SK279877B6 - Extrakt bakteriálnych makromolekúl, spôsob jeho pr - Google Patents
Extrakt bakteriálnych makromolekúl, spôsob jeho pr Download PDFInfo
- Publication number
- SK279877B6 SK279877B6 SK1111-93A SK111193A SK279877B6 SK 279877 B6 SK279877 B6 SK 279877B6 SK 111193 A SK111193 A SK 111193A SK 279877 B6 SK279877 B6 SK 279877B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- extract
- bacterial
- protein extract
- amino acids
- extraction
- Prior art date
Links
- 239000000284 extract Substances 0.000 title claims abstract description 63
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 7
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 title claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 19
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 13
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims abstract 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 41
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 22
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 16
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 8
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 8
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 7
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 4
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 claims 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 abstract 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 206010061269 Malignant peritoneal neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 4
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 201000002524 peritoneal carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 3
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 3
- 230000001031 immunopharmacological effect Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010059766 Haemorrhagic ascites Diseases 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DIIIISSCIXVANO-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dimethylhydrazine Chemical compound CNNC DIIIISSCIXVANO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 1
- IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=CC=C1OCCO IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 241000167610 Nodulus Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920004929 Triton X-114 Polymers 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004979 bone marrow derived macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 210000003191 femoral vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000000713 mesentery Anatomy 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 150000002829 nitrogen Chemical class 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004783 oxidative metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000001139 pH measurement Methods 0.000 description 1
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 1
- 230000004108 pentose phosphate pathway Effects 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 231100000161 signs of toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/848—Escherichia
- Y10S435/849—Escherichia coli
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/851—Haemophilus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/852—Klebsiella
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/871—Neisseria
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/885—Streptococcus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/886—Streptomyces
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Description
Oblasť techniky
Vynález sa týka extraktu bakteriálnych makromolekúl, hlavne extraktu na báze modifikovaných bakteriálnych makromolekúl, spôsobu jeho prípravy a farmaceutického prostriedku, obsahujúceho tento extrakt ako účinnú zložku.
Doterajší stav techniky
Sú známe bakteriálne produkty s terapeutickou účinnosťou, ktoré sa získavajú alkalickou hydrolýzou. Prihlasovateľov patent CH 633.188 opisuje napríklad koncentrát bakteriálnych lyzátov s antiinfekčnými vlastnosťami. Lyzáty každého bakteriálneho kmeňa sa získavajú progresívnou alkalickou hydrolýzou (pH 9-10), ktorá vedie k deštrukcii viditeľnej štruktúry baktérií.
Podstata vynálezu
Pôvodcovia tohto vynálezu však zistili, že je možné získavať bakteriálne extrakty s rôznymi imunofarmakologickými účinkami, napríklad s významným imunomodulačným účinkom, rôznym alkalickým spracovaním, ktoré umožňuje ponechať viditeľnú štruktúru spracovaných baktérií neporušenú. Toto spracovanie konkrétne spočíva v alkalickej extrakcii za podmienok vyššieho a hlavne stabilného pH.
Predmetom vynálezu je teda jednak extrakt na báze modifikovaných bakteriálnych makromolekúl a jednak spôsob prípravy tohto bielkovinového extraktu.
Predmetom vynálezu je ďalej farmaceutický prostriedok, obsahujúci ako účinnú zložku extrakt na báze modifikovaných bakteriálnych makromolekúl podľa vynálezu (ďalej označovaný ako bielkovinový extrakt).
Chemické spracovanie baktérií, napríklad zriedeným NaOH, spôsobuje hlboké modifikácie primárnych, sekundárnych a terciámych štruktúr bakteriálnych makromolekúl. Je možné tiež pozorovať čiastočnú deamidáciu asparagínu a glutamínu, ktorá vedie k vzniku kyseliny asparágovej, resp. kyseliny glutámovej. V priebehu tohto procesu tiež prebiehajú čiastočné racemizácie niekoľkých aminokyselín, hlavne kyseliny asparágovej, serínu a arginínu. V súhrne je dôsledkom týchto fyzikálno-chemických modifikácií štruktúry makromolekúl vznik polypeptidov, ktorých amfiónové vlastnosti sú kyslé. Všetky tieto polypeptidy majú izoelektrické body v rozmedzí medzi 2,5 a 5,5, s významnejšou koncentráciou okolo 4,5. Tieto štruktúrne zmeny tak produkujú bielkovinové extrakty, ktoré majú imunomodulačné vlastnosti in vitro i in vivo.
