývací roztok poskytovaný ako zásobný roztok, ktorý sa musí pred použitím zriediť. Súprava môže ďalej obsahovať vymývací roztok, tzn. roztok alebo pufer (napr. TE, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0), alebo čistú vodu na uvoľnenie DNA alebo RNA naviazanej k magnetickým skleným časticiam. Ďalej potom môžu byť prítomné ďalšie reakčné činidlá, ktoré sa môžu použiť na proces purifikácie nukleových kyselín, tzn. DNA alebo RNA. V jednej forme vynálezu je súprava z častí podľa predkladaného vynálezu použitá na purifikáciu nukleových kyselín.
V jednej forme vynálezu sa môže použiť zmes MGP naprípravu suspenzie, ako to bolo už opísané.
V inej forme vynálezu sa môžu použiť suspenzie podľa predkladaného vynálezu na purifikáciu nukleových kyselín, tzn. RNA alebo DNA, z komplexných zmesí, ktoré obsahujú tiež ostatné biologické substancie. Môžu sa teda purifikovať tiež zmesi rôznych nukleových kyselín, dokonca aj zmesi obsahujúce nukleové kyseliny, ktoré nás zaujímajú, v malom množstve. Purifikačný efekt je výsledkom správania DNA alebo RNA, ktoré sa viažu za určitých podmienok na magnetické sklené častice, napríklad za prítomnosti určitej koncentrácie chaotropnej látky. MGP s naviazanými DNA alebo RNA sú potom radšej aspoň jeden raz premyté, najlepšiu zmesou 70 objemových častí etanolu s 30 objemovými časťami vody („70 % etanol“). Potom sa podmienky zmenia, tzn. na vymytie DNA alebo RNA naviazaných na MGP častice sa zníži koncentrácia chaotropnej látky. To sa prednostne uskutoční peletovaním magnetických sklených častíc, napríklad gravitáciou alebo použitím magnetu a resuspendovaním v roztoku bez obsahu a/alebo s nízkym obsahom chaotropnej látky. Alebo sa môže prípadne roztok zriediť roztokom bez obsahu a/alebo s nízkym obsahom chaotropnej látky. Purifikovaná DNA alebo RNA sa teraz môže použiť na ďalšie reakcie.
Jedným cieľom predkladaného vynálezu je poskytnutie výrobného postupu pre MGP podľa predkladaného vynálezu. Sklom sa podľa predkladaného vynálezu rozumie amorfný materiál, ktorý obsahuje kremík. Sklo môže obsahovať ďalšie látky, ako B2O3 (0 - 30 %), A12O3 (0 - 20 %), CaO (0 - 20 %), BaO (0 - 10 %), K2O (0 - 20 %), Na2O (0 - 20 %), MgO (0-18 %), Pb2O3 (0-15 %). Sklo tiež môže obsahovať menšie percento (0 - 5 %) rad ďalších oxidov, ako Mn2O3, TiO2, As2O3, Fe2O3, CuO, CoO atď.
Podľa predkladaného vynálezu sú zvlášť preferované sklá, ktoré sú pripravené s použitím gél-sol procesu opísaného v WO 96/41811 a potom vysušené a zlisované. Základné princípy tohto procesu sú známe a boli opísané, napr. v C. J. Brinker, G. W. Scherer „Sol Gel Science - The Physics and Chemistry of Sol Gel Processing“, Academic Press Inc. 1990, Sol-Gel Optics, Processing and Applications, Lisa C. Klein, Ed., Kluwer Academic Publishers 1994, p. 450 ff., a v DE-A-1941191, DE-A-3719339, DE-A-4117 041, DE-A-4217432 a WO 96/41811. V prvom rade sú v gél-sol procesu alkoholáty sieťujúcich zložiek, napr. SiO2, B2O3, A12O3, TiO2, ZrO2, GeO2 skombinované s oxidmi a soľami ostatných zložiek, napríklad v alkoholovom roztoku a potom hydrolyzované. Nasledujúca rovnica opisuje postup na prípravu sodného borohliníkového silikátového skla:
+ W9O
NaOH + B2O3 + A1(OR)3 + Si(OR)4
NaOH + B2O3 + <A1(OH)3> + <Si(OH)4> ->
OH
-> B-O-Al-Si-OH T
-> (Na2O-B2O3-Al2O3-SiO2) Sklo
O- Gel Na+
Na začiatok procesu hydrolýzy východiskových komponentov sa pridá voda. Reakcia prebieha relatívne rýchlo, pretože alkalické ióny majú katalytický vplyv na rýchlosť hydrolýzy esteru kyseliny kremičitej. Len čo dôjde k vytvoreniu gélu, môže sa vysušiť a zahustiť (alebo kondenzovať) termálnymi procesmi, čím sa vytvorí sklo.
V jednej forme vynálezu sa sklovitá základná hmota pripraví kyselinou alebo zásadou katalyzovanou solgél syntézou, ako je naznačené schematicky na obrázku 1 a obrázku 2 a detailne opísané v príklade 1. Využíva sa tu koloidný systém, kde sú najskôr dispergované pevné zložky v tekutej fáze (=sol) a po spracovaní sú vzájomne pospájané podobne ako včelí plást (=gél). Zloženie skla (kód EJ) vypočítané z množstva výťažkov bolo 70,67Mol %SiO2, 14,33Mol %B2O3, 5,00 Mol %A12O3, 4,00Mol % K2O, 2,00 Mol %CaO, 4,00Mol %ZnO. Zloženie skla (kód RN) bolo 74Mol %SiO2, 15Mol %B2O3, 5,00 Mol %A12O3, 4,00Mol % K2O, 2,00 Mol %CaO. Zloženie skla (kód EP) bolo 73,61 Mol %SiO2, 14,93Mol %B2O3, 5,21 Mol %A12O3, 4,17Mol % K2O, 2,08 Mol %CaO.
Reakcia môže byť opísaná nasledovne: buď katalyzovaná kyselinou, napríklad:
BC13 + 3 H2O -> B(OH)3 + 3 H(+)C1( )
A1C13 + 3 H2O -> A1(OH)3 + 3 H(+)C1W SiCl4 + 4 H2O -> Si(OH)4 + 4 H<+)C1W Na(->NO3M(·’ + H2O -» Na(+)OH(-’ + H(+) NO3H K(+)()OOCCH3 + H2O K(+)OH(’’ + H(+)()OOCCH3 alebo katalyzovaná zásadou, napríklad:
K(+)( )OCH2CH3 4 H2O -> K<+)OHh + HOCH2CH3 Na(+)(’’OCH3 + H2O -> Na(+)OH(') + HOCH3 A|(3+) [<->oCH2CH2CH3]3 + 3 H2O -> A1(OH)3 + 3 HOCH2CH2CH3 B(OCH2CH3)3 + 3 H,O -> B(OH)3 + 3 HOCH2CH3
Rôzne hydroxidy kondenzujú na zodpovedajúce oxidy, ktoré tvoria trojrozmernú sieť, amorfnú sklenenú hmotu SiO2/B2O3/Al2O3 s kovovými iónmi na vmedzerených (interstitial) miestach. Okrem opísaných alka7 lických iónov a iónov alkalických zemných kovov, sa môžu zainkorporovať do hmoty, ako činidlá ovplyvňujúce zosieťovanie, ióny prechodových kovov, ako napríklad Zn2+ a Zr2/
III i —Ä—O -—Si— «=> —Si—OnZn<u) (,O—Si—
III I
I I I I —Si—O—51— —> —5i—Ow (iO—Si—
I I I k<*> í
V inej forme vynálezu sa môže sklo pripraviť metódami známymi odborníkom - tavením surového SiO2 a uhličitanov alkalických kovov alebo alkalických zemných kovov Na2CO3, K2CO3 alebo CaCO3.
Reakcia môže byť opísaná nasledovne:
Na2CO3 + SiO2 —> Na2SiO3 (= Na2O SiO2) + Coj K2CO3 + SiO2 -> K2SiO3 (= K2O SiO2) +CO2 Ť CaCO3 +SiO2 —>CaSiO3 (= CaO SiO2) +CO2 Ť
Vo väčšine prípadov, ale výsledkom nie je čistá silikátová matrix, ale matrix boritan-hliník-kremičitan, tzn. vzhľadom na jednotlivé časti tvoriace sieť je časť SiO2 nahradené B2O a A12O3.
Pomer sol: pigment má značný efekt na výnos magnetických častíc poskytovaných týmto vynálezom. Pre proces je dôležité, že sol môže byť stále kvalifikovaným pracovníkom pumpovaný a rozprašovaný.
Pre prípravu prášku sa kaša prednostne rozprašuje cez dvojkvapalinovú dýzu (two-fluid nozzle) opísanú na obrázku 1 a v príklade 1.3. Vhodné sušiace rozprašovacie systémy vyrába Nubilosa Molekularzerstäubung, Ladisch GmbH & Co. KG, Konstanz, Nemecko, napríklad „Labor-Zerstäubungstrockner (yp LTK)“ alebo Biichi AG, Uster, Švajčiarsko, napríklad Mini Spray Dryer (Type B-191).
Pretože pomery priemeru magnetických jadier k sklenenému obalu sú menšie ako 1:10, prednostne medzi 1 : 10 a 1 : 1000, geometria a počet včlenených magnetických jadier alebo ich inertných nosičov neurčujú tvar a veľkosť častíc; určujú to podmienky výroby, najmä podmienky počas sušenia rozprašovaním. Inými slovami voľba tlaku, vstupná teplota, výstupná teplota a rýchlosť prietoku počas procedúry sušenia rozprašovaním predstavujú stupne voľnosti, ktoré určujú rozloženie častíc a tvar sklenených kvapiek, čím modifikujú MGP.
Keď sa zvýši rozprašovací tlak, rozloženie veľkosti sa posunie smerom k sub-g-oblasti. Znížená teplota počas procesu sušenia rozprašovaním povedie k pomalšiemu vyparovaniu rozpúšťadla, čím sa tvar MGP priblíži bližšie k ideálnej guli, tzn. pomer polomerov v rovinách xy- a xz- sa priblíži zhruba 1. Pomer polomerov sa bude pohybovať medzi 0,8 a 1,2, lepšie medzi 0,9 a 1,1.
V preferovanej forme vynálezu sú dýzy zohrievané. Prívodná teplota je medzi 120 °C a 500 °C, lepšie medzi 170 °C a 230 °C, alebo 150 °C a 230 °C a najlepšie medzi 150 °C a 200 °C, alebo 190 °C a 210 °C, alebo pri teplote 200 °C alebo trochu nižšej. Výstupná teplota závisí od teploty varu sólu a tým od rozpúšťadla a môže byť nad, rovnaká alebo slabo pod, tzn. menej ako 10 °C, teplotou varu rozpúšťadla. Keď sa ako rozpúšťadlo použije etanol, je medzi 50 °C a 300 °C, lepšie medzi 70 °C a 150 °C a najlepšie medzi 80 °C a 110 °C. Optimálna teplota je medzi 90 °C a 100 °C. Tlak dýzy je cez 3 bary, najlepšie ak je regulovateľný od 4 do 6 barov.
Kvalifikovaný pracovník pozná, že presné parametre budú závisieť od použitého systému na sušenie rozprašovaním. Môže ale upraviť poznatky predkladaného vynálezu pre akúkoľvek ďalšiu rozprašovaciu sušičku a príslušné parametre hľadať s prihliadnutím na poznatky tohto vynálezu. Vzťah, ako opísaný v práci Masters: Spray Drying Handbook, Fifth Edition, John Wiley & Sons, 1991, New York, mu môže ukázať cestu na určenie, ktoré parametre sa musia vybrať pre iné nastavenie. Prednostne bude asi pracovať s návodom svojho systému na sušenie rozprašovaním, alebo bude kontaktovať technickú podporu výrobca systému na sušenie rozprašovaním.
Na optimalizáciu výťažku by zhustenie alebo teplota spekania (sinter temperature) mali byť čo možno najvyššie, tzn. mierne pod teplotou topenia. Ak je ale príliš vysoká, častice sa budú k sebe prichytávať a tvoriť aglomeráty, ktoré sa musia preosievaním odstrániť. Ak je príliš nízka, nebudú MGP optimálne zhustené.
Ďalšie spracovanie častíc pri príliš vysokej teplote povedie ku strate magnetických vlastností. Priveľmi vysoká teplota by sa teda nemala používať. Presná teplota závisí od zloženia skla, ale môže byť v rozsahu 400 °C až 1200 °C. V prípade sklenej zmesi EJ je teplota spekania medzi 720 °C a 770 °C, najlepšie okolo 750 °C. Je na zručnosti pracovníka, aby našiel teploty pre každou sklenú zmes pri prihliadnutí na poznatky predkladaného vynálezu. Podľa predkladaného vynálezu sa môže MGP prášok sušený rozprašovaním ďalej spracovať tak, ako je uvedené v obrázku 2 a opísané v príklade 1.4. Prednostne sa prášok zohreje počas 1 hodiny na 200 °C, prípadne ochladí na izbovú teplotu a zohreje na čas 1 hodiny na 750 °C (zahusťovanie alebo teplota spekania) v dusíkovej atmosfére, s rýchlosťou ohrievania lK/minútu a na tejto teplote sa udržuje 1 hodinu. Potom sa pec ochladí na 150 °C a potom sa opäť zohreje na čas 1 hodiny na 200 °C vzdušnej teploty (in air). Po ochladení na izbovú teplotu sa prášok prenesie na sito (50 pm) a po 30 minút preosieva. Preosiata vzorka sa prenesie do fliaš a 4 hodiny sterilizuje pri 200 °C; potom sa ochladí na 80 °C. Potom sa sklenené nádoby vyberú z pece, pokryjú sterilnou fóliou a uzatvoria.
Magnetické častice poskytované vynálezom sú prekvapivo vhodné zvlášť na izoláciu biologických materiálov zo vzoriek. Okrem toho je materiál jadra prírodným zdrojom a teda nepredstavuje vážny ekologický problém. Navyše nie sú častice podľa vynálezu drahé a sú ľahko vyrábané.
Iným predmetom vynálezu je postup na izoláciu biologických materiálov, ktorý je taký, že sa vzorka obsahujúca biologický materiál v tekutine zmieša s magnetickými časticami vynálezu za podmienok, keď dôjde k naviazaniu biologického materiálu na povrch častíc a oddelenie biologického materiálu od tekutiny. Podľa vynálezu výraz „v tekutine“ znamená, že tekutina sa môže pridať ku vzorke pred tým, ako sa pridajú magnetické častice. Ale bude tiež zahrnovať situáciu, keď sama vzorka má nízku viskozitu a je sama osebe tekutinou, takže sa žiadna ďalšia tekutina alebo pufer nemusí na prípravu vzorky pridávať; príprava sa môže uskutočniť pridaním pevných činidiel pred pridaním magnetických častíc. Poradie pridávaných činidiel sa môže líšiť podľa požiadaviek procesu.
Biologickými materiálmi sa myslia materiály so špecifickým alebo molekulárnym základom. Zahrnujú zvlášť bunky, ako vírusy alebo baktérie, tiež izolované bunky z mnohobunkových organizmov, ako napríklad ľudské a zvieracie bunky, ako leukocyty, ďalej imunologický aktívne nízko a vysoko molekulárne chemické zlúčeniny, ako haptény, antigény, protilátky a nukleové kyseliny. Nukleové kyseliny ako DNA alebo RNA sú zvlášť uprednostňované. V jednej forme vynálezu sa purifikujú zmesi špecifických nukleových kyselín, kde môže byť cieľová nukleová kyselina (nukleové kyseliny) menšinovou súčasťou, pokiaľ ide o koncentráciu (alebo môže byť prítomná v malom množstve). Podľa predkladaného vynálezu cieľová nukleová kyselina bude záujmová nukleová kyselina, tzn. nukleová kyselina, ktorá bude skúmaná, pretože jej prítomnosť naznačuje určitý stav alebo ochorenie človeka alebo zvieraťa. Napríklad prítomnosť vírusovej sekvencie (napr. vírusu hepatitídy B, vírusu hepatitídy C alebo vírusu ľudskej imunodificiencie) ukazuje, že príslušný jedinec je infikovaný špecifickým vírusom. Potom by táto vírusová sekvencia bola cieľovou sekvenciou. Iné cieľové sekvencie sú sekvencie, ktoré naznačujú predispozície jedinca k určitému ochoreniu, ako napríklad dedičnému ochoreniu, ako je kosáčikovitá málokrvnosť alebo určité typy rakoviny. Tieto príklady by mali ilustrovať vynález, ale nemali by ho vymedzovať.
Vzorky podľa vynálezu zahrnujú klinické vzorky, ako krv, sérum, orálne výplachy, moč, mozgovú tekutinu (cerebral fluid), sputum, stolicu, bioptické vzorky a vzorky krvnej drene. Vzorky tiež môžu byť ich rôzne typy používané pri analýze prostredia, analýze potravín alebo molekulárne biologickom výskume, napríklad z bakteriálnych kultúr, lyzátov fágov a produkty amplifikačných procedúr, ako je treba PCR.
Opísané procedúry sa môžu použiť na izoláciu prírodných alebo modifikovaných biologických materiálov. Prírodným biologickým materiálom sa rozumie materiál, ktorého štruktúra nebola nezvratné zmenená pri zrovnaní s prirodzene sa vyskytujúcimi biologickými materiálmi. To ale neznamená, že iné zložky vzorky nemôžu byť modifikované. Modifikované biologické materiály zahrnujú materiály, ktoré sa nevyskytujú v prírode, napríklad nukleové kyseliny, ktoré sú modifikované pripojením skupín, ktoré sú reaktívne a ktoré umožňujú detekciu alebo imobilizáciu. Príkladom sú biotinylované nukleové kyseliny.
V určitých prípadoch môže byť vzorka použitá v izolačnej procedúre podľa predkladaného vynálezu bez predbežnej úpravy. Vo veľa prípadoch by ale mala byť vzorka vhodnou metódou lyzovaná, čím sa uvoľní biologický materiál obsiahnutý vo vzorke.
Procedúry na lýzu vzoriek sú odborníkom známe a môžu byť chemickej, enzymatickej alebo fyzikálnej povahy. Tiež sa dá použiť kombinácia týchto procedúr. Lýza sa môže uskutočniť napríklad ultrazvukom, vysokým tlakom, strižnými silami, s využitím alkálií, detergentov alebo chaotropných soľných roztokov, alebo pomocou proteináz či lipáz. Čo sa týka lyzačného postupu na získanie nukleových kyselín, špeciálnou referenciou je Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Addition, Cold Spring Harbour University Press, Cold Spring Harbour, NY a Ausubel et al.: Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley and Sons, NY.
Okrem biologického materiálu, ktorý má byť izolovaný, môže vzorka v tekutine tiež obsahovať ďalšie zložky, ako zvyšky buniek, proteíny, soli a ďalšie látky, ktoré sa nemajú izolovať. Táto vzorka, ktorá prednostne obsahuje biologický materiál v prírodnej forme, sa zmieša s časticami za podmienok, keď sa cieľový biologický materiál naviaže na povrch častice. Tieto podmienky závisia od typu dotyčného biologického materiálu, ale v zásade sú známe. Tiež závisia od metódy, ktorou sa biologický materiál viaže na povrch. Ak sa na naväzovanie využívajú napríklad imunologické reakcie, musia sa vybrať podmienky, ktoré sú vhodné na tvorbu imunokomplexu. Ak sa používajú modifikované nukleové kyseliny, k naviazaniu môže dôjsť cez skupiny nukleových kyselín, ktoré predstavujú modifikáciu, napríklad biotín naviažuci sa na streptavidínom potiahnuté povrchy. Najmä pri nukleových kyselinách sa ale uprednostňuje priame naväzovanie nukleových kyselín na sklo, pretože (okrem iných dôvodov) sa nukleové kyseliny nemusia modifikovať a dokonca sa môžu viazať aj prírodné nukleové kyseliny. Postup na naväzovanie prírodných nukleových kyselín na sklenené častice môže byť analogický postupu opísanému skoršie. Prednostne sa uskutočňuje v prítomnosti chaotropných solí v koncentrácii medzi 2 a 8 mol/1, alebo lepšie medzi 4 a 6 mol/1. Chaotropnými soľami môžu byť jodid sodný, chloristan sodný, guanidín tiokyanát, guanidín izotiokyanát alebo guanidín hydrochlorit. Možné sú aj iné zlúčeniny.
Zmiešaním vzorky s časticami sa dostane vzorka s časticami do vzájomného kontaktu - inkubácia prebieha po dobu dostatočnú na to, aby mohlo dôjsť k naviazaniu. Odborníci sú spravidla zoznámení s dobou nevyhnutnou na inkubačný krok odvodením z postupov, kde sa používajú nemagnetické častice. Tento krok sa môže optimalizovať určením množstva naviazaného biologického materiálu na povrch v rôznych časových intervaloch. Vhodné inkubačné časy pre nukleové kyseliny môžu byť medzi 10 sekundami a 30 minútami.
V závislosti od veľkosti a typu magnetických častíc sú častice buď oddelené od tekutiny počas vlastnej inkubačnej periódy, alebo suspenzia zostane nedotknutá po dlhšie časové obdobie. Ak sú častice veľmi malé a nezmagnetizované, zostane suspenzia neporušená po dlhšie časové obdobie. Ak majú častice väčší rozmer, častica sa pomaly počas inkubačnej doby oddeľujú od tekutiny.
Imobilizácia sa prednostne neuskutočňuje precipitáciou, znížením rozpustnosti materiálov, ktoré majú byť imobilizované. Imobilizácia je skôr založená na biošpecifických interakciách (zachytenie molekúl) alebo adsorpcii. To z veľkej časti zabraňuje tomu, aby dochádzalo k zahrnutiu kontaminujúcich látok.
Po inkubácii sa biologický materiál oddelí od tekutiny. Použitím magnetického poľa sa všeobecne dosiahne oddelenie materiálu naviazaného na magnetické častice. Napríklad magnetické častice sa môžu pritiahnuť ku stene nádoby, v ktorej dochádzalo k inkubácii. Tekutina obsahujúca obsah vzorky, ktorý sa nenaviazal na magnetické častice, sa potom môže odstrániť. Proces použitý na odstránenie závisí od typu nádoby, v ktorej sa uskutočňovala inkubácia. Medzi vhodné kroky patrí odstránenie tekutiny pipetovaním alebo odsatím.
