[go: up one dir, main page]

SK156996A3 - A molecule of isolated dna for the synthesis of antipathogenic substances, vectors and hosts comprising this molecule and its use - Google Patents

A molecule of isolated dna for the synthesis of antipathogenic substances, vectors and hosts comprising this molecule and its use Download PDF

Info

Publication number
SK156996A3
SK156996A3 SK1569-96A SK156996A SK156996A3 SK 156996 A3 SK156996 A3 SK 156996A3 SK 156996 A SK156996 A SK 156996A SK 156996 A3 SK156996 A3 SK 156996A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
leu
ala
arg
gly
asp
Prior art date
Application number
SK1569-96A
Other languages
English (en)
Inventor
James M Ligon
Thomas Schupp
James J Beck
Dwight S Hill
John A Ryals
Thomas D Gaffney
Stephen T Lam
Philip E Hammer
Scott J Uknes
Original Assignee
Ciba Geigy Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ciba Geigy Ag filed Critical Ciba Geigy Ag
Publication of SK156996A3 publication Critical patent/SK156996A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/78—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Pseudomonas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/08—Oxygen as only ring hetero atoms containing a hetero ring of at least seven ring members, e.g. zearalenone, macrolide aglycons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Rekombinantná expresia polypeptidov potrebných na biologickú syntézu antipatogénnej látky (APS) umožňuje v hostiteľovi produkciu APS. Sú opísané gény kódujúce polypeptidy nevyhnutné na produkciu určitých antipatogénnych látok spolu s metódami na identifikáciu a izoláciu génov potrebných na biosyntézu žiadaných APS. Klonované gény môžu byť transformované a exprimované v hostiteľských organizmoch. Existuje rad dôvodov, prečo sa APS produkujú. Je to ochrana hostiteľa proti patogénu, vývoj hostiteľa ako biokontrolného prvku a produkcia veľkého množstva APS.
f 1.77 f 1.01 I··24 2·18
Xba
ORFl
ORF2
--->==>
ORF3 OB.F4
Okb 1.0 2.0 3-0 s:° 6iC i
Molekula izolovanej DNA na syntézu antipatogénnych látok, vektory a hostitelia, ktorí ju obsahujú a jej použitie
Oblast techniky
Vynález sa týka ochrany hostiteľských organizmov proti patogénom, zvlášť ochrany rastlín proti rastlinným patogénom. Vynález poskytuje transgenické rastliny, ktoré majú zvýšenú odolnosť voči rastlinným patogénom a biokontrolné organizmy so zvýšenými biokontrolnými vlastnosťami. Ďalej poskytuje metódy na ochranu rastlín proti rastlinným patogénom a metódy na produkciu antipatogénnych látok.
Doterajší stav techniky
Rastliny sú bežne infikované pliesňami, baktériami a mnohými mikrobiálnymi druhmi, ktoré vznikli, aby využívali rôzne niky, produkované rastúcimi rastlinami. Niektoré patogény, schopné napádať foliárny povrch rastlín, sa šíria vzduchom, vzájomným kontaktom rastlín alebo rôznymi vektormi. Pôdne patogény predovšetkým infikujú korene rastlín a novo vyklíčené semená. Popri pliesňových a bakteriálnych infekciách sa vyskytuje rad rastlinných chorôb spôsobených pôdnymi nematódami, ktoré napádajú korene. Spôsobujú vášne škody v prípade, že rovnaké druhy plodín sa pestujú na tej istej pôde v nasledujúcich rokoch po sebe.
Každoročne choroby rastlín významne znižujú výťažok úrody. V mnohých oblastiach sveta tieto straty vedú k ekonomickým problémom farmárov a k nedostatočnej výžive miestneho obyvateľstva. Široké používanie fungicídov zaručuje podstatnú ochranu proti napadnutiu rastlinnými patogénmi. Napriek tomu, že sa na fungicídy vydáva jedna miliarda dolárov, celosvetové straty na úrode tvoria približne 10 % hodnoty úrody v roku 1981. Vážnosť ničivého procesu chorôb záleží od agresivity rastlinného patogénu a odozvy hostiteľa. Jedným z cieľov väčšiny programov pestovania rastlín je zvýšenie odolnosti rastlín proti chorobám. Nové genetické zdroje a vyvinuté kombinácie zaručujúce rezistenciu proti chorobám sa úspešne využívajú v mnohých systémoch plodina-patogén iba určitú dobu. Dochádza k rýchlemu vývoju patogénu a ten dokáže prekonať gén rezistencie. Existuje rad zdokumentovaných prípadov vývoja kmeňov pliesní, ktoré sú odolné voči určitým fungicídom. Už v roku 1981 Fletcher a Wolfe (Proc. 1981 Brit. Crop Prot. Conf.(1981) tvrdili, že 24 % múčnatky trávnej z jarného jačmeňa a 53 % zo zimného jačmeňa vykazuje významné rozdiely v reakcii na fungicíd triadimenol a že výskyt týchto populácií medzi odrodami jačmeňa kolíše. Najcitlivejšie odrody jačmeňa tiež vykazujú najvyšší výskyt menej citlivých typov pliesní. Podobné odchýlky v citlivosti pliesní na fungicídy boli dokumentované u múčnatky pšeničnej (tiež na triadimenol), Botrytis (na benomyl), Pyrenophora (na organortuťnaté látky) Pseudocercosporella (na fungicídy typu MBC) a Mycosphaerella fijiensis na triazol (Jones and Clifford, Cereal Diseases, John Wiley, 1983). Aj choroby spôsobené nematódami sa úspešne kontrolujú použitím pesticídov. Kým väčšina fungicídov nie je pre cicavce nebezpečná a jediným problémom pri ich použití je vyvinutie odolnosti pliesní, pre ktoré sú určené, nematocídy sú pre cicavce relatívne vysoko toxické. Väčšina nematocídov, ktoré sa používajú pri kontrole pôdnych nematód, sú zo skupiny zlúčenín karbamátového typu, organického chlóru a organického fosforu a pri ich použití sa musia dodržiavať určité bezpečnostné opatrenia. U niektorých druhov plodín bolo vyvinuté použitie biokontrolných organizmov ako ďalšia alternatívna metóda ochrany plodín. Biokontrolné organizmy majú tú výhodu, že dokážu osídliť a chrániť časti rastlín, ktoré sú nedostupné pre bežne používané fungicídy. Táto metóda je vyvinutá na základe zistení, že rastliny rastúce v niektorých pôdach sú prirodzene odolné voči istým pliesňam a že potláčacia schopnosť týchto pôd sa stráca autoklávovaním. Ďalej sa zistilo, že pôdy, ktoré prispievajú k rozvoju istých chorôb, môžu získať potláčacie vlastnosti pridaním malého množstva pôdy z poľa s potláčacou schopnosťou (Scher et al. Phytopathology 70: 412-417 (1980)). Súčasný výskum ukazuje, že baktérie, ktoré sú schopné osídlo3 vať korene, sú zodpovedné za jav, v súčasnosti známy ako biologická kontrola chorôb (Baker et al. Biological Control of Plánt Pathogens, Freeman Press, San Francisco, 1974). V mnohých prípadoch sú najúčinnejšie kmene baktérií z rodu Pseudomonas fluorescens (Weller et al. Phytopatology 73: 463-469 (1983), Kloepper et al. Phytopatology 71: 1020-1024 (1981)) ktoré sa podieľajú na biologickej kontrole chorôb. Dôležité patogény, ktoré možno účinne kontrolovať naočkovaním semien spomenutými baktériami, zahrňujú Gaemannomyces graminis, napádajúce pšenicu (Cook et al. Soil Biol. Biochem. 8: 269-273 (1976)), Pythium a Rhizoctonia, ničiace bavlnu (Howell et al. Phytopatology 69: 480-482 (1979)). Niekoľko spomenutých kmeňov Pseudomonas produkuje antibiotiká, ktoré bránia rastu pliesňo vých patogénov (Howell et al. Phytopatology 69: 480-482 (1979) , Howell et al. Phytopatology 70: 712-715 (1980)) . Tieto antibiotiká sa uplatňujú pri kontrole pliesní v rizosfére. Na priek tomu, že biokontrola sa na začiatku považovala za metódu vhodnú pre široké použitie pri kontrole chorôb, používa sa iba v prostredí skleníkov na kontrolu pôdnych patogénov. Použitie prirodzene sa vyskytujúcich mikroorganizmov vo veľkom merítku sa ukázalo ako nevýhodné. Príčinou je obmedzenie produkcie mikroorganizmov (často rastú pomaly), obmedzenie ich rozdelením (často žijú krátko) a náklady (výsledok oboch týchto problémov) . Naviac úspech biokontrolných prístupov je limitovaný určovaním prirodzene sa vyskytujúcich kmeňov, ktoré môžu mať limitované spektrum účinnosti. Niektoré počiatočné prístupy sa využili pri kontrole nematód za použitia biokontrolných organizmov. I keď tieto prístupy sú stále vo fáze výskumu, bolo publikované, že niektoré druhy Streptomyces kontrolujú koreňové nematódy (Meliodogyne spp.) (WO 93(18135 Research Corporation Technology). Toxíny z kmeňov Bacillus thuningiensis (takých ako israeliensis) majú širokú antinematódovú aktivitu a prípravok zo spór alebo baktérií môže potom poskytovať vhodné biokontrolné príležitosti (EP 0 352 052 Mycogen, WO 93/19604 Research Corporation Technologies).
Tradičné metódy ochrany plodín proti chorobám zahŕňajú pestovanie rastlín pre odolnosť voči chorobám, pokračujúci vý4 voj fungicídov a v súčasnosti určovanie biokontrolných organizmov. Všetky tieto metódy majú úspech. Je však zrejmé, že vedci musia stále vyvíjať, nové metódy na ochranu plodín proti chorobám.
Podstata vynálezu
Tento vynález poskytuje nové metódy ochrany rastlín proti rastlinným patogénom.
Tento vynález odhaľuje genetické základy látok, ktoré produkujú určité organizmy mnohogénovou biosyntetickou cestou a ktoré majú škodlivý účinok na množenie a rast rastlinných patogénov. Tieto látky zahŕňajú cukry obsahujúce antibiotiká, ako sú aminoglykozidy, peptidové antibiotiká, nukleozidové deriváty a iné heterocyklické antibiotiká obsahujúce dusík a/alebo kyslík, polyketidy, makrocyklické laktóny a chinóny.
Tento vynález poskytuje celú sadu génov vyžadovaných pre rekombinantnú produkciu určitých antipatogénnych látok v hostiteľskom organizme. Ďalej poskytuje metódy pre manipuláciu s APS génovými sekvenciami za účelom ich vyjadrenia v transgenických rastlinách. Transgenické rastliny, ktoré sú takto pozmenené, majú zvýšenú odolnosť voči napadnutiu rastlinnými patogénmi. Vynález poskytuje metódy pre bunkové cielenie APS génových produktov, rovnako tiež zaisťuje, že génové produkty majú priestorové umiestnenie vhodné pre dostupnosť žiadaného substrátu/ov. Ďalej sú poskytované metódy na zvýšenie výkonu APS metabolickou cestou nadmerným vyjadrovaním a nadmernou produkciou génov, kódujúcich substrátové prekurzory.
Vynález ďalej poskytuje novú metódu na určenie a izoláciu génov zahrnutých do biosyntézy určitých APS v hostiteľskom organizme. Vynález tiež opisuje zdokonalený biokontrolný kmeň, ktorý produkuje heterológnu APS a ktorý je účinný v kontrole pôdnych a semenáčových rastlinných patogénov zvonku obvyklého rozpätia hostiteľa.
Vynález poskytuje metódy na potláčanie chorôb. Tieto metódy zahŕňajú použitie transgenických rastlín vyjadrujúcich biosyntetické gény APS a použitie biokontrolných činidiel, ktoré vyjadrujú gény APS.
Vynález ďalej poskytuje metódy pre produkciu APS v dostatočne veľkom množstve, aby ich bolo možné izolovať, a ďalej použiť v poľnohospodárskych prípravkoch. Výhodou týchto produk čných metód je jednotná chiralita produkovaných molekúl. Produkcia v transgenickom organizme zabraňuje vytvoreniu populácie racemických zmesí, v ktorých niektoré enantioméry môžu znižovať aktivitu.
Antipatogénna látka·, látka, ktorá vyžaduje jednu alebo viac neendogénnych enzymatických aktivít, ktoré sú pre rastlinu cudzie, je produkovaná hostiteľom, kde sa prirodzene nevyskytuje, negatívne ovplyvňuje množenie alebo rast patogénu (t.j. patogén).
Neendogénne enzymatická aktivity sú aktivity, ktoré sa nevyskytujú v hostiteľovi, kde sa prirodzene nevyskytujú ani antipatogénne látky. Patogény môžu byť pliesne, baktérie, nemató dy, vírusy, viroidy, hmyz alebo ich kombinácie a môžu spôsobovať choroby hostiteľa priamo alebo nepriamo. Antipatogénne látky môžu brániť pomnoženiu alebo rastu rastlinného patogénu alebo ho môžu usmrcovať. Antipatogénna látka môže byť syntetizovaná zo substrátu, ktorý sa prirodzene vyskytuje v hostiteľovi alebo zo substrátu, ktorý sa hostiteľovi poskytuje spolu s nevyhnutnými neendogénnymi aktivitami. Antipatogénnymi látkami môžu byť sacharidy obsahujúce antibiotiká, peptidové antibiotiká, heterocyklické antibiotiká obsahujúce dusík, heterocyklické antibiotiká obsahujúce kyslík, heterocyklické antibiotiká obsahujúce dusík a kyslík, polyketidy, makrocyklické laktóny a chinóny. Antipatogénna látka sa ďalej označuje ako APS.
Rastlinná antipatogénna látka: antipatogénna látka je tu definovaná ako látka, ktorá negatívne ovplyvňuje množenie alebo rast rastlinného patogénu (t.j. rastlinný patogén).
Biokontrolné činidlo: organizmus, ktorý je schopný ovplyvniť rast patogénu takým spôsobom, že schopnosť patogénu spôsobovať chorobu je obmedzená. Rastlinné biokotrolné činidlá zahŕňajú mikroorganizmy, ktoré sú schopné osídl'ovať rastliny alebo rizosféru. Takéto biokontrolné činidlá zahŕňajú gramnegatívne mikroorganizmy, ako sú Pseudomonas, Enterobacter a Serratia, grampozitívne mikroorganizmy, ako je Bacillus a pliesne Trichoderma a Gliocladium. Organizmy sa môžu chovať ako biokontrolné činidlá v ich prirodzenej forme alebo ak sú ich genómy pozmenené v duchu vynálezu.
Patogén: akýkoľvek organizmus, ktorý má negatívne účinok na vybraného hostiteľa za vhodných podmienok. V rozsahu tohoto vynálezu sú do termínu patogén zahrnuté pliesne, baktérie, nematódy, vírusy, viroidy a hmyz.
Promótor alebo regulačná oblasé DNK: neprekladaná DNK sekvencia, ktorá napomáha tým, že zvyšuje alebo inak ovplyvňuje transkripciu, transláciu alebo expresiu pripojenej štruktúrnej sekvencie DNK, ktorá kóduje proteín alebo iný produkt DNK. Promótor DNK sekvencie je obvykle umiestnený na 5'-konci prekladanej DNK sekvencie, typicky medzi dvadsiatym a stým nukleotidom, počítané od 5'-konca štartovacieho miesta prekladu .
Kódujúca DNK sekvencia: sekvencia DNK, ktorá je v organizme prekladaná za účelom produkcie proteínu.
Operabilne viazaný k/asociovanej s: dve sekvencie DNK, ktoré sú asociované alebo funkčne príbuzné. Napríklad sekvencií DNK možno povedať, DNK, ktorá nesie kód pre RNK operabilne viazané sú fyzicky i o promótore alebo o regulačnej že sú asociované so sekvenciou alebo kóduje proteín, ak dve oblasti sú operabilne viazané alebo umiestnené tak, že regulačná sekvencia DNK ovplyvňuje hladinu expresie kódu alebo štruktúrne sekvencie DNK.
Chimerické konštrukcie/fúzie DNK sekvencií·. rekombinantná sekvencia DNK, v ktorej sú promótor alebo regulačné sekvencie DNK operabilne viazané alebo asociované s DNK sekvenciou nesúcou kód pre mRNK alebo ktorá je vyjadrená ako proteín tak, že regulačná oblastí DNK je schopná riadiť transkripciu alebo expresiu asociovanej sekvencie DNK. Regulátor DNK sekvencie chimerickej konštrukcie nie je bežne operabilne viazaný k asociovanej DNK sekvencii. Termíny heterológny alebo nepríbuzný sa používajú na indikáciu rekombinantnéj DNK sekvencie, v ktorej promótor alebo regulátor DNK sekvencie a asociovaná DNK sekvencia sú izolované z organizmov rôzneho druhu alebo rodu.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na obr. 1 je znázornená reštrikčná mapa klonovaného kozmidu pCIB 16 9 z Pseudomonas fluorescens, ktorý nesie oblasť, biosyntetického génu kódujúcu pyrolnitrín. Ďalej reštrikčné miesta enzýmov EcoRI, HindlII, KpnI, Nôti, Sphl a Xbal a ich poloha udaná v kbp.
Na obr. 2 je znázornená funkčná mapa oblasti MOCG134 génu pre pyrolnitrín, ktorá indikuje miesto inzercie 30-tich nezávislých Tn5 inzertov spolu s úsekom pCIB169, ktorá slúži na identifikáciu génov pre biosyntézu pyrolnitrínu. Reštrikčné miesta EcoRI sú označené ako E, miesta Nôti ako N. Účinok Tn5 inzercie na produkciu prn je označený + alebo kde + znamená producenta prn a - kloň, ktorý prn neprodukuje.
Na obr. 3 je znázornená reštrikčná mapa 9,7 kb oblasti MOCG134 Prn génu klonu pCIB169, ktorý je zahrnutý do biosyntézy pyrolnitrínu. Reštrikčné miesta EcoRI sú označené ako E, miesta NotI ako N a HindlII ako H. Polohy nukleotidov sú udané v kbp.
Na obr. 4 je znázornené umiestnenie rôznych subklonov odvodených od pCIB169, ktoré boli izolované za účelom určenia sekvencie.
Na obr. 5 je znázornené umiestnenie štyroch otvorených čítacích rámcov (ORF 1-4), ktoré zodpovedajú za biosyntézu pyrolnitrínu v kmeni MOCG134 na približne 6 kb Xbal/NotI fragmentu pCIB169, ktorý obsahuje oblasť. Prn génu.
Na obr. 6 je znázornené umiestnenie vypustených fragmentov ORF 1-4 v zoskupení MOCG134 génu, ktoré kóduje pyrolnitrín. Vypustené fragmenty sú znázornené ako plné polia.
Na obr. 7 je znázornená reštrikčná mapa klonu kozmidu p98/l z Sorangiium cellulosum, ktorá nesie oblasť génu pre biosyntézu soraphenu. Horná čiara zobrazuje reštrikčnú mapu p98/l a znázorňuje reštrikčné miesta a ich vzdialenosť od ľavého konca v kilobázach. Reštrikčné miesta sú označené: BBamHI, Bg-BglII, E-EcoRI, H-HindIII, Pv-Pvul, Sm-Smal. Polia pod reštrikčnou mapou znázorňujú umiestnenie biosyntetického modulu. Oblasť aktivity v každom module je označená nasledovne: (i-ketoacylsyntáza (KS), acyltransferáza (AT), ketoreduktáza (KR), protein nesúci acyl (ACP) dehydratáza (DH), enoyl reduktáza (ER) a tioesteráza (TE).
Vysvetlenie skratiek: US: ukončené sekvenovanie; PS: pokračujúce sekvenovanie.
Na obr. 8 je znázornená konštrukcia pCIB132 vytvorenej z pSUP2021. Krok I. znázorňuje strih reštrikčnou endonukleázou Nôti a otočenie Nôti fragmentu. Krok II. znázorňuje strih endonukleázou BamHI a vypustenie BamHI fragmentu.
Orientácia a približčítacích rámcov sú
Na obr. 9 je znázornená reštrikčná endonukleázová mapa zoskupenia génu pre biosyntézu fenazínu, ktorý je nesený fragmentom EcoRI-HindlII s veľkosťou 5.7 kb.
né umiestnenie šiestich otvorených znázornené pod reštrikčnou mapou. 0RF1, ktorý nie je výhradne prítomný v uvedenom fragmente a kóduje produkt, ktorý má podstatnú homológiu s rastlinnou DAHP syntetázou. ORF2 (0,65 kb), ORF3 (0,75 kb) a ORF4 (1,15 kb) nesú oblasti, ktoré sú homológne s izochorizmatázou, s veľkou podjednotkou antranilátovej syntetázy a malou podjednotkou antranilátovej syntetázy. ORF5 (0,7 kb) nevykazuje žiadnu homológiu so známymi génovými oblasťami. ORF6 (0,65 kb) je rovnaký ako gén kódujúci pyridoxín 5-fosfát oxidázu v E. coli.
Krátky popis sekvencií
SEQ ID Č. : 1 Sekvencia génového zoskupenia pre pyrolnitrín
SEQ ID Č. : 2 Sekvencia proteínu pre ORF1 zoskupenie génov pre pyrolnitrín
SEQ ID Č. : 3 Sekvencia proteínu pre ORF2 zoskupenie génov pre pyrolnitrín
SEQ ID C. : 4 Sekvencia proteínu pre ORF3 zoskupenie génov pre pyrolnitrín
SEQ ID Č. : 5 Sekvencia proteínu pre ORF4 zoskupenie génov pre pyrolnitrín
SEQ ID Č. : 6 Sekvencia génového zoskupenia pre soraphen
SEQ ID Č. : 7 Sekvencia konsenzu iniciátora trans- lácie v rastlinách (Clontech)
SEQ ID Č. : 8 Sekvencia konsenzu iniciátora translá- cie v rastlinách (Joshi)
SEQ ID Č. : 9 Oligonukleotidové sekvencie pre použitie v molekulárnom adaptore
SEQ ID Č. : 10 Oligonukleotidové sekvencie pre použitie v molekulárnom adaptore
SEQ ID Č. : 11 Oligonukleotidové sekvencie pre použitie v molekulárnom adaptore
SEQ ID Č. : 12 Oligonukleotidové sekvencie pre použitie v molekulárnom adaptore
SEQ ID Č. : 13 Oligonukleotidové sekvencie pre použitie v molekulárnom adaptore
SEQ ID Č. : 14 Oligonukleotidové sekvencie pre použitie v molekulárnom adaptore
SEQ ID Č. : 15 Oligonukleotidy používané na zmenu
reštrikčného miesta
SEQ ID Č. : 16 Oligonukleotidy používané na zmenu reštrikčného miesta
SEQ ID Č. : 17 Sekvencia génového zoskupenia pre fenazín
SEQ ID Č. : 18 Sekvencia proteínu pre phzl z génového zoskupenia pre fenazín
SEQ- ID Č. : 19 Sekvencia proteínu pre phz2 z génového zoskupenia pre fenazín
SEQ' ID v C. : 20 Sekvencia proteínu pre phz3 z génového zoskupenia pre fenazín
SEQ ID Č. : 21 Sekvencia DNK pre phz4 génového zoskupenia pre fenazín
SEQ ID Č. : 22 Sekvencia proteínu pre phz4 z génového zoskupenia pre fenazín
Uloženie
Kloň Prístupové číslo Dátum uloženia
pJL3 NRRL B-21254 20. máj 1994
p98/l NRRL B-21255 20. máj 1994
pCIB169 NRRL B-21256 20. máj 1994
pCIB3350 NRRL B-21257 20. máj 1994
pCIB3351 NRRL B-21258 20. máj 1994
Produkcia antipatogénnych látok v mikroorganizmoch
Mnoho organizmov produkuje vedľajšie metabolity. Niektoré z nich bránia rastu iných organizmov. Od objavenia penicilínu bolo objavené veľké množstvo látok, ktoré vykazujú antibiotikovú aktivitu. Ich počet stále rastie. Metabolity s antibioti11 kovou aktivitou majú rozmanité chemické štruktúry. Najdôležitejšie sú: aminoglykozidy (napr. streptomycín) a iné sacharidy obsahujúce antibiotiká, peptidové antibiotiká (napr. β-lactAPS, rizokticín (Rapp,C. et al. , Liebigs Ann. Chem.: 655-661 (1981)), deriváty nukleozidov (napr. blasticidín S) a ďalšie heterocyklické antibiotiká obsahujúce dusík (fenazín a pyrolnitrín) a/alebo kyslík, polyketidy (napr. soraphen), makrocyklické laktóny (napr. erytromycín) a chinóny (napr. tetracyklín) .
Aminoglykozidy a ďalšie sacharidy obsahujúce antibiotiká
Aminoglykozidy sú oligosacharidy, ktoré sa skladajú z aminocyklohex.anolovej časti viazanej glykozidickou väzbou k inému aminocukru. Streptomycín produkovaný Streptomyces griseus je najlepšie preštudovaným antibiotikom tejto skupiny. Biochémia a biosyntéza tejto látky je súbor (Mansouri et al. v: Genetics a Molecular Biology of Industrial Microorganisms (ed: Hershberger et al.), American Society for Microbiology, Washington, D.C. str. 61-67 (1989)), ktorý zahŕňa 25 až 30 génov, 19 z týchto génov už bolo analyzovaných. (Retzlaff et al. v: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics (ed.: Baltz et al.), American Society for Microbiology, Washington, D.C. str. 183-194 (1993)). Streptomycín a mnoho ďalších aminoglykozidov bránia syntéze bielkovín v cieľovom organizme.
Peptidové antibiotiká
Peptidové antibiotiká sa môžu rozdeliť do dvoch skupín:
(1) antibiotiká syntetizované enzymatickým systémom bez prispenia ribozomálneho aparátu, (2) antibiotiká, ktoré vyžadujú transláciu mRNA pre poskytnutie prekurzora antibiotika.
Neribozomálne peptidové antibiotiká sú vytvárané veľkými, multifunkčnými enzýmami, ktoré aktivujú, modifikujú, polymerizujú a v niektorých prípadoch cyklizujú podjednotky aminokyselín a tým tvoria polypeptidické reťazce. Do reťazca môžu byť vkladané i iné kyseliny ako napríklad: kyselina aminoadipová, kyselina diaminobutánová, kyselina diaminopropionová, dihydroxyaminokyselina, izoserín, kyselina dihydroxybenzoová, kyselina dihydroxyizovalerová, (4R)-4-[(E)-2-butenyl]-4-N-dimetylL-treonín a ornitín (Katz and Demain, Bacteriological Review 41: 449-474 (1977), Kleinkauf and von Dohren, Annual Review of Microbiology 41: 259-289 (1987)). Produkt nie je kódovaný mRNK a ribozómy sa nezúčastňujú syntézy. Peptidové antibiotiká syntetizované bez účasti ribozómov sa môžu zatriediť, do skupín podľa ich všeobecnej štruktúry. Delia sa na lineárne, cyklické, laktóny, vetvené cyklopeptidy a depsipeptidy (Kleinkauf a von Dohren, European Journal of Biochemistry 192: 1-15 (1990) ) .. Tieto rozdielne skupiny antibiotík sa pripravujú pôsobením modifikujúcich a cyklizujúcich enzýmov. Základná schéma polymerizácie je pre všetky skupiny rovnaká. Tieto antibiotiká sú produkované baktériami a pliesňami a zahŕňajú ede in, lineárny gramicidín, tyrocidín a gramicidín S z Bacillus brevis, mykobacilín z Bacillus subtilis, polymixín z Bacillus polymixia, etamycín z Streptomyces griseus, echinomycín z Streptomyces echinatus, aktinomycín z Streptomyces clavuligerus, enterochelín z Escherichia coli, gama-(alfa-Laminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valín (ACV) z Aspergillus nidulans, alameticín z Trichoderma viride, destruxín z Metarhizium anizolpliae, eniatín z Fusarium oxysporum a beauvericín z Beauveria bassiana. Medzi prokaryotickými a eukaryotickými systémami existuje rozsiahla funkčná a štrukturálna podobnosť, čo naznačuje spoločný pôvod. Peptidové antibiotiká vykazujú podobne neurčité aktivity, pôsobia toxicky na zvieratá, rastliny, baktérie a pliesne (Hansen, Annual Review of Microbiology 47 535-564 (1993)), Katz and Demain, Bacteriological Reviews 41: 449-474 (1977), Kleinkauf and von Dohren, Annual Review of Microbiology 41: 259-289 (1987), Kleinkauf and von Dohren, European Journal of Biochemistry 192: 1-15 (1990), Kolter and Moreno, Annual Review of Microbiology 46: 141-163 (1992)).
Peptidové antibiotiká syntetizované za účasti ribozómov sú charakterizované existenciou štruktúrneho génu pre dané antibiotikum, ktorý kóduje prekurzor antibiotika. Prekurzor je modifikovaný špecifickými enzýmami. Pre syntézu peptidových antibiotík sa používa všeobecná metóda pre syntézu proteínov, čo umožňuje tvorenie omnoho dlhších polymérov, i keď tieto peptidové antibiotiká nie sú nevyhnutne veľmi veľké. Popri štruktúrnom géne sú potrebné ďalšie gény pre extracelulárnu sekréciu a imunitu. Veríme, že tieto gény ležia v blízkosti štruktúrneho génu, v mnohých prípadoch na rovnakom operóne. Existujú dve hlavné skupiny peptidových antibiotík tvorených na ribozómoc.h: antibiotiká, ktoré obsahujú neobvyklú aminokyselinu lantionín a antibiotiká, ktoré túto kyselinu neobsahujú. Antibiotiká obsahujúce lantionín (lantibiotiká) sú produkované gram-pozitívnymi baktériami, ako sú Lactococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus a Streptomyces. Sú známe lineárne (napr. nizín, subtilín, epidermín a gallidermín) a kruhové (napr. duramycín a cinamycín) lantibiotiká (Hansen, Annual Review of Microbiology 47: 535-564 (1993), Kolter and Moreno, Annual Review of Microbiology 46: 141-163 (1992)). Lantibiotiká často obsahujú ďalšie charakteristické modifikované zvyšky, ako sú dehydroalanín (DHA) a dehydrobuterín (DHB), ktoré vznikajú dehydratáciou serínu a treonínu. Reakciou tiolu z cisteínu s DHA vzniká lantionín a s DHB vzniká β-metyllantionín. Peptidové antibiotiká, ktoré neobsahujú lantionín, môžu obsahovať iné modifikácie alebo môžu pozostávať iba z bežných aminokyselín, ktoré sa používajú pri syntéze bielkovín. Peptidové antibiotiká, ktoré neobsahujú lantionín, sú produkované gram- pozitívnymi i gram-negatívnymi baktériami, ako sú Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus, Enterococcus a Escherichia. Antibiotiká tejto kategórie zahŕňajú laktacíny, laktocíny, sakacín A, pediocíny, diplokocíny, laktokocíny a mikrocíny (Hansen, supra, Kolter and Moreno, supra).
Nukleozidové deriváty a ďalšie heterocyklické antibiotiká obsahujúce dusík a/alebo kyslík
Všetky tieto zlúčeniny obsahujú heterocyklický kruh, inak sú ich štruktúry odlišné. Ako ilustrujú nasledujúce príklady, aj ich biologické aktivity sú rôzne.
Polyoxíny a nikomycíny sú nukleozidové deriváty. Ich štruktúra pripomína UDP-N-acetylglukozamín, ktorý slúži ako substrát pre syntázu chitínu. Tieto látky sú konkurenčnými inhibítormi syntázy chitínu (Gooday, v: Biochemistry of Celí Walls and Membranes in Fungi (ed.: Kuhn et al.), SpringerVerlag, Berlín str. 61 (1991)). Polyoxíny sú produkované
Streptomyces cacaoi a nikomycíny sú produkované S. tendae.
Fenazíny sú heterocyklické zlúčeniny obsahujúce dusík, vyznačujúce sa bežnou planárnou aromatickou trojkruhovou štruktúrou. Bolo určených viac ako 50 voľne sa vyskytujúcich fenazinov, každý z nich sa líši substitučnými skupinami na základnom kruhu. Táto skupina látok je v prírode produkovaná iba baktériami, zvlášť Streptomyces, Sorangium a Pseudomonas (Turner and Messenger, Advances in Microbiol Physiology 27: 211-275 (1986)). Gén pre biosyntézu fenazínu bol nedávno izolovaný z kmeňa P. aureofaciens (Pierson and Thomashow MPMI 5: 330-339 (1992)) . Vzhľadom na ich planárnu aromatickú štruktúru sa predpokladá, že fenazíny môžu tvoriť interkalatívne komplexy s DNK (Hollstein and van Gemert, Biochemistry 10: 497 (1971)), a zasahujú do metabolizmu DNK. Fenazín myxín sa dokáže vmedzeriť do molekuly DNK (Hollstein and Butler, Biochemistry 11: 1345 (1972)) a fenazín lomofungín bráni syntéze RNK v kvasinkách (Cannon and Jiminez, Biochemical Journal 142: 457 (1974), Ruet et al., Biochemistry 14: 4651 (1975)).
Pyrolnitrín je derivát fenylpyrolu, má silnú antibiotikovú aktivitu a negatívne ovplyvňuje mnoho druhov pliesní. (Homma et al., Soil Biol. Biochem. 21: 723-728 (1989), Nishida et al. , J. Antibiot., ser. A, 18: 211-219 (1995)). Táto látka bola pôvodne izolovaná z Pseudomonas pyrrcinia (Arima et al., J. Antibiot., ser. A, 18: 201-204 (1965)), potom z niekoľkých ďalších druhov Pseudomonas a Myxococcus (Gerth et al. J. Antibiot. 35: 1101-1103 (1982)). Pyrolnitrín inhibuje respiračný transport elektrónov v pliesňach (Tripathi and Gottlieb, J. Bacteriol. 100: 310-318 (1969)) a nepárovou oxidačnou fosforyláciou (Lambowitz and Slayman, J. Bacteriol. 112: 1020-1022 (1972)). Tvrdí sa, že pyrolnitrín spôsobuje poškodenie genera15 lizovaných lipoproteínových membrán (Nose and Arima, J. Antibiot., ser. A, 22: 135-143 (1996), Carlone and Scannerini, Mycopathologia et Mycologia Appicata 53: 111-123 (1974)). Pyrolnitrín je biosyntetizovaný z tryptofánu (Chang et al., J. Antibiot. 34: 555-566). Gén pre jeho biosyntézu izolovaný z kmeňa P. fluorescens bol klonovaný teraz (sekcia C, príklady).
Jedno uskutočnenie vynálezu sa týka izolovanej molekuly DNK kódujúcej jeden alebo viac polypeptidov pre biosyntézu pyrolnitrínu v heterológnom hostiteľovi. Táto molekula sa môže použiť pre genetickú manipuláciu hostiteľského organizmu za účelom dosiahnutia expresie uvedenej antipatogénnej látky. Ďalším uskutočnením vynálezu sú izolované polypeptidy nutné pre biosyntézu pyrolnitrínu.
Polyketidové syntázy
Rad antibiotík napriek tomu, že sa líšia štruktúrou, majú spoločný model biosyntézy. Molekuly sú budované z dvoch uhlíkových stavebných blokov, z ktorých (i-uhlík vždy nesie ketoskupinu, z toho je odvodený názov polyketid. Značná štruktúrna rozdielnosť pochádza z rôznych dĺžok polyketidového reťazca a z rôznych bočných reťazcov, ktoré sú vnášané buď ako časti dvoch uhlíkových stavebných blokov, alebo po -vytvorení hlavného polyketidového reťazca. Keto-skupiny môžu byť tiež redukované na hydroxyly alebo môžu byť úplne odstránené. Každé kolo adície dvoch uhlíkov prebieha za pôsobenia komplexu enzýmov, nazývaných polyketidové syntázy (PKS), podobným spôsobom ako pri biosyntéze mastných kyselín. Za účelom zvýšenia počtu polyketidových antibiotík boli izolované a sekvenované ich biosyntetické gény. Je zrejmé, že PKS gény majú konzervatívnu štruktúru. Kódované proteíny patria všeobecne do dvoch typov: proteíny typu I sú polyfunkčné, s niekoľkými kovalentne viazanými katalytickými oblasťami, ktoré uskutočňujú rôzne enzymatické kroky (napr. PKS pre erytromycín, soraphen a avermektín (Joaua et al. Plasmid 28: 157-165 (1992), MacNeil et al. v:
Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, (ed.: Baltz et al.), American Society for Microbiology,
Washington D.C. str. 245-256 (1993)), proteíny typu II sú monofunkčné (Hutchinson et al. v: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, (ed.: Baltz et al.), American Society for Microbiology, Washington D.C. str. 203-216 (1993)). Pri jednoduchších polyketidových antibiotikách, ako je actinorodín (produkuje Streptomyces coelicolor), sa niekoľko cyklov dvojuhlíkatej adície uskutočňuje opakovane za prispenia PKS enzýmov, ktoré sú kódované jednou sadou PKS génov. Naopak, syntéza zložitejších látok, ako sú erytromycín a soraphen (príklady v sekcii E) zahŕňa sady PKS génov, ktoré sú radené do modulu. Každý modul potom uskutočňuje jeden cyklus dvojuhlíkatej adície (Hopwood et al nisms: Basic and Applied Molecular al.), American Society for Microbiology, Washington D.C. str. 267-275 (1993)). Vynález poskytuje biosyntetické gény pre soraphen, izolované z Sorangium (príklady sekcie E) . Potom ďalšie uskutočnenie tohoto vynálezu sa týka molekuly izolovanej DNK, ktoré kóduje jeden alebo viac polypeptidov pre biosyntézu soraphenu v heterológnom hostiteľovi. Táto molekula sa môže použiť pre genetickú manipuláciu hostiteľského organizmu za účelom dosiahnutia expresie uvedenej antipatogénnej látky. Ďalej podľa vynálezu sú izolované polypeptidy nutné pre biosyntézu pyrolnitrínu.
v: Industrial MicroorgaGenetics (ed.: Baltz et
Makrocyklické laktóny
Pre túto skupinu je spoločné, že v molekulách je prítomný veľký laktónový kruh s rôznymi kruhovými substituentmi. Látky môžu byť rozdelené do dvoch podskupín v závislosti od veľkosti a inej charakteristiky kruhu. Makrolidy napríklad obsahujú 12-, 14-, 16- alebo 17-členné laktónové kruhy spojené glykozidickou väzbou k jednému alebo viacerým aminocukrom a/alebo k deoxycukrom. Tieto látky sú inhibítory syntézy proteínov a čiastočne pôsobia na gram-pozitívne baktérie. Dobre preštudovaným makrolidom, ktorý produkuje kmeň Sacharopolyspora erythraea je erytromycín A. Jeho molekula sa skladá zo 14-členného laktónového kruhu, ktorý je spojený s dvomi deoxycukrami. Bolo klonované veľké množstvo biosyntetických génov.
Všetky boli umiestnené na segmente s veľkosťou 60 kb chromozómu S. erythraea. Bolo určených najmenej 22 úzko zviazaných otvorených čítacích rámcov, ktoré sú zahrnuté do syntézy erytromycínu (Donadio et al., v: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, (ed. : Baltz et al., (American Society for Microbiology, Washington D.C.. str. 257-265 (1993)) .
Chinóny
Chinóny sú aromatické zlúčeniny s dvomi karbonylovými skupinami na neúplne saturovanom kruhu. Látky môžu byť rozdelené do dvoch podskupín v závislosti od počtu prítomných aromatických kruhov, t.j. benzochinóny, naftochinóny atď. Dobre preštudovanou skupinou sú tetracyklíny, ktoré v molekule obsahujú naftacénový kruh s rôznymi substituentmi. Tieto látky sú inhibítory syntézy proteínov a pôsobia na gram-pozitívne a gram-negatívne baktérie, ako aj na rickettsie, mykoplazmy a spirochéty. V tetracyklínoch sú aromatické kruhy odvodené od polyketidových molekúl. Gény, ktoré sa podieľajú na biosyntéze oxytetracyklínu (produkovaný kmeňom Streptomyces rimosus) boli klonované a exprimované v Streptomyces lividans (Binnie et al. J. Bacteriol. 171: 887-895 (1989)). PKS gény sú rovnaké ako gény kódujúce aktinorodín a preto kódujú (monofunkčné) PKS proteíny typu II (Hopewood and Sherman, Ann. Rev. Genet. 24: 37-66 (1990)) .
Ďalšie typy APS
Bolo určených niekoľko ďalších typov APS. Jeden z nich je 2-hexyl-5-propyl-rezorcinol, ktorý je produkovaný istým kmeňom Pseudomonas. Prvýkrát bol izolovaný z kmeňa Pseudomonas B-9004 (Kanada et al., J. Antibiot. 28: 935-942 (1975)) a je to dialkylsubstituovaný derivát 1,3-dihydroxybenzénu. Táto látka vykazuje antipatogénnu aktivitu ku gram-pozitívnym baktériám (zvlášť ku Clavibacter sp.), k mykobaktériám a pliesňam.
Ďalším typom APS sú metoxyakryláty, ako je strobilurín B.
Strobilurín B je produkovaný kmeňmi Basdiomycetes a vykazuje široké spektrum fungicídnej aktivity (Anke, T. et al., Journal of Antibiotics (Tokio) 30: 806-810 (1977)). Strobilurín B tiež produkuje plieseň Bolinia lutea a vykazuje fungicídnu aktivitu Je schopný blokovať, transport elektrónov závislý od cytochrómu b, a tým bráni respirácii (Becker, W. et al., FEBS Letters 132: 329-333 (1981) ) .
Väčšina antibiotík bola izolovaná z baktérií, aktinomycet a pliesní. Ich úloha v biológii hostiteľského organizmu nie je často známa, ale s úspechom sa používajú v medicíne i v poľnohospodárstve. Antibiotiká používané v poľnohospodárstve sú: blasticidín S a kasugamycín - kontrola Pyricularia oryzae, validamycín - kontrola Rhizoctonia solani, prumycín kontrola druhov Botrytis a Sclerotinia a myldiomycín - kontrola múčnatiek.
Dnes používanie antibiotík na ochranu rastlín zahrňuje ich chemickú syntézu alebo fermentáciu a spôsob ich nanesenia na semená, časti rastlín alebo vnesenie do pôdy. Tento vynález opisuje určenie a izoláciu biosyntetických génov radu rastlinných antipatogénnych látok a použitie týchto génov pre vytvorenie transgenických rastlín, ktoré majú zvýšenú rezistenčnú charakteristiku proti chorobám. Vynález ďalej opisuje vytvorenie biokontrolných kmeňov, ktoré sú schopné osídl'ovať hostiteľské rastliny alebo rizosféru. Vlastnosti týchto kmeňov sú pozmenené expresiou izolovaných génov antipatogénnych látok. Dostupnosť týchto génov poskytuje metódy pre produkciu APS, vhodných pre izoláciu a použitie v antipatogénnych formuláciách.
Metódy na klonovanie génov antipatogénnych látok
Podľa vynálezu môžu byť gény kódujúce biosyntézu antibiotík klonované použitím radu rôznych techník. Najjednoduchší postup klonovania APS génov vyžaduje klovanie genomickej DNK, izolovanej z organizmu, ktorý produkuje APS. Táto DNK je prenesená na vhodnom plazmide alebo vektore do hostiteľského or19 ganizmu, ktorý APS neprodukuje. Ďalej nasleduje určenie transformovaných kolónií hostiteľa a potvrdenie ich schopnosti produkovať APS. Použitím metódy, ako je ^.::Tn5 transpozónová mutagenéza (de Bruijin and Lupsk, Gene 27: 131-149 (1984)), je možné určiť presnú transformujúcu APS udeľujúcu oblasť DNK. Inak alebo naviac môže byť táto oblasť štiepená na malé fragmenty a ten najmenší, ktorý vykazuje produkciu APS je ďalej charakterizovaný. Kým hostiteľskému organizmu chýba schopnosť produkovať APS, môže byť odlišným druhom k organizmu, od ktorého je APS odvodená, odchýlka tejto techniky zahrňuje transformáciu hostiteľskej DNK do rovnakého hostiteľa, ktorého schopnosť produkovať APS bola porušená mutagenézou. Pri tejto metóde je organizmus, ktorý produkuje APS mutovaný a mutanty, ktoré APS neprodukujú, sú izolované a doplnené klonovanou genomickou DNK z materského kmeňa, ktorý je APS pozitívny. Ďalším príkladom štandardnej metódy, používanej pre klonovanie génov nutných pre APS biosyntézu je použitie transpozónovej mutagenézy. Vznikajú mutanty organizmu produkujúceho APS, ktoré po mutagenéze strácajú schopnosť produkcie APS. Potom je oblasť hostiteľského genómu zodpovedná za produkciu APS označená transpozónom a môže byť jednoducho znovu získaná a použitá ako sonda na izoláciu prírodného génu z materského kmeňa. APS gény, ktoré sú nutné pre biosyntézu APS a ktoré sú podobné známym APS zlúčeninám, môžu byť klonovateľné na základe ich sekvenčnej homológie k biosyntetickým génom známych zlúčenín. Metóda vhodná pre klonovanie na základe homológie zahrňuje screening štandardnej knižnice za použitia DNK hybridizácie.
Tento vynález tiež opisuje novú metódu izolácie APS biosyntetických génov, ktoré sa môžu používať na klonovanie génov akýchkoľvek APS. Táto metóda je čiastočne použiteľná na klonovanie APS biosyntetických génov, ktoré môžu rekalcitrantom pre klonovanie, používajúc akúkoľvek vyššie uvedenú metódu. Dôvodom existencie takejto rekalcitrancie ku klonovaniu je, že štandardné metódy opísané vyššie (okrem metódy klonovania na základe homológie) môžu prednostne viesť k izolácii regulátorov biosyntézy APS. Keď je takýto regulátor určený, môže sa používať na izoláciu biosyntetických génov pomocou novej metó20 dy iba v prípade, ak je táto izolácia riadená klonovaným regulátorom. Pri tejto metóde je knižnica mutantov, vznikajúcich včlenením transpozónu, vytvorená v kmeni organizmu, ktorý nemá regulátor alebo u ktorého je gén regulátora ochromený bežne používanou technikou. Transpozón používaný na inzerciu nesie tzv. reportný gén (napr. lacZ). Tento gén nemá promótor. Ak je vytvorená inzerčná knižnica, funkčná kópia regulačného génu je prenesená do knižnice buniek (napr. konjugáciou alebo elektroporáciou) a vyrastené bunky sú hodnotené na základe expresie reportného génu. V kolóniách, ktoré exprimujú reportný gén iba v prítomnosti regulačného génu, sú inzerty umiestnené bezprostredne za promótorom génu riadeného regulátorom. Ak vychádzame z predpokladu, že regulátor je špecifický pre APS biosyntetické gény, potom gény značené touto technikou sú APS biosyntetické gény. V tomto bode klonovaný regulačný gén je gafA gén, ktorý bol opísaný v PCT prihláške WO 94/01561, ktorý riadi expresiu génu pre biosyntézu pyrolnitrínu. Potom táto metóda je preferovanou metódou pre klonovanie génov pre biosyntézu pyrolnitrínu.
Alternatívna metóda pre určovanie a izoláciu génu z organizmu, nevyhnutného pre biosyntézu antipatogénnej látky (APS), kde expresia uvedeného génu je riadená regulátorom biosyntézy APS, zahrňuje:
(a) klonovanie knižnice genetických fragmentov z uvedených organizmov do vektora, ktorý susedí s reportným bezpromótorovým génom tak, že k expresii reportného génu dôjde iba v prípade, keď klonovaný fragment poskytuje funkciu promótora .
(b) prenos vektora, opísaného v bode (a) do vhodného hostiteľa (c) určenie transformantov z bodu (b), v ktorých dochádza k expresii (d) (e) uvedený reportný gén iba v prítomnosti spomenutého regulátora (f) určenie a izoláciu fragmentu DNK operabilne viazaného ku genetickému fragmentu, ktorý je prítomný v transformantoch určených v kroku (c) kde fragment DNK izolovaný a určený v bode (d) kóduje jeden alebo viac polypeptidov nutných pre biosyntézu uvedených APS.
Aby klonované APS gény boli použiteľné pre transgénnu expresiu je dôležité, že všetky gény nutné pre syntézu z určitého metabolitu boli určené a klonované. Použitie všetkých metód opísaných vyššie alebo ich kombinácií je možné pre akékoľvek APS. Aj keď väčšina APS biosyntetických génov je v organizme zoskupená dohromady, obvykle sú kódované jedným operónom, určenie všetkých génov bude možné z identifikácie jediného lokusu v mikroorganizme, ktorý produkuje APS. Predpokladá sa, že regulátory APS biosyntetických génov regulujú celú cestu, a teda klonovanie biosyntetických génov cez ich regulátory je atraktívna metóda klonovania týchto génov. V mnohých prípadoch regulátor riadi transkripciu jediného celého operónu, potom použitie tejto stratégie uľahčí klonovanie génov.
Metódou opísanou v tejto prihláške môžu byť klonované biosyntetické gény pre všetky APS. Vektory pre expresiu obsahujúce izolované molekuly DNK kódujú jeden alebo viac polypeptidov, nevyhnutných pre biosyntézu antipatogénnych látok, ako je pyrolnitrín a soraphen, môžu sa používať na transformáciu heterológneho hostitela. Vhodnými heterológnymi hostiteľmi sú baktérie, pliesne, kvasinky a rastliny. V preferovanom prevede ní vynálezu je transformovaný hostiteľ schopný syntetizovať antipatogénnu látku, ktorá sa v uvedenom hostiteľovi prirodzene neobjavuje. Hostiteľ potom rastie za podmienok, ktoré umožňujú produkciu uvedenej patogénnej látky, ktorú je potom možné získať z hostiteľa. Ak sa používajú metódy genetickej manipulácie a produkcie transgenických rastlín opísané v tejto špecifikácii, môžu byť klonované APS biosyntetické gény modifikované a vyjadrené v transgenických rastlinách. Vhodné biosyntetické gény zahrňujú tie, ktoré sú opísané na začiatku tejto sekcie, viď aminoglykozidy a iné sacharidy obsahujúce antibiotiká (napr. streptomycín), peptidové antibiotiká (tak bez účasti ribozómov, ako aj ribozomálne syntetizované typy), nuk22 leozidové deriváty a iné heterocyklické antibiotiká obsahujúce dusík/alebo kyslík (napr. polyoxíny, nikomycíny, fenazíny a pyrolnitrín), polyketidy, makrocyklické laktóny a chinóny (napr. soraphen, erytromycín a tetracyklín). Expresia v transgenických rastlinách bude riadená vhodným promótorom a zahrňuje vhodné bunkové cielenie, zohľadňujúc vhodné prekurzory nutné pre určité APS. Zatiaľ čo do vynálezu sa zamýšľa zahrnúť expresiu v transgenických rastlinách akéhokoľvek APS génu izolovatelného metódou opísanou v tejto špecifikácii, k tým, ktoré sú zvlášť preferované, patria gény pre pyrolnitrín, soraphen, fenazín a peptidové antibiotiká gramicidín a epidermín. Klonované biosyntetické gény môžu byť tiež vyjadrené v pôdnych organizmoch a alebo v organizmoch osídľujúcich rastliny za účelom preukázania a zvýšenia biokontrolnej účinnosti týchto organizmov. Zvlášť preferované APS gény pre tento účel sú tie, ktoré kódujú pyrolnitrín, soraphen, fenazín a peptidové antibiotiká .
Produkcia antipatogénnych látok ' v heterológnych mikrobiálnych hostiteľoch
Klonované APS gény môžu byť vyjadrené v heterológnych baktériách alebo pliesňach, ktoré sú schopné produkovať APS s vysokou účinnosťou. Metódy pre tieto genetické manipulácie sú špecifické pre rôzne dostupných hostiteľov a sú dobre známe. Napríklad vektory pKK223-3 a pKK223-2 sa môžu používať na vyjadrenie heterológnych génov v E. coli buď transkripčnou, alebo translačnou fúziou, za tac alebo trc promótorom. Za účelom expresie operónov kódujúcich mnohonásobné ORF, najjednoduchšou metódou je včlenenie operónu do vektora, ako je pKK223-3 v transkripčnej fúzii, čo umožňuje použiť podobné väzbové miesto na ribozóme heterológnych génov. Metódy pre nadmernú expresiu v gram-pozitívnych druhoch, ako je Bacillus, sú tiež známe a môžu sa používať v kontexte s týmto vynálezom (Quax et al. v: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, (ed.: Baltz et al., (American Society for Microbiology, Washington (1993)). Náhradné systémy pre nadmernú expresiu sa opierajú o kvasinkové vektory a používajú
Pichia, Saccharomyces a Kluyveromyces (Sreekrishna, v: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, (ed.: Baltz et al., (American Society for Microbiology, Washington (1993), Dequin and Barre, Biotechnology 12: 173-177 (1994), van den Berg et al., Biotechnology 8: 135-139 (1990)).
Klonované APS gény môžu byť tiež vyjadrené v heterológnych bakteriálnych a pliesňových hostiteľoch za účelom zvýšenia účinnosti biokontrolných kmeňov. Potom metóda na ochranu rastlín proti rastlinným patogénom spočíva v pôsobení na uvedenú rastlinu biokontrolným činidlom transformovaným jedným alebo viacerými vektormi, ktoré sú schopné vyjadriť všetky polypeptidy nevyhnutné pre reprodukciu antipatogénnych látok v množstve, ktoré inhibuje uvedený patogén. Mikroorganizmy, ktoré sú vhodné pre heterológnu nadmernú expresiu APS génov sú tie, ktoré sú schopné osídľovať rastliny alebo rizosféru. V prípade, že sa dostanú do kontaktu s fytopatogénnymi pliesňami, baktériami a nematódami, zabránia ich rastu. Do tejto skupiny sa zahrňujú gram-negatívne mikroorganizmy, ako sú Pseudomonas, Enterobacter a Serratia, gram-pozitívne mikroorganizmy Bacillus a pliesne Trichoderma a Gliocladium. Zvlášť preferovanými heterológnymi hostiteľmi sú Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas aurantiaca, Enterobacter cloacae, Serratia marscesens, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Trichoderma viride, Trichoderma harzianum a Gliocladium virens. V preferovanom uskutočnení vynálezu sú biosyntetické gény pyrolnitrínu, soraphenu, fenazínu a/alebo peptidových antibiotík prenesené do zvlášť preferovaných heterológnych hostiteľov, ktorí sú vyššie vymenovaní. V zvlášť preferovanom uskutočnení sú biosyntetické gény fenazínu a/alebo soraphenu prenesené a vyjadrené v kmeni CGA267356 druhu Pseudomonas fluorescens (opísané v publikovanej prihláške EP 0 472 494), ktorý má biokontrolnú funkciu, spôsobenú produkciou pyrolnitrínu (avšak nie fenazínu). Podľa vynálezu sú biosyntetické gény pre pyrolnitrín a/alebo soraphen prenesené do kmeňa 30-84 druhu Pseudomonas aureofaciens, ktorý má biokontrolné charakteristiky spôsobené produkciou fenazínu. Expresia v heterológnych biokontrolných kmeňoch vyžaduje výber vektora, vhodného pre replikáciu vo vybranom hostiteľovi, vhodnou voľbou promótora. Metódy expresie v gram-negatívnych a gram-pozitívnych baktériách a pliesňach sú dobre známe a sú opísané na inom mieste v tejto špecifikácii.
Expresia génov kódujúcich antipatogénne látky v rastlinách
Metóda na ochranu rastlín proti rastlinným patogénom je založená na princípe transformácie uvedenej rastliny jedným alebo viacerými vektormi, ktoré sú schopné spolu vyjadriť všetky polypeptidy nevyhnutné pre produkciu antipatogénnych látok v rastlinách v množstve, ktoré inhibuje rastlinné patogény. Podľa tohoto vynálezu APS biosyntetické gény vyjadrené v transgenetických rastlinách spôsobujú biosyntézu vybraných APS v týchto rastlinách. Týmto spôsobom sú tvorené transgenické rastliny so zvýšenou rezistenciou proti fytopatogénnym pliesňam, baktériám a nematódam. Za účelom ich vyjadrenia v transgenných rastlinách môžu APS gény a priľahlé sekvencie vyžadovať úpravu a optimalizáciu. I keď v mnohých prípadoch je expresia génov mikroorganizmov v rastlinách vysoká a ich modifikácia nie je nutná, nízka expresia v transgenických rastlinách môže byť spôsobená tým, že APS gemy majú kodóny, ktoré nie sú rastlinami preferované. Je známe, že všetky organizmy majú špecifické preferencie pre kodón, ktorý sa používa. APS génové kodóny môžu byť zamenené v súlade s preferenciami rastlín, pričom kód aminokyselín je zachovaný. Vysoká expresia v rastlinách je najlepšie dosiahnuteľná z kódových sekvencií, ktoré obsahujú najmenej 35 % GC, preferovaný počet je viac než
%. Expresia mikrobiálnych génov s nižším obsahom GC môže byť v rastlinách nízka, čo je spôsobené existenciou ATTTA motívu, ktorý môže destabilizovať informácie a AATAAA motívu, ktorý môže spôsobiť nesprávnu polyadenyláciu. Potencionálne APS biosyntetické gény sa môžu triediť vzhľadom na výskyt miest s nepravými strihovými miestami, ktoré môžu spôsobiť skomolenie informácie. Pre uskutočnenie všetkých zmien, ktoré treba urobiť v APS kódujúcej oblasti, napr. tie vyššie opísané, je možné použiť dobre známe metódy, ako sú bodová mutácia, PCR a konštrukcia syntetických génov, použitím metód opísaných v publikovaných prihláškach patentov EP 0 385 962 (Monsanto), EP 0 359 472 (Lubrizol) a WO 93/07278 (Ciba-Geigy). Preferované APS biosyntetické gény by nemali byť modifikované, mali by byť vyjadrované v cielene vybraných druhoch transgenických rastlín alebo i iných prípadoch môžu byť gény pozmenené odstránením destabilizácie a nevhodných polyadenylačných motívov a miest nepravých strihov. Ďalej môžu byť modifikované začlenením kodónu, ktorý je rastlinou preferovaný a výberom génov vzhľadom na rastlinami preferovaný obsah GC nukleotidov. I keď preferované génové oblasti môžu byť rovnako vyjadrené tak v jednoklíčnych, ako aj dvojklíčnych rastlinách, sekvencie môžu byť pozmenené vzhľadom na určité kodónové preferencie a preferencie pre obsah GC nukleotidov týchto rastlín. Tieto preferencie sa líšia (Murray et al. Nucl. Acid Res. 17: 477-498 (1989)) .
Na dosiahnutie účinnej iniciácie translácie, vyžaduje oblasť priľahlá k iniciačnému metionínu modifikáciu. Sekvencie, ktoré sú príbuzné vybraných APS génov, môžu a nemusia v rastlinách účinne iniciovať transláciu. V prípade, že účinnosť iniciácie translácie je nízka, sekvencie môžu byť modifikované začlenením sekvencie, o ktorej je známe, že v rastlinách je účinná. Joshi navrhol pre rastliny vhodný konsenzus (NAR 15: 6643-6653 (1987), SEQ ID č.: 8)) a Clontech navrhol ďalší konsenzus pre iniciátor translácie (1993/1994 katalóg, str. 210, SEQ ID č.: 7). V tomto vynáleze sú uvedené dohody využiteľné. Uvedené sekvencie sú začlenené do konštrukcií APS génov až po sekvenciu ATG alebo táto sekvencia môže byť zahrnutá (pritom druhá aminokyselina APS génu zostáva nezmenená) alebo alternatívne až po sekvenciu GTC, ktorá nasleduje po ATG, alebo ju možno zahrnúť (s možnosťou modifikácie druhej aminokyseliny transgénu). Voľba promótora sa bude meniť v závislosti od časových a priestorových požiadavok expresie a tiež v závislosti od cieľového druhu. Expresia v listoch je preferovaná pri ochrane rastlín proti foliárnym patogénom. Expresia v okvetí (napr. klas, metlina, palica atď.) je uprednostňovaná v prípade ochrany rastlín proti patogénom klasu. Expresia v koreňoch sa preferuje pri ochrane rastlín proti koreňovým patogénom. Ex26 presia v koreňoch a/alebo v semenáčoch je preferovaná pri ochrane semenáčov proti pôdnym patogénom. V mnohých prípadoch je žiadaná expresia génov látok proti viac ako jednému typu fytopatogénov. I keď rad promótorov z dvojklíčnych rastlín je funkčných v jednoklíčnych rastlinách a to platí i opačne, v ideálnom prípade promótory preferované dvojklíčnymi rastlinami sú vybrané pre expresiu v týchto rastlinách a promótory vhodné pre jednoklíčne rastliny pre expresiu v jednoklíčnych rastlinách. Neexistuje však žiadne obmedzenie, čo sa týka pôvodu vybraného promótora. Pre výber je dostatočné, že promótor je funkčný pre expresiu APS biosyntetických génov. V niektorých prípadoch expresie APS v rastlinách im môže poskytnúť, ochranu proti hmyzím škodcom. Transgenická expresia APS biosyntetických génov, napr. pre beauvericín (izolovaný z Beauveria bassiana) môže poskytnúť ochranu klasovitým rastlinám proti hmyzím škodcom.
Preferované promótory, ktoré sú vyjadrené ’ konštitučné, zahrňujú CaMV 35S a 19S promótory a promótory z génov, ktoré kódujú aktín a ubiquitín. Ďalšími preferovanými konštitučnými promótormi sú promótory z génov 12(4-28), CP21, CP24, CP38 a CP29, cDNK ktorých poskytuje tento vynález.
V tomto vynáleze môžu byť APS gény vyjadrené pri riadení promótorov, ktoré sú regulované chemicky. Táto metóda umožňuje syntézu APS iba vtedy, keď sú klasovité rastliny ošetrené indukujúcimi chemickými látkami, APS syntéza následne klesá. Preferovaná metóda pre chemickú indukciu genetickej expresie je opísaná v prihláške európskeho patentu EP 0 332 104 (Ciba-Geigy). Tu je včlenená ako referencia. Preferovaným promótorom pre chemickú indukciu je promótor PR-1 z tabaku.
Preferované promótory sú tie, ktoré je možné indukovať v poškodených miestach rastlín. Bol opísaný rad promótorov, ktoré sú vyjadrené v miestach poškodení rastliny a teda v miestach fytopatogénnej infekcie. Tieto sú vhodné pre expresiu APS génov, pretože biosyntéza APS sa začína na podnet fytopatogénne j infekcie a v okamihu, kedy sa infekcia prejaví, APS sú iba zhromažďované. V ideálnom prípade by takýto promótor bol aktívny iba lokálne v mieste infekcie a týmto spôsobom by sa APS akumulovali iba v bunkách, kde je syntéza APS nutná, za účelom zahubenia fytopatogénu, ktorý rastlinu napadol. Promótory tohoto druhu opisuje Stanford et al. Mol. Gen. Genet. 215: 200-208 (1989), Xu et al. Plánt Molec. Biol. 22: 573588 (1993), Logeman et al. Plánt Celí 1: 151-158 (1989), Rohrmeier and Lehle, Plánt Molec. Biol. 22: 783-792 (1993) Firek et al. Plánt Molec. Biol. 22: 129-142 (1993) a Warner et al. Plánt J. 3: 191-201 (1993).
Preferovaná špecifická tkanivová expresia zahrňuje expresiu v zelených častiach rastliny, v koreňoch, stvole a kvete. Promótory vhodné pre expresiu v zelenom tkanive zahrňujú rad tých, ktoré riadia gény uplatňujúce sa pri fotosyntéze. Ich veľká časť bola klonovaná z jednoklíčnych a dvojklíčnych rastlín. Preferovaný promótor je kukuričný PEPC promótor z génu pre fosfoenolovú karboxylázu (Hudspeth and Grula, Plánt Molec. Biol. 12: 579-589 (1989)). Preferovaný promótor pre špecifickú expresiu v koreňoch opísal de Fromond (FEBS 290: 103-106 (1991), EP 0 452 269 (Ciba-Geigy). Vynález poskytuje ďalší promótor tohoto druhu, ktorý pochádza z T-l génu. Preferovaný stonkový promótor je opísaný v patentovej prihláške WO 93/07278 (Ciba-Geigy), riadi expresiu kukuričného trpA génu.