V bielkovinovom extrakte podľa vynálezu predstavuje súhrnná hmotnosť stavebných aminokyselín aspoň 50 % (% hmotnostné lyofilizátu), výhodne 55 až 85 % uvedeného bielkovinového extraktu a obsah lipopolysacharidov (LPS), je výhodne nižšia ako asi 2.10-3 %. Molekulová hmotnosť stavebných elementov bielkovinového extraktu podľa vynálezu je v rozmedzí medzi 10.000 a 1,000.000. Tento bielkovinový extrakt ďalej obsahuje medzi bielkovinovými aminokyselinami, niektorými s konfiguráciou D a L, prevažujúce množstvo kyslých zvyškov, ako je kyselina asparágová a kyselina glutámová. Hlavnými racemizovanými aminokyselinami sú serin s asi 25 až 45 % konfigurácie D, kyselina asparágová s asi 10 až 30 % a arginin s asi 3 až 20 %. Použitie termínu modifikované proteíny je okrem iného spojené s prítomnosťou aminokyselín v konfigurácii D v bielkovinovom extrakte, lebo konfigurácia L je prítomná v prírodných proteínoch.
Okrem toho môže bielkovinový extrakt podľa vynálezu obsahovať nanajvýš okolo 10’3 % lipopolysacharidov, nanajvýš asi 2 % voľných aminokyselín, nanajvýš asi 8 % glycidov, nanajvýš asi 4 % aminocukrov a nanajvýš asi 15 % dezoxyribonukleových kyselín.
Principiálne je možné ako východiskový produkt podľa vynálezu použiť akýkoľvek grampozitívny alebo gramnegatívny bakteriálny kmeň, ako sú Escherichia coli alebo jeden alebo niekoľko bakteriálnych kmeňov, opísaných v citovanom patente CH 633.188. Napríklad ďalej opísaný postup používa kmeň Escherichia coli, konkrétne kmeň 1-1147, uložený podľa budapeštianskej zmluvy 3.10.1991 v Národnej zbierke mikroorganizmov, Inštitút Pasteur, 25 rue du Dr. Roux, 75724 PARIS CEDEX 15 - FRANCE.
Príklady uskutočnenia vynálezu
A. Predbežné stupne
Primáme inokulum sa pripraví zo zmrazených baktérií, ktoré sa oživia striedavou kultiváciou v kvapalnom prostredí, napríklad Tryptic Soya Broth a na pevnej pôde. Objem kultúry inokula sa progresívne zvyšuje do 1 1 vo zvyčajnom kvapalnom kultivačnom prostredí a inkubuje sa za trepania pri 37 °C.
Takto pripravené sekundárne inokulum sa uvedie do fermentora s objemom 20 1, obsahujúceho 5 1 vhodného bežného živného média. Hodnota pH sa nastaví a udržiava na 7,0, napríklad 5 % amoniakom a teplota sa reguluje na 37 °C. Kultivácia baktérií sa vykonáva za prevzdušňovania (vzduch) a miešania, za kontrolovaných podmienok vedúcich k získaniu pC>2 vyššieho ako 90 % nasýtenia. Vykoná sa meranie optickej hustoty pri 700 nm. Na konci kultivácie sa baktérie inaktivujú teplom autoklávovaním (30 min. pri 120 °C) alebo okamihovou pasterizáciou (90 s pri 105 °C) a odoberie sa vzorka na overenie absencie životaschopných zárodkov.
Bakteriálna suspenzia sa zahustí a nespotrebované zvyšky kultivačného prostredia sa odstránia odstredením alebo výhodne tangenciálnou ultrafiltráciou, napríklad ultrafiltračným systémom FILTRON na polysulfónových patrónach. Táto ultrafiltrácia sa vykonáva v dvoch stupňoch: najprv sa vykoná 5 až 10-násobná koncentrácia (membrány 30 kD až 0,3 pm) a potom premývanie diafiltráciou fyziologickým roztokom (3 až 15 premývacích objemov).
Stanoví sa sušina bakteriálnej suspenzie, čo umožňuje adjustovať biomasu prípravku pred alkalickou extrakciou. Konečná suspenzia baktérií sa zriedi fyziologickým roztokom a konečná sušina baktérii sa upraví na 2 až 20 g/1.
B. Alkalická extrakcia
Na vlastnú alkalickú extrakciu sa koncentrácia NaOH v bakteriálnej suspenzii upraví na 0,01 až 1 %, tu na 0,1 %.
Extrakcia sa vykonáva za miešania medzí 30 a 45 °C, tu pri asi 37 °C. Priebežne sa odoberajú vzorky na analytické účely. Analýza zahrnuje meranie pH, stanovenie makromolekúl a lipopolysacharidov. Baktérie použité na získa nie lótov I a II, boli zahustené a premyté (stupeň A) na patróne 30 kD a v prípade lótu III na patróne 1000 kD. V týchto príkladoch bol čas trvania procesu alkalickej extrakcie mierne kratší ako dva dni. Výsledky vzťahujúce sa k trom lótom (I, II a III), získaným z uvedeného kmeňa Escherichia coli, sú zhrnuté v tabuľke 1.