Ak je to žiaduce, magnetické častice sa môžu ďalej jeden raz alebo viackrát prečistiť použitím premývacieho roztoku. Použije sa premývací roztok, ktorý nespôsobí uvoľnenie biologického materiálu z povrchu častíc, ale obmyje čo možno najlepšie nežiaduce kontaminanty. Premývací krok sa najlepšie uskutoční inkubáciou premývacieho roztoku s časticami. Častice sú najlepšie počas tohto kroku resuspendované, napríklad pretrepaním alebo aplikáciou magnetického poľa, ktoré nie je identické s tým, ktoré sa použilo prvý raz. Kontaminovaný premývací roztok sa prednostne oddelí rovnako ako vzorka v kroku na naväzovanie biologického materiálu opísanom skôr.
Po poslednom premývacom kroku sa môžu magnetické častice rýchlo vysušiť pomocou vákua alebo sa môže nechať roztok vypariť. Tiež sa môže použiť krok s predbežnou úpravou acetónom. Ak sa to vyžaduje, biologický materiál purifikovaný týmto spôsobom sa môže od magnetických častíc oddeliť. Tento krok tiež závisí od spôsobu, ktorým sa biologický materiál naviazal na magnetické častice. Ak sú biologickým materiálom prírodné nukleové kyseliny a magnetické častice sú sklom potiahnuté častice, nukleové kyseliny sa môžu uvoľniť od častíc podľa vynálezu s použitím elučného pufra s nízkou koncentráciou soli. Pufre týchto vlastností sú známe z DE 3724442 a Analytical Biochemisty 175, 196 - 201 (1998). Vymývacími puframi s nízkym obsahom soli sú najmä pufre s obsahom nižším ako 0,2 mol/1. V inej špeciálnej forme je vymývacím pufrom demineralizovaná voda.
V ešte ďalšej forme sa uskutočňuje opísaná purifikčná a izolačná procedúra potom, čo sú bunky (napríklad vírusové častice alebo prokaryontné či eukaryontné bunky) oddelené imunomagneticky z telových tekutín alebo pletiva. V tomto kroku je vzorka inkubovaná, napríklad pri pretrepávaní s magnetickými časticami, ku ktorým je pripojená protilátka proti antigénu. Tieto častice môžu byť častice podľa vynálezu, alebo komerčne dostupné častice (napríklad MACS Microbeads od Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Nemecko). Potom, čo sa aplikuje magnetické pole, sa uskutoční jeden alebo viacej premývacích krokov s využitím soľných roztokov. Získajú sa častice, ku ktorým sú prichytené žiaduce bunky. Prichytené bunky sú potom resuspendované v soľnom pufri. V preferovanom prípade je tento soľný pufer chaotropný soľný roztok, takže nukleové kyseliny v bunke sú z buniek uvoľnené.
Zvlášť výhodné purifikačné procedúry na izoláciu nukleových kyselín zo vzoriek obsahujúcich bunky sa dosiahne kombináciou izolácie buniek opísanou skôr, s izoláciou nukleových kyselín opísanou tiež skôr, na magnetických časticiach podľa vynálezu. Výhoda tejto formy je v potenciálnej jednoduchosti (metóda využívajúca jednu skúmavku), vysokej citlivosti (zvlášť dôležitá v lekárskej mikrobiológii a onkológii) a v jednoduchosti, s ktorou môže byť automatizovaná.
Biologické materiály, izolované s využitím postupu podľa vynálezu, sa teraz môžu použiť podľa potreby ďalej. Môžu sa napríklad použiť ako substráty na rôzne enzymatické reakcie. Ak ide o nukleové kyseliny, môžu sa použiť na sekvenovanie, rádioaktívne alebo nerádioaktívne označenie, amplifikáciu jednej alebo viacej sekvencií ktoré obsahujú, transkripciu, hybridizáciu s označenými nukleovými kyselinami, transláciu alebo ligáciu. Výhoda postupu podľa vynálezu je v tom, že sa veľmi ľahko oddelí biologický materiál od tekutiny. Skôr sa na oddelenie sklenených častíc od kontaminantov používal centrifúgačný krok, alebo sa (keď bol biologický materiál prichytený na sklenená vlákna) tekutina odstránila cez filtre. To je obmedzujúci krok, ktorý predstavuje spracovanie veľkého množstva vzoriek ťažko. Biologické materiály sa môžu od kontaminantov oddeliť účinnejšie s využitím častíc podľa vynálezu. Najmä inhibítory určitých enzymatických reakcií sa môžu do značnej miery odstrániť podľa vynálezu.
V preferovanom prípade sa častice podľa vynálezu pridávajú k lyzovanej zmesi. Po vhodnom časovom úseku nutnom na adsorpciu (ktorý sa môže optimalizovať mechanickým pretrepaním) sa častice separujú od okolitej tekutiny, obsahujúce bunkové komponenty, ktoré sa nemajú detekovať. To sa uskutoční prednostne aplikáciou magnetického poľa umiestnením magnetu ku stene nádoby.
Na odstránenie všetkých kontaminantov, ktoré môžu stále byť prítomné, sa uskutoční prednostne premývací krok s roztokom, ktorý neuvoľní nukleové kyseliny, ktoré majú byť určené, od skleneného povrchu. Na uvoľnenie nukleových kyselín zo skleneného povrchu sa pridá elučný pufer s reakčnými podmienkami, ktoré to umožnia. Týmito podmienkami sú najmä podmienky s nízkym obsahom solí. V závislosti od zamýšľaného ďalšieho použitia nukleových kyselín sa môže tento roztok teraz oddeliť od častíc a ďalej spracovať. Tento separačný krok sa uskutoční prednostne aplikáciou magnetického poľa, takže sa častice oddelia od eluátu.
Preferovanou formou predkladaného vynálezu je použitie MGP predkladaného vynálezu v automatizovateľných metódach, ako napríklad opísaných v WO 99/16781. Automatizovateľná metóda znamená, že kroky metódy sú vhodné na uskutočnenie aparátom alebo prístrojom schopným pracovať s malou, alebo bez vonkajšej kontroly či ovplyvňovania ľudskou osobou. Iba prípravné kroky metódy sa môžu uskutočniť ručne, napríklad skladovacie nádoby musia byť naplnené a umiestniť na miesto, človek musí uskutočniť výber vzoriek a ako vedia odborníci, aj ďalšie kroky, napríklad práca s ovládacím počítačom. Aparát alebo prístroj môže napríklad automaticky pridať tekutiny, miešať vzorky alebo uskutočniť inkubačné kroky pri určitej teplote. Typicky je takýto prístroj alebo aparát robot ovládaný počítačom, ktorý vykonáva program, kde sú špecifikované jednotlivé kroky a príkazy. Preferovanými automatickými metódami sú tie, ktoré sa uskutočňujú vo formáte umožňujúcom vysokú priechodnosť, čo znamená, že metódy a používané prístroje alebo aparáty sú optimalizované pre vysokú priechodnosť vzoriek v krátkom čase.
V inej forme sú MGP podľa predkladaného vynálezu použité v poloautomatickom postupe, čo znamená, že sa niektoré reakčné kroky môžu robiť manuálne. V preferovanej forme vynálezu sa vezme zo skladovacej nádoby suspenzie obsahujúce MGP podľa predkladaného vynálezu a pridá sa v určitom množstve k rôznym reakčným nádobám. Reakčnými nádobami môžu byť reakčné skúmavky vyrobené z plastiku alebo mikrotitračné doštičky s 69 alebo 384 (alebo aj viacej) jamkami, kde môže prebehnúť reakcia. Tieto nádoby môžu ale byť aj z iných materiálov, napríklad zo železa.
Preferovanou formou vynálezu sú purifikačné metódy nasledované detekčným krokom alebo purifikačné metódy nasledované amplifikačným a detekčným krokom. Cieľová nukleová kyselina alebo nukleové kyseliny, ktoré nás zaujímajú, môžu byť obsiahnuté v prostredí niecieľových nukleových kyselín a môžu byť dokonca minoritnou súčasťou tejto spomínanej zmesi špecifických nukleových kyselín. Vhodné DNA detekčné metódy sú známe odborníkom v tejto oblasti a sú opísané v štandardných učebniciach, ako Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Addition, Cold Spring Harbour University Press, Cold Spring Harbour, NY a Ausubel et al.: Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley and Sons, NY. Pred detekciou DNA sa môže uskutočniť ďalší purifikačný krok, napríklad precipitačný krok. Detekčné metódy môžu zahrnovať okrem iného naväzovanie alebo interkaláciu špecifických farieb, ako je etidiumbromid, ktorý sa vmedzerí do dvojpramennej DNA a tak zmení svoju fluorescenciu. Purifikovaná DNA sa môže tiež rozdeliť pomocou elektroforetických metód, niekedy na rozštiepenie reštrikčnými enzýmami, a potom vizualizovať. Jestvujú tiež stanovenia založené na sondách, ktoré využívajú hybridizáciu oligonukleotidov k špecifickým sekvenciám a s následnou detekciou hybridu. Je tiež možné, po určitých krokoch známych odborníkom, DNA sekvenovať. Novšie metódy využívajú rôznorodosti DNA sekvencií v spojení s kremíkovým čipom, ku ktorému sú prichytené špecifické sondy - pri naviazaní komplementárnej sekvencie poskytujú signál.
Preferovanými metódami podľa predkladaného vynálezu sú amplifikačné metódy, ako ligázová reťazová reakcia a polymerázová reťazová reakcie, ktoré špecificky amplifíkujú cieľovú sekvenciu na detegovateľné množstvo. Zvlášť preferovanými detekčnými metódami sú TaqMan metódy, uvedené v WO 92/02638 a zodpovedajúcich US patentoch US 5 210 015, US 5 804 375, US 5 487 972. Táto metóda využíva exonukleázovú aktivitu polymerázy na tvorbu signálu. Podrobnejšie nukleová kyselina je detegovaná postupom zahrnujúcim kontakt vzorky s oligonukleotidom, obsahujúcim sekvenciu komplementárnej k oblasti cieľovej nukleovej kyseliny a s označeným oligonukleotidom, ktorý obsahuje sekvenciu komplementárnu k inej oblasti toho samého reťazca cieľovej nukleovej kyseliny, ale nie tej sekvencií nukleovej kyseliny, ktorá bola definovaná prvým nukleotidom; tým vznikne pri hybridizačných podmienkach zmes duplexov zahrnujúcou cieľovú nukleovú kyselinu s prichyteným prvým oligonukleotidom a s označeným oligonukleotidom tak, že 3'-koniec prvého nukleotidu je priľahlý 5'-koncu označeného nukleotidu. Potom sa na túto zmes pôsobí s od templátu závislú od polymerázy nukleových kyselín s 5'-3'nukleázovou aktivitou, za podmienok dostatočných na túto 5'-3'nukleázovou aktivitu polymerázy rozštiepiť pripojený označený nukleotid a uvoľniť označený fragment; signál produkovaný hydrolýzou označeného oligonukleotidu je detegovaný a/alebo meraný. TaqMan technológie eliminuje potrebu reakčných komplexov naviazaných na pevnú fázu nutných na detekciu.
Vo všeobecnejšom zmysle je uvedená procedúra na purifikáciu biologického materiálu nasledovaná detekčným krokom, kde je amplifikačná a/alebo detekčná reakcia homogénnym multiplexovým testom v roztoku na súčasnú detekciu viacej cieľov (pozri príklad 7.2),
V inej forme vynálezu je opísaný purifíkačný postup kombinovaný s amplifikačným postupom s využitím jednej z ďalej opísaných metód, prednostne využitím blokujúcich nukleotidov. Problém často spojený s amplifikáciou, najmä malých množstiev nukleových kyselín, je aktivita termostabilnej polymerázy pri nižšej teplote (izbová teplota až do 40 °C). Pri tejto teplote sa primérové oligonukleotidy často viažu nešpecifický jeden ku druhému alebo k nešpecifickej nukleovej kyseline a môžu byť polymerázou predlžované. To má za následok pokles reakčných komponentov a tiež vyššiu hladinu pozadia a nasledovne zníženie citlivosti. Tiež to môže viesť k falošne pozitívnym výsledkom. Aby sa obmedzila nešpecifická aktivita polymerázy, bolo opísané niekoľko postupov, ako „hot-start“-PCR (Chou et al., 1992, Nucl. Acid Res. 20, 1717 - 1723), použitie kovalentne modifikovanej polymerázy (napr. AmliTaq Gold, Perkin Elmer) alebo protilátky (Scalice et al., J. Immunol. Methods, 172, 147 - 163, 1994) a oligonukleotidov (Dang a JMB 264, 268 - 278, 1996; US 5 763173; US 5 693 502). Podľa predkladaného vynálezu blokujúce oligonukleotidy budú oligonukleotidy, ktoré sú schopné blokovať aktívne centrum polymerázy až do uvedenej teploty. Tieto oligonukleotidy môžu byť napríklad aptamér (aptamér), ako je to opísané v príklade 7.2.2.1.3
V inej forme vynálezu sa môžu použiť v amplifikačnej reakcii a nadväzujúcich detekčných metódach aptaméry (pozri napr. príklad 7.2.2.1.3) a/alebo samotné modifikované priméry (pozri napríklad príklad 7.2.2.1.3). To je výhodné a môže sa to považovať za vynález sám osebe, ktorý poskytuje lepšie výsledky. V preferovanej forme vynálezu je 3'-koncová nukleotidová báza, najlepšie adenín, modifikovaná p-(t-butyl)benzyl zvyškom. Ďalšie modifikácie vrátane tých na 3'-1 pozícii sú opísané v EP 866 071 A2 a sú tak tu zahrnuté odkazom.
V ešte inej forme vynálezu na purifikáciu biologického materiálu nasledovaného detekčným krokom je uvedený (postup), kde je aspoň po 5 cyklov polymerázovej reťazovej reakcie teplota nasadania primérov (annealing temperature) nižšia o 8 °C, alebo lepšie nižšia ako 3 °C, ako disociačná teplota komplexu polymeráza-aptamér.
Nasledujúce príklady slúžia na ilustráciu foriem vynálezu.
Opis obrázkov:
Obrázok: Schéma postupu na výrobu sol syntézou a sušením rozprašovaním.
Obrázok 2: Schéma postupu pri príprave surových MGP.
Obrázok 3: Schematické zobrazenie rozprašovacej sušičky - výrobok Nubilosa. Detaily sú opísané v texte pod príkladom 1.3.
Obrázok 4: Vysokorozlišujúci obrázok MGP s Merck pigmentom BM z rastrovacieho elektrónového mikroskopu.
Obrázok 5: Vysokorozlišujúci obrázok MGP s CERAC pigmentom z rastrovacieho elektrónového mikroskopu.
Obrázok 6: Vysokorozlišujúci obrázok MGP s Merck pigmentom MMB z rastrovacieho elektrónového mikroskopu.
Obrázok 7: Vysokorozlišujúci obrázok MGP sa Strem pigmentom z rastrovacieho elektrónového mikroskopu.
Obrázok 8: Vysokorozlišujúci obrázok MGP s BASF pigmentom FA z rastrovacieho elektrónového mikroskopu.
Obrázok 9: Vysokorozlišujúci obrázok MGP s BASF pigmentom CE-HQ z rastrovacieho elektrónového mikroskopu.
Obrázok 10: Vysokorozlišujúci obrázok MGP s BASF pigmentom CE-SU z rastrovacieho elektrónového mikroskopu.
Obrázok 11: Vplyv magnetického jadrového pigmentu alebo rozprašovacej sušičky na izoláciu RNA (rozprašovacia sušička: Buchi (B) alebo Nubilosa (N)).
Obrázok 12: Vplyv parametra „rozprašovací tlak“ na izoláciu DNA alebo RNA.
Obrázok 13: Vplyv rôznych parametrov pri produkcii MGP na izoláciu RNA (rozprašovací tlak, (L vzduch, N = dusík), teplota prívodu (E) alebo teplota vývodu (A))
Obrázok 14 a, b: Sedimentačné správanie rôznych MGP v rôznych suspenzných médiách.
Obrázok 15: HREM-obraz vzorky EJ0096.5R-01; MGP s CERAC pigmentom.
Obrázok 16: HREM-obraz vzorky EJ0100.5R-01, rozprášenej pri nízkom tlaku a vysokej teplote, skladajúcej sa hlavne z deformovaných p-častíc.
Príklad 1: Výroba magnetických sklenených častíc
Klasicky, surové materiály ako SiO2 a alkalické uhličitany alebo uhličitany alkalických zemín (Na2CO3, K2CO3 alebo CaCO3) sa spoločne roztopia.
Typ reakcie:
Na2CO3 + SiO2 -> Na2SiO3 (= Na2O SiO2) +CO2 Ť K2CO3 + SiO2 K2SiO3 í(= K2O SiO2) +CO2Ť CaCO3 + SiO2 -> CaSiO3 (= CaO SiO2) + CO2 Ť
Vo väčšine prípadov sa ale používa kompozitná matrica silikátov, boritanu a hlinitanu, tzn. v súvisiacich matrix je SiO2 čiastočne nahradený B2O3 a A12O3. Alebo sa sklo môže syntetizovať sol-gél reakciou.
Typ reakcie:
buď kyselinou katalyzovaná sol-gél reakcie, napríklad:
BC13 + 3 H2O B(OH)3 + 3 H^’Cl'·’
AlClj - 3 H2O -> A1(OH)3 + 3 H(+)C1( )
SiCl4 + 4 H,O -> Si(OH)4 + 4 H(+)C1( )
Na'+’NOý'’ + H2O Na’+’OH*-’ + H<+) NO3 ('’
KÍ+)( )OOCCH3 + H2O K(+)OH( ) + H<+)()OOCCH3, alebo zásadou katalyzovaná, ako v našom prípade, napríklad:
K(+)( )OCH2CH3 + H2O k(+)oh(·’ + HOCH2CH3
Na(+,( )OCH3 + H2O -> Na(+)OHW + HOCH3
Al(3+) [( )OCH2CH2CH3]3 + 3 H2O -> A1(OH)3 + 3 HOCH2CH2CH3
B(OCH2CH3)3 + 3 H,0 B(OH)3 + 3 HOCH2CH3
Výhoda: alkoholy sa počas sušenia rozprašovaním ľahko vyparia; v ideálnom prípade nedochádza k rekryštalizácii solí na povrchu.
Alkoholáty sú teda zmenené na hydroxidy, ktoré po eliminácii vody poskytujú zodpovedajúce oxidy. Tie nasledovne vytvoria 3-rozmemú amorfnú sklenenú hmotu skladajúcu sa z SiO2/B2O3/Al2O3, do ktorej sú začlenené určité oxidy kovov, ako oddeľovače väzby matrix (matrix bond separators), napr.
i I I I —Si—O-~SÍ— Zn Si
III I
I I I K'·' I —Si—O—Si — ==> —WO—Si
I I I Kw I
Pre experimenty tu opísané boli sklenené zložky pripravené sol-gél syntézou katalyzovanou zásadou. Zloženie skla vo všetkých experimentoch (pokiaľ nie je uvedené inak) bolo nasledujúce:
70,67 Mol % SiO2, 14,33 Mol % B2O3, 5,00 Mol % A12O3, 4,00 Mol % K2O, 2,00 Mol % CaO, 4,00 Mol % ZnO (vypočítané z hmotnosti jednotlivých zložiek vnesených do reakcie)
1.1 Opis skúmaných magnetických pigmentov
Skúmali sa rôzne typy magnetických pigmentov a výsledky sú zhrnuté v tabuľke 1.
1.2 Výroba poťahovacieho sólu (EJ-zmes)
Výťažky (educts) sa pridávajú v nasledujúcom poradí a množstvách do vyhrievateľnej premiešovateľnej
nádoby:
Tetraetoxysilán (Tetraethoxysilane - TEOS) 10700 ml
Trietylborát (Triethylborate - TEB) 3305 ml
K-metanolát
(K-metanolate) 25 % (váha/objem) v metanole 1601 ml
etanol 11292 ml
Izopropanolát hliníka (aluminiumisopropanolate) 1385 g
Vápnik 54,4 g
Octan zinku (Zincacetate) 498 g
Potom sa nádoba uzatvorí. Sol sa zohreje na 70 °C a premiešava cez noc (15 h). Teplota sa reguluje pomocou termosenzorov, ktoré sú ponorené do tekutiny.
Potom sa sol zohrieva na 90 °C a pridá sa zmes alkohol/voda (etanol: 3781 ml, H2O: 1512 ml) rýchlosťou 5000 ml/h. Po úplnom pridaní tejto zmesi sa nádoba ochladí na 20 °C.
Otvorí sa veko a za intenzívneho premiešavania sa pridá 10 249 g magnetického pigmentu (CERAC). Pripravený sol sa hadicou premiestni do rozprašovacej sušičky.
1.3 Sušenie rozprašovaním
Teplota prívodu rozprašovacej sušičky je nastavená na 200 °C. Tlak dýzy je nastavený na 6 barov a dýza sa 3 minúty ochladzuje etanolom. Potom sa pripojí na vývod sklenenej nádoby hadice a pigment obsahujúci sol sa pumpuje ultrazvukovým zariadením (200W) rýchlosťou 110 ml/min. do dvojkvapalinovej dýzy (priemer otvoru: 2 mm; dodávateľ: Nubilosa, Type 1B1WS1) rozprašovacie sušičky. Sušiace rozprašovacie zariadenie je znázornené schematicky na obrázku 3. Častice vytvorené počas prvých dvoch minút sa vyhodia. Po úplnom rozprášení sólu sa kontajner pod odlučovačom (cyclone) (AVO, pozri obrázok 3) s časticami odoberie a častice sa v ďalších krokoch upravia.
