SK181498A3 - Method for producing therapeutic dna, application of plasmid dna for producing a pharmaceutical composition - Google Patents
Method for producing therapeutic dna, application of plasmid dna for producing a pharmaceutical composition Download PDFInfo
- Publication number
- SK181498A3 SK181498A3 SK1814-98A SK181498A SK181498A3 SK 181498 A3 SK181498 A3 SK 181498A3 SK 181498 A SK181498 A SK 181498A SK 181498 A3 SK181498 A3 SK 181498A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- dna
- plasmid
- methylated
- dinucleotides
- plasmid dna
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 153
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title claims description 20
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 142
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 50
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 45
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 33
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 claims description 18
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 claims description 18
- 108010063593 DNA modification methylase SssI Proteins 0.000 claims description 9
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 claims description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 8
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 claims description 8
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 claims description 8
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract description 16
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 65
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 20
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 17
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 14
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- -1 ApoAIV Proteins 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- 229930183998 Lividomycin Natural products 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 229950003076 lividomycin Drugs 0.000 description 4
- DBLVDAUGBTYDFR-SWMBIRFSSA-N lividomycin A Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](N)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H]([C@H]1O)O[C@H]1O[C@H]([C@H]([C@H](O)[C@H]1N)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)CN)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C[C@H]1N DBLVDAUGBTYDFR-SWMBIRFSSA-N 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N (2s)-2,5-bis(3-aminopropylamino)-n-[2-(dioctadecylamino)acetyl]pentanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CC(=O)NC(=O)[C@H](CCCNCCCN)NCCCN)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N 0.000 description 3
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 241000202911 Spiroplasma sp. Species 0.000 description 3
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 2
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 6-methyladenine Chemical compound CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 2
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000622060 Photinus pyralis Luciferin 4-monooxygenase Proteins 0.000 description 2
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 2
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 2
- 101100379247 Salmo trutta apoa1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000202917 Spiroplasma Species 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- 241001518258 Streptomyces pristinaespiralis Species 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 2
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 2
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 1-methylcytosine Chemical compound CN1C=CC(N)=NC1=O HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 1
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 description 1
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 description 1
- 101100381862 Bacillus subtilis (strain 168) bmr3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 101100297345 Caenorhabditis elegans pgl-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 1
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 101150102464 Cry1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010079245 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Proteins 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000000311 Cytosine Deaminase Human genes 0.000 description 1
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 1
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 102000030914 Fatty Acid-Binding Human genes 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 101150057182 GFAP gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004038 Glia Maturation Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000495 Glia Maturation Factor Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101100175482 Glycine max CG-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000595923 Homo sapiens Placenta growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100012330 Mus musculus F9 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000008763 Neurofilament Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010088373 Neurofilament Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101150038013 PIR gene Proteins 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 241000588701 Pectobacterium carotovorum Species 0.000 description 1
- 102100035194 Placenta growth factor Human genes 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 102100032889 Sortilin Human genes 0.000 description 1
- 101100344811 Starmerella bombicola mdr gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102100038313 Transcription factor E2-alpha Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 241001672648 Vieira Species 0.000 description 1
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 description 1
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine group Chemical group [C@@H]1([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)N1C=NC=2C(N)=NC=NC12 OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 1
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical group O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 101150097231 eg gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940092559 enterobacter aerogenes Drugs 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 108091022862 fatty acid binding Proteins 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006607 hypermethylation Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 101150023497 mcrA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 230000001035 methylating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 102000003702 retinoic acid receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000064 retinoic acid receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 108020003113 steroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005969 steroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 208000001608 teratocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 101150107585 tetA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000012991 uterine carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 108090000195 villin Proteins 0.000 description 1
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Vynález sa týka prípravy DNA, osobitne plazmidovej DNA. Konkrétne sa týka prípravy DNA bakteriálnych plazmidov, ktoré sa môžu použiť v génovej terapii, ako je plazmid v nadzávitnicovej, relaxovanej kruhovej alebo lineárnej forme, pričom imunogénne vlastnosti takej DNA sú znížené alebo úplne odstránené. Vynález sa týka tiež mikroorganizmov, ktoré sa môžu použiť na prípravu DNA a ďalej sa týka aj farmaceutických prípravkov.
Doterajší stav techniky
Génová terapia spočíva v náprave nedostatku alebo abnormality zavedením genetickej informácie do ovplyvnenej bunky alebo orgánu. Genetická informácia sa môže zaviesť buď in vitro do bunky extrahovanej z orgánu a potom vloženej do tela, alebo in vivo priamo do cieľového tkaniva. Keďže je molekula DNA negatívne nabitá a má vysokú molekulovú hmotnosť, preniká spontánne iba ťažko cez fosfolipidovú bunkovú membránu. Používajú sa preto rôzne vektory, ale tiež prirodzené alebo syntetické chemické alebo biochemické vektory. Vírusové vektory (retrovírusy, adenovírusy, adenoasociované vírusy a pod.) sú veľmi účinné osobitne pri prechode membránou, ale s nimi spojený rad rizík, ako sú patogénne vlastnosti, rekombinácia, replikácia, imunogénne vlastnosti, atď.. Chemické alebo biochemické vektory umožňujú vyhnúť sa týmto rizikám (prehľady pozri Behr 1993, Cotton a Wagner 1993). K takýmto vektorom patria napríklad katióny (fosforečnan vápenatý, DEAE-dextrán, atď.), ktoré pôsobia tak, vytvárajú s DNA zrazeninu, ktorá môže byť potom pohltená bunkou (prostredníctvom fagocytózy). Ďalej sú tu lipozómy, do ktorých je inkorporovaná DNA a ktoré fúzujú s plazmatickou membránou.
Syntetické vektory na prenos génov sú obyčajne katiónové lipidy alebo polyméry, ktoré vytvárajú komplexy s DNA a tvoria tak častice nesúce kladné povrchové náboje. Takéto častice sú schopné interagovať s negatívne nabitou bunkovou membránou a sú schopné ňou prechádzať. Ako príklady takýchto vektorov možno uviesť dioktadecylamidoglycylspermin (DOGS, Transfectam™) alebo N-[1-2,
3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimetylamoniumchlorid (DOTMA, Lipofectin™) . Vyvinuli sa tiež chimérne proteíny, ktoré obsahujú polykatiónovú časť, ktorá kondenzuje DNA, spojenú s ligandom, ktorý sa viaže na membránový receptor a umožňuje vznik komplexu v bunke prostredníctvom endocytózy. Takže je aspoň teoreticky možné zacieliť určité tkanivo alebo bunkovú populáciu a tým zlepšiť in vivo biologickú dostupnosť prenášaného génu.
Plazmidy používané v súčasnosti na génovú terapiu obsahujú zvyčajne
I) replikačný počiatok
II) markerový gén ako je napr. gén rezistencie voči antibiotikám (kanamycín, ampicilín a pod.)
III) jeden alebo niekoľko transgénov so sekvenciami nevyhnutnými na ich expresiu (enhancer (t.j. zosilňovač), promótor, polyadenylačný signál, atď.).
Takýto typ plazmidu sa v súčasnosti používa napr. v génovej terapii v klinických štúdiách liečenia melanómu (Nabel a kol. 1992) alebo v iných experimentálnych štúdiách.
Použitie plazmidovej DNA v génovej terapii je však spojené s radom problémov.
Osobitne sa to týka možnosti pripraviť veľké množstvo DNA vo farmakologickej čistote. Pri týchto terapeutických technikách je liečivom v podstate samotná DNA a je preto nevyhnutné vyrobiť DNA v dostatočnom množstve a s takými vlastnosťami, aby bola vhodná na liečebné použitie pre človeka. V tejto súvislosti sa už opísali rôzne spôsoby prípravy alebo purifikácie, umožňujúce zlepšiť kvalitu plazmidovej
FR96/03519).
DNA (pozri PCT/FR95/01468,
Použitie DNA, ktorá nesie gény rezistencie voči antibiotikám alebo funkčné replikačné počiatky môže mať tiež určité nevýhody spojené s možnosťou rozšírenia po celom tele. Vyvinuli sa rôzne spôsoby na obmedzenie týchto nevýhod (pozri PCT/FR96/00274, FR95/102825).
Ďalšia nevýhoda plazmidov spočíva v ich pôvode. Plazmidy sú v podstate molekuly prokaryotických organizmov (baktérií) alebo nižších eukaryotických organizmov (kvasiniek), ktoré nesú motívy, ktoré môžu byť potenciálne imunogénne pre človeka. Pričom imunologické vlastnosti DNA sú v podstate doteraz neznáme. Je známe, že bakteriálna DNA v myši
I) spôsobuje syntézu protilátok, ktoré rozpoznávajú dvojvláknovú a jednovláknovú bakteriálnu DNA, ktorá imunizáciu spôsobila, ale nereagujú s cicavčou dvoj vláknovou DNA, a
II) stimulujú makrofágy a
Immunologic Properties of produkciu cytokínov (D. Pisetsky,
DNA, J. Immunol, 156, 1996, 1).