Tabuľka 1 Monitorovanie alkalickej extrakcie
| ut | finálna (9/1) | Č | pH | Makronolekuly (ng/1) | LPS | |
| I | 7,4 | 0 | n in. | 7.0 | 220 | >100 |
| 5 | nin. | 12.3 | 910 | 100 | ||
| 22 | h | 12.3 | 1530 | e.o | ||
| 46 | h | 12.3 | 1850 | 1.0 | ||
| II | 7,4 | 0 | nin. | 7.0 | 250 | >100 |
| 5 | nln. | 12.4 | B7Q | 100 | ||
| 22 | h | 12.4 | 1580 | 10 | ||
| 46 | h | 12.3 | 1990 | 3.3 | ||
| III | 7.0 | 0 | nin. | 7.0 | 60 | >100 |
| 5 | nin. | 12.4 | 710 | 100 | ||
| 22 | h | 12.4 | 1260 | 10 | ||
| 46 | h | 12.4 | 1640 | 1.0 |
* stanovenie makromolekúl Brád lordovou metódou referencie: hovädzí sérovým albumín (BSA) ** stanovenie LPS metódou LAL referencie: LPS Escherichia coli 0111 :B4
Toto monitorovanie ďalej umožňuje odborníkovi stanoviť približný čas procesu alkalickej extrakcie v závislosti od zamýšľaného použitia vzhľadom na typ použitých baktérií a podmienky pH a teploty. Tento čas sa všeobecne pohybuje medzi niekoľkými hodinami a asi jedným týždňom.
Čo sa týka pH, je treba pripomenúť, že jedna z charakteristík vynálezu spočíva v stabilnom pH, ktoré sa udržiava medzi 11 a 13, napríklad medzi 12,0 a 12,5, s poklesom v priebehu extrakčného procesu nanajvýš 0,4. V tomto príklade bolo pH 12,3 až 12,4 s maximálnou výchylkou v priebehu extrakcie 0,1.
Ďalšia významná výhoda spôsobu podľa vynálezu je zrejmá z výsledkov, uvedených v tabuľke L Je možné konštatovať, že obsah lipopolysacharidov v získanom bielkovinovom extrakte je značne redukovaný.
Na konci extrakcie a pred čistením bielkovinového extraktu sa vykoná mikroskopická kontrola baktérií po sfarbení gram na overenie, že viditeľné štruktúry baktérií sú neporušené.
C. Čistenie bielkovinového extraktu
Bielkovinový extrakt, získaný postupom podľa stupňa B, sa frakcionuje ultrafiltráciou; konkrétne sa vykoná 5 až 10-násobná koncentrácia ultrafiltráciou (1000 kD) a účinná zložka sa extrahuje diafiltráciou, napríklad s vodou. Nakoniec sa bielkovinový extrakt zahustí ultrafiltráciou (10 kD).
Na účely eliminácie väčšej časti endotoxínov, konkrétne LPS, sa bielkovinový extrakt podrobí procesu fázového prenosu s neiónogénnym detergentom. Tento proces je možné napríklad vykonať v prítomnosti 7 % Tritonu X-114 zahrievaním za miešania počas asi 20 min. na asi 60 °C. Po oddelení fáz sa spodná fáza (Triton + LPS) odstráni. Homá vodná fáza, obsahujúca bielkovinový extrakt, sa zhromaždí a pH sa upraví na 7.
Táto vodná fáza sa podrobí iónovýmennej chromatografii kvôli ďalšiemu zníženiu obsahu LPS a odstráneniu neiónogénneho detergentu. Na túto chromatografiu je možné použiť napríklad gél DEAE-Sepharose. Konkrétne sa vodná fáza, obsahujúca bielkovinový extrakt, najprv adsorbuje na menič iónov, potom sa odstránia molekuly, ktoré neboli zachytené a premytím pri nízkom pH sa odstránia nečistoty. Po ekvilibrácii gélu pri neutrálnom pH sa bielkovinový extrakt eluuje zvyšovaním iónovej sily a potom sa eluát zahustí ultrafiltráciou a premyje diafiltráciou s vodou. Takto vyčistený bielkovinový extrakt sa sterilné prefiltruje a prípadne lyofilizuje zvyčajným známym spôsobom.
Lyofilizát bol podrobený biochemickým analýzam a imunofarmakologickým testom. Stanovenie aminokyselín, racemizovaných v priebehu alkalickej extrakcie, sa vykonalo podľa Nimuru N. a Kinoshitu T., J. Chromatography, 352, 169 - 177, 1986. Rôzne racemizácie, detekované v bielkovinových extraktoch (lóty I, II a III) sú ako príklady uvedené v tabuľke 2 a vyjadrené v % konfigurácii D.