Preferovaným uskutočnením vynálezu sú transgenické rastliny exprimujúce APS biosyntetické gény v koreňových tkanivách. V špeciálne preferovanom uskutočnení vynálezu, za účelom ochrany transferických rastlín proti fytopatogénu Rhizoctonia, sú biosyntetické gény pre pyrolnitrín vyjadrené za špecifickým koreňovým promótorom. V ďalšom zvlášť preferovanom uskutočnení vynálezu, za účelom ochrany transgenických rastlín proti fytopatogénu Gaeumannomyces graminis, sú biosyntetické gény pre kafenazín vyjadrené za špecifickým koreňovým promótorom. Iným preferovaným uskutočnením sú transgenické rastliny, ktoré sú schopné vyjadrovať APS biosyntetické gény v miestach poškodenia rastliny a v okamihu objavenia patogénnej infekcie. Napríklad, vynález zahrňuje expresiu biosyntetického génu pre soraphen, ktorý je exprimovaný za promótorom, aktivita ktorého je vyvolateľná vniknutím patogénu alebo vznikom poškodenia rastliny. Táto látka sa používa na kontrolu foliárnych patogénov.
Génové konštrukcie pre expresiu APS v rastlinách vyžadujú vhodný terminátor transkripcie, ktorý je pripojený na 3'-konci heterológneho APS génu. Niekoľko takýchto terminátorov je známych a dostupných (napr. tmi z CaMV, E9 z rbcS). V tomto vynáleze sa môže použití akýkoľvek dostupný terminátor, ktorý funguje v rastlinách.
Rad ďalších sekvencií môže byť. včlenených do exprimujúcich kaziet APS génov. Sú do nich zahrňované sekvencie, ktoré ako bolo ukázané, zvyšujú hladinu expresie, napr. sekvencia intrónu (sekvencia z Adhl a bronzel) a vírusové vedúce sekvencie (z TMV, MCMV a AMV).
Pre nadmernú produkciu APS v rastlinách je nutné, aby APS biosyntetické gény kódujúce prvý krok priebehu expresie mali prístup k substrátu. Pre každú jednotlivú APS a zvolenú cestu sa substrát trochu líši, rovnako ako jeho miesto výskytu v rastline. V mnohých prípadoch sa substrát môže nachádzať v cytosoloch, zatiaľ čo v iných prípadoch môže byť umiestnený v niektorej subbunkovej organele. Podľa toho, koľko biosyntetickej aktivity sa v rastline objavuje v chloroplastoch, sa často môže substrát nachádzať v chloroplastoch, a preto je najlepšie APS biosyntetické produkty smerovať do príslušnej organely (napr. chloroplastu). Použitím dobre známej metódy môže byť prevzatá subcelulárna lokalizácia transgénu, ktorý kóduje enzýmy. Je typické, že DNK kódujúca peptid zo známeho do organely cieleného génového produktu je manipulovaná a spojovaná na 3'-konci žiadaného APS génu/ον. Je známych mnoho takýchto cieľových sekvencií pre chloroplasty a bolo ukázané, ako fungujú v heterológnych konštrukciách. V preferovanom uskutočnení tohoto vynálezu sú gény pre biosyntézu pyrolnitrínu cielené do chloroplastu, pretože tryptofán, ktorý funguje ako substrát, je syntetizovaný v chloroplaste. V niektorých situá29 ciách môže nadmerná expresia APS génov ochudobniť dostupnosť substrátu v bunke a to môže mať nežiadúci účinok na bunku. V takýchto situáciách je vhodné zvýšiť množstvo substrátu, aby bol dostupný pri nadmernej expresii génov, ktoré kódujú enzýmy pre biosyntézu substrátu. V prípade tryptofánu (substrát pre biosyntézu pyrolnitrínu) sa to môže dosiahnuť nadmernou expresiou trpA a trpB génov a podjednotiek antranilátovej syntézy. Podobne bude nadmerná expresia enzýmov pre biosyntézu chorizmatu, ako je DAHP syntéza, ovplyvňovať produkciu prekurzora nutného pre vytvorenie fenazínu. Ďalšia možnosť, ako vylepšiť dostupnosť substrátu, je prerušenie známych ciest, ktoré využívajú špecifický substrát (tento spôsob nemusí byť sprevádzaný nežiadúcim vedľajším pôsobením). Týmto spôsobom sa syntetizovaný substrát privádza k biosyntéze APS a nie k iným zlúčeninám .
Vektory vhodné pre transformáciu rastlín sú opísané na inom mieste tejto špecifikácie. Pre transformáciu, ktorá je spojená s Agrobacterium, sú vhodné binárne vektory alebo vektory nesúce najmenej jednu hraničnú sekvenciu T-DNK, zatiaľ čo pre priamy prenos génu je vhodný akýkoľvek vektor. V tomto prípade sa preferuje lineárna DNK, ktorá obsahuje iba danú konštruk- ciu. V prípade priameho prenosu génu sa používa buď transformácia jediného druhu DNK alebo sa môže použiť ko-transformácia (Schocher et al. Biotechnology 4: 1093-1096 (1986)) . V oboch prípadoch je transformácia obvykle (ale nie nevyhnutne) značená selekčným markérom, ktorý môže poskytovať rezistenciu na antibiotiká (kanamycín, hygromycín alebo metatrexát) alebo na herbicíd (Bašta). Voľba selekčných markérov nie je predmetom vynálezu.
Syntéza APS v transgenických rastlinách často vyžaduje súčasnú nadmernú expresiu viacpočetných génov, ktoré kódujú APS biosyntetické enzýmy. To sa môže dosiahnuť transformáciou jednotlivých APS biosyntetických génov do rôznych rastlinných línií a potom krížením výsledných línií. Výber a zachovanie línií nesúcich viacnásobné gény je ľahší, ak každá rozdielna transformačná konštrukcia využíva odlišný selekčný markér. Lí30 nia, v ktorej všetky vyžadované APS biosyntetické gény boli nahromadené, bude syntetizovať APS, zatiaľ čo pri ostatných líniách k syntéze nedôjde. Tento prístup môže byť vhodný pre hybridné plodiny, ako je kukurica, v ktorých konečný hybrid je nevyhnutne kríženec dvoch rodičov. Udržanie rôznych inbredných línií s odlišnými APS génmi môže byť tiež vhodné v situáciách, kedy určitý priebeh APS syntézy môže viesť k viacnásobnému APS produktu, z ktorých má každý využitie. Využitím rôznych línií nesúcich odlišné alternatívne gény pre neskorší krok cesty je možné vytvoriť krížence s líniami, nesúce všetky zvyšné vyžadované gény a tak generovať rôzne hybridy nesúce odlišné vybrané APS, ktoré môžu mať rôzne využitie.
Iné metódy vytvorenia rastlinných línií nesúcich viacpočetné gény zahŕňajú retransformáciu existujúcich línií, ktoré už boli transformované APS génom alebo APS génmi (a výber s rôznym markérom). Ďalšou metódou je použitie jednoduchých transformačných vektorov, ktoré nesú viacpočetné APS gény, každý je vhodne riadený regulátorom (t.j. promótor, terminátor atď.) . Vzhladom na jednoduchosť vytvorenia DNK konštrukcie, je manipulácia klonovacím vektorom za účelom vnesenia viacnásobných APS génov preferovanou metódou.
Pred tým ako sa rastlinný množiaci materiál (plod, hľuza, zrno, semeno) predáva ako komerčný produkt, je opatrený ochranným poťahom, ktorý môže obsahovať herbicídy, insekticídy, fungicídy, baktericídy, nematocídy alebo zmesi niekoľkých týchto látok. K týmto zlúčeninám je možné pridať ďalšie nosiče, povrchové činidlá alebo iné látky, ktoré prispievajú k vytvoreniu prostriedku, poskytujúcemu ochranu proti poškodeniu bakteriálnymi, pliesňovými alebo zvieracími škodcami.
Za účelom úpravy semena sa môže na semeno aplikovať ochranný poťah, a to buď napustením hľúz alebo zrna kvapalným prípravkom, alebo potiahnutím kombinovaným mokrým alebo suchým prípravkom. V špeciálnych prípadoch možno na rastliny použiť ďalšie metódy aplikácie, ako je priame ošetrenie púčkov alebo plodov.
Podľa vynálezu obsahujú semená rastlín sekvencie DNK kódujúce produkciu antipatogénnych látok a môžu byť ošetrené ochranným povlakom, ktorý zahŕňa látky, ako sú kaptán, karboxín, tirám (TMTD R), metalaxyl (Apron R) , pirimifos-metyl (Actellic R) a ďalšie, ktoré sa bežne používajú na ochranu semien. Ďalším predmetom tohoto vynálezu je potom možnosť poskytovať rastlinný množiaci materiál, špeciálne semená, ktorý nesie gény pre produkciu antipatogénnych látok. Tento materiál je ošetrený ochranným povlakom, používaným na ošetrenie semien .
Produkcia antipatogénnych látok v heterológnych hostiteľoch
Tento vynález tiež poskytuje metódy pre získavanie APS. Tieto APS môžu negatívne ovplyvňovať rast mikróbov, zvlášť rastlinných mikróbov. APS môžu byť produkované vo veľkom množstve v organizmoch, v ktorých dochádza k nadmernej expresii APS génov. Vhodnými organizmami pre tento účel sú gram-negatívne a gram-pozitívne baktérie, kvasinky a tiež rastliny. Dôležité kritériá pre voľbu hostiteľa za účelom produkcie APS sú: jednoduchá manipulácia, rýchlosť rastu (t.j. fermentácie v prípade mikroorganizmov) a chýbajúca náchylnosť k nadmernej produkcii APS. Podľa vynálezu je väčšie množstvo antipatogénnej látky syntetizovné v hostiteľovi, v ktorom sa antipatogénne látky prirodzene vyskytujú. Uvedený hostiteľ je transformovaný jednou alebo viacerými DNK molekulami, ktoré spoločne kódujú celú sadu polypeptidov žiadaných pri syntéze citovanej antipatogénnej látky. Tieto metódy produkcie APS sú výhodné v technológii chemickej syntézy, ktorá sa obvykle používa na prípravu takých APS, ako sú antibiotiká. Tieto výhody sú: nízke náklady na výrobu a schopnosť syntetizovať preferované biologické enantioméry týchto látok, čo je protiklad k racemickým zmesiam generovaným organickou syntézou. Schopnosť produkovať stereochemicky vhodné zlúčeniny je zvlášť dôležité pre molekuly s mnohými chirálne aktívnymi atómami uhlíka. APS produkované heterológnym hostiteľom sa môžu používať v medicíne (t.j. kontrola patogénov alebo infekčných chorôb), ako aj v poľnohospodárstve .
Formulácie antipatogénnych zmesí
Vynález ďalej zahŕňa prípravu antipliesňovej zmesi, v ktorej aktívna zložka je antibiotická látka, produkovaná rekombinantným biokontrolným agens, ktoré je tiež predmetom vynálezu, alebo ide o suspenziu alebo koncentrát mikroorganizmov. Aktívna prísada je homogénne premiešaná s jednou alebo viacerými tu opísanými zlúčeninami. Tento vynález sa tiež týka metód ochrany rastlín proti rastlinným patogénom, ktoré zahŕňajú pôsobenie aktívnej zložky alebo antipliesňovej zmesi s aktívnou zložkou, na rastliny v množstve, ktoré je schopné inhibovať uvedené rastlinné patogény.
Aktívne zložky sú podľa tohoto vynálezu aplikované vo forme zmesí a môžu sa použiť na ošetrenie rastlín alebo obilných oblastí, spoločne s alebo následne po ďalších zlúčeninách. Týmito zlúčeninami sú hnojivá, donory mikronutrientov alebo ďalšie prípravky, ktoré ovplyvňujú rast rastlín. Môžu to byť tiež vybrané herbicídy, insekticídy, fungicídy, baktericídy, nematocídy, moluskocídy alebo zmesi niekoľkých týchto prípravkov, ktoré v spojení s nosičmi, povrchovo aktívnymi látkami alebo inými zložkami podporujú pôsobenie prípravku. Vhodné nosiče a adjuvans sú pevné alebo tekuté a zodpovedajú látkam uplatňujúcim sa v rôznych technológiách, napríklad: prírodné alebo regenerované minerálne látky, rozpúšťadlá, dispergačné činidlá, zmáčadlá, prostriedky na zlepšenie konfekčnej lepivosti, spojivá alebo hnojivá.
Preferovanou metódou pre aplikáciu aktívnej zložky alebo agrochemickej zmesi, ktorá obsahuje najmenej jednu aktívnu látku, je podľa vynálezu aplikácia na listy. Počet aplikácií a dávka závisí od intenzity zamorenia rastlinným patogénom (pliesňového typu). Aktívne zložky môžu vstupovať do rastlín cez korene z pôdy (systematická akcia) impregnáciou lokusu rastliny tekutou zmesou alebo zlúčenina sa môže do pôdy aplikovať v pevnej forme, napr. v granulách (pevná aplikácia). Aktívne zložky sa môžu tiež aplikovať priamo na semená (poťaho33 vanie), impregnáciou semien buď tekutým prostriedkom, obsahujúcim aktívne zložky, alebo poťahovaním pevným prípravkom. V špeciálnych prípadoch prichádzajú do úvahy ďalšie typy aplikácií, napr. selektívne ošetrenie rastlinných stvolov alebo pukov.
Aktívne zložky sa používajú v nezmenenej forme alebo prednostne spolu s adjuvans, ktoré dávajú formu prípravku a sú schopné vytvárať emulgovateľné koncentráty, poťahovateľné pasty, priamo rozstrekovateľné alebo rieditelné roztoky, riediteľné emulzie, zmáčavé prášky, rozpustné prášky, prach, granuláty a tiež kapslovanie, napr. pri polymérnych látkach. Rovnako ako povaha zloženia, metódy aplikácie, ako sú rozstrekovanie, atomizácia, práškovanie, rozptyl alebo rozlievanie sa volia podl'a súčasných a pretrvávajúcich okolností. Normálna aplikačná dávka je od 50 g do 5 kg aktívnej zložky (a.s) na hektár preferovaná dávka je od 100 g do 2 kg a.s./ha, najviac preferovaná dávka je od 200 g do 500 g a.s./ha.
Formulácia, zmesi alebo prípravky obsahujúce aktívne zložky, vhodné pevné alebo tekuté adjuvans, vhodné povrchovo aktívne látky sú pripravené známym spôsobom, napr. homogénnym miešaním a/alebo rozmelňovaním aktívnych zložiek s plnidlami, ktorými napr. sú rozpúšťadlá, pevné nosiče.
Vhodné rozpúšťadlá zahŕňajú aromatické uhlovodíky, prednostne frakcie s 8 až 10 atómami uhlíka, napr. zmes xylénov alebo substituované naftalény, ftaláty, ako sú dibutylftalát alebo dioktylftalát, alifatické uhlovodíky, ako je cyklohexán alebo parafíny, alkoholy, glykoly a ich étery a estery, ako je etanol, etylénglykol, monometyl alebo monoetyléter, ketóny, ako je cyklohexanón, silne polárne rozpúšťadlá, ako sú N-metyl-2-pyrolidón, dimetylsulfoxid alebo dimetylformamid, rovnako aj epoxidizované rastlinné oleje, ako sú epoxidizovaný kokosový olej alebo sójový olej; alebo voda.
Pevné nosiče používané napr. na vytvorenie prachu a disperzných púdrov, sú prírodné minerálne plnidlá, ako sú kalcit, mastenec, kaolín, montmorilonit alebo atapulgit. Za účelom zlepšenia fyzikálnych vlastností je tiež možné pridať vysoko dispergovanú kyselinu ortokremičitú alebo polymérny absorbent. Vhodné granulované adsorpčné nosiče sú porézne typy, napr. pemza, drvené tehly, sepiolit alebo bentonit; a vhodné nesorbentné nosiče sú materiály, ako je kalcit alebo piesok. Naviac sa môže použiť veľký počet pregranulovaných materiálov anorganického alebo organického pôvodu, napr. dolomit alebo rozmelnené zvyšky rastlín. V závislosti od povahy aktívnej zložky použitej vo formulácii, od vhodnej povrchovo aktívnej látky sú neiónové, katiónové a/alebo aniónové surfaktanty s dobrými emulzifikačnými, disperznými a zmáčacími vlastnosťami. Termín surfaktanty predstavuje tiež zmesi surfaktantov.
Vhodnými aniónovými surfaktantmi môžu byť vo vode rozpustné mydlá a vo vode rozpustné syntetické povrchovo aktívne látky.
Vhodné mydlá sú soli alkalických kovov, soli kovov alkalických zemín, nesubstituované alebo substituované amónium solí vyšších mastných kyselín (reťazec 10 až 22 atómov uhlíka), napr. sodné a draselné soli kyseliny olejovej alebo stearovej, alebo zmesi prírodných mastných kyselín, ktoré sa získavajú napr. z kokosového oleja alebo z loja. Metyltaurínové soli mastných kyselín sa môžu tiež používať.
Častejšie sa používajú tzv. syntetické surfaktanty, zvlášť mastné sulfonáty, mastné sulfáty, sulfónované deriváty benzimidazolu alebo alkylarylsulfonáty.
Mastné sulfonáty alebo sulfáty sú obvykle vo forme solí alkalických kovov, solí kovov alkalických zemín alebo nesubstituovaných alebo substituovaných amónium solí a majú alkyl radikál s 8 až 22 uhlíkmi, ktorý tiež zahŕňa alkyl časť alkyl radikálov, napr. sodné alebo vápenaté soli kyseliny lignosulfónovej, dodecylsulfátu alebo zmesi sulfátov mastných alkoholov, získaných prírodných mastných kyselín. Tieto zlúčeniny tiež obsahujú soli esterov kyseliny sírovej a kyseliny sulfó35 novej aduktov mastného alkoholu/etylénoxidu. Sulfónované benziimidazolové deriváty obsahujú 2 skupiny kyseliny sulfónovej a jeden radikál mastnej kyseliny, s 8 až 22 atómami uhlíka. Príklady alkylarylsulfonátov sú sodné, vápenaté alebo trietanolamínové soli kyseliny dodecylbénzénsulfónovej, kyseliny dibutylnaftalénsulfónovej alebo produkt kondenzácie kyseliny/formaldehydu naftalénsulfónovej. Vhodné sú tiež zodpovedajúce fosfáty, napr. soli esteru kyseliny fosforečnej aduktu p-nonylfenolu so 4 až 14 mol etylénoxidu.
Neiónové surfaktanty sú deriváty polyglykoléteru alifatických alebo cykloalifatických alkoholov, saturovanej alebo nesaturovanej mastnej kyseliny a alkylfenoly. Uvedené deriváty obsahujú 3-30 skupín glykoléteru a 8-20 atómov uhlíka v (alifatickej) uhľovodíkovej časti a 6-18 atómov uhlíka v alkylovej časti alkylfenolov. Ďalšie vhodné neiónové surfaktanty sú vo vode rozpustné adukty polyetylénoxidu s polypropylénglykolom, etyléndiamínpropylénglykolu a alkylpolypropylénglykolu s 1 až 10 atómami uhlíka v alkyl reúazci, ktorého adukt obsahuje 20 až 250 skupín etylénglykoléteru a 10 až 100 skupín propylénglykoléteru. Tieto zlúčeniny obvykle obsahujú 1 až 5 jednotiek etylénglykolu na jednotku propylénglykolu.
Reprezentatívne vzorky neiónových surfaktantov sú nonylfenolpolyetoxyetanoly, polyglykolétery ricínového oleja, adukty polypropylén-/polyetylénoxidu, tributylfenoxyetanol, polyetylénglykol a oktylfenoxyetoxyetanol. Ďalej sem patria estery mastných kyselín a polyoxyetylén sorbitanu a polyoxyetylénsorbitan trioleátu.
Katiónové surfaktanty sú kvartérne amónium soli, ktoré majú N- ako substituent, najmenej jeden C8-C22 alkyl radikál a ako ďalšie substituenty nižšie nesubstituované alebo halogénované alkyl, benzyl alebo nižšie hydroxyalkyl radikály. Tieto soli sú vo forme halidov, metylsulfátov alebo etylsulfátov, napr. stearyltrimetylamóniumchlorid alebo benzyldi(2-chloroetyl)-etylamóniumbromid.
Surfaktanty, ktoré sa používajú na vylepšenie formulácie sú opísané napr. v McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual, MC Publishing Corp. Ringwood, New Jersey, 1979, and Sisely and Wood, Encyclopedia of Surface Active Agents, Chemical Publishing Co., Inc. New York, 1980.
Agrochemické zmesi obvykle obsahujú približne 0,1 až 99 %, prednostne okolo 0,1 až 95 % a najlepšie okolo 3 až 90 % aktívnej zložky, okolo 1 až 99,9 %, prednostne okolo 1 až 99 % a najlepšie približne 5 až 95 % pevného alebo kvapalného adjuvans a okolo 0 až 25 %, prednostne 0,1 až 25 % a najlepšie okolo 0,1 až 20 % surfaktantu. Komerčné produkty sú vo forme koncentrátov a pred použitím sa riedia.
Príklady uskutočnenia vynálezu
A. Určenie mikroorganizmov produkujúcich antipatogénne látky
Mikroorganizmy môžu byť izolované z mnohých zdrojov a môžu byť vyšetrované pre ich schopnosť inhibovať pliesňový a bakteriálny rast in vitro. Väčšinou sú mikroorganizmy riedené a je s nimi inokulované médium, na alebo v ktorom sú pliesňové spóry, fragmenty mycélia alebo baktérie. Potom čisté zóny okolo novo izolovaných bakteriálnych kolónií sú indikáciou antipatogénne j aktivity.
Príklad 1
Izolácia mikroorganizmov s antipatogénnymi vlastnosťami proti Rhizoctonia z pôdy
Gram pôdy (obsahujúcej približne 10θ-10θ baktérií) sa suspenduje v 10 ml sterilnej vody. Po dôkladnom premiešaní sa pôdne častice nechajú usadiť. Za účelom získania 50-100 kolónií /platňa je pripravené vhodné riedenie a alikvóty sú inokulované na platne s nutričným agarom (alebo iným médiom, ak je to nutné). Čerstvo vypestované mycélia Rhizoctonia sa miešaním rozmelnia na fragmenty a suspenzia pliesňových fragmentov sa rozstrieka na agarové platne na kolónie baktérií, ktoré sú v rannej rastovej fáze. Sú práve viditeľné. Izolované baktérie s antipliesňovou aktivitou môžu byt určené podľa čistých bezpliesňových zón, ktoré ich obklopujú, pri ďalšej kultivácii.
Produkcia bioaktívnych metabolitov týchto izolátov je potvrdená ďalšou inokuláciou platní filtrátom kultúry živých kolónií, ako je uvedené vyššie. Takáto bio-skúška sa môže použiť na sledovanie čistenia metabolitov. Prvým krokom čistenia môže byt extrakcia s organickým rozpúšťadlom, po ktorej nasledujú odlišné chromatografické kroky v závislosti od skutočnosti, či aktívna zložka je extrahovaná do organickej fázy alebo zostáva vo vodnej fáze. Tieto chromatografické kroky sú dobre známe. Čistota a chemická identita sa určia použitím spektroskopických metód.
B. Klonovanie antipatogénnych biosyntetických génov do mikroorganizmu
Príklad 2
Klonovanie antipatogénnych biosyntetických génov z ich prirodzeného zdroja
Príbuzné biosyntetické gény sú v mikroorganizme umiestnené blízko seba a jediný operón kóduje viac než jeden otvorený čítací rámec. Preto jedným z prístupov pre klonovanie génov, ktoré kódujú enzýmy v jedinej biosyntetickej ceste je prenos fragmentu genómu z mikroorganizmu, ktorý má uvedenú cestu, do iného organizmu, ktorý túto cestu neobsahuje, s následným vyšetrením fenotypu potvrdením prítomnosti tejto cesty.
V prípade, že biosyntetické gény kódujú enzýmy, vedúce k produkcii antipatogénnych látok (APS), genomická DNK organizmu produkujúceho APS je izolovaná, štiepená reštrikčnou endonukleázou, takou ako je Sau3A, veľkosť je frakcionovaná, za účelom izolácie fragmentov vybranej veľkosti (vybraná veľkosť závisí od druhu vektora, ktorý bol použitý) a fragmenty vybranej veľkosti sú klonované do vektora (napr. BamHI namiesto kozmidového vektora) pre prenos do E. coli. Z výsledných klonov E. coli sa vyberú tie, ktoré produkujú antipatogénne látky. Takýto výber môže byť založený na priamej detekcii antipatogénne j látky, ako napr. biochemický test.
V inom prípade takýto výber môže byť založený na škodlivom pôsobení antipatogénnej látky na cieľový organizmus. Pri týchto vyšetrovaniach sú klony produkujúce antipatogénnu látku vybrané na základe ich schopnosti usmrtiť alebo spomaliť rast cieleného patogénu. Takáto inhibujúca aktivita tvorí základ pre štandardnú skúšku, ako je test na schopnosť tvoriť čisté zóny na bakteriálnych platniach, na ktorých je nanesený cieľový patogén (napr. spóry pri pliesňach, bunky pri baktériách) Klony vybrané na základe ich antipatogénnej aktivity môžu byť ďalej analyzované za účelom potvrdenia prítomnosti antipatogénnej látky, za použitia štandardných chemických a biochemických metód vhodných pre danú antipatogénnu látku.
Ďalšia charakterizácia a identifikácia génov kódujúcich biosyntetické enzýmy pre antipatogénnu látku sa dosiahne nasledovne. DNK inzert z pozitívnych E. coli sa izoluje a ďalej štiepi na menšie fragmenty. Menšie fragmenty sú znovu klonované a znovu včlenené do E. coli a následne testované pre určenie antipatogénneho fenotypu. V inom prípade môžu byť pozitívne klony podrobené ::Tn5 transpozónovej mutagenéze za použitia dobre známej metódy (napr. de Brujin and Lupski, Gene 27: 131-149 (1984)). Pri použití tejto metódy sa rad rozrušujúcich transpozónových inzertov vnesie do DNK, ktorá produkuje APS, a je možné určiť presnú oblasť/i, ktoré sú zodpovedné za produkciu APS. Následne, určenie sekvencie najmenšieho inzertu, ktorý prepožičiava klonu E. coli schopnosť produkovať APS, odhalí otvorené čítacie rámce nutné pre produkciu APS. Tieto čítacie rámce môžu byť ďalej rozrušené (ako je uvedené nižšie) za účelom potvrdenia ich úlohy pri biosyntéze antipatogénnej látky.
E. coli môže byť v tejto opísanej metóde nahradená rôznymi hostiteľskými organizmami, ako sú Bacillus a kvasinky. Pre transfer sa však musia použiť vektory vhodné pre daného hostiteľa. Voľba hostiteľského organizmu je limitovaná iba tým, že nesmie byť citlivý na antipatogénnu látku, ktorej biosyntetický gén sa do neho vnáša.
Príklad 3
Klonovanie biosyntetických génov antipatogénnej látky za použitia transpozónovej mutagenézy
Pre mnoho organizmov, ktoré produkujú antipatogénne látky, je transpozónová mutagenéza rutinnou metódou na vytvorenie inzerčných mutantov. Táto metóda bola použitá, okrem iného, pre kmene rodov Pseudomonas (napr. Lam et al., Plasmid 13: 200-204 (1985)), Bacillus (napr. Youngman et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 80: 2305-2309 (1983)), Staphylococcus (napr.
Pattee, J. Bacteriol. 145: 479-488 (1981)) a Streptomyces (napr. Shauer et al., J. Bacteriol. 173: 5060-5067 (1991)). Hlavná požiadavka na metódu je schopnosť vniesť do organizmu transpozón obsahujúci plazmid a umiestniť ho na náhodné miesto genómu. Vnesením transpozónu, ktorý nesie plazmid, do veľkého počtu mikroorganizmov je vytvorená veľká knižnica inzerčných mutantov. Za účelom vnesenia plazmidu do mikroorganizmu sa môže použiť akákoľvek štandardná metóda, ako je napr. konjugácia alebo metóda priameho prenosu, ako je elektroporácia.
Jedna transpozónová knižnica bola vytvorená spôsobom opísaným vyššie. Mutanty, ktoré nesú inzerty, sú testované na produkciu APS. Výsledkom transpozónovej inzercie do génových sekvencií, ktoré sú nutné pre biosyntézu APS, je prevažujúci výskyt APS negatívnych mutantov. Tieto mutanty sú vybrané pre ďalšiu analýzu.
DNK vybraných mutantov, ktorá je priľahlá k transpozónovému inzertu, je klonované za použitia štandardnej metódy.
Napríklad hostiteľská DNK priľahlá k transpozónovému inzertu môže byť klonovaná ako časť knižnice DNK, ktorá bola vytvorená z genomickej DNK vybraného mutantu. Táto priľahlá hostiteľská DNK je potom určená z knižnice, použitím transpozónu ako DNK sondy. Ak použitý transpozôn obsahuje vhodný gén pre antibiotikovú rezistenciu, potom DNK inzerčného mutantu môže byť štiepená reštrikčnou endonukleázou, ktorej reštrikčné miesto nie je v sekvencií génu pre danú rezistenciu alebo medzi touto sekvenciou a miestom hostiteľskej inzercie. Potom nasleduje klonovanie takto generovaných fragmentov do mikroorganizmov, ako je E. coli, ktoré sú podrobené selekcii za použitia zvolených antibiotík.
Sekvenovanie DNK vedľa včleneného transpozónu odhalí priľahlé hostiteľské sekvencie. Priľahlé sekvencie sa môžu použiť ako hybridizačné sondy pre opätovné klonovanie neštiepenej DNK prirodzeného hostiteľa za použitia nemutantnej hostiteľskej knižnice. Takto izolovaná DNK z ne-mutantov je charakterizovaná a používaná na doplnenie APS deficientného fenotypu mutanta DNK, ktorej doplnok môže obsahovať buď APS biosyntetické gény, alebo gény, ktoré regulujú časť alebo celú biosyntetickú cestu. Pre uistenie, že izolované sekvencie tvoria biosyntetické gény, môžu byť tieto sekvencie prenesené do heterológneho hostiteľa, ktorý neprodukuje APS a nie je citlivý na APS (napr. E.coli). Prenášaním stále menšieho fragmentu DNK a sekvenovaním najmenšieho efektívneho fragmentu možno identifikovať gény APS. V inom prípade je na pozitívne klony aplikovaná ::Tn5 transpozónová mutagenéza (napr. de Brujin and Lupski, Gene 27: 131-149 (1984)). Pri použití tejto metódy je rad rozrušujúcich transpozónových inzertov vnesený do DNK, ktorá produkuje APS, a je možné určiť presnú oblasť/i, ktoré sú zodpovedné za produkciu APS. Tieto neskoršie kroky sa uskutočňujú analogickým spôsobom, ktorý je opísaný v príklade 1. Aby sa zabránilo situácii, že klonované gény nebudú vyjadrené v heterológnom hostiteľovi, čo je spôsobené nefunkčnosťou ich heterológneho promótora, môžu byť klonované gény prenesené do vektora pre expresiu, kde fúzujú s promótorom, o ktorom je známe, že funguje v heterológnom hostiteľovi. V prípade E. coli je príkladom vhodného vektora pre expresiu pKK223, ktorý využíva tac promótor. Podobné vhodné promótory existujú i pre ďalších hostiteľov, ako sú kvasinky. Takáto fúzia prebieha jednoducho v závislosti od typu organizácie operónu v príbuzných mikrobiálnych génoch a od pravdepodobnosti, že biosyntetické enzýmy nutné pre syntézu APS sú kódované na jedinom transkripte, ktorý vyžaduje fúziu iba s jediným promótorom.
Príklad 4
Klonovanie antipatogénnych biosyntetických génov použitím mutagenézy a komplementácie
Podobná metóda ako vyššie opísaná zahrňuje metódu neinzerčnej mutagenézy (ako sú chemické a radiačné mutagenézy) spojenú s komplementáciou. Mikroorganizmy produkujúce APS sú podrobené neinzerčnej mutagenéze a mutanty, ktoré stratili schopnosť produkovať APS, sú vybrané pre ďalšiu analýzu. Génová knižnica je vytvorená z rodičovského kmeňa produkujúceho APS kmene. Jedným vhodným prístupom je ligácia 20-30 kb veľkých· fragmentov do vektora, ako je pVKlOO (Knauf et al. Plasmid 8: 45-54 (1982)), ktorý v E. coli nesie tra+ plazmid pRK2013 a ktorý bude schopný prenosu pomocou triparentálnej konjugácie späť do vybraného APS negatívneho mutanta. (Ditta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7247-7351 (1980)). Ďalší vhodný prístup je prenos génovej knižnice elektroporáciou späť do mutanta. V každom prípade nasleduje selekcia podľa produkcie APS. Vybrané kolónie sú ďalej charakterizované retransformáciou APS-mínus mutantov menšími fragmentmi doplnkovej DNK, za účelom identifikácie najmenšieho úspešne komplementujúceho fragmentu, ktorý je podrobený sekvenačnej analýze. Rovnako ako v príklade 2, gény izolované touto metódou môžu byť biosyntetické gény alebo gény regulujúce celú alebo časť APS biosyntetickej cesty. Pre uistenie, že izolované sekvencie tvoria biosyntetické gény, môžu byť tieto sekvencie prenesené do heterológneho hostiteľa, ktorý neprodukuje APS a nie je citlivý na APS (napr. E. coli). Tieto neskoršie kroky sa uskutočňujú analogickým spôsobom, ako je opísané v príkla42 de 2 .
Príklad 5
Klonovanie antipatogénnych biosyntetických génov použitím regulátorov, ktoré riadia expresiu biosyntetických génov
Ďalší prístup ku klonovaniu APS biosyntetických génov je založený na použití regulátorov, ktoré riadia expresiu týchto biosyntetických génov. V kmeňoch mikroorganizmov, ktoré nemajú regulátor alebo regulátor bol porušený konvenčnou metódou, bola vytvorená knižnica mutantov vzniknutých inzerciou transpozónu. Používaný inzerčný transpozón nesie reportný gén, ktorý nemá promótor (napr. lacZ). Keď bola vytvorená inzerčná knižnica, funkčná kópia regulátorového génu je prenesená do knižnice buniek (napr. konjugáciou alebo elektroporáciou) a inokulované bunky sú vybrané vzhľadom na expresiu reportného génu. Bunky sa testujú pred a po prenose regulátorového génu. Kolónie, v ktorých je vyjadrený reportný gén iba v prítomnosti regulátorového génu, majú inzert priľahlý k promótoru génov riadeným regulátorom. Za predpokladu, že regulátor je špecifický pre APS biosyntetické gény, potom gény označené touto metódou budú APS biosyntetické gény. Tieto gény potom môžu byť klonované a ďalej charakterizované použitím metódy opísanej v príklade 2 .
Príklad 6
Klonovanie antipatogénnych biosyntetických génov na základe homológie
Štandardné DNK metódy sa môžu používať pre klonovanie antipatogénnych biosyntetických génov na základe ich homológie so známymi génmi. Vytvorená DNK knižnica mikroorganizmov testovaná sondou, ktorou je rádioaktívne značená DNK odvodená z APS biosyntetických génov z odlišného organizmu. Novo izolované gény sú charakterizované, sekvenované a vnesené do heterológnych mikroorganizmov alebo mutovaných APS-mínus kmeňov prirodzených mikroorganizmov, za účelom demonštrácie ich schopnosti vniesť produkciu APS.
C. Klonovanie biosyntetických génov pre z kmeňov Pseudomonas pyrolnítrín
Pyrolnitrín je fenylpyrolová zlúčenina produkovaná rôznymi kmeňmi Pseudomonas fluorescens. Kmene P. fluorescens, ktoré produkujú pyrolnitrín, sú účinné biokontrolné kmene proti pliesňam Rhizoctonia a Pythium (WO 94/01561). Biosyntéza pyrolnitrínu začína z tryptofánu (Chang et al. J. Antibiotics 34: 555-566 (1981)).
Príklad 7
Použitie regulátorového génu gafA na izoláciu biosyntetických génov pyrolnitrínu z Pseudomonas
Použitím základných princípov opísaných v príklade 5 bolo izolované zoskupenie génov, ktoré kódujú pyrolnitrínové biosyntetické enzýmy. Regulátorový gén používaný v tejto izolačnej metóde bol gén gafA z Pseudomonas fluorescens, ktorý je časťou dvojzložkového regulačného systému, ktorý riadi isté biokontrolné gény v kmeňoch Pseudomonas. Gén gafA je opísaný v WO (94/01561, ktorá je tu včlenená ako referencia. Gén gafA ďalej opísal Gaffney et al. (Molecular Plant-Microbe Interactions 7: 455-463, 1994, je tu tiež včlenený ako referencia), kde je odkaz na náš ORF5. Gén gafA riadi biosyntézu pyrolnitrínu a produkciu chitinázy, gelatinázy a kyanidu. Kmene, ktoré nemajú gén gafA alebo ktoré majú nízku expresiu tohoto génu, sú vhodné pre použitie v tejto izolačnej metóde.
Príklad 8
Izolácia biosyntetických génov pre pyrolnitrín v kmeňoch Pseudomonas
Výsledkom prenosu génu gafA z kmeňa MOCG 134, ktorý je príbuzný pyrolnitrín negatívnych divokých typov kmeňov Pseudomonas fluorescens, je schopnosť týchto kmeňov produkovať pyrolnitrín. (Gaffney et al., MPMI (1994)); Hill et al. Applied and Environmental Microbiology 60: 78-85 (1994)). To indikuje, že tieto úzko príbuzné kmene majú štruktúrne gény potrebné pre biosyntézu pyrolnitrínu, ale nie sú schopné produkovať túto látku bez aktivácie vychádzajúcej z génu gafA. Jeden takto blízko príbuzný kmeň MOCG133 sa použil na identifikáciu pyrolnitrínových biosyntetických génov. Transpozón TnCIB116 (Lam, New Directions in Biological Control: Alternatives for Suppressing Agricultural Pests and Disease, str. 767-778, Alan R. Liss, Inc. (1990)) sa použil pre mutagenézu kmeňa MOCG133. Tento transpozón, derivát Tn5, kóduje kanamycínovú rezistenciu a obsahuje bezpromótorový lacZ reportný gén, ktorý leží blízko jedného konca transpozónu. Transpozón bol vnesený do kmeňa MOCG133 konjugáciou, za použitia plazmidového vektora pCIB116 (Lam, New Directions in Biological Control: Alternatives for Suppressing Agricultural Pests and Diseases, str. 767-778, Alan R. Liss, Inc. (1990)), ktorý môže byť mobilizovaný do MOCG133, ale nemôže byť v ňom replikovaný. Väčšina, ak nie všetky transkonjuganty, ktoré nesú kanamycínovú rezistenciu, boli preto výsledkom transpozície TnCIB116 do rôznych miest v genóme kmeňa MOCG133. Ak sa transpozón integruje do bakteriálneho chromozómu za aktívny promótor, lacZ reportný gén je aktivovaný. Táto génová aktivácia môže byť vizuálne monitorovaná za použitia substrátu X-gal, ktorý uvoľňuje nerozpustný modrý produkt na základe štiepenia produktu lacZ génu. Transkonjuganty rezistentné na kanamycín boli zhromaždené a nanesené do mriežky na master platňu, ktorej replika bola vytvorená na poraste kmeňa E. coli S17-1 (Šimon et al., Biotechnology 1: 784-791 (1983)), ktorý bol transformovaný plazmidom nesúcim RK2 začiatok replikácie pre široké rozpätie hostiteľov, gén pre tetracyklínovú selekciu a gén gafA. kmeň E. coli S17-1 obsahuje do chromozómu integrované gény tra, určené pre konjugačný transfer plazmidov. Potom výsledkom vytvorenia kópie inokulácie inzerčných transpozónových mutantov na poraste kmeňa E. coli S17/gafA je transfer plazmidu nesucého gén gafA do inzerčných transpozónových mutantov a možnosť testovať aktivi45 tu lacZ génu v prítomnosti gafA regulátora (expresia hostiteľského gafA je nepodstatná pre lacZ expresiu. Vnesenie gafA génu na plazmid, tvoriaci viac kópií, je efektívnejší). Boli určené inzerčné mutanty, ktoré majú modrý fenotyp (t. j. nesú lacZ aktivitu) iba v prítomnosti génu gafA. V týchto mutantoch bol transpozón integrovaný do génov, ktorých expresia je regulovaná génom gafA. Bola testovaná (ako je opísané v Gaffney et al. , 1994 MPMI, v tlači) schopnosť týchto mutantov (so začlenením génu gafA) produkovať kyanid, chitinázu a pyrolnitrín, čo sú aktivity regulované génom gafA (Gaffney et al., 1994 MPMI, v tlači). Jeden mutant neprodukoval pyrolnitrín, ale produkoval kyanid a chitinázu, čo indikuje, že transpozón bol včlenený do genetickej oblasti, ktorá je zahrnutá iba do biosyntézy pyrolnitrínu. DNK sekvencie lemujúce jeden koniec transpozónu boli klonované štiepením chromozomálnej DNK izolovanej z vybraného inzerčného mutanta reštrikčnou endonukleázou Xhol, ligáciou fragmentov vzniknutých týmto štiepením do Xhol miesta pSP72 (Promega, cat. No. P2191) a selekciou ligačnými produktmi transformovaných E. coli na kanamycín. Štiepiace miesto unikátneho enzýmu Xhol je v transpozóne za génom pre kanamycínovú rezistenciu, čo umožňuje izolovať lemujúcu oblasť odvodenú z materského kmeňa MOCG133 na tom istom Xhol fragmente. Bolo zistené Xhol reštrikčné miesto lemujúcej sekvencie, ktoré je umiestnené približne 1 kb od konca transpozónu. Subfragment klonovaného Xhol fragmentu odvodeného z ~1 kb veľkej lemujúcej sekvencie sa potom používal na izoláciu prirodzenej (t.j. neporušenej) oblasti génu z kozmidovej knižnice kmeňa MOCG134. Kozmidová knižnica bola vytvorená z čiastočne štiepenej MOCG134 DNK reštrikčnou nukleázou Sau3A, fragmenty s veľkosťou 30-40 kb boli klonované do BamHI miesta kozmidového vektora pCIB119, ktorý je derivátom c2XB (Bates and Swift, Gene 26: 137-146 (1983)) a pRK290 (Ditta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7247-7351 (1980)). pCIB119 je kozmidový vektor, ktorý nesie dve cos miesta a má široké rozpätie hostiteľov, čo sa týka RK2 začiatku replikácie a môže sa preto replikovať v Pseudomonas rovnako ako v E. coli. Niekoľko klonov bolo izolovaných z MOCG134 kozmidovej knižnice klonov použijúc ~1 kb veľkú lemujúcu sekvenciu ako hybridizačnú sondu. Z tých46 to klonov bol jeden schopný obnoviť produkciu pyrolnitrínu v transpozónovom inzerčnom mutante, ktorý stratil schopnosť produkovať pyrolnitrín. Tento kloň nesie inzert s veľkosťou ~32 kb a bol označený ako pCIB169. Kmeň E. coli DH5oC obsahujúci kozmidový kloň pCIB169 bol uložený v Agricultural Research Culture Collection (NRRL) v 1815 N. University Street, Peoria, Illinois', 61604 USA, 20.5.1994, pod prístupovým číslom NRRL B-21256.
Príklad 9
Mapovanie a Tn5 mutagenéza pCIB169 kb veľký inzert bol subklonovaný do pCIB189 v E. coli HB101, tento vektor je odvodený od pBR322, ktorý obsahuje ojedinelé Nôti klonovacie miesto. Nôti miesto v 32 kb veľkom inzerte, rovnako ako prítomnosť Nôti miest, ktoré lemujú BamHI klonujúce miesto rodičovského kozmidového vektora pCIB119 umožňuje subklonovanie fragmentov s veľkosťou 14 a 18 kb do pCIB189. Tieto klony boli oba mapované reštrikčnou analýzou a obr. 1 ukazuje výsledok tejto reštrikčnej analýzy. Oba subklony boli podrobené /L·. :Tn5 transpozónovej mutagenéze za použitia dobre známej metódy (napr. de Brujin and Lupski, Gene 27: 131-149 (1984)). ZTn5 fág, ktorý nesie rezistenciu na kanamycín, bol použitý pre transfekciu oboch 14 a 18 kb vyššie opísaných subklonov. Tn5 transfekcie boli urobené s multiplicitou infekcie 0,1 a s následnou selekciou na kanamycín. Za účelom izolácie plazmidového klonu, ktorý nesie Tn5 inzerciu, bola pripravená plazmidová DNK vhodná pre mutagenézu. Táto DNK bola retransformovaná do E. coli HB101 s kanamycínovou selekciou. Celkom 30 nezávislých Tn5 inzertov bolo mapovaných po dĺžke inzertu s veľkosťou 32 kb (obr. 2). Každý z týchto inzertov bol vnesený do MOCG124 dvojitou homológnou rekombináciou a bol overený Southern hybridizáciou za použitia Tn5 sekvencie a vektora pCIB189 ako hybridizačnej sondy. Týmto spôsobom bol dokázaný výskyt dvojitej homológnej rekombinácie, t.j. nahradenie génu divokého typu MOCG134 Tn5 inzerčným génom. Test na pyrolnitrín bol urobený pre každý inzert, ktorý bol vnesený do MOCG134 a bola určená genetická oblasť s približnou veľkosťou 6 kb, ktorá je zahrnutá do produkcie pyrolnitrínu (obr. 3 a 5). Zistilo sa, že táto oblasť je umiestnená v pCIB169 a bola jednoducho subklonovaná ako Xbal/NotI fragment do pBluescript II KS (Promega). Xbal/NotI subklon bol označený p?RN.9X/N (obr. 4) .
Príklad 10
Určenie otvoreného čítacieho rámca v klonovanej genetickej oblasti
Genetická oblasť zahrnutá do produkcie pyrolnitrínu bola subklonovaná do 6 fragmentov vo vektore pBluescript II KS za účelom sekvenovania (obr. 4). Tieto fragmenty zodpovedajú vyššie opísanému približne 6 kb veľkému Xbal/NotI fragmentu a tiahnu sa z EcoRI reštrikčného miesta na ľavej strane obrázku 4 do úplne pravého HindlII reštrikčného miesta (obr. 4). Sekvencia inzertov klonov pPRN1.77E, pPRNl.OlE, pPRN1.24E, pPRN2.18E, pPRN0.8H/N a pPRN2.7H boli určené pomocou Taq DyeDeoxy Terminátor Cycle sekvenčnej sady, ktorá bola poskytnutá firmou Applied Biosystem, Inc., Foster City, CA., podľa protokolu, ktorý poskytol výrobca. Sekvenčná reakcia prebehla na Applied Biosystems 373A automatickom sekvenátore DNK ovládanom softwarom INHERIT, ktorý tiež poskytla firma Applied Biosystems, Inc.. Bola získaná sekvencia DNK s veľkosťou
9,7 kb, ktorá zodpovedá Eco/RI/HindlII fragmentu z obr. 3 a je viazaná cez EcoRI reštrikčné miesto no.2 a HindlII miesto no.2 na obr. 4.
DNK sekvenčná analýza sa vykonala na susediacej 9,7 kb veľkej sekvencii za použitia GCG softwaru od firmy Genetics Computer Group, Inc. Madison, WI. S cieľom nájsť otvorené čítacie rámce (ORF) vo všetkých šiestich translačných rámcoch bol použitý program rozlíšenia vzoru. Pomocou tohto programu boli nájdené štyri otvorené čítacie rámce a tabuľka frekvencie kodónu z ORF2 gafA génovej oblasti bola publikovaná (WO 94/05793, obr. 5). Celé tieto ORF ležia v ~6 kb Xbal/NotI fragmente, ktorý bol opísaný v príklade 9 (obr. 4), a sú obsiahnuté v sekvenciách označených ako SEQ ID č.:l. Porovnaním tabuľky frekvencie použitia kodónu z MOCG134 DNK sekvencie gafA oblasti so sekvenciami týchto štyroch otvorených čítacích rámcov sa zistilo, že bolo používaných veľmi málo riedkych kodónov, čo indikuje, že použitie kodónu bolo podobné v oboch týchto génových oblastiach. Toto zistenie naznačuje, že štyri otvorené čítacie rámce sú skutočné. Na 3'-konci štvrtého otvoreného čítacieho rámca bol zistený rad β-nezávislých kmeňových slučkových štruktúr, čo naznačuje, že ide o oblasť, kde môže končiť transkripcia. Potom je zrejmé, že všetky štyri ORF boli preložené z jediného transkriptu. Zo získaných sekvenčných dát z oblasti za štyrmi ORF vyplýva prítomnosť piateho ORF, ktorý nie je zahrnutý do pyrolnitrínovej syntézy v E. coli.
Bolo nájdených viac putatívnych začiatočných miest translácie pre každý ORF v zoskupení pyrolnitrínového génu. Toto zistenie vyplýva z prítomnosti štartovacieho kodónu vnútri rámca (AG alebo GTC) a ribozomálneho väzbového miesta umiestneného upstream rámca. Na určenie skutočného začiatku translácie v každom géne bola použitá metóda komplementácie. Boli syntetizované PCR priméry pre amplifikáciu segmentov každého prn génu z jedného upstream umiestneného väzbového ribozomálneho miesta k downstream terminačnému kodónu (tab. 1. Plazmid pPRN18Not (15006 CIP3, obr. 4) bol použitý ako templát pre PCR reakciu. Produkt PCR bol klonovaný do vektora pRK(KK223-3MCS), ktorý pozostáva z Ptac promótora a rrs terminátora z pKK223-3 (Pharmacia) a z hlavného reťazca z pRK290. Plazmidy obsahujúce každú konštrukciu boli mobilizované do mutantov MOCG134, ktoré majú ORF deléciu, ako je opísané v príklade 12, a triparentálnym spojením za účasti pomocného plazmidu pRK290 do E. coli HB101. Transkonjuganty boli selektované nanesením na platne na pseudomonázové minimálne médium doplnené tetracyklínom s koncentráciou 30 mg/1. Prítomnosť plazmidov a správna orientácia včlenených produktov PCR boli potvrdené izoláciou plazmidovej DNK, reštrikčnou analýzou a elektroforézou v agarózovom géle. Produkcia pyrolnitrínu bola určená extrakciou a TLC testom ako v príklade 11. Najkratší kloň každé49 ho prn génu, schopný obnoviť produkciu pyrolnitrínu bol posudzovaný, či obsahuje skutočné miesto iniciácie translácie. Týmto spôsobom boli identifikované iniciačné kodóny: 0RF1-ATG pozícia nukleotidu 423, ORF2-GTC v nukleotidovej pozícii 2026, ORF3-ATG v nukleotidovej pozícii 3166 a ORF4-ATG v nukleotidovej pozícii 4894. Počítačový program FRAMES používaný na identifikáciu otvorených čítacích rámcov rozozná iba ATG štartovacie kodóny. Pri použití komplementácie, ako tu už bolo opísané, sa zistilo, že ORF2 začína GTG kodónom v nukleotidovej pozícii 2039 a je potom dlhší bež ORF, ktorý bol určený programom FRAMES.
Tabuľka 1: Konštrukcia DNK a hostitelia používaní na identifikáciu iniciačných miest v zoskupení pyrolnitrínového génua
Konštrukcia Začiatok amplifik. segmentu Putatívny štart. kodonb Terminačný kodon0 Koniec amplifik. segmentu Hostiteľ. Kmeňd Produkcia pyrolnitrínu
ORF1-1 294 357 2039 2056 ORF1D +
ORF1-2 396 423 2039 2056 ORF1D +
ORF1-3 438 477 2039 2056 ORF1D -
ORF2-1 2026 2039 3076 3166 ORF2D +
ORF2-2 2145 2162 3076 3166 ORF2D -
ORF2-3 2249 2215 3076 3166 ORF2D -
ORF3-1 3130 3166 4869 4904 ORF3D +
ORF3-2 3207 3235 4869 4904 ORF3D -
ORF3-3 3329 3355 4869 4904 ORF3D -
0RF4-1 4851 4894 5985 6122 ORF4D +
ORF4-2 4967 4990 5985 6122 ORF4D -
ORF4-3 5014 5086 5985 6122 ORF4D -
“ Všetky čísla nukleotidových sekvencií sa odvolávajú k sekvencií v zoskupení pyrolnitrínového génu daného v SEG ID č.:1
Prvá báza putatívneho štartovacieho kodónu e Posledná báza términačného kodónu d Mutanty s ORF deléciou, ako je opísané v príklade 12
Príklad 11
Expresia biosyntetických génov pre pyrolnitrín v E. coli
Za účelom zistenia, či sú potrebné pre produkciu pyrolnitrínu iba štyri gény, boli tieto gény prenesené do E. coli. Tieto kmene potom boli testované pre produkciu pyrolnitrínu. Na dosiahnutie nadmernej expresie klonovaného operónu v E. coli bol použitý vektor pre expresiu pKK223-3 (Brosius and Holý, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6926 (1984)). PKK233-3 obsahuje silný tac promótor, ktorý je v správnom hostiteľovi riadený lac represorom a je indukovaný pridaním izopropyl-BD-tiogalaktozidu (IPTG) do bakteriálneho média. Tento vektor bol modifikovaný adíciou ďalších reštrikčných miest za účelom zjednodušenia klonovania '6 kb Xbal/NotI fragmentu (príklad 7a, obr. 4) a 10 kb Xbal/KpnI fragmentu (obr. 4). V každom prípade klonovaný fragment bol riadený E. coli tac promótorom (s IPTG indukciou) a bol klonovaný v transkripčnej fúzii tak, že použité väzbové ribozomálne miesto by bolo to, ktoré je odvodené z Pseudomonas. Každý z týchto klonov bol transformovaný do E. coli XLl-modrých hostiteľských buniek a pred testovaním pre produkciu pyrolnitrínu chromatografiou na tenkej vrstve bol indukovaný s 2,5 mM IPTG. Po IPTG indukcii boli kultúry kultivované 24 hodín v 10 ml L pôdy pri 37 °C pri rýchlom miešaní, potom boli extrahované rovnakým objemom etylacetátu. Organická fáza bola získaná a odparená pri vákuu a zvyšok bol rozpustený v 20 μΐ metanolu. 10 μΐ extraktu bolo nanesené na chromatografické silikagélové platne (TLC), mobilnou fázou bol toluén. Platne sa nechali uschnúť a ich vizuali51 zácia prebehla postriekaním van Urkovým činidlom. Urkovo činidlo obsahuje 1 g dimetylaminobenzaldehydu v 50 ml 36 % HC1 a 50 ml 95 % etanolu. Za týchto podmienok sa pyrolnitrín objaví ako purpurové spoty na TLC platni. Tento test potvrdil prítomnosť pyrolnitrínu v oboch experimujúcich konštrukciách. HPLC a hmotnostná spektrometrálna analýza potvrdili prítomnosť pyrolnitrínu v oboch extraktoch. HPLC analýza prebehla priamo po rozpustení organickej fázy v metanole (v tomto prípade bola vzorka rozpustená v 55 % metanole), za použitia Hewlett Packard Hypersil ODS kolóny (5μΜ) s rozmermi 100 x 2,1 mm. Pyrolnitrin bol vymytý približne po 14 minútach.
Príklad 11a
Konštrukcia kmeňa MOCG134cPrn, ktorý má pyrolnitrínové biosyntetické gény riadené konštrukčným promótorom
Transkripcia pyrolnitrínových biosyntetických génov je regulovaná génom gafA. V tomto prípade transkripcia a produkcia pyrolnitrínu nedosahuje vysoké hodnoty až do neskorej logaritmickej a stacionárnej rastovej fázy. Za účelom zvýšenia biosyntézy pyrolnitrínu v ranných fázach rastu, bol endogénny promótor nahradený silným konštitučným E. coli tac promótorom. Prn gény boli klonované medzi tac promótor a silné terminačné sekvencie, ako je opísané v príklade 11. Výsledný syntetický operón bol včlenený do genomického klonu, ktorý má deléciu Prn biosyntetických génov, ale tiež má homológne sekvencie oboch '•upstream a downstream inzerčných miest. Tento kloň bol mobilizovaný do kmeňa MOCG134_Prn, čo je mutant, ktorému chýbajú gény Prn A-D. Prn gény, ktoré sú riadené konštitučným tac promótorom, boli včlenené do bakteriálneho chromozómu cestou dvojitej homológnej rekombinácie. Výsledný kmeň produkuje pyrolnitrín skôr než kmeň divokého typu. Produkcia pyrolnitrínu divokého kmeňa MOCG134, kmeňa MOCG134cPrn a kmeňa, ktorý nesie PRN plazmidové gény riadené tac promótorom (MOCG134pPrn), bola testovaná v rôznom čase (14, 17, 20, 23 a 26 hodín rastu).
Kultúry boli inokulované kultúrou v stacionárnej fáze s riedením 1/10 000, pyrolnitrín bol extrahovaný etylacetátom. Množ52 stvo pyrolnitrínu bolo určené integráciou oblasti piku pyrolnitrínu detekovanou HPLC pri 212 nm. Výsledky sú ukázané v tabuľke 3, z ktorej jasne vyplýva, že kmene obsahujúce Prn gény, riadené tac promótorom, produkujú pyrolnitrín oveľa skôr než divoký kmeň MOCG134. Nové kmene produkujú pyrolnitrín nezávisle od gafA a sú použiteľné ako nové biokontrolné kmene.
Tabuľka 3: Produkcia pyrolnitrínu rôznych kmeňov v rôznom čase
Čas rastu (hod) MOCG134a MOCG134cPrna MOCG134pPrn
14 1250 7100 18300
17 3500 14600 26700
20 9600 16600 32100
23 17500 18900 31000
26 25000 22500 33500
a Množstvo produkovaného pyrolnitrínu (oblasť píkov)
Príklad 12
Konštrukcia mutantov, ktoré majú deléciu pyrolnitrínového génu
Za účelom demonštrácie, že 4 ORF sa podieľa na biosyntéze pyrolnitrínu, v každom ORF boli vytvorené nezávislé delécie a ORF boli prenesené späť do kmeňa MOCG134 Pseudomonas fluorescens použitím homológnej rekombinácie. Plazmid, ktorý bol použitý pre vytvorenie delécií je opísaný na obr. 4 a pozície delécií sú ukázané na obr. 6. Každý ORF je identifikovaný v sekvencií označenej ako.SEQ ID č.:l.
ORF (SEQ ID Č. :2) :
Plazmid pPRN1.77E bol štiepený reštrikčnou endonukleázou
Mlul, 78 bp veľký fragment bol uvoľnený z 0RF1. Bol získaný 4,66 kb veľký vektor nesúci fragment, ktorý bol znovu ligovaný T4 DNK ligázou a transformovaný do hostiteľského kmeňa DH5<A- E. coli. Tento nový plazmid bol linearizovaný Mlul a veľký Klenow fragment DNK polymerázy I bol použitý pre zarovnanie koncov (Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) . Kazeta génu pre neomycín fosfotransferázu II (NPTII) z pUC4K (Pharmacia) bola ligovaná do plazmidu metódou ligácie slepých koncov a nová konštrukcia, označená pBS(ORFlá), bola transformovaná do DH5°c. Konštrukcia obsahovala 78 bp veľkú deléciu ORF1, v ktorej bol včlenený NPTII gén kódujúci rezistenciu na kanamycín. Inzert tohoto plazmidu (t.j. 0RF1 s NPTII inzerciou) bol potom vyrezaný z vektora pBluescript II KS endonukleázou EcoRI a ligovaný do EcoRI miesta vektoru pBR322 a transformovaný do kmeňa HB101 E. coli. Nový plazmid bol potvrdený reštrikčnou analýzou a označený pBR322(ORF1Ä).
0RF2(SEQ ID č.3) :
Plazmidy pPRNl.24E a pPRNl.OlE, ktoré obsahujú priľahlé EcoRI fragmenty ORF2, boli štiepené EcoRI a Xhol. Boli získané fragmenty s veľkosťou 1,09 kb z pPRNl.24E a 0,69 kb z pPRNl.OlE, ktoré boli ďalej ligované do EcoRI miesta vektora pPRN322. Výsledný plazmid bol transformovaný do hostiteľského kmeňa DHSoc a konštrukcia bola potvrdená reštrikčnou analýzou a elektroforézou. Plazmid bol potom linearizovaný Xhol, bola do neho včlenená kazeta NPTII génu z pUCK a nová konštrukcia, značená pBR(ORF2Ä), bola transformovaná do HB101. Konštrukcia bola potvrdená reštrikčnou analýzou a elektroforézou. Konštrukcia obsahuje NPTII inzert v 472 bp delécii ORF2 génu.
ORF3 (SEQ ID č.:4):
Plazmid pPRN2.56ph bol štiepený PstI za uvoľnenia 350 bp veľkého fragmentu. Bol získaný 2,22 kb veľký vektor, ktorý nesie daný fragment, a kazeta génu pre NPTII z pUCK4K bola ligovaná do PstI miesta vektora. Tento plazmid označený ako pUC(0RF3Ä), bol transformovaný do kmeňa DH5cA a bol potvrdený reštrikčnou analýzou a elektroforézou na agarózovom géle. Konštrukcia s génovou deléciou bola vystrihnutá z pUC Sphl a ligovaná do Sphl miesta pBR322. Nový plazmid, označený ako pBR(ORF5A), bol overený reštrikčnou analýzou a elektroforézou. Plazmid nesie NPTII gén v 350 bp veľkej delécii ORF3.
ORF4(SEQ ID č. :5) :
Plazmid pPRN2.18E/N bol štiepený AatlI. Uvoľnil sa fragment s veľkosťou 156 bp. Bol získaný 2,2 kb veľký vektor nesúci fragment, ktorý bol znovu ligovaný a transformovaný do DH5<A. Konštrukcia bola overená reštrikčnou analýzou a elektroforézou. Nový plazmid bol linearizovaný endokuleázou AatlI a T4 polymeráza bola použitá na zarovnanie koncov. Kazeta NPTII génu bola ligovaná do plazmidu pomocou ligácie slepých koncov. Nová konštrukcia označená pBS(ORF4Á) bola transformovaná do DH5oC. Inzert bol vystrihnutý z vektora pBluescript II KS endonukleázou EcoRI a ligovaný do EcoRI miesta vektora pBR322, ďalej bol vektor transformovaný do E. coli HB101. Nový plazmid bol označený pBR(ORF4Á) a overený reštrikčnou analýzou a elektroforézou. Tento plazmid obsahuje NPTII gén v 264 bp veľkej delécii ORF4 génu.
R
Kontrola Km
Za účelom kontroly možného účinku markéru pre kanamycínovú rezistenciu, kazeta NPTII génu z pUC4K bola včlenená do upstream oblasti génu pre pyrolnitrín. Plazmid pPRN2.5S (subklon pPRN7.2E) bol linearizovaný endonukleázou PSTI a NPTII kazeta bola ligovaná do PstI miesta. Plazmid bol transformovaný do DH5<á. a bol overený reštrikčnou analýzou a elektroforézou. Konštrukcia s inzertom bola vystrihnutá z pUC endonukleázou Sphl a ligovaná do SPhl miesta vektoru pBR322. Nový plazmid, označený pBR(2.5SphIKmR), bol overený reštrikčnou analýzou a elektroforézou. Plazmid obsahuje NPTII oblasť včlenenú do upstream oblasti pyrolnitrínového génu.
Každá z konštrukcií, ktorá má génovú deléciu, bola mobilizovaná do MOCG134 pomocou triparentálneho spojenia za použitia pomocného plazmidu pRK2013 v HB 101. Mutanty, ktorých gény boli zamenené, boli podrobené selekcii nanesením na platne s pseudomonasovým minimálnym médiom (PMM) doplneným kanamycínom s koncentráciou 50 jítg/ml. Ďalšia selekcia prebehla na PMM doplneným tetracyklínom 30 /i/g/ml. Putatívne mutanty s vymenenými génmi boli overené Southern hybridizáciou, kde endonukleázou EcoRI štiepená DNK bola hybridizovaná s pPRN18Not, pBR322 a kazetou NPTII získanou z pUC4K (Pharmacia 1994, kat. No. 27-4958-01). Overenie hybridizácie bolo zrejmé z výsledkov: pozitívna hybridizácia pPRN18Not s EcoRI fragmentom, ktorého veľkosť sa zmenila (reflektujúc na deléciu a inzerciu NPTII), pozitívna hybridizácia sondy NPTII k uvedenému EcoRI fragmentu, neobjavil sa hybridizačný pruh zodpovedajúci delécii fragmentu a neprebehla hybridizácia k pBR322. Mutanty s deléciou boli testované pre produkciu pyrolnitrínu, 2hexyl-5-propyl-rezorcinolu, kyanidu a chitinázy. Delécia v akomkoľvek ORF zrušila produkciu pyrolnitrínu, ale neovplyvnila produkciu ďalších látok. Prítomnosť kazety NPTII génu pri KmR selekcii nemá žiadny účinok na produkciu pyrolnitrínu, 2-hexyl-5-propyl-rezorcinolu, kyanidu alebo chitinázy. Tento pokus ukazuje, že každý zo štyroch ORF je nutný pre produkciu pyrolnitrínu.