The
Teda molekuly DNA sú spôsobiť stimuláciu imunogénna (napr. cudzie teleso, sprostredkovanú bunkami). Prvé vyvoláva imunitnú odpoveď Immunol. 147, 1759). Ukázali, i imunogénne. Avšak imunitného makromolekula môže nie pričom sama imunitnú odpoveď bakteriálna DNA systému, ktoré vyvolá dôkazy, že opísali Pisetsky a že DNA z troch bakteriálnych druhov kol. (1991,
J.
môže stimulovať proliferáciu myšacích lymfocytov, zatial čo DNA extrahovaná z troch živočíšnych druhov nespôsobovala takúto stimuláciu. Neskoršie Yamamoto a kol. (1992, Microbiol. Immunol 36, 983) pozorovali, že bakteriálna DNA zo šiestich druhov spôsobovala v bunkách sleziny myši BALB/C zvýšenie aktivity NK (natural killer) buniek a indukciu tvorby interferónu. Avšak DNA izolovaná z desiatich druhov stavovcov nevyvolala žiadnu z týchto odpovedí. Okrem toho Krieg a kol. opísali v r. 1995 (Náture 374, 546), že fragment genómovej DNA z E. coli indukuje
B-buniek sekréciu in vitro proliferáciu myšacích imunoglobulínov IgM, zatiaľ čo tá istá bakteriálna DNA opracovaná in vitro CpG metylázou neindukovala takúto odpoveď. Krieg a kol. tiež ukázali, že v prítomnosti nemetylovanej DNA je vytváraný interf erón-γ, stimuluj úci) B-bunkami zistilo, ktorý pôsobí ako faktor súčasne stimulujúci (kodiferenciáciu B-buniek tým, (Krieg a kol., 1996, J.
že oligonukleotidy na svojom 5'-konci obklopené pyrimidínmi spôsobujú in vivo že moduluje tvorbu IL-6 Immunol., 156, 558). Ďalej sa s nemetylovanými CpG motívmi, 2 purínmi a na svojom 3'-konci 2 koordinovanú sekréciu interleukínu a interleukínu 12 interferónu-γ, v NK-bunkách (IFN-γ), Bbunkách (IL-6 a IL-12) a kol., 1996, Proc. Natl.
T-lymfocytoch CD4+ (IL-6 a IFN-γ)
USA 93, 2879) .
Acad. Sci.
(Krieg
Plazmidová DNA používaná dnes v génovej terapii je zásadne produkovaná prokaryotickými bunkami a teda má metylačný profil, ktorý porovnateľný s bakteriálnou genómovou DNA. Navyše sa ukázalo, že plazmidová DNA, ktorá sa injikovala do svalu alebo pečene a potom sa izolovala, ponechala si svoj prokaryotický metylačný profil (Wolf a kol., 1992, Hum. Mol. Genet. 1, 29903, Malone a kol., 1995, J. Biol. Chem. 269, 29903): možno teda zhrnúť, že používaná DNA bakteriálnych plazmidov má značný potenciál na stimuláciu imunitného systému.
Bolo teda mimoriadne výhodné mať k dispozícii plazmidovú DNA, ktorá by mala také vlastnosti, že jej imunogenicita by bola redukovaná alebo dokonca úplne odstránená. Bolo tiež mimoriadne výhodné mať k dispozícii spôsob, ktorý by umožňoval pripravovať takú plazmidovú DNA v meradle, ktoré je vhodné na priemyselné využitie.
Podstata vynálezu
Predkladaný vynález poskytuje riešenie týchto otázok. Prihlasovateľ sa zaoberal imunogénnymi vlastnosťami bakteriálnej DNA a vynašiel spôsob prípravy plazmidovej DNA farmaceutickej čistoty, potenciálne bez nežiaducich imunogénnych vlastnosti.
Prihlasovateľ tiež ukázal, že metylácia určitých zvyškov DNA umožňuje redukovať imunogénny potenciál plazmidových DNA bez toho aby sa ovplyvnila ich kapacita transfekovať bunky a exprimovať v nich požadovanú nukleovú kyselinu.
Jedným aspektom predkladaného vynálezu je príprava DNA, terapeutickou kvalitou. Ďalší týka použitia dinukleotidoch predkladaného plazmidovej
5'-CG-3' vynálezu na sa aspekt
DNA s konkrétne plazmidových DNA s predkladaného vynálezu sa metylovanými cytozínmi v terapiu. Tretí aspekt farmaceutického prípravku obsahujúceho metylované plazmidové Predkladaný vynález sa tým, že sa exprimuje vynálezu sa týkajú mikroorganizmov, ktoré terapeutických prípravkov a génovú týka DNA.
vivo tiež týka spôsobu metylácie DNA in metyláza. Ďalšie aspekty predkladaného expresných kaziet a hostiteľských môžu použiť na metyláciu, prípravy spôsobov prenosu génov.
sa
Prvý predmet vynálezu ktorá sa môže použiť v génovej terapii a bunkách obsahujúcich kazetu na expresiu ktorá sa preto týka spôsobu prípravy DNA, ktorá sa pripravuje v DNA metyltransferázy, umožňuje metyláciu cytozínových zvyškov v dinukleotidoch 5'-CG-37.
Predkladaný vynález sa preto týka prípravy DNA, osobitne plazmidovej DNA, ktorá je metylovaná na cytozínových zvyškoch v dinukleotidoch 5'-CG-3'.
Metylácia plazmidovej DNA in vitro je uvedená v literatúre (Adams a kol. 1992, FEBS Lett. 309, 97, Doerfler 1994, FEBS Lett. 344, 251, Komura a kol. 1995, Biochim. Biophys. Acta 1260, 73). Ale s týmto typom metylácie nie možné rátať na priemyselnú prípravu plazmidovej DNA, ktorá by bola vhodná na použitie v génovej terapii. Takýto spôsob prípravy plazmidovej DNA musí umožňovať reprodukovateľnú prípravu veľkého množstva homogénnej DNA a táto DNA sa potom musí čistiť spôsobmi prijateľnými na farmaceutické použitie. Je úplne jasné, že DNA metylovaná in vitro sa viac či menej líši súbor od súboru (Doerfler 1994, FEBS
Lett. 344, 251) a že takto pripravované množstvo je veľmi obmedzené.
Predkladaný vynález teraz ukazuje, že je možné metylovať požadovaný plazmid priamo v priebehu prípravy, konkrétne tým, že sa v hostiteľskej bunke koexprimuje (súčasne exprimuje) gén kódujúci metylázu. Predkladaný vynález tiež ukazuje, že takto možno pripraviť veľké a homogénne množstvo plazmidu a že metylovaná plazmidová DNA sa môže purifikovať už známymi spôsobmi. Prihlasovateľ tiež ukázal, že takto metylovaná DNA si výhodne ponecháva kapacitu transfekcie cieľových buniek a prípadne tam, kde je to vhodné, sa v nich replikovať. Osobitne je treba zdôrazniť, že prihlasovateľ ďalej ukázal, že plazmidová DNA takto metylovaná môže exprimovať požadovanú nukleovú kyselinu.
Mnohé štúdie podporujú myšlienku, že hypermetylácia má nejaký vzťah k inhibícii alebo inaktivácii promótorov a že teda aktívne transkribované promótory sú často nedostatočne metylované (hypometylované) alebo vôbec nie sú metylované. Napr. v prípade vírusových promótorov, ak neskorý promótor E2A adenovírusu s genómom typu 2 je v transformovaných škrečacích bunkách HE1 plne metylovaný v dinukleotidoch 5'-CG-3' a v transformovaných škrečacích bunkách HE1 je nemetylovaný, potom tento gén E2A je v bunkách HE1 umlčaný, zatiaľ čo v bunkách HE2 je transkribovaný (W. Doerfler 1995, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197, 209). Ďalší príklad opísali Kohn a kol. (Proc Natl. Acad. Sci. USA 91, 2567), ktorí ukázali, že neprítomnosť expresie z LTR retrovírusového vektora transdukovaného v hematopoetických kmeňových bunkách je spojená s metyláciou in vivo. Opísala sa tiež inhibícia expresie reportérového génu riadeného vírusovým promótorom, keď bol tento gén vnesený prechodnou transfekciou prostredníctvom plazmidu metylovaného in 1992, FEBS Lett. 309, 97, Doerfler
Komura a kol. Biochim. Biophys. Acta vitro (Adams a kol.
1994,
1260, a kol. (2oc. cit.) ukázali, že
FEBS
73) .
Lett.
Okrem
344, toho
251,
Razin kódujúceho promótor typ I a myšací gén kódujúci génu tymidinkinázu vírusu herpes simplex metalotioneín sú inaktívne počas prechodnej expresie v myšacích
L-bunkách a bunkách myšacieho teratokarcinómu F9, pokiaľ sú ich promótory metylované na dinukleotidoch 5'-CG-3'.
Predkladaný vynález teda opisuje prvý krát spôsob, ktorý umožňuje pripravovať metylovanú plazmidovú DNA, ktorá je homogénna a kompatibilná s priemyselným použitím a ukazuje možnosť použiť takýto typ plazmidov na expresiu génov in vitro, ex vivo alebo in vivo a osobitne potom na použitie v génovej terapii.
Spôsob podľa predkladaného vynálezu sa môže uskutočňovať v rôznych typoch hostiteľských buniek. To znamená osobitne v akýchkoľvek bunkách okrem ludských, ktoré vôbec neobsahujú systém na metyláciu cytozínu v dinukleotidoch 5'-CG-3'. Neprítomnosť metylácie môže byť dôsledkom neprítomnosti vhodného enzýmu, alebo nedostatočnou expresiou zodpovedajúceho génu, alebo je dôsledkom neprítomnosti takého génu. Výhodne sa môžu použiť prokaryotické alebo jednotlivé eukaryotické bunky.
Výhodne je hostiteľskou bunkou baktéria. Výhodnejšie ide o baktérie E. coli, B. subtilis, rod Streptomyces, rod Pseudomonas (P. putida, P. aeruginosa) f Rhizobium melioti, Agrobacterium tumefaciens, Staphylococcus aureus, Streptomyces pristinaespiralis, Enterococcus faecium alebo rod Clostridium. Môžu sa tiež použiť baktérie ako napr. Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Erwinia carotovora alebo 'Serratia marcescens. Výhodne sú hostiteľské bunky z nepatogénneho organizmu a umožňujú prípravu veľkého a homogénneho množstva plazmidovej DNA. Osobitne výhodným príkladom je použitie E. coli.