Tabuľka 2 Racemizované aminokyseliny
Pirm.tr. « konfigurácia D
Lót j nm raessisavaná aminokyseliny: kyselina asparágov^ 18 serín 33 3539 arginín 8 1012
Neracemizované: alanin, tyrozín, valín, fenylalanín a leucín.
Nedetekovateľné: kyselina glutámová, treonín, prolín, metionin, izoleucín, cysteín, lyzín, histidín a tryptofán.
Analytické výsledky sú uvedené v tabuľke 3.
Tabuľka 3 Zložky lyofylizátu
| Parametre Lót | % lyofilizÄtu | ||
| I | IX | XII | |
| obsah xakremolekúl: | |||
| proteíny (Bradford) | 69.2 | 70.4 | 63.1 |
| stavebné aminokyseliny: | |||
| asparagín a kys. asp&rágová | 7.3 | 7.3 | 7.1 |
| glutasiín a kys. glutánovi | 9.6 | 9.5 | 8.9 |
| serin | 2.6 | 2.4 | 2.2 |
| treonín | 2.9 | .2 | 2.3 |
| glycín | 3.8 | .9 | 3 .3 |
| alanin | 5.» | 5.6 | 5.6 |
| arginín | 4.8 | 4.6 | 5.3 |
| prolín | 2.5 | 2.4 | 2.5 |
| valín | 4.9 | 5.0 | 4 .4 |
| netionin | 3.1 | 4.0 | 3 .4 |
| izoleucín | 4.1 | 4.0 | 3.5 |
| leucín | 6.3 | 6.3 | 5.9 |
| fenylalanín | 3.3 | 3.3 | 3.3 |
| cystín | nd | nd | nd |
| lysín | 5. 0 | 4.9 | 4.7 |
| histidín | 1.6 | 1.9 | 1.9 |
| tyrozín | 3.9 | 4.0 | 3.9 |
| celkoa: | 71.7 | 72.6 | «8. í |
| trakcie viaeaní na aakronolakuly: | |||
| nastne kyseliny | 0.9 | 0.9 | 1.0 |
| glycidy | 3.9 | 3.6 | 4.7 |
| aninocukry | 1.8 | 1.5 | 2.B |
| iná: | |||
| lipopolysacharidy (LPS) | 6,1,10“4 | 8.4.10*4 | 2,5.10** |
| dezoxyribonukleové kys.(DNA) | 9.5 | 6.1 | 4.5 |
| voíné aminokyseliny | nd | nd | nd |
| voda | 4.8 | 4.9 | 4.8 |
| elementárna analýza: | |||
| popo_ | €.0 | 7.5 | 7.2 |
| uhlík | 47.1 | 47.0 | 46.3 |
| vodík | 6.7 | 6.7 | 6.6 |
| dusík | 13.6 | 14.0 | 13.6 |
| síra | 1.3 | 1.4 | 1.8 |
nd - nedetekované
Imunofarmakologické vlastnosti
Bolo jasne demonštrované, hlavne testami in vitro a in vivo na pokusných zvieratách, že bielkovinový extrakt podľa vynálezu má imunomodulačné vlastnosti a protinádorovú účinnosť.
1. Imunologické testy in vitro
Imunologické testy in vitro boli vykonávané namakrofágoch, derivovaných z kostnej drene a na lymfocytoch zo sleziny, Peyerových plátov alebo mezenterických ganglií, odobraných myšiam C57BL/6.
Makrofágové modely: Bielkovinový extrakt stimuluje makrofágy v ich schopnosti aktivovať oxidačný metabolizmus glukózy v dráhe pentózofosfátov a aktivuje produkciu metabolitov dusíka (nitritový test). Sekrécia TNF, rovnako ako produkcia prostaglandínov (PGE?) pri makrofágoch je stimulovaná bielkovinovým extraktom.
Nitritový test, uvedený ako príklad, bol vykonaný podľa M. A. Marlettu Biochemistry, 27, 8706-8711, 1988. Makrotägy odvodené od kostnej drene sa kultivujú namikroplatniach (70.000 makrofágov na jamku) v prítomnosti rôznych koncentrácií bielkovinového extraktu (0,1 až 50 pg extraktu/ml) alebo lipopolysacharidov E. coli ako pozitívnej kontroly (0,0004 až 07 pg LPS/ml). Produkcia NO2 v supematantoch makrofágových kultúr sa stanoví pomocou Griessovho činidla podľa J. Mauela et al., Int. J. Immunopharmac., 11, 637-645, 1989.