Aby sa predišlo sedimentácii suspendovaných častíc, pigment obsahujúci sol sa mieša v miešacej nádobe. Sol sa premiestni z nádoby do dýzy pomocou pumpy (SP). Ako sušiaci plyn sa využíva dusík ohrievaný elektrickým zohrievacím zariadením (EWT). Obalený pigment sa premiestni zo sušiacej komory (T) do odlučovača (ZY). Suchý prášok sa potom vyberie z kontajneru (AVO) pod odlučovačom. Veľmi jemné častice sa odstránia dusíkovým filtrom (SF). Aby sa zabránilo nasiatiu vzduchu do sušičky používa sa rozprašovacia sušička s pretlakom. Vzduch je fúkaný pomocou dúchadla (AV).
1.4 Ďalšie spracovanie rozprašovaním vysušeného prášku
Prášok sa prenesie do keramickej misky a zohreje v peci na 200 °C rýchlosti lK/min. Potom sa teplota 200 °C udržuje počas jednej hodiny a potom sa pec ochladí na izbovú teplotu. Miska sa prenesie do atmosférickej pece s objemom 27 1, ktorá sa premýva 60 1 dusíka za hodinu. Pec sa zohreje na 750 °C rýchlosťou 1 K/min. a táto teplota sa udržuje 1 hodinu. Potom sa pec ochladí na 150 °C a premyje 60 1 vzduchu za hodinu. Pec sa zohreje na 200 °C rýchlosťou 2K/min.; táto teplota sa udržuje 1 hodinu a potom sa ochladí na teplotu. Potom sa prášok prenesie na sito (50 gm) a 30 minút preosieva. Preosiata vzorka sa naplní do sklenených nádob, ktoré sa nezatvorené sterilizujú v peci zohriate rýchlosťou 1 K/min. na 200 °C; táto teplota sa udržuje 4 hodiny a potom sa zníži na 80 °C. Potom sa sklenené nádoby vyberú z pece, pokryjú sterilnou fóliu a uzatvoria viečkom. Prehľad dôležitých parametrov procesu je v tabuľke 2 a tabuľke 3, pripravenej individuálnej vzorky s niektorými údajmi sú poskytnuté v tabuľke 3. Každá vzorka má špecifický kód. Prvé dve písmena opisujú použitú chémiu skla (pozri nižšie) a ďalšie štyri čísla kódujú výrobný proces (pozri tabuľka 2). Ďalšie číslo opisuje použitý pigment (tabuľka 1). Písmeno R znamená, že sa neodstránil jemný obsah, zatiaľ čo písmeno E znamená, že sa jemný obsah etanolom odstránil. Posledné dve číslice opisujú číslo šarže. Zloženie skla (kód EJ) vypočítané z množstva zložiek vnesených do reakcie bolo 70,67 Mol % SiO2, 14,33 Mol % B2O3, 5,00 Mol % A12O3, 4.00 Mol % K2O, 2,00 Mol % CaO, 4,00 Mol % ZnO. Zloženie skla (kód RN) bolo 74 Mol % SiO2, 15 Mol % B2O3, 5,00 Mol % A12O3, 4,00 Mol % K2O, 2,00 Mol % CaO. Zloženie skla (kód EP) bolo 73,61 Mol % SiO2, 14,93 Mol % B2O3, 5,21 Mol % A12O3,4,17 Mol % K2O, 2,08 Mol % CaO.
Príklad 2: Vysokorozlišovacia rastrovacia elektrónová mikroskopia
Aby sa získala informácia o povrchu, veľkosti a tvare MGP, uskutočnili sme vysokorozlišovaciu rastrovaciu elektrónovú mikroskopiu (výrobok firmy JEOL - JSM). Vzorky sa elektricky vodivým obojstranným spojivom (electrically conducting double-sided adhesive) rozptýlili na nosič vzoriek a poprášili zlatom počas 36 sekúnd prúdom 30 mA. Na zobrazenie povrchu sa použili emitované sekundárne elektróny (topografia topography) a tiež spätne rozptýlené elektróny (back scattered electrons) (pravidelný číslovaný kontrast - order number contrast). Použité primáme elektrónové napätie bolo 10 kV (sekundárne elektróny) alebo 25 kV (spätne rozptýlené elektróny).
Obrázok 4 ukazuje MGP so sľudou, pokryté oxidom železitým ako magnetickým pigmentom (BM). Možno zreteľne vidieť trhlinu v sklenenom plášti, ktorá pochádza zo sušenia častíc rozprašovaním, keď sa začína zrážať vrstva na nezraziteľnom substráte (zmršťovacia trhlina vzniklá vysýchaním). Okrem toho možno vidieť väčší počet guľovitých častíc, ktoré neobsahujú jednu z väčších magnetických častíc (10 až 60 pm). Tieto gule bez magnetického jadra (jemný nemagnetický obsah) sa nemôžu odstrániť v magnetickom poli, môžu sa preniesť do PCR reakcie a interferujú s touto reakciou.
Častice s CERAC pigmentom (pozri obrázok 5) nemajú trhliny, pretože magnetický pigment (priemerná veľkosť častice 23 nm) nevytvára vo vrstve tenzné sily, takže nedochádza k tvorbe trhlín pri procese sušenia rozprašovaním. Okrem toho sú malé CERAC častice tiež začlenené v jemnom obsahu, takže tu nie sú nemagnetické častice. Častice sú tiež podstatne menšie ako častice so sľudou, ktoré je možné pozorovať na týchto obrázkoch s rovnakým zväčšením. Na obrázkoch 6 až 10 sú tiež ukázané MGP s ostatnými magnetickými pigmentmi pri rovnakom zväčšení.
Príklad 3: Fyzikálny výskum MGP
Na zhodnotenie MGP pred skutočnými funkčnými testmi sa uskutočnilo okrem HREM skúmania ďalšie fyzikálne meranie MGP. Bolo zaujímavé poučiť sa o rozpustnosti železa vo vode, magnetickej sile, jemnom obsahu a hustote. Ďalej sú tieto experimenty opísané a uvedené výsledky.
3.1 Meranie extinkcie
Aby sa testom zistilo, ak sa odstránili jemné častice, navážilo sa 1000 mg teplotné opracovaného a preosiateho prášku do 50 ml centrifúgačnej kyvety (Sarstedt), pridalo sa 40 ml vody a trepaním sa obsah premiešal. Potom sa kyveta ponorí do výšky naplnenia (with the total filling height) do ultrazvukového kúpeľa (Sonorex (RK 102H; 120/240W) a potom sa umiestni do magnetického separátora (Roche Diagnostics GmbH RD Art Nr. 1858 025). Po 3,5 minútach magnetickej separácie sa sklenenou pastérkou odoberie z nádoby tekutina až k 15 ml značky na strane protiľahlej magnetu a tou sa naplní 5 mm kremenná kyveta (typ 110-QS, Hellma). Extinkcia supematantu sa meria UV-VIS-NIR spektrofotometrom (Hitachi U-3000) oproti zodpovedajúcej kyvete naplnenej deionizovanou vodou. Aby sa zistil rozsah vlnových dĺžok absorpčných pásiem prípadných nečistôt, meralo sa v rozsahu 200 až 1100 nm v 1 nm krokoch. Extinkcia pri vlnovej dĺžke 280 nm a 400 nm sa zobrali ako referenčné.
3.2 Meranie hustoty
Na meranie hustoty sa použil plynový pyknometer (AccuPyc 1330, Fa. Micromeritics). Ako plyn sa použilo hélium 6.0. Prístroj sa kalibroval poskytnutým štandardom (kovové guľôčky so známym objemom). Ďalej sa vzorka sušila aspoň 1 hodinu pri 150 °C a potom naplnila do meracieho kontejneru a zvážila. Po zmeraní sa kontajner umiestni do plynového pyknometra a použije sa 10 premývacích cyklov a 5 meracích cyklov na určenie priemernej hodnoty a štandardnej odchýlky.
3.3 Určenie rozpustnosti železa
Rozpustnosť železa obalených (coated) a tepelne opracovaných vzoriek sa určí indukčné viazanou plazmou (Inductive Coupled Plasma), atómovou emisnou spektroskopiou (JY 24, spoločnosť ISA). Preto sa premiestnil 1 g vzorky do 50 ml polypropylénovej skúmavky naplnenej destilovanou vodou a udržoval 20 hodín pri teplote 60 °C. Potom sa vzorky filtrujú 0,2 pm injekčným filtrom a filtrát sa meria. Uskutočnia sa štyri jednoduché určenia pri vlnovej dĺžke 259,940 nm a potom sa z nich vypočíta priemerná hodnota.
3.4 Meranie magnetickej sily
Na meranie magnetickej sily sa zvážila MGP úplne naplnená vážiaca skúmavka PP (Pp-weighing tube) (Company Licefa, Art. Nr. V2-3). Pomocou šablóny sa tento obal vzorky umiestni do stredu LDPE skúmavky (Company Karteli, TS 735), zaťažený mosadzou tak, že sa viečko skúmavky dalo stále zatvoriť. Nádoba sa pomocou inej šablóny umiestni do stredu váhy (presnosť váženia 0,1 g). Po ustanovení rovnováhy váh sa nad stupnicu umiestni plastický vŕšok, ktorý obsahuje magnet v tvare valca (priemer: 30 mm; výška: 113,5 mm; samárium-kobalt 2/17).
Tak sú MGP na váhe priťahované proti gravitácii a znižujú teda svoju váhu. Po ustanovení rovnováhy (1,5 minúty) sa určí úbytok váhy vzorky a hodnota sa štandardizuje na 250 mg MGP.
3.5 Výsledky
Výsledky fyzikálnej charakterizácie MGP s EJ zložením a rôznymi pigmentmi sú zhrnuté v tabuľke 3. Stojí za povšimnutie, že hodnoty extinkcie sú veľmi nízke, keď sa použije CERAC pigment. To sa môže vysvetliť nedostatkom nemagnetického jemného obsahu, pretože malé CERAC pigmenty (23 nm) sa môžu začleniť do každej magnetickej sklenenej častice. Hustota CERAC-MGP nie je príliš veľká. To má pozitívny vplyv na rýchlosť sedimentovania. Magnetická sila je podrobená veľkým výkyvom, ale je pozitívne ovplyvnená použitím CERAC pigmentov. CERAC-MGP majú pomerne vysoký únik železa do vody. Ale ani desaťnásobne vyššie hodnoty nevykazujú žiadny vplyv na proces PCR.
Stručne povedané sa môže definovať, že medzi rôznymi pigmentmi nie sú žiadne významné rozdiely vo fyzikálnych vlastnostiach, ale CERAC-MGP má veľmi nízky jemný obsah.
4. Príklad 4: Vplyv magnetického jadrového pigmentu a rozprašovacie sušičky na BET povrch
Povrch sa určil s využitím prístroja od Micromeritics (Type ASAP 2400). Meranie sa uskutočňovalo pri teplote tekutého dusíka. Ako merací plyn sa použil dusík 5.0 (Nitrogén 5.0) a ako inertný plyn sa použilo hélium 4.6. Typicky sa na jedno meranie použil 5 g vzorky.
Povrch MGP hrá zrejmú rolu pri izolácii DNA a RNA. Čím je povrch väčší, tým viacej DNA sa môže naviazať na to isté množstvo MGP. Je tiež možné použiť menšie množstvo MGP a dosiahnuť toho samého výsledku. To má za následok to, že je medzizmový (intergrain) objem menší a že sa teda dostane menšie množstvo kontaminujúceho alkoholu do PCR reakcie. Údaje o zmeraných BET-povrchoch pri niektorých vzorkách sú zhrnuté v tabuľke 4. Keď sa porovnajú povrchy vzoriek pripravených na veľkých rozprašovacích sušičkách, malo by sa upozorniť na to, že vzorky s malými pigmentmi (BASF FA, STREM a CERAC) majú relatívne veľké povrchy, zatiaľ čo veľké pigmenty Merck majú malé povrchy. To môže byť spôsobené skutočnosťou, že veľké magnetické častice vytvárajú veľké MGP, zatiaľ čo malé magnetické častice sú zainkorporované do guľovitých kvapôčok počas procesu sušenia rozprašovaním a majú teda za podobných podmienok procesu sušenia rozprašovaním podobné povrchy. BASF CE-SU častice majú častice s veľkosťou od malých (ako BASF FA, STREM a CERAC) až po veľké Merck častice. V zrovnaní s Merck časticami nemajú štruktúrovaný povrch, takže tieto častice majú veľmi hladký sklenený povrch. To má za následok menší povrch. Pri menšej rozprašovacej sušičke sa použil vyšší tlak a dýza tejto rozprašovacej sušičky je výrazne menšia ako pri väčšej rozprašovacej sušičke. To vedie k menším časticiam a výrazne sa zväčší povrch. To je v súlade s výsledkami príkladu 5.2.1.
Akýkoľvek vplyv magnetického pigmentu alebo rozprašovacieho tlaku na výsledky ďalších fyzikálnych skúmaní je nedefinovateľný okrem spomínaného vplyvu na tvorbu trhlín a jemný obsah. Ale iba meranie povrchu vykazuje priame spojenie s výsledkami fúnkčných skúmaní. Ďalšie výsledky fyzikálneho skúmania nevykazujú tento priamy vzťah.
Príklad 5: Väzobné štúdie pomocou stopovania rádioaktivity
Jestvuje niekoľko metód na hodnotenie MGP, čo sa týka ich vhodnosti na extrakciu nukleových kyselín. Stanovenie extinkcie pri 260 nm pred purifikáciou a po purifikácii nie je veľmi citlivé a nepodobá sa situácii, pri ktorej je extrahované malé množstvo cieľovej nukleovej kyseliny z klinického materiálu. Výsledky funkčných vyhodnocovacích metód, ktoré sa spoliehajú na metódy amplifikácie nukleových kyselín, ako sú napr. PCR, RT-PCR, NASBA či akékoľvek podobné metódy, nie sú väčšinou dostatočne presvedčivé. Okrem toho tieto metódy, ktoré sú vhodné na stanovenie malého počtu kópií cieľového genómu, sú náchylné na látky, ktoré sa môžu nachádzať vo vzorkách či na látky používané počas prípravy vzoriek. Väzobné štúdie pomocou rádioaktivity sú vhodnou analytickou metódou, ktorá dovoľuje analyzovať proces prípravy vzoriek krok po kroku. Dáta týkajúce sa účinnosti nie sú absolútne dáta, ale sú vždy relatívne na účinnosť referenčných častíc.
5.1 Experimentálny protokol
Najskôr je syntetizovaná enzymaticky, pomocou PCR, rádioaktívne označená DNA alebo RNA alebo in vitro transkripciou, v prítomnosti 32P označeného deoxynukleozidu alebo nukleozidtrifosfátu. Potom je označená DNA alebo RNA oddelená od voľných nukleozidtrifosfátov. Stanoví sa obsah nukleových kyselín a je pripravené definované nariedenie. Malé množstvo označenej DNA alebo RNA sa pridá do každej vzorky pred pokusom. Počas prípravy vzoriek sa za prítomnosti chaotropných látok všetka nukleová kyselina naviaže na MGP. MGP sú oddelené (peletované) vystavením magnetickému poľu a zleje sa supematant. Pelet sa premyje a naviazané nukleové kyseliny sa eluujú pri zvýšenej teplote opačnými reakčnými podmienkami, napr. prídavkom elučného pufŕa s nízkym obsahom solí. Po naviazaní a prípadnom premývacom kroku sa alikvotná časť supematantu nanesie na filter. Tiež eluát a vo vode dispergované MGP sa taktiež nanesú na filter. Filtre sa potom usušia a nakoniec sa meria ich rádioaktivita. Pre každú vzorku sa spočíta distribúcia rádioaktivity.
5.1.1 Príprava rádioaktívne označenej DNA
5.1.1.1 A. 1.1. Reagencie
- Expand High Fidelity PCR Systém (Roche Molecular Biochemicals, kat. č. 732641)
- zmes dNTP (Roche Molecular Biochemicals, kat. č. 1277049)
- deoxycytidín 5'-alfa-P32 Trifosfát dCTP 3000 Ci/mmol (Amersham kat. č. PB 102 05)
- lambda-DNA (Roche kat. č . 1029053), koncentrácia lng/ml - rádioznačkovací primér 1 (SEQ ID NO 1) koncentrácia
5,3 OD26o/ml
- rádioznačkovací primér 2 (SEQ ID NO 2) koncentrácia
5.2 OD260/ml
- QIA Quick PCR Purifícation Kit (Qiagen kat. č. 28104)
5.1.1.2 Reakcia
- 29,5 μΐ dvojnásobne destilovanej vody
- 5 μΐ Expand High Fidelity pufer
- 2,5 μΐ zmesi dNTP (1 : 10) riedenej dvojnásobne destilovanou vodou
- 1 μΐ rádioznačkovací primér 1 (SEQ ID NO1)
- 1 μΐ rádioznačkovací primér 2 (SEQ ID NO2)
- 0,3 μΐ 32P-dCTP
- 10 μΐ lambda-DNA
- 0,75 μΐ enzýmovej zmesi Expand High Fidelity
5.1.1.3 Amplifikácia
- 2 min. 94 °C
-10 cyklov (10 sek. 94 °C/30 sek. 60 °C/60 sek. 72 °C)
- 20 cyklov (10 sek. 94 °C/30 sek. 60 °C/60 sek. 72 °C +10 sek. 72 °C predĺženie na cyklus)
- 7 min. 72 °C
-4°C
5.1.1.4 Purifikácia
- podľa protokolu QIA Quick PCR Purifícation Protocol (Qiagen)
5.1.1.5 Riedenie
Riedenie DNA 1 : 10 v dvojnásobne destilovanej vode a meranie rádioaktivity
5.1.2 A.2. Príprava rádioaktívne označenej RNA
5.1.2.1 -Reagencie
- SP6/T7 Transcription Kit (Roche Molecular Biochemicals kat. č. 999644)
- Uridín 5'-alfa-P32 Trifosfát UTP 3000 Ci/mmol (Amersham kat. č. PB 10203)
- Plazmid pBKBHlOS, linearizovaný EcoRI v koncentrácii 100 μΐ/ml
- High Pure RNA Isolation Kit (Roche Molecular Biochemicals kat. č. 1828665)
5.1.2.2 -Reakcia
- 2 μΐ lOx pufra
- 3 μΐ zmesi NTP (AGC)
- 1 μΐ UTP (1 : 50 s dvojnásobne destilovanou vodou)
- 5 μΐ 32P-UTP
- 7 μΐ linearizovaného plazmidu
- 1 μΐ RNAse Inhibítor (Roche Molecular Biochemicals kat. č. 802808)
- 1 μΐ T7 RNA-Polymerázy
5.1.2.3 Transkripcia a rozštiepenie pomocou DNAzy
- 20 min. inkubácia pri 37 °C
- pridanie 2 μΐ DNAzy, RNAse free
-10 min. inkubácia pri 37 °C
- pridanie 178 μΐ dvojnásobne destilovanej vody
5.1.2.4 -Purifikácia
- podľa High Pure RNA Isolation Protocol (Roche Molecular Biochemicals)
5.1.2.5 Riedenie
Riedenie RNA v pomere 1 : 30 dvojnásobne destilovanou vodou a meranie rádioaktivity.
5.1.3 Príprava rádioaktívnej vzorky
5.1.3.1 Reagencie
- negatívna plazma
- Proteínáza K, koncentrácia 20 mg/ml (napr. Roche, č. 1942387) - Poly-A-RNA (napr. Roche, č. 1942387), koncentrácia 1 mg/ml, riedené 1 : 1000 (objem na objem) lyzačným pufrom
- lyzačný pufer (50 mM Tris pH 7,0,15 % (obj./obj.) Polydocanol, SM guanidín izotiokyanát, 1 mM DTT)
- MGP (s EJ zložením skla a rôznymi pigmentmi jadra (BM, MMB, CERAC, STREM, BASF-FA, BASF-CE)) suspendované v izopropanole 60 mg/ml alebo 6 mg/ml
- premývací pufer (20 mM Tris pH 7,5, 20 mM NaCl, 70 % (obj./obj.) etanol)
- elučný roztok: redestilovaná voda
- pomocný materiál: Filter Whatman GF/D
5.1.3.2 Reakcia (protokol pre 1,5 ml)
- 80 μΐ Proteínkinázy K
- pridať 410 μΐ negatívnej plazmy a zamiešať
- pridať 500 μΐ lyzačného pufra a zamiešať
- pridať 10 μΐ rádioaktívne označenej DNA alebo RNA, zamiešať
-10 min. inkubácie pri izbovej teplote za miešania
- pridať 500 μΐ suspenzie MGP (koncentrácia 6 mg/ml) a zamiešať
- 20 min. inkubácia pri izbovej teplote za miešania
- dvojminútové oddelenie v magnetickom separátore (Magnetic separator, Dynal)
- odstránenie supematantu a nanesenie 300 μΐ na filter
- pridať 750 μΐ premývacieho pufra, zamiešať, 2 min. separovať
- odstrániť supematant, prípadne naniesť 375 μΐ supematantu na filter
- opakovanie premývacieho postupu dvakrát
- pridať 100 μΐ elučného roztoku, inkubácia 5 min. pri 80 °C za stáleho miešania
- separácia 2 min. v magnetickom držiaku, nanesenie supematantu na filter
- pridanie 100 μΐ elučného roztoku, resuspendovať a naniesť MGP na filter
- usušiť filtre 60 min. pri 75 °C v sušiarni
- preniesť filtre do scintilačných fľaštičiek, pridať 5 ml scintilačného roztoku a zmerať rádioaktivitu
5.1.3.3 Experimentálny protokol (na 1 ml)
- 25 μΐ Proteínkinázy K
- pridať 415 μΐ negatívnej plazmy a zamiešať
- pridať 500 μΐ lyzačného pufra a zamiešať
- pridať 10 μΐ rádioaktívne označenej DNA alebo RNA, zamiešať
- 5 min. inkubácie pri izbovej teplote pri miešaní
- pridať 50 μΐ suspenzie MGP (koncentrácia 60 mg/ml) a zamiešať
- 20 min. inkubácie pri izbovej teplote za miešania
- dvojminútové oddelenie v magnetickom separátore (Magnetic separator, Dynal)
- odstránenie supematantu a nanesenie 300 μΐ na filter
- pridať 700 μΐ premývacieho pufra, zamiešať, 2 min. separovať
- odstrániť supematant, pripadne naniesť 350 μΐ supematantu na filter
- dvojnásobné opakovanie premývacích krokov
- pridať 120 μΐ elučného roztoku, inkubácia 10 min. pri 80 °C za stáleho miešania
- separácia 2 min. v magnetickom držiaku, nanesenie supematantu na filter
- pridanie 100 μΐ elučného roztoku, resuspendovať a naniesť MGP na filter
- sušiť filtre 60 min. pri 75 °C v sušiarni
- preniesť filtre do scintilačných fľaštičiek, pridať 5 ml scintilačného kokteilu a zmerať rádioaktivitu
5.2 Výsledky experimentov pomocou rádioaktívneho stopovania
5.2.1 Vplyv magnetického jadrového pigmentu alebo rozprašovacej sušičky na izoláciu RNA
Charakterizovali sa rozdielne typy MGP, ktoré sa pripravili s použitím EJ sklenenej chémie a rozdielne jadrá s nano alebo mikro veľkosťou (MMB, CERAC, atd.) a s použitím rozdielnych rozprašovacích sušičiek (Buchi alebo Nubilosa) s ohľadom na ich správanie počas extrakcie nukleových kyselín z materiálu prostého vírusov (negatívna plazma). Charakterizácia sa uskutočnila pomocou rádioaktívneho stopovania, metódou podľa príkladu 5.1.3.2. RNA parameter sa počas štúdií ukázal ako najcitlivejší materiál a vybral sa preto ako typická veličina. Obrázok 11 ukazuje, že BASF-CF nie je vhodný ako materiál na jadro, pretože v eluáte sa nachádza iba malá časť naviazanej RNA. Častice EJ/CERAC, rozprašované pomocou systému Biichi pri 6 baroch, vykazovali rovnakú účinnosť ako referenčné častice EJ/MMB, ktoré boli rozprašované pomocou Nubilosa systému.