Spôsob podľa predkladaného vynálezu dovoluje prípravu DNA terapeutickej kvality.
DNA môže byť lineárna alebo kruhová, jednovláknová alebo dvojvláknová molekula, v replikatívnej alebo integratívnej forme alebo plazmid v nadzávitnicovej forme alebo v uvoľnenej kruhovej alebo lineárnej forme. V ďalšom texte tu sa bude DNA tiež označovať ako GT plazmidová DNA alebo GT plazmid (v prípade plazmidu vhodného na génovú terapiu).
GT plazmidy všeobecne používané v génovej terapii nevyhnutne obsahuj ú
I) replikačný počiatok
II) jednu alebo niekoľko požadovaných nukleových kyselín (t. j. terapeutických génov) so sekvenciami nevyhnutnými na ich expresiu (enhancer, promótor, polyadenylačný signál, atď.)
III) markerový gén
Výber replikačného počiatku závisí predovšetkým na hostiteľských bunkách použitých na prípravu. Môže to byť replikačný počiatok pochádzajúci z plazmidu s inkompatibilitou skupiny P (napr. pRK290), ktorý umožňuje replikáciu v kmeňoch E. coli polA. Úplne všeobecne to môže byť akýkoľvek replikačný počiatok pochádzajúci z plazmidu, ktorý sa replikuje v prokaryotických alebo nižších eukaryotických bunkách. Takýto plazmid je napríklad pBR322 (Bolivar a kol., Gene 2, 1977, 95), derivát pUC (Vieira a Messing, Gene 19, 1982, 259) alebo ďalšie plazmidy odvodené z rovnakej inkompatibilnej skupiny, napr. ColEl alebo pMBl. Ale môžu sa vybrať aj plazmidy z iných inkompatibilných skupín, ktoré sa replikujú v E. coli. Možnými plazmidmi sú plazmidy patriace napr. do skupín inkompatibility A, B, El, FII, FIII, Hl, Hli, II, 12, J, K, L, N, OF, P, Q, T, U, W, Y, Z alebo 9. Môžu sa tiež použiť iné plazmidy, ktoré sa nereplikujú v E. coli, ale replikujú sa v iných hostiteľoch, ako je napr. B. subtilis, Streptomyces, P. putida, P. aeruginosa, Rhizobium melioti, Agrobacterium tumefaciens, Staphylococcus aureus, Streptomyces pristinaespiralis, Enterococcus faecium alebo Clostridium. Výhodné je použitie replikačné počiatku z plazmidov, ktoré sa replikujú v E. coli. V závislosti na konkrétnom variante, replikačný počiatok môže byť tzv. Podmieneného pôvodu, t. j. taký replikačný počiatok, ktorého aktivita závisí na prítomnosti faktora pôsobiaceho v trans. Použitie takéhoto replikačného počiatku zabraňuje replikácii plazmidovej DNA po podaní, napr.. človeku (FR95/10825).
Z markerových génov je nutné uviesť gény rezistencie, osobitne potom rezistencie voči antibiotikám (ako je napr. ampicilín, kanamycín, geneticín, hygromycín a pod.), alebo to môže byť akýkoľvek gén poskytujúci bunke vlastnosť, ktorú sama už nemá (napr. gén odstránený z chromozómu alebo inaktivovaný) a ktorú gén v plazmide obnoví.
V konkrétnom uskutočnení vynálezu plazmidová DNA obsahuje sekvencie, ktoré umožňujú, aby všetky úseky, ktoré nemajú terapeutickú funkciu (replikačný počiatok, markerový gén a pod.) boli po produkčnej fáze odstránené. Osobitne výhodný spôsob prípravy na prípravu molekúl takého typu (tzv. minikruhová molekula) sa opísal v prihláške vynálezu PCT/FR95/00274.
Plazmid podľa predkladaného vynálezu je výhodne dvojvláknová molekula DNA obsahujúca jednu alebo niekoľko požadovaných nukleových kyselín spoločne so sekvenciami nevyhnutnými na ich expresiu. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je použitá replikatívna alebo integratívna molekula. Výhodne plazmidová DNA obsahuje nevyhnutne jednu alebo niekoľko požadovaných nukleových kyselín spoločne so sekvenciami nevyhnutnými na ich expresiu (tzv. miniplazmid).
Požadovaná nukleová kyselina (t. j. ktorá má byť prenesená) môže byť akákoľvek nukleová kyselina (cDNA, gDNA, syntetická alebo polosyntetická DNA, a pod.), ktorej transkripcia, prípadne translácia v bunke podmieňuje vznik produktov, ktoré majú terapeutický, očkovací, poľnohospodársky alebo veterinárny význam.
K nukleovým kyselinám s terapeutickými vlastnosťami patria predovšetkým gény kódujúce enzýmy, krvné deriváty, hormóny, lymfokíny, osobitne interleukíny, interferóny, TNF a pod. (pozri FR92/03120), rastové faktory, nervové prenášače a ich prekurzory alebo syntetické enzýmy, trofické faktory, konkrétne BDNF, CNTF,
NGF, IGF, konkrétne dystrofin nádory ako gény kódujúce faktory VII, pre celú časť
GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 a pod., ApoAI, ApoAIV, ApoE a pod. (pozri alebo minidistrofin (FR91/11947), gény k-rev a pod.
sa na koagulácii, sebevražedné gény, konkrétne a pod., alebo alternatívne prirodzeného alebo umelého imunoglobulínu alebo jej ScFv a pod.) alebo ligand génom môže byť antisense (s normálnej transkripcie) gén alebo cieľovej bunke umožňuje mRNA. Takáto (FR91/11947), je p53, Rb, RaplA, DCC, faktory zúčastňujúce VIII, IX a pod., tzv.
tymidínkinázu, cytozíndeaminázu molekulu apolipoproteíny,
FR93/05125), potláčajúce (FR93/04745), konkrétne (WO91/19813), atď.
orientáciou proti sekvencia, ktorých kontrolovať expresiu alebo sekvencia sa môže (Fab,
Terapeutickým zmyslu expresia v transkripciu bunkovej transkribovať v cieľovej mRNA, ktorá potom blokuje patente EP 140308.
bunke do RNA komplementárna k bunkovej transláciu na proteín, čo sa opísalo v
Požadovaná nukleová kyselina môže byť tiež vakcinačný (očkovací) gén, t. j. taký gén, ktorý kóduje antigénny peptid, schopný vyvolať imunitnú odpoveď v človeku alebo zvierati, s ohľadom na tvorbu vakcín. Takýto antigénny peptid môže byť napr. špecifický pre vírus Epstein-Barrovej, vírus HIV, vírus hepatitídy B (pozri EP 185573) alebo vírus pseudorabies, alebo to tiež môžu byť nádorovo špecifické peptidy (EP 259212).
Všeobecne je v plazmidoch s génmi terapeuticky, vakcinačne, poľnohospodársky alebo veterinárne významnou nukleovou kyselinou tiež promótor transkripcie, ktorý je funkčný v cieľovej bunke alebo organizme (t. j. v cicavcovi a osobitne v človeku) a tiež úsek lokalizovaný na 3'-konci, ktorý špecifikuje terminačný signál transkripcie a polyadenylačné miesto.
Pokial sa týka promótorového úseku, môže to byť promótorový úsek prirodzene zodpovedajúci za expresiu požadovaného génu, pokiaľ je takýto promótorový úsek schopný funkcie v hostiteľskej bunke alebo organizme. Promótorove úseky rôzneho pôvodu (zodpovedajúce za expresiu iných proteínov, alebo dokonca syntetické úseky) sú ďalšie možnosti. Promótorové úseky môžu byť osobitne promótorové sekveňcie eukaryotických alebo vírusových génov, napr. to môžu byť promótorové sekveňcie pochádzajúce z genómu cieľovej bunky. Z eukaryotických promótorov je možné použiť akýkoľvek promótor alebo odvodenú sekvenciu, ktorý stimuluje alebo potláča transkripciu génu špecificky alebo nešpecifický, indukovatelne alebo neindukovateľne, silne alebo slabo. K možným promótorom patria všeobecne rozšírené promótory (HPRT, PGF, α-aktin, tubulín, a pod.), promótory intermediárnych vláken (promótory génov pre GFAP, desmín, vimentín, neurofilament, keratín, a pod.), promótory terapeutických génov (ako je napr. promótor génu MDR, CFTR, faktora VIII, ApoAI a pod.), tkanivové špecifické promótory (ako napr. promótory génov pre pyruvátkinázu, vilin, intestinálny proteín viažuci mastné kyseliny, α-aktín v hladkých svaloch a ďalšie) alebo pripadne promótory, ktoré odpovedajú na určitý stimul (receptory steroidných hormónov, receptor kyseliny retinovej a pod.), podobne môžu byť promótorové sekveňcie pochádzajúce z vírusového genómu, ako sú napr. promótory adenovírusových génov E1A a MLP, skorý promótor CMV alebo prípadne promótor LTR RSV alebo LTR MMTV a ďalšie. Navyše tieto promótorové úseky môžu byť modifikované tým, že sa pridajú aktivačné alebo regulačné sekveňcie, alebo sekveňcie umožňujúce tkanivovo špecifickú alebo prevládajúcu expresiu.