Tabuľka 4 Výsledky nitritového testu μς extraktu/ml nmol »02 /ml <0.02 0-1 0.9 t 0.1
0.39 4.1 + 0.1
1-56 7.7 ± 0,2
6.25 10.8 ± 0.2
25.0 13.1 ±0.8
50.0 15.1 * 0.J
| μ? LPS/nl | nne>l J«o2“/nl |
| 0 | <0.02 |
| 0.0004 | 0.1 í 0.1 |
| 0.001« | 0.3 i 0.1 |
| C.0063 | 4.2 ± 0.1 |
| 0.025 | 6.5 í 0.4 |
| 0.1 | 7.1 ± O.l |
| C.2 | 8.3 ± 0.2 |
Výsledky pri rôznych koncentráciách testovaných produktov sú uvedené v tabuľke 4 v nmol NO2’/ml bunkového supernatantu v závislosti od koncentrácie extraktu alebo LPS. Bielkovinový extrakt vyvoláva silnú produkciu NO2*.
Lymfocytáme modely: Lymfocyty, pochádzajúce zo sleziny, Peyerových plátov alebo mezenterických ganglií, sa kultivujú na mikroplatniach (5.1()5 buniek na jamku) za štandardizovaných kultivačných podmienok v prítomnosti rôznych koncentrácií bielkovinového extraktu (1 až 100 pg extraktu/ml) alebu lipopolysacharidov E. coli ako pozitívnej kontroly (1 až 100 LPS pg/ml). Proliferácia buniek, vyvolaná produktmi, je stanovovaná mierou inkorporácie tritiovaného tymidínu do DNA buniek podľa J. Louise et al., Eur. J. Immunol., 9, 841-847, 1979. Amplitúda stimulácie lymfocytov bielkovinovým extraktom je za rovnakej koncentrácie pri všetkých troch zdrojoch lymfocytov porovnateľná s pozitívnou kontrolou. Bielkovinový extrakt sa aktivuje od 1 pg extraktu/ml a má maximum aktivity medzi 30 a 100 pg extraktu/ml.
2. Imunologický test in vi vo
Protinádorová účinnosť bielkovinového extraktu bola preukázaná in vivo na modele vyvolaného peritoneálneho karcinómu pri myšiach BDIX.
Použité bunky: Bunky Pro b boli klonované z kultúry buniek KÍ 2, izolovaných z nádoru DHD, vyvolaného dimetylhydrazínom pri polorodej myši BD IX, podľa F. Martina et al., Int. J. Cancer, 32, 623-627, 1983.
Indukcia peritoneálnych karcinómov: Bunky Pro b, vstreknuté intraperitoneálnou cestou syngénnym myšiam (106 buniek/myš), vyvolávajú po asi desiatich dňoch početné pevné noduly, ktoré sa objavujú v epiploome alebo mezentériu na úrovni mliečnych škvŕn (milky spots) a potom progresívne prenikajú do peritoneálnej dutiny, podľa P. Lagadaca et al., Invasion and Metastasis, 7, 83 - 95, 1987. Po ďalších 4 až 5 týždňoch sa objavuje krvácavá vodnateľnosť a všetky myši umierajú po 8 až 12 týždňoch.
Indukcia pulmonálnych metastáz: Vstreknutie 7.106 buniek Pro b do femorálnej žily vyvoláva pulmonálne metastázy, ktoré napádajú laloky a všetky myši umierajú po 6 až 10 týždňoch.
Liečba peritoneálnych a pulmonálnych karcinómov: Imunoterapia sa začína 14 dní po injekcii nádorových buniek, keď sú karcinómy makroskopické. Liečba spočíva v intraperitoneálnych injekciách bielkovinového extraktu v množstve 10 mg na kg telesnej hmotnosti. Myši dostávajú celkovo 5 injekcií v odstupe 3 až dní. Každý pokus zahrnuje kontrolnú a ošetrovanú skupinu s 10 (alebo 12) myšami, ktoré sú očíslované.
Výsledky: Myši sa usmrtia 6 týždňov po vstreknutí buniek a vykoná sa autopsia. Objem peritoneálnych karcinómov sa zhodnotí naslepo a myši sa zoradia podľa vzrastajúcej veľkosti karcinómov. Zostaví sa stupnica karcinomatózy podľa počtu a veľkosti pozorovaných nodulov. Objem hemoragických ascitov sa meria dvojitým vážením. Klasifikácia pulmonálnych metastáz sa vykoná po mikroskopickom pozorovaní pľúc a myši sa rozdelia do dvoch skupín: s metastázami a bez nich.
Získané výsledky ukazujú, že vo ôsmich pokusoch na 82 ošetrených myšiach nemalo 41 myší pri autopsii žiaden nodulus (40 až 60 % myší na pokus); pri ostatných myšiach bol rast nodulov významne inhibovaný. Okrem toho 78 z 82 myší nemalo ascites. Všetky neošetrené myši mali nádory a hemoragické ascity. Tieto výsledky potvrdzuje tiež test prežitia: z 10 myší ošetrených bielkovinovým extraktom prežili 3 myši do 10., 18. a 27. mesiaca po injekcii rakovinových buniek a pri autopsii nemali nádor. Všetky myši z kontrolnej skupiny zomreli na nádor 3 mesiace po injekcii buniek.