5.2.2 Vplyv parametra tlaku pri rozprašovaní na izoláciu DNA alebo RNA
Rozdielne typy MGP pripravené pomocou systému Nubilosa s použitím rozdielnych rozprašovacích tlakov sú porovnané podľa 5.1.3.3. Referenčnými časticami sú EJ/MMB MGP. Skúmali sa väzobné vlastnosti DNA a RNA. Zatiaľ čo DNA parametre neukazujú závislosť od rozprašovacieho tlaku, RNA parametre vykazujú významné rozdiely v účinnosti. Účinnosť častíc EJ/CERAC, pripravovaných pri rozprašovaní tlakom
1,5 barov s použitím systému Nubilosa, je nižší, ako účinnosť referenčných častíc. Nižšia účinnosť je pri rade vzoriek pripravovaných rozprašovaním tlakom, ktorý sa menil medzi 1,5 a 3,4 barov 30 %). Častice, ktoré sú rozprašované tlakom 4,3 barov dosiahli 90 % účinnosti častíc, ktoré sú rozprašované tlakom 1,5 barov (pozri obrázok 12). Experimenty dokázali priamo súvislosť medzi parametrami prípravy MGP a účinnosťou v teste. Malo by sa poznamenať, že zvyšujúci sa tlak rozprašovania vedie k nižšej účinnosti v teste, ale od určitého rozprašovacieho tlaku sú vlastnosti častíc zlepšené a vedú k lepšej účinnosti.
5.2.3 Vplyv rozdielnych parametrov prípravy MGP na izoláciu RNA a DNA
Tieto experimenty by mali viesť ku zisteniu, či rozdielne rozprašovacie tlaky vedú k MPG s ešte lepšou účinnosťou.
Preto sa MGP pripravujú systémom Nubilosa za tlaku 1,5 barov, 4,3 barov a 6 barov a s použitím dusíka ako rozprašovacieho plynu. Aby sa dosiahlo šetrného sušiaceho procesu, boli vstupné aj výstupné teploty rozprašovacej sušičky dodatočne znížené. Vplyv týchto faktorov na izoláciu RNA sa skúmal podľa 5.1.3.3. a MGP častice EJ/MMB slúžili ako referenčné.
Výsledky (pozri obrázok 13) ukazujú prekvapivý vplyv dramatického zníženia účinnosti, ktoré je spôsobené znížením teploty rozprašovania a ktoré sa nemohlo predvídať. Zvýšením rozprašovacieho tlaku sa mohlo dosiahnuť účinnosti referenčnej kvality. Takto pripravené častice sú lepšie ako referenčný materiál, pretože sú súčasne stabilnejšie v suspenzii.
Príklad 6: Sedimentačná analýza magnetických sklenených častíc
6.1 Experimentálny protokol
Na zhodnotenie sedimentačných vlastností magnetických sklenených častíc sa použil Spektrofotometer Uvikon, Model 930 firmy Kontron Instruments. Tento spektrofotometer je modifikovaný tak, aby dovolil variabilné nastavenie kyvety pozdĺž mierky. Na meranie sa kyveta nastaví do polohy, v ktorej merací lúč s vlnovou dĺžkou 650 nm pretína kyvetu vo 2/3 plniacej výšky (meracia pozícia 7,5). Používajú sa makrokyvety z polystyrénu s objemom 4 ml a šírkou 1 cm. Pred meraním sa urobí kalibrácia pomocou jednolúčového postupu proti čistému suspenznému médiu. Vzorky MGP sú dispergované homogénne v suspenznom médiu, bežne pri pomere hmotnosť/objem 3 mg/ml, a ihneď namerané. Sledujú sa zmeny extinkcie v čase, kontinuálne pri danej vlnovej dĺžke (650 nm).
Fyzikálna veličina používaná na porovnanie sedimentačnej rýchlosti rozdielnych vzoriek je „polčas života“ O1/2) v určitom suspenznom médiu. Je to časový úsek, v ktorom extinkcia suspenzie v hornej tretine kyvety klesne na polovicu hodnoty, ktorá bola na počiatku merania. Znižovanie extinkcie je spôsobené sedimentáciou častíc a s tým spojené prečistenie hornej tretiny testovaného objemu.
Opísané zariadenie ďalej umožňuje inštaláciu magnetu pod ky vetou. Takto môže byť stanovená rýchlosť magnetickej separácie.
6.2 Výsledky sedimentačnej analýzy
6.2.1 Experiment 1
Niekoľko typov MGP s rozdielnymi jadrami v rozmedzí nano alebo mikrometrov a vyrobených pomocou EJ sklenenej chémie sa skúmali spektrofotometricky - zisťovalo sa ich sedimentačné a separačné správanie, tzn. s magnetom a bez magnetu pod kyvetou. V tomto prípade bol pomer hmoty ku objemu 6 mg/ml. Suspenzné médium bola zmes izopropanolu a lyzačného pufra v pomere 1:1. Výsledky sú zosumarizované.
Častice typu CERAC vykazujú jasné výhody v stabilite suspenzie, ale nemajú žiadne nevýhody pre magnetickú separáciu (pozri tiež obrázok 14).
6.2.2 Experiment 2
Sedimentačné správanie rozdielnych MGP typu CERAC vyrobených sklennou chémiou EJ bolo skúmané v čistom izopropanole.
Dôležité výrobné parametre:
EJ0100.5R-01 - rozprašovací tlak 1,5 baru, teplota na vstupe 230 °C, systém Nubilosa
EJ0108.5R-01 - rozprašovací tlak 4,3 baru, teplota na vstupe 230 °C, systém Nubilosa
EJ0096.5R-01 - rozprašovací tlak 6,0 baru, teplota na vstupe 150 °C, systém Biichi
EJ0096.5R-01 sú ukázané na obrázku 15. Tieto guľôčky sú väčšinou guľovité s vysoko štruktúrovaným povrchom a veľkosťou prevažne 0,5 - 5 pm. Vzorka EJ0100.5R-01 rozprašovaná pri nízkom tlaku a vysokej teplote sa skladá hlavne z deformovaných častíc v pm mierke (pozri obrázok 16, ktorý ukazuje funkčný ekvivalent k EJ0100.5R). Záverom možno konštatovať, že častice ako EJ0096.5R-01 vykazujú významné spomalenie sedimentácie, čo je najvýhodnejšie na prenos kvapalných suspenzií MGP (pozri obrázok 14b). Výsledky sú zosumarizované.
Príklad 7: Funkčný test pomocou PCR
7.1 Heterogénne funkčné testy: amplifikácia PCR pomocou prístroja GeneAmp 9600 od firmy Perkin Elmer a detekcia biošpecifickým väzobným testom s chemiluminiscenčne označenou detekčnou sondou na modifikovanom ElecsyslOlO®.
7.1.1 Všeobecné úvahy
Vírusové častice vo vzorke (napr. plazme) sú lyzované v prítomnosti proteáz, vysokej koncentrácie chaotropných solí a tiež detergentov. Potom sa pridá adsorbent častíc (= MGP) pre fyzikálne-chemickú adsorpciu uvoľnených nukleových kyselín na sklenený povrch. Nasleduje magnetická separácia a premytie pridaných guľôčok, tzn. separácia uvoľnených a naviazaných komponent. Nakoniec sa uskutoční disociácia naviazaných nukleových kyselín z guľôčok (= elúcia) za opačných reakčných podmienok, ako je tomu pri adsorpcii, čo znamená nízkou koncentráciou solí v pufri či dokonca destilovanou vodou. Alikvotná časť eluátu sa potom zmieša s alikvotnou časťou PCR mastermixu na naštartovanie amplifikácie nukleových kyselín izolovaných v eluáte. Táto reakcia je charakterizovaná rovnicou:
Nj = No x (1 + E)n, kde
No = počet molekúl na počiatku PCR
Nj = počet molekúl na konci PCR
E = účinnosť amplifikácie = 0 < E < 1
N = počet reakčných cyklov = typicky 20 < n < 35
Po PCR s aspoň jedným biotinylovaným primérom sa alikvót amplifikátu s naviazaným biotínom zmieša s hybridizačným pufrom a detekčnou sondou. Po inkubácii sa pridajú guľôčky potiahnuté streptavidídom a nasleduje ďalšia inkubácia. Nakoniec sa guľôčky premyjú, pridá sa signálny pufer a meria sa intenzita signálu chemiluminiscencie, ktorá zodpovedá množstvu amplifikovanej naviazanej nukleovej kyseliny a teda množstvu vírusu vo vzorke plazmy.
Odborník môže tiež uskutočniť ručne 1 ml protokol.
7.1.2 Experimentálny protokol
7.1.2.1 Reagencie
7.1.2.1.1 Príprava vzorky
- Proteínáza K v roztoku octanu vápenatého v glycerole (20 mg/ml)
- Poly-A-RNA, 1 mg/ml, používa sa riedenie 1 : 1000 v lyzačnom pufri
- Lyzačný pufer obsahuje:
- Tris pufer, 50 mmol/1, pH 7,0 (1,0 a prípadne extrakčný protokol) alebo 4,0 (1,5 ml protokol)
- Polydokanol (Polydocanol), 15 % (v/v) (1,0 a prípadne extrakčný protokol) alebo Triton X-100 20 % (v/v) (1,5 ml protokol)
- guanidín izotiokyanát, 5 mol/1
- 1 mmol/1 DTT
- magnetické sklenené častice (MGP), buď typ EJ/BM, EJ/MMB alebo EJ/CERAC suspendované v izopropanole (čistota 99,8 %) v koncentrácii 60 mg/ml
- premývací pufer zložený z
- Tris-pufer, 20 mmol/1, pH 7,5
- 60 % etanol vo vode (1,0 a prípadne extrakčný protokol) alebo 70 % (1,5 ml protokol)
- NaCl, 20 mmol/1
Eluent = redestilovaná voda
Amplifikácia/Mastermix:
- PCR-pufer obsahujúci pufračné médium
RT-PCR (vírus ľudskej imunodeficiencie (HIV Human immunodeficiency virus), vírus hepatitídy C (HCV)): 250 mmol/1 Bicin/KOH pH 8,2, 557 mmol/1 octanu draselného, 40 % glycerol
HBV-PCR (vírus hepatitídy B (HBV)): 20 mmol/1 Tris-HCl pH 8,3:
100 mmol/1 KC1, 0,012 % Brij 35 (= 2x koncentrovaný) katióny kovov MgCl2 (HBV-PCR) 3 mmol/1 alebo MnCl2 (RT-PCR) 2,5 mmol/1 (HCV) a 1,25 mmol/1 (HIV) deoxynukleozid trifosfát (dATP, dGTP, dCTP, dTTP, dUTP) pre analyt špecifické popredné priméry (forward) pre analyt špecifické spätné priméry (reverse)
Uracil-N-glykosidáza (UNG)
DNA-polymeráza (Taq alebo Tth polymeráza pre HBV respektíve pre HIV/HCV) demineralizovaná H2O (čistota pre molekulárnu biológiu) na úpravu objemu na 100 μΐ
Stop reagencie pre UNG po amplifikácii
N-lauroylsarkozín (napr. Roche kat. č. 133895), 1 % (váha/objem): 5 μΐ na 100 μΐ amplifikátu
7.1.2.1.2 Detekcia hybridizačný pufer (napr. Roche kat. č. 1930273) chemiluminiscenčne označené detekčné sondy:
HCV (Roche BMO 28.140336), pracovný roztok = 8,0 nmol/1
HIV (Roche BMO 28.540948), pracovný roztok = 7,8 nmol/1
HBV (Roche BMO 28.540917), pracovný roztok = 9,2 nmol/1
ECL guľôčky pokryté SA (napr. Roche kat. č. 1865943-001) denaturačný roztok (napr. Roche kat. č. 1930257)
ProCell (napr. Roche kat. č. 1717685)
CleanCell (napr. Roche kat. č. 1717642)
7.1.2.1.3 Priméry a sondy
Primér:
HIV- popredný: SEQ ID NO 3
HIV- spätný: SEQ ID NO 4
HCV- popredný: SEQ ID NO 5
HCV- spätný: SEQ ID NO 6
HBV- popredný: SEQ ID NO 7
HBV- spätný: SEQ ID NO 8
Detekčné sondy: HIV: SEQ ID NO 9
HCV: SEQ ID NO 10
HBV: SEQ ID NO 11
7.1.2.2 Reakčné podmienky a pracovný postup
Príprava vzorky:
ml manuálny protokol; => použitý na pokus 1 pozri príklad 7.3.1 pridať 25 μΐ proteínázy K ku 425 μΐ vzorky s plazmou, premiešať pridať 500 μΐ lyzačného pufra, inkubovať 5 min. pri izbovej teplote s mechanickým miešaním (1300 ot./min. v trepačke Eppendorf) pridať 50 μΐ MGP suspendovaných v izopropanole (koncentrácia 60 mg/ml), premiešať a inkubovať 20 min. pri izbovej teplote na roleri magnetická separácia s použitím magnetického separátora Dynal (2 min.);
odstrániť nenaviazanú frakciu odsatím, pridať 700 μΐ premývacieho pufra, premiešať, separovať a odsať; zopakovať premývaci postup ešte 4x pridať 120 μΐ DEPC vody, premiešať a eluovať 10 min. pri 80 °C v termomixéri Eppendorf pri 1300 ot./min., vzorky sú odzátkované oddeliť guľôčky od vodného supematantu (=eluát) pomocou magnetického separátora Dynal (2 min.) eluát zamraziť až do doby použitia
Automatizovaný protokol použitý v nami vyvinutom extraktore; => použitý v experimentoch 2 a 3 (pozri príklad 7.3.2 a príklad 7.3.3)
V podstate rovnaký postup a reagencie ako v predchádzajúcom prípade. Navyše je do každej vzorky pridaná RNA interná kontrola (IC, pozri nižšie). Extrakčný postup je termostatovaný na 40 °C a objemy sú upravené na 2 ml celkového lyzačného roztoku, to znamená:
μΐ IC μΐ proteinázy K
850 μΐ vzorky
1000 μΐ lyzačného pufra
100 μΐ suspenzie MGP
2200 μΐ premývacieho pufra pre každý z piatich premývacích krokov
125 μΐ eluentu
1,5 ml manuálny protokol; => použitý pre Experiment 4 (pozri príklad 7.3.4) pridať 80 μΐ proteinázy K ku 420 μΐ vzorky plazmy, premiešať pridať 500 μΐ lyzačného pufra, inkubovať 10 min. pri izbovej teplote s mechanickým miešaním (1300 ot./min. v trepačke Eppendorf) pridať 500 μΐ MGP suspendovaných v izopropanole (koncentrácia 6 mg/ml), premiešať a inkubovať 20 min. pri izbovej teplote na roleri magnetická separácia s použitím magnetického separátora Dynal (2 min.) odstrániť nenaviazanú frakciu odsatím, pridať 700 μΐ premývacieho pufra, premiešať, separovať a odsať zopakovať premývaci postup ešte 4x pridať 100 ml DEPC vody, premiešať a eluovať 15 min. pri 80 °C v termomixéri Eppendorf pri 1300 ot./min., oddeliť guľôčky od vodného supernatantu (= eluát) pomocou magnetického separátora Dynal (2 min.) zamraziť eluát až do doby použitia
Amplifikácia
Celkový objem reakcie je 100 μΐ (platí pre všetky vzorky)
HBV: objem eluátu pre PCR = 20 μΐ
voda (PCR čistota) zásobný roztok konečná koncentrácia v PCR/μΙ 4 μΐ
DNA-Mastermix 2x lx/50 μΐ
MgCl2 25 mM 3,0 mM/12 μΐ
primér SEQ ID NO 7 5 μΜ 0,2 μΜ/4 μΐ
primér SEQ ID NO 8 5 μΜ 0,4 μΜ/8 μΐ
UNG lU/μΙ 2U/2 μΐ
HCV: objem eluátu pre PCR = 40 μΐ
voda (PCR čistota) zásobný roztok konečná koncentrácia v PCR/μΙ 18 μΐ
bicínový pufer 5x lx/20 μΐ
MnOAc 25 mM 2,5 mM/10 μΐ
DNTP-Mix (dUTP/ 30 mM 0,6 mM
DATP/dCTP/dGTP 10 mM 0,2 mM/2 μΐ
primér SEQ ID NO 5 10 μΜ 300 nM/3 μΐ
primér SEQ ID NO 6 10 μΜ 300 nM/3 μΐ
UNG lU/μΙ 2U/2 μΐ
Tth-polymeráza 5,5 U/μΙ 10U/2 μΐ
HIV: objem eluátu pre PCR = 40 μΐ
zásobný roztok konečná koncentrácia v PCR/μΙ
voda (PCR čistota) 20 μΐ
bicínový pufer 5x lx/20 μΐ
MnOAc 25 mM 1,25 mM/5 μΐ
DNTP-Mix (dUTP/ 0,6 mM
DATP/dCTP/dGTP 10 mM 0,2 mM/2 μΐ
primér SEQ ID NO 3 5 μΜ 0,2 μΜ/4 μΐ
primér SEQ ID NO 4 5 μΜ 0,2 μΜ/4 μΐ
UNG lU/μΙ 2U/2 μΐ
Tth-polymeráza 5,5 U/μΙ 10U/3 μΐ
Po PCR je UNG zablokovaná pridaním laurylsarkozínu do koncentrácie 1 % Termocyklerové profily boli nasledujúce:
HBV:
UNG-krok lx 10 min. 37
PCR 35x 30 sek. 92
30 sek. 55
40 sek. 72
HCV:
UNG-krok lx 10 min. 37
krok
reverznej transkripcie 1 x 30 min. 60
denaturácia 1 min. 95
PCR 2x 10 sek. 95
20 sek. 60
33x 15 sek. 90
20 sek. 60
ďalšia inkubácia 7 min. 72
HIV:
UNG-krok 1 x 10 min. 37
krok
reverznej transkripcie 1 x 30 min. 60
PCR 4x 10 sek. 95
10 sek. 55
10 sek. 72
31x 10 sek. 95
sek. 60 sek. 72 °C °C °C °C °C °C °c °c °c °c °c °c °c °c °c °c °c °c °c °c detekcia s použitia, modifikovaného Elecsys 1010®
reagencie objem čas inkubácie
(HBV, HCV, HIV) (HBV, HCV, HIV)
PCR produkt 10 μΐ
denaturačný roztok 35 μΐ 5 min.
detekčná sonda 120 μΐ 30 min.
SA-guľôčky 35 μΐ 10 min.
7.2 Homogénny funkčný test: technológia 5'-nukleázového testu na prístroji Cobas Taqman®
7.2.1 Všeobecné úvahy
Lýza vírusových častíc a tiež adsorpcia, purifikácia a elúcia nukleových kyselín extrahovaných zo vzorky sú uskutočnené spôsobom opísaným skôr (pozri príklad 7.1.2). Amplifikácia cieľových molekúl je opäť opísaná rovnicou
Nj= No x (1+E)n, kde
No = počet molekúl na počiatku PCR
Nj = počet molekúl na konci PCR
E = účinnosť amplifíkácie = 0 < E < 1 n = počet reakčných cyklov = v tomto prípade typicky 40 < n < 60
Pri 5'-nukleázovej technológii sú však amplifikačné a detekčné reakcie tesne prepojené a objavujú sa vo fáze roztoku, to znamená bez imobilizácie na pevnej fáze a bez tomu zodpovedajúcich premývacích krokov (= homogénna PCR). Do PCR mastermixe sa pridajú sondy s dvomi špeciálnymi chemickými modifikáciami. Jednou z týchto modifikácií je kovalentne naviazaná fluorescenčná reportérová skupina (R, napr. derivát 6-karboxy-fluoresceínu). Táto skupina je naviazaná na základný reťazec sondy. Druhá modifikácia je farbivo (napr. derivát polymetín-cyanínu) schopné absorbovať fluorescenčné svetlo reportérove skupiny, „zhasnúť“ ju (quencher - zhášač). Zhášač je zvyčajne pripojený k základnému reťazcu sondy na 5'-konci, zatiaľ čo reportérová skupina sa nachádza vnútri oligo sekvencie, oddelená od zhášača množstvom nukleotidových stavebných blokov. Tieto sondy sa viažu na cieľové nukleové kyseliny (na sense alebo antisense vlákno) bližšie 3'-koncu priméru (prednému či spätnému). Ako sa primér naviaže na cieľ a DNA polymeráza sa naviaže na hybrid primér : cieľ a začne elongácia. Vďaka 5'-nukleázovej aktivite enzýmu je, spolu s kopírovaním a syntézou nového vlákna, vo chvíli, keď polymeráza dosiahne väzobného miesta sondy, hydrolyzovaná sonda. Tým sa reportérová skupina a zhášač vzdiali a fluorescenčný signál začne byť merateľný. Tento proces sa opakuje v každom cykle a stále viacej fluorescenčného reportéru sa akumuluje v roztoku dokiaľ sa nespotrebujú reagencie na konci reakcie. Takto na grafu závislosti signálu od času vzniknú sigmoidné krivky. Čím vyšší je No, tým skôr sa signálna krivka objaví nad pozadím.