Okrem toho požadované gény môžu tiež obsahovať signálnu sekvenciu, ktorá smeruje syntetizovaný produkt do sekrečnej dráhy cieľovej bunky. Takáto signálna sekvencia môže byť prirodzená signálna sekvencia syntetizovaného produktu, ale môže to byť tiež iná funkčná signálna sekvencia alebo umelá signálna sekvencia.
V závislosti od toho, akú nukleovú kyselinu požadujeme, metylovaná DNA podľa predkladaného vynálezu sa môže použiť na liečenie alebo prevenciu mnohých chorôb, vrátane genetických porúch (ako je napr. dystrofia, cystická fibróza atď.), neurodegeneratívnych chorôb (Alzheimerova alebo Parkinsonova choroba, ALS a pod.), rakoviny, chorôb spojených s vírusovou infekciou (hepatitída, AIDS a pod.), alebo sa môže použiť v poľnohospodárstve alebo veterinárnom lekárstve.
Metylovaná plazmidová DNA podľa predkladaného vynálezu je osobitne výhodná na liečenie chorôb, keď je potrebná trvalá expresia bez imunologickej reakcie, osobitne teda v genetike a v odbore neurodegeneratívnych a kardiovaskulárnych porúch a chorôb.
Ako sa už uviedlo v predchádzajúcom texte, spôsob podľa predkladaného vynálezu používa hostiteľskú bunku obsahujúcu kazetu na expresiu DNA metyltransferázy, ktorá umožňuje, že sa metylujú cytozínové zvyšky v dinukleotidoch 5'-CG-3'.
Po syntéze DNA sú niektoré puríny alebo pyrimidíny modifikované chemicky, napr. metyláciou. Tak napr. niektoré DNA obsahujú 5-metylcytozin alebo N6-metyladenín. Tieto modifikácie sa uskutočňujú prostredníctvom DNA metyltransferáz, udržiavacích alebo de novo enzýmov, ktoré prenášajú metylovú skupinu s Sadenozyl-L-metioninu na adenínový alebo cytozínový zvyšok, ktoré môžu byť umiestnené v špecifických polohách sekvencie. Tak napr. sú dobre známe dve metyltransferázy z E. coli, DNA metyltransferáza dam, ktorá metyluje adenozínový zvyšok ležiaci vo vnútri sekvencie 5'-GATC-3' a DNA metyltransferáza dcm, ktorá metyluje druhý cytidinový zvyšok v sekvencii 5'-CCA/TGG-3'. Ďalšie metylázy sa skúmali v baktériách, kde metylujú zvyšky nachádzajúce sa v rozpoznávacích miestach pre reštrikčné enzýmy. Napr. enzým M.Hpalľ metyluje cytozínový zvyšok v sekvencii 5'CCGG-3'.
Väčšina jednoduchých eukaryotických organizmov a väčšina bezstavovcov obsahujú relatívne málo metylcytozínu a N6-metyladenínu. Avšak metylácia báz u stavovcov je omnoho častejšia a v takom prípade je najčastejšou metylovanou bázou 5-metylcytozín. Viac ako 95% metylových skupín v DNA stavovcov sa objavuje na C zvyškoch nie veľmi hojného dinukleotidu 5'-CG~3' (frekvencia výskytu dinukleotidu 5'-CG-3' je v cicavčích sekvenciách veľmi nízka, je 0,8%, aj keď zastúpenie GC párov je omnoho vyššie, v priemere 40% a pritom náhodné usporiadanie by malo viesť k 4% frekvencii dinukleotidu 5'-CG-3'. Pritom viac ako 50% všetkých dinukleotidov môže byť metylovaných. Existencia radu dôkazov vedie k predstave, že stupeň metylácie niektorých sekvencii obsahujúcich dinukleotid 5'-CG-3' by mohol byť rozhodujúci faktor v regulácii expresie určitých génov v cicavcoch, na inaktiváciu X chromozómu, v onkogenéze (1993, DNA Methylation: Molecular Biology and Biological Significance, Ed. Jost a Saluz) a tiež pre dedičné choroby (Bates a kol. 1994, BioEssays 16, 277).
Predkladaný vynález používa kazetu na expresiu metyltransferázy, ktorá umožňuje, že cytozínové zvyšky v dinukleotidoch 5'-CG-3' sú metylované. Výsledkom je metylovaná DNA, čo v zmysle predkladaného vynálezu špecificky znamená DNA metylovanú na cytozínových zvyškoch v dinukleotidoch 5'-CG-3' . Výhodne použitá DNA metyltransferáza metyluje cytozínové zvyšky v dinukleotidoch 5'-CG-3', takže vôbec neovplyvňuje adenínové zvyšky alebo cytozínové zvyšky ležiace v inom kontexte ako v dinukleotidoch 5'-CG-3'. Výhodne metylovaná DNA je plazmidová DNA, v ktorej je viac ako 50% cytozínových zvyškov ležiacich v dinukleotidoch 5'-CG-3' metylovaných. Výhodnejšie je metylovaných aspoň 80% a najvýhodnejšie je metylovaných 90% uvedených zvyškov.
Metylácia plazmidovej DNA sa môže overiť rôznymi spôsobmi. Metylácia sa môže overiť štiepením izolovanej plazmidovej DNA s reštrikčnými enzýmami, ktoré nie sú schopné štiepiť, pokial štiepne miesto obsahuje cytozínový zvyšok v dinukleotidoch 5'-CG3' , ktorý je metylovaný. Je potrebné napr. uviesť enzýmy Hpall, AatlI a BstBI. Metylácia môže byť tiež stanovená chromatograficky. Napr. množstvo nemetylovaného plazmidu v preparáte metylovaného plazmidu sa stanovilo nasledovným spôsobom: 1% alebo 5% nemetylovaného plazmidu úplne štiepeného s Hpall sa pridalo k neštiepenému nemetylovanému plazmidu. Tieto vzorky spoločne s metylovaným plazmidom štiepeným s Hpall sa analyzovali anexovou kvapalinovou chromatografiou s detekciou pri 260 nm, čo umožnilo oddeliť nenaštiepenú DNA od štiepenej DNA a kvantifikovať ju. Zistilo sa, že metylovaný plazmid obsahoval menej ako 5% nemetylovanej plazmidovej DNA, inými slovami, viac ako 95% plazmidovej DNA sa metylovalo.
Výhodný spôsob podľa predkladaného vynálezu sa vyznačuje tým, že DNA metyltransferáza prednostne metyluje cytozinové zvyšky v dinukleotidoch 5'-CG-3'.
Výhodne pri spôsobe podľa predkladaného vynálezu je v ako 50% cytozinových zvyškov ležiacich v 5'-CG-3' metylovaných. Výhodnejšie je metylovaných a najvýhodnejšie je metylovaných viac zvyškov ležiacich v dinukleotidoch plazmidovej DNA viac dinukleotidoch viac ako 80% ako 90% cytozinových plazmidovej DNA.
5'-CG-3'
Niekoľko cicavčích DNA metyltransferáz, ktoré metyláciu cytozínového zvyšku ležiaceho v dinukleotide charakterizovalo a zodpovedajúce .gény sa klonovali,
Mol. Biol. 203, 971) sa už umožňujú
5'-CG-3', ako napr.
alebo enzým z myši (Bestor a kol. 1988, J. človeka (Yen a kol. 1992, Nucl. Acids enzýmy majú molekulovú hmotnosť medzi 135 hemimetylovanú DNA zrejme znamená, že Progress in Nucleic
Homologický enzým v metyláza M.SssI zo cytozinové zvyšky porovnateľnou rýchlosťou, bez ohľadu na to, hemimetylovaný alebo nemetylovaný (Razin a kol. 313, 243, Baker a kol.
Res. 20, 2287). Tieto a 1.75 kDa. Metylujú nemetylovanú DNA, čo (Smith omnoho rýchlejšie ako o udržiavacie metylázy
Research and Molecular Biology coli neexistuje. Na rozdiel
Spiroplasma metyluje výhradne v akomkoľvek dinukleotide ide
Acid
49,
1994,
E.
od toho úplne
5'-CG-3' či je
1992 substrát
FEBS Lett
Tento enzým enzýmu je 42 a kol. 1990 sa z kmeňa kDa a
Nucl.
1993, Biochim. Biophys.
sp. MQ1. Molekulová hmotnosť a exprimoval v E. coli (Razin 1145, EP 0412676A1 Derwent
Acta 196, 864).
91045812) .
Výhodne sa
Spiroplasma sa klonoval gén
Acids Res. 18,
DNA metyltransferáza vyberie zo skupiny obsahujúcej metylázu M.Sssľ, myšaciu metylázu a ľudskú metylázu. Výhodnejšie sa použije metyláza M.Sssľ.
Kazeta na expresiu DNA metyltransferázy všeobecne obsahuje nukleovú kyselinu kódujúcu DNA metyltransferázu, ktorá umožňuje metyláciu cytozínového zvyšku ležiaceho v dinukleotide 5'-CG-3', a ktorá je riadená promótorom. Promótor použitý na tento účel môže byť akýkoľvek promótor, ktorý je funkčný vo vybranej hostiteľskej bunke. Môže to teda byť promótor definovaný už v prechádzajúcom texte. V prípade prokaryotickej hostiteľskej bunky je treba uviesť osobitne promótor laktózového operónu (Plač) a tryptofánového operónu (Ptrp), hybridný promótor Plac/Ptryp, promótory PL alebo PR bakteriofága lambda alebo promótor génu tetA (Vectors 1988, 179, Rodriguez a Denhardt, eds.) a ďalšie.