Výsledky, získané v priebehu dvoch pokusov s rastom pulmonálnych metastáz ďalej umožnili preukázať, že bielkovinový extrakt má systemický účinok. Z 20 myší, liečených intraperitoneálnou injekciou totiž 13 myší má úplnú inhibíciu rastu pulmonálnych metastáz. Protinádorový účinok bielkovinového extraktu sa dosahuje pri metastázach, vyvolaných rakovinovými bunkami časti hrubého čreva a tiež disociovanými nádormi. V priebehu liečby neboli pozorované známky toxicity.
3. Akútna toxicita
Bielkovinový extrakt má slabú toxicitu. Jednotkové dávky, dosahujúce 300 mg na kg, aplikované intraperitoneálne, sú myšami dobre tolerované.
4. Aplikácia
Aplikácia bielkovinového extraktu sa vykonáva injekčné, výhodne intraperitoneálne, vo forme lyofilizátu, rozpusteného napríklad vo fyziologickom roztoku. Rovnako je možné použiť ďalšie galenické formy, napríklad aplikované orálnou, rektálnou alebo topickou cestou.
Claims (9)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Extrakt na báze bakteriálnych makromolekúl, vyznačujúci sa tým, že obsahuje zmes modifikovaných kyslých bakteriálnych polypeptidov s molekulovou hmotnosťou 10 000 až 1 000 000 a s izoelektrickým bodom v rozmedzí 2,5 až 5,5, v ktorom celková hmotnosť stavebných aminokyselín predstavuje aspoň 50 % hmotnosti extraktu, kde obsah lipopolysacharidov je nižší ako 2.10’3 % hmotn., obsah voľných aminokyselín je do 4 % hmotn. a kyseliny dezoxyribonukleovej je do 15 % hmotn..
- 2. Extrakt bakteriálnych makromolekúl podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m, že uvedená celková hmotnosť stavebných aminokyselín je 55 až 85 % hmotn., pričom medzi stavebnými aminokyselinami, z ktorých niektoré sú racemizované, prevažujú kyslé zvyšky, ako jc kyselina asparágová a kyselina glutámová.
- 3. Extrakt bakteriálnych makromolekúl podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že racemizované aminokyseliny sú v D konfigurácii a to serín aspoň na 25 až 45 % , kyselina asparágová na 10 až 30 % a arginín na 3 až 20 %.
- 4. Spôsob prípravy extraktu podľa nároku 1, v y značujúci sa tým, že zahrnuje kultiváciu baktérií v kvapalnom prostredí, prípravu suspenzie týchto baktérií vo vodnom prostredí, bez obsahu zvyškov média, potom alkalickú extrakciu tejto suspenzie baktérií a čistenie bielkovinového extraktu, pričom sa alkalická extrakcia vykonáva v prítomnosti zriedeného vodného zdroja iónov OH a pri stabilnom pH v rozmedzí 11 až 13, pričom pokles pH v priebehu tejto extrakcie nie je vyšší ako 0,4, teplota v priebehu extrakcie sa udržiava medzi 30 a 45 °C a čas extrakcie je niekoľko hodín až jeden týždeň.
- 5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým , že na kultiváciu sa použijú baktérie Escherichia coli, CNCM 1-1147 zdrojom iónov OH je roztok hydroxidu sodného s koncentráciou 0,01 až 1 % hmotn., pH je v rozmedzí 12,0 až 12,5.
- 6. Spôsob podľa nároku 4 alebo 5, vyznačujúci sa tým, že bielkovinový extrakt, získaný alkalickou extrakciou, sa podrobí čisteniu na zníženie obsahu lipopolysacharidov v bielkovinovom extrakte pod 2.10-3 % hmotn. zahrnujúcemu jeden alebo niekoľko stupňov ultrafíltrácie, spracovanie neionogénnym detergentom, chromatograficky a/alebo sterilnú filtráciu a lyofilizáciu.
- 7. Farmaceutický prostriedok s imunomodulačnými vlastnosťami, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ako účinnú zložku terapeuticky prijateľné množstvo extraktu bakteriálnych makromolekúl podľa nároku 1 až 3.
- 8. Farmaceutický prostriedok s protirakovinovým terapeutickým účinkom, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje ako účinnú zložku terapeuticky prijateľné množstvo extraktu bakteriálnych makromolekúl podľa nároku 1 až 3.