Bod na časovej osi, kde už možno spoľahlivo oddeliť fluorescenčný signál od pozadia sa nazýva prahový cyklus (threshold cycle = ct). ct je mierka citlivosti stanovenia - čím nižšia je hodnota ct, tým citlivejšie je stanovenie. Hodnotu ct možno vypočítať pomocou rôznych matematických operácií, ako sú napríklad limitné prístupy (priemerná intenzita signálu pozadia násobená konštantným faktorom dá limitnú intenzitu signálu na odlíšenie negatívneho od pozitívneho) alebo prístup, v ktorom sa lokalizuje maximum prvej derivácie krivky závislosti signálu od času (teda strmosť profilu) alebo sa spočíta lokalizácia maxima druhej derivácie na časovej osi a definuje ako ct.
Táto amplifíkačná/detekčná technológia dovoľuje sledovať PCR v reálnom čase, pričom skúmavky sú uzatvorené, čo je v kontraste so štandardným postupom. PCR skúmavky sú od napipetovania eluátu a mastermixu uzatvorené, čím je účinne znížené riziko kontaminácie.
Okrem to je možné použiť súpravy sond a primérov pre rozdielne druhy vírusov (a teda rozdielne molekuly analytu a rozdielne cieľovej sekvencie) kombinovanej v jedinom mastermixe. Takto je možné uskutočniť niekoľko amplifikačných a detekčných reakcií naraz, v závislosti od prítomnosti vírusov kontrolovaného jedinca. To je základom tzv. viacnásobného stanovenia.
A čo viacej. Vďaka všeobecnej povahe prípravy vzoriek pomocou MGP, je všetka nukleová kyselina prítomná vo vzorkách extrahovaná na základe fyzikálne-chemickej adsorpcie na povrch častíc, bez ohľadu na sekvenčnú charakteristiku. To zahrnie tiež ľudskú DNA (human hDNA), uvoľnenú z rozrušených krvných buniek, napr. leukocytov, ktorých titer sa môže vo veľkej miere líšiť v závislosti od fyziologického alebo patologického stavu jednotlivých darcov krvných vzoriek. Napr. v prípadoch autoimúnnych ochorení, ako sú SLE, môžu byť hladiny hDNA výrazne zvýšené. Takže hDNA a jedna či viacej patogénnych nukleových kyselín prítomných v danej vzorke tvoria zmes rozdielnych nukleových kyselín s rozdielnymi sekvenčnými vlastnosťami, ktoré sú extrahované spoločne. Tvoria sieť polynukleotidov, ktoré sú extrahované bez rozdielu a následne sú cieľové nukleové kyseliny za vhodných reakčných podmienok sekvenčne špecificky amplifíkované a detegované pomocou interakcie so špecifickými primérmi a sondami.
Daná patologická hladina 4000 ng/ml hDNA (v prípade SLE) a nízka hladinu vírusu - 50 kópií vírusovej genomickej DNA na ml plazmy, čo je 10000 nukleotidov na genómovú RNA. 50 kópií resp. 50000 nukleotidov cieľovej RNA s hmotnosťou cca 325 daltonov (1 dalton = 1,66 x 10'24 g) na nukleotid dáva cca 2,7 x 10'7 ng na ml plazmy, čo vedie k výsledku, že relatívne zastúpenie cieľovej nukleovej kyseliny k necieľovej je približne 1 : 10+12! Na monitorovanie celého procesu môže byť do vzoriek pridávaný umelý konštrukt nukleovej kyseliny, najlepšie pokiaľ je zabalený (obalený) modifikovanou vírusovou časticou. Ten je potom extrahovaný a amplifikovaný dohromady s prírodným cieľom. Táto vnútorná kontrola (intemal control = IC) predstavuje unikátnu väzobnú oblasť pre IC detekčnú sondu, ktorá sa líši od sond špecifických pre cieľ rozdielnymi reportérovými skupinami, s odlišnými emisnými charakteristikami. Takto môže byť IC signál odlíšený od cieľového signálu a pretože je známe, že IC sú prítomné vo vzorke, môže tento signál slúžiť k monitorovaniu. Takže viacnásobné označenie zvyšuje užitočnosť multiplex technológie. Interná kontrola je opísaná v W098/00547.
7.2.2 Experimentálny protokol
7.2.2.1 Reagencie
7.2.2.1.1 Príprava vzorky
Pozri (príklad 7.1.2 => automatizovaný protokol na vyvinutom extraktore)
7.2.2.1.2 5'-nukleázový test, reakčné činidlá a reakčné podmienky
koncentrácia konečná prídavok
Reagent zásobného koncentrácia (μΐ/ reaction)
roztoku v teste
Mn(OAc)2 pH 6,5 50 mM 3 mM 5,75
dNTPs 2,50
(dG, dA, dC) 100 mM 300 μΜ
(dT) 50 μΜ
(dU) 500 μΜ
DEPC-H2O - 9,50
Glycerol 80% 5,64 % napospol 3,50
*2,8 % prid. tu
K Oac pH 7,5 2M 100 mM 5,00
Tricín pH 8,3 1 M 50 mM 5,00
DMSO 80% 5,0 % 6,25
Primér SEQ ID NO 12 50 μΜ 150 nM 0,30
Primér SEQ ID NO 13 50 μΜ 150 nM 0,30
Primér SEQ ID NO 14 50 μΜ 400 nM 0,80
Primér SEQ ID NO 15 50 μΜ 150 nM 0,30
Primér SEQ ID NO 16 50 μΜ 400 nM 0,80
Primér SEQ ID NO 17 50 μΜ 150 nM 0,30
Primér SEQ ID NO 18 50 μΜ 150 nM 0,30
Sonda SEQ ID NO 19 50 μΜ 100 nM 0,20
Sonda SEQ ID NO 20 50 μΜ 100 nM 0,20
Sonda SEQ ID NO 21 50 μΜ 100 nM 0,20
Sonda SEQ ID NO 22 50 μΜ 100 nM 0,20
UNG 2,4 U/μΙ 10 U 4,20
ZO5 10 U/μΙ 40 U 4,00
Aptamér SEQ ID NO 23 50,4 μΜ 200 nM 0,40
* Zvyšok glycerolu sa pridá s enzýmami ZO5 (mutovaná Tth-DNA polymeráza) a UNG (uracil-N-glykozidáza).
Bežný profil na multiplex termálnu cyklovaciu reakciu pre všetky testované parametre sú nasledujúce:
UNG krok Denaturácie 45 °C 94 °C 10 min. 30 sek.
reverzná transkripcia 94 °C 30 sek.
PCR 95 °C 20 sek./59 °C 50 sek. - 5x
91 °C 15 sek./52 °C 50 sek. - 55x
7.2.2.1.3 Sekvencia
Primér:
HIV popredný SEQ ID NO 12
HIV popredný SEQIDNO 13
HIV spätný SEQ ID NO 14
HCV popredný SEQIDNO 15
HCV spätný SEQIDNO 16
HBV popredný SEQIDNO 17
HBV spätný SEQIDNO 18
Sondy:
HIV: SEQ ID NO 19
HIV: SEQ ID NO 20
HIV: SEQIDNO 21
HIV: SEQ ID NO 22
Aptamér:
SEQ ID NO 23
Teplota topenia komplexu DNA polymeráza-aptamér = 51,7 °C (= 50 % disociácia).
Terminológia chemickej derivatizácie:
Niektoré z nukleotidov sú derivatizované Cy5, čo je Pentamethine-di-indocarbocyanine pripojený k alkylfosfatidilovému spojovníku (linker) (Pharmacia Biotech Cy5-N-ethy-phosphoramidite) a ktorý pôsobí ako zhášač (quencher) (Q); λΕχ = 630 nm, λΕΜ= 665 nm. Niektoré z oligonukleotidov sú derivatizované FAM, čo je 6-karboxyfluoresceín pripojený k 2-(amino-cyklohexyl-)propán-l,3-diol (ovému) spojovníku (Biogenex CX-FAM-phosphoramidite) a ktorý funguje ako reportér na ciele (R); λΕχ = 485 nm, λΕΜ = 515 nm. Niektoré z oligonukleotidov sú derivatizované hexachloro-6-carboxyfluoresceínom, ktorý je pripojený k 2-(aminocyklohexyl-)propán-l,3-diol(ovému) spojovníku (Biogenex CX-HEX-phosphoramidite) a ktorý pôsobí ako reportér na internú kontrolu (R); λΕΧ = 530 nm, λΕΜ = 585 nm.
7.2.2.1.4 Reakčné podmienky
Reakčné podmienky sú opísané vo výsledkoch experimentov (pozri príklad 7.3).
7.2.2.1.5 Ďalšie potreby
- vírus-negatívna plazma (0-Matrix, jednoduchá plazma alebo zložená plazma (single plasma or PlasmaPool)), napríklad citrát plazma alebo EDTA-plazma
- vírus pozitívna plazma, alebo vírus obsahujúci supematanty kultúr, ktoré sa môžu použiť na úpravu určitých titrov vírusov zmiešaním s 0-matrix v zodpovedajúcich pomeroch;
- alebo: in-vitro transkripty so skúmanými cieľovými sekvenciami - ľudská placentáma DNA (a. genómová, Sigma kat. č. D4 642; b. fragmentovaná, Sigma kat. č. D3287) pridaná ku vzorke na napodobnenie patologických podmienok, ktoré vedú ku zvýšenému uvoľňovaniu intracelulámych látok a tak ku zvýšeným hladinám DNA/RNA v krvi, napríklad autoimúnne ochorenie ako SLE hemolýza.
7.3 Výsledky funkčných testov
7.3.1. Experiment 1
Rôzne MGP-vzorky typu EJ/CERAC sa skúmali metódou opísanou v 7.1. Premennou v teste bol rozprašovací tlak:
EJ0100.5R- 1,5 baru EJ0106.5R-2,5 baru EJ0107.5R- 3,5 baru EJ0108.SR-4,3 baru
Môže sa ukázať, že so zvyšujúcim sa rozprašovacím tlakom, tzn. posunom smerom k menšiemu priemernému priemeru guľôčok, klesá nešpecifické nadväzovanie (USB, unspecific binding), zatiaľ čo tvorba vysoko špecifického signálu je nezmenená, čo má za následok zvýšený pomer signálu k pozadiu.
Upravením titra vírusu 0,5xGG je približne 100 sgu/ml (sgu = signál generating units, signál vytvárajúci jednotky) v prípade HBV a asi 150 sgu/ml v prípade HIV. Údaje sú zhrnuté v tabuľke 7.
7.3.2 Experiment 2
Dva varianty ako EJ/MMB a EJ/CERA.C sa funkčne porovnali s využitím metódy opísané v príklade 7.2 v spojení so spojenými (multipool, MP) a jednotlivými (PL) vzorkami plazmy. EJ0047.2R (MMB) a EJ0100.5R (CERAC) sa rozprašovali za štandardných podmienok, tzn. 1,5 baru, teplota na vstupe 230 °C a na výstupe 110 °C. EJ0102.2R (MMB) a EJ0108.5R (CERAC) sú vývojové varianty, čo sa týka rozprašovacích podmienok (teplota na vstupe znížená na 200 °C [MMB]) a rozprašovací tlak zvýšený na 4,3 baru [CERAC]). Výsledky sú zhrnuté v tabuľke 8 a ukazujú možnosti CERAC nano-jadrových častíc získať vyššiu citlivosť, ako je vysvetlené časnejším „threshold“ cyklom a/alebo väčšími rozdielmi signálu (saturačný signál mínus šum, S-N (signál minus noise)).
7.3.3 Experiment 3
Niekoľko MGP prípravkov typu EJ/MMB a EJ/CERAC (pozri tabuľka 9) je funkčne porovnané s využitím metód opísaných v príklade 7.2. Výsledky sú zhrnuté v tabuľke 10 a ukazujú potenciál častíc typu EJ0096.5R-01 dosiahnuť vyššiu citlivosť, ako dokazuje časnejší „threshold“ cyklus alebo vyššiu úspešnosť hľadania (hit rate) nezávisle od konkrétneho testu.
7.3.4 Experiment 4
Niekoľko MGP prípravkov typu EJ/MMB a ES/CERAC je funkčne porovnaných s využitím metód opísaných v príklade 7.1, kde sa uskutočňuje adsorpčná inkubácia s trepaním a/alebo bez trepania. Tým sa stane sedimentačná rýchlosť rozhodujúca, tzn. čím je vyššia sedimentačná rýchlosť, tým je vyšší počet častíc, ktoré sa (vo vytvárajúcom sa precipitáte) neúčastnia interakcie s analytom. Na rozdiel od stavu, keď je sedimentačná rýchlosť menšia ako časové rozpätie, v ktorom sa môžu molekuly analytu z tekutiny naviazať na povrch adsorbentu. Výsledky zhrnuté v tabuľke 11 (EJ0047.2R sa použil ako referencia) ukazujú, že bez mechanického trepania je strata výkonnosti najväčšia (>40 %) u MMB typu (líšia sa významne od charakteristík tohto vynálezu) a najmenšia alebo prakticky vôbec žiadna u CERAC typu (najviac sa podobá v tejto sérii charakteristikám vynálezu).
Aby bolo možné starostlivo zhodnotiť funkčnosť rôznych typov MGP, vypočítal sa pre každý typ nasledujúcim spôsobom výkonnostný index:
- eluáty rôznych dávok každého typu MGP a každej hladiny titra sú spojené do 1 spojeného eluátu
- z každého spojeného eluátu sa uskutočnili 3 amplifíkácie každého testu (HIV, HCV, HBV)
- každý amplifikát sa meral zvlášť (in singlicite) na modifikovanom Elecsys 1010®
- signál sa pre všetky typy MGP, testy a hladiny titrov spriemerkovali
- pre každý typ MGP a test sa vypočítali faktory signál/šum (S/N), tzn. nízky titer (slabo pozitívny) cez O5 -matricu (negatívny) a zvýšený titer cez O-matricu
- S/N faktory sú normalizované k referenčnému typu MGP súčasne (at the time)
- výpočet súčtu normalizovaných S/N faktorov pre každý typ MGP získaný zo všetkých testov a hladín titrov; S/N faktory pre nízke rozsahy titrov sú vážené dvojnásobne relatívne k hodnotám pre vysoké hladiny titrov, aby sa zohľadnili aspekty citlivosti
- výsledná suma je pridelený index výkonnosti pre každý skúmaný typ MGP
7.3.5 Experiment 5
Na extrakciu HCV in vitro transkriptov, ktoré sa nariedili na rôzne hladiny titrov riediacim roztokom obsahujúcim 10 mmol/1 Tris, pH 80,1 mM EDTA, 20 ug/ml poly-A-RNA a 0,05 % NaN3 a pridané do spojenej plazmy, sa použili rôzne typy MGP.
Ľudské DNA pozadia (human background DNA - hBG-DNA) sa pridali do vzorky v koncentráciách 0 alebo 4000 ng/ml. Prekvapivo je možné obmedziť interferenciu hBG-DNA výberom guľôčok, ako ukazujú hodnoty uvedené v tabuľke 12.
7.3.6 Experiment 6
Na spracovanie vzoriek HCV pozitívnej plazmy sa použili rôzne typy MGP. Do vzorky sa pridávala ľudská DNA pozadia (human background DNA - hBG-DNA) v koncentrácii 0 alebo 4 000 ng/ml. Opäť bolo možné pozorovať značný dopad veľkosti guľôčok a geometrie guľôčok. MGP EJ0096.5R, čo je najlepší predstaviteľ MGP predkladaného vynálezu, vykazuje jasné výhody čo sa týka minimálneho posunu ct hodnôt a znížením straty generovaného špecifického signálu (S-N), ako ukazujú dáta uvedené v tabuľke 13.
Tabuľka 1
Spoločnosť Skratka Opis Kód (pozri príklad 1.4
— — Bez pigmentu 0
Merck Darmstadt, Nemecko BM Merck Black Mica: Malé plátky sľudy (podpora), priemer = 10 až 60 pm, hrúbka asi 1 - 2 pm, pripojené sú malé kvádre Fe3O4, a zrna TiO2; typicky dochádza k agregácii niekoľkých jednotiek pigmentu 1
Merck Darmstadt, Nemecko MMB Merck Microna Matte Black Malé plátky sľudy (podpora), priemer = 3-15 pm, hrúbka asi 1 - 2 pm, pripojené sú malé kvádre Fe3O4; typicky dochádza k agregácii niekoľkých jednotiek pigmentu 2
BASF Ludwigshafen, Nemecko BASF-FA BASF oxid železitý FA28-41: Ihlice nanoveľkosti vyrobenej z gam p= Fe2O3, dĺžka asi 200 až 400 nm, vďaka tvaru a veľkému, vysoko štruktúrovanému povrchu veľmi vysoká náchylnosť k agregácii do častíc v urozsahu Cerac, 4
CERAC Milwaukee WI, USA CERAC y-Fe2O3, (kat. č. 1-2012, distribuovaný Chemco Chemiprodukte GmbH v Nemecku) y-Fe2O3 -mikroguľôčky v nano-oblasti (čistý oxid železitý), priemer = 23 nm, neagregujúci 5
Strem Chemicals, Newburyport MA, USA STREM STREM Fe3O4 > 95 % (kat. č.: 93 - 2616) mikroguľôčky v nano-oblasti vyrobené z precipitovaného Fe3O4, priemer = 200 - 500 nm, silná tendencia k agregácii do častíc v u-rozsahu 7
BASF Ludwigshafen, Nemecko BASF-CE Guľôčky v μ-oblasti vyrobenej z kovového železa - BASF karbonylový železný prášok HQ: 10 % < 1,04 pm, 50 % < 1,91 pm, 90 % < 3,71 pm, - BASF karbonylový železný prášok SU: 10 % < 0,43 pm, 50 % < 0,93 pm, 90 % <1,81 pm, 8 9
Tabuľka 2
Kód MI TEOS Voda (ml/100 ml) TEOS Alkohol I Alkohol (ml/100 ml TEOS Starnutie (h) Rozprašovací tlak (bar) Dýza Teplou vstupu (°C) Teplota vo vzduchu pred FA (°C) Teplota n2 po FA (°C) Teplota O2po FA (°C) Tepelné opracovanie vo fľaši pod vzduch (°C)
0005 1750 13,33 EtOH 50 1 1,5 A 230 250 675 300 300
0009 1750 13,33 EtOH 50 1 1,5 A 230 250 675 300 300
0045 1400 13,33 EtOH 50 0 1,5 A 230 200 675 300 200
00456 250 13,33 EtOH 50 0 5 Biich 150 200 675 300 200
0047 1300 14,13 EtOH 137 0 1,5 A 230 250 750 200 200
0096 150 14,1 EtOH 141 0 230 6 Biich i 150 200 750 200 200
0097 150 14,1 EtOH 141 0 191 6 Buch 150 200 750 200 200
0098 210 14,1 EtOH 141 0 230 6 Biich 150 200 690 200 200
0099 210 14,1 EtOH 141 0 230 6 Biich i 150 200 710 200 200
0100 840 14,1 EtOH 141 0 230 1,5 A 230 200 750 200 200
0101 840 14,1 EtOH 141 0 191 1,5 A 230 200 750 200 200
0102 1300 14,1 EtOH 141 0 230 1,5 A 230 200 750 200 200
0106 840 14,1 EtOH 141 0 230 2,5 A 230 200 750 200 200
0107 3,5 A 230 200 750 200 200
0108 4,3 A 230 200 750 200 200
0109 8000 14,1 EtOH 141 0 230 1,5 A 210 200 750 200 200
0111 1300 14,1 EtOH 141 0 230 1,5 A 210 200 750 200 200
0119 1200 14,6 EtOH 130 0 230 1,5 A 210 200 750 200 200
0124 6 Biich i 150 200 750 200 200
0128 7830 14,1 EtOH 141 0 230 1,5 A 230 200 750 200 200
0129 1,5 A 200 200 750 200 200
0130 4,3 A 200 200 750 200 200
0131 6 A 200 200 750 200 200
Tabuľka 3
vzorka Výstupná teplota Hustota (°C) (g/cm3) Extincia (280 nm) Extincia (400 nm) Rozpustnosť železa (mg/ml) Magnetická sila (g/250 mg)
RN0005.2E-01 116 3,420 0,037 0,027 < detekčný limit 16,04
RN0009.1E-01 119 3,155 0,106 0,093 < detekčný limit 9,50
EJ0028.25-01 118 3,602 0,019 0,024 < detekčný limit 12,25
RN0045.4R-01 130 >3,647 0,032 0,034 < detekčný limit 9,23
RN0046.7R-01 98 3,866 0,013 0,013 < detekčný limit 13,12
RN0045.5R-01 120 3,802 0,019 0,017 0,047 9,52
EJ0047.2R-01 118 3,659 0,022 0,018 < detekčný limit 12,00
EJ0096.5R-01 96 4,203 0,001 0,000 < detekčný limit 13,53
EJ0096.7R-01 96 4,328 0,000 0,001 < detekčný limit 18,36
EJ0097.4R-01 96 3,859 0,001 0,000 < detekčný limit 15,17
EJ0098.8R-01 95 5,588 0,065 0,055 < detekčný limit 15,76
EJ0099.9R-01 95 5,538 0,103 0,101 0,016 14,13
EJ0100.7R-01 122 4,196 0,027 0,003 < detekčný limit 16,29
EJ0100.5R-01 126 4,069 0,012 0,012 < detekčný limit 12,42
EJ0101.4R-01 119 4,079 0,083 0,084 0,015 11,67
EJ0102.2R-01 128 3,668 0,009 0,009 < detekčný limit 13,36
EJ0047.2R-07 118 3,612 0,024 0,022 0,159 11,26
EJ0100.5R-02 127 4,107 0,029 0,023 0,054 14,51
EJ0100.5R-03 127 4,173 0,063 0,045 0,126 10,44
EJ0106.5R-01 127 4,191 0,004 0,004 0,025 10,09
EJ0107.5R-01 127 4,235 0,016 0,009 0,037 10,25
vzorka Výstupná teplota Hustota (°C) (g/cm3) Extincia (280 nm) Extincia (400 nm) Rozpustnosť železa (mg/ml) Magnetická sila (g/250 mg)
EJ0108.5R-01 127 4,233 0,026 0,026 0,039 11,56
EJ0109.2R-01 110 3,700 0,046 0,043 0,028 11,23
EJ0111.5R-01 117 3,612 0,071 0,036 0,166 16,48
EJ0111.5R-02 121 4,082 0,065 0,040 0,161 15,95
EJ0124.5R-01 3,992 0,001 0,001 0,051 17,57
EJ0128.5R-01 125 4,078 0,023 0,028 8,97
EJ0129.5R-01 92 4,013 0,044 0,043 9,64
EJO13O.5R-O1 87 4,022 0,031 0,036 11,70
EJO131.5R-O1 89 3,908 0,033 0,037 11,73
EP0119.5R-01 127 4,110 0,003 0,003 0,079 17,15
Tabuľka 4
Šarža BET povrch (m2/g) Poznámka
EJ0096.5R-01 26,85 Cerac, malá rozprašovacia sušička, 6 bar
EJ0100.5R-01 8,95 Cerac, veľká rozprašovacia sušička, 1,5 bar
EJ0101.4R-01 8,47 BASF FA, veľká rozprašovacia sušička, 1,5 bar
RN0005.2E-01 3,54 MERC MMB, veľká rozprašovacia sušička, 1,5 bar
RN0009.1E-01 3,25 MERC MMB, veľká rozprašovacia sušička, 1,5 bar
EJ0099.9R 0,74 BASF CE-SU, veľká rozprašovacia sušička 6 bar
EJ0100.7R 8,53 STREM, veľká rozprašovacia sušička 1,5 bar
Tabuľka 5
typ MGP veľkosť izolovaných jadier zloženie forma ti/2 sedimentácia [min.] t|/2 separácia [sec.]