Príklad 12a
Klonovanie kódovacej oblasti pre expresiu v rastlinách
Kódujúce oblasti ORF 1,2,3 a 4 boli označené ako prnA, prnB, prnC a prnD. Pre každý prn gén boli vytvorené priméry pre PCR amplifikáciu kódujúcich oblastí z miesta štartovacieho kodónu do alebo za terminačný kodón. Za účelom pripojenia reštrikčných miest ku koncom kódujúcich oblastí, a v prípade prnB, za účelom zmeny iniciačného kodónu z GTG na ATG boli navrhnuté priméry. Plazmid pPRN18Not (obr. 4) bol použitý ako templát pre PCR reakcie. PCR produkty boli klonované do pPEH14 a bola testovaná ich funkcia. Plazmid pPEH14 je modifi56 káciou pRK(KK223-3), ktorý obsahuje syntetické ribozomálne väzbové miesto na pozícii 11 až 14 bázy upstream štartovacích kodónov klonovaného PCR produktu. Konštrukcia bola mobilizovaná do mutantov nesúcich ORF deléciu triparentálnym spojením, ako už bolo opísané skôr. Prítomnosť každého plazmidu a správna orientácia včleneného PCR produktu boli potvrdené reštrikčnou analýzou a elektroforézou izolovanej plazmidovej DNK. Produkcia pyrolnitrínu komplementovanými mutantmi bola potvrdená rovnako ako v príklade 11.
Bola overené expresia funkčného proteínu každej kódujúcej oblasti (tzn. bola ukázaná schopnosť obnoviť produkciu pyrolnitrínu v mutantoch, ktoré majú ORF deléciu), klony boli sekvenované a sekvenčné údaje boli porovnané so sekvenciami zoskupení pyrolnitrínového génu (11506 CIP3). V prnA, prnB a prnC boli sekvencie amplifikovanej kódujúcej oblasti identické so sekvenciami pôvodného génového zoskupenia. V prnD došlo k zmene jedinej bázy v pozícii 5605 z G pôvodnej sekvencie na A v amplifikovanej kódujúcej oblasti. Táto zmena ovplyvní dedukované aminosekvencie. Dôjde k zámene glycínu za serín, ale neovplyvní sa funkcia génového produktu z hľadiska komplementačných testov opísaných vyššie.
Tabuľka 2: Kódujúce oblasti prn génov3
Kódujúca oblasť Začiatok amplif. segmentu Štartovací kodónb Terminač. kodónc Koniec amplif. segmentu
prnA 423 423 2039 2055
prnB 2039 2039 3076 3081
prnC 3166 3166 4869 4975
prnD 4894 4894 5985 5985
a Všetky čísla nukleotidových pozícií sa odvolávajú na sekvencie ID Č . : 1 b Prvá báza štartovacieho kodónu c Posledná báza kodónu
Príklad 12b
Expresia prn génov v rastlinách
Kódujúca oblasť pre každý prn gén, opísaný v príklade 12, bola subklonovaná do kazety, ktorá je schopná expresie v rastlinách. Kazeta sa skladá z promótora CaMV 35S, vedúcej sekvencie a terminátora CaMV 35S lemovaného Xbal reštrikčným miestom. Každá konštrukcia obsahujúca promótor, kódujúcu oblasť a terminátor, bola uvoľnená Xbal reštriktázou a subklonovaná do binárneho transformačného vektora pCIB200 a potom vnesená do hostiteľského kmeňa A136 Agrobacterium tumifaciens. Transformácia vektora do rastliny tabaku bola urobená podľa opisu Horscha et al., Science 227: 1229-1231, 1985. Transformácia do Arabidopsis prebehla podľa opisu Lloyda et al., Science 234: 464-466, 1986. Rastlinky boli selektované a regenerované na médiu obsahujúcom 100 mg/1 kanamycínu a 500 mg/1 karbenecilínu.
Z jednotlivých transformovaných rastlín bolo získané listové tkanivo. Za účelom získania každej génovej konštrukcie použitej pre transformáciu bolo listové tkanivo z desiatich nezávislých transformovaných rastlín Arabidopsis zlúčené dohromady. RNK sa čistila fenol/chloroformovou extrakciou a rozdelila sa elektroforézou na formaldehydovom géle, následne bola blotovaná na nylonovú membránu. Boli vytvorené sondy pre každú kódujúcu oblasť za použitia random primed labeling metódy. Hybridizácia prebiehala v 50 % formaldehyde a pri 42 °C, ako je opísané v Sambrook et al., Molecular Cloning, 2n^ ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. Boli identifikované transgenické tabakové rastliny pre každý prn gén. Tieto rastliny vykazujú pruhy RNK hybridizujúce silne s príslušnou sondou prn génu, ktoré majú očakávanú veľkosť mRNK transkriptov pre relevantné prn gény. Podobné pruhy boli tiež nájdené v RNK extrahovanej zo spojených vzoriek tkaniva z Arabidopsis. Údaje ukazujú, že mRNK kódujúce enzýmy pre pyrolnitrínovú biosyntetickú cestu, sú akumulované v transgenických rastlinách.
D. Klonovanie biosyntetických génov pre rezorcinol z Pseudomonas
2-hexyl-5-propyl-rezorcinol je ďalšia APS produkovaná istými kmeňmi Pseudomonas. Táto látka má antipatogénnu aktivitu proti gram-pozitívnym baktériám (čiastočne Clavibacter spp.), mykobaktériám a pliesňam.
Príklad 13
Izolácia génov kódujúcich rezorcinol
Boli izolované dva mutanty, ktoré nesú transpozónový inzert, ktorým chýba schopnosť produkovať antipatogénnu súbstanciu 2-hexyl-5-propyl-rezorcinol. Produkcia tejto látky v Preudomonas fluorescens je regulovaná gafA génom (WO/01561). Inzercia transpozónu bola použitá na vytvorenie knižnice mutantov v MOCG134 a gafA” derivátov kmeňa MOCG134 (BL1826). Táto konštrukcia bola testovaná na zmeny schopnosti inhibície plies ní in vitro; neskôr bola triedená podľa génov regulovaných génom gafA po včlenení gafA do plazmidu (sekcia C). Vybrané mutanty boli testované pomocou HPLC na produkciu známych zlúčenín, ako sú pyrolnitrín a 2-hexyl-5-propyl-rezorcinol. HPLC test je schopný porovnať nové mutanty s divokým rodičovským kmeňom. V žiadnom prípade nebol v mutantoch nájdený HPLC pík, ktorý zodpovedá zlúčenine 2-hexyl-5-propyl-rezorcinol. Mutant odvodený z kmeňa MOCG134 bol označený ako BL1846. Mutant odvodený z kmeňa BL1826 bol označený ako BL1911. HPLC na rezorcinol prebehla rovnako ako na pyrolnitrín (príklad 11) s tým rozdielom, že ako elučné činidlo sa používa 100 % metanol a rezorcinol je eluovaný za 20 min. Rezorcinolové biosyntetické gény môžu byť klonované z vyššie opísaných mutantov nasledujúcim spôsobom. Z mutantov je pripravená genomická DNK. Klony obsahujúce inzerciu transpozónu a priľahlé pseudomonázové sekvencie sa získajú selekciou na kanamycín (rezistencia na kanamycín je kódovaná na transpozóne). Klonované pseudomonazové sekvencie sa potom používajú ako sonda na identifikáciu prírodných sekvencií pre genomickú knižnicu kmeňa MCG134 P.
fluorescens. Klonované prirodzené gény pravdepodobne reprezentujú rezorcinolové biosyntetické gény.
E. Klonovanie biosyntetických génov pre soraphen zo Sorangium
Soraphen je polyketidové antibiotikum produkované myxobaktériou Sorangium cellulosum. Táto zlúčenina má široké antipliesňové aktivity, čím je užitočná hlavne v poľnohospodárstve Soraphen je účinný tiež proti foliárnym patogénom.
Príklad 14
Izolácia zoskupenia génov pre soraphen
Genomická DNK bola izolovaná zo Sorangium cellulosum a čiastočne štiepená reštrikčnou Sau3A. Vybrané fragmenty s veľkosťou 30 až 40 kb boli klonované do kozmidového vektora pHC79 (Hohn and Collins, Gene 11: 291-298 (1980)), ktorý bol predtým štiepený reštriktázou BamHI a upravený alkalickou fosfotázou, aby sa predišlo vzájomnej ligácii molekúl vektora. Ďalej bola vytvorená kozmidová knižnica, ktorá bola analyzovaná sondou, čo je 4,6 kb veľký fragment obsahujúci graľ oblasť kmeňa Tu22 Streptomyces violaceoruber kódujúci ORF 1-4, zodpovedný za biosyntézu granaticínu v S. violaceoruber. Boli identifikované kozmidové klony, ktoré hybridizujú s gral sondou a ich DNK bola izolovaná pre reštrikčnú analýzu a ďalej hybridizovaná. Zistilo sa, že kozmid p98/l obsahuje 1,8 kb veľký Sali fragment, ktorý silne hybridizuje s gral oblasťou; tento Sali fragment bol lokalizovaný vo väčšom 6,5 kb Pvul fragmente p98/l ~40 kb veľkom inzerte. Určenie sekvencií, ktoré sú časťou 1,8 kb Sali inzertu, vykazujú homológiu s acetyltransferázovými proteínmi, nutnými pre syntézu erytromycínu. Bola -vytvorená reštrikčná mapa kozmidu p98/l, ktorá je zobrazená na obr 7. Kultúra E. coli HB101 obsahujúca kozmidový kloň 98/1 bola uložená v Agriculture Research Culture Collection (NRRL) v 1815 N. University Street, Peoria, Illinois 61604 USA, 20.5.1994, pod prístupovým číslom NRRL B-21255.
Sekvencia DNK zoskupenia génov pre soraphen je opísaná v SEQ ID č.:6.
Príklad 15
Funkčná analýza zoskupení génov pre soraphen
Použitím metódy rozrušenia génov bola identifikovaná oblasť v p98/l, ktorá kóduje proteíny podieľajúce sa na biosyntéze soraphenu. Fragmenty DNK z kozmidu p98/l boli odštiepené reštriktázou Pvul a klonované do jedinečného Pvul klonujucého miesta (ktoré leží v géne pre ampicilínovú rezistenciu) plazmidu pSUP2021, ktorý má použitie pre široký okruh hostiteľov (Šimon et al., v Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interaction (ed.: A. Puhler), Springer Verlag, Berlín, str. 98-106 (1983)). Transformovaný E. coli HB101 bol selektovaný na základe rezistencie na chloramfenikol, ale senzitivita na ampicilín. Vybrané kolónie s príslušným inzertom boli konjugáciou transferované do Sorangium cellulosum kmeňa SJ3, použitím metódy publikovanej v prihláške EP 0 501 921 (Ciba-Geigy).
Plazmidy boli transferované do E. coli ED8767, ktorá nesie pomocný plazmid pUZ8 (Hedges and Mathew, plazmid 2: 269-278 (1979)) a darcovské bunky boli inkubované s bunkami Sorangium cellulosum SJ3 zo stacionárnej kultúry, určenej pre konjugačný transfer (opísané v EP 0 501 921 (príklad 5) a EP - neskoršia prihláška (príklad 2). Selekcia bola urobená na kanamycín, fleomycín a streptomycín. Zistilo sa, že žiadne takto testované plazmidy nie sú schopné sa replikovať v Sorangium cellulosum, ale skôr dochádza k integrácii celého plazmidu do chromozómu pomocou homológnej rekombinácie, ktorá sa objavuje s nízkou frekvenciou v mieste s klonovaným fragmentom. Tento prípad môže byť selektovaný na základe prítomnosti markéru pre antibiotikovú rezistenciu v plazmide. Výsledkom integrácie plazmidu do daného miesta je inzercia plazmidu do chromozómu a zrušenie tejto oblasti je sprievodným javom. Preto môže byť testovaný daný fenotyp, t.j. produkcia soraphenu a porušený fenotyp indikuje, že DNK oblasť klonovaná do plazmidu musí mať istú úlohu pri determinácii tohoto fenotypu.
Boli vybrané rekombinantné klony pSUP2021 s Pvul inzertmi s približnou veľkosťou 6,5 kb (pSN105/7), 10 kb (pSN120/l0),
3,8 kb (pSNl20/43-39) a 4,0 kb (pSN120/46). Mapa umiestnenia (v kb) týchto Pvul inzertov je na obr. 7: pSN125/7 25.0-31.7, pSN120/l0 2.5-14.5, pSNl20/43-39 16.1-20.0 a pSN120/46 20.024.0. pSN105/7, ako bolo dokázané štiepením endonukleázami PvUI a Sali, je tu obsiahnutý fragment s veľkosťou 1,8 kb (odkaz na príklad 11). Génové rozrušenie 3,8, 4,0,6,5 a 10 kb veľkých Pvul fragmentov vedie k eliminácii produkcie soraphenu. Tieto výsledky svedčia o tom, že všetky tieto fragmenty obsahujú gény alebo fragmenty, ktoré ovplyvňujú produkciu tejto zlúčeniny.
Ďalej bola metóda rozrušenia génov použitá v dvoch BglII fragmetoch odvodených z kozmidu p98/l. Veľkosti týchto fragmentov sú 3,2 kb (mapa lokácie 32,4-35,6 je na obr. 7) a 2,9 kb (mapa lokácie 35,6-38,5 je na obr. 7). Tieto fragmenty boli klonované do BamHI miesta plazmidu pCIB132, ktorý je odvodený z pSOP2021 podľa obr. 8.5 kb veľký Nôti fragment vektora pSUP2021 bol vystrihnutý a invertovaný, s následným odstránením ~3 kb veľkého BamHI fragmentu. Každý z týchto BglII fragmentov bol schopný porušiť biosyntézu soraphenu, keď bol znovu včlenený do Sorangium, metódou už opísanou. To dokazuje, že DNK týchto fragmentov nemá žiadnu úlohu v biosyntéze soraphenu. Preskúmanie DNK sekvencií ukázalo prítomnosť tioesterázovej oblasti blízko BglII reštrikčného miesta v lokácii 32,4. Bezprostredne za tioesterázovou oblasťou je terminačný kodón transkripcie, ktorý pravdepodobne vymedzuje koniec ORF1 kódovacej oblasti. Napriek tomu, že 2,9 a 3,2 veľké BglII fragmenty ležia bezprostredne na pravo od týchto sekvencií, je pravdepodobné, že downstream ORF1 neleží žiadny gén, ktorý sa podieľa a biosyntéze soraphenu.
Zobrazenie ľavého konca biosyntetickéj oblasti vyžaduje izoláciu dvoch ďalších kozmidových klonov, pJLl a pJL2, ktoré prekrývajú p98/l na ľavom konci, ale zahrňujú viac DNK na ľavej strane p98/l. Tieto klony boli izolované hybridizáciou 1,3 kb veľkým BanHI fragmentom lokalizovaným na ľavom konci p98/l (mapa lokalizácie 0,0-1,3) s génovou knižnicou kmeňa Sorangum cellulosum. Treba poznamenať, že BamHI miesto v pozícii 0,0 neexistuje v chromozóme S. cellulosum, ale bolo vytvorené ako artefakt z ligácie Sau3A reštrikčného fragmentu derivovaného z genómu Sorangium cellulosum v BamHI klonovacom mieste vektora pHC79. Southern hybridizácie s 1,3 kb veľkým BamHI fragmentom demonštruje, že pJLl a pLJ3 obsahujú približne 12, 5 kb veľký BamHI fragment, ktorý obsahuje sekvencie bežné v 1, 3 kb veľkom fragmente. Tento fragment je fakticky zobrazený pomocou BamHI miesta v pozícii 1,3. Kultúra kmeňa E. coli HB101, obsahujúca kozmidový kloň pJL3, bola uložená v Agricultural Research Culture Collection (NRRL) v 1815 N. University Street, Peoria Illinois, 61604 USA, 20.5.1994, pod prístupovým číslom NRRL B-21254. Metóda rozrušenia génov používajúc 12,5 kb BamHI fragment indikuje, že tento fragment obsahuje sekvencie, ktoré sú zahrnuté do syntézy soraphenu. Rozrušenie génov za použitia menšieho EcoRV fragmentu odvodeného z tejto oblastí indikuje potrebu tejto oblasti pre biosyntézu soraphenu. Keď sa použije metóda rozrušenia génov, dva EcoRV fragmenty veľkosti 3,4 a 1,1 kb, ktoré sú umiestnené vedľa distálneho BamHI miesta na ľavom konci 12,5 kb veľkého fragmentu, dokážu redukovať biosyntézu soraphenu.
Príklad 16
Sekvenčná analýza zoskupenia génov pre soraphen
Sekvencia DNK zoskupení génov pre soraphen boli určené od Pvul reštrikčného miesta v pozícii 2,5 až do BglII miesta v pozícii 32,4 (obr. 7). Sekvenovanie bolo urobené za použitia Taq DyeDeoxy Terminátor Cycle sekvenačnej sady, ktorú poskytla firma Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA. Podľa protokolu výrobcu. Sekvenačná reakcia prebehla na automatizovanom DNK sekvenátore Applied Biosystems 373A, za použitia Software INHERIT od firmy Applied Biosystems, Inc. Program rozlíšenia vzoru FRAMES sa používal na vyhľadávanie ORF vo všetkých šiestich translačných rámcoch DNK sekvencií. Celkove bolo zhromaždených približne 30 kb a tie korešppondujú s oblasťou, ktorá je nenahraditeľná pre biosyntézu soraphenu, opísané v príklade 12. Táto sekvencia kóduje dva ORF, ktorých Štruktúra je opísaná nižšie.
ORF1
0RF1 je približne 25,5 kb veľký a kóduje päť biosyntetických modulov. Vykazuje homológiu s modulmi nájdenými v biosyntetických génoch pre erytromycín v Saccharopolyspora erythrea (Donadio et al., Science 252: 675-679 (1991)). Každý modul obsahuje [^-ketoacylsyntázu (KS) , acyltransferázu (AT) , ketoreduktázu (KR) a oblasť proteín acyl nosiča (ACP), ako aj oblasť pre spracovanie (1-ketónov, ktorá môže zahŕňať dehydratázu (DH) a/alebo oblasť enoylovej reduktázy (ER). Pri biosyntéze polyketidovej štruktúry každý modul riadi inkorporáciu nových dvoj karbónových jednotiek a opravuje spracovanie β-ketónového uhlíka.
ORF2
Sekvenačné data z p98/l -fragmentu, ktorý je ohraničený Pvul miestom v pozícii 2,5 kb a Smal miestom v pozícii 6,2 kb, indikujú prítomnosť ďalšieho ORF (ORF2) bezprostredne vedľa ORF1. Sekvencie DNK ukazujú prítomnosť typického biosyntetického modulu, ktorý je kódovaný v ORF, jeho 5'-koniec nie je ešte sekvenovaný. Z porovnania s ďalšími polyketidovými biosyntetickými génovými jednotkami a z počtu atómov uhlíka v soraphenovorn kruhu je pravdepodobné, že by sa tu malo vyskytovať celkom osem modulov pre syntézu molekuly soraphenu so 17 uhlíkmi. Až dosiaľ bolo opísaných päť modulov v ORF1, ďalej sa predpokladalo, že 0RF2 obsahuje ďalšie tri a že tieto moduly sa rozpínajú za ľavý koniec kozmidu p98/l (pozícia 0 na obr.
7). To je v úplnom súlade s génovým opisom v príklade 12. Kozmidové klony pJLl a pJL3, ktoré presahujú ľavý koniec p98/l, pravdepodobne nesú sekvencie kódujúce zvyšné moduly potrebné pre biosyntézu soraphenu.
Príklad 17
Soraphen: požiadavka pre metyláciu
Syntéza polyketidov vyžaduje na vytvorenie reťazca s tromi uhlíkmi ako prvý krok kondenzáciu štartovnej jednotky (väčšinou ide o acetát) a nastavovacej jednotky (malonat). Dochádza k strate jedného atómu uhlíka vo forme C02· Výsledkom všetkých po sebe prebiehajúcich adícií je pridanie jednotky dvoch uhlíkov do polyketidového kruhu (Donadio et al., Science 252: 675-679 (1991)). Napriek tomu, že soraphen má kruh so 17 uhlíkmi, je pravdepodobné, že syntéza vyžaduje 8 biosyntetických modulov. Päť modulov je kódovaných v ORF1 a šiesty je prítomný na 3'-konci ORF2. Ako už bolo skôr vysvetlené, je pravdepodobné, že zvyšné dva moduly sú taktiež kódované 0RF2 v oblastiach, ktoré ležia v 15 kb Veľkom BamHI fragmente z klonov pJLl a pJL3, ktorých sekvencie ešte neboli určené.
Polyketidový modulárny biosyntetický aparát prítomný v Sorangium cellulosum je nutný pre produkciu zlúčeniny soraphen C, ktorá vykazuje antipatogénnu aktivitu. Štruktúra tejto zlúčeniny je rovnaká ako štruktúra antipatogénneho soraphenu A s výnimkou, že O-metyl skupiny soraphenu A na pozíciách kruhu 6, 7 a 14 sú nahradené hydroxylovou skupinou. Tieto skupiny sú metylované špecifickou metyltransferázou a tvorí sa aktívna zlúčenina soraphen A. Podobná situácia existuje pri biosyntéze erytromycínu v Saccharopolyspora erythraea. Konečný krok v biosyntéze tejto molekuly je metylácia troch hydroxylových skupín metyltransferázou (Haydock et al., Mol. Gen. Genet. 230: 120-128 (1991)). Je vysoko pravdepodobné, že podobná metyltransferáza (alebo možno viac ako jedna) sa podieľa na biosyntéze soraphenu A (soraphen C nie je metylovaný a soraphen A je čiastočne metylovaný). Zistilo sa, že vo všetkých polyketidových biosyntetických systémoch, ktoré boli preverené, sú biosyntetické gény a sprievodné metylázy spojené spolu (Summers et al., J. Bacteriol. 174: 1810-1820 (1992)). Je tiež pravde65 podobné, že podobná situácia existuje v soraphenovom operóne a že gén kódujúci metyltransferázu/y je nutný pre konverziu soraphenu B a C na soraphen A a je lokalizovaný blízko ORF1 a ORF2, ktoré kódujú polyketidovú syntázu. Výsledok metódy rozrušenia génov, opísaný vyššie, indikuje, že tento gén je lokalizovaný bezprostredne downstream 3'-konca 0RF1 a že je pravdepodobne lokalizovaný upstream 0RF2 v DNK, ktorá je obsiahnutá v pJLl a pJL3. Potom použitím štandardných metód môže byú klonovaný a sekvenovaný gén pre metyltransferázu.
Určenie soraphenu
Bunky Sorangium cellulosum boli kultivované v kvapalnom médiu, ktoré obsahuje výmennú živicu XAD-5 (Rohm and Haas) (5 % w/v). Soraphen A produkovaný bunkami sa viaže na živice, ktoré sú zhromažďované filtráciou cez polyesterový filter (Sartorius B 420-47-N). Soraphen sa zo živice uvoľňuje extrakciou 50 ml izopropanolu počas 1 hod. pri 30 °C. Izopropanol obsahujúci soraphen A je zhromaždený a koncentrovaný sušením na objem približne 1 ml. Alikvóty tejto vzorky boli analyzované pomocou HPLC pri 210 nm za účelom detekcie a kvantifikácie soraphenu A. Tento postup je špecifický pre soraphen A (úplne metylovaný); čiastočne metylované a nemetylované formy majú rôzne a nie sú meratel'né týmto postupom. Tento postup sa používal na testovanie produkcie soraphenu A po rozrušení génov .
F. Klonovanie a charakterizácia biosyntetických génov pre fenazín z Pseudomonas aureofaciens
Fenazínové antibiotiká sú produkované rôznymi druhmi Pseudomonas a Streptomyces ako sekundárne metabolity pri syntéze kyseliy šikimovej. Bolo stanovené, že dve molekuly kyseliny chorizmovej sú kondenzované s dvomi dusíkmi odvodenými z glutamínu pri vytvorení trojkruhového fenazínového prekurozora fenazín-1,6-dikarboxylátu. Je tu však tiež genetický dôkaz, že antranalit je medziprodukt chorizmatu a fenazín-1,6-dikarboxylátu (Essar et al., J. Bacteriol. 172: 853-866 (1990)).
V prípade Pseudomonas aureofaciens 30-84, produkcia troch fenazínových antibiotík, t.j. kyseliny fenazín-l-karboxylovej, kyseliny 2-hydroxyfenazín-l-karboxylovej a 2-hydroxyfenazínu, je hlavný spôsob, ktorým tento kmeň chráni pšenicu proti plies ňovému patogénu Gaeumannomyces graminis var. tritici (Piersom and Thomashow, MPMI 5: 330-339 (1992)). Podobne pri Pseudomonas fluorescens 2-79 je produkcia fenazínu hlavným faktorom pri kontrole G. graminis var. tritici (Thomashow and Weller,
J. Bacteriol. 170: 3499-3508 (1988)).
Príklad 18
Izolácia biosyntetických génov pre fenazín
Pierson a Tomashow opísali klonovanie kozmidu, ktorý prepožičiava fenazínový fenotyp mutantom nesúci transpozón. Ide o kmeň Pseudomonas aureofaciens 30-84, ktorého schopnosť syntetizovať fenazínové antibiotiká bola porušená. Bola vytvorená knižnica mutantov kmeňa 30-84 konjugáciou s E. coli S17l(pSUP1021) a boli vybrané mutanty, ktoré nie sú schopné produkovať fenazín. Vybrané mutanty neboli schopné produkovať kyselinu fenazínkarboxylovú, 2-hydroxyfenazín alebo kyselinu 2-hydroxyfenazínkarboxylovú. Tieto mutanty boli transformované kozmidovou genomickou knižnicou kmeňa 30-84. Transformácia viedla k izolácii kozmidu pLSP259, ktorý má schopnosť komplementovať fenazínové mutanty syntézou kyseliny fenazínkarboxylovej, 2-hydroxyfenazínu a kyseliny 2-hydroxy-fenazín-karboxylovej . PLSP259 bol ďalej charakterizovaný transpozónovou mutagenézou za použitia Λ::Τη5 fágu, ktorý opísal de Brujin and Lupski (Gene 27: 131-149 (1984)). Potom bol identifikovaný segment DNK s veľkosťou približne 2,8 kb, ktorý je zodpovedný za fenazínový fenotyp; tento 2,8 kb segment je lokalizovaný vo väčšom 9,2 kb EcoRI fragmente vektora pLS259. Prebehol transfer 9,2 kb EcoRI fragmentu a jeho rôznych delečných derivátov do E. coli, ktorý bol riadený lacZ promótorom. Vzniknuté mutanty boli testované na produkciu fenazínu. Derivát s najkratšou deléciou, ktorý umožňuje biosyntézu všetkých troch zlúčenín v E. coli obsahuje inzert približne 6 kb veľký a bol označený pLSP18-6Hdel3. Tento plazmid obsiahnutý v 2,8 kb segmente, ktorý bol skôr identifikovaný ako nenahraditeľný pri biosyntéze fenazínu v hostiteľskom kmeni 30-84, poskytol Dr. L. S. Pierson (Department of Plánt Pathology, U. Arizona, Tuscon, AZ) pre sekvenčnú charakterizáciu. Ďalšie delečné deriváty boli schopné obnoviť produkciu kyseliny fenazínkarboxylovej v E. coli, bez produkcie 2-hydroxyfenazínu a kyseliny 2-hydroxyfenazínkarboxylovej. Toto zistenie naznačuje, že najmenej dva gény môžu byť zahrnuté do syntézy fenazínu a jeho hydroxy derivátov.
DNK sekvencie s génmi pre biosyntézu fenazínu sú v SEQ ID č.:17. Plazmid pCIB3350, ktorý obsahuje Pstl-HindlI fragment fenazínového génového zoskupenia, bol uložený v Agricultural Research Culture Collection (NRRL) v 1815 N. University Street, Peoria, Illinois, 61604 USA, 20.5.1994 pod prístupovým číslom NRRL B-21257. Plazmid pCIB3351 obsahuje EcoRI-PstI fragment zoskupenia génov pre fenazín a bol uložený v Agricultural Research Culture Collection (NRRL) v 1815 N. University Street, Peoria, Illinois, 61604 USA, 20.5.1994 pod prístupovým číslom NRRL B-21258. PCIB3350 spolu s pCIB335l obsahujú celý fenazínový gén SEQ č.:17. Z dererminácie DNK sekvencie inzertu pLSP18-6H3del3 vyplýva prítomnosť štyroch ORF, ktoré sú obsiahnuté v alebo sú priľahlé k 2,8 kb veľkému segmentu. ORF1 (SEQ ID č.:18) bol označený phzl, ORF2 (SEQ ID č.:19) bol ORF3 (SEQ ID č.:20) bol označený phz3 a 0RF4 bol označený phz4. DNK sekvencie phz4 sú zobrazené v SEQ ID č.:21. phzl je približne 1,35 kb veľký a má homológiu na 5'-konci s entB génom E. coli, ktorý kóduje izochorizmatázu. phz2 je približne 1,15 kb veľký a má homológiu na 3'-konci s trpG génom, ktorý kóduje beta subjednotku antranilátovej syntázy. phz3 je priblžižne 0,85 kb veľký. phz4 je približne 0,65 kb veľký a je homológny ku génu pdxHv E. coli, ktorý kóduje pyridoxamín 5'-fosfát oxidázu.
označený phz2, (SEQ ID Č.:22)
Určenie fenazínu
Thomashow et al (Appl. Environ. Microbiol. 56: 908-912 (1990)) opisuje metódu pre izoláciu fenazínu. Táto metóda zahŕňa okyslenie kultúry na pH 2,0 HCI a extrakciu benzénom. Benzénová frakcia sa dehydratuje Na2SO4 a odparuje do sucha. Zvyšok sa znovu rozpustí vo vodnom 5 % NaHCO-j, znovu extrahuje rovnakým objemom benzénu, okyslí sa, separuje do benzénu a znovu suší. Fenazín koncentráty sú určené po rozdelení HPLC s reverznou fázou, ako opisuje Thomashow et al.
G. Klonovanie peptidových antipatogénnych génov
Táto skupina látok je rozličná a dajú sa klasifikovať do dvoch skupín: (1) tie, ktoré sú syntetizované enzýmovými systémami bez účasti ribozomálneho aparátu a (2) tie, ktoré vyžadujú ribozomálnu transláciu mRNK za vzniku prekurzora.
Peptidové antibiotiká bez účasti ribozómov
Neribozomálne peptidové antibiotiká sú vytvorené veľkými, viacfunkčnými enzýmami, ktoré aktivujú, modifikujú, polymerizujú a v niektorých prípadoch cyklizujú subjednotky aminokyselín, výsledkom je vytvorenie polypeptidového reťazca. Ďalšie kyseliny, ako je kyselina aminoadipová, kyselina diaminobutánová, kyselina diaminopropionová, dihydroxyaminokyselina, izoserín, kyselina dihydroxybenzoová, kyselina hydroxyizovalérová, (4R)-4-[(E)-2-butenyl]-4,N-dimetyl-L-treonín a ornitín sú tiež inkorporované (Katz and Demain, Bacteriological Review 41: 449-474 (1977)), Kleinkauf and von Dohren, Annual Review of Microbiology 41: 259-289 (1987)). Produkty nie sú kódované žiadnou mRNK a ribozómy sa nezúčastňujú syntézy. Tieto peptidové antibiotiká môžu byť zaradené do skupín podľa ich štruktúry. Delia sa na lineárne, cyklické, laktóny, vetvené cyklopeptidy a depsipeptidy (Kleinkauf a von Dohren, European Journal of Biochemistry 192: 1-15 (1990)). Tieto rozdielne skupiny antibiotík sa pripravujú pôsobením modifikujúcich a cyklizujúcich enzýmov. Základná schéma polymerizácie je pre všetky skupiny rovnaká. Tieto antibiotiká produkujú baktérie a pliesne a zahŕňajú edeín, lineárny gramicidín, tyrocidín a gramicidín S z Bacillus brevis, mykobacilín z Bacillus subtilis, polymi69 xín z Bacillus polymixia, etamycín zo Streptomyces griseus, echinomycín zo Streptomyces echinatus, aktinomycín zo Streptomyces clavurigerus, enterochelín z Escherichia coli, gama-(alfa-L-aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valín (ACV) z Aspergillus nidulans, alameticín z Trichoderma viride, destruxín z Metarhizium anisolpliae, eniatin z Fusarium oxysporum a beauvericín z Beauveria bassiana. Medzi prokaryotickými a eukaryotickými systémami existuje rozsiahla funkčná a štrukturálna podobnosť, čo naznačuje spoločný pôvod. Peptidové antibiotiká vykazujú podobné neurčité aktivity, pôsobia toxicky na zvieratá, rastliny, baktérie a pliesne (Hansen, Annula Review of Mic· robiology 47: 535-564 (1993)), Katz and Demain, Bacteriological Reviews 41: 449-474 (1977), Kleinkauf and von Dohren, Annual Review of Microbiology 41: 259-289 (1987), Kleinkauf and von Dohren, European Journal of Biochemistry 192: 1-15 (1990), Kolter and Moreno, Annual Review of Microbiology 46: 141-163 (1992) ) .
Aminokyseliny sú aktivované hydrolýzou ATP a tvoria adenylovú amino alebo hydroxy kyselinu, čo je analogické k nabíjacej reakcii, ktorá prebieha za prispenia aminoacyl-tRNK syntetázy a potom je vytvorený kovalentný tioesterový medziprodukt medzi aminokyselinami a enzýmom/ami, či už v špecifickom cysteínovom zvyšku, alebo s tiolom z panteteínu. Hydrolýza ATP, ktorá závisí od aminokyseliny, sa často používa ako test pre komplexy peptidových antibiotikových enzýmov (Ishira et al., J. Bacteriol. 171: 1705-1711 (1989)). Aminokyseliny naviazané na enzým môžu byť modifikované pred ich včlenením do polypeptidu. Najbežnejšou modifikáciou je epimerácia L-amino (hydroxy) kyselín na D-formu, N-acetylácia, cyklizácia a Nmetylácia. Polymerizácia prebieha za účasti panteteínového kofaktora, ktorý umožňuje začlenenie aktivovanej podjednotky do peptidového reťazca. Mechanizmus, ktorý uvoľňuje peptid z enzýmového komplexu je dôležitý pre určenie štruktúrnej triedy, do ktorej produkt patrí. Hydrolýza alebo aminolýza voľnými amínmi tiolesteru vedie k vytvoreniu lineárneho (nemodifikovaného alebo s amínovými koncami) peptidu, ako je edeín; aminolýza tiolesteru aminoskupinami na samotný peptid vytvorí buď cyklický peptid (pôsobením koncového amínu), ako je gramicidín S, alebo vetvený peptid (pôsobenie bočným amínovým reťazcom), ako je napr. bacitracín; laktonizácia s koncovou hydroxy skupinou alebo hydroxy bočným reťazcom umožní vznik vetveného laktónu (napr. destrukcín), resp. cyklodepsipeptidu (napr. beauvericínu).
Enzýmy, ktoré sa podieľajú na týchto reakciách sú veľké viacfunkčné proteíny, ktorých molekulová váha sa zhoduje s rôznosťou funkcií, ktoré zastávajú. Napríklad, gramicidín syntetázy 1 a 2 majú molekulovú váhu 120 a 280 kDa; ACV syntetáza má molekulovú váhu 230 kDa; eniatinová syntetáza je 250 kDa; bacitracínová syntetáza 1, 2, 3 sú 335, 240 a 380 kDa (Katy and Demain, Bacteriological Reviews 41: 449-474 (1977)); Kleinkauf and von Dohren, Annual Review of Microbiology 41: 259-289 (1987); Kleinkauf and von Dohren, European J. of Biochemistry 192: 1-15 (1990)) . Veľkosť a komplexnosť týchto proteínov vedie k tomu, že relatívne málo génov musí byť klonovaných za účelom odovzdania schopnosti kompletnej neribozomálnej syntézy peptidových antibiotík. Ďalej funkčná a štrukturálna homológia medzi bakteriálnymi a eukaryotickými syntetickými systémami indikuje, že takéto gény z akéhokoľvek zdroja peptidových antibiotík môžu byť klonované za použitia dostupných sekvenčných informácií, informácií o funkcii, a konvenčných mikrobiálnych metód. Produkcia fungicídnych, insekticídnych alebo baktericídnych peptidových antibiotík v rastlinách zaručuje ich rezistenciu voči poľnohospodárskym škodcom.
Príklad 19
Klonovanie biosyntetických génov pre gramicidín
Gramicidín S je cyklický antibiotikový peptid a dokáže inhibovať tvorbu pliesňových spór (Murray et al., Letters in Applied Microbiology 3: 5-7 (1986)) a používa sa pri ochrane rastlín proti pliesňovým chorobám. Operón (grs) pre biosyntézu gramicidínu S z Bacillus brevis ATCC 9999 bol klonovaný a sekvenovaný. Tento operón zahŕňa celé kódujúce sekvencie pre gra71 micidín syntetázu 1 (GS1, grsA), ďalej zahrňuje gén s neznámou funkciou (grsT) a gén pre GS2 (grsB) (Kratzschmar et al., J. of Bacteriology 171: 5422-5429 (1989); Krause et al., J. of Bacteriology 162: 1120-1125 (1985)). Dobre známou metódou boli vytvorené PCR priméry na základe publikovaných sekvencií DNK, ktoré sú vhodné pre amplifikáciu segmentov z grs operónu s veľkosťou približne 500 bp. Ako templát bola použitá ATCC 9999 DNK izolovaná z Bacillus brevis. Fragmenty pre amplifikáciu sú: (1) na 3'-konci kódujúcej oblasti grsB, ktorý siaha až k terminačnému kodónu, (2) na 5'-konci grsB kódujúcej sekvencie, zahŕňa iniciačný kodón, (3) na 3'-konci kódujúcej sekvencie grsA, zahŕňa terminačný kodón, (4) na 5'-konci kódujúcej sekvencie grsA, zahŕňa terminačný kodón, (5) na 3'-konci kódujúcej sekvencie grsT, zahŕňa terminačný kodón a (6) na 5'-konci kódujúcej sekvencie grsT, zahŕňa iniciačný kodón. Amplifikované fragmenty sú rádioaktívne a nerádioaktívne značené metódou používanou pre triedenie genomickej knižnice Bacillus brevis ATCC 9999 DNK včlenenú do vektora EMBL3. Šesť amplifikovaných fragmentov sa používa v pároch na izoláciu fragmentov genomickej DNK, ktorá obsahuje intaktné kódujúce sekvencie pre tri biosyntetické gény. Klony, ktoré hybridizujú so sondami 1 a 2, obsahujú intaktné grsB sekvencie. Klony hybridizujúce so sondami 3 a 4 obsahujú intaktný grsA gén. Klony hybridizujúce so sondami 5a 6 obsahujú intaktný grsT gén. Klonované sekvencie grsA boli vnesené do E. coli a extrakty boli pripravené lýzou transformovaných baktérií dobre známou metódou. Extrakty boli testované na aktivitu určením ATP-PP^ zámeny závislej od fenylalanínu (Krause et al., J. of Bacteriology 162: 1120-1.125 (1985) ) po odstránení proteínov menších než 120 kDa gélovou chromatografiou. GrsB bol testovaný podobne, pri extraktoch z transformovaných baktérií filtrovaných cez gél bola určovaná výmena ATP-PPj_ závislá od prolínu, valínu, ornitínu a leucínu. ’
Príklad 20
Klonovanie biosyntetických génov pre penicilín kb veľký fragment genomickej DNK z Penicillium chrysogenum prenáša schopnosť, syntetizovať penicilín na pliesne As pergillus niger a Neurospora crassa, ktoré penicilín normálne neprodukujú (Smith et al. , Bio/Technology 8: 39-41 (1990)). Gény, ktoré sú zodpovedné za biosyntézu delt-(L-alfa-aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valín syntetázy, izopenicilín N syntetázy a izopenicilín N-acyltransferázy boli individuálne klonované z P . chrysogenum a Aspergillus nidulans a boli určené ich sekvencie (Ramon et al., Gene 57: 171-181 (1987); Smith et al., EMBO Journal 9: 2743-2750 (1990); Tobin et al., Journal of Bacteriology 172: 5908-5914 (1990)). Klonovanie týchto génov prebieha na základoch PCR, ako už bolo opísané, čo vedie k vytvoreniu sond s približnou veľkosťou 500 bp z genomickej DNK izolovanej buď z Penicillium chrysogenum (napr. kmeň AS-P-78, z Antibioticos, S.A., Leon Spain), alebo z Aspergillus nidulans, napr. kmeň G69. Ich integrita a funkčnosť môže byť testovaná transformáciou neproduktívnych pliesní, ktoré bo li uvedené, a skúmaním ich produkcie antibiotík a individuálnych enzýmových aktivít, ako je opísané (Smith et al., Bio/Technology 8: 39-41 (1990)).
Príklad 21
Klonovanie biosyntetických génov pre bacitracín
Bacitracín A je vetvené cyklopeptidové antibiotikum, ktoré zvyšuje odolnosť rastlín proti bakteriálnym patogénom. Bacitracín A je produkovaný Bacillus licheniformis ATCC10716 a pre syntézu sú potrebné tri viacfunkčné enzýmy, ktorými sú bacitracín syntetáza (BA) 1,2 a 3. Molekulové váhy BA1, BA2 a BA3 sú 335 kDa, 240 kDa a 380 kDa. 32 kb veľký fragment DNK z Bacillus licheniformis, ktorý kóduje BA2 proteín a časť BA3 proteínu, ukazuje, že najmenej tieto dva gény sú spojené (Ishira et al., J. of Bacteriology 171: 1705-1711 (1989)). Informácie o gramicidínovom S, penicilínovom a surfaktínovom biosyntetickom operóne naznačujú, že prvý proteín biosyntetickej cesty BA1 je kódovaný génom, ktorý je relatívne blízko k BA2 a BA3. BA3 sa získava pomocou publikovaných metód. BA3 sa používa na vytvorenie králičích protilátok (Ishira et al., supra). Genomická knižnica DNK z Bacillus licheniformis je transformovaná do E. coli a klony, ktoré exprimujú antigénne determinanty, ktoré majú vzťah k BA3, sú detekované dobre známymi metódami. Pretože BA1, BA2 a BA3 sú antigénne príbuzné, detekčná metóda poskytuje klony, ktoré kódujú každý z týchto troch enzýmov. Identifikácia každého klonu je potvrdená testovaním extraktov transformovaných E. coli na vhodnú zámenu ATP-PPj_ závislú od aminokyseliny. Klony kódujúce BA1 vykazujú ATP-PPj_ závislú od leucínu, kyseliny glutamovej a ornitínu. Klony kódujúce BA3 vykazujú zámenu závislú od izoleucínu, fenylalanínu, histidínu, kyseliny asparágovej a od asparagínu. Ak jeden alebo dva gény sú získa j,ú touto metódou, ďalšie sú izolované metódou označovanou ako walking alebo chromosome walking (Sambrook et al., v: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) .
Príklad 22
Klonovanie biosyntetických génov pre beauvericín a destruxín
Beauvericín je insekticídny hexadepsipeptid produkovaný pliesňou Beauveria bassiana (Kleinkauf and von Dohren, European Journal of Biochemistry 192: 1-15 (1990)), ktorý poskytuje rastlinám ochranu proti hmyzím škodcom. Táto látka je analóg eniatinu, fytotoxického hexadepsipeptidu produkovaného niektorými fytopatogénnymi druhmi pliesní Fusarium (Burmeister and Plattner, Phytopathology 77: 1483-1487 (1987)). Destruxín je insekticídny laktónový peptid produkovaný pliesňou Metarhiyum anisopliae (James et al., Journal of Physiology 39: 797-804 (1993)). Monoklonálne protilátky smerované do oblasti komplexu eniatinovej syntetázy, ktorá je zodpovedná za N-metyláciu aktivovanej aminokyseliny, vykazuje krížovú reakciu so syntetázou pre beauvericín a destruxín, čím demonštruje ich štruktúrnu príbuznosť (Kleinkauf and von Dohren,, European Journal of Biochemistry 192: 1-15 (1990)). Gén pre eniatinovú syntetázu (esynl) z Fusarium scripi bol klonovaný a sekvenovaný (Haese et al., Molecular Biology 7: 905-914 (1993)). Sekvenčné dáta sú použité pre klonovaciu stratégiu génov pre beauvericín syntetázu a destruxín syntetázu, ako bolo opísané. Sondy pre gén beauvericín syntetázy (BE) a pre gén destruxín syntetázy (DXS) sú produkované amplifikáciou špecifických oblastí genomickej DNK z Beauveria bassiana alebo genomickej DNK Metarhizium anisopliae za použitia oligomérov, ktorých sekvencie sú vzaté zo sekvencií eniatinovej syntetázy, ako PCR priméry. Boli vybrané dva pary PCR primérov, jeden pár je schopný amplifikovaú segment BE génu, ktorý presahuje iniciačný kodón a druhý pár je schopný spôsobovať amplifikáciu segmentu BE génu, ktorý presahuje terminačný kodón. Každý pár spôsobuje produkciu fragmentu DNK, ktorý je približne 500 bp veľký. Knižnica genomickej DNK z Beauveria bassiana a Metarhizium anisopliae bola hybridizovaná so značenými fragmentmi a boli vybrané klony, ktoré vykazujú pozitívne hybridizačné reakcie k obom fragmentom. Kompletné kódujúce sekvencie beauvericínovej syntetázy spôsobujú výskyt zámeny ATP-PP^ závislej od fenylalanínu vo vhodnom hostiteľovi. Kompletné kódujúce sekvencie destruxínu spôsobujú výskyt zámeny ATP-PP^ závislej od valínu, izoleucínu a alanínu. Extrakty z týchto transformovaných organizmov budú tiež uskutočňovať bezbunkovú biosyntézu beauvericínu a destruxínu.
Príklad 23
Klonovanie génov pre biosyntézu neznámych peptidových antibiotík
Gény pre akékoľvek peptidové antibiotiká sú klonované za použitia konzervatívnej oblasti v kódujúcej oblasti. Funkcie bežné pre všetky peptidové antibiotikové syntetázy, ktorými sú aktivácia aminokyselín, viazanie ATP a pantoteínu, sú viazané na Štruktúru opakujúcej sa oblasti, v ktorej každá oblasť zaberá približne 600 aminokyselín. V týchto oblastiach sú známe vysoko konzervatívne sekvencie a očakáva sa, Že existujú príbuzné sekvencie i v peptidovej antibiotikovéj syntetáze, bez ohľadu na ich zdroj. Publikované sekvencie DNK génov peptidových syntetáz, zahŕňajúce gramicidín gramicidín syntetázu la 2 (Hori et al., Journal of Biochemistry 106: 639-645 (1989); Krause et al., Journal of Bacteriology 162: 1120-1125 (1985); Turgay et al., Molecular Microbiology 6: 529-546 (1992)), tyrocidínovú syntetázu 1 a 2 (Weckermann et al., Nucleic Acids Research 16: 11841 (1981)), ACV syntetázu (MacCabe et al., Journal of Biological Chemistry 266: 12646-12654 (1991)), eniatinovú syntetázu (Haese et al., Molecular Microbiology 7: 905-914 (1993)) a surfaktínovú syntetázu (Fuma et al., Nucleic Research 21: 93-97 (1993); Grandi et al., Eleventh International Spores Conference (1992)) sú porovnané a jednotlivé opakujúce sa oblasti sú identifikované. Oblasti zo všetkých týchto syntetáz sú porovnané ako skupina a najviac konzervatívne sekvencie sú identifikované. Na základe znalostí týchto konzervatívnych sekvencií sú vytvorené DNK oligoméry, ktoré sú vhodné pre hybridizáciu všetkých pozorovaných variantov sekvencií a ďalšie sekvencie, ktoré ležia napr. od 0,1 do 2 kb ďaleko od prvej DNK sekvencie, sa používajú na vytvorenie iných DNK oligomérov. Takéto páry DNK oligomérov sa používajú na amplifikáciu uprostred ležiaceho segmentu neznámeho génu. Sú zmiešané s genomickou DNK izolovanou z organizmu, ktorý produkuje antibiotikum a PCR amplifikované. Výsledný fragment DNK je sekvenovaný za účelom potvrdenia jeho identity a ďalej sa používa ako sonda na identifikáciu klonov, ktoré obsahujú veľké segmenty génu peptidovej syntetázy v genomickej knižnici. Rôznosť týchto prístupov, kde sa oligoméry určené pre hybridizáciu s génovými konzervatívnymi sekvenciami používali ako hybridizačné sondy, skôr ako priméry pre PCR reakcie, viedla k identifikácii časti génu pre surfaktínovú syntetázu z Bacillus subtilis ATCC 21332 (Borchert et al., FEMS Microbiological Letters 92: 175-180 (1992)). Klonovaná genomická DNK, ktorá hybridizuje s PCR generovanou sondou, bola sekvenovaná. Kompletná DNK sekvencie sa získali pomocou spomínanej walking metódy. Táto metóda tiež odhalí ďalšie gény nutné pre syntézu peptidových antibiotík, pretože je o nich známe, že tvoria zoskupenie. Ďalšia metóda získania génov, ktoré kódujú syntetázu/y nového peptidového antibiotika, je detekcia antigénnych determinantov vyjadrených v heterológnom hostiteľovi po jeho transformácii s vhodnou genomickou knižnicou vytvorenou z organizmu produkujúceho antibiotikum. Očakáva sa, že bežné štruktúrne rysy syntetáz budú dokázané krížovými reakciami s protilátkami, vzniknutými proti rôznym syntetázovým proteínom. Takéto protilátky vznikajú proti peptidovým syntetázam získaným zo známych organizmov, ktoré produkujú antibiotiká. (Ishihara et al., J. Bacteriol. 171: 1705-1711 (1989)) . Fragmenty DNK vzniknuté v transformovaných organizmoch, ktoré sú producentmi neznámych peptidových antibiotík, sú testované na prítomnosť antigénnych determinantov, ktoré sa rozoznávajú antisérom antipeptidovej syntetázy. Klonovaná genomická DNK nesená bunkami a identifikovaná antisérom je izolovaná a sekvenovaná. Walking metóda, ako je uvedené vyššie, je použiteľná pre získanie celej kódujúcej sekvencie a ďalších biosyntetických génov.
Ďalšia metóda získania génov, ktoré kódujú syntetázy neznámych peptidových antibiotík, je purifikácia proteínu, ktorý má charakteristiky vhodnej peptidovej syntetázy a určenie všetkých alebo časti sekvencií jeho aminokyselín. Aminokyseliny prítomné v antibiotikách sú určené z prvej purifikácie, z chloroformového extraktu kultúry antibiotika produkujúceho organizmu, napr. chromatografiou so spätnou fázou na C18 kolóne v zmesi etanol/voda. Zloženie čistenej zlúčeniny je určené hmotnostnou spektrofotometriou, NMR a analýzou produktov kyslej hydrolýzy. Amino alebo hydroxy kyseliny, prítomné v peptidových antibiotikách, po pridaní do extraktu, ktorý obsahuje peptidové syntetázy, produkujú ATP-PP^ zámenu. Táto reakcia sa používa ako test pre detekciu prítomnosti peptidových syntetáz počas purifikácie proteínu. Podstatne čistá preparácia peptidovej syntetázy sa použila na určenie sekvencií jej aminokyselín buď priamym sekvenovaním intaktného proteínu, čo vedie k získaniu sekvencií aminokyselín N-konca, alebo produkciou, purifikáciou a sekvenovaním peptidov odvodených z intaktnej peptidovej syntetázy pôsobením špecifických proteolytických enzýmov. DNK sekvencie sú odvodené zo sekvencií aminokyselín syntetázy. Boli vytvorené DNK oligoméry, ktoré sú schopné hybridizovať s takýmito kódujúcimi sekvenciami. Oligoméry sa používajú pre hybridizáciu s genomickou knižnicou, ktorá bola vytvorená z DNK mikroorganizmu, ktorý produkuje antibiotiká.
Vybrané klony sú sekvenované za účelom ich identifikácie. Kompletné kódujúce sekvencie a príbuzné gény nutné pre biosyntézu peptidov boli získané použitím walking metódy. Extrakty z organizmov, ktoré boli transformované celým komplementom génov pre peptidovú biosyntézu, napr. baktérie alebo pliesne, budú produkovať peptidové antibiotiká, ak sa im poskytnú žiadané amino alebo hydroxy kyseliny, ATP a panteteín.
Ďalšie metódy vhodné pre klonovanie génov, ktoré sú nutné pre syntézu neribozomálnych peptidových antibiotík, sú opísané v príkladoch v sekcii B.
Ribozomálne syntetizované peptidové antibiotiká
Ribozomálne syntetizované peptidové antibiotiká sú charakterizované existenciou štruktúrneho génu pre samotné antibiotiká. Tento gén kóduje prekurzor, ktorý je modifikovaný špecifickými enzýmami za vytvorenia zrelej molekuly. Použitie aparátu všeobecnej syntézy proteínov otvára pre syntézu peptidových antibiotík možnosť vytvorenia ovel'a dlhších polymérov, i keď tieto peptidové antibiotiká nie sú nevyhnutne príliš vel'ké. Okrem štruktúrneho génu sú nutné pre extrabunkovú sekréciu a odolnosť ešte ďalšie gény. Tieto gény sú pravdepodobne umiestnené blízko štruktúrneho génu, v mnohých prípadoch pravdepodobne na rovnakom operóne. Existujú dve hlavné skupiny peptidových antibiotík tvorených na ribozómoch: tie, ktoré obsahujú neobvyklú aminokyselinu lantionín a tie, ktoré túto aminokyselinu neobsahujú. Antibiotiká obsahujúce lantionín (lantibiotiká) sú produkované gram-pozitívnymi baktériami, zahrňujúcimi druhy Lactococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus a Streptomyces. Sú známe lineárne lantibiotiká (napr. nizín, subtilín, epidermín a galidermín) a cirkulárne lantibiotiká (napr. duramycín a cinamycín) (Hansen, Annual Review of Microbiology 47: 535-564 (1993)); Kolter and Moreno, Annual Review of Microbiology 46: 141-163 (1992)). Lantibiotiká často obsahujú charakteristicky modifikované zvyšky, ako je dehydroalanín (DHA) a dehydrobuterín (DHB), ktoré vznikajú dehydratáciou serínu a treonínu. Reakcia tiolu z cysteínu s DHB vedie k vytvoreniu lantionínu a rovnaká reakcia s DHB vedie k vytvoreniu β-metyllantionínu. Peptidové antibiotiká, ktoré neobsahujú lantionín, môžu obsahovať ďalšie modifikácie alebo sa môžu skladať iba z obyčajných aminokyselín používaných pri syntéze proteínov. Peptidové antibiotiká, ktoré neobsahujú lantionín, sú produkované gram-pozitívnymi i gram-negatívnymi baktériami, ako sú Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus, Enterococcus a Escherichia. Antibiotiká v tejto kategórii zahrňujú laktacíny, laktocíny, sakacín A, pediocíny, diplokocín, laktokocíny a mikrocíny (Hansen, supra; Kolter and Moreno, supra). Všeobecne sú peptidové antibiotiká, ktorých syntéza začínala na ribozómoch, predmetom niekoľkých typov posttranslačných procesov, zahrňujúc proteolytické štiepenie a modifikácia vedľajších reťazcov aminokyselín. Tieto antibiotiká vyžadujú špecifické transportné a/alebo imunitné mechanizmy. Nutnosť ochrany proti účinkom týchto antibiotík silne kontrastuje s neprítomnosťou takého systému v neribozomálnych peptidových antibiotikách. Toto sa môže vysvetliť tým, že antibiotiková aktivita mnohých ribozomálne syntetizovaných peptidových antibiotík je smerovaná do úzkeho rozmedzia baktérií, ktoré sú príbuzné organizmu, ktorý ich produkuje. V tejto situácii sú nutné určité metódy na rozlíšenie producenta od kompetitora. Táto vlastnosť limituje použiteľnosť tejto triedy molekúl pre situácie, v ktorých široký rozsah aktivity je žiadúci, ale naopak zvyšuje ich atraktívnosť v prípadoch, kedy velmi limitované rozpätie aktivít je výhodou. V eukaryotických systémoch, ktoré nie sú citlivé na akékoľvek peptidové antibiotikum tohoto typu, nie je jasné, či produkcia ribozomálne syntetizovaných peptidových antibiotík nerobí jeden z týchto transportných systémov nevyhnutným alebo či transport z bunky je iba otázka umiestnenia antibiotika na lepšie miesto vzhľadom na potencionálne patogény. Táto otázka môže byť skusmo položená, ako je ukázané v príkladoch, ktoré nasledujú.
Príklad 24
Klonovanie génov pre biosyntézu lantibiotík
Skúšky génov, ktoré sú viazané k štruktúrnym génom pre lantibiotiká nizín, subtilín a epidermín, ukazujú niekoľko otvorených Čítacích rámcov, ktoré majú sekvenčnú homológiu a predpokladané sekvencie aminokyselín naznačujú funkcie, ktoré sú nevyhnutné pre zrenie a transport antibiotík, spa gény Bacillus subtilis ATCC 6633, ktoré zahŕňajú spaS, štruktúrny gén kódujúci prekurzor subtilínu, boli sekvenované (Chung and Hansen, Journal of Bacteriology 174: 6699-6702 (1992); Chung et al., Journal of Bacteriology 174: 1417-1422 (1992); Klein et al., Applied and Environmental Microbiology 58: 132-142 (1992)). ORF boli nájdené iba upstream spaS, vo vzdialenosti 1-2 kb. Niekoľko ORF sa javia ako časť rovnakej transkripčnej jednotky, spaE, spaD, spaB a spaC, s putatívnym promótorom upstream spaE. SpaB, ktorý kóduje proteín s 599 aminokyselinami a spaD, ktorý kóduje proteín so 177 aminokyselinami, majú homológiu s génmi nutnými pre transport hemolyzínu, kódujúce HylB a HlyD proteíny. SpaE, ktorý kóduje proteín 851 aminokyselín, je homológny s nisB, Čo je gén zviazaný so štruktúrnym génom pre nizín, ktorého funkcia nie je známa. spaC kóduje proteín so 442 aminokyselinami, jeho funkcia nie je známa, ale porušením je eliminovaná produkcia subtilínu. Tieto gény sú obsiahnuté na segmente genomickej DNK, ktorý je približne 7 kb veľký (Chung and Hansen, Journal of Bacteriology 174: 66996702 (1992); Chung et al., Journal of Bacteriology 174: 1417-1422 (1992); Klein et al., Applied and Environmental Microbiology 58: 132-142 (1992)). Nebolo jasne ukázané, či tieto gény sú kompletne dostatočne schopné prepožičať schopnosť produkcie subtilínu. 13,5 kb veľký fragment z plazmidu Tu32 Staphylococcus epidermis TÚ3298 obsahujúci štruktúrny gén pre epidermín (epiA), tiež obsahuje päť ORF značených epiA, epiB, epiC, epiD, epiQ a epiP. Gény epiBC sú homológne s génmi spaBC, zatiaľ čo epiQ sú, zdá sa, zahrnuté do regulácie expresie operónu a epiP môže kódovať proteázu, ktorá pôsobí počas zrenia pre-epidermínu na epidermín. EpiD kóduje proteín so 181 aminokyselinami, ktorý sa viaže na koenzým flavín mononukleotid a pravdepodobne uskutočňuje posttranslačnú modifikáciu preepidermínu (Kupka et al., J. Bacteriol. 174: 5354-5361 (1992); Peschel et al., Molecular Microbiology 9: 31-39 (1993); Schnell et al. , European J. of Biochemistry 204: 57-68 (1992)) . Očakáva sa, že mnoho, ak nie všetky gény nutné pre biosyntézu lantibiotík, budú zoskupené buď na genomickej DNK alebo na plazmide a prístup, ktorý umožňuje lokalizovať jeden z nevyhnutných génov bude užitočný pre nájdenie a klonovanie ďalších. Štruktúrny gén pre lantibiotiká je klonovaný pomocou oligonukleotidovej sondy založenej na sekvencií aminokyseliny určenej z podstatne čistej preparácie samotného lantibiotika, ako bolo urobené s lantibiotikom lakticín 481 z Lactococcus lactis CNRZ 481 (Piard et al., J. of Biological Chemistry 268: 16361-16368 (1993)), streptokokcín A-FF22 zo Streptococcus pyogenes FF22 (Hynes et al., Applied and Environmental Microbiology 59: 1969-1971 (1993)) a salivaricín A zo Streptococcus salivarius 203P (Ross et al., Applied and Environnmental Microbiology 59: 2014-2021 (1993)). Fragmenty bakteriálnej DNK s veľkosťou približne 10-20 kb, obsahujúce štruktúrny gén, boli klonované a sekvenované za účelom určenia oblasti homológie s charakterizovanými génmi v spa, epi a nis operónoch. ORF, ktoré majú homológiu s akýmkoľvek z týchto génov alebo ktorý leží v rovnakej transkripčnej jednotke ako ORF, ktorá má homológiu k akémukoľvek z týchto génov, boli klonované jednotlivo dobre známou metódou. Fragment DNK obsahujúcej všetky príbuzné ORF je transformovaný do baktérie, ako je E. coli. Za účelom demonštrácie, že všetky nutné gény sú prítomné, bola analyzovaná produkcia lantibiotika.
Príklad 25
Klonovanie génov pre biosyntézu ribozomálne syntetizovaných peptidových antibiotík, ktoré neobsahujú lantionín
Vzhľadom na to, že pri lantibiotikách neprebiehajú extenzívne modifikácie, predpokladá sa zníženie počtu génov žiadaných pre kompletnú syntézu peptidových antibiotík. Tento predpoklad je doložený príkladmi laktacín F, sakacín A, laktokocín A a helveticín J. Zoskupené gény zahrnuté do syntézy antibiotík boli nájdené v Lactobacillus johnsonii VPI11088 pre lakticín F (Fremaux et al., Applied and Environmental Microbiology
59: 3906-3915 (1993)), v Lactobacillus sake Lb706 pre sakacín A (Axelsson et al. , Applied and Environmental Microbiology 59: 2868-2875 (1993)), Lactococcus lactis pre laktokokcín A (Stoddard et al., Applied and Environmental Microbiology 58: 1952-1961 (1992)) a v Pedicoccus acidilactici pre pediocín
PA-1 '(Marugg et al., Applied and Environmental Microbiology 58: 2360-2367 (1992)). Gény nutné pre biosyntézu nových peptidových antibiotík, ktoré neobsahujú lantionín, sú klonované pomocou prvej určujúcej aminokyselinovej sekvencie podstatne čistenej preparácie antibiotika, vytvorením DNK oligomérov založených na aminokyselinových sekvenciách a použití sond na DNK knižnicu vytvorenú buď z genomickej, alebo plazmidovej DNK z produkujúcej baktérie. DNK fragmenty s veľkosťou 5-10 kb, ktoré obsahujú štruktúrny gén pre antibiotiká, sú klonované a sekvenované. ORF, ktoré majú homológiu a sakB z Lactobacillus sake alebo k lafX, ORFY alebo ORFZ z Lactobacillus johnsonii, alebo ktoré sú časťou rovnakej transkripčnej jednotky, ako je antibiotikový štruktúrny gén alebo gény, ktoré majú homológiu k uvedeným génom, sú jednotlivo klonované známou metódou. DNK fragment obsahujúci príbuzné čítacie rámce bol transformovaný do neprodukčného kmeňa baktérií, ako je E. coli. Za účelom demonštrácie, že všetky nutné gény sú prítomné, bola analyzovaná produkcia antibiotika.