Vo výhodnom uskutočnení predkladaného vynálezu sa použije promótor, ktorý sa líši od promótora, ktorý je zodpovedný za expresiu požadovanej nukleovej kyseliny v plazmidovej DNA. Je osobitne výhodné použiť indukovatelný promótor, ktorý umožňuje riadiť expresiu metylázy. Takýto indukovatelný promótor môže byť napr. promótor z bakteriofága T7 alebo promótor Plač.
Výhodne obsahuje expresná kazeta tiež terminačný signál transkripcie (transkripčný terminátor) ako je napr. terminátor ribozómu.
Kazeta na expresiu DNA metyltransferázy môže byť nesená replikatívnym vektorom alebo sa môže integrovať do genómu hostiteľa.
V prípade replikatívneho vektora je výhodné použiť vektor, ktorý je kompatibilný s GT plazmidom, čiže ktorý je schopný koexistencie v rovnakej bunke. Dva odlišné plazmidy sa môžu replikovať v rovnakej bunke, ak replikácia každého plazmidu je riadená odlišným spôsobom. Takže v tomto zmysle kompatibilné plazmidy patria do dvoch inkompatibilných skupín. Teraz je známych asi 30 inkompatibilných skupín plazmidov, ktoré sa replikujú v enterobaktériách (Maas a kol. 1988, Microbiol·. Rev. 52, 375). Existuje teda mnoho možností na replikáciu dvoch plazmidov v tej istej bunke a v literatúre sa doteraz opísalo niekoľko príkladov. Ako príklad je možné uviesť súčasnú replikáciu (koreplikáciu) plazmidov odvodených z ColEl spoločne s plazmidmi, ktoré majú replikón R6K alebo pl5A alebo RSF1010 alebo RK2, ďalej koreplikáciu plazmidov odvodených z RK2 s plazmidmi odvodenými z R6K alebo RSF1010 alebo pSa alebo ColEl (Vectors 1988, Rodriguez a Denhardt, eds.). Tento zoznam nie je obmedzujúci a ďalšie príklady sú opísané v publikácii Vectors, 1988, Rodriguez a Denhardt. Výhodne použitý replikatívny vektor sa počtom kópií v hostitelskej bunke odlišuje od GT plazmidov. Teda vektor nesúci gén kódujúci metylázu, ktorej expresia je indukovatelná, je vektor s nízkym počtom kópií (odvodený napr. z vektorov pACYC184 alebo RK2) , zatiaľ čo GT plazmid je plazmid s vysokým počtom kópií (odvodený od ColEl) . Je tiež možné klonovať do GT plazmidu sekvenciu, ktorá umožní vytvorenie trojzávitnice sekvencie s vhodným oligonukleotidom, takže GT plazmid sa potom môže oddeliť od druhého plazmidu afinitnou purifikáciou.
Kazeta na expresiu DNA metyltransferázy sa môže tiež integrovať do genómu hostiteľskej bunky. Integrácia sa môže uskutočniť homologickou rekombináciou za predpokladu, že expresná kazeta je obklopená priľahlými fragmentmi neesenciálneho génu hostiteľského genómu a že je klonovaná do plazmidu, ktorý sa nemôže replikovať v danom hostiteľovi. Takýto plazmid môže byť:
I) derivát ColEl v kmeni E. coli polAts (Gutterson a kol. 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4894),
II) teplotné citlivý derivát pSCIOl a akokoľvek kmeni E. coli (Kushner a kol. 1989, J. Bacteriol. 171, 4617),
III) sebevražedný vektor ako je M13mpl0 v kmeni E. coli sup+ (Blum a kol. 1989, J. Bacteriol. 171, 538) alebo
IV) plazmid obsahujúci počiatok g z R6K a akomkoľvek kmeni neobsahujúcom gén pir (Filutowicz a kol 1994, Prog. Nucl. Acid Res. and Mol. Biol. 48, 239).
Expresná kazeta môže byť vnesená do hostiteľskej bunky pred plazmidovou DNA, po nej alebo súčasne s ňou. V prípade integratívnej kazety sa všeobecne vnáša dopredu a bunky obsahujúce uvedenú kazetu sa potom selektujú a použijú na prípravu plazmidovej DNA.
Zvláštnym aspektom predkladaného vynálezu je expresia génu kódujúceho metylázu M.SssI v bakteriálnych bunkách (osobitne v E. coli) obsahujúcom GT plazmid. Ako je ukázané v príkladoch, uvedený plazmid má potom metylované cytozíny v dinukleotidoch 5'CG-3' . Konkrétnejšie je GT plazmid transformovaný do kmeňa E. coli mcrA mcrM D(mcrC-mrr) ktorý už obsahuje plazmid nesúci gén, ktorý kóduje metylázu M.Ssil a ktorý je kompatibilný s GT plazmidom. Počas rastu baktérie obidva plazmidy koexistujú, replikujú sa a sú metylované (Gottschlich a kol., J'. Bacteriol. 173, 5793).
Plazmidová DNA alebo expresná kazeta sa môžu vniesť do hostiteľskej bunky ľubovoľnou technikou známou odborníkovi (transformáciou, transfekciou, konjugáciou, elektroporáciou, pulznou metódou, precipitáciou a pod.). Transformácia sa môže uskutočniť osobitne spôsobom pomocou CaC12 (Dagert a Ehrlich, Gene 6, 1979, 23) alebo spôsobom, ktorý vyvinuli Hanahan a kol. (J. Mol. Biol. 166, 1983, 557) alebo akýmkoľvek ďalším spôsobom odvodených z predchádzajúcich (Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989) a tiež elektrotransformáciou (Wirth a kol., Mol. Gen. Genet. 216, 1989, 175) alebo pomocou TSB (transformation and storage buffer, Chung a kol., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 3580). Pozri tiež všeobecné techniky v molekulovej genetike uvedené v ďalšom texte.
Metylovaná plazmidová DNA môže purifikovať ktoroukoľvek (precipitáciou, chromatografiou, pod.). V zvláštnom prípade, ak sa expresiu metyltransferázy, vynálezu sa odborníkovi dialýzou a podľa predkladaného z metód známych centrifugáciou, použije replikatívny vektor na musí sa GT plazmid navyše oddeliť od uvedeného vektora. Na to sa môžu použiť viaceré spôsoby, založené na rozdiele vo veľkosti alebo hmotnosti uvedených dvoch plazmidov alebo v tom, že sa štiepi vektor v reštrikčných miestach prítomných iba vo vektore a nie v GT plazmide.
Osobitne výhodný spôsob purifikácie je založený na afinite medzi špecifickou sekvenciou prítomnou v GT plazmide a imobilizovaným oligonukleotidom. Takýto spôsob purifikácie využívajúci trojzávitnicové štruktúry sa podrobne opísal v prihláškach FR96/03519 a FR94/15162, na ktoré sa týmto odvolávame.
Osobitne to, vynálezu je vynálezu vedie promótorom, aká plazmidom. Takáto imunitnú stimuláciu spojenú s bakteriálnou DNA výhodným že sa výsledkom plazmidová DNA rovnako dobrej uskutočnenia metylovaná expresii dosahuje s rovnakým metylovaná plazmidová DNA ale predkladaného spôsobom podlá génu riadenej nemetylovaným nemala vyvolať by a predstavuje teda výhodu na použitie v nevírusovej génovej terapii.
Metylovaná plazmidová DNA podľa predkladaného vynálezu sa môže použiť na akékoľvek očkovanie alebo génovú terapiu s akýmkoľvek génom, na prenos génu do tela, tkaniva alebo určitej bunky. Osobitne sa môže použiť na priame podávanie in vivo alebo na modifikácie buniek in vitro alebo ex vivo na ich implantáciu pacientovi. V tejto súvislosti molekuly podľa predkladaného vynálezu sa môžu použiť také ako sú (vo forme nahej DNA), alebo v kombinácii s rôznymi syntetickými alebo prirodzenými chemickými alebo biochemickými vektormi. K vhodným vektorom patria zvlášť katióny (fosforečnan vápenatý, DEAE-dextrán a pod.), ktoré pôsobia tak, že vytvárajú s DNA zrazeninu, ktorá môže byť fagocytózou pohltená do bunky. K ďalším vektorom patria lipozómy, do ktorých je molekula DNA vložená a ktoré fúzujú s plazmatickou membránou. Syntetické vektory na prenos génov sú zvyčajne všeobecne katiónové lipidy alebo polyméry, ktoré vytvárajú komplexy s DNA a vytvárajú tak častice, ktoré nesú na povrchu pozitívny náboj. Tieto častice sú schopné interagovať s negatívnymi nábojmi na povrchu bunkovej membrány, ktorou sú potom schopné prejsť. Ako príklady takýchto vektorov možno uviesť DOGS (Transfectam™) alebo DOTMA (Lipofectin™).
Pripravili sa tiež chimérne proteíny: skladajú sa z polykatiónovéj časti, ktorá kondenzuje DNA a táto časť je spojená s ligandom, ktorý sa viaže na membránový receptor a umožňuje vznik komplexu v bunkách prostredníctvom endocytózy. Molekuly DNA podlá vynálezu sa tiež môžu použiť na prenos génov do buniek fyzikálnymi metódami transfekcie, ako je napr. bombardovanie mikročasticami, elektroporácia a pod.