MMB 3-15 pm agregované doštičky 3,9 14
CERAC 23 nm individuálne guľôčky » 10 16
STREM 300 - 500 nm agregované guľôčky 4,8 10
BASF-FA 200 - 300 nm agregované ihličky 4,6 12
Tabuľka 6
MGP vzorka to>9 (90 %-Wert) sedimentácia [min.] tl/2 (90 %-Wert) sedimentácia [min.]
EJ0100.5R-01 0,35 2,78
EJ0108.5R-01 0,62 7,58
EJ0096.5R-01 1,39 19,85
Tabuľka 7_
MGP USB [impulzy] - HIV 0-tnatrixHBV SB [impulzy] - HIV
EJ0100.5R-01_4997_2277_20380
EJ0100.5R-02_6100_3590_22036
EJ0100.5R-03_4856_2270_19791
EJ0106.5R-01 4427 2263 19030
0,5x-matrix HBV 80292 53417 65109 75128
EJ0107.5R-01_3940_2261_19255_68285_
EJO1O8.5R-O1 3429 2217 20048 80426
Tabuľka 8
HBV HCV
vzorka MGP šarža Ct S-N Ct S-N
MP2 El 0047.2 40,49 19,88 41,68 12,6
MP2 EJ100.5 40,96 21,80 43,08 12,74
MP2 EJ0102.2 41,93 21,39 44,74 10,10
MP2 BJ0108.5 40,09 22,01 47,36 10,61
Pl.1/2 EJ0047.2 41,03 18,14 - -
Pl 1/2 EJ100.5 40,12 19,31 - -
Pl 1/2 EJ0102.2 41,81 22,80 44,69 14,30
Pl 1/2 EJ0108.5 39,93 21,77 43,27 12,58
P14/5 EJ0047.2 46,33 12,83 39,54 18,30
Pl. 4/5 EJ100.5 40,82 15,12 38,24 21,48
Pl. 4/5 EJ0102.2 42,49 19,65 39,24 19,05
Pl. 4/5 EJ0108.5 47,33 9,51 39,47 17,81
Pl. 6/8 EJ0047.2 41,08 20,83 49,44 9,46
Pl. 6/8 EJ100.5 40,68 23,16 48,98 10,31
Pl. 6/8 EJ0102.2 40,50 22,49 54,50 6,50
Pl. 6/8 EJ0108.5 38,79 18,60 50,41 8,61
Pl. 6/8 EJ0047.2 44,16 17,26 41,40 10,59
Pl. 6/8 EJ100.5 42,97 18,59 41,01 11,33
Pl. 6/8 EJ0102.2 44,49 12,41 42,18 11,32
Pl. 6/8 EJ0108.5 41,24 18,73 41,46 10,80
Štatistika merania: Ktorý typ vyhovuje lepšie
„štandardné vzorky“ MMB: CERAC „vývojové varianty“ MMB: CERAC súhrn: najlepší typ na vzorka * stanovenie MMB: CERAC
Ct S-N Ct S-N Ct S-N
2 : 7 0 : 9 3 : 7 5 : 5 1 : 9 3 : 7
(1 zrovnanie nemohlo byť vyhodnotené)
Tabuľka 9
MGP Opis
EJ0096.5R 6 barov rozprašovací tlak, 150 °C vstupná teplota, Biichi laboratórne vybavenie. Tento preparát sa blíži charakteristikám podľa vynálezu veľmi dobre, pozri obrázok 15
EJ0111.5R 1,5 barov rozprašovací tlak, 230 °C vstupná teplota, Nubilosa laboratórne vybavenie
EP0119.5R 1,5 barov rozprašovací tlak, 230 °C vstupná teplota, Nubilosa laboratórne vybavenie, zmenené zloženie skla bez Zn-acetátu, K-metanolát je nahradený K-acetátom s rovnakou stechiometriou
|EJ108,5R |4,3 barov rozprašovací tlak, 230 °C vstupná teplota, Nubilosa laboratórne vybavenie |
Tabuľka 10
ct-hodnoty (HBV) ct- prepočet cez maximum prvej derivácie
Parameter Titer [sgu/ml] MGP šarže EJ0111.5R-02 AVG MGP šarže EP0119.5R AVG MGP šarže EJ0096.5R AVG MGP šarže EJ0108.5R AVG
HBV NK - - - -
100 46,1 44,1(6/6) 43,4 44,2
40 47,6 46,5(7/8) 45,5(7/8) 46,7(6/7)
20 50,6(6/8) 46,1(6/8) 46,8(7/8) 50,0(4/8)
10 47,6(5/8) 50,1(5/8) 46,8(4/8) 47,7(3/7)
5 51,2(3/8) 48,6(4/8) 47,8(5/8) 49,7(4/7)
pomerná početnosť 75% 74% 77,5 % 67,5 %
Parameter ct-prepočet cez vzorec medznej hodnoty
Titer (sgu/ml] MGP šarže EJ0111.5R-02 AVG MGP šarže EP0119.5R AVG MGP šarže EJ0096.5R AVG MGP šarže EJ0108.5R AVG
HBV NK - - - -
100 44,2 41,7(6/6) 41,5 41,9
40 45,5 44,1(7/8) 42,7(6/8) 45,0(6/7)
20 47,7(6/8) 43,5(6/8) 44,3(7/8) 47,2(6/8)
10 45,5(5/8) 47,7(3/8) 44,4(6/8) 45,6(3/8)
5 49,3(3/8) 45,7(4/8) 45,4(4/8) 46,6(4/7)
pomerná početnosť 75 % 74% 77,5 % 71 %
ct-hodnoty (HCV)
ct- prepočet cez maximum prvej derivácie
MCP šarže MGP šarže MGP šarže MGP šarže
Parameter EJ0111.5R-02 EP0119.5R EJ0096.5R EJ0108.5R
AVG AVG AVG AVG
HCV NK - - - -
400 42,7 42,5(7/8) 41,8 42,6(7/7)
80 44,4(7/8) 44,1(6/6) 44,2(7/8) 44,2(7/7)
60 45,1 44,7(7/7) 44,4(6/7) 45,1(6/6)
40 46,2(7/8) 45,8(7/7) 43,9(5/7) 44,5(7/7)
20 46,(5/8) 46,3(7/7) 45,9(6/8) 47,4(4/8)
pomerná početnosť 90% 97% 84% 85 %
ct-prepočet cez vzorec medznej hodnoty
MGP šarže MGP šarže MGP šarže MGP šarže
Parameter Titer (IU/ml) EJ0111.5R-02 EP0119.5R EJ0096.5R EJ0108.5R
AVG AVG AVG AVG
HCV NK - - - -
400 41,8 4106(7/8) 40,9 41,7(7/7)
80 44,6(7/7) 44,0(6/6) 43,4(7/8) 44,5(7/7)
60 44,7 45,5(7/7) 45,1(6/7) 44,3(5/6)
40 47,9(7/8) 46,1(7/7) 44,7(4/7) 47,5(7/7)
20 49,6(5/8) 47,2(7/7) 45,3(5/8) 47,4(4/8)
pomerná početnosť 90% 97% 79% 86%
ct - hodnoty (HIV)
ct- prepočet cez maximum prvej derivácie
MGP šarže MGP šarže MGP šarže MGP šarže
Parameter i iter EJ0111.5R EP0119.5R EJ0096.5R EJ0108.5R
[sgu/ml] AVG AVG AVG AVG
HIV NK - - - -
30 43,2(6/8) 46,9(3/8) 43,9(3/7) 41,9(1/7)
60 42,7(4/7) 42,6(4/7) 42,8(7/7) 42,4.4(2/7)
150 42,4(5/7) 42,0 41,7(6/6) 42,6(6/8)
300 41,9(5/5) 41,0(5/5) 41,5(6/6) 41,3(6/6)
600 41,6(7/7) 40,8(6/6) 40,8(5/5) 41,5
pomerná početnosť 79% 76% 87% 64,0 %
ct-prepočet cez vzorec medznej hodnoty
MGP šarže MGP šarže MGP šarže MGP šarže
Parameter Titer [IU/ml] EP011.5R EP0119.5R EJ0096.5R EJ0108.5R
AVG AVG AVG AVG
HIV NK - - - -
30 44,3(1/8) 47,3(2/8) 46,8(1/7) -(0/7)
60 50,3(3/7) 54,1(1/7) 51,4(4/7) -(0/7)
150 47,4(5/7) 43,7(5/8) 45,5(5/7) 52,2(2/8)
300 42,2(5/5) 44,8(5/5) 41,6(4/6) 46,5(6/6)
600 41,2(7/7) 41,3(5/6) 41,1(5/5) 42,5
pomerná početnosť 62% 53 % 59% 44%
Tabuľka 11
typ MGP HIV 1 HCV HBV výkonnostný index index pomer výkonnosti
60 sgu/neg 600 sgu/neg 4800 sgu/neg 40 sgu/neg 400 sgu/neg kumulovaný/vážený/ normalizovaný s trepaním/bez trepania
EJ0047.2R (referencie) 100 100 100 100 100 100 900 -
EJ0096.5R 55 34 44 74 146 112 709 -
EJ0096.7R 47 47 18 8 116 107 523 -
EJ0097.4R 32 54 29 47 169 132 692 -
RN0045.5R 85 64 76 63 7 84 545 -
RN0046.7R 109 80 43 40 121 135 803 -
RN0045.4R 48 93 112 128 136 96 908 -
EJ0047.2R (referencie) 24 24 52 49 93 122 534 0,59
EJ0096.5R 28 23 47 88 102 154 619 0,87
EJ0096.7R 34 23 38 14 99 70 449 0,86
EJ0097.4R 33 36 20 18 101 94 456 0,66
RN0045.5R 53 74 60 25 107 72 610 1,12
RN0046.7R 141 90 16 8 32 40 518 0,64
RN0045.4R 55 113 25 146 78 101 675 0,74
Tabuľka 12
častice HCV- titer (IVT-RNA) AhDNA Act AS-N
RN00091 .E = veľké doštičky (3 - 60 pm) 1000 cp/PCR 4000 ng/ml +2 -6,1
EJ0100.SR = deformované guľôčky -1 -3,2
(ca. 1 - 12 μ rozsah)
EJO1O8.5R= (ca. 1-4 μ rozsah) ±0 -1,2
deformované* guľôčky ▼ ▼
* vysokotlaková varianta, pozri sekcia 7.2.4.2. a 7.3.1 poznámka:
Δ (+) Δ ct = menej citlivý (tzn. tendencia k falošne negatívnym výsledkom); (-)Δ ct = citlivejší (tendencia k falošne pozitívnym výsledkom?) (-)AS-N= tvorba menej špecifického signálu = negatívna interferencia
Tabuľka 13
(EJ/CERAC iba) HCV- titer (extrahovaná genómová RNA) AhDNA Act AS-N
EJ0096.5R = zamýšľaný cieľ* 200 IU/ml vzorka 4000 ng/ml -0,95 -8,5
EJ0127.5R= štandard -3,08 -13,89
EJ0129.5R = p-variant -2,30 -12,62
EJ0130.5R = p-variant -2,62 -10,57
EJ0131.5R = p-variant 1 F -2,46 -12,41
* = 0,5 - 5 μ-rozsah: > 50 % sub- μ -stupnice; veľká povrchová plocha (27 m2/g BET); dokonale guľovité gu15 ľôčky p- variant = sušenie rozprašovaním pri vyššom tlaku (pozri sekcia 7.3.1).
Obrázok 1
Schematické znázornenie prípravy syntézou sólu a sušením rozprašovaním
pridanie magnetického pigmentu .......... ..... *, ▼
sól s disperziou pigmentu vhodný pre rozprašovanie proces sušenia rozprašovaním(premenlivý tlak, teplota, rýchlosť prietoku, geometria trysky)
Xerogél častice s magnetickým jadrom
Obrázok 2
Schematické znázornenie prípravy nehotových častíc
Predkondenzácia teplotným pôsobením (4h/200 ’C) na vzduchu pre stabilizáciu povrchu
I
Konečná kondenzácia a spekanie v inertnej atmosfére (N?) pôsobením vysokej teploty (lh, 750 °C) => jadra pigmentov obklopené slabo podchladenou taveninou
I
Rýchle ochladenie => sklom obalené častice s magnetickým jadrom = MGP
Teplotní opracovanie na vzduchu (4h, 200 ’C) = oxidácia skleneného obalu
I
Príprava neagregujúcej frakcie použitím sita
Plnenie MGP prášku do fliaš, potom teplotné opracovanie 4h/200 °C í
Ochladenie na asi 80 ’C, uzatvorenie fľaše fóliu a zaskrutkovanie viečka
I
Skladovanie MGP častíc ==> suspenzia v R-OH (napr. izopropanole)
Obrázok 3
WB nádoba so solom
5 SP plniaca pumpa EWT elektrický ohrievač T sušiaca komora ZY odlučovač SF filter
10 WT kondenzátor AV ventilátor AVO nádoba US ultrazvukové zariadenie
15 Technické údaje: Priemer sušiacej komory 0,75 m
Výška sušiacej komory 2,5 m
Vyparovacia schopnosť 1 - 2 1/h
20 Obrázok 4
Obrázok 5
Obrázok 7
Obrázok 8
Obrázok 9
Obrázok 11
% £ £
04
\o o in
CA Ί
'S £ £
m \O Ol
ΙΛ o í<
CA «—»
100,0%
g g £ <£ £ £ á?
O O o o o o O o o o
o c5 o o o σ O o o o
CA OO Γν. tn »r en 04 r—<
[%] H^sqo
Obrázok 12
100,0%
Obrázok 13
100,0%
Obrázok 14a tn
-r £1 (uiu 059) ciOTfuuxg “L o
«3
CD
T
CN o
CM
Obrázok 14b
(BIUBJ3UI OJS3IUI 3Uq3JA) QCg UOJlUOýf g
Cas merania [min.]
Obrázok 15
Obrázok 16
Prehľad sekvencii <110> Roche Diagnostics GmbH < 120> Magnetické sklenené častice, metódy ich prípravy a použitie <130> 52960AEP engl AB <140>
<141>
<150> EP99122853.7 <151> 1999-11-17 <160> 23 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 23 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický olinukleotidový primér <400> 1 tcagggcaaa actcagctca ccg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <400> 2 gatgagttcg tgtccgtaca act 23 <210>3 <211> 30 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický olinukleotidový primér (HIV vopredný) <220>
<221> Modifikovaná báza <222> (1) <223> Derivatizácia biotínu <400> 3 agttggagga catcaagcag ccatgcaaat 30 <210>4 <211> 27 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický olinukleotidový primér(HIV spätný) <220>
<221> Modifikovaná báza <222> (1) <223> Derivatizácia biotínu <400> 4 tgctatgtca gttccccttg gttctct 27 <210>5 <211> 24 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický olinukleotidový primér (HCV vopredný) <400> 5 gcagaaagcg tctagccatg gcgt 24 <210> 6 <211> 24 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický olinukleotidový primér(HCV spätný) <220>
<221> Modifikovaná báza <222> (1) <223> Derivatizácia biotínu <400> 6 ctcgcaagca ccctatcagg cagt 24 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický olinukleotidový primér (HBV vopredný) <400> 7 ggagtgtgga ttcgcact 18 <210> 8 <211> 18 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický olinukleotidový primér (HBV spätný) <220>
<221> Modifikovaná báza <222> (1) <223> Derivatizácia biotínu <400>8 tgagatcttc tgcgacgc 18 <210>9 <211>20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetická olinukleotidová sonda (HIV) <220>
<221> Modifikovaná báza <222> (1) <223> Ruthenium3+-(tris-bipyridyl)- derivatizácia <400>9 atcaatgagg aagctgcaga 20 <210> 10 <211> 21 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetická olinukleotidová sonda (HCV) <220>
<221> Modifikovaná báza <222>(1) <223> Ruthenium3+-(tris-bipyridyl)- derivatizácia <400> 10 gtcgtgcagc ctccaggacc c 21 <210> 11 <211> 18 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetická olinukleotidová sonda (HCV) <220>
<221 > Modifikovaná báza <222> (1) <223> Ruthenium3+-(tris-bipyridyl)- derivatizácia <400> 11 agaccaccaa atgcccct 18 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický olinukleotidový primér (HIV) <220 Modifikovaná báza <221>
<222> (29) <223> derivatizácia p-(t-butyl)benzyl- zvyškom <400> 12 agtgggggga catcaagcag ccatgcaaa 29 <210 13 <211> 29 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: syntetický olinukleotidový primér (HIV) <220 <221> Modifikovaná báza <222> (29) <223> derivatizácia p-(t-butyi)benzyl- zvyškom <400 13 agtgggggga caccaggcag caatgcaaa 29 <210> 14 <211> 30 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický olinukleotidový primér (HIV spätný) <220>
<221> Modifikovaná báza <222> (30) <223>' derivatizácia p-(t-butyl)benzyl- zvyškom <400> 14 ggtactagta gttcctgcta tgtcacttcc 30 <210> 15 <211> 26 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: syntetický olinukleotidový primér (HCV vopredný) <220>
<221> Modifikovaná báza <222> (26) <223> derivatizácia p-(t-butyl)benzyl- zvyškom <400> 15 gcagaaagcg tctagccatg gcgtta 26 <210> 16 <211> 28 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický olinukleotidový primér (HCV vopredný) <220>
<221> Modifikovaná báza <222> (28) <223> derivatizácia p-(t-butyl)benzyl- zvyškom <400> 16 gcaagcaccc tatcaggcag taccacaa 28 <210> 17 <211> 28 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický olinukleotidový primér (HBV vopredný) <220>
<221> Modifikovaná báza <222> (20) <223> i <220>
<221> Modifikovaná báza <222> (28) <223> derivatizácia p-(t-butyl)benzyl- zvyškom <400> 17 agaagtcaga aggcaaaaaa gagagtaa 28 <210> 18 <211> 27 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický olinukleotidový primér (HBV vopredný) <220>
<221> Modifikovaná báza <222> (27) <223> derivatizácia p-(t-butyl)benzyl- zvyškom <400> 18 cacctctgcc taatcatctc ttgttca 27 <210> 19 <211>32 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetická olinukleotidová sonda (HIV) <220>
<221> Modifikovaná báza <222> (1) <223> Derivatizácia Pentamethine-di-indocarbocyanine via a alkylphosphatidyl- spojovníkom (Pharmacia Biotech CyS-N-ethyl-phosphoramidite) <220>
<221> rôzne vlastnosti <222> (10) <223> N predstavuje 2-(amino-cyclohexyl-)propane-l,3-diol-spojovník derivatizovaný 6-carboxy-fluoresceinem (Hiogenex CX-FAM-phosphoramidite) <220>
<221> Modifikovaná báza <222> (31) <223> derivatizácia 3’-koncovou fosfátovou skupinou <400> 19 tctgcagctn tcctcattga tggtatcttt ta 32 <210> 20 <211> 32 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetická olinukleotidová sonda (HCV) <220>
<221> Modifikovaná báza <222> (1) <223> derivatizácia Pentamethine-cli-inclocarbocyanine cez a alkylphosphatidyl-spojovník (Pharmacia Biotech CyS-N-ethyl-phosphoramidite) <220>
<221> rôzne vlastnosti <222> (15) <223> N predstavuje; 2-(amino-cyclohexyl-)propane-l,3-diol-spojovník derivatizovaný 6-carboxy-fluoresceinem (Biogenex CX-FAM-phosphoramidite) <220>
<221> Modifikovaná báza <222> (31) <223> derivatizácia 3'-koncovou fosfátovou skupinou <400> 20 cggtgtactc accgnttccg cagaccacta tg 32 <210> 21 <211> 33 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <220>
<221> Modifikovaná báza <222> (1) <223> derivatizácia Pentamethine-di-indocarbocyanine via a alkylphosphatidyl- spojovníkom (Pharmacia Biotech CyS-N-ethyl-phosphoramidite) <220>
<221> rôzne vlastnosti <222> (17) <223> N predstavuje 2-(amino-cyclohexyl-)propane-l,3-diol-spojovnik derivatizovaný 6-carboxy-fluoresceinem (Biogenex CX-FAM-phosphoramidite) <220>
<221> Modifikovaná báza <222> (32) <223> derivatizácia 3'-terminal fosfátovou skupinou <400> 21 ccaagctgtg ccttggntgg ctttggggca tgg 33 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1) <223> derivatizácia
Pentamethine-di-indocarbocyanine cez alkylphosphatidyl-spojovník (Pharmacia Biotech CyS-N-ethyl-phosphoramidite) <220>
<221> rôzne vlastnosti <222> (14) <223> N predstavuje 2-(amino-cyclohexyl-)propane-l,3-diol-spojovník derivatizovaný hexachloro-6-carboxy-fluoresceinem (Hiogenex CX-HEX-phosphoramidite) <220>
<221> Modifikovaná báza <222> (30) <223> derivatizácia 3'-koncovou fosfátovou skupinou <400> 22 tggactcagt cctntggtca tctcaccttc t 31 <210> 23 <211> 46 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: syntetický oligonukleotid (Aptamér) <220>
<221> Modifikovaná báza <222> (46) <223> derivatizácia 3’-koncovou fosfátovou skupinou <400> 23 cgatcatctc agaacattct tagcgttttg ttcttgtgta tgatcg 46

Claims (54)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Spôsob výroby zmesi magnetických sklenených častíc, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje stupne:
    a) suspendovanie magnetických objektov s priemerom medzi 5 a 500 nm v sóle,
    b) sušenie suspenzie rozprašovaním v dvoj dýzovej rozprašovacej sušiarni a
    c) slinovanie rozprašovaním vysušeného prášku.