H. Expresia antibiotikových biosyntetických génov v mikrobiálnom hostiteľovi
Príklad 26
Nadmerná expresia APS biosyntetických génov za účelom nadmernej produkcie APS použitím fermentačnej technológie
APS biosyntetické gény môžu byť vyjadrené v heterológnych organizmoch za účelom zvýšenia ich produkcie v porovnaní s ich prírodným hostiteľom. Vhodný hostiteľ pre heterológnu expresiu je E. coli a metódy pre expresiu génov v E. coli sú dobre známe. Napríklad klonované APS môžu byť vyjadrené v E. coli za použitia vektora pKK223, ako je opísané v príklade 11. Klono82 vané gény môžu byť spojené do transkripčnej fúzie za použitia dostupného miesta pre naviazanie ribozómu, ktoré je príbuzné s heterológnym génom. Tento prístup uľahčuje expresiu operónov, ktoré kódujú viac než jeden ORF. Translácia jednotlivých ORF potom bude závisieť od signálov ich príbuzného ribozomálneho väzbového miesta. V inom prípade PAS gény môžu byť fúzované s ATG sekvenciou vektora (napr. Ncol fúzia) tak, že používajú ribozomálne väzbové miesto v E. coli. Pre viacnásobnú expresiu v E. coli (napr. v prípade operónu s viacerými ORF) tento typ konštrukcie bude vyžadovať samostatný promótor, ktorý je fúzovaný s každým ORF. Ja však možné fúzovať prvý ATG APS operónu s E. coli ribozomálnym väzbovým miestom, zatiaľ čo ďalšie ORF vyžadujú využívať ich príbuzné ribozomálne väzbové miesta. Tieto typy konštrukcie pre nadmernú expresiu génov v E. coli sú dobre známe. Vhodné bakteriálne promótory zahŕňajú lac promótor, tac (trp/lac) promótor a P 2-promótor z bakteriofágu Ä. Vhodné komerčne dostupné vektory sú napr. pKK223-3, pKK233-2, pDR540, pDR720, pYEJOOl a pPL-2- (Pharmacia, Piscataway, NJ).
Podobne gram-pozitívne baktérie, môžeme uviesť druh Bacillus a zvlášť Bacillus licheniformis, sa používajú v komerčnom merítku pre produkciu heterológnych proteínov a môžu byť adaptované pre expresiu APS biosyntetických génov (napr. Quax et al., v Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics (ed.: Baltz et al.), American Society for Microbiology, Washington, D.C. str. 183-194 (1993)). Regulačné signály z vysoko exprimovaných génov z kmeňa Bacillus (napr. amylázový promótor, Quay et al., supra) generujú transkripčné fúzie s APS biosyntetickými génmi.
V niektorých prípadoch, za použitia systému kvasiniek, ako sú metylotrofné kvasinky Pichia pastoris sa dosiahla vysoká hladina expresie (Sreekrishna, v: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics (ed.: Baltz et al.), American Society for Microbiology, Washington, D.C. str. 183-194 (1993)). APS gén/y sú umiestnené za 5'-regulačnou sekvenciou génu pre alkoholovú oxidázu z kmeňa Pichia vo vekto83 roch, ako sú pHIL-Dl a pHIL-D2 (Sreekrishna, supra). Takéto vektory sa používajú pre transformáciu Pichia a na včlenenie heterológnej DNK do genómu kvasiniek. Podobne sa aj kvasinky Saccharomyces cerevisiae používajú pre expresiu heterológnych bakteriálnych kmeňov (napr. Dequin and Barre, Biotechnology 12: 173-177 (1994). Kvasinky Kluyveromyces lactis sú tiež vhodným hostiteľom pre heterológnu expresiu génov (napr. van den Berg et al., Biotechnology 8: 135-139 (1990)).
Nadmerná expresia APS génov v organizmoch, ako sú E. coli, Bacillus a kvasinky, ktoré majú rýchly rast a rozmnožovanie, budú schopné fermentačnej produkcie veľkého množstva APS. Voľba vhodného organizmu je obmedzená možnou náchylnosťou organizmu k nadmernej produkcii APS; avšak táto náchylnosť môže byť odhalená metódou opísanou v sekcii J. APS môžu byť izolované a purifikované z kultúry (odstavec G) organizmov, za účelom použitia pre kontrolu mikroorganizmov, ako sú pliesne a baktérie.
I. Expresia antibiotikových biosyntetických génov v mikrobiálnych hostiteľoch pre biokontrolné použitie
Klonované APS biosyntetické gény sa používajú na zvýšenie pôsobivosti biokontrolných génov rôznych mikroorganizmov. Jedna možnosť je transfer určitých APS génov späť do ich prirodzeného hostiteľa. Silné regulácia transkripcie potom spôsobuje produkciu veľkého množstva APS. Ďalšou možnosťou je transfer génov do heterológneho hostiteľa, čo vedie k produkcii APS v heterológnom hostiteľovi, ktorý normálne APS neprodukuje.
Mikroorganizmy, ktoré sú vhodné pre heterológnu nadmernú expresiu APS génov, sú všetky mikroorganizmy, ktoré sú schopné osídľovať rastliny alebo rizosféru. Ak sa dostanú do kontaktu s fytopatogénnymi pliesňami, spôsobujú inhibíciu ich rastu. Tieto organizmy zahŕňajú gram negatívne mikroorganizmy, ako sú Pseudomonas, Enterobacter a Serratia, gram-pozitívne mikroorganizmy Bacillus a Streptomyces spp. a pliesne Trichoderma a Gliocladium. Preferovanými heterológnymi organizmami sú Pse84 udomonas fluorescens, P. putida, P. cepacia, P. aureofaciens, P. aurantiaca, Enterobacter cloacae, Serratia marscesens, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Trichoderma viridae, Trichoderma harzianum a Gliocladium virens.
Príklad 27
Expresia APS biosyntetických génov v E. coli a ďalších gram-negatívnych baktériách
Mnoho génov bolo vyjadrených v gram negatívnych organizmoch heterológnym spôsobom. Príklad 11 opisuje expresiu génov pre biosyntézu pyrolnitrínu v E. coli za použitia exprimujúceho vektora pKK223-3 (Pharmacia kat. č. 27-4935-01). Tento vektor má silný tac promótor (Broisius, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81) regulovaný lac represorom a indukovaný IPTG. Rad ďalších expresných systémov bol vyvinutý pre E. coli a niektoré sú detailne opísané v príkladoch 14-17. Termoindukovateľný expresný vektor pPL (Pharmacia 27-4946-01) sa používa na reguláciu promótora bakteriofágu R , ktorý umožňuje vysokú expresiu proteínov. lac promótor poskytuje ďalší prostriedok pre expresiu, ale promótor nie je vyjadrený tak vysoko, ako je tac promótor. Niektoré tieto exprimujúce vektory majú replikóny použiteľné v širokom rozmedzí hostiteľov, preto je možná produkcia antipliesňových látok v príbuzných gram-nega tívnych baktériách, ako sú Pseudomonas, Enterobacter, Serratia a Erwinia. Napríklad pLRKD211 (Kaiser and Kroos, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5816-5820 (1984)) obsahuje replikón oriT, ktorý umožňuje replikáciu v mnohých gram-negatívnych baktériách.
V kmeňoch E. coli je pre expresiu tac promótora (t.j. trp-lac) nutná indukcia pomocou IPTG. Ak je tento promótor v kmeňoch Pseudomonas indukovaný (t.j. na plazmide pLRKD211, použiteľný pre široké rozmedzie hostiteľov), je aktívny bez indukcie pomocou IPTG. Tento trp-lac promótor môže byé umiestnený pred akýmkoľvek génom alebo operónom, ktorý sa hodí pre expresiu v Pseudomonas alebo v ďalších príbuzných baktériách, za účelom konštitučnej expresie takýchto génov. Ak operón nesie informáciu pre biosyntézu APS, potom kmene gram-negatívnych baktérií, ktoré nemajú kontrolné schopnosti, môžu byť schopné ochrániť rastliny proti radu pliesňových chorôb. Gény pre antipliesňové zlúčeniny môžu byť preto umiestnené za silI ným konštrukčným promótorom a môžu byť transformované do baktérií, ktoré normálne antipliesňové produkty nevytvárajú a ktoré sú schopné kolonizovať rastliny alebo rizosféru, čo ich pretvára na efektívne biokontrolné organizmy. Existujú ďalšie možné promótory, ktoré sa môžu používať pre expresiu APS génov v gram-negatívnych baktériách. Medzi ne patrí napr. promótor regulačných génov gafA a LemA z kmeňov Pseudomonas (WO 94/01561) a Pseudomonas savastanoi IAA operónovy promótor (Gaffney et al., J. Bacteriol. 172: 5593-5601 (1990)).
Tento syntetický Prn operón s lac promótorom je opísaný v príklade 11a. Bol včlenený do dvoch vektorov, ktoré sa replikujú v širokom rozmedzí gram-negatívnych baktérií. Tento vektor pRK290 (Ditta et al., 1980 PNAS 77(12) str. 7347-7351) je plazmid s nízkym počtom kópií a druhý vektor pBBRIMCS (Kovach et al., 1994, Biotechniques 16(5): 800-802) je plazmid so stredným počtom kópií. Konštrukcie oboch vektorov, obsahujúce Prn gény boli včlenené do radu gram-negatívnych bakteriálnych kmeňov a testované na produkciu pyrolnitrínu pomocou TLC a HPLC. Rad kmeňov heterológne produkuje pyrolnitrín. Tieto kmene zahŕňajú E. coli, Pseudomonas sp. (MOCG133, MOCG380, MOCG382, BL897, BL1889, BL2595) a Enterobacter taylorae (MOCG206).
Príklad 28
Expresia APS biosyntetických génov v gram-pozitívnych baktériách
Heterológna expresia génov kódujúca APS v gram pozitívnych baktériách je prostriedok pre produkciu nových biokontrolných kmeňov. Exprimujúce systémy pre Bacillus a Streptomyces sú najlepšie charakterizované. Promótor génu pre erytromy86 cínovú rezistenciu (ermR) zo Streptococcus pneumoniae je aktívny v gram-pozitívnych aeróboch i anaeróboch a tiež v E. coli (Trieu-Cuot et al., Nucl. Acids Res. 18: 3660 (1990)). Ďalší promótor pre antibiotickú rezistenciu z génu pre tiostrepton sa používa v klonovacích vektoroch v Streptomyces (Bibb. Mol. Gen. Genet. 199: 26-36 (1985)). Shuttle vektor pHT3101 je tiež vhodný pre expresiu v Bacillus (Lereclus, FEMS Microbiol. Lett. 60: 211-218 (1989)) . Expresiou operónu (ako je pyrolnitrínový operón) jednotlivých APS kódujúcich génov, za riadenia ermR alebo iných promótorov, je možné premeniť pôdne bacily na kmene, ktoré sú schopné ochrániť rastliny proti mikrobiálnym chorobám. Podstatná výhoda tohoto prístupu je, že rad gram-pozitívnych baktérií produkuje spóry, ktoré sa môžu použiť vo formuláciách, ktoré produkujú biokontrolné produkty s dlhou životnosťou. Druhy Bacillus a Streptomyces sú agresívni kolonizátori pôdy. Oba druhy produkujú druhotné metabolity, ktoré majú antibiotickú aktivitu proti radu organizmov a vnesenie heterológnych antipliesňových génov (gény kódujúce pyrolnitrín, soraphen, fenazín alebo cyklické peptidy) do gram pozitívnych baktérií môže urobiť z týchto organizmov ešte lepšie kontrolné kmene.
Príklad 29
Expresia APS biosyntetických génov v pliesňach.
Trichoderma harzianum a Gliocladium virens poskytujú rôznu úroveň biokotroly (US 5,165,928 a US 4,996157, oba Cornell Research Foundation). Úspešné použitie týchto biokontrolných kmeňov bude podporené vývojom kmeňa vylepšeného inzerciou APS génov. Toto sa môže uskutočniť niekoľkými spôsobmi. Jedným z nich je transformácia pliesní sprostredkovaná protoplastmi. Táto transformácia je urobená pomocou PEG alebo elektroporácie. Ostreľovanie časticami sa môže použiť pre transformáciu protoplastov alebo ďalších pliesňových buniek, ktoré majú schopnosť vyvinúť sa do regenerovanej vyzretej štruktúry. Vektor pAN7-l, pôvodne vyvinutý pre transformáciu Aspergillus sa teraz používa pre transformáciu pliesní (Curragh et al., Mycol.
Res. 97(3): 313-317 (1992); Tooley et al., Curr. Genet 21:
55-60 (1992); Punt et al., Gene 56: 117-124 (1987)), je geneticky manipulovaný tak, že obsahuje pyrolnitrínový operón alebo ďalšie gény pre biosyntézu APS. Tento plazmid obsahuje E. coli gén pre hygromycín B rezistenciu, ktorý je lemovaný gpd promótorom z Aspergillus nidulans a trpC terminátorom (Punt et al., Gene 56: 117-124 (197)).
J. Aktivita in vitro antipatogénnych látok proti rastlinným patogénom
Príklad 30
Biotest na detekciu antipliesňovej aktivity
Inhibícia rastu pliesní potencionálnym antipliesňovým agens môže byť určená radom testov. Makroskopické metódy, ktoré sa bežne používajú, zahŕňajú test agarová difúzia (Dhingra and Sinclair, Basic Plánt Pathology Methods, CRC Press, Boca Raton, FLA (1985) a test na kvapalnom médiu (Broekaert et al., FEMS Microbiol. Lett. 69: 55-60 (1990)). Oba typy testov sa uskutočňujú buď so spórami pliesní, alebo s mycéliom, ktoré sa používa ako inokulum. Spôsob udržovania pliesňových zásobných kultúr je v súlade so štandardnými mykologickými metódami. Spóry pre biotest sa zberajú zo zrelých pliesňových platní, zmývaním povrchu kultúry sterilnou vodou alebo pufrom. Suspenzia mycélia je pripravená homogenizáciou pliesní z platní až do rozptýlenia kolónií. Homogenát je filtrovaný cez niekoľko vrstiev plátna, takže veľké častice sú odstránené. Prefiltrovaná suspenzia je premytá centrifugáciou a supernatant sa vymení za čerstvý pufer. Koncentrácia mycélia v suspenzii je určená empiricky testovaním v bioteste.
Test agarovej difúzie sa môže uskutočniť suspenzáciou spór alebo fragmentov mycélia v pevnom testovacom médiu, aplikáciou antipliesňového činidla do jedného bodu, z ktorého postupuje difúziou. Toto sa môže urobiť pridaním spór alebo mycé88 lia do roztaveného pliesňového rastového média, ktoré je naliate na sterilné platne a ponechané zgelovatieť. Sterilný filter je umiestnený na povrch média a roztok antipliesňového činidla je nanesený do jedného miesta na filtri. Keď filter roztok absorbuje, platne sa inkubujú pri vhodnej teplote, obvykle 1 až 2 dni. Inhibícia rastu je indikovaná prítomnostou zón okolo filtra, v ktorých nevyklíčili spóry alebo kde nevyrástli mycélia. Antipliesňová potencia činidla, označená ako minimálna účinná dávka môže byť kvantifikovaná nanesením série riedení činidla na filtre a určením najnižšej dávky, ktorá spôsobuje vznik inhibičnej zóny. Ďalší test agarovej difúzie sa môže urobiť vytvorením dier do stuhnutého pliesňového rastového média, kam je umiestnený roztok antipliesňového činidla. Platňa je inokulovaná v bode rovnomerne vzdialenom od dier, obvykle v centre platne, buď malým množstvom suspenzie spór alebo mycélia, alebo kusmi agaru, v ktorom je zaliata zásobná kultúra mycélia. Platňa sa inkubuje niekoľko dní, kým rastúce mycélium dosiahne diery. Potom sa platňa podrobí zhodnoteniu rastovej inhibície. Inhibícia je indikovaná deformá· ciou kruhovej oblasti, kde sa predpokladá, že by rástli pliesňové kolónie za normálnych podmienok. Keď sa objaví sploštené čelo myceliárnej oblasti alebo dokonca má táto oblasť konkávny tvar, ide o inhibíciu rastu. Minimálna účinná dávka je určená testovaním riedených roztokov činidla.
Biotest v kvapalnom médiu sa uskutoční použitím suspenzií spór alebo mycélia, ktoré sú inkubované v kvapalnom rastovom pliesňovom médiu namiesto pevného média. Pliesňové inokulum, médium a antipliesňové činidlo sa zmieša a zmes sa rozdelí do buniek 96-jamkovéj mikrotitračnej platne a sleduje sa rast pliesní spektrofotometrickým meraním turbidity kultúry. Rast turbidity koreluje s rastom biomasy. Inhibícia rastu je určená porovnaním, rastu pliesní v prítomnosti antipliesňového činidla s rastom bez jeho prítomnosti. Minimálna koncentrácia inhibítora alebo ECso sa môže určiť testovaním riedených roztokov antipliesňového inhibítora.
Príklad 31
Biotest pre detekciu antibakteriálnej aktivity
Rad biotestov sa môže používať na určenie antibakteriálne j aktivity neznámych zlúčenín. Inhibícia bakteriálneho rastu na pevnom médiu sa môže uskutočniť rozptýlením inokula bakteriálnej kultúry do roztaveného média a vyliatím na dno sterilnej Petriho misky. Po stuhnutí média bol sterilný filtračný disk umiestnený na povrch a alikvóty testovaného materiálu boli nanesené na tieto disky. Platne sa inkubovali cez noc pri vhodnej teplote a inhibícia rastu sa pozorovala ako oblasť okolo filtra, kde baktérie nerástli alebo kde ich rast bol redukovaný v porovnaní s okolitou oblasťou. Čisté látky môžu byť charakterizované určením minimálnej účinnej látky, čo je najmenšie množstvo materiálu, ktorý spôsobí vznik zóny inhibovaného rastu. V prípade kvapalného média sa môžu použiť ďalšie dve metódy. Rast kultúry sa môže monitorovať meraním optickej denzity kultúry, skutočne sa meria rozptyl dopadajúceho svetla. Do dvoch médií s rovnakým objemom sa vnesie rovnaké množstvo inokula, do jednej z týchto kultúr sa pridá známe množstvo potencionálneho antibakteriálneho činidla. Po inkubácii pri vhodnej teplote a aerácii sa pozorujú optické denzity oboch kultúr. Vhodná vlnová dĺžka pre porovnanie je 600 nm. Antibakteriálne činidlo môže byť charakterizované určením minimálnej účinnej dávky, čo je najmenšie množstvo materiálu, ktoré spôsobuje redukciu denzity kultúry alebo určením EC^q, čo je koncentrácia, pri ktorej je testovacia kultúra polovičná v porovnaní s kontrolnou. Vyššie opísané biotesty nerozlišujú medzi bakteriostatickým a bakteriocídnym účinkom. Ďalší test na určenie bakteriocídnej aktivity činidla prebieha týmto spôsobom: baktérie a aktívne činidlo sa inkubujú spolu v kvapalnom médiu za daný čas a daných podmienok, ktoré sú vhodné pre uplatnenie účinku činidla. Po inkubácii sa baktérie buď premyjú centrifugáciou a resuspendujú, alebo sa nariedia pridaním čerstvého média. V každom prípade je koncentrácia antibakteriálneho činidla redukovaná a neprejavuje sa antibakte90 riálny účinok. Baktérie sa nanesú na pevné médium a inkubujú pri vhodnej teplote. Určí sa počet vyrastených kolónií, počet kolónií, ktoré vyrástli zo zmesi obsahujúcej antibakteriálne činidlo sa porovná s počtom kolónií, ktoré vyrástli zo zmesi bez tohto činidla. Redukcia v počte kolónie tvoriacej jednotky udáva baktericidnú aktivitu činidla. Baktericidná aktivita môže byť kvántifikovaná ako minimálna účinná dávka alebo ako EC^q. Baktérie vhodné pre tieto testy sú druhy Agrobacterium, Erwinia, Clavibacter, Xanthomonas a Pseudomonas.
Príklad 32
Určenie antipatogénnej aktivity APS
Za účelom zistenia, proti ktorým pliesňam a baktériám sú APS aktívne, sú tieto látky testované metódou opísanou v príkladoch 30 a 31. APS môžu byť izolované z buniek a z kultúry hostiteľského organizmu, ktorý ich bežne produkuje alebo môžu byť izolované z heterológnych hostiteľov, ktorí boli geneticky manipulovaní za účelom produkcie APS. Ďalšou možnosťou je chemická syntéza APS látok so známou chemickou štruktúrou alebo ich deriváty.
Príklad 33
Určenie antimikrobiálnej aktivity pyrolnitrínu
a) Pozorovala sa antifytopatogénna aktivita fluorinovaného 3-kyano-derivátu pyrolnitrínu (označeného CGA173506) proti kukuričnému pliesňovému fytopatogénu Diplodia maydis, Colletotrichum graminicola a Gibberella zeae-maydis. Spóry pliesní boli zhromaždené a suspendované vo vode. Približne 1000 spór kmeňa CGA173506 bolo inokulovaných do pôdy so zemiakovou dextrózou. Pri slepom stanovení bola pôda doplnená vodou do celkového objemu 100 μ.1. Touto zmesou boli naplnené diery 96-jamkovej mikrotitračnej platne, ktorá je vhodná pre čítacie zariadenie. Látka CGA173506 bola získaná ako 50 % zmáčatelný prášok a bola pripravená zásobná suspenzia s koncentráciou 10 mg/ml v sterilnej vode. Táto zásobná suspenzia bola nariedená sterilnou vodou a vzniknutá alikvóta používaná v teste bola označená 173506. Spóry, médium a 173506 boli zmiešané a bola zmeraná turbidita (absorbancia pri 600 nm) zmesi. Tieto hodnoty predstavujú slepé meranie a boli odpočítané od hodnôt neskoršieho merania. Po 46 hodinách inkubácie bolo určené, že prítomnosť 1 μg/ml látky 173506 redukuje rast Diplodia maydis na 64 % a po 120 hodinách rovnaká koncentrácia 173506 inhibuje rast Colletotrichum graminicola na 50 %. Po 40 hodinách inkubácie koncentrácia 0,5 μg/ml 173506 100 % inhibuje
Gibberella zeae-maydis.
b) Testoval sa účinok pyrolnitrínu na rôzne kukuričné pliesňové patogény a zistilo sa, že inhibuje rast Bipo laris maydis, Colletotrichum graminicola, Diplodia maydis, Fusarium moniliforme, Gibberella zeae a Rhizoctonia solani.
Na určenie inhibície rastu bol autoklávovaný filtračný disk (6,25 cm v priemere, od Schleicher a Schuell) umiestnený blízko obvodu PDA (DIFCO) platne. Roztoky boli pipetované na tieto filtre. 2,5 μς pyrolnitrínu (25 μΐ) sa nanieslo na filtračný disk a 25 μΐ 63 % etanolu sa nanieslo na iný disk. Kúsky gélu z pliesní sa preniesli zo zásobných platní a umiestnili sa do stredu PDA platní. Každý druh pliesne bol inokulovaný na zvláštnu platňu. Pliesne boli inkubované a inhibícia sa vyhodnotila vo vhodnom čase. Inhibícia bola detekovaná vizuálne.
K. Expresia antibiotikových génov v transgenických rastlinách
Príklad 34
Modifikácia kódujúcich a priľahlých sekvencií
Klonované APS biosyntetické gény opísané v tejto prihláške môžu byť modifikované pre expresiu v transgenických rástli92 nách. Toto bolo urobené za účelom produkcie izolovateľného množstva APS z transgénnych rastlín (t.j. z rovnakých dôvodov, ako sú opísané v sekcii E) alebo za účelom takej expresie, že dochádza k akumulácii APS v rastlinných tkanivách, čo vedie k ochrane rastlín proti patogénom. Hostiteľská rastlina, ktorá vyjadruje gény pre biosyntézu APS a produkuje APS v svojich bunkách, bude zvyšovať svoju rezistenciu voči napadnutiu fytopatogénmi, nebude dochádzať k takým stratám na úrode.
Transgenická expresia mikrobiálnych génov v rastlinách môže vyžadovať modifikáciu týchto génov, ktorá vedie k dosiahnutiu a optimalizácii ich expresie v rastlinách. Bakteriálne ORF, ktoré kódujú jednotlivé enzýmy, ale ktoré sú kódované rovnakým transkriptom v prírodnom mikróbe, sú najlepšie vyjadrené v rastlinách na separovaných transkriptoch. Na dosiahnutie toho je nutné izolovať každý mikrobiálny ORF jednotlivo a klonovať ho do kazety, ktorá poskytuje sekvencie rastlinného promótora v 5-konci ORF a rastlinný transkripčný terminátor na 3-konci ORF. Izolované ORF sekvencie pravdepodobne zahŕňajú iniciačný ATG kodón a terminačný kodón, ale môžu tiež zahŕňať d'alšie sekvencie na druhej strane iniciačného kodónu ATG a terminačného kodónu. Naviac ORF môžu byť obmedzené, ale stále im zostáva žiadaná aktivita; dostatočne dlhé ORF obmedzenej verzie so zvyšnou aktivitou môžu byť prednostne vyjadrené v transgenických organizmoch. Termíny rastlinný promótor a rastlinný transkripčný terminátor znamenajú promótory a transkripčné terminátory, ktoré sú funkčné v rastlinách. Do toho sa zahŕňajú promótory a transkripčné terminátory, ktoré môžu byť odvodené z nerastlinných zdrojov, ako sú vírusy (napr. karfiolový mozaikový vírus).
V niektorých prípadoch modifikácia ORF kódujúcich sekvencií a sekvencií priľahlých nie je nutná. Stačí izolovať fragment obsahujúci žiadaný ORF a rastlinný promótor, ktorý leží downstream k ORF. Napríklad Gaffney et al., (Science 261: 754-756 (1993)) exprimoval gén nahG z Pseudomonas v transgenických rastlinách. Expresia bola úspešne riadená CaMV 35S promótorom a CaMV tmi terminátorom bez modifikácie kódujúcej sekvencie a s 56 bp veľkým génom z Pseudomonas umiestneným upstream ATG a 165 bp veľkým génom umiestneným downstream terminačného kodónu, ktoré sú stále pripojené k nahG ORF. Uprednostňuje sa, že malé priľahlé sekvencie by mali byť zľava pripojené upstream k ATG a downstream terminačnému kodónu. V praxi môže vytvorenie tejto konštrukcie závisieť od dostupnosti reštrikčných miest.
V iných prípadoch expresia mikrobiálnych génov môže byť problematická. Tieto problémy boli dobre charakterizované, sú bežné v prípadoch génov odvodených z určitých zdrojov, ako je Bacillus. Tieto problémy môžu ovplyvňovať biosyntézu APS génov tohoto vynálezu a musia byť podrobené istej modifikácii, použitím dobre známej metódy. Tieto problémy sú:
(1) Použitie kodónu. Preferované kodóny v rastlinách sa líšia od preferovaných kodónov iných organizmov. Z porovnaní použitia kodónov v klonovaných mikrobiálnych ORF s použitím v rastlinných génoch (a v určitých génoch rastlín) je možné určiť kodóny v ORF, ktoré by mali byť prednostne vymenené. Vývoj rastlín smeruje k silnej preferencii nukleotidov C a G a v báze na tretej pozícii jednoklíčnych rastlín, zatiaľ čo dvojklíčne rastliny v tejto pozícii často používajú nukleotidy A alebo T. Modifikáciou génov sa môže predísť problémom, uvedeným nižšie, spojeným s obsahom a GC/AT a s nepravým zostrihom, pri použití preferovaného kodónu pre určité transgenické druhy.
(2) Obsah GC/AT. Rastlinné gény majú obsah GC vyšší než 35 %. ORF sekvencie, ktoré sú bohaté na A a T nukleotidy, môžu spôsobovať v rastlinách niekoľko problémov. Po prvé, motívy ATTTA spôsobujú destabilizáciu informácií a sú zistené na 3'-konci mnohých mRNA. Po druhé, výskyt polyadenylačných signálov, ako je AATAAA v nevhodných pozíciách v informácii spôsobuje skomolenie transkripcie. Naviac monokotyledóny môžu rozoznať sekvencie bohaté na AT nukleotidy ako miesta strihu (uvedené nižšie).
(3) Sekvencie priľahlé k iniciačnému metionínu. Rastliny sa odlišujú od mikroorganizmov v tom, že ich matrice nemajú definované ribozomálne väzbové miesto. Skôr sa ukazuje, že ribozómy sa viažu na 5-konci matrice a hľadajú prvé dostupné ATG, ktoré štartuje transláciu. Existuje tu však preferencia pre isté nukleotidy priľahlé k ATG a expresia mikrobiálnych génov môže byť zvýšená inklúziou eukaryotického translačného iniciátora v pozícii ATG. Clontech (1993/1994 kat., str. 210) navrhuje sekvencie GTCGACCATGGTC (SEQ ID č.:7) ako konsenzus translačného iniciátora pre expresiu E. coli uidA génu v rastlinách. Ďalej Joshi (NAR 15: 6643-6653 (1987)) porovnal priľahlé sekvencie k ATG mnohých rastlín a naznačuje ďalší konsenzus TAAACAATGGCT (SEQ ID č.:8). V situáciách, kde sa musí počítať s problémami v expresii mikrobiálnych ORF v rastlinách, inklúzia jednej z týchto sekvencií v iniciačnom ATG môže zlepšiť transláciu. V takýchto prípadoch posledné tri nukleotidy konsenzu nemusia byť vhodné pre inklúziu v modifikovaných sekvenciách druhého AA zvyšku. Preferované sekvencie priľahlé k iniciačnému metionínu môžu byť rôzne medzi rôznymi rastlinnými druhmi. Štúdia 14 kukuričných génov umiestnených v GenBank databéza poskytuje nasledujúce výsledky.
Umiestnenie pred iniciačným ATG v 14 kukuričných génoch
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 2 -1
C 3 8 4 6 2 5 6 0 10 7
T 3 0 3 4 3 2 1 1 1 0
A 2 3 1 4 3 2 3 7 2 3
G 6 3 6 0 6 5 4 6 1 5
Táto analýza sa môže uskutočniť v žiadaných druhoch rastlín,
do ktorých boli vnesené APS gény a sekvencie priľahlé k ATG
boli modifikované tak, aby došlo k včleneniu preferovaných nukleotidov.
(4) Odstránenie nepravých strihových miest. Gény klonované z iných než rastlinných zdrojov a nie sú optimalizované pre expresiu v rastlinách, môžu tiež obsahovať motívy, ktoré môžu byť u rastlín rozoznané ako 5' alebo 3'strihové miesta, môžu byť štiepené, a týmto spôsobom môžu vzniknúť skomolené alebo neúplné informácie .
Metódy pre modifikáciu kódujúcich sekvencií a priľahlých sekvencií sú dobre známe. V prípadoch, kde počiatočná expresia mikrobiálnych ORF je nízka, je vhodné zmeniť sekvencie, ako je uvedené vyššie, potom konštrukcia syntetických génov môže byť uskutočnená podľa dobre známych metód. Tieto sú napríklad opísané v publikovanom patente EPO 385 962 (Monsato), EP 0 359 472 (Lubrizol) a WO 93/07278 (Ciba-Geigy). Vo väčšine prípadov sa pre testovanie expresie génových konštrukcií používa prechodný testovací protokol pred ich transferom do transgenických rastlín.
Príklad 35
Konštrukcia rastlinných transformačných vektorov
Rad transformačných vektorov je dostupných pre transformáciu rastlín a gény v tomto vynáleze sa môžu používať v spojení s týmito vektormi. Selekcia vektorov závisí od preferovanej transformačnej metódy a cieľového druhu organizmu. Pre isté cieľové druhy sú preferované rôzne antibiotikové a herbicídne selekčné markéry. Selekčné markéry rutinne používané pri translácii zahŕňajú nptll gén, ktorý prepožičiava rezistenciu na kanamycín a príbuzné antibiotiká (Messing and Vierra, Gene 19: 259-268 (1982)); Bevan et al., Náture 304: 184-187 (1983)), bar gén, ktorý vnáša rezistenciu na herbicíd fosfinotricín (White et al., Nucl. Acids Res. 18: 1062 (1990), Spenser et al., Theor. Appl. Genet. 79: 625-631 (1990)), hph gén, ktorý zodpovedá za rezisteniu na antibiotikum hygromycin (Blochinger and Diggelmann, Mol. Celí Biol. 4: 2929-2931) a dhfr gén, ktorý vnáša rezisteniu na metotrexáty (Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1083)).
(1) Konštrukcia vektorov vhodných pre transformáciu do Agrobacterium
Rad vektorov je vhodných pre transformáciu za použitia Agrobacterium tumefaciens. Tieto vektory nesú najmenej jednu T-DNK hraničnú sekvenciu a zahŕňajú vektor, ako je pBIN19 (Bevan, Nuvcl. Acids Res. (1984)). Ďalej je opísaná konštrukcia dvoch typických vektorov.
Konštrukcia pCIB200 a pCIB2001
Binárne vektory pCIB200 a pCIB2001 boli použité pre konštrukciu rekombinantných vektorov pre použitie spoločne s Agrobacterium. Boli konštruované nasledujúcim spôsobom: pTJS75kan bol vytvorený štiepením pomocou NarI vektora pTJS75 (Schmidhauser and Helinski, J. Babteriol. 164: 446-455 (1985)) umožňujúcim -vystrihnúť gén pre tetracyklínovú rezistenciu, za čím nasleduje inzercia Accl fragmentu z pUC4K nesúcou NPTII (Messing and Vierra, Gene 19: 259-268 (1982)); Bevan et al., Náture 304: 184-187 (1983); McBride et al., Plánt Molecular Biology 14: 266-276 (1990)). Xhol linkery boli ligované do EcoRV fragmentu pCIB7, ktorý obsahuje ľavé a pravé T-DNK hranice, rastlinný selekcie schopný nos/nptll chimerický gén a pUC polylinkér (Rothstein et al., Gene 53: 153-161 (1987)) a Xhol vyštipnutý fragment bol klonovaný do Sali štiepeného pTJS75kan za vzniku pCIB200 (EP 0 332 104, príklad 19). pCIB200 obsahuje nasledujúce jedinečné reštrikčné miesta na polylinkéri: EcoRI, SstI, KpnI, BglII, Xbal a Sali. PCIB 2002 je odvodený z pCIB200,. ktorý bol vytvorený inzerciou ďalších reštrikčných miest do polylinkéra. Jedinečné reštrikčné miesta v polylinkéri pCIB2001 sú EcoRI, SstI, KpnI, BglII, Xbal, Sali, Mlul, Bell, AvrlI, Apal, Hpal a Stul. PCIB2001, ktorý obsahuje tieto jedinečné reštrikčné miesta a naviac ne97 sie rastlinnú a bakteriálnu kanamycínovú selekciu, ľavé a pravé T-DNK hranice pre Agrobacterium sprostredkovanou transformáciou, z RK2 odvodené trfA funkcie pre mobilizáciu medzi E. coli a iných hostiteľov a OriT a OriV funkcie tiež odvodené z RK2. pCIB2001 polylinkér je vhodný pre klonovanie rastlinných exprímujúcich kaziet, ktoré obsahujú ich vlastné regulačné signály.
Konštrukcia pCIBlO a jeho deriváty schopné selekcie na hydromycín
Binárny vektor pCIBlO obsahuje gén kódujúci kanamycínovú rezistenciu, ktorá je vhodná ako selekčný markér v rastlinách, T-DNK pravé a ľavé hraničné sekvencie a inzerované sekvencie z plazmidu pRK252, ktorý sa replikuje v širokom rozmedzí hostiteľov vrátane E. coli a Agrobacterium. Jeho konštrukciu opisuje Rothstein et al., Gene 53: 153-161 (1987). Boli skonštruované rôzne deriváty pCIBlO, ktoré majú včlenený gén pre hygromycín E, fosfotransferázu, opísal Grity et al. , (Gene 25: 179-188 (1983)). Tieto deriváty sú schopné selekcie buniek transgenických rastlín iba na hygromycín (pCIB743)) alebo hygromycín a kanamycín (pCIB715, pCIB717).
(2) Konštrukcia vektorov vhodných pre transformáciu bez sprostredkovania druhu Agrobacterium
Transformácia bez použitia Agrobacterium tumefaciens obchádza požiadavku T-DNK sekvencií vo vybraných transformačných vektoroch a preto vektory, ktoré nemajú tieto sekvencie, sa môžu používať spolu s vektormi, ktoré obsahujú T-DNK sekvencie. Transformačné metódy, ktoré nepočítajú s Agrobacterium, zahŕňajú transformáciu cez ostreľovanie časticami, za prispenia protoplastov (napr. PEG a elektroporácie) a mikroinjektáž. Voľba vektora závisí vo veľkej miere od selekcie, ktorú preferujú druhy, do ktorých je vektor transformovaný. Ďalej sú opísané niektoré typické vektory.
Konštrukcia pCIB3064 pCIB3064 je vektor odvodený z pUC, vhodný pre metódu priameho prenosu génu v kombinácii so selekciou na herbicíd Bašta (alebo fosfonotricín). Plazmid pCIB246 obsahuje CaMV 35S promótor v operačnej fúzii s génom GUS z E. coli a CaMV 35S transkripčný terminátor, ako je opísané v PCT prihláške WO 93/07278. Promótor 35S tohoto vektora obsahuje dve ATG sekvencie 5-konca štartovacieho miesta. Tieto miesta boli mutované za použitia štandardnej PCR metódy takým spôsobom, že ATG miesta boli odstránené a boli generované reštrikčné miesta SspI a PvuII. Nové reštrikčné miesta boli vzdialené 95 a 37 bp od jedinečného Salo miesta a 101 a 42 bp od štartovacieho miesta. Výsledný derivát pCIB246 bol označený pCIB3025. GUS gén bol vystrihnutý z pCIB3025 štiepením s Sali a Sací, konce boli zarovnané a gén bol znovu ligovaný a vznikol plazmid pCIB3060. Plazmid pJIT82 sa získal z John Innes Center, Norwich a 400 bp Smal fragment obsahujúci gén bar zo Streptomyces viridochromogenes bol vyštipnutý a znovu včlenený do Hpal miesta pCIB3060 (Thompson et al., EMBO J 6: 2519-2523 (1987)). Týmto spôsobom vznikol pCIB3064, ktorý obsahuje gén bar, ktorý je riadený promótorom CaMV 35S a terminátorom pre selekciu na herbicíd, gén pre ampicilínovú rezistenciu (selekcia v E. coli) a polylinkér s jedinečnými miestami Sphl, PstI, HindlII a BamHI. Tento vektor je vhodný pre klonovanie rastlinných exprimujúcich kaziet, ktoré obsahujú ich vlastné regulačné signály.
Konštrukcia pSOG19 a pSOG35 pSOG35 je transformačný vektor, ktorý využíva gén pre dihydrofolatovú reduktázu z E. coli (DHFR) ako selekčný markér, ktorý prepožičiava rezistenciu na metotrexát. PCR reakcia bola použitá pre amplifikáciu promótora 35S (~800 bp), intrón 6 z kukuričného Adhl génu (~550 bp) a 18 bp GUS neprekladanej vedúcej sekvencie z pSOGlO. 250 bp veľký fragment nesúci v E. coli gén pre dihydrofolátovú reduktázu typ II bol tiež amplifikovaný pomocou PCR a tieto dva PCR fragmenty boli spojené s SacI-PstI fragmentom z pBI221 (Clontech), ktorý obsahuje kostru vektora pUC19 a terminátor nopalinovej syntetázy.· Spojením týchto fragmentov vzniká pS0G19, ktorý obsahuje promótor 35S vo fúzii so sekvenciami intrónu 6, GUS vedúcu sekvenciu, DHFR gén a terminátor nopalinovej syntetázy. Zámena GUS vedúcej sekvencie v pCOG19 za vedúcu sekvenciu z kukuričného chloritického mramorového vírusu (MCMV) vedie k vytvoreniu vektora pSOG35. PSOG19 a pSOG35 nesú pUC gén pre ampicilínovú rezistenciu a má HindlII, Sphl, PstI a EcoRI miesta dostupné pre klonovanie cudzích sekvencií.
Príklad 36
Požiadavky na konštrukciu rastlinných exprimujúcich kaziet
Génové sekvencie zamýšľané pre expresiu v transgenických rastlinách sú najprv spojené do exprimujúcich kaziet za vhodný promótor a upstream vhodný transkripčný terminátor. Tieto kazety sa môžu ľahko preniesť do rastliny transformačným vektorom, ako je opísané predtým v príkladoch 2-6.
Selekcia promótora
Selekcia promótora používaného v exprimujúcich kazetách bude určená priestorovým a časovým modelom expresie transgénov v transgenických rastlinách. Vybrané promótory budú vyjadrovať transgény v špecifických typoch buniek (ako sú listové epidermálne bunky, bunky meosfylu, bunky koreňového kortexu) alebo v špecifických tkanivách alebo orgánoch (korene, listy alebo okvetie) a táto selekcia bude odrážať vyžadované umiestnenie biosyntézy APS. V inom prípade môže expresia génov prebiehať pomocou svetlom indukovateľného alebo inak časovo regulovaného promótora. Toto poskytuje možnosť indukovania indukcie APS iba vtedy, ak je žiadúca a keď je spôsobená chemickým indukčným činidlom.
Transkripčný terminátor
Vo vyjadrovacích kazetách sa dajú použiť rôzne trans100 kripčné terminátory. Terminátory sú zodpovedné za ukončenie transkripcie na druhej strane transgénu a jeho správnu polyadenyláciu. Vhodné transkripčné terminátory a tie, ktoré fungujú v rastlinách, zahŕňajú CaMV terminátor, tmi terminátor, terminátor nopalinovej syntézy a hrachový rbcS E9 terminátor sa môžu použiť v jednoklíčnych i dvojkllčnych rastlinách.
Sekvencie pre zvýšenie alebo reguláciu expresie
Bol objavený rad sekvencii, ktoré zvyšujú expresiu génu z transkripčnéj jednotky a tieto sekvencie sa môžu používať v spojení s génmi v tomto vynáleze za účelom zvýšenia expresie v transgenických rastlinách.
Rôzne sekvencie intrónov zvyšujú expresiu, zvlášť v jednokllčnych rastlinách. Napríklad intróny v kukuričnom géne Adhl podstatne zvyšujú expresiu génu divokého typu za pomoci jeho príbuzného promótora, keď sa včlení do buniek kukurice. Intrón 1 je zvlášť účinný a zvyšuje expresiu vo fúznej konštrukcii s génom chloramfenikolovej acetyltransferázy (Callis et al., Genes Develop 1: 1183-1200 (1987)). V niektorých pokusných systémoch, intrón z kukuričného génu bronzel mal podobný účinok v zvýšení expresie (Callis et al., supra). Sekvencie intrónu boli rutinne včlenené do rastlín transformačným vektorom s neprekladanou vedúcou sekvenciou.
Rad neprekladaných vedúcich sekvencii odvodených z vírusov sú schopné zvýšiť expresiu a sú zvlášť účinné v dvojklíčných bunkách. Vedúca sekvencia z tabakového mozaikového vírusu (TMV ’Ή-sekvencia), kukuričného chloritického mramorového vírusu (MCMV) a mozaikového vírusu lucerny (AMV) sú účinné pre zvýšenie expresie (napr. Galie et al., Nucl. Acids Res. 15: 8693-8711 (1987); Skuzeski et al., Plánt Molec. Biol. 15: 65-79 (1990)).
Cielenie génového produktu v bunke
Sú známe rôzne mechanizmy pre cielenie génových produktov v rastlinách a boli charakterizované sekvencie kontrolujúce
101 tieto mechanizmy. Napríklad cielenie génových produktov do chloroplastu je riadené signálnou sekvenciou, ktorá bola objavená na N-konci rôznych proteínov, ktoré sú štiepené počas importu chloroplastu, čo vedie k vytvoreniu zrelého proteínu (napr. Comai et al., J. Biol . Chem. 263: 15104-15109 (1988)) . Tieto signálne sekvencie môžu byť fúzované do heterológnych génových produktov, čím ovplyvňujú import heterológnych produktov do chloroplastu (van den Broeck et al., Náture 313: 358-363 (1985)). DNK kódujúca vhodné signálne sekvencie môže byť izolovaná z 5'-konca cDNK kódujúcej RUBISCO proteín, CAB proteín, enzým EPSP syntázy, GS2 proteín a mnoho ďalších proteínov, ktoré sú lokalizované v chloroplastoch.
Ostatné génové produkty sú umiestnené v ďalších organelách, ako sú mitochondrie a peroxizómy (napr. Unger et al., Plánt Molec. Biol. 13: 411-418 (1989)). cDNK kódujúca tieto produkty môže byť geneticky manipulovaná za účelom ovplyvniť cielenie heterológnych génových produktov do týchto organel. Príklady takýchto sekvencií sú v jadre kódované ATP-ázy a špecifické izoformy aspartátovej aminotransferázy z mitochondrií. Cielenie bunkových proteínov opisuje Rogers et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6152-6516 (1985)). Sekvencie, ktoré spôsobujú cielenie génových produktov do ďalších častí buniek boli tiež charakterizované. Sekvencie amino-konca sú zodpovedné za cielenie do ER, apoplastov a extracelulárnu sekréciu z aleurónových buniek (Koehler and Ho, Plánt Celí 2: 769-783 (1990)). Sekvencie amino-konca v spojení so sekvenciami karboxylového konca sú zodpovedné za cielenie génových produktov do vakuol (Shinshi et al., Plánt Molec. Biol. 14: 357-368 (1990)) .
Fúzovaním vhodných sekvencií pre cielenie génových produktov so sekvenciami transgénov je možné riadiť produkciu transgénov do organel alebo bunkových častí. Napríklad, pre cielenie do chloroplastov, chloroplastovej signálnej sekvencie z RUBISCO génu, CAB génu, génu EPSP syntetázy alebo GS2 génu, je fúzovaná do rámca k amino-koncu ATG transgénu. Signálna sekvencia by mala zahŕňať známe štiepiace miesto a pre kon102 štrukciu spojenia by sa mali brať do úvahy aminokyseliny za štiepiacim miestom. V niektorých prípadoch táto požiadavka môže byť splnená pridaním malého množstva aminokyselín medzi miesto štiepenia a transgén ATG alebo zámenou niektorých aminokyselín v transgénnej sekvencií. Fúzie konštruované pre import chloroplastov sú testované na účinnosť chloroplastov in vitro transláciou in vitro transkribovaných konštrukcií, výsledkom čoho je zvýšenie počtu chloroplastov in vitro za použitia opísanej metódy (Bartlett et al., v: Edelmann et al., (Eds.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier. str. 1081-1091 (1982)); Wasmann et al., Mol. Gen. Genet. 205: 446-453 (1986)). Tieto konštrukčné metódy sa môžu použiť pri mitochondriách a peroxizómoch. Voľba cielenia, ktorá môže byť žiadaná pre APS biosyntetické gény, závisí od bunkovej lokalizácie prekurzora nutného ako štartovací bod pre danú cestu. Tieto prekurzory môžu byť cytostatického alebo chloroplastického, v niektorých prípadoch mitochondriálneho alebo peroxizomálneho pôvodu. Produkty APS biosyntetických génov nie sú cielené do ER, apoplastov alebo vakuol.
Vyššie opísané mechanizmy pre bunkové cielenie sa môžu používať nielen v spojení s ich príbuznými promótormi, ale tiež v spojení s heterológnymi promótormi, ktoré ovplyvňujú špecifické bunkové cielenie transkripčnou reguláciou promótora, ktorý má model expresie odlišný od modelu promótora, z ktorého je signál odvodený.
Príklad 37
Príklady konštrukcií expresných kaziet
Tento vynález kladie dôraz na expresiu APS kódujúcich génov za regulácie promótora, ktorý je exprimovatel'ný v rastlinách bez ohľadu na pôvod promótora.
Ďalej tento vynález zdôrazňuje použitie akéhokoľvek promótora, ktorý je exprimovatel'ný v rastlinách v spojení s ďalšími sekvenciami, ktoré sú nutné pre expresiu APS génov. Také103 to sekvencie zahŕňajú transkripčné terminátory, doplňujúce sekvencie, ktoré zvyšujú expresiu (napr. intróny (Adh intrón 1)), vírusové sekvencie (napr. TNV-Ω) a sekvencie zamýšľané pre cielenie génového produktu do špecifických organel a časti buniek.
Konštitučná expresia: CaMV 35S promótor
Konštrukcia plazmidu pCGN1761 je opísaná v publikovanej prihláške EP 0 392 225 (príklad 23). pCGN1761 obsahuje dva 35S promótory a tmi transkripčný terminátor s EcoRI reštrikčným miestom medzi promótorom a terminátorom a má základnú kostru z pUC plazmidu. Derivát pCGN1761 má modifikovaný polylinkér, ktorý zahŕňa naviac Nôti a Xhol reštrikčné miesta k existujúcemu EcoRI. Tento derivát bol označený pCGN1761ENX. pCGN1761ENX je použiteľný pre klonovanie cDNK sekvencií alebo génových sekvencií (zahrňujúci mikrobiálne ORF sekvencie), ktoré môžu byť umiestnené do jeho polylinkéra za účelom ich expresie v transgenických rastlinách, ktorá prebieha za riadenia promótorom 35S. Celá kazeta 35S promótor-génové sekvencietml terminátor môže byť vystrihnutá reštriktázami Hind II, Sphl, Sali a Xbal na 5'-konci promótora a Xbal, BamHI a BglII na 3'konci terminátora a ďalej môžu byť transformované do transformačných vektorov, ako sú opísané v príklade 35. Ďalej môže byť fragment zdvojeného 35S promótora vyňatý strihom na 5'-konci v miestach HindlII, Sphl, Sali, Xbal alebo PstI a na 3'-konci strihom v akomkoľvek mieste polylinkéra (EcoRI, Nôti alebo Xhol) za účelom zámeny s iným promótorom.
Modifikácia pCGN1761ENX optimalizáciou translačného iniciačného miesta
Modifikácia v okolí klonovacích miest včlenením sekvencií, ktoré môžu zvýšiť transláciu, sa môže uskutočniť pre akúkoľvek konštrukciu opísanú v tejto sekcii. Je zvlášť výhodné, keď gény odvodené z organizmov neobsahujúcich sekvencie priľahlé k ich iniciačnému metionínu, ktoré sa môžu použiť pre ich expresiu v rastlinách, sú včlenené do rastlinnej exprimo104 vateľnej kazety. Gény odvodené z organizmov, klonované do rastlinných exprimovatelných kaziet v ich ATG, sú použiteľné pre modifikáciu ich inzertného miesta za účelom optimalizácie ich expresie. Modifikácia pCGN1761ENX je opísaná príkladom inkorporácie jednej z niekoľkých optimalizovaných sekvencií pre expresiu v rastlinách (napr. Joshi, NAR 15: 6643-6653 (1987)).
pCGN1761ENX je štiepený s Sphl, ošetrený T4 DNK polymerázou a znovu ligovaný, potom nasleduje rozrušenie Sphl miesta umiestneného na 5'konci dvojitého 35S promótora. Týmto spôsobom vznikol vektor pCGN1761ENX/Sph-. pCGN1761ENX/Sph- je štiepený s EcoRI a ligovaný do zosilneného molekulárneho adaptora a sekvencií 5'-AATTCTAAAGCATGCCGATCGG-3' (SEG ID č.:9)/5'AATTCCGATCGGCATGCTTTA-3' (SEQ ID č.:10). Takto vznikol vektor pCGNSENX, ktorý má inkorporované optimalizované rastlinné translačné iniciačné sekvencie quasi TAAA-C, priľahlé k ATG kodónu, ktorý je sám súčasťou Sphl reštrikčného miesta, ktoré je vhodné pre klonovanie heterológnych génov v ich iniciačnom metioníne. Downstream od Sphl miesta ostávajú miesta EcoRI, Nôti a Xhol.
Bol vytvorený alternatívny vektor, ktorý využíva Ncol miesta v iniciačnom ATG. Tento vektor značený ako pCGN1761NENX je vytvorený inzerciou molekulárneho adaptora sekvencií 5'- AATTCTAAACCATGGCGATCGG-3' (SEQ ID č.:11)/5'-AATTCCGATCGCCATGGTTTA-3' (SEQ ID č.12) do pCGN1761ENX v EcoRI mieste (SEQ ID č.: 14 a 15). Potom tento vektor zahrňuje optimalizovanú sekvenciu quasi TAAACC priľahlú k iniciačnému ATG s Ncol miestom. Downstream miesta sú EcoRI, Nôti a Xhol. Pred touto manipuláciou dve Ncol miesta v pCGN1761ENX vektora (v upstream pozíciách 5'-konca 35S promótorovej jednotky) boli rozrušené za použitia podobnej metódy, ako bola opísaná pre Sphl alebo použitím inside-outside PCR (innes et al., PCR Protocols: A quide to methods and applications. Academic Press, New York (1990); príklad 14). Táto manipulácia je testovaná pre možný škodlivý účinok na expresiu inzercií akejkoľvek rastlinnej cDNK alebo sekvencie reportného génu do klonovacieho miesta, čo je nasledované rutinnou analýzou expresie v rastlinách.
105
Expresia s chemicky regulovateľným promótorom
Táto sekcia opisuje zámenu zdvojeného promótora 35S v pCGN1761ENX s ľubovoľným promótorom; chemicky regulovaný promótor PR-1 je opísaný na príklade. Zvolený promótor je vystrihnutý z jeho zdroja reštrikčným enzýmom alebo môže byť amplifikovaný PCR za použitia primérov, ktoré nesú vhodné koncové reštrikčné miesta. Po PCR amplifikácii je promótor resekvenovaný za účelom vylúčenia chyby pri amplifikácii, potom nasleduje klonovanie amplifikovaného promótora do vektora. Chemicky regulovateľný tabakový promótor PR-1 je vystrihnutý z plazmidu pCIB1004 (konštrukcia opísaná v EP 0332 104, príklad 21) a prenesený do plazmidu pCGN1761ENX. pCIB1004 je štiepený Ncol reštrikčnou endonukleázou a 3'koniec linearizovaného fragmentu je zarovnaný použitím T4 DNK polymerázou. Fragment je potom štiepený HindlII a výsledný fragment, ktorý obsahuje promótor je purifikovaný z gélu a klonovaný do pCGN1761ENX, z ktorého je odstránený zdvojený promótor 35S. Toto je uskutočnené enzýmom Xhol a konce sú zarovnané T4 polymerázou, nasleduje štiepenie enzýmom HindlII a izolácia väčšieho fragmentu, ktorý obsahuje vektor s terminátorom a do ktorého fragment nesúci pCIB1004 promótor je klonovaný. Týmto spôsobom vzniká derivát pCGN1761ENX s PR-1 promótorom a tmi terminátorom a polylinkérom s EcoRI a Nôti reštrikčnými miestami. Vybrané APS gény môžu byť včlenené do tohoto vektoru a produkt fúzie (t.j. promótor-gén-terminátor) môže byť ďalej prenesený do vybraného transformačného vektora, zahŕňajúc tie, ktoré boli opísané v tejto prihláške.
Konštitučná expresia: promótor pre aktín
Niekoľko izoforiem aktínu je vyjadrených vo väčšine typov buniek a preto aktínový promótor je dobrá voľba pre konštitučný promótor. Ryžový promótor z Actl génu bol klonovaný a charakterizovaný (McElroy et al., Plánt Celí 2: 163-171 (1990)). 1,3 kb veľký fragment promótora obsahuje všetky regulačné elementy pre expresiu v protoplastoch ryže. Rad expresných vekto106 rov založených na promótore Actl bol konštruovaný špecificky pre použitie v jednoklíčnych rastlinách McElroy et al., Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991)). Tieto vektory majú včlenené Actl intrón 1, Adhl 5-koniec lemujúcej sekvencie a Adhl intrón 1 (z kukuričného génu pre alkohol hydrogenázu) a sekvencie z CaMV 35S promótora. Vektory, ktoré vykazujú najvyššiu expresiu, vznikli fúziou 35S a Actl intrónu alebo Actl 5'-koniec lemujúcej sekvencie a Act 1 intrónu. Optimalizácia sekvencií okolo iniciačnej ATG (GUS reportný gén) tiež zvyšuje expresiu. Promótorové exprimujúce kazety opísané McElroy et al., (Mol.Gen.Genet. 231: 150-160 (1991)) môžu byť jednoducho modifikované pre expresiu APS biosyntetických génov a sú zvlášť; vhodné pre použitie v jednoklíčnych hostiteľoch. Napríklad, promótor obsahujúci fragmenty sa môže odstrániť z McElroy konštrukcií a môže sa použiť pre zámenu so zdvojeným 35S promótorom v pCGN1761ENX. Takto upravený vektor je potom vhodný pre inzerciu špecifických génových sekvencií. Týmto spôsobom konštruované spojenie génov môže byť transformované do vhodného transformačného vektora. Ryžový Actl promótor s jeho prvým intrónom riadi vysokú expresiu v kultúre buniek jačmeňa (Chibbar et al., Plánt Celí Rep. 12: 506-509 (1993)).
Konštrukčná expresia: promótor pre ubiquitín
Ubiquitín je ďalší génový produkt, ktorý sa akumuluje v mnohých typoch buniek. Jeho promótor bol klonovaný z niekoľkých špécií za účelom použitia v transgenických rastlinách (napr. slnečnica - Binet et al., Plánt Science 79: 87-94 (1991, kukurica - Christensen et al., Plánt Molec. Biol. 12: 619-632 (1989)) . Promótor kukuričného ubiquitínu bol vyvinutý v transgenických jednoklíčnych systémoch. Jeho sekvencie a vektory konštruované pre jednoklíčnu transformáciu sú priblížené v EP 0 342 926 (Lubrizol). Ďalej Taylor et al., (Plánt Celí Rep. 12: 491-495 (1993).) opisuje vektor (pAHC25) , ktorý obsahuje promótor kukuričného ubiquitínu a prvý intrón. Má jeho vysokú aktivitu v suspenzii buniek radu jednoklíčnych rastlín, do ktorých bol včlenený mikroprojektilovým ostreľovaním. Ubiquitínový promótor je vhodný pre expresiu APS biosyntetic107 kých génov v transgenických rastlinách, zvlášť jednoklíčnych. Vhodné vektory sú deriváty pAHC25 alebo akékoľvek vektory opísané v tejto aplikácii, modifikované včlenením vhodného ubiquitínového promótora a/alebo intrónových sekvencií.
Špecifická expresia v koreňoch
Preferovaným modelom expresie APS tohoto vynálezu je expresia v koreňoch. Expresia v koreňoch je zvlášť použiteľná pre kontrolu pôdnych fytopatogénov, ako sú Rhizoctonia a Pythium. Expresia APS iba v koreňových tkanivách, bez súčasnej akumulácie v okvetných tkanivách a v semenách, je výhodná pri kontrole fytopatogénov, ktoré napádajú korene. Vhodný koreňový promótor je opísaný de Framond (FEBS 290: 103-106(1991)) a tiež v publikovanej prihláške EP 0 452 269 (Ciba-Geigy). Tento promótor bol prenesený do vhodného vektora, ako je pCGN1761ENX, za účelom inzercie APS génu a potom nasleduje transfer celej kazety promótor-gén-terminátor do transformačného vektora.
Promótor indukovatelný poškodením tkaniva
Promótory indukovateľné poškodením tkaniva sú zvlášť vhodné pre expresiu APS biosyntetických génov, pretože sú aktívne nielen v momente poškodenia, ale tiež v miestach fytopatogénnej infekcie. Rad takýchto promótorov bol opísaný (napr. Xu et al., Plánt Molec. Biol. 22: 573-588 (1993), Logemann et al., Plánt Celí 1: 151-158 (1989), Rohrmeier and Lehle, Plánt
Molec. Biol. 22: 783-792 (1993), Fiker et al., Plánt Molec. Biol. 22: 129-142 (1993), Warner et al., Plánt J. 3: 191-201 (1993)) a všetky sú vhodné pre použitie v tomto vynáleze. Logemann et al. (supra) opisuje 5' upstream sekvencie wunl génu dvojklíčnych zemiakov. Xu et al. (supra) ukazuje, že poškodením indukovatelný promótor z dvojklíčnych zemiakov (pin2) je aktívny v jednoklíčnej ryži. Ďalej Rohrmeier and Lehle (supra) opisuje klonovanie kukuričnej Wipl cDNK, ktorá je poškodením indukovatelná a ktorá sa môže použiť pre izoláciu príbuzného promótora štandardným spôsobom. Podobne Fiker et al., (supra) a Warner et al. (supra) opísali poškodením indukovatelný gén z jednoklíčnej rastliny Asparágus offic.inalis, ktorý je expri108 movaný v mieste lokálneho poškodenia a v mieste patogénnej invázie. Za použitia dobre známej klonovacej metódy môžu byť tieto promótory transferované do vhodných vektorov, pripojených k APS biosyntetickým génom a používajú sa pre expresiu týchto génov v miestach fytopatogénnej infekcie.
Preferovaná expresia v dužine
Patentová prihláška WO 93/07278 (Ciba-Geigy) opisuje izoláciu kukuričného trpA génu, ktorý je prednostne vyjadrený v bunkách drene. Sú tu prezentované jeho génové sekvencie a promótor siahajúci z miesta štartu transkripcie k nukleotidu - 1726. Za použitia štandardnej molekulárnej biologickej metódy môže byť tento promótor alebo jeho časť prenesená do vektora, ako je pCGN1761, kde ja zamenený za 35S promótor a používa sa na riadenie expresie cudzích génov bunkami dužiny preferovaným spôsobom. Fragmenty obsahujúce dužinou preferovaný promótor alebo jeho časť môžu byť transformované do vektora a môžu byť modifikované pre použitie v transgenických rastlinách .
Expresia v peli
Patentová prihláška WO 93/07278 (Ciba-Geigy) ďalej opisuje izoláciu génu kukuričnej proteínovej kinázy (CDPK) závislej od vápnika, ktorá je exprimovaná v peľových bunkách. Génové sekvencie a promótor zaberá 1400 bp od štartovného miesta transkripcie. Za použitia štandardnej molekulárnej biologickej metódy, tento promótor alebo jeho časť môžu byť prenesené do vektora, ako je pCGN1761, kde môže nahradiť promótor 35S a môže sa používať pre expresiu cudzieho génu pre peľové bunky špecifickým spôsobom. Fragmenty obsahujúce pre peľ špecifický promótor alebo jeho časť môžu byť prenesené do vektora a modifikované pre použitie v transgenických rastlinách.
Expresia v listoch
Kukuričný gén kódujúci fosfoenylovú karboxylázu (PEPC)
109 opísal Hudspeth a Grula (Plánt Molec. Biol. 12: 579-589 (198 9)) . Použitím štandardných molekulárno-biologických metód, sa môže promótor uvedeného génu používať pre expresiu génov, pre bunky listov špecifickým spôsobom, v transgenických rastlinách .
Expresia cielená do chloroplastov
Chen a Jagendorf (J. Biol. Chem. 268: 2363-2367 (1993) opísali úspešné použitie chloroplastového tranzitného peptidu pre import heterológneho transgénu. Tento peptid je z rbcS génu z Nicotiana plumbaginifolia (Poulsen et al., Mo. Gen. Genet. 205: 193-200 (1986)). DNK sekvencie kódujúce tento tranzitný peptid môžu byť vystrihnuté z plazmidu prbS-8B (Poulsen et al., supra) pomocou reštrikčných enzýmov Dral a Sphl alebo Tsp5091 a Sphl a sú upravené pre použitie do konštrukcií, ktoré boli opísané predtým. Dral-Sphl fragment sa rozkladá z pozície -58 do iniciačného miesta rbcS ATG. Zahrňuje prvú aminokyselinu (tiež metionín) zrelého peptidu ihneď za importným miestom štiepenia. Tsp5091-SphI fragment zasahuje z -8 pozície do iniciačného miesta rbcS ATG a zahrňuje prvú aminokyselinu zrelého peptidu. Tieto fragmenty môžu byť vhodne umiestnené do polylinkéra vybranej kazety, čo vedie k vytvoreniu transkripčného spojenia s neprekladanou vedúcou sekvenciou zvoleného promótora (napr. 35S, PR-la, aktín, ubiquitín atď.), pritom musí dôjsť k inzercii žiadaného APS génu do správneho spojenia downstream tranzitného peptidu. Konštrukcie tohoto druhu sú rutinnou záležitosťou. Dral koniec je už zarovnaný, 5'-koniec Tsp5091 môže byť zarovnaný T4 polymerázou alebo môže byť ligovaný do polylinkéra alebo do adaptorovej sekvencie pre uľahčenie fúzie s vybraným promótorom. 3' Sphl koniec môže zostať bez úpravy alebo môže byť ligovaný k adaptoru alebo k linkéru pre zjednodušenie jeho inzercie k vybranému vektoru takou cestou, ktorá sprístupni vhodné reštrikčné miesta pre následnú inzerciu vybraného APS génu. Ideálne je, keď ATG Sphl miesto je zachované a zahrňuje prvú ATG vybraného APS génu. Chen a Jagendorf (supra) poskytujú sekvencie ideálneho štiepenia pre import do chloroplastov a v každom prípade je metionín
110 preferovaný v prvej pozícii zrelého proteínu. V nasledujúcej pozícii je viac možností a aminokyseliny nemusia byť tak kritické. V mnohých prípadoch môžu byť spojené konštrukcie hodnotené pre účinnosť importu in vitro, za použitia metód opísaných Bartlet et al. (V Edelmann et al. (Eds.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier, str. 1081-1091 (1982) ) a Wasmann et al., (Mol. Gen. Genet. 205: 446-453 (1986)). Najlepší prístup môže byť vytvorenie fúzie za použitia vybraného APS génu bez modifikácie na amino konci a iba inkorporovať modifikácie, keď je zjavné, že takáto fúzia nemôže byť importovaná do chloroplastov s vysokou účinnosťou. V tomto prípade sa môžu modifikácie uskutočniť v súlade s literatúrou (Chen and Jagendorf, supra; Wasman et al., supra; Ko and Ko, J. Biol. Chem. 267: 13910-13916 (1992)).