- 9. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 7, v y značujúci sa tým, že je pripravovaný vo forme injekčnej, orálnej, rektálnej alebo topickej aplikácie.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH450/92A CH685498A5 (fr) | 1992-02-14 | 1992-02-14 | Extrait de macromolécules bactériennes, procédé pour sa préparation et composition pharmaceutique contenant cet extrait. |
| PCT/CH1993/000029 WO1993016190A1 (fr) | 1992-02-14 | 1993-02-03 | Extrait de macromolecules bacteriennes, procede pour sa preparation et composition pharmaceutique contenant cet extrait |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK111193A3 SK111193A3 (en) | 1994-03-09 |
| SK279877B6 true SK279877B6 (sk) | 1999-05-07 |
Family
ID=4187312
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1111-93A SK279877B6 (sk) | 1992-02-14 | 1993-02-03 | Extrakt bakteriálnych makromolekúl, spôsob jeho pr |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5424287A (sk) |
| EP (1) | EP0580829B1 (sk) |
| JP (1) | JPH06507077A (sk) |
| AT (1) | ATE160588T1 (sk) |
| BR (1) | BR9304205A (sk) |
| CA (1) | CA2106854A1 (sk) |
| CH (1) | CH685498A5 (sk) |
| CZ (1) | CZ282924B6 (sk) |
| DE (1) | DE69315388T2 (sk) |
| DK (1) | DK0580829T3 (sk) |
| ES (1) | ES2111149T3 (sk) |
| GR (1) | GR3025882T3 (sk) |
| HU (1) | HU215262B (sk) |
| PL (1) | PL175058B1 (sk) |
| RO (1) | RO117621B1 (sk) |
| SK (1) | SK279877B6 (sk) |
| WO (1) | WO1993016190A1 (sk) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2703587B1 (fr) | 1993-04-06 | 1995-06-16 | Oreal | Composition cosmetique coloree. |
| DE59505786D1 (de) | 1994-02-07 | 1999-06-02 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur abreicherung oder entfernung von endotoxinen |
| DE19710255A1 (de) * | 1997-03-13 | 1998-09-17 | Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg | Verwendung einer Lösung zur Desaktivierung von Endotoxinen |
| FR2842208B1 (fr) * | 2002-07-10 | 2004-10-22 | Lco Sante | Extraits membranaires de klebsiella presentant des proprietes avantageuses, et procede de production de ces extraits |
| WO2008031020A2 (en) * | 2006-09-08 | 2008-03-13 | Wyeth | Arginine wash in protein purification using affinity chromatography |
| EP3332791A1 (en) * | 2007-03-05 | 2018-06-13 | OM Pharma | Bacterial extract for respiratory disorders and process for its preparation |
| HUE038602T2 (hu) * | 2007-03-05 | 2018-10-29 | Om Pharma | Bakteriális extraktum emésztõrendszeri vagy húgyúti traktus rendellenességekhez, és eljárás ennek elõállítására |
| AU2013200193B2 (en) * | 2007-03-05 | 2015-04-23 | Om Pharma | Bacterial extract for digestive or urinary tract disorders and process for its preparation |
| AU2013202504B2 (en) * | 2007-03-05 | 2014-09-11 | Om Pharma | Bacterial extract for respiratory disorders and process for its preparation |
| US20100055082A1 (en) * | 2008-09-04 | 2010-03-04 | Jacques Alain Bauer | Immunomodulatory extracts from lactobacillus bacteria and methods of manufacturing and use thereof |
| CN102617703A (zh) * | 2012-04-14 | 2012-08-01 | 拜明(苏州)生物技术有限公司 | 一种无需裂解高效提取发酵细菌中外源表达蛋白的方法 |
| JP2014200194A (ja) * | 2013-04-04 | 2014-10-27 | 浜松ホトニクス株式会社 | 細胞から細胞小器官又はタンパク質を回収する方法 |
| EP3937957A1 (en) | 2019-03-14 | 2022-01-19 | OM Pharma SA | Process for making stable bacterial extracts and their use as pharmaceuticals |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2405298A1 (fr) * | 1977-01-27 | 1979-05-04 | Cassenne Lab Sa | Nouvelles glycoproteines isolees d'escherichia coli, procede de preparation et application de medicaments |
| FR2396018A1 (fr) * | 1977-07-01 | 1979-01-26 | Cassenne Lab Sa | Nouveaux glycopeptides acetyles hydrosolubles extraits de corps microbiens lyses d'escherichia coli, procede de preparation et application a titre de medicaments de ces produits |
| CH633188A5 (fr) * | 1978-05-26 | 1982-11-30 | Om Laboratoires Sa | Medicament contre des maladies infectieuses des voies respiratoires. |
-
1992
- 1992-02-14 CH CH450/92A patent/CH685498A5/fr not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-02-03 DK DK93902023T patent/DK0580829T3/da active
- 1993-02-03 BR BR9304205A patent/BR9304205A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-02-03 CZ CZ932064A patent/CZ282924B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1993-02-03 EP EP93902023A patent/EP0580829B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1993-02-03 RO RO93-01371A patent/RO117621B1/ro unknown