  2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že vstupná teplota dvojdýzovej rozprašovacej sušiarni leží medzi 120 °C a 500 °C, výstupná teplota je zvolená podľa teploty varu sóla a rozprašovací tlak je aspoň rovnajúci sa 0,3 MPa.
  3. 3. Spôsob podľa niektorého z nárokov laž 2, vyznačujúci sa tým, že vstupná teplota dvojdýzovej rozprašovacej sušiarni leží medzi 170 °C a 230 °C, výhodne medzi 190 °C a 210 °C.
  4. 4. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že rozprašovací tlak leží medzi 0,4 a 0,6 MPa.
  5. 5. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že sol ako rozpúšťadlo obsahuje etanol.
  6. 6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že výstupná teplota leží medzi 50 °C a 300 °C.
  7. 7. Spôsob podľa niektorého z nárokov 5 až 6, vyznačujúci sa tým, že výstupná teplota leží medzi 90 °C a 100 °C.
  8. 8. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že slinovacia teplota leží medzi 400 °C a 1200° c, výhodne medzi 720 °C a 770 °C.
  9. 9. Magnetické sklenené častice získateľné spôsobom nárokovanom v niektorom z nárokov 1 až 8.
  10. 10. Zmes magnetických sklenených častíc získateľná spôsobom nárokovaným v niektorom z nárokov 1 až 8, ktorá obsahuje aspoň jeden magnetický objekt so stredným priemerom medzi 5 a 500 nm, vyznačujúca sa tým, že polčas sedimentácie suspenzie zmesi v izopropanole s obsahom 3 mg/ml (hmotnosť/objem) je dlhší než 3 minúty.
  11. 11. Zmes podľa nároku 10, vyznačujúca sa tým, že magnetický objekt má stredný priemer medzi 10 a 200 nm, výhodne medzi 15 a 50 nm.
  12. 12. Zmes podľa niektorého z nárokov lOažll, vyznačujúca sa tým, že polčas sedimentácie je dlhší než 6 minút.
  13. 13. Zmes podľa niektorého z nárokov 10 až 12, vyznačujúca sa tým, že magnetický objekt má stredný priemer 23 nm.
  14. 14. Zmes podľa nároku 10 alebo 13, vyznačujúca sa tým, že pomer priemeru magnetického telieska k priemeru skleneného plášťa je menší než 1:10.
  15. 15. Zmes podľa niektorého z nárokov 10 až 15, vyznačujúca sa tým, že magnetické sklenené častice majú stredný priemer medzi 0,5 pm a 5 pm.
  16. 16. Zmes podľa niektorého z nárokov 10 až 15, vyznačujúca sa tým, že magnetické sklenené častice sú mikroporézne.
  17. 17. Zmes podľa niektorého z nárokov 10 až 16, vyznačujúca sa tým, že porézny povrch magnetických sklenených častíc tvorí menej než 10 % celkového povrchu.
  18. 18. Zmes podľa niektorého z nárokov lOaž 17, vyznačujúca sa tým jekt je supermagnetický.
  19. 19. Zmes podľa niektorého z nárokov 10 až 16, vyznačujúca sa tým jekt je ferimagnetický alebo feromagnetický.
  20. 20. Zmes podľa niektorého z nárokov 10 až 19, vyznačujúca sa tým, že magnetických objekt obsahuje železo alebo oxid železa.
  21. 21. Zmes podľa nároku 20, v y z n a č u j ú c a sa tým, že oxidom železa je Fe3O4 alebo yFe2O3.
  22. 22. Zmes podľa niektorého z nárokov 10 až 21, vyznačujúca sa tým, že magnetické sklenené častice majú povrchovú plochu väčšiu než 4 m2/g.
  23. 23. Zmes podľa nároku 22, vyznačujúca sa tým, že magnetické sklenené častice majú povrchovú plochu medzi 5 a 100 m2/g, najvýhodnejšie v rozmedzí 15 až 30 tn/g.
  24. 24. Zmes podľa niektorého z nárokov 10 až 23, vyznačujúca sa tým, že magnetické sklenené častice sú v podstate sférické.
  25. 25. Suspenzia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje zmes magnetických častíc v kvapaline podľa niektorého z nárokov 10 až 24.
  26. 26. Suspenzia podľa nároku 25, vyznačujúca sa tým, že kvapalina obsahuje alkohol.
  27. 27. Suspenzia podľa nároku 26, vyznačujúca sa tým, že alkoholom je izopropanol alebo etanol.
    že magnetický obže magnetický ob53 vyznačujúca sa tým, že kvapalinou je pufrovaný vodný vyznačujúca sa tým, že suspenzia dodatočne obsahuje vyznačujúca sa tým, že suspenzia že chaotropné činidlo je prítomné v sa tým, že suspenzia tým tým, tým, tým, stkové tým tým tým
  28. 28. Suspenzia podľa nároku 25, roztok.
  29. 29. Suspenzia podľa nároku 28,
    DNA alebo RNA.
  30. 30. Suspenzia podľa niektorého z nárokov 25 až 29 dodatočne obsahuje chaotropné činidlo.
  31. 31. Suspenzia podľa nároku 30, vyznačujúca sa koncentrácii medzi 2 a 8 mol/1, výhodne medzi 4 a 6 mol/1.
  32. 32. Suspenzia podľa niektorého z nárokov 25až31, vyznačujúca obsahuje 5 až 60 mg/ml kompozície podľa niektorého z nárokov 10 až 24.
  33. 33. Skúmavka obsahujúca kompozíciu podľa niektorého z nárokov 10 až 24 alebo suspenziu podľa niektorého z nárokov 25 až 32.
  34. 34. Viaczložková súprava, vyznačujúca sa tým, že obsahuje skúmavku podľa nároku 33.
  35. 35. Viaczložková súprava podľa nároku 34, vyznačujúca sa tým, že ďalej obsahuje premývací roztok alebo eluent.
  36. 36. Viaczložková súprava podľa niektorého z nárokov 34 až 35, vyznačujúca sa tým, že obsahuje činidlá vhodné na čistenie nukleovej kyseliny.
  37. 37. Použitie zmesi podľa niektorého z nárokov 25 až 32 na prípravu suspenzie.
  38. 38. Použitie suspenzie podľa niektorého z nárokov 25 až 32 na čistenie nukleových kyselín.
  39. 39. Použitie viaczložkovej súpravy podľa niektorého z nárokov 34 až 35 na čistenie nukleových kyselín.
  40. 40. Spôsob izolácie biologického materiálu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje:
    a) privedenie vzorky, ktorá obsahuje biologický materiál v kvapaline, do styku zo zmesi podľa niektorého z nárokov 10 až 24, magnetickými sklenenými časticami podľa nároku 9 alebo suspenzií podľa niektorého z nárokov 25 až 32 za podmienok, pri ktorých sa biologický materiál viaže priamo na sklenený povrch, a
    b) oddelenie biologického materiálu od kvapaliny.
  41. 41. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že biologickým materiálom je nukleová kyselina.
  42. 42. Spôsob podľa niektorého z nárokov 40 až 41, vyznačujúci sa tým, že sa oddelenie uskutoční pomocou magnetu.
  43. 43. Spôsob podľa niektorého z nárokov 40 a 42, vyznačujúci sa tým, že magnetické častice nie sú predmagnetizované, keď sú privedené do styku so vzorkou.
  44. 44. Spôsob podľa niektorého z nárokov 40 až 43, vyznačujúci sa matizovaný.
  45. 45. Spôsob podľa niektorého z nárokov 40 až 44, vyznačujúci vádzkovaný vo formáte vysokého nastojenia.
  46. 46. Spôsob podľa niektorého z nárokov 40 až 45, vyznačujúci berie zo zásobnej nádoby suspenzia podľa niektorého z nárokov 25 až 26 a čiastkové objemy suspenzie sa pridajú do rôznych reakčných nádob.
  47. 47. Spôsob podľa niektorého z nárokov 40 až 46, vyznačujúci selina po čistení deteguje.
  48. 48. Spôsob podľa niektorého z nárokov 40 až 47, vyznačujúci sa selina deteguje po amplifikačnom stupni.
  49. 49. Spôsob podľa niektorého z nárokov 40 až 48, vyznačujúci sa selina deteguje spôsobom zahrnujúcim:
    a) uvedenie do styku vzorky s oligonukleotidom obsahujúcim sekvenciu komplementárnej k oblasti cieľovej nukleotidovej kyseliny a s označeným oligonukleotidom obsahujúcim sekvenciu komplementárnej k druhej oblasti toho istého vlákna sekvencie cieľovej nukleovej kyseliny, ale nezahrnujúcim sekvenciu nukleovej kyseliny definovanou prvým oligonukleotidom, na vytvorenie za hybridizačných podmienok zmesi duplexov, pričom tieto duplexy obsahujú cieľovú nukleovú kyselinu spojenú s prvým oligonukleotidom a s označeným oligonukleotidom tak, že 3'-koniec prvého oligonukleotidu je priľahlý k 5'-koncu označeného oligonukleotidu;
    b) udržanie zmesi zo stupňa a) s templat-dependentnou polymerázou nukleových kyselín majúci 5'- a 3'-nukleázovú aktivitu za podmienok dostatočných na umožnenie 5'- a 3'-nukleázovej aktivite rozštiepiť pripojený označený oligonukleotid a uvoľniť značené fragmenty; a
    c) detekciu a/alebo meranie signálu generovaného hydrolýzou označeného oligonukleotidu.
  50. 50. Spôsob podľa niektorého z nárokov 48 až 49, vyznačujúci sa tým, že detekcia sa uskutočňuje v prítomnosti blokujúceho oligonukleotidu.
  51. 51. Spôsob podľa nároku 50, vyznačujúci sa tamér.
    že spôsob je autože spôsob je preže sa pri ňom odoyemy suspenzie sa že sa nukleová kyže sa nukleová kyže sa nukleová kys a tým, tým, že blokujúcim oligonukleotidom je ap54
  52. 52. Spôsob podľa nároku 51, vyznačujúci sa tým, že aptamér má sekvenciu SEQ ID NO:23.
  53. 53. Spôsob podľa niektorého z nárokov 50 až 52, vyznačujúci sa tým, že amplifikačná a detekčná reakcia sa uskutočňuje vo formáte homogénneho multiplexového stanovenia v roztoku na účely sú5 časnej detekcie viacpočetných cieľov.
  54. 54. Spôsob podľa niektorého z nárokov 51až 53, vyznačujúci sa tým, že v priebehu aspoň 5 cyklov polymerázovej reťazovej reakcie je teplota nasadenia primérov menej než 8 °C, výhodne menej než 3 °C, nad disociačnou teplotou polymerázo-aptamérového komplexu.
SK664-2002A 1999-11-17 2000-11-17 Magnetic glass particles, method for their preparation and uses thereof SK287932B6 (sk)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99122853 1999-11-17
EP00110165A EP1154443A1 (en) 2000-05-12 2000-05-12 Magnetic glass particles, method for their preparation and uses thereof
PCT/EP2000/011459 WO2001037291A1 (en) 1999-11-17 2000-11-17 Magnetic glass particles, method for their preparation and uses thereof
US10/147,679 US20030224366A1 (en) 1999-11-17 2002-05-16 Magnetic glass particles, method for their preparation and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK6642002A3 SK6642002A3 (en) 2003-08-05
SK287932B6 true SK287932B6 (sk) 2012-05-03

Family

ID=32096539

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK664-2002A SK287932B6 (sk) 1999-11-17 2000-11-17 Magnetic glass particles, method for their preparation and uses thereof

Country Status (15)

Country Link
US (3) US20030224366A1 (sk)
EP (1) EP1232502B1 (sk)
JP (2) JP2003514383A (sk)
AT (1) ATE315826T1 (sk)
CA (1) CA2392009C (sk)
CY (1) CY1105229T1 (sk)
CZ (1) CZ20021608A3 (sk)
DE (1) DE60025529T2 (sk)
DK (1) DK1232502T3 (sk)
ES (1) ES2256068T3 (sk)
HU (1) HUP0203386A3 (sk)
PL (1) PL202358B1 (sk)
PT (1) PT1232502E (sk)
SK (1) SK287932B6 (sk)
WO (1) WO2001037291A1 (sk)

Families Citing this family (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19520398B4 (de) 1995-06-08 2009-04-16 Roche Diagnostics Gmbh Magnetisches Pigment
ES2256068T3 (es) 1999-11-17 2006-07-16 Roche Diagnostics Gmbh Particulas de cristal magneticas, metodo para su preparacion y usos de las mismas.
DE10140089A1 (de) * 2001-08-16 2003-02-27 Degussa Superparamagnetische oxidische Partikel, Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung
DE10153547A1 (de) * 2001-10-30 2003-05-22 Degussa Dispersion, enthaltend pyrogen hergestellte Abrasivpartikel mit superparamagnetischen Domänen
ES2294287T5 (es) 2002-01-08 2015-10-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Empleo de un material de sílice en una reacción de amplificación
DE10201084A1 (de) * 2002-01-14 2003-07-24 Bayer Ag Siliziumhaltige Magnetpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung der Partikel
ATE375512T1 (de) * 2002-06-27 2007-10-15 Toyo Boseki Magnetischer träger für biologische substanzen, verfahren zur seiner produktion und seiner verwendung zur isolierung dieser biologischen substanzen
GB0215185D0 (en) 2002-07-01 2002-08-07 Genovision As Binding a target substance
EP1394172A1 (en) * 2002-08-29 2004-03-03 Boehringer Mannheim Gmbh Improved method for bisulfite treatment
US9394332B2 (en) * 2002-08-29 2016-07-19 Epigenomics Ag Method for bisulfite treatment
EP1576351A4 (en) * 2002-11-26 2010-06-23 Univ Utah Res Found MICROPOROUS MATERIALS; METHODS AND ARTICLES FOR LOCALIZING AND QUANTIFYING ANALYTES
US7597936B2 (en) 2002-11-26 2009-10-06 University Of Utah Research Foundation Method of producing a pigmented composite microporous material
US7560231B2 (en) 2002-12-20 2009-07-14 Roche Molecular Systems, Inc. Mannitol and glucitol derivatives
EP1590362B8 (en) 2003-01-29 2015-06-03 Epigenomics AG Improved method for bisulfite treatment
JP3644641B2 (ja) * 2003-03-07 2005-05-11 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸回収方法
CA2463719A1 (en) 2003-04-05 2004-10-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Nucleotide analogs with six membered rings
CA2482097C (en) 2003-10-13 2012-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods for isolating nucleic acids
EP1524317B1 (en) * 2003-10-13 2015-03-04 Roche Diagnostics GmbH Methods for isolating nucleic acids
JP4435174B2 (ja) 2003-12-02 2010-03-17 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 重亜硫酸塩処理の改良された方法
US7939249B2 (en) 2003-12-24 2011-05-10 3M Innovative Properties Company Methods for nucleic acid isolation and kits using a microfluidic device and concentration step
US7727710B2 (en) 2003-12-24 2010-06-01 3M Innovative Properties Company Materials, methods, and kits for reducing nonspecific binding of molecules to a surface
DE602005024234D1 (de) 2004-02-10 2010-12-02 Roche Diagnostics Gmbh Neue primer und sonden zum nachweis von parvovirus b19
US7939251B2 (en) 2004-05-06 2011-05-10 Roche Molecular Systems, Inc. SENP1 as a marker for cancer
EP1632578A1 (en) 2004-09-03 2006-03-08 Roche Diagnostics GmbH DNA decontamination method
EP1642648A1 (de) 2004-09-30 2006-04-05 Roche Diagnostics GmbH Vorrichtung und Verfahren zum Einstellen einer Temperatur einer Flüssigkeit
US7842794B2 (en) 2004-12-17 2010-11-30 Roche Molecular Systems, Inc. Reagents and methods for detecting Neisseria gonorrhoeae
EP1749892B1 (en) 2005-08-02 2008-03-19 Roche Diagnostics GmbH Nucleotide sequence for assessing TSE
US7249521B1 (en) 2005-08-24 2007-07-31 Peter Frasca Method for determining the presence of a magnetically susceptible or magnetic material in a sample
US7569367B2 (en) 2005-09-07 2009-08-04 Roche Diagnostics Operations, Inc. Nucleic acid preparation from whole blood for use in diagnosis of transmissible spongiform encephalopathy
US7981606B2 (en) 2005-12-21 2011-07-19 Roche Molecular Systems, Inc. Control for nucleic acid testing
EP1932913B1 (en) 2006-12-11 2013-01-16 Roche Diagnostics GmbH Nucleic acid isolation using polidocanol and derivatives
CN102776173B (zh) 2006-12-11 2014-10-29 霍夫曼-拉罗奇有限公司 使用聚多卡醇和衍生物的核酸分离
ATE490320T1 (de) 2006-12-13 2010-12-15 Hoffmann La Roche Verwendung von acetalen zur isolation von nukleinsäuren
WO2008071384A1 (en) 2006-12-13 2008-06-19 Roche Diagnostics Gmbh Use of tde for the isolation of nucleic acids
US8535888B2 (en) 2006-12-29 2013-09-17 Mayo Foundation For Medical Education And Research Compositions and methods for detecting methicillin-resistant S. aureus
US20100062421A1 (en) * 2007-04-25 2010-03-11 Wensheng Xia Compositions, methods, and devices for isolating biological materials
EP2140001A2 (en) * 2007-04-25 2010-01-06 3M Innovative Properties Company Methods for nucleic acid amplification
DE102007063102B4 (de) 2007-12-28 2022-02-10 Robert Bosch Gmbh Verfahren zur Erfassung eines periodisch pulsierenden Betriebsparameters
WO2009129236A2 (en) * 2008-04-14 2009-10-22 Integrated Nano-Technologies Llc Method for manipulating samples with magnetic nucleation nanoparticles
WO2009154852A2 (en) * 2008-04-14 2009-12-23 Integrated Nano-Technologies Llc Paramagnetic nucleation nanoparticles
EP2402462A1 (en) 2008-06-06 2012-01-04 F. Hoffmann-La Roche AG Internally controlled multiplex detection and quantification of microbial nucleic acids
EP2177271B8 (en) 2008-10-15 2019-12-18 F. Hoffmann-La Roche AG Magnetic separation system comprising flexible magnetic pins and corresponding method
CA2688174C (en) 2008-12-19 2018-08-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Dry composition of reaction compounds with stabilized polymerase
US20110028703A1 (en) * 2009-03-06 2011-02-03 Nanosphere, Inc. Method and apparatus for suspending magnetic microparticles
DE102009058650A1 (de) 2009-12-16 2011-06-22 Leibniz-Institut für Neue Materialien gemeinnützige GmbH, 66123 Magnetische Kompositpartikel
WO2011077333A1 (en) * 2009-12-23 2011-06-30 Koninklijke Philips Electronics N.V. Analyte measurement apparatus and method
PL2579987T3 (pl) * 2010-06-11 2020-08-24 Basf Se Zastosowanie naturalnie występujących składników magnetycznych z rud
US8865000B2 (en) 2010-06-11 2014-10-21 Basf Se Utilization of the naturally occurring magnetic constituents of ores
ES2569220T3 (es) 2010-06-22 2016-05-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Envase de suspensión para partículas de unión para el aislamiento de material biológico
US9175332B2 (en) 2010-07-29 2015-11-03 Roche Molecular Systems, Inc. Generic PCR
CN107190056A (zh) 2010-07-29 2017-09-22 霍夫曼-拉罗奇有限公司 微生物核酸的定性和定量检测
US9725754B2 (en) 2010-07-29 2017-08-08 Sean F. Boyle Generic sample preparation
CN107604097A (zh) 2010-07-29 2018-01-19 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于多种参数的对照核酸
JP6169489B2 (ja) * 2010-07-29 2017-07-26 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 一般的な試料調製
CN103270171B (zh) 2010-07-29 2014-09-17 霍夫曼-拉罗奇有限公司 通用pcr
US8609340B2 (en) 2010-07-29 2013-12-17 Roche Molecular Systems, Inc. Control nucleic acids for multiple parameters
EP2426222A1 (en) 2010-09-07 2012-03-07 F. Hoffmann-La Roche AG Generic buffer for amplification
CN103328981B (zh) 2010-10-04 2017-04-12 吉纳普赛斯股份有限公司 用于自动化可重复使用的平行生物反应的系统和方法
US9184099B2 (en) 2010-10-04 2015-11-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biosensor devices, systems and methods therefor
US9399217B2 (en) 2010-10-04 2016-07-26 Genapsys, Inc. Chamber free nanoreactor system
EP2465945A1 (en) 2010-12-17 2012-06-20 F. Hoffmann-La Roche AG Generic matrix for control nucleic acids
US9926596B2 (en) 2011-05-27 2018-03-27 Genapsys, Inc. Systems and methods for genetic and biological analysis
US8585973B2 (en) 2011-05-27 2013-11-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Nano-sensor array
EP2535712A1 (en) 2011-06-15 2012-12-19 F. Hoffmann-La Roche AG Analytical system for the preparation of biological material
GB201113698D0 (en) * 2011-08-09 2011-09-21 Wirtz Ralf M Matrix and method for purifying and/or isolating nucleic acids
US20130071946A1 (en) 2011-09-21 2013-03-21 Roche Molecular Systems, Inc. Suspension Container For Binding Particles For The Isolation Of Biological Material
CN104105797B (zh) 2011-12-01 2016-08-31 吉纳普赛斯股份有限公司 用于高效电子测序与检测的系统和方法
RU2666989C2 (ru) * 2012-06-07 2018-09-13 Сомалоджик, Инк. Мультиплексные анализы на основе аптамеров
US9399986B2 (en) 2012-07-31 2016-07-26 General Electric Company Devices and systems for isolating biomolecules and associated methods thereof
CA2889415C (en) 2012-10-24 2020-06-02 Genmark Diagnostics, Inc. Integrated multiplex target analysis
US20140322706A1 (en) 2012-10-24 2014-10-30 Jon Faiz Kayyem Integrated multipelx target analysis
RU2527427C1 (ru) * 2013-02-14 2014-08-27 Виталий Богданович Черногиль Способ производства микрошариков и микросфер
RU2527047C1 (ru) * 2013-02-14 2014-08-27 Виталий Богданович Черногиль Способ изготовления микрошариков и микросфер
US20140272971A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 Health Diagnostic Laboratory, Inc. Unheated extraction of genomic dna in an automated laboratory system
CN105051214B (zh) 2013-03-15 2018-12-28 吉纳普赛斯股份有限公司 用于生物分析的系统和方法
EP3034171B1 (en) 2013-03-15 2019-04-24 Genmark Diagnostics Inc. Systems, methods and apparatus for manipulating deformable fluid vessels
US9409148B2 (en) 2013-08-08 2016-08-09 Uchicago Argonne, Llc Compositions and methods for direct capture of organic materials from process streams
RU2540312C1 (ru) * 2013-10-22 2015-02-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химии и химической технологии Сибирского отделения Российской академии наук Способ получения магнитного аффинного сорбента для выделения рекомбинантных белков
US9498778B2 (en) 2014-11-11 2016-11-22 Genmark Diagnostics, Inc. Instrument for processing cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system
USD881409S1 (en) 2013-10-24 2020-04-14 Genmark Diagnostics, Inc. Biochip cartridge
CN105916962B (zh) 2013-11-19 2019-02-05 三星电子株式会社 发光颗粒、包含其的材料和产品、以及方法
EP3080300B1 (en) 2013-12-11 2020-09-02 Genapsys Inc. Systems and methods for biological analysis and computation
US9822401B2 (en) 2014-04-18 2017-11-21 Genapsys, Inc. Methods and systems for nucleic acid amplification
JP2017539080A (ja) 2014-10-23 2017-12-28 コーニング インコーポレイテッド 高分子被包磁性ナノ粒子
US9598722B2 (en) 2014-11-11 2017-03-21 Genmark Diagnostics, Inc. Cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system
US10005080B2 (en) 2014-11-11 2018-06-26 Genmark Diagnostics, Inc. Instrument and cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system employing electrowetting fluid manipulation
CN109790575A (zh) 2016-07-20 2019-05-21 吉纳普赛斯股份有限公司 用于核酸测序的系统和方法
EP3299471B1 (en) 2016-09-23 2019-10-23 Roche Diagniostics GmbH Methods for determining the amount of a nucleic acid of interest in an unprocessed sample
MX2020003113A (es) 2017-09-21 2020-09-07 Genapsys Inc Sistemas y metodos para secuenciar acido nucleico.