Preferovaný vektor je konštruovaný prenesením Dral-Sphl fragmentu, ktorý kóduje tranzitný peptid z prbcS-8B do klonovacieho vektoru pCGN1761ENX/Sph-. Tento plazmid je štiepený s EcoRI a koniec je zarovnaný T4 DNK polymerázou. Plazmid prbcS-8B je štiepený s Sphl a ligovaný do molekulárneho adaptora so sekvenciami 5'-CCAGCTGGAATTCCG-3' (SEQ ID č.: 13/5'CGGAATTCCAGCTGGCATG-3' (SEQ ID č.:14) Výsledný produkt je na 5'-konci fosforylizovaný použitím T4 kinázy. Následné štiepenie Dral reštrikčným enzýmom uvoľňuje tranzitný peptid kódujúci fragment, ktorý je ligovaný do zarovnaného konca EcoRI miesta modifikovaného vektoru vyššie opísaného. Klony orientované tak, že 5'-koniec inzertuje priľahlý k 3'-koncu promótora 35S sú identifikované sekvenovaním. Tieto klony nesú DNK spojenie 35S vedúcej sekvencie k rbcS-8A promótora-sekvencie tranzitného peptidu, ktoré idú z pozície -58, vztiahnuté na rbcS ATG, do ATG zrelého proteínu. Tieto sekvencie zahrňujú Sphl miesto a novo vzniknuté EcoRI miesto, rovnako ako existujúce Nôti a Xhol miesta pCGN1761ENX. Tento nový vektor je označený pCGN176l/CT. DNK sekvencie sú prenesené do rámca k pCGN1761/CT amplifikáciou za použitia PCR metódy a inkorporáciou Sphl, Nsphl alebo Nlall miest do amplifikovaného ATG. Potom nasleduje štiepenie príslušným enzýmom a fragment je ligovaný do pCGN176l/CT, ktorý je štiepený Sphl. Pre zjednoduše111 nie konštrukcie môže byť vyžadovaná zmena druhej aminokyseliny klonovaného génu, avšak vo väčšine prípadov použitím PCR spolu s mutagenézou riadenou do štandardných miest je možné vytvoriť konštrukciu akejkoľvek žiadanej sekvencie okolo miesta štiepenia a prvého metionín zrelého proteínu. Ďalej je možné preferované vektory konštruovať zámenou dvojitého 35S promótora pCGN1761ENX s BamHI-Sphl fragmentom prbcS-8A, ktorý obsahuje celý svetlom regulovaný rbcS-8A promótor z nukleotidu -1038 (vztiahnuté k miestu začiatku transkripcie) až do prvého metionínu zrelého proteínu. Modifikovaný pCGN1761 s rozrušeným Sphl miestom je štiepený s PstI a EcoRI a konce sú zarovnané T4 DNK polymerázou. PrbcS-8A je štiepený Sphl a ligovaný do molekulárneho adaptora, ktorého sekvencie sú opísané vyššie. Výsledný produkt je na 5'-konci fosforylovaný za použitia T4 kinázy. Následné štiepenie enzýmom BamHI uvoľní fragment nesúci promótor-tranzitný peptid. BamHI koniec fragmentu je zarovnaný T4 DNK polymerázou. Takto upravený fragment je klonovaný do pripraveného pCGN1761ENX vektora, generujúc konštrukciu obsahujúcu rbcS-8A promótor a tranzitný peptid s Sphl miestom umiestnenom v miestne štiepenia pre inzerciu heterológnych génov. Doi^nstream Sphl miesta sa vyskytujú EcoRI (znovu vytvorené miesto), Nôti a Xhol klonovacie miesta. Táto konštrukcia je označená pCGN1761rbcS/CT.
Podobné manipulácie môžu prebiehať za účelom využitia ďalšieho GS2 kódujúcich sekvencií chloroplastového tranzitného peptidu z iných zdrojov (jednoklíčne a dvojklíčne rastliny) a z iných génov. Podobné metódy sa môžu použiť na dosiahnutie cielenia do iných subbunkových častí, ako sú mitochondrie.
Príklad 38
Metódy pre izoláciu nových promótorov vhodných pre expresiu APS génov
Nové promótory sú izolované použitím štandardných molekulárnych metód zhrňujúcich ľubovoľnú metódu opísanú ďalej. Izolované promótory sú spojené s reportnými génmi, ako sú GUS
112 alebo LUC a ich expresný model v transgenických rastlinách je analyzovaný (Jefferson et al., EMBO J. 6: 3901-3907 (1987); Ow et al., Science 234: 856-859 (1986)). Promótory, ktoré ukazujú žiadaný model, sú spojené s APS génmi pre expresiu v rastlinách.
Subtraktívne cDNK klonovanie
Metódy pre subtraktívne cDNK klonovanie sú užitočné pre vytvorenie cDNK knižníc bohatých na určitú populáciu mRNK (napr. Hara et al., Nucl. Acids Res. 19: 1097-7104 (1991)). Nedávno boli opísané metódy, ktoré umožňujú konštruovať subtraktívne knižnice z malého množstva tkaniva (Sharma et al., Biotechniques 15: 610-612 (1993)). Tieto metódy sú vhodným obohatením informácií pre tkanivá, ktoré môžu byť dostupné iba v malom množstve, ako sú tkanivá priľahlé k miestam poškodenia alebo k miestam patogénnej infekcie.
Diferenciálne triedenie štandardnými plus/mínus metódami
Λ fág nesúci cDNK odvodenú od rôznych RNK populácií (korene kontra celá rastlina, stvol kontra celá rastlina, miesto lokálnej patogénnej infekcie kontra celá rastlina atď.) je kultivovaný na platni v nízkej denzite a prenesený na dve sady hybridizačných filtrov (prehľad rôznych diferenciálnych triediacich metód opisuje Calvet, Pediatr. Nephrol. 5: 751-757 (1991)) . CDNK odvodená zo zvolenej RNK populácie je hybridizovaná s prvou sadou a cDNK z RNK celej rastliny sú hybridizované s druhou sadou. Plaky, ktoré hybridizujú s prvou sondou, avšak nie s druhou, sú izolované za účelom ďalšieho skúmania. Ich cDNK sa používa pre Northen blotovanie vybranej RNK proti RNK z rôznych ďalších tkanív a iných zdrojov. Klony ukazujú, že žiadaný model expresie sa používa pre klonovanie génových sekvencií z genomickej knižnice za účelom izolácie príbuzného promótora. Medzi 500 a 5000 bp je potom klonovaný promótor pripojený k reportnému génu (napr. GUS, LUC) a znovu včlenený do transgenických rastlín pre expresnú analýzu.
113
Diferenciálne triedenie pomocou diferenciálneho zobrazenia
RNK je izolovaná z rôznych zdrojov, t.j. zvolený zdroj a celá rastlina ako kontrola, a bola podrobená diferenciálnej zobrazovacej metóde opísanej Liang a Pardee (Science 257: 967'971 (1992)) . Amplifikované fragmenty, ktoré sa objavujú v zvolenej RNK, avšak nie v kontrolnej RNK, sú purifikované z gélu a použité ako sonda na Northen bolt, ktorý nesie rôzne vzorky RNK, ako je uvedené vyššie. Fragmenty, ktoré selektívne hybridizujú k žiadanej RNK, sú klonované a používané ako sonda za účelom izolácie cDNK a tiež fragmentu genomickej DNK, z ktorého môže byť izolovaný promótor. Izolovaný promótor je spojený s GUS alebo LUC reportným génom, ako je opísané vyššie, čo je vhodné pre určenie jeho expresného modelu v transgenických rastlinách.
Izolácia promótora za použitia promótor trap metódy
Inzercia bezpromótorových reportných génov do transgenických rastlín sa môže použiť pre identifikáciu sekvencií v hostiteľskej rastline, v ktorej riadi expresiu v žiadaných bunkových typoch alebo ovplyvňujú metód opisujú Ott a Chua (1990)) a Kertbundit et al.
silu expresie. Odlišnosti týchto (Mol. Gen. Genet. 223: 169-179 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:
5212-5216 (1991)) . V štandardných transgenických pokusoch môžu byť využité rovnaké princípy pre identifikáciu elementu v hostetelskom genóme, ktorý je zodpovedný za vyššiu expresiu. Tu potom môže byť určitý transgén vyjadrený v dostatočne vysokej hladine.
Príklad 39
Transformácia dvojklíčnych rastlín
Transformačné metódy pre dvojklíčne rastliny sú dobre známe a zahrňujú metódy založené na použití Agrobacterium a metódy, pre ktoré Agrobacterium nie je nutné. Metódy bez Agrobakterium zahrňujú príjem exogénneho materiálu priamo do
114 protoplastov alebo buniek. Toto sa môže dosiahnuť PEG alebo elektroporáciou, časticovým ostreľovaním alebo mikroinjektážou. Príklady týchto metód opísal Paszkowski et al., EMBO J. 3: 2717-2722 (1984)), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199:
169-177 (1985), Reich et al., Biotechnology 4: 1001-1004 (1986) a Klein et al., Náture 327: 70-73 (1987). V každom prípade sú transformované bunky regenerované v celej rastline za použitia známych štandardných metód.
Transformácia sprostredkovaná Agrobacterium je preferovanou metódou pre transformáciu dvojklíčnych rastlín, pre jej vysokú účinnosť a širokú využiteľnosť pre rôzne špécie. Mnoho druhov plodín, ktoré sú rutinne transformovatelné pomocou Agrobacterium zahrňujú tabak, rajčiaky, slnečnicu, bavlnu, semená repky olejnej, zemiaky, sóju, ďatelinu a topoľ (EP 0 317 511 (bavlna), EP 0 249 432 (rajčiak, Calgene), WO 87/07299 (Brassica, Calgene), US 4,795,855 (topoľ). Transformácia pomocou Agrobacterium zahrňuje transfer binárnych vektorov nesúci cudziu DNK (napr. pCIB200 alebo pCIB2001), voľbu vhodného kmeňa Agrobacterium, čo závisí od komplementu vir génov, ktoré sú nesené hostiteľským kmeňom Agrobacterium buď na Ti plazmide, alebo na chromozóme (napr. kmeň pCIB200 a pCIB2001 (Uknes et al. , Plánt: Celí 5: 159-169 (1993)). Transfer rekombinantných binárnych vektorov do Agrobacterium je uskutočnený triparentálnym spojením za použitia E. coli nesúcej rekombinantný binárny vektor. Tento pomocný kmeň nesie plazmid, ako je pRK2013 a je schopný mobilizovať rekombinantný binárny vektor do cieľového kmeňa Agrobacterium. Rekombinantný binárny vektor môže byť transformovaný do Agrobacterium pomocou DNK transformácie (Hofgen and Willmitzer, Nucl. Acids Res. 16: 9877 (1988) ) .
Transformácia cieľových rastlinných druhov rekombinantným Agrobacterium obvykle zahrňuje kultiváciu Agrobacterium s vybraným rastlinným tkanivom. Transformované tkanivo, nesúce markér pre antibiotikovú alebo herbicídnu rezistenciu medzi hranicami T-DNK binárneho plazmidu, je regenerovaná na selekčnom médiu.
115
Príklad 40
Transformácia jednoklíčnych rastlín
Transformácia väčšiny jednoklíčnych druhov sa teraz stáva rutinou. Preferované metódy zahrňujú priamy transfer génu do protoplastov za použitia PEG alebo elektroporačnej metódy, a alebo do tkaniva kalusu časticovým ostreľovaním. Transformácie prebiehajú s druhmi, ktoré majú jednoduchú alebo viacnásobnú (ko-transformácia) DNK a obe tieto metódy sú vhodné pre použitie v tomto vynáleze. Kotransformácia s výhodou obchádza konštrukciu komplexných vektorov. Nevýhodou kotransformácie je nízka frekvencia integrácie izolovanej druhovej DNK do genómu (menej než 100 % (Schocher et al., Biotechnology 4: 1093-1096 (1986) ) .
Patentové prihlášky EP 0 292 435 (Ciba Geigy), EP 0 392 225 (Ciba-Geigy) a WO 93/07278 (Ciba-Geigy) opisujú metódy pre izoláciu kalusu a protoplastov z najlepšej inbrednej línie kukurice, transformáciu protoplastov za použitia PEG alebo elektroporácie a regenerácie kukuričných rastlín z transformovaných protoplastov. Gordon-Kamm et al., (Plánt Celí 2: 603618 (1990)) a Fromm et al., (Biotechnology 8: 833-839 (1990)) publikovali metódy transformácie kukuričnej línie odvodenej z A188 časticovým ostreľovaním. Prihláška WO 93/07278 (CibaGeigy) a Koziel et al. (Biotechnology 11: 194-200 (1993)) opisuje metódy pre transformáciu elitných inbredných línií kukurice časticovým ostreľovaním. Táto metóda využíva nezrelé kukuričné embryá veľkosti 1,5-2,5 mm získané z kukuričného klasu 14-15 dní po opeľovaní. PDS-lOOHe Biolistics zariadenie je vhodné zariadenie pre ostreľovanie.
Transformácia ryže môže tiež prebiehať metódou priameho transferu génu do protoplastov alebo časticovým ostreľovaním. Transformácia sprostredkovaná protoplastmi je opísaná pre ryžu typu Japonica a Indica (Zhang et al., Plánt Celí Rep. 7: 379384 (1988)); Shimamoto et al., Náture 338: 274-277 (1989);
116
Datta et al., Biotechnology 8: 736-740 (1990). Oba typy sú tiež rutinne transformovateľné časticovým ostreľovaním (Christou et al., Biotechnology 9: 957-962 (1991)).

Claims (63)

  1. Patentová prihláška EP 0 332 581 (Ciba-Geigy) opisuje metódy pre generáciu, transformáciu a regeneráciu protoplastov z Pooideae. Tieto metódy umožňujú transformáciu Dactylis a pšenice. Transformáciu pšenice opisuje Vasil et al. (Biotechnology 10: 667-674 (1992)) použitím časticového ostreľovania buniek typu C z dlhodobo regenerovateľného kalusu, ďalej Vasil et al. (Biotechnology 11: 1553-1558 (1993) a Weeks et al. (Plánt Physiol. 102: 1077-1084 (1993)) použitím časticového ostreľovania nezrelých embryí a kalusu z nezrelých embryí. Preferovanou metódou pre transformáciu pšenice je ostreľovanie nezrelých embryí, súčasťou ktorých je krok s vysokým obsahom sacharózy alebo maltózy pred vstupom génu do bunky. Pred ostreľovaním embrya (0,75-1 mm veľkých) je nanesený na platňu s MS médiom obohateným 3% sacharózou (Murashiga and Skoog, Physiologia Plantarum 15: 473-497 (1962)) a s 3 mg/l 2,4-D pre indukciu soatických embryí, ktoré sú schopné prežívať v tme. V deň ostreľovania sa embryá vyberú z indukčného média a nanesú sa na osmotikum (t.j. indukčné médium so sacharóza alebo maltózou v požadovanej koncentrácii, 15 %). Embryá po 2-3 hod. plazmolyzujú a potom sa ostreľujú. Používa sa 20 embryí na platňu, ale tento počet nie je kritický. Vhodný plazmid nesúci gén (ako je pCIB3064 alebo pSG35) je precipitovaný na mikrometrických časticiach zlata za použitia štandardných metód. Každá platňa embryí je ostreľovaná DuPont Biolistics héliovým prístrojom s detonačným tlakom ~1000 psí za použitia štandardného sita s 80 okami. Po ostreľovaní sa embryá umiestnia späť do tmy, kde zostávajú 24 hod. (stále na pôde osmotikum). Po 24 hod. sa embryá vyberú z osmotika a umiestnia späť na indukčné médium, kde zostanú asi mesiac pre regeneráciou. Približne po mesiaci sa embryové explanty s vyvinutým embryogenickým kalusom prenesú do regeneračného média (MS + 1 mg/l NAA, 5 mg(l GA), s vhodným selekčným činidlom (10 mg/l Bašta v prípade pCIB3064 a 2 mg/l metotrexátu v prípade pSOG35). Po mesiaci kultivácie sa vytvorené klíčky prenesú do väčšej steril117 nej nádoby, známej pod označením GA7, ktorá obsahuje MS polovičnej koncentrácie, 2 % sacharózu a rovnakú koncentráciu selekčného činidla. Patentová prihláška WO 94/13822 opisuje metódy pre transformáciu pšenice a je tu uvedená ako referencia.
    Príklad 41
    Expresia pyrolnitrínu v transgenických rastlinách
    Obsah GC nukleotidov je vo všetkých štyroch pyrolnitrínových ORF medzi 62 a 68 %, a preto nie je nutné predchádzať problémom z ich expresiou, ktoré vyplývajú z obsahu AT nukleotidov. Môže byť však výhodné modifikovať gény tak, že sa do nich vnesie kodón preferovaný cieľovými druhmi rastlín. Ďalej opísané spojenie, sa môže uskutočniť s ľubovoľným žiadaným promótorom s alebo bez modifikácie (napr. za účelom optimalizovanej translačnej iniciácie v rastlinách alebo zvýšenej expresie) .
    Expresia za promótorom 35S
    Každý zo štyroch pyrolnitrínových ORF je prenesený do pBluescript KS II za účelom ďalšej manipulácie. Toto sa uskutoční amplifikáciou za použitia primárov homológnych ku každému koncu každého génu a ktoré naviac zahrňujú reštrikčné miesto pre zjednodušenie prenosu amplifikovaných fragmentov do pBulescript vektora. V ORF1 má primér N-konca Sali miesto a primér C-konca má Nôti miesto. Podobne v ORF2 má N-primér Sali miesto a C-primér Nôti miesto. V ORF3 má N-primér Nôti miesto a C-primér Xhol miesto. Podobdne pre ORF4, primér na N-konci zahrňuje Nôti miesto a na C-konci má Xhol reštrikčné miesto. Potom sú amplifikované fragmenty štiepené s vhodnými reštrikčnými enzýmami (ktoré sú vybrané tak, že neštiepia v ORF) a sú ligované pBluescript, ktorý je tiež štiepený zodpovedajúcim spôsobom. Klonovanie jednotlivých ORF do pBluescript uľahčuje ich následnú manipuláciu.
    Rozrušenie vnútorných reštrikčných miest, ktoré sú nutné
    118 pre ďalšiu konštrukciu sa uskutoční pomocou inside-outside PCR (Innes et al. PCR Protocols: A quide to methods and applifications. Academic Press, New York (1990). Ak existujú na jednej alebo druhej strane reštrikčného miesta, ktoré má byť rozrušené, ďalšie reštrikčné miesta (ideálne medzi 100 a 500 bp od miesta, ktoré má byť rozrušené), prebehnú dve oddelené amplifikácie. Jedna amplifikuje DNK od reštrikčného miesta na ľavej strane miesta, ktoré má byť rozrušené, až do miesta, ktoré má byť rozrušené. Táto amplifikácia prebieha za účasti amplifikujúcich oligonukleotidov, ktoré preklenú toto miesto a inkorporujú vhodné zmenené bázy. Druhá amplifikácia prebieha od miesta rozrušenia do reštrikčného miesta na jeho pravej strane. Oligonukleotidy prekleňujúce miesto, ktoré je rozrušené, v tejto druhej reakcii inkorporujú rovnaké bázy ako v prvej reakcii. V ideálnom prípade sa vytvorí prekrytie 10 až 20 nukleotidov s nukleotidmi prvej reakcie. Potom produkty oboch reakcií majú prekrytie, ktoré má inkorporované rovnaké zmeny báz v reštrikčných miestach, korešpondujúce s tými, ktoré boli vytvorené v každej amplifikácii. Po týchto dvoch amplifikáciách sa amplifikované produkty purifikujú z gélu (účelom purifikácie je odstrániť štyri použité oligonukleotidové priméry), zmiešajú a znovu amplifikujú PCR reakciou, za použitia primérov, ktoré preklenú tieto dve reštrikčné miesta. V tejto konečnej PCR reakcii prekrytie medzi amplifikovanými fragmentmi poskytuje iniciátor nevyhnutný pre prvé kolo syntézy. Produkt týchto reakcií sa rozpína od ľavého reštrikčného miesta k pravému a uprostred leží modifikované reštrikčné miesto. Tento produkt môže byť štiepený v reštrikčných miestach a môže sa včleniť do vhodného miesta nemodifikovaného génu zámenou za fragment divokého typu.
    Na vytvorenie ORFl bez prvého z jeho dvoch vnútorných Sphl reštrikčných miest boli navrhnuté oligonukleotidy, ktoré spájajú k Xmal a AspI reštrikčné miesta a sú k nim homológne. Xmal oligonukleotid sa používa v PCR reakcii dohromady s oligonukleotidom prekleňujúcim prvé Sphl reštrikčné miesto a ktoré obsahuje sekvencie ..CCCCCTCATGC.. (dolný reťazec, EQ ID č.: 15), tak dôjde k vneseniu zmeny zásady do Sphl reštrikčné119 ho miesta. Druhá PCR reakcia využíva oligonukleotidové premostenie Sphl miesta (horný reťazec) a obsahuje sekvenciu..GCATGAGGGGG.. (SEQ ID č.16), ktoré sa používa v kombinácii s oligonukleotidovým premostením EspI miesta. Oba produkty sú purifikované z gélu, sú samostatne amplifikované s Xmai a EspI spájajúcimi nukleotidy. Výsledný fragment je štiepený s Xmai a EspI a je použitý pre zámenu za prírodný fragment v ORF1 klone. Podľa vyššie uvedeného opisu, modifikované Sphl miesto je GCATGA a nespôsobuje zmenu v kodóne. Ďalšie zmeny v tomto mieste sú možné (t.j. zámena druhého nukleotidu za G, T alebo A) bez porušenia integrity aminokyseliny.
    Podobná stratégia sa používa na porušenie druhého Sphl miesta v 0RF1. V tomto prípade EspI je vhodné reštrikčné miesto na ľavej strane a pravej strane je PstI, ktoré sa nachádza blízko 3-konca génu alebo alternatívne je možné použiť miesto SstI, ktoré sa nevyskytuje v ORF, ale hneď vedľa v polylinkéri pBluescriptu. V tomto prípade je vhodný nukleotid ten, ktorý prekleňuje toto miesto alebo alternatívne jeden z dostupných sekvenčných primérov pBluescriptu. Toto Sphl miesto je modifikované na GAATGC alebo GCATGT alebo GAATGT. Každá z týchto zmien rozrušuje miesto bez zmien v kodóne.
    Pre vytvorenie 0RF2 bez jedného Sphl miesta sa používa rovnaký protokol. PstI alebo Mlul sú miesta na ľavej strane a Sst miesto v pBluescript polylinkéra je vhodné pravostranné miesto. V tomto prípade je miesto zmenené na GCTTGC, GCATGC alebo GCTTGT; tieto zmeny neporušujú integritu aminokyselín.
    0RF3 nemá vnútorné Sphl miesta.
    V prípade 0R44 poskytuje PstI vhodné pravostranné miesto, ale neexistuje tu vhodné miesto na ľavej strane Sphl miesta, ktoré by mohlo byť zmenené. V tomto prípade sa môže použiť reštrikčné miesto v pBluescript polylinkéri s rovnakým účinkom, ako už bolo opísané. Sphl miesto je modifikované na GGATGC, GTATGC, GAATGC alebo GCATGT atď.
    120
    Odstránenie Sphl miest z pyrolnitrín biosyntetických génov, ako je uvedené vyššie, zjednodušuje ich transfer amplifikáciou do pCGN1761SENX vektora za použitia priméru N-konca, ktorý nesie Aphl miesto v ATG a priméru C-konca, ktorý nesie reštrikčné miesto neexistujúce v géne, ktorý je amplifikovaný. Výsledný amplifikovaný fragment je štiepený Sphl v sekvencií C-konca a potom je klonovaný do pCGN1761SENX. Vhodné reštrikčné miesta pre inkorporáciu do priméru C-konca sú Nôti (pre všetky štyri ORF) Xhol (pre ORF3 a ORF4) a EcoRI (pre ORF4). Je daná požiadavka na C nukleotid v pozícii 6 v Sphl reštrikčnom mieste, v niektorých prípadoch druhý kodón ORF môže vyžadovať také zmeny, že musí začínať s nukleotidom C. Táto konštrukcia spája každý ORF v jeho ATG s Sphl miestami vektora pCGN1761SENX, ktorý je optimalizovaný pre transláciu, do operabilného spojenia k dvojitému promótoru 35S. Po vytvorení konštrukcie sú konečné inzercie génov a body spojení znovu sekvenované za účelom uistenia, že nedošlo k nežiadúcim zámenám báz.
    Využitím oligonukleotidových primárov N-konca, ktoré nesú Ncol reštrikčné miesto v jeho ATG namiesto Sphl reštrikčného miesta, ORF 1-4 môžu byť jednoducho klonované do vektora pCGN1761NENX, ktorý je optimalizovaný pre transláciu. Žiadny zo štyroch ORF pre biosyntézu pyrolnitrínu nenesie Ncol reštrikčné miesto a preto v tomto prípade nie je požiadavka na rozrušenie vnútorných reštrikčných miest. Priméry pre C-koniec génu sú navrhnuté rovnako, ako už bolo uvedené i klonovanie prebieha rovnakým spôsobom. Je daná požiadavka na G nukleotid v pozícii 6 v Ncol reštrikčnom mieste, v niektorých prípadoch druhý kodón ORF môže vyžadovať také zmeny, že musí začínať s nukleotidom G. Táto konštrukcia spája každý ORF v jeho ATG v Ncol mieste vektora pCGN1761NENX do operabilného spojenia so zdvojeným promótorom 35S.
    Kazety pre expresiu vhodného vektora derivovaného z pCGN1761 sú transformované do transformačného vektora. Ak je možné vytvoriť viacnásobné kazety pre expresiu, tie sú potom prenesené do jedného transformačného vektora a tak sa redukuje
    121 počet transformácií do rastlín a krížení transformantov, ktoré sú nutné pre expresiu všetkých štyroch ORF v rastlinách, čo vedie k produkcii pyrolnitrínu.
    Expresia za promótorom 35S s cielením do chloroplastov
    Pyrolnitrínové ORF 1-4 amplifikované za použitia oligonukleotidov nesúcich Sphl miesto na jeho N-konci sú klonované do chloroplastov cieleného vektora pCGN176l/CT. Fúzie sú vytvorené v Sphl mieste umiestnenom v mieste štiepenia rbcS tranzitného peptidu. Takto konštruované expresné kazety sú prenesené do vhodných transformačných vektorov a používajú sa pre vytvorenie transgenických rastlín. Vzhľadom na to, že tryptofán, prekurzor pre biosyntézu pyrolnitrínu, je syntetizovaný v chloroplastoch, je výhodné exprimovať biosyntetické gény pre pyrolnitrín v chloroplastoch, čím je zaručený dostatok substrátu. Transgenické rastliny exprimujúce všetky štyri ORF budú smerovať všetky štyri génové produkty do chloroplastov a budú potom syntetizovať pyrolnitrín v chloroplastoch.
    Expresia za rbcS s cielením do chloroplastov
    Pyrolnitrínové ORF 1-4 amplifikované za použitia oligonukleotidov nesúcich Sphl miesto v ich N-koncoch sú klonované do chloroplastov cieleného vektora pCGN1761rbcS/CT. Fúzie sú vytvorené v Sphl mieste, ktoré je lokalizované v mieste štiepenia rbcS tranzitného peptidu. Takto vzniknuté expresné kazety sú prenesené do vhodných transformačných vektorov a sú použité pre vytvorenie transgenických rastlín. Vzhľadom na to, že tryptofán, prekurzor pre biosyntézu pyrolnitrínu, je syntetizovaný v chloroplastoch, je výhodné experimovať biosyntetické gény pre pyrolnitrín v chloroplastoch, čím je zaručený dostatok substrátu. Transgenické rastliny exprimujúce všetky štyri ORF budú smerovať všetky štyri génové produkty do chloroplastov a budú potom syntetizovať pyrolnitrín v chloroplastoch. Expresia štyroch ORF je však indukovatelná svetlom.
    Príklad 42
    122
    Expresia soraphenu v transgenických rastlinách
    Kloň p98/l obsahuje celý ORF1 pre soraphen, ktorý kóduje päť biosyntetických modulov pre biosyntézu soraphenu. Čiastočne sekvenovaný ORF2 obsahuje zvyšné tri moduly a ďalší modul pre soraphenovú metylázu je umiestnený na rovnakom operóne.
    ORF1 pre soraphen je geneticky manipulovaný za účelom expresie v transgenických rastlinách nasledujúcim spôsobom. DNK fragment je amplifikovaný z N-konca ORF1 za použitia p98/l ako templátu. Oligonukleotidový primér 5'-konca zahrňuje buď Sphl, alebo Ncol reštrikčné miesto v ATG, vhodné pre klonovanie do vektorov pCGN1761SENX alebo pCGNNENX. Ďalej oligonukleotid 5'-konca zahrňuje buď bázu C (pre klonovanie v Sphl mieste), alebo bázu G (pre klonovanie v Ncol mieste) umiestnené hneď za ATG.' Druhá aminokyselina proteínu je zamenená za histidín alebo aspartát (ďalšie aminokyseliny môžu byť vybrané na druhú pozíciu pomocou dodatočnej zmeny ďalších báz v druhom kodóne). Oligonukleotid 3'-konca, vhodný pre amplifikáciu, je umiestnený v prvnom BglOO mieste ORF a nesie distálne EcoRI miesto, ktoré umožňuje, že amplifikovaný fragment je štiepený s Sphl (alebo Ncol) a EcoRI a potom je klonovaný do pCGN1761SENX (alebo pCGN1761NENX). Pre zjednodušenie štiepenia amplifikovaných fragmentov, každý oligonukleotid zahrňuje niekoľko prídavných báz na jeho 5'-konci. Oligonukleotidy majú 12-30 bp homológnych k 0RF1 templátu. Táto manipulácia spája ~112 aminokyselín N-konca ORFl v jeho ATG, v Sphl alebo Ncol miestach vektorov pCGN1761SENX alebo pCGN1761NENX, ktoré sú optímalizované pre transláciu, so zdvojeným promótorom 35S. Zvyšok ORFl je nesený na BglII fragmente, ktorý môže byť následne klonovaný do BglII miesta vyššie opísanej konštrukcie. Začlenenie týchto dvoch fragmentov nie je problémom, vyžaduje iba štiepenie konštrukcie N-konca s BglII enzýmom nasledované inzerciou prvého z týchto fragmentov. Pre začlenenie dvoch zvyšných fragmentov je nutné čiastočné štiepenie konštrukcie N-konca (táto konštrukcia teraz má naviac BglII miesto), nasledované vnesením ďalšieho BglII fragmentu. Týmto spôsobom je možné
    123 vytvoriť vektor obsahujúci celý ~25 kb vel'ký ORF1 pre soraphen v operabilnej fúzii s promótorom 35S. Alternatívny prístup ku konštrukcii 0RF1 pre soraphen fúziu sekvenčných reštrikčných fragmentov je amplifikácia celého ORF za použitia PCR. Barnes (Proc. Natl. Acad. Sci USA 91: 2216-2220 (1994)) opisuje metódy pre veľmi presnú PCR amplifikáciu fragmentov do veľkosti 35 kb. Táto metóda môže byť aplikovaná na ORF1. Oligonukleotidy špecifické pre každý koniec ORF1, s pridanými vhodnými reštrikčnými miestami, sa používajú pre amplifikáciu celej kódujúcej oblasti, ktorá je potom klonovaná do vhodných miest vektora, ako je pCGN1761 alebo jeho derivátov. Po PCR amplifikácii sa odporúča opakovanie sekvenácie na potvrdenie, že nedošlo k zámene báz amplifikovaných sekvencií. V inom prípade test funkčnosti sa môže uskutočniť priamo v transgenických rastlinách.
    Ďalší prístup pre expresiu génov pre biosyntézu polyketidov (takých ako je soraphen) v transgenických rastlinách je konštrukcia transkripčných jednotiek, ktoré obsahujú menej modulov než je obvyklé a poskytujú zvyšné moduly na ďalších transkripčných jednotkách. Teória hovorí, že biosyntéza polyketidových antibiotík, ako je soraphen, je proces, ktorý vyžaduje sekvenčnú aktivitu špecifických modulov a že pre syntézu špecifických molekúl, ktoré majú tieto aktivity, by mali existovať špecifické sekvencie. Je pravdepodobné, že expresia rôznych transgénov v rastlinách nesúcich rôzne moduly môžu viesť k biosyntéze nových polyketidových molekúl, pretože sekvenčná enzymatická prirodzenosť génov divokého typu je určená ich konfiguráciou v jednoduchej molekule. Predpokladá sa, že lokalizácia piatich špecifických modulov pre biosyntézu soraphenu na ORF1 je vymedzujúca v biosyntéze soraphenu a že expresia dajme tomu troch modulov a jednom transgéne a ďalších dvoch na inom transgéne, spolu s ORF2, môže viesť k biopsyntéze polyketidu odlišnej molekulárnej štruktúry a možno s odlišnou antipatogénnou aktivitou. Tento vynález kladie dôraz na všetky tieto výnimky v expresii modulov, ktoré môžu viesť k syntéze nových polyketidov v transgenických organizmoch.
    124
    Napriek tomu, že špecifické konštrukčné detaily sú poskytnuté iba pre ORF1, podobné metódy sa používajú pre expresiu ORF2 a soraphenovej metylázy v transgenických rastlinách. Aby došlo k expresii funkčného soraphenu v rastlinách, musí byť splnená podmienka, že všetky tri gény sú vyjadrené a to je opísané v detailoch v tejto špecifikácii.
    Fúzie tohoto druhu, opísané vyššie, môžu byť vytvorené s ľubovoľným žiadaným promótorom s alebo bez modifikácie (napr. za účelom optimalizovanej translačnej iniciácie v rastlinách alebo na zvýšenie expresie). Zistilo sa, že ORF pre biosyntézu soraphenu majú okolo 70 % GC a nie je vylúčené, že kódujúce sekvencie musia byť modifikované v zmysle zvýšenia obsahu GC za účelom optimálnej expresie v rastlinách. Je výhodné zahrnúť do génu kodón, ktorý je preferovaný príslušnou cieľovou rastlinou .
    Príklad 43
    Expresia fenazínu v transgenických rastlinách
    Obsah GC všetkých klonovaných génov kódujúcich biosyntetické enzýmy pre syntézu fenazínu je medzi 58 a 65 % a preto sa nemusia riešiť problémy expresie v rastlinách, spojené s obsahom AT (i keď môže byť výhodné zahrnúť do génov kodóny, ktoré sú preferované príslušnou cieľovou rastlinou). Fúzie tohoto druhu, opísané ďalej, môžu byť vytvorené s ľubovoľným žiadaným promótorom s alebo bez modifikácie (napr. za účelom optimalizovanej translačnej expresie).
    Expresia za 35S promótorom
    Za účelom ďalšej génovej manipulácie je každý z troch ORF pre fenazín prenesený do pBluescript SK II. phzB ORF je prenesený ako EcoRI-BglII fragment klonovaný z plazmidu pLSP186H3del3 obsahujúci celý fenazínový operón. Tento fragment je včlenený do EcoRI-BamHI miest pBluescriptu SK II. phzC ORF je prenesený z pLSP18-6H3del3 ako Xhol-Scal fragment klonovaný do
    125
    Xhol-Smal miest pBluescript II SK. phzD ORF je prenesený z pLSP18-6H3del3 ako BglII-HindlII fragment do BamHI-HindlII miest Bluescript II SK.
    Rozrušenie vnútorných interných miest, ktoré sú nutné pre ďalšiu konštrukciu, sa uskutočňuje za použitia metódy insideoutside PCR opísanej skôr (Innes et al., PCR Protocols: A quide to methods and applications. Academic Press, New York (1990) . V prípade phzB ORF dve Sphl miesta sú rozrušené (jedno miesto je lokalizované upstream ORF. Prvé je rozrušené použitím reštrikčných miest EcoRI (ľavé miesto Sphl je rozrušené) a BclO (pravé Sph miesto). Aby táto manipulácia prebehla úspešne, DNK je štiepená Bell pre konečné zostavenie insideoutside PCR, produkt musí byť produkovaný v dam-mínus E. coli, ako je SCS110 (Strategene). Pre druhé phzB Sphl miesta sú vybrané unikátne reštrikčné miesta PstI a Spel, ktoré sú na druhej strane phzB ORF v polylinkéri pBluescript. phzC ORF nemá interné Sphl miesta. phzD ORF má však jediné miesto, ktoré môže byť odstránené použitím unikátnych reštrikčných miest Xmal a HindlI (Xmal/Smal miesto polylinkéru pBluescriptu sa nepodieľa na inzercii ORF medzi BamHI a HindlI miesta).
    Odstránenie Sphl miest z fenazínových biosyntetických génov, ako bolo opísané, uľahčuje ich transfer do pCGN1761SENX vektora amplifikáciou za použitia oligonukleotidového priméru N-konca, ktorý nesie Sphl miesto v ATG a priméru C-konca, ktorý nesie reštrikčné miesto nevyskytujúce sa v géne, ktorý je amplifikovaný. Výsledný amplifikovaný fragment je štiepený Sphl reštriktázou v sekvencií C-konca a je klonovaný do pCGN1761SENX. Vhodné miesta pre inkorporáciu do priméru C-konca sú EcoRI a Nôti (platí pre všetky tri ORF; pri Nôti treba urobiť kontrolu po kompletácii sekvencie) a Xhol (pre phzB a phzD). Je daná požiadavka na C nukleotid v pozícii 6 v Sphl reštrikčnom mieste, v niektorých prípadoch druhý kodón ORF môže vyžadovať také zmeny, že musí začínať s nukleotidom C. Táto konštrukcia pripája každý ORF v jeho ATG v Sphl mieste vektora pCGN1761SENX, ktorý je optimalizovaný pre transláciu, do operabilného spojenia k dvojitému promótoru 35S. Po
    126 vytvorení konštrukcie sú inzert a body spojenia znovu sekvenované za účelom potvrdenia, že nedošlo k nežiadúcim zámenám báz .
    Použitím oligonukleotidového priméru N-konca, ktorý nesie Ncol miesto v jeho ATG miesto Sphl miesta,· tri phz ORF môžu byť tiež jednoducho klonované do vektora pCGN1761NENX optimalizovaného pre transláciu. Žiadny z troch fenazín biosyntetických ORF nenesie Ncol miesto, a preto v tomto prípade nemusia byť porušené vnútorné reštrikčné miesta. Sú navrhnuté priméry pre C-konce génu, ako je uvedené vyššie, a klonovanie prebieha rovnakým spôsobom. G nukleotid je nutný v pozícii 6 v Ncol reštrikčnom mieste, v niektorých prípadoch druhý kodón ORF môže vyžadovať takú zmenu, že musí začínať s nukleotidom G. Táto konštrukcia spája každý ORF v jeho ATG s Ncol miestami vektora pCGN1761NENX, ktorý je optimalizovaný pre transláciu, do operabilného spojenia s dvojitým promótorom 35S.
    Exprimovateľné kazety vhodného vektora, ktorý je derivovaný z pCGN1761, sú prenesené do transformačných vektorov. V prípade, že je možné vytvoriť viacnásobné kazety, tie sú potom prenesené do jedného transformačného vektora a tak sa redukuje počet transformácií do rastlín a krížení transformantov, ktoré sú nutné pre expresiu všetkých štyroch ORF v rastlinách, čo vedie k produkcii fenazínu.
    Expresia za promótorom 35S s cielením do chloroplastov'
    Tri ORF pre fenazín, amplifikované za použitia oligonukleotidov, nesúce Sphl miesto na jeho N-konci, sú klonované do chloroplastov cieleného vektora pCGN1761/CT. Fúzie sú vytvorené v Shpl mieste lokalizovanom v mieste štiepenia rbcS tranzitného peptidu. Takto konštruované kazety pre expresiu sú prenesené do vhodných transformačných vektorov a používajú sa na vytvorenie trangenických rastlín. Vzhľadom na to, že chorizmat, prekurzor pre biosyntézu fenazínu, je syntetizovaný v chloroplastoch, je výhodné exprimovať biosyntetické gény pre fenazín v chloroplastoch, čim je zaručený dostatok substrátu.
    127
    Transgenické rastliny exprimujúce všetky štyri ORF budú smerovať všetky štyri génové produkty do chloroplastov a budú potom syntetizovať fenazín v chloroplastoch.
    Expresia za rbcS s cielením do chloroplastov
    Tri fenazínové ORF, amplifikované za použitia oligonukleotidov, nesúce Sphl miesto v ich N-koncoch, sú klonované do chloroplastov cieleného vektora pCGN1761rbcS/CT. Fúzie sú vytvorené v Sphl mieste, ktoré je lokalizované v mieste štiepenia rbcS tranzitného peptidu. Takto vzniknuté kazety pre expresiu sú prenesené do vhodných transformačných vektorov a použité na vytvorenie transgenických rastlín. Vzhľadom na to, že chorizmat, prekurzor pre biosyntézu fenazínu, je syntetizovaný v chloroplastoch, je výhodné exprimovať biosyntetické gény pre fenazín v chloroplastoch, čím je zaručený dostatok substrátu. Transgenické rastliny exprimujúce všetky štyri ORF budú smerovať všetky štyri génové produkty do chloroplastov a budú potom syntetizovať fenazín v chloroplastoch. Expresia štyroch ORF je však indukovateľná svetlom.
    Príklad 44
    Expresia peptidového antibiotika gramicidínu bez účasti ribozómov v transgenických rastlinách
    Tri biosyntetické gény pre gramicidín grsA, grsB a grsT z Bacillus brevis boli klonované a sekvenované (Turgay et al., Mol. Microbiol. 6: 529-546 (1992); Kraetzschmar et al., J.
    Bacteriol. 171: 5422-5429 (1989)). Ich dĺžky sú 3296, 13358 a 770 bp. Tieto sekvencie sú publikované v GenBank pod prístupovými číslami X61658 a M29703. Tu opísané génové manipulácie sa uskutočnili použitím klonov dostupných verejnosti, ktoré opísal Turgay et al., (supra) a Kraetyschmar et al., (supra) alebo alternatáívnym spôsobom z novo izolovaných klonov z Bacillus brevis, ako je opísané v tejto prihláške.
    Každý z troch ORF grsA, grsB a grsT je amplifikovaný PCR
    128 za použitia oligonukleotidov, ktoré prekrývajú celú kódujúcu sekvenciu. Do ľava smerované nukleotidy (upstream) zahrňujú SstI miesto a do prava smerované nukleotidy (downstream) zahrňujú Xhol miesto. Tieto reštrikčné miesta sa v žiadnej z troch kódujúcich sekvencií nenachádzajú a umožňujú štiepenie amplifikovaného produktu s SstI a Xhol enzýmami, za účelom inzercie do korešpondujúcich miest pBluescriptu IISK. Týmto spôsobom sa vytvárajú klony pBL-GRSa, pBLGRSb a pBLGRSt. Obsah GC v týchto génoch je medzi 35 a 38 %. V ideálnom prípade môžu byť kódujúce sekvencie pre tri gény znovu vytvorené použitím metód uvedených v sekcii K, je však možné, že nemodifikované gény môžu byť vyjadrené vo vysokej miere v transgenických rastlinách bez problémov, ktoré sú spojené s obsahom AT. V každom prípade môže byť výhodné zahrnúť do génov kodón, ktorý je preferovaný príslušnými cieľovými rastlinami. ORF grsA neobsahuje žiadne Sphl miesto a žiadne Ncol miesto. Tento gén potom môže byť amplifikovaný z pBLGSRa za použitia oligonukleotidu N-konca, ktorý nesie Sphl miesto alebo Ncol miesto v ATG, a druhého oligonukleotidu C-konca, ktorý nesie Xhol miesto, čo umožňuje, že amplifikovaný produkt môže byť klonovaný priamo do pCGN1761SENX alebo pCGN1761NENX za zdvojený promótor 35S.
    ORF grsB neobsahuje žiadne Ncol miesto a preto tento gén môže byť amplifikovaný použitím oligonukleotidu N-konca, ktorý nesie Ncol miesto, rovnakým spôsobom, ako už bolo uvedené, pre grsA ORF; amplifikovaný fragment je štiepený Ncol a Xhol a ligovaný do pCGN1761NENX. Avšak grsB ORF obsahuje tri Sphl miesta a tieto sú rozrušené za účelom zjednodušenia následného klonovania. Miesta sú rozrušené použitím inside-outside PCR metódy. Jedinečné klonovacie miesta, ktoré boli nájdené v grsB géne, ale nie v pBluescript II SK, sú EcoNl, PflMl a RsrII. Buď EcoNl alebo PflMl sa môžu použiť spolu s RsrII na odstránenie prvých dvoch miest a RsrII sa môže použiť spolu s Apal z pBluescript polylinkéra na odstránenie tretieho miesta. Po odstránení týchto miest (bez zmeny v aminokyseline) môže byť celok grsB ORF amplifikovaný za použitia oligonukleotidu N-konca s Sphl miesta v ATG a oligonukleotidu C-konca, ktorý má Xhol miesto. Výsledný fragment je klonovaný do
    129 pCGN1761SENX. Pre úspešnú PCR amplifikáciu fragmentov tejto veľkosti je protokol amplifikácie modifikovaný podľa Barnes (1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2216-2220 (1994)), ktorý opisuje vysokú presnosť amplifikácie veľkých DNK fragmentov. Alternatívny prístup k transferu grsB ORF do pCGN1761SENX bez nutnosti rozrušenia troch Sphl reštrikčných miest zahrňuje transfer fragmentu N-konca grsB do Sphl a Xhol klonovacích miest pCGN1761SENX. Tento transfer je uskutočnený amplifikáciou z ATG génu za použitia oligonukleotidu N-konca, ktorý nesie Sphl miesto v ATG a druhého oligonukleotidu, ktorý je priľahlý, a 3'-konca PflMl miesta v ORF, ktorý zahrňuje Xhol miesto. Potom N-koniec amplifikovaného fragmentu je štiepený Sphl a Xhol a klonovaný do pCGN1761SENX. Nasleduje vystrihnutie zvyšnej časti grsB génu z pBLGRSb za použitia PflMl a Xhol (ktorý štiepi polylinkér pBluescript) a klonovanie do N-konca nesúce konštrukciu štiepenú s PflMl a Xhol a dochádza k rekonštitúcii génu.
    ORF grsT neobsahuje žiadne Sphl ani Ncol miesta. Tento gén potom môže byť amplifikovaný z pBLGSRt za použitia oligonukleotidu N-konca, ktorý nesie buď Sphl miesto, alebo Ncol miesto v iniciačnom kodóne, ktorý je zmenený na ATG (z GTG) z dôvodu expresie v rastlinách a druhého oligonukleotidu C-konca, ktorý nesie Xhol miesto. Takto amplifikovaný produkt je možné priamo klonovať do pCGN1761SENX alebo do pCGN1761NENX za zdvojený promótor 35S.
    G nukleotid je nutný v pozícii 6 v Ncol reštrikčnom mieste, v niektorých prípadoch druhý kodón ORF môže vyžadovať takú zmenu, že musí začínať s príslušným nukleotidom.
    Existujú transgenické rastliny, ktoré exprimujú všetky tri biosyntetické gény pre gramicidín, ako bude opísané ďalej. Transgenické rastliny exprimujúce všetky tri gény syntetizujú gramicidín.
    Príklad 45
    130
    Expresia ribozomálne syntetizovaného peptidového lantibiotika epidermínu v transgenických rastlinách epiA ORF kóduje štrukturálnu jednotku pre biosyntézu epidermínu, ktorá je približne 420 bp dlhá (GenBank prístupové číslo XO7840; Schnell et al., Natura 333: 276-278 (1988)). Tento gén môže byť subklonovaný pomocou PCR metódy z plazmidu pTu32 do pBluescript SK II. Ďalej sú použité nukleotidy nesúce koncové reštrikčné miesta BamHI (5'-koniec) a PstI (3'- koniec) . epiA génové sekvencie majú obsah GC 27% a ten môže byť zvýšený použitím metódy referovanej na inom mieste tejto špecifikácie; modifikácia tejto sekvencie nemusí byť podstatná, avšak zabezpečuje vysokú hladinu expresie v rastlinách. Nasleduje epiA ORF transformácia do klonovacieho vektora pCGN1761SENX alebo do pCGN1761NENX PCR amplifikáciou génu. Pri tejto amplifikácii je použitý oligonukleotid N-konca, ktorý premosťuje iniciačný metionín a nesie Sphl miesto (pre klonovanie do pCGN1761SENX) alebo Ncol miesto (pre klonovanie do pCGN1761NENX), spolu s nukleotidom C-konca nesúcej EcoRI, Nôti alebo Xhol miesta pre klonovanie do pCGN1761SENX alebo pCGN1761NENX. Je daná požiadavka na nukleotid C v pozícii 6 v Sphl reštrikčnom mieste, v niektorých prípadoch druhý kodón ORF môže vyžadovať takú zmenu, že musí začínať príslušným nukleotidom.
    Použitím tejto metódy sú zvyšné gény epi operónu (viď epiB, epiC, epiD, epiQ a epiP) subklonované z plazmidu pTu32 do pBluescript SK II. Tieto gény sú zodpovedné za modifikáciu a polymerizáciu epiA kódovanú štrukturálnu jednotku a sú opísané v (Kupke et al., J. Bacteriol. 174: 5354-5361 (1992)); Schnell et al. , European J. of Biochemistry 204: 57-68 (1992)) . Subklonované ORF sú geneticky manipulované za účelom transferu do vektora derivovaného z pCGN1761, ako je uvedené vyššie. Exprimovateľné kazety príslušných vektorov derivovaných z pCGN1761 sú prenesené do transformačných vektorov. V prípade, že je možné vytvoriť viacnásobné kazety pre expresiu, tie sú potom prenesené do jedného transformačného vektora a tak sa redukuje počet transformácií do rastlín a krížení
    131 transformantov, ktoré sú nutné pre expresiu všetkých ORF v rastlinách a teda pre redukciu epidermínu.
    L. Analýza transgenických rastlín pre akumuláciu APS
    Príklad 46
    Analýza expresie génov APS
    Expresia génov APS v transgenických rastlinách môže byť analyzovaná použitím štandardnej metódy Northen blot na určenie množstva APS mRNK akumulovanej v tkanivách. V inom prípade môže byť množstvo produktov APS génov tiež odhadnuté Western analýzou za použitia antiséra proti APS biosyntetickým produktom. Antiséra môžu byť vyvinuté konvenčnými metódami a pomocou proteínov odvodených z expresie APS génov v hostiteľovi, ako je E. coli. Za účelom zabránenia vzniku antiséra k rozmanitým génovým produktom z E. coli, v ktorých je vyjadrených viac APS génov z viacerých ORF operónov, APS biosyntetické gény môžu byť potom vyjadrené jednotlivo v byť pripravené proti syntetickým tak, že majú homológiu alebo sú rovnaké so známymi APS biosyntetickými sekvenciami aminokyselín.
    E. coli. Ďalej antiséra môžu peptidom, ktoré sú navrhnuté
    Príklad 47
    Analýza produkcie APS v transgenických rastlinách
    Detekcia produkcie APS v tkanivách transgenických rastlín sa uskutočňuje podľa známych protokolov. Tieto protokoly sú dostupné v príslušnej literatúre, týkajúcej sa APS. Metóda opísaná v príklade 11 sa používa pre pyrolnitrín. Pre soraphen sa používa metóda opísaná v príklade 17. Na určenie fenazínu sa používa metóda opísaná v príklade 18. Pri peptidových antibiotikách syntetizovaných bez účasti ribozómov, ako je gramicidín S sa používa príslušná všeobecná metóda testovania ATP-PPj_ zmien. V prípade gramicidínu je testovaný grsA gén metódou zámeny ATP-PPj_ závislej od fenylalanínu a grsB gén metó132 dou zámeny ATP-PPj_ závislej od prolínu, valínu, ornitínu alebo leucínu. Alternatívne metódy sú opísané Gause a Brazhnikova (Lancet 247: 715 (1994)). Ribozomálne syntetizované peptidové antibiotiká sú izolované butanolovou extrakciou, sú rozpustené v metanole a dietylétere a analyzované chromatografiou, ako opisuje Allgaier et al., pre epidermín (Eur. Ju. Biochem. 160: 9-22 (1986)). Pre rad APS (napr. pyrolnitrín, gramicidin, fenazín) sú príslušné metódy opísané v Merck Indexe (Merck and Co., Rahway, NJ (1989)).
    M. Test odolnosti transgenických rastlín proti chorobám
    Transgenické rastliny exprimujúce APS biosyntetické gény sú testované na rezistenciu voči fytopatogénom. Pri testovaní rastlín na odolnosť, proti foliárnym patogénom, sú rastliny pestované v skleníku do dosiahnutia príslušného štádia vývoja a potom je nanesené príslušným spôsobom inokulum fytopatogénu. Pri pôdnych patogénoch je patogén vnesený do pôdy pred alebo v dobe, kedy sa vysievajú semená. Druh rastliny zvolenej pre transfer génov sa musí brať do úvahy pri posudzovaní relatívnej fytopatogénnej senzitivity. Preferujú sa kultivary, ktoré sú citlivé na väčšinu patogénov a umožňujú určenie zvýšenej rezistencie.
    Test rezistencie na foliárne fytopatogény
    Príklad 48
    Odolnosť, voči chorobám spôsobeným tabakovými foliárnymi fytopatogénmi
    Transgenické rastliny tabaku exprimujúce APS gény a produkujúce APS látky boli testované nasledujúcimi testami.
    Phytophthora parasitica
    Test na rezistenciu voči Phytophthora parasitica sa ušku133 točňuje s rastlinami, ktoré sú staré šesť týždňov a sú pestované podl'a opisu v Alexandr et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7327-7331. Rastliny sú zaliate, dobre odvodnené a potom inokulované aplikáciou 10 ml suspenzie sporangia (300 sporangia/ml) do pôdy. Inokulované rastliny rastú v skleníku pri dennej teplote 23-25 °C a nočnej teplote 20-22 °C. Index vädnutia je nasledovný: 0 = žiadne symptómy, 1 = niektoré známky vädnutia s regulovanou turgidnosťou, 2 = jasné symptómy vädnutia, ale nie hnitia alebo zakrnutia, 3 = jasné symptómy zakrnutia, ale nie zjavné hnitie stvolu, 4 = silné vädnutie so zjavným hnitím stonky a poškodením koreňového systému, 5 = rovnako ako u, ale rastliny sú blízko úhynu alebo vyhynuli, silná redukcia koreňového systému. Všetky testy sú hodnotené vzhľadom na slepý pokus.
    Pseudomonas syringea
    Pseudomonas syringea pv. tabaci (kmeň č. 551) injektovaný do dvoch nižších listov 6-7 týždňov starých v koncentrácii 10 alebo 3x10 v ml vody. Sest jednotlivých rastlín sa použije pre daný čas. Rastliny infikované Pseudomonas tabaci sú zaradené do piatich skupín podľa vážnosti poškodenia, 5=100 % mŕtve tkanivo, 0=žiadne symptómy. Hodnotenie T-test (LSD) sa robí pre každý deň a zaradenie do skupiny je určené po stanovení strednej hodnoty choroby. Hodnoty nasledované rovnakým stupňom pri ďalšom hodnotení nie sú štatisticky odlišné.
    Cercospora nicotianae
    Suspenzia spór Cercospora nicotianae (ATCC #18366) (100 000-150 000 spór/ml) je rozprášená na povrch listov. Rastliny sú pestované v 100 % vlhkosti počas piatich dní. Potom sa rastliny rosia vodou 5-10-krát denne. Šesť jednotlivých rastlín sa hodnotí za určitú časovú jednotku. Cercospora nicotianae je posudzovaná podľa % plochy listov, ktoré vykazujú symptómy choroby. Hodnotenie T-test (LSD) sa robí pre každý deň a zaradenie do skupiny je určené po stanovení strednej hodnoty choroby. Hodnoty nasledované rovnakým stupňom pri ďal134 šom hodnotení nie sú štatisticky odlišné.
    Štatistická analýza
    Všetky testy zahrňujú i netransgenické rastliny (šesť rastlín pre jeden test, alebo rovnaký kultivar ako transgenické línie) (Alexandr et al., Pro. Natl. Acad. Asi. USA 90: 7327-7331) . Párový spôsob T-testov sa uskutočňuje za účelom porovnania rôznych genotypov.
    Test rezistencie na pôdne fytopatogény
    Príklad 49
    Rezistencia na Rhizoctonia solani
    Testy na určenie rezistencie voči Rhizoctonia solani sa uskutočňujú zasiatím semien alebo výsadbou semenáčov do prirodzenej alebo umelo zamorenej pôdy. Pre vytvorenie umelo zamorenej pôdy sa proso, ryža, ovos alebo iné podobné semená navlhčia vodou, potom sú autoklávované a inokulované hubovým fytopatogénom z platne. Keď sú semená úplne prerastené fytopatogénom, sušia sa na vzduchu a a rozmelnia sa na prášok. Prášok sa zmieša s pôdou v pokusne určenom pomere vzhľadom, ktorý je nutný na vyvolanie choroby. Choroba sa hodnotí porovnaním počtu stojacich jedincov, pomerom lézií koreňov, a váhou pukov alebo koreňov transgenických alebo netransgenických rastlín rastúcich v zamorenej pôde. Hodnotenie choroby sa môže urobiť aj porovnaním rastu rastlín za rovnakých podmienok, ale bez fytopatogénu pridaného do pôdy.
    Príklad 50
    Rezistencia voči Pseudomonas solanacearum
    Testy na určenie rezistencie voči Pseudomonas solanacearum sa uskutočňujú zasiatím semien alebo výsadbou semenáčov do prirodzenej alebo umele zamorenej pôdy. Za účelom vytvorenia
    135 umelo zamorenej pôdy sú baktérie kultivované vo fľašiach za stáleho miešania, potom sa zmiešajú s pôdou v pomere dostatočnom pre vývoj choroby. V niektorých prípadoch je nutné trochu poškodiť korene, aby došlo k vývoju choroby. Choroba sa hodnotí porovnaním počtu stojacich jedincov, pomerom lézií koreňov a váhou pukov alebo koreňov transgenických alebo netransgenických rastlín rastúcich v zamorenej pôde. Hodnotenie choroby sa môže urobiť aj porovnaním rastu rastlín za rovnakých podmienok, ale bez fytopatogénu pridaného do pôdy.
    Príklad 51
    Rezistencia voči pôdnym pliesňam, ktoré slúžia ako vektory na prenos vírusov
    Rad pôdnych druhov pliesní Polymyxa, Olpidium a Spongospo ra sú vektory na prenos vírusov. Medzi tieto vírusy patria (1) Polymyxa betea, ktorá prenáša repný nekrotický žltý žilkový vírus na cukrovú repu, (2) Polymyxa graminis, ktorá prenáša pšeničný pôdny mozaikový vírus na pšenicu, jačmeňový žltý mozaikový vírus a jačmeňový mierny mozaikový vírus na jačmeň, (3) Olpidium brassicae, ktorý prenáša tabakový nekrotický vírus na tabak, (4) Spongospora subterranea, ktorá prenáša zemiakový mop top vírus na zemiaky. Semená alebo rastliny exprimujúce APS v ich koreňoch (napr. konštitučná alebo špecifická expresia v koreňoch) sa vysievajú alebo rozsadzujú do sterilnej pôdy, do ktorej je vnesené i pliesňové inokulum nesúce vi rus. Po určitej dobe sa transgenické rastliny testujú na vírusové symptómy a akumuláciu vírusu pomocou metód ELISA a Northen blot. Kontrolné pokusy sa robia bez inokulácie a s inokuláciou pliesne, ktorá nenesie vírus. Skúmané transgenické rast linné línie by mali byť v ideálnom prípade citlivé na vírusy, aby sa mohla testovať účinnosť ochrany založená na APS. V prípade vírusov, ako je jačmeňový mierny mozaikový vírus, sú prenášané pomocou Polymyxa a sú schopné mechanického prenosu. Ako kontrola tiež úspešne slúži mechanické vnesenie vírusu do rastlín, ktoré sú chránené proti pôdnej infekcii koreňovou expresiou APS.
    136
    Rezistencia voči vírusom prenášaným pliesňami, ktorá je zaručená expresiou APS, zabraňuje vírusom infikovať takto vylepšené rastliny.
    Príklad 52
    Rezistencia voči nematódam
    U transgenických rastlín exprimujúcich APS je analyzovaná ich rezistencia k nematódam. Semená alebo rastliny exprimujúce APS v svojich koreňoch (napr. konštitučné alebo špecifickou expresiou v koreňoch) sú vysiate alebo rozsadené do sterilnej pôdy, inokulum nematód je vnesené do pôdy. Pôsobenie nematód je hodnotené v určitom časovom bode. Koreňové nematódy, ako je Meloidogyne spp. sú nanesené na tabakové alebo rajčiakové rastliny, ktoré exprimujú APS. Nematódy tvoriace cysty, ako je Heterodera spp. sú nanesené na transgenické obiloviny, zemiaky a cukrovú repu. Léziové nematódy, ako je Pratylenchus spp. sú nanesené na transgenické rastliny sóje, lucerny a kukurice. Nematódy obličkového tvaru, ako je Rotylenchulus spp. sú vnesené do transgenických rastlín sóje, bavlny alebo rajčiakov, Ditylenchus spp. sú nanesené na transgenické rastliny lucerny. Podrobné informácie o metódach pre určovanie rezistencie voči nematódam poskytuje Starr v (Ed.; Methods for Evaluating Plánt Species for Resistence to Plánt Parasitic Nematodes, Society of Nematodologists, Hyattsville, Maryland (1990)).
    Príklady dôležitých patogénov v poľnohospodárstve
    Príklad 53
    Prípady rezistencie kukurice
    Na transgenických rastlinách kukurice, ktoré exprimujú APS gény a produkujú APS látky sa uskutočňujú nasledujúce testy. Testy pre každý patogén sa robia podľa štandardného fytopatologického protokolu.
    137
    Ochorenie listov a hniloba stonky (1) Helminthosporium turcicum syn. Exserohilum turcicum (2) Colletotrichum graminicola (3) Helminthosporium maydis syn Bipolaris maydis (4) Kabatiella zeae (5) Puccinia sorghi (6) Puccinia polysora (7) Cercospora zeae-maydis a C. sorghi (8) komplex dvoch alebo viacerých nasledujúcich patogénov: Pythium aphanidermatum, Erwinia chrysanthemi-zeae, Colletotrichum graminicola, Diplodia maydis, D. macrospora, Gibberella zeae, Fusarium moniliforme, Macrophomina phaseolina, Cephalosporium acremonium (9) Clavibacter nebraskanense
    Dôležité pliesne klasu (1) Gibberella zeae
    Aspergillus flavus, A. parasiticus (2) Diplodia maydis, D. macrospora (3) Sphacelotheca reiliana, syn. Ustilago reiliana i
    Príklad 54
    Rezistencia pšenice
    Na transgenických rastlinách pšenice, ktoré exprimujú APS gény a produkujú APS látky sa uskutočňujú nasledujúce testy. Testy pre každý patogén sa robia podľa štandardného fytopatologického protokolu.