Navyše sa môžu molekuly terapeutickým použitím prípadne štiepením.
podľa vynálezu pred ich linearizovať, napr. enzýmovým vynálezu sa týka akéhokoľvek obsahuje metylovanú plazmidovú Táto DNA môže
Ďalší predmet predkladaného farmaceutického prípravku, ktorý DNA, ktorá bola definovaná v predchádzajúcom texte, byť buď nahá alebo kombinovaná s chemickým alebo biochemickým vektorom na transfekciu. Farmaceutické prípravky podľa vynálezu parenterálne, subkutánne, Výhodne je , ktorú možno sa môžu formulovať na topické, perorálne, ] intravenózne, intramuskulárne, transdermálne a ďalšie podávanie, injikovatelnej forme alebo vo forme, sa zmiešať s akýmkoľvek farmaceutický injekčné miesta, ktoré sa má izotonický sterilný prípravok, ktorý po roztoku umožní vytvorenie roztoku na injekciu, konkrétne pufre obsahujúci Tris alebo PBS glukózy alebo chloridu sodného. Priama kyseliny do zasiahnutej oblasti je výhodná, terapeutický účinok nukleovej kyseliny, rôznych faktoroch vektore, liečenia.
intranazálne, intraokulárne, molekula DNA v aplikovať. Môže nosičom na prijateľným podávanie, osobitne na priame injikovanie do' ošetriť. Takýmto nosičom je konkrétne napr. roztok, alebo suchý, konkrétne lyofilizovaný pridaní sterilnej vody alebo fyziologického K príkladom patria nariedené v roztoku injekcia nukleovej pretože umožňuje, aby bol koncentrovaný v príslušnom tkanive. Dávky ktoré sa použijú sa upravia v závislosti na a osobitne v závislosti na použitom géne, spôsobe podávania, liečenom stave a požadovanom čase
Predkladaný vynález je podrobnejšie a úplnejšie opísaný pomocou nasledujúcich príkladov, ktorých funkcia je ilustrovať vynález a vôbec ho neobmedzovať.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1. Mapa plazmidu pXL2784
Obr. 2. Reštrikčná mapa plazmidu pXL2784
Obr. 3. Profil štiepenia plazmidov:
- pXL2784
- metylovaný pXL2784
- metylovaný pXL2784 + metylovaný pAIT2
- metylovaný pAIT2, štiepený enzýmami:
A-AatlI,
B-BstBI
C-HindlII
D-Hpall
E-EcoRI (M je 1 kb rebríkový marker molekulovej hmotnosti).
Niektoré všeobecné techniky molekulovej biológie a klonovania
Štandardné metódy molekulovej biológie, ako je napr. centrifugácia plazmidovej DNA v gradiente chloridu cézneho a etídiumbromide, štiepenie reštrikčnými enzýmami, gélová elektroforéza, elektroelúcia fragmentov DNA z agarózového gélu, transformácia E. coli, precipitácia nukleových kyselín a ďalšie, sú opísané v odbornej literatúre (Maniatis a kol. 1989, Ausubel a kol. 1987) .
Nukleotidové sekvencie sa stanovili terminačnou metódou podlá protokolu, ktorý publikovali Ausubel a kol. (1987).
Použité reštrikčné enzýmy sa kúpili od firiem New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) alebo Amersham Ltd. (Amersham).
Na ligáciu sa fragmenty DNA oddelili podlá veľkosti v 0,7% agarózovom géli alebo v 8% akrylamidovom géli, purifikovali elektroforézou a potom elektroelúciou, extrahovali fenolom, zrážali etanolom a potom inkubovali v 50mM Tris-HCl, pH 7,4 s lOmM MgCl2, lOmM DTT, 2mM ATP v prítomnosti T4 DNA ligázy (Biolabs).
Oligonukleotidy sa syntetizovali fosforamiditovou technológiou, pričom fosforamiditové deriváty sa chránili v βpolohe kyanoetylovou skupinou (Sinha a kol 1984, Giles 1985) pomocou automatického syntetizačného zariadenia DNA/RNA Synthetizer Applied Biosystems 394 podľa odporučenia výrobcu.
V bakteriologickej práci sa použili médiá LB a 2xTY (Maniatis a kol. 1989).
Plazmidové DNA sa purifikovali tiež pomocou alkalickej lýzy (Maniatis a kol. 1989).
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Opis GT plazmidu
Odborníkom je známy rad kaziet na eukaryotickú expresiu, ktoré sú nesené plazmidmi replikujúcimi sa v baktérii E. coli. Takéto kazety môžu exprimovať reportérové gény, ako je napr. gén E. coli kódujúci β-galaktozidázu alebo gén pre chloramfenikolacetyltransferázu z transpozónu Tn9, alebo gén pre luciferázu, alebo gény vhodné na génovú terapiu. Tieto kazety obsahujú promótor, ktorý je vírusového alebo eukaryotického pôvodu. Takéto expresné systémy sú buď tkanivovo špecifické, alebo sa môžu exprimovať všeobecne. Kazeta použitá v tomto príklade obsahuje gén luc, kódujúci luciferázu z Photinus pyralis a promótor CMV, intermediátny promótor/enhancer ľudského cytomegalovírusu. Gén luc obsahuje 4,78% dinukleotidu 5'-CG-3' a vírusový promótor pCMV ich obsahuje 5%. Avšak toto zastúpenie je relatívne vysoké vzhľadom na nízku frekvenciu dinukleotidov 5'-CG-3' v sekvenciách cicavcov, kde je 0,8%. V prítomnosti metylázy (ako je napr. metyláza M.SssI alebo CpG metyláza, ktoré sú endogénne pre cicavce) promótor pCMV a gén luc sa môžu vysoko metylovať. Táto expresná kazeta sa klonovala do plazmidu pXL2784, ktorý sa replikuje v E. coli a ktorého mapa je uvedená na obr. 1. Tento plazmid má veľkosť 6390 bp a obsahuje 5,8% dinukleotidov 5'-CG3'.Plazmid pXL2784 sa konštruoval z vektora pXL2675 (2,513 kb) , minimálneho replikónu ColEl z plazmidu Bluescript (Ori) a má ako selektovateľný marker gén kódujúci rezistenciu voči kanamycinu z transpozónu Tn5. Plazmid pXL2784 tiež obsahuje TH sekvenciu (GAA)i7, ktorá sa môže viazať k oligoméru (CTT)n, kde n=l až 17, čím sa vytvára lokálna trojzávitnicová štruktúra, ktorá umožňuje afinitnú purifikáciu. Plazmid pXL2784 má lokus cer (382 bp) pochádzajúci z ColEl, tento lokus cer obsahuje miestne-špecifickú sekvenciu pre rekombinázu XerC/XerD a vedie k rozlíšeniu plazmidových dimérov (Summers a kol. 1988, EMBO J. 7, 851).
Transgén klonovaný do tohto plazmidu pXL2784 je expresná kazeta (3,3 kb) pre gén luc kódujúci luciferázu z Photinus pyralis (pochádzajúci z plazmidu Promega pGL2 basic) riadená jednotkou promótor/enhancer ľudského cytomegalovírusu pCMV (pochádzajúci z plazmidu Invitrogen pcDNA3).
Príklad 2
Konštrukcia kazety na expresiu DNA metylázy
Tento príklad opisuje štruktúru kazety na expresiu metylázy
M.SssI zo Spiroplasma sp. MQ1. Je samozrejmé, že podľa rovnakého princípu by sa postupovalo pri konštrukcii kazety na expresiu ktoréhokoľvek enzýmu podľa predkladaného vynálezu.
Expresná kazeta obsahuje gén zo Spiroplasma sp. MQ1 kódujúci metylázu M.SssI, ktorej expresia je riadená promótorom Plač. Takže v prítomnosti IPTG (Izopropyl^-D-tiogalaktozid) je metyláza syntetizovaná a je aktívna (Gottschlich a kol. 1991, J. Bacteriol 173, 5793) .
Táto kazeta je prítomná v plazmide pAIT2, ktorý má replikón pACYC184 a navyše nesie gén z transpozónu Tn903 kódujúci rezistenciu voči lividomycínu, ktorý umožňuje selekciu transformovaných hostiteľských buniek.
Príklad 3
Príprava plazmidu pXL2784 s metylovanými cytozínovými zvyškami dinukleotidov 5'-CG-3'.
Metylázou M.SssI zo Spiroplasma Sp. MQ1 sú metylované všetky cytozínové zvyšky v dinukleotidoch 5'-CG-3' plazmidu pXL2784. Spôsob metylácie podľa predkladaného vynálezu využíva tento enzým z plazmid je metylovaný v priebehu prípravy v baktérii.
Na tento účel sa kmeň E. coli ER 1821, ktorý má genotyp F’ľ endAl thil supE44 mcrA5 D(mrr-hsdRMS-mcrB)1-::IS10 a nesie plazmid pAIT2, transformovaný TSB metódou (transformation and storage buffer, Chung a kol. 1988, Nucleic Acids Research 16, 3580) plazmidom pXL2784. Transformanty sa selektovali na médiu LB obsahujúcom 50 mg/1 kanamycínu a 100mg/l lividomycínu, aby sa selektovali pXL2784 nesúci gén rezistencie voči kanamycínu z transpozónu Tn5 a pAIT2 nesúci gén rezistencie voči lividomycínu z transpozónu Tn903. Keď sa transformanty ER1821 pAIT2 pXL2784 kultivovali v médiu LB s 50 mg/1 kanamycínu a 100mg/l lividomycínu a 2,5mM IPTG pri 37 °C 15 hodín, extrahovaný plazmid bol metylovaný.