CN118852319A (zh) 2019-03-19 2024-10-29 安进公司 用于病毒灭活的替代性洗涤剂
US20220259584A1 (en) * 2019-09-19 2022-08-18 Sanyo Chemical Industries, Ltd. Magnetic particle composition, use of magnetic particle composition for nucleic acid separation, kit for obtaining magnetic particle composition, magnetic particles, chaotropic salt, and separation and purification method
EP4015074A1 (en) 2020-12-17 2022-06-22 Université de Liège Preparation of magnetic core-shell particles
US20230127156A1 (en) 2020-03-30 2023-04-27 Université de Liège Preparation of Magnetic Core-Shell Particles
WO2022060732A1 (en) 2020-09-17 2022-03-24 Nanophase Technologies Corporation Magnetic beads, method of making and method of use thereof

Family Cites Families (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2913419A (en) * 1956-04-18 1959-11-17 Du Pont Chemical process and composition
US2885366A (en) * 1956-06-28 1959-05-05 Du Pont Product comprising a skin of dense, hydrated amorphous silica bound upon a core of another solid material and process of making same
US3290122A (en) * 1964-07-28 1966-12-06 Sam D Clinton Process for preparing oxide gel microspheres from sols
DE2313331C2 (de) * 1973-03-17 1986-11-13 Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt Eisenoxidhaltige Glimmerschuppenpigmente
US3945862A (en) * 1973-06-26 1976-03-23 Merck & Co., Inc. Coated ferrous substrates comprising an amorphous magnesia-silica complex
DE2625106C2 (de) * 1976-06-04 1982-03-11 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Eisenoxidschwarz-Pigmente mit verbesserter Oxidationsbeständigkeit und Verfahren zu ihrer Herstellung
US4124735A (en) * 1976-12-02 1978-11-07 Xerox Corporation Magnetic glass carrier materials
US4126437A (en) * 1976-12-02 1978-11-21 Xerox Corporation Magnetic glass carrier materials
US4124385A (en) * 1976-12-02 1978-11-07 Xerox Corporation Magnetic glass carrier materials
US4233169A (en) * 1979-04-13 1980-11-11 Corning Glass Works Porous magnetic glass structure
US4297337A (en) * 1979-04-13 1981-10-27 Corning Glass Works Solid-phase immunoassays using magnetic glass
US4395271A (en) * 1979-04-13 1983-07-26 Corning Glass Works Method for making porous magnetic glass and crystal-containing structures
JPS5676510A (en) * 1979-11-28 1981-06-24 Tdk Corp Manufacture of magnetic recording material
JPS56105337A (en) * 1980-01-28 1981-08-21 Tdk Corp Magnetic recording medium and its production
US4280918A (en) * 1980-03-10 1981-07-28 International Business Machines Corporation Magnetic particle dispersions
US4360441A (en) * 1981-06-25 1982-11-23 Corning Glass Works Glass-encapsulated magnetic materials and methods for making them
US4448884A (en) 1982-03-03 1984-05-15 Kms Fusion, Inc. Glass-surface microcarrier for growth of cell cultures
DE3211309A1 (de) * 1982-03-26 1983-09-29 Metin Dipl.-Ing. 6100 Darmstadt Colpan Chromatographisches verfahren zur isolierung von makromolekuelen
US4477492A (en) * 1983-04-22 1984-10-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for preparing superficially porous supports for chromatography and catalysts
US4695392A (en) * 1983-05-12 1987-09-22 Advanced Magnetics Inc. Magnetic particles for use in separations
US4698302A (en) * 1983-05-12 1987-10-06 Advanced Magnetics, Inc. Enzymatic reactions using magnetic particles
US4628037A (en) * 1983-05-12 1986-12-09 Advanced Magnetics, Inc. Binding assays employing magnetic particles
US4695393A (en) * 1983-05-12 1987-09-22 Advanced Magnetics Inc. Magnetic particles for use in separations
US4672040A (en) * 1983-05-12 1987-06-09 Advanced Magnetics, Inc. Magnetic particles for use in separations
US4554088A (en) * 1983-05-12 1985-11-19 Advanced Magnetics Inc. Magnetic particles for use in separations
GB8401636D0 (en) * 1984-01-21 1984-02-22 British Petroleum Co Plc Coating process
US5236623A (en) * 1984-07-11 1993-08-17 Rhone-Poulenc Chimie Process for the production of a silica colloid
US4824712A (en) * 1984-07-16 1989-04-25 Ppg Industries, Inc. Treatment of glass to reduce venting during thermal treatment and a glass article made thereby
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5597531A (en) * 1985-10-04 1997-01-28 Immunivest Corporation Resuspendable coated magnetic particles and stable magnetic particle suspensions
US5512332A (en) * 1985-10-04 1996-04-30 Immunivest Corporation Process of making resuspendable coated magnetic particles
US5076950A (en) * 1985-12-20 1991-12-31 Syntex (U.S.A.) Inc. Magnetic composition for particle separation
US5206568A (en) * 1986-03-26 1993-04-27 Beckman Instruments, Inc. Coordinated control of stepper motors
US4751211A (en) * 1986-08-07 1988-06-14 Aluminum Company Of America Composite adsorbent for removing acids from organophosphate functional fluids
JPS63109105A (ja) * 1986-10-25 1988-05-13 Chisso Corp 強磁性金属微粒子の製造方法
DE3639949A1 (de) * 1986-11-22 1988-06-09 Diagen Inst Molekularbio Verfahren zur trennung von langkettigen nukleinsaeuren
US4767670A (en) * 1987-01-21 1988-08-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Chromatographic supports for separation of oligonucleotides
NO162946C (no) * 1987-08-21 1990-03-14 Otto Soerensen Anordning for magnetisk separasjon av celler.
DE3724442A1 (de) 1987-07-23 1989-02-02 Europ Lab Molekularbiolog Verfahren und vorrichtung zur reinigung von m-13-phagen-dna
ES2066851T3 (es) * 1988-05-24 1995-03-16 Anagen Uk Ltd Particulas atraibles magneticamente y metodo de preparacion.
US5312485A (en) * 1988-08-05 1994-05-17 J. M. Huber Corporation Precipitated encapsulated paper pigments and methods
US5041390A (en) * 1988-08-11 1991-08-20 Skov Per S Method and means for allergy diagnosis
US5075430A (en) * 1988-12-12 1991-12-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Process for the purification of DNA on diatomaceous earth
US5234809A (en) * 1989-03-23 1993-08-10 Akzo N.V. Process for isolating nucleic acid
NL8900725A (nl) 1989-03-23 1990-10-16 Az Univ Amsterdam Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur.
US5352645A (en) * 1989-04-14 1994-10-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company Silica microspheres, method of improving attrition resistance and use
JP2545282B2 (ja) * 1989-04-17 1996-10-16 日東化学工業株式会社 球状シリカ粒子の製造方法
US5055194A (en) * 1989-07-28 1991-10-08 University Of Pennsylvania Support for high performance liquid chromatography in a magnetically stabilized fluidized bed
US5698271A (en) * 1989-08-22 1997-12-16 Immunivest Corporation Methods for the manufacture of magnetically responsive particles
US5279936A (en) * 1989-12-22 1994-01-18 Syntex (U.S.A.) Inc. Method of separation employing magnetic particles and second medium
US5523231A (en) * 1990-02-13 1996-06-04 Amersham International Plc Method to isolate macromolecules using magnetically attractable beads which do not specifically bind the macromolecules
US5236783A (en) * 1990-02-21 1993-08-17 Toda Kogyo Corp. Superparamagnetic fine particles of iron oxide and magnetic recording media containing said particles
US5316699A (en) * 1990-03-28 1994-05-31 The United States Of America As Repesented By The Secretary Of Commerce Process for the controlled preparation of a composite of ultrafine magnetic particles homogeneously dispersed in a dielectric matrix
ATE154981T1 (de) * 1990-04-06 1997-07-15 Perkin Elmer Corp Automatisiertes labor für molekularbiologie
US5693502A (en) * 1990-06-11 1997-12-02 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases
US5763173A (en) * 1990-06-11 1998-06-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases
US5210015A (en) * 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5217804A (en) * 1990-11-06 1993-06-08 Eastman Kodak Company Magnetic particles
US5155018A (en) * 1991-07-10 1992-10-13 Hahnemann University Process and kit for isolating and purifying RNA from biological sources
US5395498A (en) * 1991-11-06 1995-03-07 Gombinsky; Moshe Method for separating biological macromolecules and means therfor
US5734020A (en) * 1991-11-20 1998-03-31 Cpg, Inc. Production and use of magnetic porous inorganic materials
US5610274A (en) * 1991-11-20 1997-03-11 Cpg, Inc. Production and use of magnetic porous inorganic materials
US5346994A (en) * 1992-01-28 1994-09-13 Piotr Chomczynski Shelf-stable product and process for isolating RNA, DNA and proteins
DE69324716T2 (de) * 1992-02-13 1999-09-09 Becton Dickinson And Co. Celithydrat und Reinigung von DNS
US5389482A (en) * 1992-04-23 1995-02-14 Toda Kogyo Corp. Magnetic particle powder included in magnetic toners for magnetic image character recognition
TW221381B (sk) * 1992-04-28 1994-03-01 Du Pont
IT1256064B (it) * 1992-07-28 1995-11-27 Donegani Guido Ist Metodo per la preparazione di geli porosi contenenti boro
CA2107524C (en) * 1992-10-06 1999-01-19 Hiromitsu Misawa Iron oxide particles and process for producing the same
US5578238A (en) * 1992-10-30 1996-11-26 Lord Corporation Magnetorheological materials utilizing surface-modified particles
CA2102264C (en) * 1992-11-13 2000-08-01 Daniel Lee Woodard Boron silicates, aluminum silicates, phosphosilicates and purification of dna
DE4307262A1 (de) 1993-03-02 1994-09-08 Christian Bergemann Magnetisches polymeres Siliciumdioxid
US5648170A (en) * 1993-04-27 1997-07-15 Toda Kogyo Corporation Coated granular magnetite particles and process for producing the same
AU7375794A (en) 1993-07-28 1995-02-28 Akzo Nobel N.V. Process for isolating nucleic acid from gram positive microorganisms
CA2170604C (en) * 1993-08-30 2007-03-13 Vikas V. Padhye Nucleic acid purification compositions and methods
US5438127A (en) * 1993-09-27 1995-08-01 Becton Dickinson And Company DNA purification by solid phase extraction using a PCl3 modified glass fiber membrane
US5503816A (en) * 1993-09-27 1996-04-02 Becton Dickinson And Company Silicate compounds for DNA purification
US5468427A (en) * 1993-09-27 1995-11-21 Alfred University Process for making ultra-fine ceramic particles
US5523065A (en) * 1993-09-27 1996-06-04 Alfred University Process for making ultra-fine barium titanate particles
US5599627A (en) * 1993-10-08 1997-02-04 Toda Kogyo Corporation Magnetic particles comprising magnetite core and process for producing the same
US5538848A (en) * 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
DE59505786D1 (de) * 1994-02-07 1999-06-02 Qiagen Gmbh Verfahren zur abreicherung oder entfernung von endotoxinen
US5990301A (en) * 1994-02-07 1999-11-23 Qiagen Gmbh Process for the separation and purification of nucleic acids from biological sources
GB9411572D0 (en) * 1994-06-09 1994-08-03 Amersham Int Plc Magnetic bead precipitation method
EP0772776B1 (de) * 1994-07-27 2000-03-22 Herbert Dr. Pilgrimm Superparamagnetische teilchen, verfahren zur herstellung und deren verwendung
US5817327A (en) * 1994-07-27 1998-10-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Incorporation of biologically active molecules into bioactive glasses
US5582988A (en) * 1994-09-15 1996-12-10 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Methods for capture and selective release of nucleic acids using weakly basic polymer and amplification of same
US5705628A (en) * 1994-09-20 1998-01-06 Whitehead Institute For Biomedical Research DNA purification and isolation using magnetic particles
US5660984A (en) * 1994-12-09 1997-08-26 Davis; Thomas E. DNA isolating apparatus comprising a non-porous DNA binding, anion exchange resin and methods of use thereof
FR2732116B1 (fr) * 1995-03-21 1997-05-09 Bio Merieux Procede et dispositif pour la determination qualitative et/ou quantitative d'un analyte, notamment d'une bacterie, dans un echantillon, par voie magnetique
US5683875A (en) * 1995-05-04 1997-11-04 Hewlett-Packard Company Method for detecting a target nucleic acid analyte in a sample
IN188702B (sk) * 1995-06-01 2002-10-26 Degussa
DE19520964A1 (de) * 1995-06-08 1996-12-12 Inst Neue Mat Gemein Gmbh Beschichtete anorganische Pigmente, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
DE19854973B4 (de) * 1998-11-30 2010-02-04 Institut Für Neue Materialien Gem. Gmbh Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren
DE19520398B4 (de) * 1995-06-08 2009-04-16 Roche Diagnostics Gmbh Magnetisches Pigment
KR100463475B1 (ko) * 1995-06-08 2005-06-22 로셰 디아그노스틱스 게엠베하 자기성피그먼트
WO2000032762A1 (de) * 1998-11-30 2000-06-08 Roche Diagnostics Gmbh Magnetische partikel zur reinigung von nukleinsäuren
JP2965131B2 (ja) * 1995-07-07 1999-10-18 東洋紡績株式会社 核酸結合用磁性担体およびそれを用いる核酸単離方法
US5578179A (en) * 1995-07-12 1996-11-26 The Perkin-Elmer Corporation Method and silicate composition for conditioning silica surfaces
US5783686A (en) * 1995-09-15 1998-07-21 Beckman Instruments, Inc. Method for purifying nucleic acids from heterogenous mixtures
US5904848A (en) * 1996-02-21 1999-05-18 Cpg, Inc. Controlled pore glass-synthetic resin membrane
US5972721A (en) * 1996-03-14 1999-10-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force Immunomagnetic assay system for clinical diagnosis and other purposes
DE19622885A1 (de) 1996-06-07 1997-12-11 Boehringer Mannheim Gmbh Reagenzzubereitung enthaltend magnetische Partikel in Form einer Tablette
ES2187926T3 (es) * 1997-01-21 2003-06-16 Grace W R & Co Adsorbente de silice sobre un susbstrato magnetico.
US6027945A (en) * 1997-01-21 2000-02-22 Promega Corporation Methods of isolating biological target materials using silica magnetic particles
ATE280177T1 (de) 1997-03-20 2004-11-15 Hoffmann La Roche Modifizierte primer
DE19743518A1 (de) * 1997-10-01 1999-04-15 Roche Diagnostics Gmbh Automatisierbare universell anwendbare Probenvorbereitungsmethode
US5990479A (en) * 1997-11-25 1999-11-23 Regents Of The University Of California Organo Luminescent semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process for making and using such probes
DE69815282T2 (de) 1997-12-25 2004-05-06 Tosoh Corp., Shinnanyo Magnetischer Träger, seine Herstellung, und Verfahren zum Extrahieren von Nukleinsäuren
ES2256068T3 (es) 1999-11-17 2006-07-16 Roche Diagnostics Gmbh Particulas de cristal magneticas, metodo para su preparacion y usos de las mismas.
US7267964B2 (en) * 2000-03-31 2007-09-11 Merial Limited DNA molecules encoding ligand gated ion channels from Dermacentor variabilis
US20030032146A1 (en) 2001-07-10 2003-02-13 Dwulet Francis Edward Enzyme/tag binding and detection system

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0203386A3 (en) 2010-01-28
ATE315826T1 (de) 2006-02-15
CY1105229T1 (el) 2010-03-03
US20050266462A1 (en) 2005-12-01
EP1232502B1 (en) 2006-01-11
US20030224366A1 (en) 2003-12-04
PL202358B1 (pl) 2009-06-30
PL356771A1 (en) 2004-07-12
DK1232502T3 (da) 2006-05-22
PT1232502E (pt) 2006-05-31
WO2001037291A1 (en) 2001-05-25
EP1232502A1 (en) 2002-08-21
CZ20021608A3 (cs) 2003-06-18
JP2006193421A (ja) 2006-07-27
US8129118B2 (en) 2012-03-06
JP4361905B2 (ja) 2009-11-11
SK6642002A3 (en) 2003-08-05
DE60025529T2 (de) 2006-08-24
CA2392009A1 (en) 2001-05-25
US20120247150A1 (en) 2012-10-04
ES2256068T3 (es) 2006-07-16
CA2392009C (en) 2009-07-14
DE60025529D1 (de) 2006-04-06
JP2003514383A (ja) 2003-04-15
HUP0203386A1 (hu) 2002-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK287932B6 (sk) Magnetic glass particles, method for their preparation and uses thereof
JP4148900B2 (ja) 増幅反応におけるシリカ物質の使用
JP4048022B2 (ja) 自動化可能なユニバーサル試料調製方法
US9868756B2 (en) Method for bisulfite treatment
JP4456046B2 (ja) 磁性色素
CN101082062B (zh) 单个细胞的基因表达定量方法
JP5537894B2 (ja) 磁性色素
CA2614069A1 (en) Nucleic acid isolation using polidocanol and derivatives
KR20220059418A (ko) 다중 진단을 위한 핵산 분리 및 검출용 미세입자 프로브
EP1154443A1 (en) Magnetic glass particles, method for their preparation and uses thereof
KR102880002B1 (ko) 단일 염기 다형성 분석을 위한 미세입자 프로브
JP2001078761A (ja) 核酸結合性磁性シリカ粒子担体
EP4527943A1 (en) Diagnostic microparticle probe comprising magnetic particle and inactivated genetic scissors, and multi-diagnostic system and method involving probe

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20121117