    (1) Septoria tritici, S. nodorum (2) Erysiphe graminis (3) Puccinia striiformis (4) Puccinia recondita, P. hordei (5) Fusarium culmorum, Fusarium roseum, Pseudocercosporella herpotrichoides, Gaeumannomyces graminis (6) vírusy
    138
    N. Test biokontrolnej účinnosti v mikrobiálnych kmeňoch, ktoré exprimujú APS gény
    Príklad 55
    Ochrana bavlny proti Rhizoctonia solani
    Testy na určenie ochrany bavlny proti infekcii spôsobenej Rhizoctonia solani sa uskutočňujú vysiatím semien, ktoré sú ošetrené biokontrolným kmeňom do prirodzenej alebo umelo zamorenej pôdy. Pre vytvorenie umelo zamorenej pôdy sa proso, ryža, ovos alebo iné podobné semená navlhčia vodou, potom sú autoklavované a inokulované pliesňovým fytopatogénom z platne Keď sú semená úplne prerastené fytopatogénom, súšia sa na vzduchu a rozmelnia sa na prášok. Prášok sa zmieša s pôdou v pokusne určenom pomere, aby došlo k vyvolaniu choroby. Takto zamorená pôda je daná do kvetináčov a semená sa zasejú 1,5 cm pod povrch. Biokontrolný kmeň je kultivovaný vo fľašiach za stáleho miešania. Bunky sa získajú centrifugáciou, resuspendujú sa vo vode a táto suspenzia sa naleje na semená. Kontrolné rastliny sa zalejú iba vodou. Choroba rastlín sa môže hodnotiť po 14 dňoch porovnaním počtu stojacích jedincov a koreňových léziou ošetrených a neošetrených semenáčov. Hodnotenie choroby sa môže urobiť aj porovnaním rastu rastlín za rovnakých podmienok, ale bez fytopatogénu pridaného do pôdy.
    Príklad 56
    Ochrana zemiakov proti Claviceps michiganese subsp. Speedonicum
    Claviceps michiganese subsp. Speedonicum je agents spôsobujúci kruhovú hnilobu zemiakov. Rozširuje sa pred sadením, kedy zemiakové hľuzy sa rozkrajujú, aby vzniklo viac sadbového materiálu. Prenos patogénu na povrch noža vedie k inokulácii celej sadby. Testy na určenie ochrany zemiakov proti tomuto agents sa robia inokuláciou zemiakov patogénom a biokontrolným
    139 kmeňom. Patogén je nanesený použitím infikovaného noža po krájaní prirodzene infikovaných hľúz. Ďalej je infikovaná zemiaková sadba ošetrená suspenziou biokontrolných baktérií alebo vodou (kontrola). Ochorenie zemiakov sa hodnotí na konci rastového obdobia. Hodnotí sa rastlina, výťažok a počet hľúz infikovaných Clavibacter.
    0. Izolácia APS z organizmov, ktoré exprimujú klonované gény
    Príklad 57
    Postup extrakcie APS
    Aktívne APS môžu byť izolované z buniek alebo z rastového média transformovaných kmeňov divokého typu, ktoré produkujú APS. Toto prebieha za použitia známeho protokolu na izoláciu charakterizovaných molekúl. Napríklad u APS, ktoré obsahujú viac benzénových jadier (pyrolnitrín a soraphen), rastú kultúry 24 hod. V 10 ml L pôdy pri príslušnej teplote a bunky sú potom extrahované rovnakým objemom etylacetátu. Organická fáza sa ďalej odparí vo vákuu a zvyšok sa rozpustí v 20 μΐ metanolu.
    V prípade pyrolnitrínu je aktívna antipatogénna látka extrahovaná z rastového média transformovaného kmeňa, ktorý produkuje toto antibiotikum. Toto sa uskutoční extrakciou média s 80 % acetónom, potom nasleduje odparenie acetónu a druhá extrakcia dietyléterom. Dietyléter sa odstráni odparením a suchý extrakt sa resuspenduje v malom objeme vody. Malé alikvóty antibiotikového extraktu sú nanesené na malé sterilné filtračné disky, ktoré sú umiestnené na agarovej platni. Tu dôjde k inhibícii rastu Rhizoctonia solani, čo indikuje prítomnosť aktívnej antibiotikovej látky.
    Preferovanú metódu pre izoláciu fenazánu opisuje Tomashowet al. (Appl. Environ. Microbiol. 56: 908-912 (1990)). Kultúra je okyslená na pH 2,0 HCI a nasleduje extrakcia benzénom. Benzénová frakcia je dehydratovaná Na^SO^ a vysušená vo vákuu. Zvyšok sa rozpustí 5 % NaHCOa, znovu sa extrahuje rovnakým ob140 jemom benzénu, okyslí, rozdelí do benzénu a znovu usuší.
    Pri peptidových antibiotikách (sú typicky hydrofóbne) je pre extrakciu vhodný butanol, metanol, chloroform alebo hexán. V prípade gramicidínu bola izolácia opísaná Gause a Brazhnikova (Lancet 247: 715 (1944)). Izoláciu epidermínu opisuje Allgier et al., (Eur. Ju. Biochem. 160: 9-22 (1986)), je vhodné zahrnúť extrakciu butanolom a rozpustenie v metanole a díetylétere. Izolácia mnohých APS (napr. pyrolnitrín, gramicidín, fenazín) je opísaná v Merck Index (Merck and Co., Rahway, NJ (1989)) .
    P. Formulácia a použitie izolovaných antibiotík
    Antipliesňové formulácie môžu byť vytvorené použitím ak tívnych zložiek buď izolovaných APS, alebo alternatívne použitím suspenzií alebo koncentrátov buniek, ktoré tieto aktívne látky produkujú. Formulácie môžu byť v pevnej alebo kvapalnej forme.
    Príklad 58
    Kvapalná formulcia antipliesňových zmesí
    V nasledujúcich príkladoch je percentách.
    zloženie udané vo váhových
    1. emulgovateľné koncentráty aktívna zložka kalcium dodecylbenzénsulfonát polyetylénglykol ricínového oleja éter (36 mol etylénoxidu) tributylfenol polyetylénglykol éter (30 mol etylénoxidu) cyklohexanón xylénová zmes a
    20%
    5%
    5%
    70% b
    40%
    8%
    12%
    15%
    25% c
    50%
    6%
    4%
    20%
    20%
    Emulzie žiadaných koncentrácií sa pripravujú riedením týchto
    141 koncentrátov vodou.
    2. roztoky a b c d aktívna zložka 80% 10% 5% 95% etylénglykol monometyléter 20% polyetylénglykol 400 70% N-metyl-2-pyrolidón 20% epoxidizovaný kokosový olej 1% 5% petrolejový destilát 94% (rozpätie, varu 160-190 °C) Tieto roztoky sú vhodné pre aplikáciu vo forme mikrokvapiek
    3. granuláty a b aktívna zložka 5% 10%
    kaolín 94% vysoko disperzná kyselina ortokremičitá 1% atapulgit 90%
    Aktívna zložka je rozpustená v metylchloride, roztok je rozprášený na nosič a rozpúšťadlo sa následne odparí vo vákuu.
    4. prach a aktívna zložka 2% vysoko disperzná kyselina ortokremičitá 1% mastenec 97% kaolín b
    5%
    90%
    Prach, ktorý je určený na priame použitie sa získava miešaním nosiča s aktívnou zložkou.
    Príklad 59
    142
    Pevné formulácie antipliesňových zmesí
    V nasledujúcich príkladoch je zloženie udané vo váhových percentách.
    1. zmáčateľné prášky aktívna zložka sódium lignosulfonát sódium laurylsulfát sódium diizobutylnaftalén sulfonát oktylfenol polyetylénglykoléter (7-8 mol etylénoxidu) vysoko disperzná kyselina ortokremičitá kaolín a
    20í
    5°
    3° lí
    67° b
    60'
    5° c
    75'
    10s
    Aktívna zložka sa zmieša s adjuvans a zmes sa rozomelie vo vhodnom mlyne, čím vzniká zmáčateľný prášok, ktorý sa môže riediť vodou za vzniku suspenzie žiadanej koncentrácie.
  2. 2. emulgovateľné koncentráty aktívna zložka 10% oktylfenol polyetylénglykol éter (4-5 mol etylénoxidu) 3% kalcium dodecylbenzénsulfonát 3% polyetylénglykol ricínového oleja éter (36 mol etylénoxidu) 4% cyklohexanón 30% xylénová zmes 50%
    Emulzie žiadaných koncentrácií sa pripravujú riedením týchto koncentrátov vodou.
  3. 3 . prach aktívna zložka mastenec kaolín a
    143
    Prach, ktorý je určený na priame použitie sa získava miešaním nosiča s aktívnou zložkou.
  4. 4. extrudovaný granulát aktívna zložka sódium lignosulfonát karboxymetylcelulóza kaolín
    10í
    2' lí
    87'
    Aktívna zložka sa zmieša s adjuvans a rozmelní sa. Zmes sa následne zvlhčí vodou, lisuje sa a suší v prúde vzduchu.
  5. 5. potiahnuté granuláty aktívna zložka 3% polyetylénglykol 200 3% kaolín 94%
  6. 6. koncentrovaná suspenzia aktívna zložka etylénglykol nonylfenol polyetylénglykol (15 mol etylénoxidu) sódium lignosulfonát karboxymetylcelulóza 37% roztok formaldehydu 75% emulzia silikónového oleja voda
    40%
    10%
    6%
    10%
    1%
    0,2%
    0,8%
    32%
    Rozdrvená aktívna zložka sa zmieša s adjuvans za vzniku koncentrátu suspenzie, z ktorej sa môže riedením vodou získať suspenzia žiadanej koncentrácie.
    144
    Zoznam sekvencií (1) Všeobecné informácie (i) Prihlasovateľ:
    (A) Meno: CIBA-GEIGY AG (B) Ulica: Klybeckstr. 141 (C) Mesto: Bazilej (D) Štát: Švajčiarsko (E) Zip: 4002 (F) Telefón: +41 61 69 11 11 (G) Telefax: +41 61 696 79 76 (H) Telex: 962 991 (ii) Názov vynálezu: Molekula izolovanej DNK na syntézu antipatogénnych látok, vektory a hostitelia, ktorí ju obsahujú a ich použitie (iii) Počet sekvencií: 22 (iv) Forma čitateľná počítačom:
    (A) Typ média: floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software:Patent in Release #1.0,verzia #1.25 (EPO) (2) Informácie o SEQ ID č. 1:
    (i) Charakteristika sekvencie:
    (A) Dĺžka: 7 000 párov báz (B) Typ: kyselina nukleová (C) Reťazcovosť: jednoduchý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNK (genomová) (iii) Hypotetická: nie (iv) Anti-senza: nie (v) Pôvodný zdroj:
    (B) Kmeň: jeden (iv) Rysy:
    (A) Meno/kl'úč: CDS (B) Umiestnenie: 357..2039 (C) Ďalšia informácia: /označenie=ORFl (vii) Rysy:
    145 (A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestnenie: 2249.3076 (C) ďalšie informácie: /označenie=ORF2 (viii) Rysy:
    (A) Meno/kl'úč: CDS (B) Umiestnenie: 3166..4869 (C) Ďalšie informácie: /o2načenie=0RF3 (ix) Rysy:
    (A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestnenie: 4894..5985 (C) Ďalšie informácie: /označenie=ORF4
    146 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č.:l
    GAATTCCGAC AACGCCGAAG AAGCGCGGAA CCGCTGAAAG AGGAGCAGGA ÄCTGGAGCAA 60
    ACGCIGICCC AGGIGATCGA CAGCCTGCCA CTGCGCATCG ÄGGGCCGATG AACAGCATTG 120
    GCAAAAGCTG GCGGIGCGCA GIGCGCG-d GATCCGÄTCA TITTTGATCG GCTCGCCTCT 180
    TCAAAATCGG CGGTGGAIGA AGICGACGGC GGACTGATCA GGCGCAAAAG AACATGCGCC 240
    AAAACCTTCľ TTTATAGCGA. ATACCTTTGC ACTTCAGAAT GTTAATTCGG AÄACGGAATT 300
    TGCAICGCTT TTCCGGCAGT CIAGAdCTC TAACAGCACA. TTGATGTGCC TCITGC 356
    ATG GAT GCÄ CGA. AGA CTG GCG'GCC TCC CCT Cd GAC AGG CGG CCC GCC 404 Meč T_ Asp Ala ÄXC Am 5 Leu Ala Ala Ser Pro Arg Eis Arg Arg Pro Ala 10 15 TĽT GAC ACA AGG Ad GIT ATG AAC AAG CCG ATC AAG AAT ÄTC GTC ATC 452 ah g Asp ľiir Arr Ser Val Asn Lvs Pro íle Lys Asn íle Val íle 20 25 30 GIG GGC GGC GGI Ad GCG GGC TGG ATG GCC GCC TCG TAC CTC GTC CGG 500 Val Gly Gly Gly Thr Ala Gly to Met Ala Ala Ser Tvr Leu Val Arg 35 40 45 GCC CTC CAA CAG CAG GCG AAG ATT ACG CIC ATC GAA TCT GCG GCG ATC 548 Ala Leu Gin Gin Gin Ala Asn íle Thr Leu íle Glu Ser Ala Ala íle 50 55 60 CCT CGG ATC Gd GIG GGC GAA GCG ACC ATC CCA AGT TTG CAG AAG GIG 596 Pro Arg íle Gly Val Gly Glu Ala Thr íle Pro Ser Leu Gin Lys Val 65 70 75 80 TTC TIC GAT TIC CTC GGG ATA CCG GAG CGG GAA TGG ATG CCC CAA GIG 644 Phe Phe Asp Phe Leu Gly íle Pro Glu Arg Glu Trp Met Pro Gin Val 85 90 95 AAC GGC GCG TIC AAG GCC GCG ÄTC AAG TIC GTG AAT TGG AGA AAG TCT 692 Asn. Gly Ala Phe Lys Ala Ala íle Lys Phe Val Asn Trp Arg Lys Ser 100 105 110 CCC GAC CCC TCG CGC GAC GAT CAC TTC TAC CAT TTG TTC GGC AAC GTG 740 Pro Asp Pro Ser Arg Asp Asp His Phe Tyr His Leu Phe Gly Asn Val
    147
    788
    115 120 125 CCG AAC TGC GAC GGC GTG CCG CTT ACC CAC TAC TGG CTG CGC AAG CGC Pro Asn Cys Asp Gly Val Pro Leu Thr His Tyr Trp Leu Arg Lys Arg 130 135 140 GAA CAG GGC TTC CAG CAG CCG ATG GAG TAC GCG TGC TAC CCG CAG CCC Glu Gin Gly Phe Gin Gin Pro Met Glu Tyr Ala Cys Tyr Pro Gin Pro 145 150 155 160 GGG GCA CTC GAC GGC AAG CTG GCA CCG TGC CTG TCC GAC GGC ACC CGC Gly Ala leu Asp Gly Lys Leu Ala Pro Cys Leu Ser Asp Gly Thr Arg 165 170 175 CAG ATG TCC CAC GCG TGG CAC TTC GAC GCG CAC CTG GTG GCC GAC TTC Gin Met Ser His Ala Trp His Phe Asp Ala His Leu Val Ala Asp Phe 180 18*5 190 TTG AAG CGC TGG GCC GTC GAG CGC GGG GTG AAC CGC GTG GTC GAT GAG Leu Lys Arg Trp Ala Val Glu Arg Gly Val Asn Arg Val Val Asp Glu
    195 200 205
    836
    884
    932
    980
    GTG GTG GAC Val Val Asp GTT Val CGC CTG Arg Leu AAC AAC- CGC GGC TAC ATC TCC AAC CTG CTC Asn Asn Arg Gly Tyr íle Ser Asn Leu Leu 210 215 220 ACC AAC- GAG GGG CGG ACG CTG GAG GCG GAC CTG TTC ATC GAC TGC TCC Thr 225 Lys Glu Gly Arg Thr 230 Leu Glu Ala Aso Leu Phe 235 íle Asp Cys Ser 240 GGC ATG CGG bej CTC CTG ATC AAT CAG GCG CTG AAG GAA CCC TTC ATC Gly Met Arg Gly Leu Leu 245 íle Asn Gin Ala Leu Lys 250 Glu Pro Phe íle 255 GAC ATG TCC GAC TAC CTG CTG TGC GAC AGC GCG GTC GCC AGC GCC GTG Asp Met Ser Asn 26*0 Tyr Leu Leu Cys Aso Ser Ala Val 265 Ala Ser Ala Val 270 CCC AAC GAC GAC GCG CGC GAT GGG GTC GAG CCG TAC ACC TCC TCG ATC Pro Asn Asp 275 Asp Ala Arg Asp Gly Val Glu Pro Tyr 280 Thr Ser Ser íle 285 GCC ATG AAC TCG GGA TGG ACC TGG AAG ATT CCG ATG CTG GGC CGG TTC Ala Met Asn 290 Ser Gly Trp Thr 295 Trp Lys íle Pro Met 300 Leu Gly Arg Phe GGC AGC GGC TAC GTC TTC TCG AGC CAT TTC ACC TCG CGC GAC CAG GCC Gly 305 Ser Gly Tyr Val Phe 310 Ser Ser His Phe Thr Ser 315 Arg Asp Gin Ala 320 ACC GCC GAC TTC CTC AAA CTC TGG GGC CTC TCG GAC AAT CAG CCG CTC Thr Ala Asp Phe Leu Lys 325 Leu Trp Gly Leu Ser Asp 330 Asn Gin Pro Leu 335 AAC CAG ATC AAG TTC CGG GTC GGG CGC AAC AAG CGG .GCG TGG GTC AAC
    1023
    1076
    1124
    1172
    1220
    1268
    1316
    1364
    1412
    148
    Asn Gin íle Lys 340 Phe Arg Val Gly Arg 345 Asn Lys Arg Ala Trp 350 Val Asn AAC TGC GTC TCG ATC GGG CTG TCG TCG TGC TTT CTG GAG CCC CTG GAA 1460 Asn Cys Val 355 Ser íle Gly Leu Ser 360 Ser Cys Phe Leu Glu 365 Pro Leu Glu TCG ACG GGG ATC TAC TTC ATC TAC GCG GCG CTT TAC CAG CTC GTG AAG 1508 Ser Thr 370 Gly íle Tyr Phe íle 375 Tyr Ala Ala Leu Tyr 380 Gin Leu Val Lys CAC TTC CCC GAC ACC TCG TTC GAC CCG CGG CTG AGC GAC GCT TTC AAC 1555 His 385 Phe Pro Asp Thr Ser 390 Phe Asp Pro Arg Leu 395 Ser Asp Ala Phe Asn 400 GCC GA.G ATC GTC CAC ATG TTC GAC GAC TGC CGG GAT TTC GTC CAA GCG 1604 Ala Glu íle Val His 405 Met Phe Asp Asp Cys 410 Arg Asp Phe Val Gin 415 Ala CAC TAT TTC ACC ACG TCG CGC GAT GAC ACG CCG TTC TGG CTC GCG AAC 1652 His Tyr Phe Thr 420 Thr Ser Arg Asp Asn 425 Thr Pro Phe Trp Leu 430 Ala Asn CGG CAC GAC CTG CGG CTC TCG GAC GCC ATC AAA GAG AAG GTT CAG CGC 1700 Arg His ÄSO 435 Leu Arg Leu Ser Asp 440 Ala íle Lys Glu Lvs 445 Val Gin Arg TAC AAG GCG GGG CTG CCG CTG ACC ACC ACG TCG TTC GAC GAT TCC ACG 1748 Tyr Lvs 450 Ala Gly Leu Pro Leu 455 Thr Thr Thr Ser Phe 460 Asp Asp Ser Thr TAC TAC GAG ACC TTC GAC TAC GAA TTC AAG ÄAT TTC TGG TTG AAC GGC 1796 Tyr Tyr 465 Glu Thr Phe Asp 470 Tyr Glu Phe Lys Asn 475 Phe Trp Leu Asn Gly 480 AAC TAC TAC TGC ATC TTT GCC GGC TTG GGC ATG CTG CCC GAC CGG TCG 1844 Asn Tyr Tyr Cys íle 485 Phe Ala Gly Leu Gly 490 Met Leu Pro Asp Arg 495 Ser CTG CCG CTG TTG CAG CAC CGA CCG GAG TCG ATC GAG AAA GCC GAG GCG 1892 Leu Pro Leu Leu 500 Gin His Arg Pro Glu 505 Ser íle Glu Lys Ala 510 Glu Ala ATG TTC GCC AGC ATC CGG CGC GAG GCC GAG CGT CTG CGC ACC AGC CTG 1940 Met Phe Ala 515 Ser íle Arg Arg Glu 520 Ala Glu Arg Leu Arg 525 Thr Ser Leu CCG ACA AAC TAC GAC TAC CTG CGG TCG CTG CGT GAC GGC GAC GCG GGG 1988 Pro Thr 530 Asn Tyr Asp Tyr Leu 535 Arg Ser Leu Arg Asp 540 Gly Asp Ala Gly CTG TCG CGC GGC CAG CGT GGG CCG AAG CTC GCA GCG CAG GAA AGC CTG 2036 Leu 545 Sér Arg Gly Gin Arg Gly 550 Pro Lys Leu Ala 555 Ala Gin Glu Ser Leu 560
    149
    TAGTGGAACG
    CCTGCGATCC
    AGGACGTGCC
    CACCTTGGAC CGGGTAGGCG TATTCGCGGC CACCC-.CGCT
    GCTGCAGGCG CGCGCGCTCG TTCTGCAACľ GCCGGGCCTG
    CGGTATCGTC GGCCTGCTGC GCGAGTTCCT TCCGGľGCGC
    GCCGTGGCGG
    AACCGTAACA
    GGCCTGCCCT
    2096
    2156
    2216
    GCGGCTGGGG TTTCGTCGAA GCCGCCGCCG CG ATG CGG GAC ATC GGG TTC TTC 2269
    1 Arg Asp Ile Gly 5 Phe Phe CTG r-rn TCG CTC AAG CGC CAC GGA CAT GAG CCC GCG GAG GTG GTG CCC 2317 Leu Gly Ser Leu Lys Arg His Glv His Glu Pro Ala Glu Val Val Pro 10 15 20 GGG CTT GAG CCG GTG CTG CTC GAC CTG GCA CGC ACC AAC CTG CCG 2365 Gly Leu Glu Pro Val Leu Leu Asp Leu Ala Ala Thr Asn Leu Pro 25 30 35 CCG CGC GAG ACG CTC CTG CAT GTG ACG GTC TCG AAC CCC AGG GCG GCC 2413 Pro Arg Glu Thr Leu Leu His Val Thr Val Trp Asn Pro Thr Ala Ala 40 45 50 55 GAC GCG CAG AGC TAC ACC GGG CTG Cuu GAC GAA GCG CAC CTG CTC 2461 Asp Ala Gin Arg Ser Tyr Thr Gly Leu Pro Asp Glu Ala His Leu Leu 60 65 7,0 GAG AGC GTG 'CGC ATC TCG ATG GCG GCC CTC GAG GCG GCC ATC GCG TTG 2509 Glu Ser Val Arg Ile Ser Met Ala Ala Leu Glu Ala Ala Ile Ala Leu 75 80 85 ACC GTC GAG CTG TTC GAT GTG TCC CTG CGG TCG CCC GAG TTC GCG CAA 2557 Thr Val Glu Leu Phe Asp Val Ser Leu Arg Ser Pro Glu Phe Ala Gin 90 95 100 AGG TGC GAC GAG CTG GAA GCC TAT CTG CAG AAA ATG GTC GAA TCG ATC 2605 Arg Cys Asp Glu Leu Glu Ala Tyr Leu Gin Lys Met Val Glu Ser Ile 105 110 115 GTC TAC GCG TAC CGC TTC ATC TCG CCG CAG GTC TTC TAC GAT GAG CTG 2653 Val Tyr Ala Tyr Arg Phe Ile Ser Pro Gin Val Phe Tyr Asp Glu Leu 120 125 130 135 CGC CCC TTC TAC GAA CCG ATT CGA GTC GGG GGC CAG AGC. TAC CTC GGC 2701 Arg Pro Phe Tyr Glu Pro Ile Arg Val Gly Gly Gin Ser Tyr Leu Gly 140 145 150 CCC GGT GCC GTA GAG ATG CCC CTC TTC. GTG CTG GAG CAC GTC CTC TGG 2749 Pro Gly Ala Val Glu Met Pro Leu Phe Val Leu Glu His Val Leu Trp 155 160 165 GGC TCG CAA TCG GAC GAC CAA ACT TAT’ CGA GAA TTC AAA GAG ACG TAC 2797 Gly Ser Gin Ser Asp Asp Gin Thr Tyr Arg Glu Phe Lys Glu Thr Tyr 170 175 180 CTG CCC TAT GTG CTT CCC GCG TAC AGG GCG GTC TAC GCT CGG TTC TCC 2845
    150
    Leu Pro 185 Tyr Val Leu Pro Ala 190 Tyr Arg Ala Val Tyr 195 Ala Arg Phe Ser GAG CCS GCG CTC ATC GAC CGC GCG CTC GAC GAG GCG CGA GCG GTC 2893 Gly 200 Glu Pro Ala Leu íle 205 Asp Arg Ala Leu Asp 210 Glu Ala Arg Ala Val 215 GGT ACG LaäJ GAC GAG CAC GTC CGG GCT G*jG CTG ACA GCC CTC GAG CGG 2941 Gly Thr Arg Asp Glu 220 His Val Arg Ala Gly 225 Leu Thr Ala Leu Glu 230 Arg GTC TTC AAG GTC CTG CTG CGC TTC CGG GCG CCT CAC CTC AAA TTG GCG 2989 Val Phe Lys Val 235 Leu Leu Arg Phe Arg 240 Ala Pro His Leu Lys 245 Leu Ala GAG CGC GCG TAC GAA GTC GGG CAA ÄGC GGC CCG AAA TCG GCA GCG z·* z’··/·' 3037 Glu Arg Ala 250 Tyr Glu Val Gly Gin 255 Ser Gly Pro Lys Ser 260 Ala Ala Gly GGT Gly ACG Thr 265 CGC Arg CCA Pro GCA Aia TGC Cys TCG Ser 270 GTG Val AGC Ser TGC Cys TCA Ser CGC Arg 275 TGACGTATGC 3083
    CGCGCGGTCC CGCGTCCGCG CCGCGCTCGA CGAATCCTCA TGCGCGCGAC CCAGTGTĽÄT 3143
    CTCACAAGGA GAGTTTGCCC CC ATG ACT CAG AAG ÄGC CCC GCG AAC GAA CAC 3195
    Met Thr Gin Lys Ser Pro Ala Asn Glu His
    15 10
    GAT AGC AAT CAC TTC GAC GTA Val ATC ATC CTC GGC TCG GGC ATG TCC GGC Gly 3243 Asp Ser Asn His Phe 15 Asp íle íle Leu 20 Gly Ser Gly Met Ser 25 ACC CAG ATG GGG GCC ATC TTG GCC AAA CAA CAG TTT CGC GTG CTG ATC 3291 Thr Gin Met Glv Ala íle Leu Ala Lys Gin Gin Phe Arg Val Leu íle 30 35 40 ATC GAG GAG TCG TCG CAC CCG CGG TTC ACG ATC GGC GAA TCG TCG ATC 3339 íle Glu Glu Ser Ser Eis Pro Arg Phe Thr íle Gly Glu Ser Ser íle 45 50 55 CCC GAG ACG TCT CTT ATG AAC CGC ATC ATC GCT GAT CGC TAC GGC ATT 3387 Pro Glu Thr Ser Leu Met Asn Arg íle íle Ala Asp Arg Tyr Gly íle 60 65 70 CCG GAG CTC GAC CAC ATC ACG TCG TTT TAT TCG ACG CAA CGT TAC GTC 3435 Pro Glu Leu Asp His íle Thr Ser Phe Tyr Ser Thr Gin Arg Tyr Val 75 80 85 90 GCG TCG AGC ACG GGC ATT AAG CGC AAC TTC GGC TTC GTG TTC CAC AAG 3483 Ala Ser Ser Thr Gly íle Lys Arg Asn Phe Gly Phe Val Phe His Lys 95 100 105 CCC GGC CAG GAG CAC GAC CCG AAG GAG TTC ACC CAG TGC GTC ATT CCC 3531 Pro Gly Gin. Glu His Asp Pro Lys Glu Phe Thr Gin Cys Val íle Pro
    151
    110 115 120
    GA.G CTG CCG TGG GGG CCG GAG AGC CAT TAT TAC CGG CAA GAC GTC GAC 3579 Glu Leu Pro Trp Gly Pro Glu Ser His Tyr Tyr Arg Gin Asp 135 Val Asp 125 130 GCC TAC TTG TTG CAA GCC GCC ATT AAA TAC GGC TGC AAG GTC CAC CAG 3627 Ala Tyr 140 Leu Leu Gin Ala Ala íle 145 Lys Tyr Gly Cys Lys Val 150 His Gin AAA ACT ACC GTG ACC GAA TAC CAC GCC GAT AAA GAC GGC GTC GCG GTG 3675 Lys Thr 155 Thr Val Thr Glu Tyr His 160 Ala Asp Lys 165 Asp Gly Val Ala Val 170 ACC ACC GCC CAG GGC GAA CGG TTC ACC GGC CGG TAC ATG ATC GAC TGC 3723 Thr Thr Ala Gin Gly 175 Glu Arg Phe Thr Gly Arg Tyr Met íle 180 Aso Cys 185 GGA. GGA CCT CGC GCG CCG CTC GCG ACC AAG TTC AAG CTC CGC GAA GAA 3771 Gly Gly Pro Arg Ala 190 Pro Leu Ala Thr Lys 195 Phe Lys Leu Arg 200 Glu Glu CCG TGT CGC TTC AAG ACG CAC TCG CGC AGC CTC TAC ACG CAC ATG CTC 3819 Pro Cys Arg Phe Lvs 205 Thr His Ser 210 Arg Ser Leu Tyr Thr His 215 Met Leu GGG GTC AAG CCG TTC GAC GAC ATC TTC AAG GTC AAG GGG CAG CGC TGG 3867 Glv Val 220 Lys Pro Phe Asp Asp Ile 225 Phe Lys Val Lys Gly Gin 230 Arg Trp CGC TGG CAC GAG GGG ACC TTG CAC CAC ATG TTC GAG' GC-C GGC TGG CTC 3915 Arg Trp 235 His Glu Gly Thr Leu His 240 His Met Phe 245 Glu Gly Gly Trp Leu 250 TGG GTG ATT CCG TTC AAC AAC CAC CCG CGG TCG ACC AAC AAC CTG GTG 3963 Trp Val Ile Pro Phe 255 Asn Asn His Pro Arg 260 Ser Thr Asn Asn Leu Val 265 AGC GTC GGC CTG CAG CTC GAC CCG CGT GTC TAC CCG AAA ACC GAC ATC 4011 Ser Val Gly Leu Gin 270 Leu Asp Pro Arg Val 275 Tyr Pro Lys Thr 280 Asp Ile TCC GCA. CAG CAG GAA TTC GAT GAG TTC CTC GCG CGG TTC CCG AGC ATC 4059 Ser Ala Gin Gin Glu 285 Phe Asp Glu 290 Phe Leu Ala Arg Phe Pro 295 Ser Ile GC-G GCT CAG TTC CGG GAC GCC GTG CCG GTG CGC GAC TGG GTC AAG ACC 4107 Gly Ala 300 Gin Phe Arg Asp Ala Val 305 Pro Val Arg Asp Txp Val 310 Lys Thr GAC CGC CTG CAA TTC TCG TCG AAC GCC TGC GTC GGC GAC CGC TAC TGC 4155 Asp Arg Leu Gin Phe 315 Ser Ser Asn 320 Ala Cys Val 325 Gly Asp Arg Tyr Cys 330 CTG ATG CTG CAC GCG AAC GGC TTC ATC GAC CCG CTC TTC TCC CGG GGG 4203
    152
    Leu Met Leu His Ala 335 Asn Gly Phe íle Asp 340 Pro Leu Phe Ser Arg Gly 345 CTG GAA AAC ACC GCG GTG ACC ATC CAC GCG CTC GCG GCG CGC CTC ATC 4251 Leu Glu Asn Thr 350 Ala Val Thr íle His 355 Ala Leu Ala Ala Arg 360 Leu íle AAG z·' CTG CGC GAC GAC GAC TTC TCC CCC GAG CGC TTC GAG TAC ATC 4299 Lys Ala Leu 365 Arg Asp Asp Asp Phe 370 Ser Pro Glu Arg Phe 375 Glu Tyr íle GAG CGC CTG CAG CAA AAG CTT TTG GAC CAC AAC GAC GAC TTC CTC AGC 4347 Glu Arg 380 Leu Gin Gin Lys Leu 385 Leu Asp His Asn Asn 390 Asp Phe Val Ser TGC TGC TAC ACG GCG TTC TCG GAC TTC CGC CTA TGG GAC GCG TTC CAC 4395 Cys 395 Cys Tyr Thr Ala Phe 400 Ser Asp Phe Leu 405 Trp Asp Ala Phe Eis 410 AGG CTG TGG z-'-'z— (λα? GTC GGC ACC ATC CTC GGG CAG TTC CGG CTC GTG CAG 4443 Arg Leu Tr? Ala Val 415 Gly Thr íle Leu Glv Gin 420 Phe Arg Leu Val 425 Gin GCC CAC GCG AGG TTC CGC GCG TCG CGC AAC GAG GGC GAC CTC GAT CAC 4491 Ala His Ala 430 Phe Arg Ala Ser Arg 435 Asn Glu Gly Asp Leu 440 Asp His CTC GAC AAC GAC CCT CCG TAT CTC GGA TAC CTG TGC GCG GAC ATG GAG 4539 Leu Asp Asn 445 Asp Pro Pro Tyr Leu 450 Gly Tyr Leu Cys Ala 455 As? Met Glu GAG TAC TAC CAG TTG TTC AAC GAC GCC AAA GCC GAG GTC GAG GCC CTG 4587 Glu Tyr 460 Tyr Gin Leu Phe Asn 465 Asp Ala Lys Ala Glu 470 Val Glu Ala Val AGT GCC GGG CGC AAG CCG GCC GAT GAG GCC GCG GCG CGG ATT CAC GCC 4635 Ser 475 Ala Gly Arg Lys Pro 480 Ala Asp Glu Ala Ala 485 Ala Arg íle His Ala 490 CTC ATT GAC GAA CGA GAC TTC GCC AAG CCG ATG TTC /“•r·» r** TTC GGG TAC 4633 Leu íle Asp Glu Arg 495 Asp Phe Ala Lys Pro 500 Met Phe Gly Phe Gly 505 Tyr TGC ATC ACC GGG GAC AAG CCG CAG CTC AAC AAC TCG AAG TAC AGC CTG 4731 Cys íle Thr Glv 510 Asp Lys Pro Gin Leu 515 Asn Asn Ser Lys Tyr 520 Ser Leu CTG CCG GCG ATG CGG CTG ATG TAC TGG ACG CAA ACC CGC GCG CCG GCA 1 4779 Leu Pro Ala 525 Met Arg Leu Met Tyr 530 Trp Thr Gin Thr Arg 535 Ala Pro Ala GAG GTG AAA AAG TAC TTC GAC TAC AAC CCG ATG TTC GCG CTG CTC AAG 4827 Glu Val Lys Lys Tyr Phe Asp Tyr Asn Pro Met Phe Ala Leu Leu Lys
    540 545 550
    153
    GCG TAC ATC ACG ACC CGC ATC GGC CTG GCG CTG AAG AAG TAGCCGCTCG 4876
    Ala Tyr íle Thr Thr Arg íle Gly Leu Ala Leu Lys Lys
    555 560 565
    ACGACGACAT AAAAACG ATG AAC GAC ATT CAA TTG GAT CAA GCG AGC GTC 4926
    Met Asn Asp íle Gin Leu Asp Gin Ala Ser Val
    15 10
    AAG Lys AAG CGT CCC TCG GGC GCG TAC Tyr GAC GCA ACC ACG CGC CTG GCC GCG 4974 Lys Arg Pro 15 Ser Gly Ala Asp 2*0 Ala Thr Thr Arg Leu 25 Ala Ala AGC TGG TAC GTC GCG ATG CGC TCC AAC GAG CTC AAG GAC AAG CCG ACC 5022 Ser Tr? Tyr Val 30 Ala Met Arg Ser 35 Asn Glu Leu Lys Aso Lys 40 Pro Thr GAG TTG ACG CTC TTC GGC CGT CCG TGC GTG TGG CGC GGA GCC ACG 5070 Glu Leu 45 Thr Leu Phe Gly Arg 50 Pro Cys Val Ala Trp Arg Gly Ala Thr 55 GGG CGG GCC GTG GTG ATG GAC CGC CAC TGC TCG CAC CTG GGC GCG AAC 5118 Gly 60 Arg Ala Val Val Met 65 Asp Arg His Cys Ser 70 His Leu Gly Ala Asn 75 CTG GCT GAC GGG CGG ATC AAG GGG TGC ATC CAG TGG CCG ITT CAC 5166 Leu Ala Asp Glv Arg íle 80 Lys Asp Gly Cys 85 íle Gin Cys Pro Phe His 90 CAC TGG CGG TAC GAC GAA CAG GGC CAG TGC GIT CAC ATC CCC GGC CAT 5214 His Trp Arg Tyr 95 Asp Glu Gin Gly Gin 100 Cys Val His íle Pro 105 Gly His AAC CAG GCG GTG CGC CAG CTG GAG CCG GTG CCG CGC GGG GCG CGT CAG 5262 Asn Gin Ala Val 110 Arg Gin Leu Glu 115 Pro Val Pro Arg Gly Ala 120 Arg Gin CCG ACG TTG GTC ACC GCC GAG CGA TAC TAC GTG TGG GTC TGG TAC 5310 Pro Thr 125 Leu Val Thr Ala Glu 130 Arg Tyr Gly Tyr Val Trp Val 135 Trp Tyr z-*-» r* TCC CCG CTG CCG CTG CAC CCG CTG CCC GAA ATC TCC GCG GCC GAT 5358 Gly 140 Ser Pro Leu Pro Leu 145 His Pro Leu Pro Glu 150 íle Ser Ala Ala Asp 155 GTC GAC AAC GGC GAC ΤΊΤ ATG CAC CTG CAC TTC GCG TTC GAG ACG ACC 5406 Val Asp Asn Gly Asp Phe 160 Met His Leu His 165 Phe Ala Phe Glu Thr Thr 170 ACG GCG GTC TTG CGG ATC GTC GAG AAC TTC TAC GAC GCG CAG CAC GCA 5454 Thr Ala Val Leu 175 Arg íle Val Glu Asn 180 Phe Tyr Asp Ala Gin 185 His Ala ACC CCG GTG CAC GCA CTC CCG ATC TCG GCC TTC GAA CTC AAG CTC TTC 5502 Thr Pro Val His 190 Ala Leu Pro íle 195 Ser Ala Phe Glu Leu Lys 200 Leu Phe
    154 ...
    GAC GAT TGG Trp CGC CAG TGG CCG GAG Glu GTT GAG TCG CTG GCC CTG GCG GGC 5550 Asp Asp 205 Arg Gin Trp Pro 210 Val Glu Ser Leu 215 Ala Leu Ala Gly GCG TC-G TTC GGT GCC GGG ATC GAC TTC ACC GTG GAC CGG TAC TIC GGC 5598 Ala Tľľo Phe Gly Ala Gly íle Asp Phe Thr Val Asp Arg Tyr Phe Gly 220 225 230 235 CTC GGC ATG CTG TCA CGC GCG CTC GGC CTG AAC ATG TCG CAG ATG 5646 Pro Leu Gly Leu Ser Arg Ala Leu Gly Leu Asn Met Ser Gin Met 240 245 250 ÄÄC CTG CAC TTC GAT GGC TAC CCC /*<·<* GGG TGC GTC ATG ACC GTC GCC 5694 Asn Leu Sis D hg Aso Gly Tyr Pro Gly Gly Cys Val Met Thr Val Ala 255 260 265 CTG GAC GGA GAC CTC AAA TAC AAG CTG CTC CAG TGT GTG ACG CCG GTG 5742 Leu Asp Glv Asp Val Lys Tyr Lys Leu Leu Gin Cys Val Thr Pro Val 270 275 280 AGG GAA GG~ AAG AAC GTC ATG CAC ATG CTC ATC TCG ATC AAG AAG GTG 5790 Ser Glu Gly Lys Asn Val Met Sis Met Leu íle Ser íle Lys Lys Val 285 290 295 GGC GGC ATC CTG CTC CGC GCG ACC GAC TTC GTG CTG TTC GGG CTG CAG 5838 Gly Gly 7*1 o Leu Leu Arg Ala Thr Asp Phe Val Leu Phe Gly Leu Gin 300 305 310 315 ACC AGG CAG GCC GCG GGG TAC GAC GTC AAA ATC TGG AAC GGA ATG AAG 5885 Thr Arg Gin Ala Ala Gly Tyr Asp Val Lys íle Trp Asn Gly Met Lys 320 325 330 CCG GAC GGC GGC GCG TAC AGC AAG TAC GAC AAG CTC GTG CTC AAG 5934 Pro Asp Gly Gly Gly Ala Tyr Ser Lys Tyr Asp Lys Leu Val Leu Lys 335 340 345 TAC CGG GCG TTC TÄľ CGA TGG GTC GAC CGC GTC GCA AGT GAG CGG 5982 Tyr Arg Ala Phe Tyr Arg Gly Trp Val Asp Arg Val Ala Ser Glu Arg 350 355 360
    TGATGCGIGA AGCCGAGCCG CTCTCGACCG CGTCGCTGCG CCAGGCGCTC GCGAACCTGG 6042
    CGAGCGGCCT GACGATCACG GCCTACGGCG CGCCGGGCCC GCTTGGGCTC GCGGCCACCA 6102
    GCTTCGTCTC GGACTCGCTC TTTGCGAGGT ATTCATGACT ATCTGGCTGT TGCAACTCCT 6162
    GCTGGTGATC GCGCTCTGCA ACGTCTGCGG CCGCATTGCC GAACGGCTCG GCCAGTGCGC 6222
    GGTCATCGGC GAGATCGCGG CCGGTTTGCT GTTGGGGCCG TCGCTGTTCG GCGTGATCGC 6282
    ACCGAGTTTC TACGACCTGT TGTTCGGCCC CCAGGTGCTG TCAGCGATGG CGCAAGTCAG 6342
    CGAAGTCGGC CTGGTACTGC TGATGTTCCA GGTCGGCCTG CATATGGAGT TGGGCGAGAC 6402
    155
    GCTGCGCGAC
    GGCCGCGATC
    GGCGCTGCCC
    GGCGCGCATC
    TGCCGCGATG
    GAGCGGGCCC
    GTGCGCGCTG
    GCATGCGACG
    GACGTCGCTG
    CCGGGTGCCC
    AAGCGCTGGC
    GGCATGATCG
    TATGTGCTCT
    ATCGACGACC
    CTGACGGATG
    GGCTGGGCAT
    CTGGTGCGCT
    CGCGACCGCT
    ATCGGATTCC
    GGCGTCGCGA
    GCATGCCCGT
    TCGCCATCGT
    TCTGCGGTGT
    TGGAGCTCAG
    CGCTCGGATG
    TTGCGCGCAT
    TCGTGGTTCG
    TGGCCGTGTT
    ÄIÄGCGCTTT
    AGGAGTGGCG
    CGCGATCGCA
    TTCGAAAGGC
    CGCACTTGCG
    CGCCATGGTG
    GATGCTGCTT
    GCTCGTCAGC
    ÄCCGACCCTT
    GTTCTGCTTC
    TGGCGCACTT
    CGACAA.CGTC
    GCGGGCGGGACGCTCGCCA
    GTATCGGCGG
    GGCGCGCGGC
    GCAACGATTG
    CTGCTCGCGT
    GCGCC-GCTCG
    GTAATGTTGľ
    GCCGCGGCGC
    GAAGGTTTCG
    TCGTCGCACC
    GCGACGCGCC
    TGCCGGTGAT
    ACGCAATGTC
    CCTCGCIATC
    ATCTGGTGCT
    CGTCGACCGC
    CGGCACTCGC
    TGITCGTGCS
    TCAAGCTT
    6462
    6522
    6582
    6642
    6702
    6762
    6322
    6882
    6342
    7000
    156 (2) Informácie o SEQ ID NO: 2 (i) Charakteristika sekvencie:
    (A) DÍžka: 560 aminokyselín (B) Typ: aminokyseliny (C) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (iii) Opis sekvencie: SEQ ID č. 2
    Met Asp Ala Ary Leu Ala Ala Ser Pro Ary Sis Ary Ary Pro Ala 1 5 10 15 Phe Asp Thr Ar- Ser Val Met Asn Lvs Pro íle Lvs Asn íle Val íle 20 25 30 Val Gly Gly Gly Thr Ala Gly Trp Met Ala Ala Ser Tyr Leu Val Ary 35 4*0 45 Ala Leu Gin Gin Gin Ala Asn íle Thr Leu íle Glu Ser Ala A_La íle 50 55 60 Pro Arg íle Gly Val Gly Giu Ala Thr íle Pro Ser Leu Gin Lys Val 65 70 75 80 Phe Phe Asp Pne Leu Gly íle Pro Glu Ary Glu Trp Met Pro Gin Val 85 90 95 Asn Gly Ala Phe Lys Ala Ala íle Lvs Phe Val Asn Tr? Ary Lys Ser 100 105 110 Pro Asp Pro Ser Ary Asp Asp tiis Phe Tyr Eiis Leu Phe Gly Asn Val 115 120 125
    . -157
    Pro Asn Cys Asp Gly 130 Val Pro Leu Thr His Tyr Trp Leu Arg Lys Arg 135 140 Glu Gin Gly Phe Gin Gin Pro Met Glu Tyr Ala Cys Tyr Pro Gin Pro 145 150 155 160 Gly Ala Leu Asp Gly Lys Leu Ala Pro Cys Leu Ser Asp Gly Thr Arg 165 170 175 Gin Met Ser His Ala Trp His Phe Aso Ala His Leu Val Ala Asp Phe 180 185 190 Leu Lys Arg Trp Ala Val Glu Arg Gly Val Asn Arg Val Val Asp Glu 135 200 205 Val Val Asp Val Arg Leu Asn Asn Arg Gly Tyr íle Ser Asn Leu Leu 210 215 220 Thr Lys Glu Gly Arg Thr Leu Glu Ala Asp Leu Phe íle Asp Cys Ser 225 230 235 240 Gly Met Arg Gly Leu Leu íle Asn Gin Ala Leu Lys Glu Pro Phe He 245 250 255 Aso Met Ser Aso Tyr Leu Leu Cys Asp Ser Ala Val Ala Ser Ala Val 26*0 265 270 Pro Asn Aso Asp Ala Arg Asp Gly Val Glu Pro Tyr Thr Ser Ser íle 275 280 285 Ala Met Asn Ser Gly Trp Thr Trp Lys íle Pro Met Leu Gly Arg Phe 290 295 300 Glv Ser Gly Tyr Val Phe Ser Ser His Phe Thr Ser Arg Aso Gin Ala 305 310 315 320 Thr Ala Aso Phe Leu Lys Leu Trp Gly Leu Ser Asp Asn Gin Pro Leu 325 330 335 Asn Gin íle Lys Phe Arg Val Gly Arg Asn Lys Arg Ala Trp Val Asn 340 345 350 Asn Cys Val Ser íle Gly Leu Ser Ser Cys Phe Leu Glu Pro Leu Glu 355 360 365 Ser Thr Gly íle Tyr Phe íle Tyr Ala Ala Leu Tyr Gin Leu Val Lys 370 375 380 His Phe Pro Asp Thr Ser Phe Asp Pro Arg Leu Ser Asp Ala Phe Asn 385 390 395 400 Ala Glu íle Val His Met Phe Asp Asp Cys Arg Asp Phe Val Gin Ala 405 410 415
    158
    His Tyr Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asp Thr Pro Phe Trp Leu Ala Asn 420 425 430 Arg His Asp Leu Arg Leu Ser Asp Ala íle Lys Glu Lys Val Gin Arg 435 440 445 Tyr Lys Ala Gly Leu Pro Leu Thr Thr Thr Ser Phe Asp Asp Ser Thr 450 455 460 Tyr Tyr Glu Thr Phe Asp Tyr Glu Phe Lys Asn Phe Trp Leu Asn Gly 465 470 475 480 Asn Tyr Tyr Cys íle Phe Ala Gly Leu Glv Met Leu Pro Asp Arg Ser 485 490 495 Leu Pro Leu Leu Gin Eis Arg Pro Glu Ser íle Glu Lys Ala Glu Ala 500 505 510 Met Phe Ala Ser Zle Arg Arg Glu Ala Glu Arg Leu Arg Thr Ser Leu 515 520 525 Pro Thr Asn Tyr Asp Tyr Leu Arg Ser Leu Arg Asp Gly Asp Ala Gly 530 535 540 Leu Ser Arg Gly Gin Arg Gly Pro Lys Leu Ala Ala Gin Glu Ser Leu 545 550 555 560
    159 (2) Informácie o SEQ ID č.: 3 (i) Charakteristika sekvencie:
    (A) Dĺžka: 275 aminokyselín (B) Typ: aminokyseliny (C) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (iii) Opis sekvencie: SEQ ID č. 3
    Met Arg Asp He GIv Phe Phe Leu Gly Ser Leu Lys Arg Eis Gly Eis 1 5 10 15 Glu Pro Ala Glu Val Val Pro Gly Leu Glu Pro Val Leu Leu Asp Leu 20 25 30 Ala Arg Ala Thr Asn Leu Pro Pro Aro Glu Thr Leu Leu cíis Val Thr 35 40 45 Val Tr? Asn Pro Thr Ala Ala Asp Ala Gm Arg Ser Tyr Thr Gly Leu 50 55 60 Pro Asp Glu Ala His Leu Leu Glu Ser val Arg íle Ser Ala Ala 65 70 75 80 Leu Glu Ala Ala íle Ala Leu Thr Val Glu Leu Phe Aso Val Ser Leu
    85 90
    Arg Ser Pro Glu Phe Ala Gin Arg Cvs Asp Glu Leu Glu Ala Tyr Leu 100 105 110 Gin Lys Met Val Glu Ser íle Val Tyr Ala Tyr Arg Phe íle Ser Pro 115 120 125 Gin Val Phe Tyr Asp Glu Leu Arg Pro Phe Tyr Glu Pro íle Arg Val 130 135 140 Gly Gly Gin. Ser Tyr Leu Gly Pro Gly Ala Val Glu Met Pro Leu Phe 145 150 155 160 Val Leu Glu Eis Val Leu Trp Gly Ser Gin Ser Asp Asp Gin Thr Tyr 165 170 175 Arg Glu Phe Lys Glu Thr Tyr Leu Pro Tyr Val Leu Pro Ala Tyr Arg 180 185 190
    160
    Ala Val Tyr Ala Arg Phe Ser Gly Glu Pro Ala Leu Ile Asp Arg Ala 195 200 205
    Leu Asp Glu Ala Arg Ala Val Gly Thr Arg Asp Glu His Val Arg Ala 210 215 220
    Gly Leu Thr Ala Leu Glu Arg Val Phe Lys Val Leu Leu Axg Phe Arg
    225 230 235 240
    Ala Pro Eis Leu Lys Leu A_La Glu Arg Ala Tyr Glu Val Gly Gin Ser
    245 250 ' 255
    Gly Pro Lys Ser Ala Ala Gly Gly Thr Arg Pro Ala Cys Ser Val Ser
    Cys Ser Arg 275
    260
    265
    270
    161 (2) Informácie o SEQ ID č.: 4 (i) Charakteristika sekvencie:
    (A) DÍžka: 567 aminokyselín (B) Typ: aminokyseliny (C) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (iii) Opis sekvencie: SEQ ID č.4
    Met Thr Gin Lys Ser Pro Ala Asn Glu His Asp Ser A-sn His Phe Asp 1 5 10 15 Val íle íle Leu Gly Ser Gly Mat Ser Gly Thr Gin Mor Gly Ala íle 20 25 30 Leu Ala Lvs Gin Gin Phe Arg Val Leu íle Ue Glu Glu Ser Ser His 35 40 45 Pro Axg· Pírs Thr íle Gly Glu Ser Ser íle Pro Glu Thr Ser Leu Met 50 55 50 Asn Arg íle íle Ala Asp Arg Tyr Gly íle Pro Glu Leu Asp His íle 65 7*0 75 80 Thr Ser Phe Tyr Ser Thr Gin Arg Tyr Val Ala Ser Ser Thr Gly íle 85 90 95 Lys Arg Asn. Phe Gly Phe Val Phe His Lys Pro Gly Gin Glu His Asp 100 105 110 Pro Lys Glu Phe Thr Gin Cvs Val íle Pro Glu Leu Pro Trp Gly Pro 115 120 125 Glu Ser His Tyr Tyr Arg Gin Asp Val Asp Ala Tyr Leu Leu Gin Ala 130 135 140 Ala íle Lys Tyr Gly Cys Lys Val His Gin Lvs Thr Thr Val Thr Glu 145 150 155 160 Tyr His Ala Äsp Lys Äsp Gly Val Äla Val Thr Thr Ala Gin Glv Glu 165 170 175 Arg Phe Thr Gly Arg Tyr Met íle Asp Cys Gly Gly Pro Arg Äla Pro 180 185 190 Leu Ala Thr Lys Phe Lys Leu Arg Glu Glu Pro Cys Arg Phe Lys Thr 195 200 205 His Ser Arg Ser Leu Tyr Thr His Met Leu Gly Val Lys Pro Phe Asp 210 215 220 Aso íle Phe Lys Val Lys Gly Gin Arg Trp Arg Trp His Glu Gly Thr 225 230 235 240
    162
    Leu His His Met Phe Glu Gly Gly Tr? Leu Trp Val íle Pro Phe Asn 245 250 255 Asn His Pro Arg Ser Thr Asn . Asn Leu Val Ser Val Gly Leu Gin Leu 260 265 270 Asp Pro Ä Val Tyr Pro Lys 1 Thr Asp íle Ser Ala Gin Gin Glu Phe 275 280 285 Asp Glu Phe Leu Ala Arg Phe Pro Ser íle Gly Ala Gin Phe Arg Asp 290 295 300 Ala Val Pro Val Arg Asp Trp Val Lys Thr Asp Arg Leu Gin Phe Ser 305 310 315 320 Ser Asn Ala Cys Val Gly Asp Arg Tyr Cys Leu Met Leu His Ala Asn 325 330 335 Gly Phe íle Asp Pro Leu Phe Ser Arg Gly Leu Glu Asn Thr Ala Val 34*0 345 350 Thr íle His Ala Leu Ala Ala Arg Leu íle Lys Ala Leu Arg Asp Asp 355 360 365 Asp Phe Ser Pro Glu Arg Phe Glu Tyr íle Glu Arg Leu Gin Gin Lys 370 375 380 Leu Leu Asp His Asn Asn Asp Phe Val Ser Cvs Cys Tyr Thr Ala Phe 385 3SÔ 395 400 Ser Asp Phe Arg Leu Trp Asp Ala Phe His Arg Leu Trp Ala Val Gly 405 410 415 Thr íle Leu Glv Gin Phe Arg Leu Val Gin Ala His Ala Arg Phe Arg 420 425 430 Ala Ser Arg Asn Glu Gly Asp Leu Asp Eis Leu Asp Asn Asp Pro Pro 435 440 445 Tyr Leu Gly Tyr Leu Cys Ala Asp Met Glu Glu Tyr Tyr Gin Leu Phe 450 455 460 Asn Asp Ala Lys Ala Glu Val Glu Ala Val Ser Ala Gly Arg Lys Pro 465 470 475 480 Ala Asp Glu Ala Ala Ala Arg íle His Ala Leu íle Asp Glu Arg Asp 485 490 495 Phe Ala Lys Pro Met Phe Gly Phe Gly Tyr Cys íle Thr Gly Asp Lys 500 '505 510 Pro Gin Leu Asn Asn Ser Lys Tvr Ser Leu Leu Pro Ala Met Arg Leu 515 520 525 Met Tyr Trp Thr Gin Thr Arg Ala Pro Ala Glu Val Lys Lys Tyr Phe 530 535 540 Asp Tyr Asn Pro Met Phe Ala Leu Leu Lys Ala Tyr íle Thr Thr Arg 545 550 555 560 íle Gly Leu Ala Leu Lys Lys
    565
    163 (2) Informácie o SEQ ID č.: 5 (i) Charakteristika sekvencie:
    (A) Dĺžka: 363 aminokyselín (B) Typ: aminokyseliny (C) Topológia: lineárna (i.i) Typ molekuly: proteín (iii) Opis sekvencie: SEQ ID č.5
    Met Asn As? íle Gin Leu Asp Gin Ala Ser Val Lys Lys Arg Pro Ser 1 S 10 15 Gly Ala Tyr Asp Ala Thr Thr Arg Leu Ala Ala Ser Trp Tyr Val Ala 2*0 25 30 Met Arg Ser Asn Glu Leu Lys Asp Lys Pro Thr Glu Leu Thr Leu Phe 35 40 45 Gly Arg Pro Cys Val Ala Trp Arg Gly Ala Thr Gly Arg Ala Val Val 50 55 60 Met Asp Arg His Cys Ser His Leu Gly Ala Asn Leu Ala Asp Gly Arg 65 70 75 80 íle Lvs Asp Gly Cvs íle Gin Cys Pro Phe His His Trp Arg Tyr Asp 85 90 95 Glu Gin Gly Gin Cys Val His íle Pro Gly His Asn Gin Ala Val Arg 100 105 110 Gin Leu Glu Pro Val Pro Arg Glv Ala Arg Gin Pro Thr Leu Val Thr 115 12Ô 125 Ala Glu Arg Tyr Gly Tyr Val Trp Val Trp Tyr Gly Ser Pro Leu Pro 130 135 140 Leu .His Pro Leu Pro Glu íle Ser Ala Ala Asp Val Asp Asn Gly Asp 145 150 155 160 Phe Met His Leu His Phe Ala Phe Glu Thr Thr Thr Ala Val Leu Arg 165 170 175 íle Val Glu Asn Phe Tyr Asp Ala Gin His Ala Thr Pro Val His Ala 180 185 190 Leu Pro íle Ser Ala Phe Glu Leu Ĺys Leu Phe Asp Asp Trp Arg Gin 195 200 205
    Trp Pro Glu Val Glu Ser Leu Ala Leu Ala Gly Ala Trp Phe Gly ALa 210 215 220
    164
    Gly íle 225 Asp Phe Thr Val 230 Asp Arg Tyr Phe Gly Pro Leu Gly Met Leu 235 240 Ser Arg Ala Leu Gly Leu Asn Met Ser Gin Met Asn Leu His Phe Aso 245 250 255 Gly Tyr Pro Gly Gly Cys Val Met Thr Val Ala Leu Asp Gly Asp Val 260 265 270 Lys Tyr Lys Leu Leu Gin Cys Val Thr Pro Val Ser Glu Gly Lys Asn 275 280 285 Val Met His Met Leu Ile Ser Ile Lys Lys Val Giv Gly Ile Leu Leu 290 295 300 Arg Ala Thr Asp Phe Val Leu Phe Gly Leu Gin Thr Arg Gin Ala Ala 305 310 315 320 Gly Tyr Asp Val Lys íle Tro Asn Gly Met Lys Pro Asp Giv Gly Gly 325 330 335 Ala Tyr Ser Lys Tyr Asp Lys Leu Val Leu Lys Tyr Arg Ala Phe Tyr 340 345 350 Arg Gly Trp Val Asp Arg Val Ala Ser Glu Arg 355 360
    165 (2) Informácie o SEQ ID c.: 6 (i) Charakteristika sekvencie:
    (A) Dĺžka: 28 958 párov báz (B) Typ: kyselina nukleová (C) Reťazcovitosť: jednoduchý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNK (genómová) (iii) Hypotetická: nie (iv) Anti-senza: nie (v) Opis sekvencie:
    SEQ ID c. 6
    CGAJTCS3GTC GGCCľCGACA CCGTCGAAGA.
    CTCľCAAGGC ACCAITCTCA TCCASTCIC
    GICGCľCICC CTCCA2TGGCC GGA.CCGA.GGA
    CGCGAjGCGGG TCGCICGCIAÍ AAGCTGCCCC
    TCCICCGGGG GGCA.CGCCGG TGGA.CA.CCCA.