Metylácia sa overila štiepením izolovanej plazmidovej DN s reštrikčnými enzýmami Hpall, AatlI a BstBI. Integrita a prítomnosť obidvoch plazmidov sa overila štiepením preparátu DNA reštrikčnými enzýmami HindlII a EcoRI, ako je uvedené na obr. 2. Reštrikčné enzýmy Hpall, AatlI a BstBI sú tri enzýmu, ktoré nie sú schopné štiepiť, ak cytozínové zvyšky v dinukleotidoch 5'-CG3' nachádzajúcich v štiepnom mieste sú metylované. V promótore pCMV podlá mapy existujú štyri rozpoznávacie miesta AatlI, v géne luc sú dve miesta pre BstBI a jedenásť rozpoznávacích miest Hpal, pričom tento enzým Hpal štiepi plazmid pXL2784 na 30 fragmentov. Na fotografii agarózového gélu zafarbeného s etídiumbromidom (obr. 3) je vidieť, že v prípade metylovaného plazmidu pXL2784 purifikovaného afinitnou chromatografiou (pozri príklad 4) nedochádza k žiadnemu štiepeniu enzýmami Hpall. AatlI a BstBI, zatiaľ čo štiepenie enzýmami HindlII a EcoRI poskytuje profil, ktorý možno očakávať podľa reštrikčnej mapy. Kontrolné štiepenie plazmidu pXL2784 enzýmami Hpall, AatlI a BstBI poskytlo tiež profil, ktorý možno očakávať podľa reštrikčnej mapy.
Výsledky jasne ukazujú, že extrahovaná plazmidová DNA je metylovaná na cytozínových zvyškoch v dinukleotidoch 5'-CG-3'. Výsledky navyše ukazujú, že metylácia ovplyvňuje viac ako 90% takýchto cytozínových zvyškoch.
Príklad 4
Použitie metylovaných plazmidov na prenos genetického materiálu
Tento príklad ukazuje, že metylovaná plazmidová DNA podľa predkladaného vynálezu si uchová svoju kapacitu transfekovať bunky, replikovať sa v nich a exprimovať v nich požadovaný gén.
A. Protokol na prípravu roztokov na transfekciu
V porovnávacej štúdii sa použili dve skupiny plazmidov:
a) pXL2784
b) metylovaný pXL2784
Metylovaný pXL2784 sa získal vo forme zmesi s pAIT2, ktorý spôsoboval jeho metyláciu po kotransformácii baktérií. Uskutočnila sa frakcionácia afinitná chromatografia, aby bol požadovaný plazmid vyčistený. Použitý spôsob čistenia sa opísal v prihláške FR94/15162. Uskutočnil sa krok, kde sa uskutočňuje dialýza proti 0,15M NaCl aby sa odstránil pufor tvoriaci elučnú fázu v kolóne.
Pokiaľ sa plazmid pXL2784 použil ako referenčný, purifikoval sa rovnakým spôsobom, ako je opísané vyššie.
V tomto príklade sa ako vektor použil, katiónový lipid RPR120535A, ktorý je opísaný v prihláške FR95/13490. Pritom je samozrejmé, že je možné na prenos použiť akýkoľvek iný chemický alebo biochemický vektor.
Transfekčné roztoky sa pripravili zo zmesi rovnakých objemov DNA s koncentráciou 30 μς/ml a 90μΜ vodného roztoku katiónového lipidu RPR1200535A, takže pomer katiónový lipid/DNA bol 3 nmol katiónového lipidu/1 μς DNA. Po homogenizácii vortexom a aspoň 15 minútovej inkubácii pri teplote miestnosti sa roztok DNA/lipofektant distribuoval v pomere 4,8% (objemových) do jamiek, kde boli bunky opláchnutí médiom bez proteínu (t. j. bez séra) a potom sa ponechali rásť počas transfekcie v médiu bez séra.
B. Transfekčný protokol
Vzorky obsahujúce lxlO5 buniek (NIH3T3, t. j. myšacích fibroblastov a HeLa, t.j. buniek ľudského karcinómu maternice) v exponenciálnej fáze rastu na 2 cm2 (500 μΐ média bez séra na jamku) sa ošetrili 25 μΐ transfekčného roztoku, čo zodpovedalo 0,375 μg DNA na lx 105 buniek. Po 2 hodinovej inkubácii pri 37 °C vo zvlhčovanej atmosfére s 5% C02 sa do rastového média pridalo teľacie fetálne sérum, takže jeho výsledná koncentrácia bola 8% (objemová).
hodín po transfekcii sa bunky opláchli s PBS a lyžovali pufrom obsahujúcim 1% TritonX-100 a 2mM DTT. Aktivita exprimovanej luciferázy sa merala 10 sekúnd ako emisia svetla (RLU - relatívna jednotka svetla) v prítomnosti luciferínu, koenzýmu A a ATP a vyjadrená na mg proteínu extrahovaného lyzovacím pufrom.
C. Výsledky
Výsledky získané postupmi opísanými v predchádzajúcich odsekoch sú uvedené v nasledovnej tabuľke.
| Bunky | Bunky | NIH 3T3 | Bunky | HeLa |
| Plazmid | pXL2784 | PXL2784CH3 | pXL2784 | PXL2784CH3 |
| Purifikované afinitnou | 2 x 1O10 | 2,2 x 1O10 | 3,1 x 1O10 | 1,7 x 1O10 |
| chromatografiou | + /- 4% | +/- 10% | +/- 15% | +/- 11% |
| Purifikované dialýzou | 2,3 x 1O10 | 3,1 x 1O10 | 3,8 x 1O10 | 2,4 x 1O10 |
| +/- 21% | +/- 10% | +/- 14% | + /- 7% |
Enzýmová aktivita je vyjadrená v RLU/10 sekúnd/mg proteínu s variačným koeficientom v %, každý výsledok reprezentujú tri transfekčné pokusy.
Ak si uvedomíme význam koeficientu rozptylu v takomto type pokusu, je z výsledkov možno uzavrieť, že nie je žiadny významný rozdiel v expresii u dvoch použitých plazmidoch pri rovnakých podmienkach transfekcie. Okrem toho je luciferázová aktivita získaná s obidvoma purifikačnými postupmi rovnakého poriadku.
1. Postup prípravy DNA na použitie v génovej terapii, vyznačujúci sa tým, že uvedená DNA sa pripravuje v bunke obsahujúcej kazetu na expresiu DNA metyltransferázy, ktorá umožňuje metyláciu cytozínových zvyškov v dinukleotidoch
5'-CG-3'.
Claims (17)
- PATENTOVÉ NÁROKY
- 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že bunka je prokaryotická bunka.
- 3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že bunka je baktéria.
- 4. Spôsob podľa nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že expresná kazeta je nesená replikatívnym vektorom.
- 5. Spôsob podľa nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že expresná kazeta je integrovaná v genóme bunky.
- 6. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že expresná kazeta obsahuje nukleovú kyselinu kódujúcu DNA metyltransferázu, ktorá umožňuje aby cytozínové zvyšky v dinukleotidoch 5'-CG-3' boli metylované pod kontrolou promótora.
- 7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že promótor je indukovateľný promótor.
- 8. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že DNA metyltransferáza prednostne metyluje cytozínové zvyšky v dinukleotidoch 5'-CG-3'.
- 9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že DNA metyltransferáza je vybraná zo skupiny obsahujúcej metylázu M.SssI, myšaciu metylázu a ľudskú metylázu.
- 10. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že viac ako 50% cytozinových zvyškov v dinukleotidoch 5'-CG-3' plazmidovej DNA je metylovaných.
- 11. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že viac ako 80% cytozinových zvyškov v dinukleotidoch δ'-ΟΘ-β'' plazmidovej DNA je metylovaných.
- 12. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že viac ako 90% cytozinových zvyškov v dinukleotidoch 5'-CG-3' plazmidovej DNA je metylovaných.
- 13. Použitie plazmidovej DNA na prípravu farmaceutického prípravku na terapeutické alebo diagnostické použitie na ľudskom alebo zvieracom tele, keď viac ako 50% cytozinových zvyškov v dinukleotidoch 5'-CG-3' plazmidovej DNA je metylovaných.
- 14. Použitie plazmidovej DNA na prípravu farmaceutického prípravku na terapeutické alebo diagnostické použitie na ľudskom alebo zvieracom tele, keď viac ako 80% cytozinových zvyškov v dinukleotidoch 5'-CG-3' plazmidovej DNA je metylovaných.
- 15. Použitie plazmidovej DNA na prípravu farmaceutického prípravku na terapeutické alebo diagnostické použitie na ľudskom alebo zvieracom tele, keď viac ako 90% cytozinových zvyškov v dinukleotidoch 5'-CG-3' plazmidovej DNA je metylovaných.
- 16. Spôsob prípravy farmaceutického prípravku, na terapeutické alebo diagnostické použitie na ľudskom alebo zvieracom tele, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky, keď sa- pripraví DNA tak, že sa kultivujú bunky obsahujúce uvedenú DNA a kazetu na expresiu DNA metyltransferázy, ktorá umožňuje aby cytozínové zvyšky v dinukleotidoch 5'-CG-3' boli metylované,- získa uvedená DNA a- uvedená DNA obalí s farmaceutický prijateľným nosičom.