- 1993-02-03 CA CA002106854A patent/CA2106854A1/en not_active Abandoned
- 1993-02-03 SK SK1111-93A patent/SK279877B6/sk unknown
- 1993-02-03 WO PCT/CH1993/000029 patent/WO1993016190A1/fr not_active Ceased
- 1993-02-03 AT AT93902023T patent/ATE160588T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-02-03 JP JP5513639A patent/JPH06507077A/ja active Pending
- 1993-02-03 HU HU9302893A patent/HU215262B/hu not_active IP Right Cessation
- 1993-02-03 PL PL93301012A patent/PL175058B1/pl unknown
- 1993-02-03 US US08/119,124 patent/US5424287A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-02-03 ES ES93902023T patent/ES2111149T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-02-03 DE DE69315388T patent/DE69315388T2/de not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-01-14 GR GR980400055T patent/GR3025882T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2111149T3 (es) | 1998-03-01 |
| GR3025882T3 (en) | 1998-04-30 |
| CH685498A5 (fr) | 1995-07-31 |
| HU9302893D0 (en) | 1994-01-28 |
| SK111193A3 (en) | 1994-03-09 |
| US5424287A (en) | 1995-06-13 |
| WO1993016190A1 (fr) | 1993-08-19 |
| BR9304205A (pt) | 1994-08-02 |
| DE69315388T2 (de) | 1998-05-14 |
| HUT70268A (en) | 1995-09-28 |
| DK0580829T3 (da) | 1998-08-10 |
| JPH06507077A (ja) | 1994-08-11 |
| PL301012A1 (en) | 1994-04-05 |
| PL175058B1 (pl) | 1998-10-30 |
| CA2106854A1 (en) | 1993-08-15 |
| EP0580829B1 (fr) | 1997-11-26 |
| CZ206493A3 (en) | 1994-04-13 |
| RO117621B1 (ro) | 2002-05-30 |
| EP0580829A1 (fr) | 1994-02-02 |
| HU215262B (hu) | 1998-11-30 |
| ATE160588T1 (de) | 1997-12-15 |
| CZ282924B6 (cs) | 1997-11-12 |
| DE69315388D1 (de) | 1998-01-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nakashima et al. | Synthesis of peptides from amino acids and ATP with lysine-rich proteinoid | |
| SU1297712A3 (ru) | Способ получени анатоксина @ @ | |
| SK279877B6 (sk) | Extrakt bakteriálnych makromolekúl, spôsob jeho pr | |
| JPS60136597A (ja) | デスルフアトヒルジン、その製造及びそれを含む製薬組成物 | |
| TWI549682B (zh) | 用於消化或泌尿道失調症的細菌萃取物和其製備方法 | |
| Gmeiner | The isolation of two different lipopolysaccharide fractions from various Proteus mirabilis strains | |
| FI72143C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av maenniskointerferon. | |
| JPS6123167B2 (sk) | ||
| SU1423002A3 (ru) | Способ получени белка,понижающего содержание холестерина в крови млекопитающих животных | |
| Okuda et al. | An envelope-specific glycoprotein from Escherichia coli B | |
| FI86959C (fi) | Foerfarande foer odling av bordetella pertussis tohama (fas i)-stammen och foerfarande foer framstaellning av kikhostavaccin och ett blandat vaccin, som innehaoller kikhostatoxoid | |
| JPH05176789A (ja) | Ｎ−末端にメチオニンを含有しない、遺伝子組換えによるヒト・システイン非含有γ− インターフェロンの製造方法 | |
| CN105177097A (zh) | 一种具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方法及应用 | |
| EP0027710A1 (en) | Antibiotic substances, a process for the preparation and compositions thereof; a new strain of Staphylococcus epidermidis which produces the said antibiotic substance and compositions thereof | |
| CA1186629A (en) | Biologically active substance, process for preparing the substance and immunoactive composition | |
| US4621054A (en) | Biologically active substance, process for preparing the substance and immunoactive composition | |
| DE69029315T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Oxazopyrrolochinolinen, die sie enthaltenden Produkte und deren Verwendung | |
| Simpson et al. | Cytotoxicity of the glycolipid region of streptococcal lipoteichoic acid for cultures of human heart cells | |
| US5244807A (en) | Production of pseudomonas xa cells containing indolyl-3-alkane alpha-hydroxylase | |
| IE46649B1 (en) | Biologically active substance | |
| Ye et al. | Purification and characterization of glycolactin, a novel glycoprotein from bovine milk | |
| EP0125892B1 (en) | Islets-activating protein derivatives | |
| FI59815C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av en alfa-amylas-inhibitor med peptidstruktur | |
| IT9021332A1 (it) | Exopolimero ottenuto a partire da ceppi selezionati del genere bifidobaceterium, suo procedimento di preparazione e composizioni farmaceutiche che lo contengono | |
| Koga et al. | Isolation and Partial Properties of a Porin‐Like Protein from Vibrio parahaemolyticus Cell Envelope |