    GCTCGCCTAT GGGCCTCA.GT TCCA.GGGA.CT
    CTTCGCCGAjG GCCAAGCTCC CGGACGCAjGG
    CCCCC-CCCTG TTCGAjCAGCG CCCTGCACGC
    CGICGCľCIG CCCTľCTCCT GGAGAGGAGT
    GCGCGTGCGC TľCCATCGTC CGAATGGCAA CGCA.GGCGAG CCCCTCGCCľ CGGľCCAAGC
    GCTCCGCACC CAGGGAGCTT CCCTCCACGA
    GCCCAGCCCT ACGTCGCTCT CTGAGGCCCC
    CGACCTCGCG CTGCAGGCST CICTCGCCCG
    GCTCGACCAA. GGCGCTTCGC. CTCCGGGCCT
    TGGCGACCTC ATAGAGAGCG CTCACAACTC
    GGTCACGCTC ©AGCTCCCC TCGCTCTCCC 60 CGTCGGÄCCC ATGGSCGAGG CGGGACGAAG 120 CGCTCCTCAG GACGCCCCTT GGACGCGCCA 180 CTCCCTCTCC TTCGAICTTC ACGAÄIGGGC 240 AGGCTCTTA.C GCAGGGCTCG AAÄGCGGGGG 300 TCGCTCCGTC TGGAA.GCGCG GCGA.CGA.GCT 360 CGCCAAGGAT GCCGCTCGGT TCGCCCTCCA 420 GCTTGTCCTT GAAGACGAGC GGACGCCGGG 480 CTCGCTGCGC TCCGTCGGCG CCACCACCCT 540 GTCCTCCGTG TCGCTCCTCC TCGGCGACGC 600 GCTCGCCACG CGCAICACGT CCCAGGAGCA 660 TGCTCTCTTC CGGGTTGTCT GGAGAGATCT 720 GAAGGGTGTC CTCCTAGAGA CAGGGGGICT 780 CIACGACGGT CICGCTC-CCC TCCGGAGCGC 840 CGTCGICGTC CCCTTCATCG ATTCGCCCTC 900 CAjCCGCGCGC GCCCTCGCCT TGCTGCAAGC 960
    166
    GTGGCTTGAC' GACGAACGCC TCGCCTCCTC GCGCCTCGTC CTGCTCACCC GACAGGCCAT 1020 CGCAACCCAC CCCGACGAGG ACGTCCTCGA CCTCCCTCAC GCTCCTCTCT GGGGCCTTCT 1080 GCGCACCGCG ČAAäGCGAAC ACCCGGAGCT CCCTCTCTTC CTCGTCGACC TGGACCICGG 1140 TCAGGCCTCG gägcgcc-ccc TGCTCGGCGC GCTCGACACA GGAGAGCGTC AGCTCGCTCT 1200 CCGCCATGGA AääTGCCTCG TCCCGAGGTT GGTGAATGCÄ CGCTCGACAG AGGCGCTCAT 1260 CGCGCCGAAC GTATCCACCT GGAGCCTTCA TATCCCGACC AAAGGCACCT TCGACTCGCT 1320 CGCCCTCGTC GACGCTCCTC TAGCCCGTGC GCCCCTCGCA CAAGGCCAAG TCCGCGTCGC 1380 CGTGCACGCG GCAGGTCTCA ACTTCCGCGA TGTCCTCAAC ACCCTTGGCA TGCTTCCGGA 1440 CÄACGCGGGG CCGCTCGGCG GCGAAGGCGC GGGCATTGTC ACCGAAGTCG GCCCAGCTCT 1500 TTCCCGA.TA.C ACTGTAGGCG ACCGGGTGAT GGGCATCTTC 1. TTGGCCCCA.C 1560 GGTCGTCGCC GACGCCCGCA TGATCTGCCC CATCCCCGAT GCCTGGTCCT TCGTCCAAGC 1620 CGCCAGCGTC CCCGTCGTCT TTCTCACCGC CTACTATGGA. CTCGTCGATG TCGGGCATCT 1630 CAAGCCCAAT CAACGTGTCC TCATCCATGC GGCCGCAGGC GGCGTCGGIA CTGCCGCCGT 1740 CCAGCTCGCG CGCCACCTCG GCGCCGAAGT CTTCGCCACC GCCAGTCCSG GGAAGTGGGA 1800 CGCTCTGCGC GCGCTCGGCT TCGACGATGC GCACCTCGCG TCCTCACGTG ACCTGGAATT 1860 CGAGCAGCAT TTCCTGCGCT CCACACGAGG GCGCGGCATG GATCTCGTCC TCAÄCGCCTT 1920 GGCC-CGCGAG TTCGTCGACG CTTCGCTGCG TCTCCTGCCG AGCGCTGGAA GCTTTCTCGA 1980 GATG<jGCAAG ACGGATATCC GCGAGCCCGA CGCCGTAGGC CTCGCCTACC CCGGCGTCGT 2040 TTACCGCGCC TTCGATCTCT TGGAGGCTGG ACCGGATCGA ATTCAAGAGA TGCTCGCAGA 2100 GCTC-CTCGAC CTGTTCGÄGC GCGGCGTGCT TCGTCCGCCG CCCATCACGT CCTGGGACAT 2160 CCGGCATGCC CCCCAGGCGT TCCGCGCGCT CGCTCAGGCG CGGCATATTG GAAAGTTCGT 2220 CCTCACCGTT CCCGTCCCAT CGATCCCCGA AGGCACCATC CTCGTCACGG GAGGCACCGG 2280 CACGCTCGGC GCGCTCATCG CGCGCCACCT CGTCGCCAAT CGCGGCGACA AGCACCTGCT 2340 CCTCACCTCG CGAAAGGGTG CGAGCGCTCC GGGGGCCGAG GCATTGCGGA GCGAGCTCGA 2400 AGCTCTGGGG GCTGCGGTCA CGCTCGCCCG GTGCGACGCG GCCGATCCAC GCGCGCTCCA 2460 AGCCCTCTTG GACAGCATCC CGAGCGCTCA . CCCGCTCACG GCCGTCGTGC ACGCCGCCGG 2520 CGCCCTTGAC GATGGGCTGA TCAGCGACÄT GAGCCCCGAG CGCÄTCGACC GCGTCTTTGC 2580
    167
    TCCCAAGCTC GACGCCGCTT GGCACTTGCA TCAGCTCACC CAGGACAAGG CCGCTCGGGG 2640
    CTTCGTCCTC TTCTCGTCCG CCTCCGGCGT CCTCGGCGGT AIGGGTCAAT CCAACTAGGC 2700
    GGGGGGCAAT GCGTTCCTTG ACGCGCTCGC GCATCACCGA CGCGTCCAIG GGCTCCCAGG 2760
    CTCCTCGCTC GCATGGGGCC ATTGGGCCGA GCGCAGCGGA AIGACCCGAC AACCTCAGCG 2320
    GCGTCGATAC CGCTCGCATG AGGCGCGCGG TCTCCGATCC ATCC-CCTCGG ACGAGGGTCT 2380
    CGCCCTCTTC GATATGGCGC TCGGGCGCCC GGAC-CCCGCG CTGGTCCCCG CCCGCTTCGA . 2940
    CATGAÄCGCG CTCGGCGCGA AGC-CCGACGG GCľACCCTCG ATGTTCCAGG GľCTCGTCCG 3000
    CGCTCGCGTC GCGCGCAAGG TCGCCAGCAA TAATGCCCTG GCCGCGTCGC TCACCCAGCG 3060
    CCTCGCCTCC CTCCCGCCCA CCGACCGCGA GCC-CATGCTG CTCGATCTCG TCCGCGCCGA 3120
    AGCCGCCATC GTCCTCGGCC TCGCCTCGTT CGAATCGCTC GATCCCCGTC GCCCTCľTCA. 3130
    AGAGCTCGGT CTCGATTCCC TCATGGCCAT CGAGCTCCGA ÄATCGACTCG CCGCCGCCAC 3240
    AGGCTTGCGA CTCCAAGCCA CCCTCCTCTT CGACCACCCG ACGCCCGCCG CGCTCGCGAC 3300
    CCTGCTGCTC GGGAÄGCTCC TCCAC-CATGA AGCTGCCGAT CCTCGCCCCT TGGCCGCAGA. 3360
    GCTCGACAGG CTAGAGGCCA CTCTCTCCGC GATAGCCGTG GACGCTCAAG CACGCCCGAA 3420
    GATCATATTA CGCCTGCAAT CCTCGTTGTC GAAGTGGAGC GACGCTCAGG CTGCCGACGC ' 3480
    TGGACCGATT CTCGGCAAGG ATTTCAAGTC TGCTACGAAG GAAGAGCTCT TCGCTGCTTG 3540
    TGACGAAGCG TTCGGAGGCC TGGGTAÄATG AATAACGACG AGAAGCTTGT CTCCĽACCTA 3600
    CAGCAGGCGA TGAATGAGCT TCAGCGTGCĽ CATCAGCCCC TCCGCGCGGT CGAAGAGAAG 3660
    GAGCACGAGC CCATCGCCAT CGTGGCGATG AGCTGCCGCT TCCCGGGCGA CGTGCGCACG 3720
    CCCGAGGATC TCTGGAAGCT CTTGCTCGAT GGGAAAGATG CTATCTCCGA CCTTCCCCCA 3780
    AACCGTGGTT GGAAGCTCGA CGCGCTCGAC GTCCACGGTC GCTCCCCAGT CCGAGAGGGA 3840
    GGCTTCTTCT ACGACGCAGA CGCCTTCGAT CCGGCCTTCT TCGGGATCAG CCCACGCGAG 3900
    GCGCTCGCCA TCGATCCCCA GCAGCGGCTC CTCCTCGAGA TCTCATGGGA AGCCTTCGAG 3960
    CGTGCGGGCA TCGACCCTGC CTCGCTCCAA GGGAGCCAAA GCGGCGTCTT CGTCGGCGTG 4020
    ATACACAACG ACTACGACGC ATTGCTGGAG AACGCAGCTG GCGAACACAA AGGATTCGTT 4080
    TCCACCGGCA GCACAGCGAG CGTCGCCTCC GGCCGGATCG CGTATACATT CGGCTITCAA 4140
    GGGCCCGCCA TCAGCGTGGA CACGGCGTGC AGCTCCTCGC TCGTCGCGGT TCACCTCGCC 4200
    TGCCAGGCCC TGCGCGGTGG CGAATGCTCC CTGGCGCTCG CCGGCGGCGT GACCGTCATG 4260
    168
    GCCACGCCAG CAGTCTTCGT CGCSTTCGAT TCCGAGAGCG CGGGCGCCCC CGATGGTCGC 4320 TGCAAJGľCGT TCľCGGTGGA GGCCAACGGT TCGGGCTGGG CCGAGGGCGC CGGGATGCTC 4380 CTGCTCGAGC GCCTCTCCGA TGCCGTCCAA AACGGTCATC CCGTCCTCGC CGTCCTTCGA 4440 GGCTCCGCCG TCAACCAGGA CGGCCGGAGC CAAGGCCTCA CCGCGCCCAA TGGCCCTGCC 4500 CäAGAGCGCG TCÄTCCGGCA AGCGCTCGAC AGCGCGCGGC TCACTCCAAA GGACGTCGAC 4560 GTCGTCGAGG CTCACGGCAC GGGAACCACC CTCGGAGACC CCATCGAGGC ACAGGCCATT 4620 CTTGCCACCT ATGGCGA.GGC CCATTCCCAA GACAGACCCC TCTGC-CTTGG AAGTCTCAAG 4680 TCCAACCTGG GACATGCTCA GGCCGCGGCC GGCGTGGGAA GCGTCATCAA GATGGTGCTC 4740 GCGTTGCAGC AAGGCCTCTT GCCCAAGACC CICCATGCCC AGAATCCCTC CCCCCACATC 4800 GACTGGTCTC CGGGCACGGT AAAGCTCCTG ÄACGAGCCCG TCGTCTGGAC GACCÄACGGG 4860 CATCCTCGCC ACGCCGGCGT CTCCGCCTTC GGCATCTCCG GCACCAACGC CCACGTCATC 4920 CTCGAAGAGG CCCCCGCCAT CGCCCGGGľC GAGCCCGCAG CGTCACAGCC CGCGICCGAG 4980 CCGCTTCCCG CAGCGIGGCC CGIGCTCCTG TCGGCCAAGA GCGAGGCGGC CGTGCGCGCC 5040 caggcaaag: ggctccgcga ccacctcctc GCCAAÄAGCG AGCTCGCCCT CGCCGATGTG 5100 GCCTATTCGC TCGCGACCAC GCGCGCCCAC TTCGAGCAjGC GCGCCGCTCT CCTCGTCAAA 5160 GGCCGCGACG AGCTCCTCTC CGCCCTCGAT GCGCTGGCCC AAGGACATTC CGCCGCCGTG 5220 CTCGGACGAÄ gcggggcccc aggaaagctc gccgtcctct tcacggggca AGGAAGCCAG 5280 CGGCCCACCA TGGGCCGCGG CCTCTACGAC GTTTTCCCCG TCTTCCGGGA CGCCCTCGAC 5340 ACCGTCGGCG CCCACCTCCA CCGCGAGCTC GACCGCCCCC TGCGCGACGT CCTCTTCGCT 5400 CCCGACGGCT CCGAGCAGGC CGCGCGCCTC GAGCAAACCG CCTTCACCCA GCCGGCCCTG 5460 TTTGCCCTCG AAGTCGCCCT CTTTCAGCTT CTACAATCCT TCGGTCTGAA GCCCGCTCTC 5520 CTCCTCGGAC ACTCCATTGG CGAGCTCGTC GCCGCCCACG TCGCCGGCGT CCTTTCTCTC 5530 CAGGACGGCT GCACCCTCGT CGCCGCCCGC GCAAAGCTCA TGCAAGCGCT CCCACAAGGC 5640 GGCGCCATGG TCACCCTCCG AGCCTCCGAG GAGGAAGTCC GCGACCTTCT CCAGCCCTAC 57Ó0 GAAGGCCGAG CTAGCCTCGC CGCCCTCAAT GGGCCTCTCT CCACCGTCGT CGCTGGCGAT 5760 GAAGACGCGG TGGTGGAGAT CGCCCGCCAG GCCGAAGCCC TCGGACGAAA GACCACACGC 5820
    CTGCGCGTCA GCCACGCCTT CCATTCCCCG CACATGGACG GAATGCTCGA CGACTTCCGC 5880
    169
    CGCGTCGCCC AGAGCCTCAC CTACCATCCC GCACGCATCC CCATCATCIC CAACGTCACC 5940 GGCGCGCGCG CCACGGACCA CGAGCTCGCC TCGCCCGACT ACTGGGTCCG CCACGTTCGC 6000 CACACCGTCC GCTTCCTCGA CGGCGIACGT GCCCTTCACG CCGAAGGGGC ACGIGTCTTT 6060 CTCGAGCTCG GGCCTCACGC TGTCCTCTCC GCCCTTGCGC AAGACGCCCT CGGACAGGAC 6120 GAAGGCACGT CGCCA1GCGC citccttccc ACCCTCCGCA AGGGACGCGA CGACC-CCGAG 6180 GCGTTCACCG CCGCGCTCGG CGCTCICCAC TCCGCAGGCA TCACACCCGA CTGGAGCGCT 6240 TTCTTCGCCC CCITCGCTCC ACGCÄAGGTC TCCCTCCCCA CCTATGCCTT CCAGCGCGAG 6300 CGCTTCTGGC CCGAGGCCTC CAAGGCACCC GGCGCCGACG TCAGCCACCT TGCTCCGCTC 6360 GAGGGGGGGC TCTGGCAÄGC CATCGAGCGC GGGGACCTCG ATGCGCTCAG CGGTC-GCIC 6420 CACGTGGACG GCGACGAGCG GCGCGCCGCG CTCGCCCTGC TCCTTCCCAC CCTCTCGAGC 6480 TTTCGCCACG AGCGGCAAGA GCAGAGCACG GTCGACGCCT GGCGCTACCG TATCACCTGG 6540 AAGCCTCTGA CCACCGCCGA AACACCCGCC GACCTCGCCG GCACCTGGCT CGTCGTCGTG 6600 CCGGCCGCTC TGGACGACGA CGCGCTCCCC TCCGCGCTCA CCGAGGCGCT CACCCGGCGC 6660 GGCGCGCGCG TCCTCGCCTT GCGCCTGAC-C CAGGCCCACC TGGACCGCGA GGCTCTCGCC 6720 GAGCATCTGC GCCAGGCTTG CGCCGAGACC GCCCCGATTC GCGGCGTGCT CTCGCTCCTC 6780 GCCCTCGACG AGCGCCCCCT CGCAGACCCT CCTGCCCTGC CCGCCGGACT CGCCCTCTCG 6840 CTTTCTCTCG CTCAAGCCCT CGGCGÄCCTC GACCTCGAGG CGCCCTTGTG GTTCTTCACG 6900 CGCGGCGCCG TCTCCATTGG ACACTCTGAC CCCCTCGCCC ATCCCGCCCA GGCCATGACC 6960 TGGGGCTTGG GCCGCGTCAT CGGCCTCGAG CACCCCGACC TCTCGTCGAC 7020 GTCTGCGCTG GGGTCGACGA GAGCGCCGTG GGCCGCTTGC TGCCGGCCCT CGCCGAGCGC 7080 CACGACGAAG ACCAGCTCGC TCTCCGCCCG GCCGGACTCT ACGCTCGCCG CATCGTCCGC 7140 GCCCCGCTCG GCGATGCGCC TCCCGCGCGC GACTTCACGC CCGGAGGCAC CATTCTCATC 7200 ACCGGCGGCA CCGGCGCCAT TGGCGCTCAC GTCGCCCGAT GGCTCGCTCG AAGAGGCGCT 7260 CAGCACCTCG TCCTCATCAG CCGCCGAGGC GCCGAGGCCC CTGGCGCCTC GGAGCTCCAC 7320 GACGAGCTCT CGGCCCTCGG CGCGCGCACC ACCCTCGCCG CGTGCGATGT CGCCGACCGG 7380 AATGCTCTCG CCACGCTTCT TGAGCÄGCTC GACGCCGAAG GGTCGCAGGT CCGCGCCGTG 7440 TTCCACGCGA GCGGCATCGA ACACCACGCT CCGCTCGACG CCACCTCTTT CAGGGATCTC 7500
    GCCGAGGTTG TCTCCGGCAA GGTCGAAGCT GCAAAGCÄCC TCCACGACCT GCTCGGCTCT 7560
    170
    CGACCCCTCG aCGCCitig r TCrcrrrrcG TCCGGCGCGG CCGTCIGGGG CGGCGGACAG 7620 CAAGGCGGCT ACGCGGCCGC AAACGCCTTC CTCGACGCCC TTGCCGAGCA TCGGCGCAGC . 7630 GCTGGATTGA CAGCGACGTC GGTGGCCTGG GGCGCGTGGG GCGGCGGCGG CATGGCCACC 7740 GATCAGGCGG CÄGCCCACCT CCAACAC-CGC GCTCTCTCGC GGATGGCCCC CTCGCTIGCC 7800 CTGGCGGCGC TCGCGCTGGC TCTGGAGCAC GACGAGACCA CCGTCACCGT CGCCGACATC 7860 GACTGGGCGC GCTTTGCGCC TTCGTTCAGC GCCGCTCGCC CCCGCCCGCT CCTGCGCGAT 7920 TTGCCCGAGG CGCAGCGCGC TCTCGAGACC AGCGAAGGCG CGTCCTCCGA GCATGGCCCG 7980 GCCCCCGACC TCCTCGACAA. GCTCCGGAGC CGCTCGGAGA GCGAGCAGCI TCGICTGCTC 8040 GTCTCGCTGG TGCGCCACGA. GACGGCCCTC GTCCTCGGCC ACGAÄGGCGC CTCCCATGTC 8100 GACCCCGACA AGGGCTTCCT CGATCTCC-CT CTCGATTCGC TCATGGCCGT CGAGCTTCGC 8160 CGGCGCTTGC AACAGGCCAC CGGCATCAÄG CTCCCGGCCA CCCTCGCCTT CGACCATCCC 8220 TCTCCTCATC GAGICGCGCT CTTCTTGCGC GACTCGCTCG CCCACGCCCT CGGCACGAGG 8280 CTCTCCGTCG AGCCCGACGC CGCCGCGCTC CCGGCGCTTC GCGCCGCGAG CGACGAGCCC 8340 ATCGCCATCG TCGGCATGGC CCTCCGCCTG CCC-GGCGGCG TCGGCGATGT CGACGCTCTT 8400 TGGGAGTTCC TGGCCCAGGG ACGCGACGGC GTCGAGCCCA TTCCÄAAGGC CCGATGGGAT 8460 GCCGCTGCGC TCĽACGACCC CGACCCCGAC GCCAAGACCA AGAGCTACGT CCGGCATGCC 8520 GCCATGCTCG ACCAGCTCGA CCTCTTCGAC CCTGCCTTCT TTGGCATCAG CCCCCGGGAG 8580 GCCAAACACC TCGACCCCCA GCACCGCCTG CTCCTCGAAT CTGCCTGGCA GGCCCTCGAA 8640 GACGCCGGCA TCGTCCCCCC CACCCTCAAG GATTCCCCCA CCGGCGTCTT CGTCGGCATC 8700 GGCC-CCAGCG AATACGCATT GCGAGAGGCG AGCACCGAAG ATTCCGACGC TTATGCCCTC 8760 CAAGGCACCG CCGGGTCCTT TGCCGCGGGG CGCTTGGCCT ACACC-CTCGG CCTGCAAGGG 8820 CCCGCGCICT CGCTCGACAC CGCCTGCTCC TCCTCGCTCG TCGCCCTCCA CCTCGCCTGC 8880 CAAGCCCTCC GA.CAGGGCGA CTGCAACCTC GCCCTCGCCG CGGGCGTCTC CGTCATGGCC 8940 TCCCCCGAGG GCTTCCTCCT CCTTTCCCGC CTGCGCGCCT TGGCGCCCGA CGGCCGCTCC 9000 AAGACCTTCr CGGCCAACGC CGACGGCTAC GGACGCGGAG AAGGCGTCAT CGTCCTTGCC 9060 CTCGAGCGGC TCGCTGACGC CCTCC-CCCGA GGACACCGCG TCCTCGCCCT CGTCCGCGC-C 9120
    ACCGCCATCA ACCACGACGG CGCGTCGAGC GGIATCACCG CCCCCAACGG CACCTCCCAG 9180
    171 .
    CAGAAGGTCC TCCGCGCCGC GCTCCACGAC
    GTCGAGTGCC ATGGCACGGG CACCTCCTTG
    GGCGTCľACG CCGACGGCAG SCCCGCTGAA
    AACATCGGCC ATCTCGAGGC CGCCTCCGGC
    CTCCGCCATG ACGCCCTGCC CCCCACCCTC
    TGGGAEACAC TCGCCATCGA CGľCGTTGAT
    AGCAGICCCC GCCGCGCCGG CGTCTCCGGC
    ÄTCCTCGAGG AGGCTCCCGC CGCCCTGTCG
    CGACCGCTCC CCGCGGCGTG TGGCGTGCTC
    GCCCAGGCGA AGCGGCTCCG CGACCACCTC
    GTGGGCTATľ CGCAGGCC3C CACCCGCGCC
    CGCGACCGGG ACGAGCTCCT CľCCGCGGTC
    AGCACCGTTC TCGGCCGGAG CGGAAGCCAC
    GGCTCGCAGT GGGAAGGGAT GGCCCTCTCC
    CAGCTCGAAG CATGCGAGCG CGCGCTCGCT
    CTGCGCCGGG ACGAGGGCGC CCCCTCCCTC
    TTTGCCCTCA TGGTCTCCCT C-GCCGCCCTC
    GTCGTCGGCC ACAGCCAGGG CGAGAICGCC
    GAGGACGCGG CGCGCAICGC CGCCCTGCGC
    GGCGGCATGG CCGCCGTCGA GCTCGGCGCC
    GGCGACAGGC TCTCCACCGC CGCCGTCAAC
    CCCGCCGCCG TCGACGCGCT GCTCGACGTC
    ATCCGCGTCG ACTACGCCTC CCACTCCGCC
    GCAGGTCTAG CCAACATCGC TCCTCGGACG
    GGCACCAGGC TCGACGGCTC CGAGCTCGAC
    ACCGTCCTGT TCTCGAGCGC GACCGAGCGG
    GAGGTCAGCC CCCATCCCCT GCTCACGCTC
    GCCCGCATCA CCCCCGCCGA CGTCGACGTC
    GGAGACCCCA TCGAGGTGCA AGCCCTGGCC
    AAGCCTCTCC TTCTCGGCGC GCTCAAGACC
    CTCGCGGGCG TCGCCAAGAT CGTCGCCTCC
    CACACGGGCC CGCGCAATCC CTTGATTGAT
    ACCCCGAGGT CTTGGGCCCG CCACGAAGAT
    TTCGGACTCT CCGGCACCAA CGCCCACGTC
    GGCGAGCCCG CCACCTCACA GACGGCGTCG
    CTCTCGGCCA GGAGCGAGGC CGCCGTCCGC
    CTCGCCCACG' ACGACCTCGC CCTTATCGAT cacttcgagc äccgcgccgc tctcctggcc
    GACTCGCTCG CCCAGGACAA GCCCGCCCCG
    GGCAAGGTCG TCTTCGTCTT TCCTGGGCAA
    CTGCTCGACT CCTCGCCGGT CTTCCGCGCT
    CCTCACGTCG AGTGGAGCCT GCTCGCCGTC
    GACCGCGTCG ACGTCGTACA GCCCGCCCTC
    TGGCGCTCGC TCC-C-CGTCGA GCCCGCCGCC
    GCCGCCTTCG TCGCAGGCGC TCTCTCCCTC
    AGGAAAGCGC TCACCACCGT CGGCGGCAAC
    TCCGACCTCC AGACCTAGCT CGCTCCCTGG
    AGCCCCAGGG CTACCCTCGT ATCCGGCGAG
    CTCACCGCCA CCAAGGTGTT CGCCCGCAAG
    CAGATGGACG CCGTCCAAGA CGAGCTCGCC
    TGCGAGCTCC CTCTTTATTC GACCGTCACC
    GGCGCGTACT GCTAICGAAA CCTCCGGCAA
    CTCCTCGACG ATGGGCATCG CTTCTCCGTC
    GCCCTCCGCG AGACCTGCGA GCGCTCACCG
    9240
    9300
    9360
    9420
    9480
    9540
    9600
    9660
    9720
    9780
    9840
    9900
    9960
    10020
    10080
    10140
    10200
    10260
    10320
    10380
    10440
    10500
    10560
    10620
    10680
    10740
    10800
    CTCGATCCCG TCCTCCTCGG CTCCATTCGA CGAGAAGAAG GCCACCTCGC CCGCCTGCTC 10 8 60
    172
    CTCTCCTGGG CGGAGCTCTC TACCCGAGGC CTCGCGCTCG ACTGGAAGGA CTTCTTCGCG 10920 CCCTACGCTC CCCGCAAGGT CTCCCTCCCC ACCTACCCCT TCCAGCGAGA GCGGTTCTGG 10980 CTCGACGTCT CCACGGACGA ACGCTTCCGA CGTCGCCTCC GCAGGCCTGA CCTCGGCCGA 11040 CCAATCCCGC TGCTCGGCGC CGCCGTCGCC TTCGCCGACC GCGGTGGCTT TCTCTTTACA 11100 GGGCGC-CTCT CCCTCGCAGA GCACCCGTGG CTCGAAGGCC ATGCCGTCTT CGGCACACCC 11160 ATCCTACCGG GCACCGGCTT TCTCGAGCTC GCCCTGCACG TCGCCCACCG CGTCGGCCTC 11220 GACACCGTCG AAGAGCTCAC GCTCGAGGCC CCICTCGCTC TCCCAICGCA GGACACCGTC 11280 CTCCTCCAGA TCTCCGICGG GCCCGTGGÄC GACGCAGGAC GAAGGGCGCI CTCTTTCCAT 11340 AGCCGACAAG AGGACGCGCT TCAGGATGGC CCCTGGACTC GCCACC-CCAG CGGCTCTCTC 11400 TCGCCGGCGA CCCCATCCCT CTCCGCCGAT CTCCACGAGT GGCCTCCCTC GAGTGCCATC 11460 CCGGTC-GACC TCGAAGGCCT CTACGCAACC CTCGCCAACC TCGGGCTTGC CTACC-GCCCC 11520 GAGTTCCAGG GCCTCCGCTC CGTCTACAAG CGCGGCGACG AGCTCTTTGC CGAAC-CCAAG 11580 CTCCCGGAAG CGGCCGAAAA GGATC-CCGCC CGGTTTGCCC TCCACCCTGC GCTC-CTCGAC 11640 AGCGCCCTGC ATGCACTGGC CTTTGAGGAC GAGCAGAGAG GGACGGICGC TCIGCCCTTC 11700 TCGTGGAGCG GAGTCTCGCT GCGCTCCGTC GGTGCCACCA CCTTGCGCGT GCGCTTCCAC 11760 CGTCCCAAGG GTGAATCCTC CGTCTCGATC GTCCTGGCCG ACGCCGCAGG TGACCCTCTT 11820 GCCTCGGTGC AAGCGCTCGC CATGCGGACG ACGTCCGCCG CGCAGCTCCG CACCCCGGCA 11880 GCTTCCCACC ATGATGCGCT CTTCCGCGTC GACTGGAGCG AGCTCCAAAG CCCCACTTCA 11940 CCGCCTGCCG CCCCGAGCGG CGTCCTTCTC GGCACAGGCG GCCACGATCT CGCGCTCGAC 12000 GCCCCGCTCG CCCGCTACGC CGACCTCGCT GCCCTCCGAA GCGCCCTCGA CCAGGGCGCT 12060 TCGCCTCCCG GCCTCGTCGT CGCCCCCTTC ATCGATCGAC CGGCAGC-CGA CCTCGTCCCG 12120
    AGCGCCCACG AGGCCACCGC GCTCGCACTC GCCCTCTTGC AAGCCTGGCT CGCCGACGAA 12180
    CGCCTCGCCT CGTCGCGCCT CGTCCTCGTC ACCCGACGCG GCGTCGCCAC CCACACCGAA 12240
    GACGACGTCA AGGACCTCGC TCACGCGCCG CTCTGGGGGC TCGCGCGCTC CGCGCAAAGT 12300
    GAGCACCCAG ACCTCCCGCT CTTCCTCGTC GACATCGACC TCAGCGAGGC CTCCCAGCAG 12360
    GCCCTGCTAG GCGCC-CTCGA CACAGGAGAA CGCCAGCTCG CCCTCCGCAA CGGGAAACCC 12420
    CTCATCCCGA GGTTGGCGCA ACCACGCTCG ACGGACGCGC TCATCCCGCC GCAAGCACCC 12480
    173
    ACGTGGCGCC TCCATATTCC GACCAAAGGC ACCTTCGACG CGCTCGCCCT CGTCGACGCC 12540 CCCGAGGCCC AGGCGCCCCT CGCACACGGC CAAGTCCGCA TCGCCGTGCA CGCGGCAGGG 12600 CTCAACTTCC GCGATGTCGT CGACÄCCCTT GGCAIGTATC CGGGCGACGC GCCGCCGCTC 12660 GGAGGCGAAG GCGCGGGCAT CGTTACTGAA GTCGGTCCAG GTGTCTCCCG ATACACCGTA 12720 GGCGACCGGG TGATGGGGGT CTTCGGCGCA GCCTTTGGTC CCACGGCCAT CGCCGACGCC 12780 CGCATGATCT GCCCCATCCC CCACGCCTGG TCCTTCGCCC AAGCCGCCAG CGTCCCGATC 12840 ATCTATCTCA CCGCCTACTA TGGACTCGTC GATCTCGGGC ÄTCTGAAACC CAATCAACGľ 12300 GTCCTCATCC ATGCGGCCGC CGGCGGCGTC GGGACGGCCG CCGTTCAGCľ CGCACGCCAC 12360 CTCGGCGCCG AGGICTTTGC CACCGCCAGľ CCAGGGAAGT GGAGCGCICT CCGCC-CGCTC 13020 GGCTTCGACG ATGCGCACCT CGCGTCCTCA CGTGACCTGG GCTTCGAGCA GCACTTCCTG 13080 CGCTCCACGC ATGGGCGCGG CATGGATGTC GTCCTCGACT GTCTGGCACG CGAGTTCGTC 13140 GACGCCTCGC TGCGCCTCAT GCCGAGCGGT GGACGCTTCA TCGAGATGGG AAAGACGGAC 13200 ATCCGTGAC-C CCGACGCGAT CGGCCTCC-CC TACCCTGGCG TCGTTTACCG CGCCTTCGAC 13260 GTCACAGAGG CCGGACCGGA TCGAATTGGG CAGATGCTCG CAGAGCTGCT CAGCCTCTTC 13320 GAGCGCGGTG TGCTTCGTCT GCCACCCATC ACATCCTGGG ACATCCGICA TGCCCCCCAG 13380 GCCTTCCGCG CGCTCGCCCA GGCGCGGCAI GTTGGGAA.GT TCGTCCICAC CAITCCCCGT 13440 CCGATCGATC CCGAGGGGAC CGTCCTCATC ACGGGAGGCA CCGGGACGCT AGGAGTCCTG 13500 GTCGCACGCC ACCTCGTCGC GAAACACAGC GCCAAACACC TGCTCCTCAC CTCGAGGAAG 13560 GGCGCGCGTG CTCCGGGCGC GGAGGCTCTG CGAAGCGAGC TCGAAGCGCT GGGGGCCTCG 13620 GTCACCCTCG TCGCGTGCGA CGTGGCCGAC CCACGCGCCC TCCGGACCCT CCTGGACAGC 13680 ATCCCGAC-GG ATCATCCGAT CACGGCCGTC GTGCACGCCG CCGGCGCCCT CGACGACGGG 13740 CCGCTCGGTA GCATGAGCGC CGAGCGCATC GCTCGCGTCT TTGACCCCAA GCTCGATGCC 13800 GCTTGGTACT TGCATGAGCT CACCCAGGAC GAGCCGGTCG CGGCCTTCGT CCTCTTCTCG 13860 GCCGCCTCCG GCGTCCTTGG TGGTCCAGGT CAGTCGAACT ACGCCGCTGC CAATGCCTTC 13320 CTCGATGCGC TCGCACATCA CCGGCGCGCC CAAGGACTCC CAGCCGCTTC : GCTCGCCTGG 13980 GGCTACTGGG : CCGAGCGCAG TGGGATGACC CGGCACCTCA . GCGCCGCCGA . CGCCGCTCGC 14040 ATGAGGCGCG i CCGGCGTCCG GCCCCTCGAC : ACTGACGAGG : CGCTCTCCCT ' CTTCGATGTG 14100
    GCTCTCTTGC GACCCGAGCC CGCTCTGGTC CCCGCCCCCT TCGACTACAA CG1GCTCAGC 14160
    174
    ACGAGTGCCG ACGGCGZGCC CCCGCTGTľC
    ÄAGGCCGCCA GOÄ3SCTGC CCTCGCCTCG
    CCCGCCGAAC GCGAGCGCGT CCTCCTCGAT
    GGCCTCGCCT CGTTCGAATC GCTCGATCCC
    TCCCICATGG CCCTCGAGCT CCGAAATCGA
    GCTACTCTCC TCTTCGACTA TCCAACCCCG
    CTCTTCGGGG GAACCACCCA CCGCCCCGGC
    CCTATCGCCA TCGTGGCGAT GAGCTGCCGC
    CTCTGGAAGC TCTTGCTCGA CGGACAAGAT
    TGGAGTCTCG AľGCGCTCGA CGCCCCCGGT
    TACGACC-CAG ACGCCTTCGA TCCGGCCTTC
    GTTGATCCCC AACAGCGCAT TTTGCTCGAG
    ATCGACCCGG CCTCCCTCCA ÄGGAÄGCCAA
    GACTACCAAT GCATCGCTGG TGAftCGCGAC
    AGCGCAGCGC GICCGTCCGG CCGftATCGCA
    AGCGIGGAGA CGGCGTGCAG CTTCCTCGTC
    CACGGCGftAT ACTCCCTGGC GCTCGCTGGC
    TTCATCGCGT TCGACTCCGA GAGCGCGGGT
    CCGGAAGCCG ACGGTTCGGG CTGGGCCGAA
    TCCGATGCCG TCCAÄAACGG TCATCCCGTC
    CAGGACGGCC GGAGCCAAGG CCTCACCGCG CGGCAAGCGC TCGACAGCGC GCGGCTCACT
    GGCACGGGAA CCACCCTCGG AGACCCCATC
    GAGGCCCATT CCCAAGACAG ACCCCTCTGG
    ACTCAGGCCG CGGCCGGCGT CGGCGGCATC
    CTCTTGCCCA AGACCCTCCA TGCCCAGAAT
    CAGCGTCTCG TCCGCGCTCG CATCGCGCGC
    TCGCTTGCAG AGCACCTCTC CTCCCTCCCG
    CTCGICCGCA CCGAAGCCGC CTCCGTCCTC
    CATCGCCCTC TACAAGAGCT CGGCCTCGAT
    CTCGCCGCCG CCGCCGGGCT GCGGCTCCAG
    ACTGCGCTCT CACGCTTTTT CACGACGCAT
    GTACCGCTCA CCCCGGGGGG GAGCGAAGAC
    TTCCCGGGCG AjCGTGCGCAC GCCCGAGGAT
    GCCATCTCCG GCTTTCCCCA AÄATCGCGGC
    CGCTTCCCAG TCCGGGAGGG GGGCTTCGTC
    TTCGGGAICA GICCACGTGA AGCGCTCGCC
    ATCACATGGG AAGCCTTCGA GCGTGCAGGC
    AGCGGGGTCT TCGTTGGCGT ATGGCAGAGC
    TGGCGAATAC AAGGACTCGT TGCCACCGGT
    TACACGTTCG GACTTCAÄGG GCCCGCCATC
    GCGGTTCACC TCGCCTGCCA GGCCCCCCCC
    GGCGTGACCA TCATGGCCAC GCCAGCCATA
    GCCCCCGACG GTCGCTGCAA GGCCTTCTCG
    GGCGCCGGGA TGCTCCTGCT CGAGCGCCTC
    CTCGCCGTCC TTCGAGGCTC CGCCGTCAAC
    CCCAATGGCC CTGCCCAGGA GCGCGTCATC CCÄAAGGACG TCGACGTCGT CGAGGCTCAC
    GAGGCACAGG CCGTTTTTGC CACCTATCGC
    CTTGGAAGCC TCAAGTCCAA CCTGGGACAT
    ATCAAGATGG TGCTCGCGTT GCAGCACGGT
    CCCTCCCCCC ACATCGACTG GTCTCCAGGC
    14220
    14280
    14340
    14400
    14460
    14520
    14580
    14640
    14700
    14760
    14820
    14880
    14940
    15000
    15060
    15120
    15180
    15240
    15300
    15360
    15420
    15480
    15540
    15600
    15660
    15720
    ATCGTAAAGC TCCTGAACGA GGCCGTCGCC TCGACGACCA GCGGACATCC TCGCCGCGCC 15780
    175
    GGTGTTTCCT CGTTCGGCGT CTCCGGCACC AACGCCCATG TCATCCTCGA AGAGGCTCCC 15840 GCCGCCACGC GGGCCGAGTC AGGCGCTTCA CAGCCTGCAT CGCAGCCGCT CCCCGCGGCG 15900 TGGCCCCTCG TCCTGTCGGC CAGGAGCGAG GCCGCCGTCC GCGCCCAGGC TCAAAGGCTC 15960 CGCGAGCACC TGCTCGCCCA AGGCGACCTC ACCCTCGCCG ATGTGGCCTA TTCGCTGGCC 16020 ACCACCCGCG CCCACTTCGA GCACCGCGCC GCTCTCGTAG CCCACGACCG CGACGAGCTC 16080 CICTCCGCGC TCGACTCGCT CGCCCAGGAC AAGCCCGCAC CGAGCACCGT CCTCC-GACGG 16140 AGCGGAAGCC ACGGCAAGGT CGTCTTCGTC TTTCCTGGGC AAGGCTCGCA GTGGGAAGGG 16200 ATCGCCCTCT CCCTGCTCGA CTCCTCGCCC CTCTTCCGCA CACAGCTCGA AGCATGCGAG 16260 CGCGCGCTCC GTCCTCACGT CGAGTGGAGC CTGCTCGCCG TCCTGCGCCG CGACGAGGGC 16320 gccccctccc TCGACCGCGT CGACGTCGTG CAGCCCGCCC TCTTIGCCGT CATGGTCTCC. 16380 CTGGCCGCCC TCTGGCGCTC GCTCGGCGTC GAC-CCCGCCG CCGTCGTCGG CCACAGCCAG 16440 GGCGAGATAS CCGCCGCCTT CGTCGCAGGC GCTCTCTCCC TCGAGGACGC GGCCCGCATC 16500 GCCGCCCIGC GCAGCAAAGC GTCACCACCG TCGCCGGCAA CGGGCATGGC CGCCGTCGAG 16560 CTCGGCGCCT ccgacctcca GACCTACCTC GCTCCCTGGG GCGACAGGCT CTCCATCGCC 16620 GCCGTCAACA GCCCCAGGGC CACGCICGTA TCCGGCGAGC CCGCCGCCGT CGACGCGCIG , 16680 ATCGACTCGC TCACCGCAGC GCAGGTCTTC GCCCGAAGAG TCCGCGTCGA CTACGCCTCC 16740 cactcagccc: AGATGGACGC CGTCCAAGAC GAGCTCGCCG CAGGTCTAGC CAACATCGCT 16800 CCTCGGACGT GCGAGCTCCC TCTTTATTCG ACCGTCACCG GCACCAGGCT CGACGGCTCC 16360 GAGCTCGACG GCGCGTACTG GTATCGAAAC CTCCGGCAAA CCGTCCTGTT CTCGAGCGCG 16920 ACCGAGCGGC TCCTCGACGA TGGGCATCGC TTCTTCGTCG AGGTCAGCCC TCATCCCGTG 16980 CTCACGCTCG CCCTCCGCGA GACCTGCGAG CGCTCACCGC TCGATCCCGT CGTCGTCGGC 17040 TCCATTCGAC GCGACGAAGG CCACCTCCCC CGTCTCCTTG CTCTCTTGGG CCGAGCTCTA 17100 TGGCCGGGCC TCACGCCCGA GTGGAAGGCC ITCTTCGCGC CCTTCGCTCC CCGCAAGGTC 17160 TCACTCCCCA CCTACGCCTT CCAGCGCGAG CGTTTCTGGC TCGACGCCCC CAACGCACAC 17220 CCCGAAGGCG TCGCTCCCGC TGCGCCGATC GATGGGCGGT TTTGGCAAGC CATCGAACGC 17280 GGGGACCTCG ACGCGCTCAG CGGCCAGCTC CACGCGGACG GCGACGAGCA GCGCGCCGCC 17340 CICGCCCTGC TCCTTCCCAC . CCTCTCGAGC TTTCACCACC AGCGCCAAGA GCAGAGCACG 17400 GTCGACACCT GGCGCTACCG CATCACGTGG AGGCCTCTGA CCACCGCCGC CACGCCCGCC 17460
    176
    GACCTCGCCG GCACCTGGCT
    GCCACGCTCA. CCGATGCGCT
    CAGGTTCACA TAGGCCGCGC
    GCCCCGATTC GCGGCGTGCT
    GCCGCCCTGC CCGCC-GGCCT
    GCCCTCGAGG CTCCCTTGTG
    CCACTCGCCC ATCCCACCCA
    CACCCCGAGC GGTGGGGCGG
    GGCCGCTTGC TCCCGGCCCT
    GCCGGCCTCI ACGCÄCGCCG
    GGCTTCATGC CCCGAGGCAC
    GTCGCCCGAT GGCTCGCTCG
    GCCCAGGCCG AAGGCGCCGT
    ACCTTCGCCG CGTGCGATGT
    GACGCCGGAG GGCCACAGGT
    CCGCTCGCCG CCACCTCCAT
    GCAAGACACC TCCACGACCT
    TCCGGCGCGG TCGTCTGGGG
    CTCGATGCCC TGGCCGAGCA
    GGCGTGTGGG GCGGCGGCGG
    GGTCTGTCGC CGATGGCCCC GACGAGACCA CCCTCACCGT
    GCCGCTCGCľ CCCGCCCGCT
    AGCGCCGATG CGTCCTCCGA
    CGCTCGGAGA GCGAGCAGAT
    GTCCTGGGCC ATACCGACGC
    CCTCGTCGTG CCGTCCGCGC
    TACCCGGCGC GGCGCGCCTG
    GGCICTCACC GAGCACCTGC
    CTCCCTCCTC GCCCTCGACG
    TGCCCTCTCG CTCGCCCTCG
    GCTCTTCACG CGCGGCGCCG
    GGCCATGATC TGGGGCTTGG
    GCTCGTCGAC CTCC-GCGCAG
    CGCCCAGCGC CACGACGAAG
    CTTCGTCCGC GCCCCGCTCG
    CÄTCCTCATC ACCGGTGGTA
    AÄAAGGCGCT GAGCACCTCG
    GGAGCTCCAC GCCGAGCTCA
    CGCCGACAGG AGCGCTGTCG
    GAGCGCCGTG TTCCACGCGG
    GGAGGATCTC GCCGAGGTTG
    GCTCGGCTCT CGACCCCTCG
    CGC-CGGACAA CAAGGCGGCT
    GCGGCGCAGC CTTGGGCTGA
    CATGGCTACC GC-GCTCCTGG
    CTCGCTGGCC GTGGCGACGC CGCCGACATC GACTGGGCGC
    CCTGCGCGAT TTGCCCGAGG
    GCAAGACGC-G GCCACAGGCC
    CCACCTGCTC TCCTCGCTGG
    CTCCCAGGTC GACCCCCACA
    TCGGCGACGA CGCGCTCCCT
    TCCTCGCGCT GCGCCTGAGC
    GCGAGGCTGT TGCCGAGACT
    AGCGCCCCCT CGCGGACCAT
    TCCAAGCCCT CGGCGACCIC
    TCTCGATTC-G ACACTCCGAC
    GCCGCGTCGT CGGCCTCGAG
    CGCTCGACGC GAGCGCCGCA
    ACCAGCTCGC GCTGCGCCCG
    GCGATGCGCC TGCCGCTCGC
    CCGGCGCCAT TGGCGCTCAC
    TCCTCAICAG CCGACGAGGG
    CCGCCCTCGG CGCGCGCGTC
    CCACGCTTCT CGAGQ.GCTC
    GCGGCATCGA GCCCCACGCT
    TCTCCGGCAA GGTACAAGGT
    ACGCCTTTGT TCTCTTCTCG
    ATGCCGCTGC GAACGCCTTC
    CGGCGACÄTC GGTGGCCTGG
    CAGCCCAGCT AGAGCAACGC
    TCGCGCTGGC GCTGGAGCAC GCTTTGCGCC TTCGITCAGC
    CGCAGCGCGC TCICGAAGCC
    TCCTCGACAA GCTCCGAAAC
    TGCGCCACGA AGCGGCCCTC
    AGGGCľTCÄT GGACCTCGGC
    17520
    17530
    17640
    17700
    17760
    17820
    17880
    17940
    18000
    18060
    18120
    18180
    18240
    18300
    18360
    18420
    18480
    18540
    18600
    18660
    18720
    18780
    18840
    18900
    13960
    13020
    CTCGATTCGC TCATGACCGT CGAGCTTCGT CGGCGCTTGC AGCÄGGCCAC CGGCATCAAG 19080
    177
    CTCCCGGCCA CCCTCGCCTT CGACCATCCC
    GACTCGCTCG CCCACGCCCT CGGCGCGAGG
    CCGGCGCTTC GCTCGGCGAG CGACGAGCCC
    CCGGGCGGCA TCGGCGATGťT CGACGCTCTT
    GTCGAGCCCA TICCCCATGC CCGATGGGAT
    GCCAAGGCCA AGAGCTACGT CCGGCATGCC
    CCTGCCTTCT TTGGCATCAG CCCTCGCGAG
    CTCCTCGAAT CTGCCTGGCT GGCCCTCGAG
    GATICICCCA CCGGCGTCIT CGICGGCATC
    AGCTCCGAAG AGGTCGAAGC GTATGCCCTC
    CGCTTGGCCT ACACGCTCGG CCTGCAAGGG
    TCCTCGCTCG TCGCCCTCCÄ CCTCGCCTGC
    GCCCTCGCCG CGGGCGTCTC CGTCATGGCC
    ATGCGTGCTT TGGCGCCCGA TGGCCGCTCC
    GGACGCGGAG AGGGCGTCGT CGTCCTTGCC
    GGACACCGCG TCCTCGCCCT CGTCCGCGGC
    GGCATCACCG CCCCCAATGG CACCTCCCAC
    GCCCATATCG GCCCTGCCGA CGTCGACGTC
    GGAGACCCCA TCGAGGTGCA AGCCCTGGCC
    AAGCCTCTCC TICTCGGCGC ACTCAAGACC
    CTCGCGGGCG TCGCCAAGAT CGTCGCCTCC
    CACACGACCC CGCGCAATCC CCTGATCGAG
    GCCACGAGGG: CGTGGGCCCG CCACGAAGAT
    TTCGGACTCT CCGGCACCAA CGCCCACGTT
    GCCGAGCCCA CCGCGGCACA GCICGCGTCG
    CTGTCGGCCA GGAGCGAGCC GGCCGTGCGC
    CTCGCCCACG ACGACCTCGC CCTGGCCGAT
    ACCTTCGAGC. ACCGIGCCGC TCTCGTGGTC
    TCTCCICÄTC GCGTCGCGCT CTTCTTGCGC
    CTCTCCGTCG AGCGCGACGC CGCCGCGCTC
    ATCGCCATCG TCGGCATGGC CCTCCGCTTG
    TGGGAGTTCC TCGCCCAAGG ACGCGACGCC
    GCCGGTGCCC TCTACGACCC CGACGCCGAC
    GCCATGCTCG ACCAGGTCGA CCTCTTCGAT
    GCCAAAIACC TCGACCCCCA GCACCGCCTG
    GACGCCGGCA TCGTCCCCTC CACCCTCÄAG
    GGCGCCAGCG AATACGCACT GCGAAACACG
    CAAGGCACCG CCGGGTCCTT TGCCGCGGGG
    CCCGCGCTCT CGGTCGACAC CGCCTGCTCC
    CAAGCCCTCC GACAGGGCGA GTGCAACCTC
    TCCCCCGGGC TCTTCGĽCGT CCTTTCCCGC
    AAGACCTTCT CGACCÄACGC CGACGGCTAC
    CTCGAGCGGC TCGGCGACGC CCTCGCCCGA
    ACCGCCATGA ACCATGACGG CGCGTCGAGC
    CAGAAGGTCC TCCGCGCCGC GCTCCACGAC
    GĽCGAATGCC ATGGCACCGG CACCTCCTTG
    GCCGTCTACG CCGATGGCAG ACCCGCTGAA
    AACATTGGCC ATCTCGAGGC CGCCTCCGGC
    CTCCGCCATG ACGCCCTGCC CCCCACCCTC
    TGGGATGCGC TCGCCATCGA CGĽCGTCGAT GGCAGTCCCC GCCGCGCCGG CGTCTCCGCC
    ÄTCCTCGAAG AGGCTCCCGC GATCCCGCAG
    CAGCCGCTTC CCGCAGCCTG GCCCGTGCTC
    GCCCAGGCCC AGAGGCTCCG CGACCACCTC
    GIAGCCTACT CGCTCGCCAC CACCCGGGCT
    CACGACCGCG AAGAGCTCCT CTCCGCGCTC
    19140
    19200
    19260
    19320
    19380
    19440
    19500
    19560
    19620
    19680
    19740
    19800
    19860
    19920
    19980
    20040
    20100
    20160
    20220
    20280
    20340
    20400
    20460
    20520
    20580
    20640
    20700
    20760
    178
    GAITCGCTCG CCCAGGGAAG
    GGCAAGGTCG TCTTCGTCTT
    CTGCTCGATA CCTCGCCGGT
    CCCCACGľGG ACľGGTCGCT
    GACCGGGTCG ACGTGGTCCA
    TGGCGCTCCA TGGC-CGTCGA
    GCGGCCTGTG TGGCGGGCGC
    AGCCGTGCGC TCGTGGAGCT
    GCCGAGGTCG CACGGCGCCT
    AGCCCTCGTT TCACGACGAT
    CTGGAGTCCG AGGGCGICTT
    CAGGTCGAGT CGATTCGCGA
    ACGGCGGICC CGTTCľACTC
    GCCGCCTACT GGTACCGGAA
    CTCCTTGCCG GAGAACATCG
    GCCTTGCACG AGCTCCTCGA
    AGCGACGAAG GGGATCTACG
    TTCGCCCTGG ATTGGACGAC
    CCCTTCCAC-C GCGAGCGCTT
    CACCTTGCTC CGCTCGAGGG
    CTCAGCGGCC AGCTCCACGT
    CCCACCCTCG CGAGCTTTCG
    TACCGCATCA CGTGGAAGCC
    TGGCTCCTCG TCGTGCCGGC
    GCGCTCGCCC GGCGCGGCGC
    CGCGAjSGCTC TCGCCGAGCA
    GTGCTCTCGC TCCTCGCCCT
    GCCCGCCCCG AGCACCGTCG
    TCCTGGGCAA GGCTCGCACT
    CTTCCGGGCA CAGCTCGAAG
    GCTCGCGCTG CTCCGCGGCG
    GCCCGCGCTG TTCTCGATGA
    GCCCGACGCG GTGGTCGGCC
    GCTGTCGCTC GAGGACGCTG
    CGCCGGCCAG GGGGCCATGG
    CCAGCGCTAT GGCGATCGGC
    CTCCGGCGAG CCCCCTGCCG
    CGCCCTCAAG CTGAGTTACG
    CGAGCTCCTC GATCTCCTCT
    CACGGTGAGC GGCGCCGCGA
    CCTCCGGCAG CCGGTCCGCT
    CTTCTTCGTG GAGGTGAGCC
    AGCGTCGGAG CGCTCGGCGG
    GCGCTTCCTC GTCTCGCTCT
    GATCCTGCCC CCCGGGÄAGC
    CTGGCTCGAC GCCTCCACGG
    GCGGTTCTGG CAGGCCATCG
    GGACGGCGAC GAGCAGCGCG
    TCGAACGAAG CGGAAGCCAC
    GGGAAGGGAT GGCCCTCTCC
    CGTGCGAGCG CGCCCTCGCG
    AGGAGGGCGC GCCCCCGCTC
    TGGTCTCGCT GGCCGCCCTG
    ATAC-CCAGGG CGAGATCGCC
    CCAAGCTGGT GGCGCTGCGC
    CCGCGGTGGA GCTGCCGGAG
    TCTCCATCGG GGCGATCAAC
    TCGCCGCCCT GCTCCGCGAT
    ACTTCGCCTC CCACTCCGCG
    CGTC-GCTCGA GCCGCGCTCG
    TCGACGGGAG CGAGCTCGAC
    TCGCAGACGC TGTGCAAGC-C
    CCAGTCCTGT GCTGACCTTG
    CGGTGGTCGG CTCTCTGTGG
    CCGAGCTCTA CGTCAACGGC
    GGGTGCCGCT GCCCACCTAC
    CACCCGCCGC CGGCGTCAAC
    AGAGCGGGAA TATCGACGCG
    CCGCCCTTGC CCTGCTCCTT
    CCACGAGCGG CAAGAGCAGG GCACGGTCGA CGCCTGGCGC
    TCTGACCACC GCCACCACGC CCGCCGACCT GGCCGGCACC
    CGCTCTGGAC GACGACGCGC TCCCCTCCGC GCTCACCGAG
    GCGCGTCCTC GCCGTGCGCC TGAGCCAGGC CCACCTGGAC
    CCTGCGCCAG GCTTGCGCCG AGACCGCGCC GCCTCGCGGC
    CGACGAAAGT CCCCTCGCCG ACCATGCCGC CGTGCCCGCG
    20820
    20880
    20940
    21000
    21060
    21120
    21180
    21240
    21300
    21360
    21420
    21480
    21540
    21600
    21660
    21720
    21780
    21840
    21900
    21960
    22020
    22080
    22140
    22200
    22260
    22320
    22380
    179
    GGACTCGCCT TCTCGCTCAC CCTCGTCCAA GCCCTCGGCG ACATCGCCCT CGACGCGCCC 22440 TTGTGGCTCT TCACCCGCGG CGCCGTCTCC GTCGGACACT CCGACCCCAT CGCCCATCCG 22500 ACGCAGGCGA TGACCTGGGG CCTGGGCCGC GTCGTCGGCC TCGAGCACCC CGAGCGCTGG 22560 GGAGGGCTCG TCGACGTCGG CGCAGCGATC GACGCGAGCG CCGTGGGCCG CTTGCTCCCG 22620 GTCCTCGCCC TGCGCAACGA TGAGGACCAG ctcgctctcc GCCCGGCCGG GTTCTACGCT 22580 CGCCGCCTCG TCCGCGCTCC GCTCGGCGAC GCGCCGCCCG CACCTACCTT CAAGCCCCGA 22740 GGCACCCTCC TCATCACCGG AGGCACCGGC GCCGCTGGCG CTCACGTCC-C CCGATGGCTC 22800 GCTCGAGAAG GCGCAGAGCA CCTCGTCCTC ATCAGCCGCC GAGGGG-CCA 22860 GCCTCGGAGC TCCACGCCGA GCTCACGGCC CTGGGCGCGC GCGTCACCTT CGCCGCGTGT 22920 GATGTCGCCG ACAGGAGCGC TGTCGCCACG CTTCTCGAGC AGCTCGACGC CGAAGGGTCG 22980 CAGGTCCGCG CCGTGTTCCA CGCGGGCGGC ATCGGGCGCC ACGCTCCGCT CGCCGCCACC 23040 TCľTCTCATGG AGCTCGCCGA CCTTGTCTCT GCCAAGGTCC TAGGCGCAGG GAACCTCCAC 23100 GACCTGCTCG GTCCTCGACC CCTCGACGCC TTCGTCCTTT TCTCGTCCAT CGCAGGCGTC 23160 TGGGGCGGCG GACAACAAGC CGGAIACGCC GCCGGAAACG CCTTCCTCGA CGCCCTGGCC 23220 GACCAGCGGC GCAGTCTTGG ACAGCCGGAC ACGTCCGTGG TGTGGGGCGC GTGGGGCGGC 23280 GGCGGTGGTA TATTCACGGG GCCCCTGGCA GCCCAGCTGG AGCAACGTCG TCTGTCGCCG 23340 ATGGCCCCTT CGCTGGCCGT GGCGGCGCTC GCGCAAGCCC TGGAGCACGA CGAGACCACC 23400 GTCACCGTCG CCGACATCGA CTGGGCGCGC TTTGCGCCTT CGATCAGCGT CGCTCGCTCC 23460 CGCCGCTCCT GCGCGACTTG CCCGAGCAGC GCGCCCTCGA AGACAGAGAA GGCGCGTCCT 23520 CCTCCGAGCA CGGCCCGGCC CCCCGACCTC CTCGACAAGC TCCGGAGCCG CTCGGAGAGC 23580 GAGCAGCTCC GTCTGCTCGC CGCGCTGGTG TGCGACGAGA CGGCCCTCGT CCTCGGCCAC 23640 GAAGGCCGCT TCCCAGCTCG ACCCCGACAA GGCTTCTTCG ACCTCGGTCT CGATTCGATC 23700 ATGACCGTCG AGCTTCGTCG GCGCTTGCAA CAGGCCACCG GCATCAAGCT CCCGGCCACC 23760 CTCGCCTTCG - ACCATCCCTC . TCCTCATCGC GTCGCGCTCT TCATGCGCGA CTCGCTCGCC 23820 CACGCCCTCG ί gcacgaggct CTCCGCCGAG GCGACGCCGC : CGCGCTCCGG CCGCGCCTCG 23880
    AGCGACGAGC CCATCGCCAT CGTCGGCATG GCCCTGCGCC TGCCGGGCGG CGICGGCGAT 23940 GTCGACGCTC TTTGGGAGTT CCTCCACCAA GGGCGCGACG CGGTCGAGCC CATTCCACAG 24000 AGCCGCTGGG ACGCCGGTGC CCTCTACGAC CCCGACCCCG ACGCCGACGC CAAGAGCTAC 24060
    180
    GTCCGGCATG CCGCGATGCT CGACCAGATC GACCTCTTCG ACCCTGCCTT CTTCGGCATC 24120 AGCCCCCGGG AGGCCAAACA CCTCGACCCC CAGCACCGCC TGCTCCTCGA ATCTGCCTGG 24180 CTGGCCCTCG AGGACGCCGG CATCGTCCCC AGcrcccrcA AGGACTCCCT CÄCCGGCCTC 24240 TTCGTCGGCA TCTGCGCCGG CGAATACGCG ATGCAAGA.GG CGAGCTCGGA AGGTTCCGAG 24300 GTTTACTTCA TCCAAGGCAC TTCCGCCTCC TTTGGCGCGG GGGGCTTGGC CTATACGCTC 24360 GGGCTCCÄGG GGCCGCGATC TTCGGTCGAC ACCGCCTGCT ccTCcrcGcr CGTCTCCCTC 24420 CACCTCGCCT GCCAAGCCCT ccgacagggc GACTGCAACC TCGCCCTCGC CGCGGGCGTG 24480 TCGCTCATGG TCTCCCCCCA GACCTTCGTC ATCCTTTCCC GTCTGCGCGC CTTGGCGCCC 24540 GACGGCCGCT CCAAGACCTT CTCGGACAAC GCCGACGGCT ACGGACGCGG AGAAGGCGTC 24600 GTCGTCCTTG CCCTCGAGCG GATCGGCGAC GCCCTCGCCC GGAGACACCG CGICCTCGTC 24660 CTCGTCCGCG GCACCGCCAT CAACCACGAC GGCGCGTCGA GCGGTATCAC CGCCCCCAAC 24720 GGCACCTCCC AGCAGAAGCT CCTCCGGGCC GCGCTCCACG ACGCCCGCAT CACCCCCGCC 24780 GACGTCGACG TCGTCGAGTG CCATGGCACC GGCACCTCGC TGGGAGACCC CATCGAGGTG 24840 CAAGCCCTGG CCGCCGTCIA CGCCGACGGC AGACCCGCTG .AAAAGCCTCT CCTTCTCGGC 24900 GCGCTCAÄGA CCAACATCGG CCATCTCGAG GCCGCCTCCG GCCTCGCGGG CGTCGCCAAG 24960 ATGGTCGCCT CGCTCCGCCA CGACGCCCTG CCCCCCACCC TCCACGCGAC CCCACGCAAT 25020 CCCCTCATCG AGTGGGAGGC GCTCGCCATC GACGTCGTCG ATACCCCGAG GCCTTGGCCC 25080 CGCCACGAAG ATGGCAGTCC CCGCCGCGCC GGCATCTCCG CCTTCGGATT CTCGGGCACC 25140 AACGCCCACG TCATCCTCGA AGAGGCTCCC GCCGCCCTGC CGGCCGAGCC CGCCACCTCÄ 25200 CAGCCGGCGT CGCAAGCCGC TCCCGCGGCG TGGCCCGTGC TCCTGTCGGC CAGGAGCGA.G 25260 GCCGCCGTCC GCGCCCAGGC GAAGCGGCTC CGCGACCACC TCGTCGCCCA CGACGAGCTC 25320 ACCCTCGCGG ATGTGGCCTA TTCGCTGGCC ACCACCCGCG CCCÄCTTCGÄ GCACCGCGCC 25380 GCTCTCGTAG CCCACAACCG CGACGAGCTC CTCTCCGCGC TCGACTCGCT CGCCCAGGAC 25440 AAGCCCGCCC CGAGCACCGT CCTCGGACGG AGCGGAAGCC ACGGCAAGCT CGTCTTCGTC 25500 TTTCCTGGGC AAGGCTCGCA GTGGGAAGGG ATGGCCCTCT CGCTGCTCGA CTCCTCGCCC 25560 CTCTTCCGCG CTCAGCTCGA AGCATGCGAG CGCGCGCTCG CTCCTCACGT CGAGTGGAGC 25620 CTGCTCGCCG TCCTGCGCCG CGACGAGGGC GCCCCCTCCC TCGACCGCGT CGACGTCGTA 25680
    181
    CÄGCCCGCCC TCTTTGCCGT CATGGTCTCC CTGGCGGCCC TCTGGCGCTC GCTCGGCGTA 25740 GAGCCCGCCG CCGTCGTCGG CCACAGTCAG GGCGAGATCG CCGCCGCCTT CGTCGCAGGC 25800 GCTCTCTCCC TCGAGGACGC GGCCCGCATC GCCGCCCTGC GCAGCAAAGC GCTCACCACC 25860 t 25920 GTCGCCGGCA ACGGGGCCAT GGCCGCCGTC GAGCTCGGCG CCTCCGACCT CCAGACCTAC CTCGCTCCCľ GGGGCGACAG GCTCTCCATC GCCGCCGTCA ACAGCCCCAG GGCCACGCTC 25980 GTGTCCGGCG AGCCCGCCGC CATCGACGCG CTGATCGACT CGCICACCGC AGCGCAGGTC 26040 TTCGCCCGAA AAGTCCGCGT CGACTACGCC TCCCACTCCG CCCAGATGGA CGCCGTCCAA 26100 GACGAGCICG CCGCAGGTCT AGCCAACATC GCTCCTCGGA CGTGCGAGCT CCCTCTTTAT 26160 TCGACCGICA CCC-GCACCAG GCTCGACGGC TCCGAGCTCG ACGGCGCGTA CTGGTATCGA 26220 ÄACCTCCGGC AAACCGICCT GTTCTCGAGC GCGACCGAGC GGCTCCTCGA CGATGGGCAT 26280 CGCTTCTTCG TCGAGGICAG CCCCCATCCC GTGCTCACGC TCGCCCTCCG CGAGACCTGC 26340 GAGCGCTCAC CGCTCGATCC CGTCGTCGTC GGCTCCATTC GACGCGACGA AGGCCACCTC 26400 GCCCGCCTGC TCCTCTCCTG GGCGGAGCTC TCTACCCGAG GCCTCGCGCT CGACIGGAAC 26460 GCCTTCTTCG CGCCCTTCGC TCCCCGCAAG GTCTCCCTCC CCACCTACCC CTTCCAACGC 26520 GAGCGCTTCT GGCTCGACGC CTCCACGGCG CACGCTGCCG ACGTCGCCTC CGCAGGCCTG 26580 ACCTCGGCCG ACCACCCGCT GCTCGGCGCC GCCGTCGCCC TCGCCGACCG CGATGGCTTT 26640 GTCTTCACAG GACGGCTCTC CCTCGCAGAG CÄCCCGTGGC TCGAAGACCA CGTCGTCTTC 26700 GGCATACCCT GTCCTGCCAG GCGCCGCCTC CTCGAGCTCG CCCTGCATGT CGCCCATCTC 26760 GTCGGCCTCG ACACCGTCGA AGACGTCACG CTCGACCCCC CCCTCGCTCT CCCATCGCAG 26820 GGCGCCGTCC TCCTCCAGAT CTCCGTCGGG CCCGCGGACG GTGCTGGACG AAGGGCGCTC 26880 TCCGTTCATA GCCGGCGCCA CGACGCGCTT CAGGATGGCC CCTGGACTCG CCACGCCAGC 26940 GGCTCTCICG CGCAAGCTAG CCCGTCCCAT TGCCTTCGAT GCTCCGCGAA TGGCCCCCCC 27000 TCGGGCGCCA CCCAGGTGGA CACCCAAGGT TTCTACGCAG CCCTCGAGAG CGCTGGGCTT 27060 GCTTATGGCC CCGAGTTCCA GGGCCTCCGC CGCCGTCTAC AAGCGCGGCG ACGAGCTCTT 27120 CGCCGAAGCC AAGCTCCCGG ACGCCGCCGA AGAGGACGCC GCTCGTTTTG CCCTCCACCC 27180 CGCCCTGCTC GACAGCGCCT TGCAGGCGCT CGCCTTTGTA GACGACCAGG CAAAGGCCTT 27240 CAGGATGCCC TTCTCGTGGA GCGGAGTAIC GCTGCGCTCC GGICGGAGCC ACCACCCTGC 27300 GCGIGCGTTT CCACCGTCCT GAGGGCGAAT CCTCGCGCTC GCTCCTCCTC GCCGACGCCA 27360
    182
    GAGGCGAACC CATCGCCTCG
    TCCGCAGACC CGGGAGCGTC
    CAAAGCCCCA CCTCACCGCC
    GACCTCGGGA CCAGGGTGCC
    CTCGACCAGG GCGCTTCGCC
    GGCGACCTCA TCGCGAGCGC
    TGGCTCGCCG ACGAGCGCCT
    GCCACCCACG CTGAAGAAGA
    CGCTCCGCC-C ÄGAGCGAGCA
    GAGGCCTCCC AGCACGCCCT
    CGCÄACGGCA aacccctcgt
    GCGTCCCCCG CAGGCCTCGG
    GCCCTC-GTCG CGCGCCGCCT
    CGCCAGGGCG CGAGCGCTCC
    GCTTCGGTCA CCCTCGCCGC
    GATAACATTC CGAGCGCTCA
    GGCGATCTGC TCGGCGCCAT
    GATCCCGCCT GGCACTTGCA
    TTCTCGTCCG TCGGCGGCCT
    GCCTTCCTCG ATGCGCTTGC
    GCCTGGAGCC ACTGGGCCGA
    CCTCGCATGG AGCGCGCCGG
    GCGGCGCTCT TCCGAACCGA
    AGGGCGAACG CCGGCAGCGT
    CGCAAGGCCG CCAGCAACAC
    CCGCCCGCCG AACGCGAGCG
    GTGCAAGCGC TCGCCATGCG
    CCACCTCGAT GCCCTCTTCC
    CATCGCCCCG AGCGGTGCCC
    TCTCGACCGC TATACCGACC
    TCCAAGCCTC GTCATCGCCC
    CCGCGAGACC ACCGCGCACG
    CGCCTCCTCG CGCCTCGCCC
    CGTCÄAGGGC CTCGCTCACG
    CCCAGAGCGC CCTCTCGTCC
    GCTCGGCGCG CTCGACGCAA
    TCCAAGCCTC TCACGCCTGC
    AGGCACCCTC CTCATCACGG
    CCTCCTAAAC CACGACGCCA
    GGCTGCTGAT CTCTTGCGAA
    GTGCGACGTG GCCGATCCÄC
    CCCGCTCGCC GCCGTCGTGC
    GAGCCTCGAG CGGATCGACC
    TCAGCTCACC CAAGATAAGC
    CCTCGGCAGC TCAGGTCACT
    GCACCACCGG CGCGCGCAAG
    GCGCAGCGCA ATGACAGAGC
    CCTTCCCTCG ACCTCTGAGG
    GACCGCCCTG GTCCCCGCGC
    CCCCCCGTTG TTCCAACGTC
    CGCCCAGGCC TCGTCGCTTA
    TGCCCTGCTC GATCTCATCC
    CGCCGCGTCC GCCGAGCAGC
    GCATCGACTG GAGCGAGCTG
    TCCTCGGCAC AGAAGGTCTC
    TTGCTGCTCT ACGCAGCGCC ccrrcATCGC tctgcccgaa
    CGCICGCCCT CTTGCÄAGCC
    TCGTCÄCCCG ACGCGCCCTC
    CGCCTCTCTG GGCTCTCGCT
    TCCTCGACCI CGACGACAGC
    GAGAGCCAGA GATCGCCCTC
    CCCAGGCGCC CACGGACACA
    GAGGCACCGG CACGCTCGGC
    AGCACCTGCT CCTCACCTCG
    GCGAGCTCGA AGCTCTGGGG
    GCGCTCTAAA GGACCTTCTG
    ATGCCGCCAG CGICCTCGAC
    GCGTCTTCGC CCCCAAGATC
    CCCTTGCCGC CTTCATCCTC
    CCAACTACGC CGCIGCGAGC
    GGCTCCCTGC CTCATCGCTC
    ACGTCAGCGC CGCCGGCGCC
    AGAGGCTCGC CCTCITCGAT
    GCTTCGACTT GAGCGCGCTC
    TCGTCCGCGC TCGCACCCTA
    CAGAGCGCCT CTCAGCCCTC
    GCACCGAAGC CGCCGCCGTC
    27420
    27480
    27540
    27600
    27660
    27720
    27780
    27840
    27900
    27960
    28020
    28080
    23140
    28200
    28260
    28320
    28380
    28440
    28500
    28560
    28620
    28680
    23740
    28800
    23860
    28920
    CTCGGCCTCG CCTCCTTCGA ATCGCTCGAT CCCGAICG
    28958
    183 (2) Informácie o SEQ ID č.: 7 (i) Charakteristika sekvencie:
    (A) Dĺžka: 13 párov báz (B) Typ: kyselina nukleová (C) Reťazcovitosť: jednoduchý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: ďalšia kyselina nukleová (iii) Hypotetická: nie (iv) Anti-senza: nie (v) Rysy:
    (A) Meno/kľúč: mise feature (B) Umiestnenie: 1..13 (C) Ďalšie informácie: /poznámka=sekvencia rastlinného konsenzu translačného iniciátora (Clontech) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č.: 7
    GTCGACCATG GTC 13 (2) Informácie o SEQ ID č.: 8 (i) Charakteristika sekvencie:
    (A) DÍžka: 12 párov báz (B) Typ: kyselina nukleová (C) Reťazcovitosť: jednoduchý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: ďalšia kyselina nukleová (iii) Hypotetická: nie (iv) Anti-senza: nie (v) Rysy:
    (A) Meno/kľúč: mise feature (B) Umiestnenie: 1..12 (C) Ďalšie informácie: /poznámka=sekvencia rastlinného konsenzu translačného iniciátora (Joshi) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č.: 8
    TAAACAATGG CT
    184 (2) Informácie o SEQ ID č.: 9 (i) Charakteristika sekvencie:
    (A) DÍžka: 22 párov báz (B) Typ: kyselina nukleová (C) Reťazcovitosť: jednoduchý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: ďalšia kyselina nukleová (iii) Hypotetická: nie (iv) Anti-senza: nie (v) Rysy:
    (A) Meno/kľúč: mise feature (B) Umiestnenie: 1..22 (C) Ďalšie informácie: /poznámka^sekvencia oligonukleotidu pre použitie v molekulárnom adaptore (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č.: 9
    AATTCTAAAG CATGCCGATC GG 22 (2) Informácie o SEQ ID č.: 10 (i) Charakteristika sekvencie:
    (A) DÍžka: 21 párov báz (B) Typ: kyselina nukleová (C) Reťazcovitosť: jednoduchý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: ďalšia kyselina nukleová (iii) Hypotetická: nie (iv) Anti-senza: nie (v) Rysy:
    (A) Meno/kľúč: mise feature (B) Umiestnenie: 1..21 (C) Ďalšie informácie: /poznámka=sekvencia oligonukleotidu pre použitie v molekulárnom adaptore (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č.: 10
    AATTCCGATC GGCATGCTTT A (2) Informácie o SEQ ID č.: 11 (i) Charakteristika sekvencie:
    185 (A) DÍžka: 22 párov báz (B) Typ: kyselina nukleová (C) Reťazcovitosť: jednoduchý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: ďalšia kyselina nukleová (iii) Hypotetická: nie (iv) Anti-senza: nie (v) Rysy:
    (A) Meno/kľúč: mise feature (B) Umiestnenie: 1..22 (C) Ďalšie informácie: /poznámka=sekvencia oligonukleotidu pre použitie v molekulárnom adaptore (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č.: 11
    AATTCTAAAC CATGGCGATC GG 22 (2) Informácie o SEQ ID č.: 12 (i) Charakteristika sekvencie:
    (A) DÍžka: 21 párov báz (B) Typ: kyselina nukleová (C) Reťazcovitosť: jednoduchý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: ďalšia kyselina nukleová (iii) Hypotetická: nie (iv) Anti-senza: nie (v) Rysy:
    (A) Meno/kľúč: mise feature (B) Umiestnenie: 1..21 (C) Ďalšie informácie: /poznámka=sekvencia oligonukleotidu pre použitie v molekulárnom adaptore (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č.: 12
    AATTCCGATC GCCATGGTTT A 21 (2) Informácie o SEQ ID č.: 13 (i) Charakteristika sekvencie:
    (A) DÍžka: 15 párov báz (B) Typ: kyselina nukleová (C) Reťazcovitosť: jednoduchý reťazec
    186 (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: ďalšia kyselina nukleová (iii) Hypotetická: nie (iv) Anti-senza: nie (v) Rysy:
    (A) Meno/kľúč: mise feature (B) Umiestnenie: 1..15 (C) Ďalšie informácie: /poznámka=sekvencia olígonukleotidu pre použitie v molekulárnom adaptore (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č.: 13
    CCAGCTGGAA TTCCG 15 (2) Informácie o SEQ ID č.: 14 (i) Charakteristika sekvencie:
    (A) DÍžka: 19 párov báz (B) Typ: kyselina nukleová (C) Reťazcovitosť: jednoduchý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: ďalšia kyselina nukleová (iii) Hypotetická: nie (iv) Anti-senza: nie (v) Rysy:
    (A) Meno/kľúč: mise feature (B) Umiestnenie: 1..19 (C) Ďalšie informácie: /poznámka=sekvencia oligonukleotidu pre použitie v molekulárnom adaptore (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č.: 14
    CGGAATTCCA GCTGGCATG 19 (2) Informácie o SEQ ID č.: 15 (i) Charakteristika sekvencie:
    (A) DÍžka: 11 párov báz (B) Typ: kyselina nukleová (C) Reťazcovitosť: jednoduchý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: ďalšia kyselina nukleová (iii) Hypotetická: nie
    187 (iv) Anti-senza: nie (v) Rysy:
    (A) Meno/kľúč: mise feature (B) Umiestnenie: 1..11 (C) Ďalšie informácie: /poznámka= oligonukleotid používaný pre zámenu báz v Sphl mieste ORF1 zosku penia génov pre pyrolnitrín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č.: 15
    CCCCCTCATG C 11 (2) Informácie o SEQ ID č.: 16
    (i) Charakteristika sekvencie: (A) Dĺžka: 11 párov báz reťazec (B) (C) (D) Typ: kyselina nukleová Reťazcovitosť: jednoduchý Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: ďalšia kyselina nukleová (iii) Hypotetická: nie (iv) Anti-senza: nie (v) Rysy: (A) Meno/kľúč: mise feature (B) Umiestnenie: 1..11 (C) Ďalšie informácie: /poznámka= oligonukleotid
    používaný pre zámenu báz v Sphl mieste 0RF1 zosku penia génov pre pyrolnitrín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č.: 16
    GCATGAGGGG G 11 (2) Informácie o SEQ ID č. : 17 (i) Charakteristika sekvencie:
    (A) Dĺžka: 4603 párov báz (B) Typ: kyselina nukleová (C) Reťazcovitosť: jednoduchý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNK (genómová) (iii) Hypotetická: nie (iv) Anti-senza: nie
    188 (ix) Rysy:
    (A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestnenie: 230.. , 1597 (C) Ďalšie informácie: /označenie=ORFl /gén=pzhl Rysy: (D) Meno/kľúč: CDS (E) Umiestnenie: 1598. . .2761 (F) Ďalšie informácie: /označenie=0RF2 : /gén=pzh2
    Rysy: (G) Meno/kľúč: CDS (H) Umiestnenie: 2764. .3600 (I) Ďalšie informácie: /označenie=0RF3 /gén=pzh3
    (íx) Rysy:
    (J) Meno/kľúč: mise feature (K) Umiestnenie: 3597..4265
    Ďalšie informácie: /označenie=0RF4
    189 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č.: 17 gcaigccctg acctccgccg gtggcgtggc cgccggcctg CACCTGGAAA CCACCCCTGA 60
    CGACCTCAGC GAGTGCGCTT CCGATGCCGC CGGCCTGCAT CAGGTCGCCA GCCGCTACAA 120 aagcctctgc GACCCGCGCC TGAACCCCTG GCAAGCCATT ACTGCGGTGA TGGCCTGGAA 180
    AÄACCAGCCC TCTTCAACCC TTGCCTCCTT TTGACTGGAG TTTGTCGTC ATG ACC 235
    Met Thr
    GGC Gly ATT CCA TCG ATC CTC CCT TAC GCC TTG CCT ACC AAC CGC GAC CTG Asp Leu 293 íle Pro 5 Ser íle Val Pro Tyr ÍO Ala Leu Pro Thr Asn 15 Arg CCC GTC AAC CTC GCG OA TGG AGC ATC GAC CCC GAG CCT GCC GTG CTG 331 Pro Val 20 A; n Leu Ala Gin Trp 25 Ser íle Asd Pro Glu Arg 30 Ala Val Leu CTG GTG CAT GAC ATG CAG CGC TAC TTC CTG CGG CCC TTG CCC GAC GCC 379 Leu 35 Val Eis Asp Met Gin 40 Arg Tyr Phe Leu Arg Pro Leu 45 Pro Asp Ala 50 CTG CCT GAC GAA CTC GTG AGC AAT GCC GCG CGC ATT CGC CAG TGG GCT 427 Leu Arg· Asp Glu Val 55 Val Ser Asn Ala Ala Arg íle Arg 60 Gin Trp Ala 65 GCC GAC AAG GGC GIT CCG GTG GCC TAC ACC GCC CAG CCC GGC AGC ATG 475 Ala Asp Asn Gly 70 Val Pro Val Ala Tyr 75 Thr Ala Gin Pro Gly 80 Ser Met AGC GAG GAG CAA CGC GGG CTG CTC AAG GAC TTC TGG GGC CCG GGC ATG ' 523 Ser Glu Glu 85 Gin Arg Gly Leu Leu 90 Lys Asp Phe Trp Gly 95 Pro Gly Met AAG GCC AGC CCC GCC GAC CGC GAG GTG GTC GGC GCC CTG ACG CCC AAG 571 Lys Ala 100 Ser Pro Ala Asp Arg 105 Glu Val Val Gly Ala Leu 110 Thr Pro Lys CCC GGC GAG TGG CTG CTG ACC AAG TGG CGC TAC AGC GCG TIC TTC AAC 619 Pro 115 Gly Asp Trp Leu Leu 120 Thr Lys Trp Arg Tyr Ser Ala 125 Phe Phe Asn 130 TCC GAC OPj· CTG GAA CGC ATG CGC GCC AAC GGG CGC GAT CAG TTG ATC 667 Ser Asp Leu Leu Glu 135 Arg Met Arg Ala Asn Gly Arg Asp 140 Gin Leu íle 145 CTG TGC GGG CTG TAC GCC CAT GTC GGG GTA CTG ATT TCC ACC GTG GAT 715 Leu Cys Gly Val 150 Tyr Ala His Val Gly Val Leu íle Ser 155 Thr Val Aso 160 GCC TAC TCC AAC GAT ATC CAG CCG TTC CTC GTT GCC GAC GCG ATC GCC 763 Ala Tyr Ser Asn Asp íle Gin Pro Phe Leu Val Ala Asp Ala íle Ala
    165 170 175
    190
    GAC TTC AGC AAA GAG CAC CAC TGG ATG CCA TCG AAT ACG CCG CCA GCC Asn Phe Ser Lys Glu His His Trp Met 185 Pro Ser Asn Thr 190 Pro Pro Ala 180 GTT GCG CCA TGT CAT CAC CAC CGA CGA GGT GGT GCT ATG AGC CAG ACC Val 195 Ala Pro Cys His His His Arg Arg Gly Gly Ala Met 200 205 Ser Gin· Thr 210 GCA GCC CAC CTC ATG GAA CGC ATC CTG CAA CCG GCT CCC GAG CCG TTT Ala Ala His Leu Met 215 Glu Arg Ile Leu Gin 220 Pro Ala Pro Glu Pro Phe 225 GCC CTG TTG TAC CGC CCG GAA TCC AGT GGC CCC GGC CTG CTG GAC GTG Ala Leu Leu Tyr 230 Arg Pro Glu Ser Ser 235 Gly Pro Gly Leu Leu Asp Val 240 CTC ATC GGC GAA ATG TCG GAA CCG CAG GTC CTG GCC GAT ATC GAC TTG Leu Ile Gly Glu 245 Met Ser Glu Pro Gin 250 Val Leu Ala Asp 255 Ile Asp Leu CCT GCC ACC TCG ATC GGC GCG CCT CGC CTG GAT GTA CTG GCG CTG ATC Pro Ala 260 Thr Ser Ile Gly Ala Pro Arg 265 Leu Asp Val Leu 270 Ala Leu Ile CCC TAC CGC CAG ATC GCC GAA CC-C GGT TTC GAG GCG GTG GAC GAT GAG Pro 275 Tyr Arg Gin Ile Ala Glu Arg Gly 280 Phe Glu Ala Val 285 Aso Asp Glu 290 TCG CCG CTG CTG GCG ATG AAC ATC ACC GAG CAG CAA TCC ATC AGC ATC Ser Pro Leu Leu Ala 295 Met Asn íle Thr Glu 300 Gin Gin Ser Ile Ser Ile 305 GAG CGC TTG CTG GGA ATG CTG CCC AAC GTG CCG ATC CAG TTG AAC AGC Glu Arg Leu Leu 310 Gly Met Leu Pro Asn 315 Val Pro íle Gin Leu Asn Ser 320 GAA CGC TTC GAC CTC AGC GAC GCG AGC TAC GCC GAG ATC GTC AGC CAG Glu Arg Phe Aso 325 Leu Ser Asp Ala Ser 330 Tyr Ala Glu Tie 335 Val Ser Gin GTG ATC GCC AAT GAA ATC GGC TCC GGG GAA GGC GCC AAC TTC GTC ATC Val Ile 340 Ala Asn Glu Ile Glv Ser Gly 345 Glu Gly Ala Asn 350 Phe Val Ile AAA CGC ACC TTC CTG GCC GAG ATC AGC GAA TAC GGC CCG GCC AGT . GCG Lys 355 Arg Thr Phe Leu' Ala Glu Ile Ser 360 Glu Tyr Gly Pro 365 Ala Ser Ala 370 CTG TCG TTC TTT CGC CAT CTG CTG GAA CGG GAG AAA GGC GCC TAC TGG Leu Ser Phe Phe Arg 375 His Leu Leu Glú Arg 380 Glu Lys Gly Ala Tyr Trp 385 ACG TTC ATC ATC CAC ACC GGC AGC CGT ACC TTC GTG GGT GCG TCC CCC Thr Phe Ile íle His Thr Gly Ser Arg Thr Phe Val Gly Ala Ser Pro
    390 395 400
    811
    859
    907
    955
    1003
    1051
    1099 .