17 . Spôsob podľa nároku 16, v y z n a č u j ú c i sa tým, že DNA je plazmidová DNA obsahujúca nukleovú kyselinu s terapeutickým významom. 18. Spôsob podľa nároku 16, v y z n a č u j ú c i sa tým, že DNA je mini kruhová DNA obsahuj úca nukleovú kyselinu s terapeutickým významom. - 19. Prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje bakteriálnu DNA, v ktorej je aspoň 50% cytozinových zvyškov v dinukleotidoch 5'-CG-3' metylovaných.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9608327A FR2750704B1 (fr) | 1996-07-04 | 1996-07-04 | Procede de production d'adn therapeutique |
| PCT/FR1997/001116 WO1998001540A1 (fr) | 1996-07-04 | 1997-06-24 | Procede de production d'adn therapeutique |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK181498A3 true SK181498A3 (en) | 1999-07-12 |
Family
ID=9493705
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1814-98A SK181498A3 (en) | 1996-07-04 | 1997-06-24 | Method for producing therapeutic dna, application of plasmid dna for producing a pharmaceutical composition |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6410273B1 (sk) |
| EP (1) | EP0914418A1 (sk) |
| JP (1) | JP2000514293A (sk) |
| KR (1) | KR20000022488A (sk) |
| AU (1) | AU722909B2 (sk) |
| BR (1) | BR9710173A (sk) |
| CA (1) | CA2258792A1 (sk) |
| CZ (1) | CZ438298A3 (sk) |
| FR (1) | FR2750704B1 (sk) |
| IL (1) | IL127620A0 (sk) |
| NO (1) | NO986177L (sk) |
| SK (1) | SK181498A3 (sk) |
| WO (1) | WO1998001540A1 (sk) |
| ZA (1) | ZA975959B (sk) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7026468B2 (en) | 1996-07-19 | 2006-04-11 | Valentis, Inc. | Process and equipment for plasmid purification |
| US7807822B2 (en) | 1996-08-01 | 2010-10-05 | Robert Bridenbaugh | Methods for purifying nucleic acids |
| US7026155B2 (en) * | 1999-02-02 | 2006-04-11 | Regents Of The University Of California | Method of reducing bacterial proliferation |
| AU2001290984A1 (en) * | 2000-09-18 | 2002-04-02 | Genzyme Corporation | Expression vectors containing hybrid ubiquitin promoters |
| GB0025913D0 (en) * | 2000-10-23 | 2000-12-06 | Guldberg Per | Materials and methods relating to nucleic acid amplification and profiling |
| US20030152950A1 (en) * | 2001-06-27 | 2003-08-14 | Garner Harold R. | Identification of chemically modified polymers |
| US8765408B2 (en) | 2002-01-23 | 2014-07-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Prophage element-free bacteria |
| US6989265B2 (en) * | 2002-01-23 | 2006-01-24 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Bacteria with reduced genome |
| US8119365B2 (en) * | 2002-01-23 | 2012-02-21 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Insertion sequence-free bacteria |
| US8039243B2 (en) * | 2002-01-23 | 2011-10-18 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Insertion sequence-free bacteria |
| US20060270043A1 (en) * | 2002-01-23 | 2006-11-30 | Blattner Frederick R | Bacteria with reduced genome |
| US7303906B2 (en) | 2002-09-06 | 2007-12-04 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Competent bacteria |
| US20090191218A1 (en) | 2005-05-11 | 2009-07-30 | Fengchun Li | DNA Vaccines And Methods For The Prevention Of Transplantation Rejection |
| DE602006015373D1 (de) * | 2005-05-11 | 2010-08-19 | Univ Loma Linda | Zusammensetzungen und Verfahren zur Prävention und Behandlung von immunvermittelten Entzündungskrankheiten |
| CA2663026C (en) * | 2006-09-28 | 2013-04-16 | Loma Linda University | Apoptotic cell-mediated transfection of mammalian cells with interfering rna |
| GB0701253D0 (en) | 2007-01-23 | 2007-02-28 | Diagnostics For The Real World | Nucleic acid amplification and testing |
| EP3760226A1 (en) | 2011-09-23 | 2021-01-06 | Loma Linda University | Bacterial strains expressing methylase genes and uses thereof |
| US11680273B2 (en) | 2011-09-23 | 2023-06-20 | Loma Linda University | Treatment of autoimmune diseases |
| EP3921416A1 (en) * | 2019-02-06 | 2021-12-15 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Minicircle producing bacteria engineered to differentially methylate nucleic acid molecules therein |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
| US5693622A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-02 | Vical Incorporated | Expression of exogenous polynucleotide sequences cardiac muscle of a mammal |
| US5491060A (en) * | 1989-05-01 | 1996-02-13 | The University Of Maryland | Mutant strain of E. coli for detection of methyltransferase clones |
| EP0412676B1 (en) * | 1989-08-07 | 1995-06-07 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Method for producing the spiroplasma SP. DNA methylase |
| US5405760A (en) * | 1992-04-30 | 1995-04-11 | New England Biolabs, Inc. | Process for producing recombinant McrBC endonuclease and cleavage of methylated DNA |
| US5470740A (en) * | 1993-11-04 | 1995-11-28 | Life Technologies, Inc. | Cloned NsiI restriction-modification system |
| US5587305A (en) * | 1993-12-06 | 1996-12-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Agriculture | Pasteurella haemolytica transformants |
| FR2714830B1 (fr) | 1994-01-10 | 1996-03-22 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations. |
| CA2560114A1 (en) * | 1994-07-15 | 1996-02-01 | The University Of Iowa Research Foundation | Immunomodulatory oligonucleotides |
| FR2730637B1 (fr) | 1995-02-17 | 1997-03-28 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations |
| FR2739292B1 (fr) | 1995-09-28 | 1997-10-31 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition pharmaceutique utile pour la transfection d'acides nucleiques et ses utilisations |
| FR2741066B1 (fr) | 1995-11-14 | 1997-12-12 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques |
| FR2754272B1 (fr) | 1996-10-08 | 1998-11-13 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procede de preparation de compositions pour le transfert d'acides nucleiques |
| US6060245A (en) | 1996-12-13 | 2000-05-09 | Stratagene | Methods and adaptors for generating specific nucleic acid populations |
-
1996
- 1996-07-04 FR FR9608327A patent/FR2750704B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-06-24 JP JP10504844A patent/JP2000514293A/ja active Pending
- 1997-06-24 AU AU34475/97A patent/AU722909B2/en not_active Ceased
- 1997-06-24 BR BR9710173A patent/BR9710173A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-06-24 EP EP97930569A patent/EP0914418A1/fr not_active Withdrawn
- 1997-06-24 KR KR1019980710929A patent/KR20000022488A/ko not_active Ceased
- 1997-06-24 CA CA002258792A patent/CA2258792A1/fr not_active Abandoned
- 1997-06-24 CZ CZ984382A patent/CZ438298A3/cs unknown
- 1997-06-24 WO PCT/FR1997/001116 patent/WO1998001540A1/fr not_active Ceased
- 1997-06-24 SK SK1814-98A patent/SK181498A3/sk unknown
- 1997-06-24 IL IL12762097A patent/IL127620A0/xx unknown
- 1997-06-24 US US09/202,314 patent/US6410273B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-07-03 ZA ZA9705959A patent/ZA975959B/xx unknown
-
1998
- 1998-12-29 NO NO986177A patent/NO986177L/no not_active Application Discontinuation
-
2001
- 2001-12-28 US US10/037,488 patent/US20020187527A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1998001540A1 (fr) | 1998-01-15 |
| JP2000514293A (ja) | 2000-10-31 |
| ZA975959B (en) | 1998-01-30 |
| KR20000022488A (ko) | 2000-04-25 |
| AU722909B2 (en) | 2000-08-17 |
| NO986177L (no) | 1999-02-15 |
| US6410273B1 (en) | 2002-06-25 |
| IL127620A0 (en) | 1999-10-28 |
| US20020187527A1 (en) | 2002-12-12 |
| CZ438298A3 (cs) | 1999-04-14 |
| FR2750704A1 (fr) | 1998-01-09 |
| CA2258792A1 (fr) | 1998-01-15 |
| AU3447597A (en) | 1998-02-02 |
| FR2750704B1 (fr) | 1998-09-25 |
| EP0914418A1 (fr) | 1999-05-12 |
| BR9710173A (pt) | 1999-08-10 |
| NO986177D0 (no) | 1998-12-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK181498A3 (en) | Method for producing therapeutic dna, application of plasmid dna for producing a pharmaceutical composition | |
| Mayrhofer et al. | Use of minicircle plasmids for gene therapy | |
| JP4756014B2 (ja) | 条件複製起点をもつ環状ｄｎａ分子、それらの製造方法、及び、遺伝子治療におけるそれらの使用 | |
| Mairhofer et al. | Rational vector design for efficient non-viral gene delivery: challenges facing the use of plasmid DNA | |
| JPH11500618A (ja) | Ｄｎａ分子、その製造及び遺伝子治療における使用 | |
| FI120046B (fi) | Menetelmä yhdistelmä-DNA-adenovirusgenomin valmistamiseksi | |
| CN112154208A (zh) | 产生改进的病毒和非病毒纳米质粒载体 | |
| EP1272625A2 (en) | CpG REDUCED PLASMIDS AND VIRAL VECTORS | |
| CN115768487A (zh) | 用于面肩肱型肌营养不良症的crispr抑制 | |
| Tan et al. | Overcoming the inflammatory toxicity of cationic gene vectors | |
| Schakowski et al. | Minimal size MIDGE vectors improve transgene expression in vivo | |
| MX2007003214A (es) | Formulaciones liquidas estables de adn plasmidico. | |
| JP4451842B2 (ja) | 遺伝子治療に用いるための製品 | |
| US20170096679A1 (en) | Eukaryotic expression vectors resistant to transgene silencing | |
| US6323003B1 (en) | Compositions and methods for activating genes of interest | |
| US9816077B2 (en) | Use of integrase for targeted gene expression | |
| MXPA98010328A (en) | Terapeut dna production procedure | |
| Tolmachov et al. | Minimized, CpG‐Depleted, and Methylated DNA Vectors: Towards Perfection in Nonviral Gene Therapy | |
| Bigey et al. | Optimization of plasmid backbone for gene expression in mammalian cells |