    1147
    1195
    1243
    1291
    1339
    1387
    1435
    191
    GAG CGC CAC ATC AGC ATC AAG GAT GGG CTC TCG GTG ATG AAC CCC ATC Glu Arg· His íle Ser íle Lys Asp Gly Leu Ser Val Met Asn Pro íle 405 410 415 AGC GGC act TAC CGC TAT CCG CCC GCC CCC AAC CTG TCG GAA GTC Ser Glv Thr Tyr Arg Tyr Pro Pro Ala Gly Pro Asn. Leu Ser Glu Val 420 425 430 ATG GAC ttc: CTG GCG GAT CGC AAG GAA GCC GAC GAG CTC TAC ATG GTG Met Asp Phe Leu Ala Asp Arg Lys Glu Ala Asp Glu Leu Tyr Met Val 435 440 445 450 GTG GAT GAA. GAG CTG TAA ATG ATG GCG CGC ATT TGT GAG GAC GGC GGC Val Asp Glu Glu Leu * Met Met Ala Arg íle Cys Glu Asp Gly Gly 455 1 5 10
    CAC GTC CIC GGC CCT TAC CTC AAG GAA ATG GCG CAC CTG GCC CAC ACC His Val Leu Gly Pro Tyr Leu Lys Glu Met Ala His Leu Ala His Thr
    15 20 25
    GAG Glu TAC TTC ATC GAA GGC AAG ACC CAT CGC GAT GTA CGG GAA ATC CTG Tyr Phe íle 30 Glu Gly Lys Thr His Arg 35 Asp Val Arg Glu 40 íle Leu CGC GAA ACC CTG TTT GCG CCC ACC GTC ACC AGC CCA CTG GAA AGC Arg Glu Thr Leu Phe Ala Pro Thr Val Thr Gly Ser Pro Leu Glu Ser 45 50 55 GCC TGC CGG GTC ATC CAG CGC TAT GAN CCG CAA GGC CGC GCG TAC TAC Ala Cys Arg Val íle Gin Arg Tyr Xaa Pro Gin Glv Arg Ala Tyr Tyr 60 65 70 AGC GGC ATG GCT GCG CTG ATC GGC AGC GAT GGC AAG GGC GGG CGI TCC Ser Gly Met Ala Ala Leu íle Gly Ser Asp Gly Lys Gly Gly Arg Ser 75 80 85 90 CTG GAC TCC GCG ATC CTG ATT CGT ACC GCC GAC ATC GAT AAC AGC GGC Leu Asp Ser Ala íle Leu íle Arg Thr Ala Asp íle Asp Asn Ser Gly 95 100 105 GAG GTG CGG ATC AGC GTG GGC TCG ACC ATC GTG CGC CAT TCC GAC CCG Glu Val Arg íle Ser Val Gly Ser Thr íle Val Arg His Ser Asp Pro 110 115 120 1 ATG ACC GAG GCT GCC GAA AGC CGG GCC AAG GCC ACT GGC CTG ATC AGC Met Thr Glu Ala Ala Glu Ser Arg Ala Lys Ala Thr Gly Leu íle Ser 125 130 135 GCA CTG AAA AAC CAG GCG CCC TCG CGC TTC GGC AAT CAC CTG CAA GTG Ala Leu Lys Asn Gin Ala Pro Ser Arg Phe Gly Asn His Leu Gin Val 140 145 150 CGC GCC GCA TTG GCC AGC CGC AAT GCC TAC GTC TCG GAC TTC TGG CTG Arg Ala Ala Leu Ala Ser Arg Asn Ala Tyr Val Ser Asp Phe Trp Leu 155 ISO 165 170
    1483
    I
    1531
    1579
    1627
    1675
    1723
    1771
    1819
    1867
    1915
    1963
    2011
    2059
    2107
    192
    ATG GAC AGC CAG CAG CGG GAG CAG ATC CAG GCC GAC TTC AGT GGG CGC 2155 Met Asp Ser Gin Gin Arg Glu Gin íle Gin Ala Asp Phe Ser Gly Arg 175 180 185 CAG GTG CTG ATC GTC GAC GCC GAA GAC ACC TTC ACC TCG ATG ATC GCC 2203 Gin Val Leu íle Val . Asp Ala Glu Asp Thr Phe Thr Ser Met íle Ala 190 195 200 AAG CAA CTG CGG GCC CTG GGC CTG GTA GTG ACG GTG TGC AGC TTC AGC 2251 Lys Gin Leu Arg Ala Leu Gly Leu Val Val Thr Val Cys Ser Phe Ser 205 210 215 GAC GAA TAC AGC TTT GAA GGC TAC GAC CTG GTC ATC ATG CCC GC-C 2299 Asp Glu Tyr Ser Phe Glu Gly Tyr Asp Leu Val íle Met Gly Pro Gly 220 225 230 CCC GGC AAC CCG AGC GAA GTC CAA CAG CCG AAA ATC AAC CAC CTG CAC 2347 Pro Gly Asn Pro Ser Glu Val Gin Gin Pro Lys íle Asn His Leu His 235 240 245 250 GTG GCC ATC CGC TCC TTG CIC AGC CAG CAG CGG CCA TTC CTC GCG GTG 2395 Val Ala íle Arg Ser Leu Leu Ser Gin Gin Arg Pro Phe Leu Ala Val 255 260 265 TGC CTG AGC CAT CAG GTG CTG AGC CTG TGC CTG GGC CTG GAA CTG CAG 2443 Cys Leu Ser His Gin Val Leu Ser Leu Cys Leu Gly Leu Glu Leu Gin 270 275 280 CGC AAA GCC ATT CCC AAC CAG GGC GTG CAA AAA CAG ATC GAC CTG TTT . 2491 Arg Lys Ale. íle Pro Asn Gin Gly Val Gin Lys Gin íle Asp Leu Phe 28 S 290 295 GGC AAT GTC GAA CGG GTG GGT TTC TAC AAC ACC TTC GCC GCC CAG AGC 2539 Gly Asn Val Glu Arg Val Gly Phe Tyr Asn Thr Phe Ala Ala Gin Ser 300 305 310 TCG ÄGT GAC CGC CTG GAC ATC GAC GGC ATC GGC ACC GTC GAA ATC AGC 2587 Ser Ser Asp Arg Leu Asp íle Asp Gly íle Gly Thr Val Glu íle Ser 315 320 325 330 CGC GAC AGC GAG ACC GGC GAG GTG CAT GCC CTG CGT GGC CCC TCG TTC 2635 Arg Asp Ser Glu Thr Gly Glu Val His Ala Leu Arg Gly Pro Ser Phe 335 340 345
    193
    GCC TCC ATG CAG TTT CAT GCC GAG TCG CTG CTG ACC CAG GAA GGT CCG 2683 Ala Ser Met Gin Phe His Ala Glu Ser Leu Leu Thr Gin Glu Gly Pro 350 355 360 CGC ATC ATC GCC GAC CTG CTG CGG CAC GCC CTG ATC CAC ACA CCT GTC 2731 Arg Ile Ile Ala Asp Leu Leu Arg His Ala Leu Ile His Thr Pro Val 365 370 375 GAG AAC AAC GCT TCG GCC GCC GGG AGA TAA CC ATG CAC CAT TAC GTC 2778 Glu Asn Asn Ala Ser Ala Ala Gly Arg * Met His His Tyr Val 380 385 1 5 ATC ATC GAC GCC TTT GCC AGC GTC CCG CTG GAA GGC AAT CCG GTC GCG 2826 Ile íle Asp Ala Phe Ala Ser Val Pro Leu Glu Gly Asn Pro Val Ala 10 15 20 GTG TTC TTT GAC GCC GAT GAC TTG TCG GCC GAG CAA ATG CAA CGC ATT 2874 Val Phe Phe Asp Ala Asp Asp Leu Ser Ala Glu Gin Met Gin Arg Ile 25 30 35 GCC CGG GAG ATG AAC CTG TCG GAA ACC ACT TTC GTG CTC AAG CCA CGT 2922 Ala Arg Glu Met Asn Leu Ser Glu Thr Thr Phe Val Leu Lys Pro Arg 40 45 50 AAC TGC GGC GAT GCG CTG ATC CGG ATC TTC ACC CCG GTC AAC GAA CTG 2970 Asn Cys Gly Asp Ala Leu íle Arg Ile Phe Thr Pro Val Asn Glu Leu 55 60 65 CCC TTC GCC GGG CAC CCG TTG CTG GGC ACG GAC ATT GCC CTG GGT GCG 3018 Pro Phe Ala Gly His Pro Leu Leu Gly Thr Asp Ile Ala Leu Gly Ala 70 75 80 85 CGC ÄCC GAC AAT CAC CGG CTG TTC CTG GAA ACC CAG ATG GGC ACC ATC 3066 Arg Thr Asp Asn His Arg Leu Phe Leu Glu Thr Gin Met Gly Thr Ile 90 95 100 GCC TTT GAG CTG GAG CGC CAG AAC Uisv., AGC GTC ATC GCC GCC AGC ATG 3114 Ala Phe Glu Leu Glu Arg Gin Asn Gly Ser Val Ile Ala Ala Ser Met 105 110 115 GAC CAG CCG ATA CCG ACC TGG ACG GCC CTG GGG CGC GAC GCC GAG TTG 3162 Asp Gin Pro Ile Pro Thr Trp Thr Ala Leu Gly Arg Asp Ala Glu Leu 120 125 130 CTC AAG GCC CTG GGC ATC AGC GAC TCG ACC TTT CCC ATC GAG ATC TAT 3210 Leu Lys Ala Leu Gly Ile Ser Asp Ser Thr Phe Pro Ile Glu Ile Tyr 135 140 145 CAC AAC GGC CCG CGT CAT GTG TTT GTC GGC CTG CCA AGC ATC GCC GCG 3258 His Asn Gly Pro Arg His Val Phe Val Gly Leu Pro Ser Ile Ala Ala 150 155 160 165 CTG TCG GCC CTG CAC CCC GAC CAC CGT GCC GTG TAC AGC TTC CSC GAC 3306 Leu Ser Ala Leu His Pro Asp His Arg Ala Leu Tyr Ser Phe His Asp 170 175 180
    194
    ATC GCC ATC AAC TCT TTT GCC GGT GCG GGA CCG CGC TGG CGC AGC CGG 3354
    Met Ala íle Asn Cys Phe Ala Gly Ala Gly Arg Arg Trp Äxg Ser Arg
    185 190 195
    ATG TTC TCG CCG GCC TAT GGG GTG GTC GAG GAT GCG NCC ACG GGC TCC 3402
    Met Phe Ser Pro Ala Tyr Gly Val Val Glu Asp Ala Xaa Thr Gly Ser
    200 205 ' 210
    GCT GCC GGG CCC TTG GCG ATC CAT CTG GCG CGG CAT GGC CAG ATC GAG 3450
    Ala Ala Gly Pro Leu Ala íle Eis Leu Ala Arg His Gly Gin íle Glu
    215 220 225
    TTC GGC CAG CAG ATC GAA ATT CTT CAG C-GC GTG GAA ATC GGC CGC CCC 3498
    Phe Gly Gin Gin íle Glu íle Leu Gin Gly Val Glu íle Gly Arg Pro
    230 235 240 245
    TCA CTC ATG TTC GCC CGG GCC GAG GGC CGC GCC GAT CAA CTG ACG CGG 3546
    Ser Leu Met Phe Ala Arg A_La Glu Gly Arg Ala Asp Gin Leu Thr Arg
    250 · 255 260
    GTC GAA GTA TCA GGC AAT GGC ATC ACC TTC GGA CGG GGG ACC ATC GTT 3594
    Val Glu Val Ser Glv Asn Gly íle Thr Phe Gly Arg Gly Thr íle Val
    265 * 270 275
    CTA TGA ACAGTTCAGT ACTAGGCAAG CCGCTGTTGG GTAAAGGCAT GTCGGAATCG 3650
    Leu *
    CTGACCGGCA CACTGGATGC GCCGTTCCCC GAGTACCAGA AGCCGCCTGC CGATCCCATG 3710
    AGCGTGCTGC ACAACTGGCT CGAACGCGCA CGCCGCGTGG GCATCCGCGÄ ACCCCGTGCG 3770
    CTGGCGCTGG CCACGGCTGA CAGCCAGGGC CGGCCTTCGA CACGCATCGT GGTGATCAGT 3830
    GAGATCAGTG ACACCGGGGT GCTGTTCAGC ACCCATGCCG GAAGCCAGAA AGGCCGCGAA 3890
    CTGACAGAGA ACCCCTGGGC CTCGGGGACG CTGTATTGGC GCGAAACCAG CCAGCAGATC 3950
    ATCCTCAATG GCCAGGCCGT GCGCATGCCG GATGCCÄAGG CTGÄCGAGGC CTGGTTGAAG 4010
    CGCCCTTÄTG CCACGCATCC GATGTCATCG GTGTCTCGCC AGAGTGAAGA. ACTCAAGGAT 4070
    GTTCAAGCCA TGCGCAACGC CGCCAGGGAA CTGGCCGAGG TTCAAGGTCC GCTGCCGCGT 4130
    CCCGAGGGTT ATTGCGTGTT TGAGTTACGG CTTGAATCGC TGGAGTTCTG GGGTAACGGC 4190
    GAGGAGCGCC TGCATGAACG CTTGCGCTAT GACCGCAGCG CTGAACGCTG GAAACATCGC 4250
    CGGTTACAGC CATAGGGTCC CGCGAIAAAC AIGCITTGAA GTGCCTGGCT GCTCCAGCTT 4310
    CGAACTCATT GCGCAAACTT CAACACTTAT GACACCCGGT CAACATGAGA AAAGTCCAGA 4370
    TGCGAAAGAA CGCGTATTCG AAATACCAAA CAGAGAGTCC GGATCACCAA AGTGTGTAAC 4430
    GACATTAACT CCTATCTGAA TTTTÄTAGTT GCTCTAGAAC GTTGTCCTTG ACCCAGCGAT 4490
    ÄGACATCGGG CCAGAACCTA CATAAACAAA GTCAGACATT ACTGAGGCTG CTACCATGCT 4550
    AGATTTTCAA AACAAGCGTA AATATCTGAA AAGTGCAGAA TCCTTCAAAG CTT 4603
    195 (2) Informácie o SEQ ID č.: 18 (i) Charakteristika sekvencie:
    (A) DÍžka: 456 aminokyselín (B) Typ: aminokyseliny (C) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: protein
    (ii i) Opi: s sekvenci e: ; SEQ ID č . : 18 Met Thr Gly íle Pro Ser íle Val Pro Tyr Ala Leu Pro Thr Asn Arg i 5 10 15 Asp Leu Pro Val Asn Leu Ala Gin Trp Ser íle Asp Pro Glu Arg Ala 20 25 30 Val Leu Leu Val His Asp Met Gin Arg Tyr Phe Leu Arg Pro Leu Pro 35 40 45 Asp Ala Leu Arg Asp Glu Val Val Ser Asn Ala Ala Arg íle Arg Gin 50 55 60 Trp Ala Ala Aso Asn Glv Val Pro Val Ala Tyr Thr Ala Gin Pro Gly 65 70 75 80 Ser Met Ser Glu Glu Gin Arg Gly Leu Leu Lys Asp Phe Trp Gly Pro 85 90 95 Gly Met Lys Ala Ser Pro Ala Asp Arg Glu Val Val Gly Ala Leu Thr 100 X t 105 110 Pro Lys Pro Gly Asp Trp Leu Leu Thr Lys Trp Arg Tyr Ser Ala Phe 115 120 125 Phe Asn Ser Asp Leu Leu Glu Arg Met Arg Ala Asn Gly Arg Asp Gin 130 135 140 Leu íle Leu Cys Gly Val Tyr Ala His Val Gly Val Leu íle Ser Thr 145 150 155 160 Val Asp Ala Tyr Ser Asn Asp íle Gin Pro Phe Leu Val Ala Asp Ala 165 170 175 íle Ala Asp Phe Ser Lys Glu His His Trp Met Pro Ser Asn Thr Pro 180 185 190 Pro Ala Val Ala Pro Cys HŤ «ΐ His His· Arg Arg Gly Gly Ala Met Ser 195 200 205 Gin Thr Ala Ala His Leu Met Glu Arg íle Leu Gin Pro Ala Pro Glu 210 215 220
    196
    Pro Phe Ala Leu Leu Tyr Arg Pro Glu Ser Ser Gly Pro Gly Leu Leu 225 230 235 240 Asp Val Leu íle Gly Glu Met Ser Glu Pro Gin Val Leu Ala Asp íle 245 250 255 Asp Leu Pro Ala Thr Ser íle Gly Ala Pro Arg Leu Asp Val Leu Ala 260 265 270 Leu íle Pro Tyr Arg Gin íle Ala Glu Arg Gly Phe Glu Ala Val Asp 275 280 285 Asp Glu Ser Pro Leu Leu Ala Met Asn íle Thr Glu Gin Gin Ser íle 290 295 300 Ser íle Glu Arg Leu Leu Gly Met Leu Pro Asn Val Pro íle Gin Leu 305 310 315 320 Asn Ser Glu Arg Phe Asp Leu Ser Asp Ala Ser Tyr Ala Glu íle Val 325 330 335
    Ser Gin Val íle Ala Asn Glu íle Glv Ser Gly Glu Gly Ala Asn Phe 340 345 350 Val íle Lys Arg Thr Phe Leu Ala Glu íle Ser Glu Tvr Gly Pro Ala 355 360 365 Ser Ala Leu Ser Phe Phe Arg His Leu Leu Glu Arg Glu Lys Gly Ala 370 375 380 Tyr Trp Thr Phe íle- íle His Thr Gly Ser Arg Thr Phe Val Gly Ala 385 390 395 400 Ser Pro Glu Arg His íle Ser íle Lys Asp Gly Leu Ser Val Met Asn 405 410 415 Pro íle Ser Gly Thr Tyr Arg Tyr Pro Pro Ala Gly Pro Asn Leu Ser 420 425 430 Glu Val Mét Asp Phe Leu Ala Asp Arg Lys Glu Ala Asp Glu Leu Tyr 435 440 445
    Met Val Val Asp Glu Glu Leu * 450 455
    197 (2) Informácie o SEQ ID č.: 19 (i) Charakteristika sekvencie:
    (A) Dĺžka: 388 aminokyselín (B) Typ: aminokyseliny (C) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: protein (iii) Opis sekvencie: SEQ ID č.:. 19
    Ala . Arg Ile Cys ' Glu . Asp 1 Gly Giv Eis Val : Leu Gly Pro ' Tyr 1 5 1Ô 15 Leu Lys Glu Met . Ala Eis Leu Ala Eis Thr Glu Tyr Phe íle Glu Gly 20 25 30 Lys Thr Eiis Arg Asp Val Arg Glu Ile Leu a rs—3 Glu Thr Leu Phe Ala 35 4Q 45 Pro Thr Val Thr Gly Ser Pro Leu Glu Ser Ala Cvs Arg Val Ile Gin 50 55 60 Are Tyr Xaa Pro Gin Gly Arg Ala Tyr Tyr Ser Gly Met Ala Ala Leu 65 70 75 80 Ile Gly Ser Asp Gly Lys Gly Gly Arg Ser Leu Asp Ser Ala íle Leu 85 90 95 Ile Arg Thr Ala Asp Ile Asp Asn Ser Gly Glu Val Arg Ile Ser Val 100 105 110 Gly Ser Thr Ile Val Arg His Ser Asp Pro Met Thr Glu Ala Ala Glu 115 120 125 • Ser Arg Ala Lys Ala Thr Gly Leu Ile Ser Ala Leu Lys Asn Gin Ala 130 135 140 Pro Ser Arg Phe Gly Asn His Leu Gin Val Arg Ala Ala Leu Ala Ser 145 150 155 160 Arg Asn Ala Tyr Val Ser Asp Phe Trp Leu Met Asp Ser Gin Gin Arg 165 170 175 Glu Gin He Gin Ala Asp Phe Ser Gly Arg Gin Val Leu Ile Val Asp 180 185 190 Ala Glu Asp Thr Phe Thr Ser Met Ile Ala Lys Gin Leu Arg Ala Leu 195 200 205 Gly Leu Val Val Thr Val Cys Ser Phe Ser Asp Glu Tyr Ser Phe Glu 210 215 220
    198
    Gly Tyr Asp Leu Val íle Met Gly Pro Gly Pro Gly Asn Pro Ser Glu 225 230 235 240 Val Gin Gin Pro Lys íle 245 Asn His Leu His Val Ala 250 íle Arg Ser Leu 255 Leu Ser Gin Gin Arg Pro Phe Leu Ala Val Cys Leu Ser His Gin Val
    260 265 270
    Leu Ser Leu 275 Cys Leu Gly Leu Glu 280 Leu Gin Arg Lys Ala 285 íle Pro Asn Gin Gly 290 VaJ. Gin Lys Gin íle 295 Asp Leu Phe Gly Asn 300 Val Glu Arg Val Gly 305 Phe Tyr Asn Thr Phe Ala 310 Ala Gin Ser Ser Ser 315 Asp Arg Leu Aso 320 íle Asp Gly íle Gly 325 Thr Val Glu íle Ser 330 Arg Asp Ser Glu Thr 335 Gly Glu Val His Ala 340 Leu Arg Gly Pro Ser 345 Phe Ala Ser Met Gin 350 Phe His Ala Glu Ser 355 Leu Leu Thr Gin Glu 360 Gly Pro Arg íle íle 365 Ala Asp Leu Leu Arg 370 His Ala Leu íle His 375 Thr Pro Val Glu Asn 380 Asn Ala Ser Ala
    Ala Gly Arg *
    199 (2) Informácie o SEQ ID č.: 20 (i) Charakteristika sekvencie:
    (A) DÍžka: 279 aminokyselín (B) Typ: aminokyseliny (C) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín
    (ii .i) Opi: s sekve :nci e: í SEQ ID v· C. : 20 Met His His Tyr Val íle íle Aso Ala Phe Ala Ser Val Pro Leu Glu 1 5 10 15 Gly Asn Pro Val Ala Val Phe Phe Aso Ala Asp Asp Leu Ser Ala Glu 20 25 30 Gin Met Gin Arg n a Ala Arg Glu Met Asn Leu Ser Glu Thr Thr Phe 35 40 45 Val Leu Lys Pro Arg Asn Cys Gly Asp Ala Leu íle Arg He Phe Thr 50 55 SO Pro Val Asn Glu Leu Pro Phe Ala Glv His Pro Leu Leu Gly Thr Aso 65 70 75 80 íle Ala Leu Glv Ala Arg Thr Asp Asn His Arg Leu Phe Leu Glu Thr 85 90 95 Gin Met Gly Thr íle Ala Phe Glu Leu Glu Arg Gin Asn Glv Ser Val 100 105 11Ô íle Ala Ala Ser Met Asp Gin Pro íle Pro Thr Trp Thr Ala Leu Gly 115 120 125 Arg Aso Ala Glu Leu Leu Lys Ala Leu Gly íle Ser Asp Ser Thr Phe 13*0 135 140 Pro íle Glu íle Tyr His Asn Gly Pro Arg His Val Phe Val Gly Leu 145 150 155 160 Pro Ser íle Ala Ala Leu Ser Ala Leu His Pro Asp His Arg Ala Leu 165 170 175 Tyr Ser Phe His Asp Met Ala íle Asn Cys Phe Ala Gly Ala Gly Arg 180 185 190 Arg Trp Arg Ser Arg Met Phe Ser Pro Ala Tyr Gly Val Val Glu Asp 195 200 205 Ala Xaa Thr Gly Ser Ala Ala Gly Pro Leu Ala ĽLe His Leu Ala Arg 210 215 220
    200
    His 225 Gly Gin íle Glu Phe 230 Gly Gin Gin íle Glu 235 íle Leu Gin Gly Val 240 Glu íle Gly Arg Pro 245 Ser Leu Met Phe Ala 250 Arg Ala Glu Gly Arg 255 Ala Asp Gin Leu Thr 260 Arg Val Glu Val Ser 265 Gly Asn Gly íle Thr Phe 270 Gly Arg Gly Thr íle Val Leu ★
    275
    201 (2) Informácie o SEQ ID č.: 21 (i) Charakteristika sekvencie:
    (A) Dĺžka: 1007 párov báz (B) Typ: kyselina nukleová (C) Reťazcovitosť: jednoduchý reťazec (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNK (genómová) (iii) Hypotetická: nie (iv) Anti-senza: nie (ix) Rysy:
    (A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestnenie: 1..669 (C) Ďalšie informácie: /gén=pzh4 /označenie=0RF4 /poznámka=Táto DNK sekvencia je opakovaná z SEQ ID č.:17 tak, že presahuje ORF4, môže byť samostatne prekladaná (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č.: 21
    ATG AAC, AGT TCA GTA CTA GGC AAG CCG CTG TTG GGT AAA /•r'»*’ ATG TCG Met 1 Asn Ser Ser Val 5 Leu Gly Lys Pro Leu 10 Leu Gly Lys Gly Met 15 Ser GAA TCG CTG ACC GGC ACA CTG GAT GCG CCG TTC CCC GAG TAC CAG AAG Glu Ser Leu Thr 20 Gly Thr Leu Asp Ala 25 Pro Phe Pro Glu Tyr 30 Gin Lys CCG CCT GCC GAT CCC ATG AGC GTG CTG CSC AAC TGG CTC GAA CGC GCA Pro Pro Ala 35 Asp Pro Met Ser Val 40 Leu His Asn Trp Leu 45 Glu Arg Ala CGC CGC GTG GGC ATC CGC GAA CCC CGT GCG CTG GCG CTG GCC ACG GCT Arg Arg Val Gly íle Arg Glu Pro Arg Ala Leu Ala Leu Ala Thr Ala
    202
    50 55 60
    GAC AGC CAG GGC CGG CCT TCG ACA CGC ATC GTG GTG ATC AGT GAG ATC 240 Aso 65 Ser Gin Gly Arg Pro 70 Ser Thr Arg íle Val 75 Val íle Ser Glu íle 80 AGT GA.C ACC GG<j GTG CTG TTC AGC ACC CAT GCC GGA AGC CAG AAA GGC 288 Ser Asp Thr Gly Val Leu Phe Ser Thr His Ala Gly Ser Gin Lys Gly 85 90 95 CG2 GAA CTG ACA GAG AAC CCC TGG GCC TCG GGG ACG CTG TAT TGG CGC 336 Arg Glu Leu Thr Glu Asn Pro Trp Ala Ser Gly Thr Leu Tyr Trp Arg 100 105 •110 GAA ACC AGC CAG CAG ATC ATC CTC AAT GGC CAG GCC GTG CGC ATG CCG 384 Glu Thr Ser Gin Gin íle íle Leu Asn Gly Gin Ala Val Arg Met Pro 115 120 125 GAT GCC AAG GCT GAC GAG GCC TGG TTG AAG CGC CCT TAT GCC ACG CAT 432 Asp Ala Lys Ala Asp Glu Ala Trp Leu Lys Arg Pro Tyr Ala Thr His 130 135 140 CCG ATG TCA TCG GTG TCT CGC CAG AGT GAA GAA CTC AAG GAT GTT CAA 480 Pro Met Ser Ser Val Ser Arg Gin Ser Glu Glu Leu Lys Aso Val Gin 145 150 155 160 GCC ATG CGC AAC GCC GCC AGG GAA CTG GCC GAG GTT GAA GGT CCG CTG 528 Ala Met Arg Asn Ala Ala Arg Glu Leu Ala Glu Val Gin Gly Pro Leu 165 170 175 CCG CGT CCC GAG GGT TAT TGC GTG TTT GAG TTA CGG CTT GAA TCG CTG 576 Pro Arg Pro Glu Gly Tyr Cys Val Phe Glu Leu Arg Leu Glu Ser Leu 180 185 190 GAG TTC TGG GCT AAC GGC GAG GAG CGC CTG GAT GAA.CGC TTG CGC TAT 624 Glu Phe Trp Gly Asn Gly Glu Glu Arg Leu His Glu Arg Leu Arg Tyr 195 200 205 GAC CGC AGC GCT GAA TGG AAA CAT CGC CGG TTA CAG CCA TAGGGTCCCG 676 Asp Arg Ser Ala Glu Gly Trp Lys His Arg Arg Leu Gin Pro 210 215 220
    CGATAÄACAT
    ACACTTATGA
    ATACCAAA.CA
    TTATAGTTGC
    TAAACÄAAGT
    GCTTTGAAGT
    CACCCGCTCA
    GAGACTCCGG
    TCTAGAACCT
    CAGACATTAC
    GCCTGGCTGC
    ACATGAGAAA
    ATCÄCCAAAG
    TGTCCTTGAC
    TGAGGCTGCT
    TATCTGAAAA GTGCAGAATC CTTCAAAGCT T
    TCCAGCTTCG
    AGTCCAGATG
    TCTGTAACGA
    CCAGCGATAG
    ACCATGCTAG
    AACTCATTGC GCAAACTTCA 736 CGAAAGAACG CGTATTCGAA 796 CATTAACTCC TATCTGAATT 856 ACATCGGGCC AGAACCTACA 916 ATTTTCAAAA CAAGCGTAAA 976
    1007
    203 (2) Informácie o SEQ ID č.: 22 (i) Charakteristika sekvencie:
    (A) Dĺžka: 222 aminokyselín (B) Typ:’ aminokyseliny (C) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (iii) Opis sekvencie: SEQ ID č.: 22
    Met Asn Ser Ser Val Leu Gly Lys Pro Leu Leu Gly Lys Gly Met Ser 1 5 10 15 Glu Ser Leu Thr Gly Thr Leu Asp Ala Pro Phe Pro Glu Tvr Gin Lys 20 25 30 Pro Pro Ala Asp Pro Met Ser Val Leu His Asn Trp Leu Glu Arg Ala 35 40 45 Arg Arg Val Gly íle Arg Glu Pro Arg Ala Leu Ala Leu Ala Thr Ala 50 55 60 As? Ser Gin Gly Pro Ser Thr Arg íle Val Val íle Ser Glu íle 65 70 75 80 Ser Asp Thr Gly Val Leu Phe Ser Thr His Ala Gly Ser Gin Lvs Gly 85 90 95 Arg Glu Leu Thr Glu Asn Pro Trp Ala Ser Gly Thr Leu Tvr Trp Arg 100 105 110 Glu Thr Ser Gin Gin íle íle Leu Asn Gly Gin Ala Val Arg Met Pro 115 120 125 Asp Ala Lys Ala Asp Glu Ala Trp Leu Lys Arg Pro Tyr Ala Thr His 130 135 140 Pro Met Ser Ser Val Ser Arg Gin Ser Glu Glu Leu Lys Asp Val Gin 145 150 155 160 Ala Met Arg Asn Ala Ala Arg Glu Leu Ala Glu Val Gin Gly Pro Leu 165 170 175 Pro Arg Pro Glu Gly Tyr Cys Val Phe Glu Leu Arg Leu Glu Ser Leu 180 185 190 Glu Phe Trp Gly Asn Gly Glu Glu Arg Leu His Glu Arg Leu Arg Tyr
    195 200 205
    Asp Arg Ser Ala Glu Gly Trp Lys His Arg Arg Leu Gin Pro 210 215 220
    204 ? P 45V<?- Ý c
    PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Molekula DNK vyznačená tým, že kóduje najmenej jeden biosyntetický enzým nutný pre biosyntetickú cestu antipatogénnej látky (APS), pričom APS je vybraná zo skupiny obsahujúcej pyrolnitrín a soraphen.
    2. Molekula DNK podľa nároku 1,vyznačená tým, že APS je pyrolnitrín.
    3. Molekula DNK podľa nároku 2, vyznačená tým, že že je získatelná z organizmu produkujúceho pyrolnitrín.
    4. Molekula DNK podľa nároku 2, vyznačená tým, že organizmus produkujúci pyrolnitrín je kmeň Pseudomonas.
    5. Molekula DNK podľa nároku 4, vyznačená tým, že je zahrnutá do plazmidu pCIB169, ktorý bol uložený pod prístupovým číslom NRRL B-21256, vrátane všetkých molekúl DNK, ktoré sú schopné s ňou hybridizovaú a stále kódujú jeden alebo viac enzýmov nutných pre biosyntetickú cestu pyrolnitrínu .
    6. Molekula DNK podľa nároku 4, vyznačená tým, že je lokalizovaná na 6,2 kb veľkom Xbal/NotI fragmente medzi pozíciami 423 a 2039, fragment je centrálne lokalizovaný v plazmide pCIB169, ktorý bol uložený pod prístupovým číslom NRRL B-21256 a zahrnuje všetky molekuly DNK, ktoré sú schopné s ňou hybridizovaú a stále kódujú jeden alebo viac enzýmov nutných pre biosyntetickú cestu pyrolnitrínu.
  7. 7. Molekula DNK podľa nároku 4, vyznačená tým, že je lokalizovaná na 6,2 kb veľkom Xbal/NotI fragmente a začína sa štartovacím kodónom GTG v pozícii 2039, tento fragment je centrálne lokalizovaný v plazmide pCIB169, ktorý bol uložený pod prístupovým číslom NRRL B-21256 a zahrnuje
    205 všetky molekuly DNK, ktoré sú schopné hybridizovať s touto molekulou a stále kódujú biosyntetický enzým nutný pre biosyntetickú cestu pyrolnitrínu.
  8. 8. Molekula DNK podľa nároku 4,vyznačená tým, že je lokalizovaná na 6,2 kb veľkom Xbal/NotI fragmente medzi pozíciami 3166 a 4869,tento fragment je centrálne lokalizovaný v plazmide pCIB169, ktorý bol uložený pod prístupovým číslom NRRL B-21256, vrátane všetkých molekúl DNK,. ktoré sú schopné hybridizovať s touto molekulou a stále kódujú biosyntetický enzým nutný pre biosyntetickú cestu pyrolnitrínu.
  9. 9. Molekula DNK podľa nároku 4,vyznačená tým, že je lokalizovaná na 6,2 kb veľkom Xbal/NotI fragmente medzi pozíciami 4894 a 5985, tento fragment je centrálne lokalizovaný v plazmide pCIB169, ktorý bol uložený pod prístupovým číslom NRRL B-21256, vrátane všetkých molekúl DNK, ktoré sú schopné s touto molekulou hybridizovať a stále kódujú biosyntetický enzým nutný pre biosyntetickú cestu pyrolnitrínu.
  10. 10. Molekula DNK podľa nároku 6, vyznačená tým, že kóduje proteínové sekvencie poskytované v SEQ ID č. 2.
  11. 11. Molekula DNK podľa nároku 8, vyznačená tým, že kóduje proteínové sekvencie poskytované v SEQ ID č. 4.
  12. 12. Molekula DNK podľa nároku 9, vyznačená tým, že kóduje proteínové sekvencie poskytované v SEQ ID č. 5.
  13. 13. Molekula DNK podľa nároku 1, vyznačená tým, že APS j e soraphen.
  14. 14. Molekula DNK podľa nároku 13, vyznačená tým, že má sekvencie dané v SEQ ID č. 6a zahrňuje všetky molekuly DNK, ktoré sú s ňou schopné hybridizovať a stále kódujú biosyntetický enzým nutný pre biosyntetickú cestu soraphenu .
    206
  15. 15. Molekula DNK podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 14, vyzná č e n á tým, že génové kodóny sú zamenené, aby zodpovedali preferenciám rastliny, zatiaľ čo kódované aminokyseliny sa nemenia.
  16. 16. Molekula DNK podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 15, vyzná č e n á tým, že je geneticky manipulovaná, aby sa stala súčasťou genómu rastliny.
  17. 17. Biosyntetický operón pre pyrolnitrín, vyznačený tým, že je izolovaný z organizmu produkujúceho pyrolnitrín, ktorý kóduje a exprimuje všetky enzýmy v biosyntetickej ceste pre pyrolnitrín, kedy zmenený operón je transformovaný do heterológneho hostiteľa.
  18. 18. Biosyntetický enzým, vyznačený tým, že je nutný v biosyntetickéj ceste antipatogénnej látky (APS), pričom APS je zo skupiny obsahujúcej pyrolnitrín a soraphen .
  19. 19. Biosyntetický enzým podľa nároku 18, vyznačený tým, že je kódovaný molekulou DNK obsiahnutou v plazmíde pCIB169, ktorý bol uložený pod prístupovým číslom NRRL B-21256, a alebo molekulou DNK, ktorá je schopná s ňou hybridizovať a stále kóduje biosyntetický enzým nutný pre biosyntetickú cestu pyrolnitrínu.
  20. 20. Biosyntetický enzým podľa nároku 18, vyznačený tým, že je kódovaný molekulou DNK lokalizovanou na 6,2 kb veľkom Xbal/NotI fragmente medzi pozíciami 423 a 2039, tento fragment je centrálne lokalizovaný v plazmide pCIB169, ktorý bol uložený pod prístupovým číslom NRRL B21256, a alebo molekulou DNK, ktoré sú schopné s ňou hybridizovať a stále kóduje biosyntetickú cestu pyrolnitrínu.
  21. 21. Biosyntetický enzým podľa nároku 18, vyznačený tým, že je kódovaný molekulou DNK lokalizovanou na 6,2 i
    207 kb veľkom Xbal/NotI fragmente a začína sa štartovacím kodónom GTG v pozícii 2039, tento fragment je centrálne lokalizovaný v plazmide pCIB169, ktorý bol uložený pod prístupovým Číslom NRRL B-21256, a alebo molekulou DNK, ktoré sú schopné s ňou hybridizovať a stále kóduje biosyntetickú cestu pyrolnitrínu.
  22. 22. Biosyntetický enzým podľa nároku 18, vyznačený tým, že je kódovaný molekulou DNK lokalizovanou na 6,2 kb veľkom Xbal/NotI fragmente medzi pozíciami 3166 a 4869, tento fragment je centrálne lokalizovaný v plazmide pCIB169, ktorý bol uložený pod prístupovým číslom NRRL B21256, a alebo molekulou DNK, ktoré sú schopné s ňou hybridizovať a stále kóduje biosyntetický enzým nutný pre biosyntetickú cestu pyrolnitrínu.
  23. 23. Biosyntetický enzým podľa nároku 18, vyznačený tým, že je kódovaný molekulou DNK lokalizovanou na 6,2 kb veľkom Xbal/NotI fragmente medzi pozíciami 4894 a 5985, tento fragment je centrálne lokalizovaný v plazmide pCIB169, ktorý bol uložený pod prístupovým číslom NRRL B21256, a alebo molekulou DNK, ktoré sú schopné s ňou hybridizovať a stále kóduje biosyntetickú cestu pyrolnitrínu.
  24. 24. Biosyntetický enzým podľa nároku 18, vyznačený tým, že APS je pyrolnitrín a enzým je zo skupiny, ktorá sa skladá zo sekvencií uvedených v SEQ ID č. 2 až 5.
  25. 25. Biosyntetický enzým podľa nároku 19, vyznačený tým, že APS je pyrolnitrín a enzým je kódovaný nukleotidovou sekvenciou udanou v SEQ ID č. 1.
  26. 26. Biosyntetický enzým podľa nároku 20, vyznačený tým, že sekvencia proteínu je poskytnutá v SEQ ID č. 2.
  27. 27. Biosyntetický enzým podľa nároku 21, vyznačený tým, že sekvencia proteínu je poskytnutá v SEQ ID č. 3.
    208
  28. 28. Biosyntetický enzým podľa nároku 22, vyznačený tým, že sekvencia proteínu je poskytnutá v SEQ ID č. 4.
  29. 29. Biosyntetický enzým podľa nároku 23 vyznačený tým, že sekvencia proteínu je poskytnutá v SEQ ID č. 5.
  30. 30. Biosyntetický enzým podľa nároku 18, vyznačený tým, že APS je soraphen a enzým je kódovaný sekvenciou udanou v SEQ ID č. 6.
  31. 31. Expresný vektor obsahujúci molekulu DNK podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 16, v y z n a č e n ý tým, že je schopný exprimovať jeden alebo viac enzýmov kódovaných molekulou DNK pri transformácii do hostiteľskej bunky.
  32. 32. Expresný vektor podľa nároku 31, vyznačený tým, že hostiteľská bunka je vybraná zo skupiny obsahujúcej bakteriálnu, hubovú, kvasinkovú a rastlinnú bunku.
  33. 33. Expresný vektor podľa nároku 32, vyznačený tým, že hostiteľská bunka je rastlinná bunka.
  34. 34. Expresný vektor podľa nároku 33, vyznačený tým, že molekula DNK je riadená promótorom a transkripčným terminátorom, ktoré sú funkčné v rastlinách.
  35. 35. Expresný vektor podľa nároku 34, vyznačený tým, že promótor je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z konštitučného promótora, chemicky regulovaného promótora, poškodením alebo patogénom indukovateľného promótora a tkanivovo špecifického promótora.
  36. 36. Expresný vektor podľa nároku 35, vyznačený tým, že tkanivovo špecifický promótor je koreňový špecifický promótor.
  37. 37. Expresný vektor podľa nároku 31, vyznačený tým, že obsahuje doplnkové sekvencie známe zvyšovaním expresie pripojeného štrukturálneho génu.
    209
  38. 38. Expresný vektor podľa nároku 33, vyznačený tým, že obsahuje doplnkové sekvencie známe cielením pripojeného štrukturálneho génu do rastlinného chloroplastu.
  39. 39. Hostiteľ transformovaný expresným vektorom podľa ľubovoľného z nárokov 31 až 32, vyznačený tým, že je zo skupiny obsahujúcej baktériu, hubu, kvasinku a rastlinu .
  40. 40. Hostiteľ podľa nároku 39, vyznačený tým, že je rastlina.
  41. 41. Hostiteľ podľa nároku 40, vyznačený tým, že je rastlina kukurice, pšenice alebo jačmeňa.
  42. 42. Hostiteľ podľa nároku 40, vyznačený tým, že je hybridná rastlina.
  43. 43. Množiaci materiál hostiteľa podľa ľubovoľného z nárokov 40 až 42, vyznačený tým, že obsahuje molekulu DNK stabilne integrovanú do genómu hostiteľa podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 6.
  44. 44. Množiaci materiál hostiteľa podľa nároku 43, vyznačený tým, že obsahuje semeno ošetrené ochranným povlakom zo skupiny zahrňujúcej herbicídy, insekticídy, baktericídy, nematocídy, moluskocídy alebo ich zmesi.
  45. 45. Hostiteľ schopný syntetizovať zvýšené množstvo antipatogénnej látky, prirodzene sa v ňom vyskytujúcej, vybranej zo skupiny obsahujúcej pyrolnitrín a soraphen vyznačený tým, že je transformovaný jednou alebo viacerými molekulami DNK, ktoré spoločne kódujú kompletnú sadu polypeptidov nutných pre syntézu antipatogénnej látky.
  46. 46. Hostiteľ ľubovoľného z nárokov, 39 až 45 vyznačený tým, že je biokontrolný agent.
    210
  47. 47. Hostiteľ podľa nároku 46, vyznačený tým, že je organizmus kolonizujúci rastlinu.
  48. 48. Hostiteľ ľubovoľného z nárokov 39 až 45, vyznačený tým, že je vhodný pre produkciu veľkého množstva APS.
  49. 49. Spôsob produkcie transgenickej rastliny obsahujúcej sadu molekúl DNK spoločne kódujúcich celú sadu enzýmov nutných pre syntézu antipatogénnej látky (APS), ktorá je zo skupiny obsahujúcej pyrolnitrín a soraphen a chráni rastlinu proti poškodeniu spôsobenému fytopatogénmi vyznačený tým, že biosyntetické gény jednotlivej APS sú najprv transformované do rôznych rastlín a výsledné rastliny sú krížené, pričom vznikajú rastliny, ktoré obsahujú a exprimujil uvedený biosyntetický gén jednotlivej · APS takým koordinovaným spôsobom, že antifytopatogénna látka je produkovaná v množstve, ktoré inhibuje fytopatogén.
  50. 50. Spôsob produkcie transgenickej rastliny obsahujúcej sadu molekúl DNK spoločne kódujúcich celú sadu enzýmov nutných pre syntézu antipatogénnej látky (APS), ktorá je zo skupiny obsahujúcej pyrolnitrín a soraphen a chráni rastlinu proti poškodeniu spôsobenému fytopatogénmi, vyznačený tým, že (a) transgenická rastlina, ktorá už obsahuje jeden alebo viac APS biosyntetických génov je transformovaná jedným alebo viacerými doplnkovými APS génmi;
    (b) rastlina je transformovaná použitím jedného transformačného vektora, ktorý nesie viacpočetné APS gény, pričom každý je regulovaný signálmi expresie, funkčnými v rastlinách, ako je produkcia anti-fytopatogénnej látky v množstve, ktoré inhibuje fytopatogén.
  51. 51. Spôsob podľa nároku 49 alebo 50, vyznačený tým, že obsahuje krok pohlavného alebo nepohlavného rozmnožovania primárneho transformantu tak, že najmenej jedna kópia exogénnej DNK vnesená do tohoto transformantu je stabilne
    V w*— i
    211 inkorporovaná do genómu progénu rastliny získaného týmto spôsobom.
  52. 52. Spôsob ochrany progénu transgenickej rastliny proti fytopatogénu, vyznačený tým, že zahŕňa (a) transformáciu rastliny jedným alebo viacerými vektormi, ktoré sú spoločne schopné exprimovať všetky biosyntetické enzýmy nevyhnutné pre produkciu anti-fytopatogénne látky v rastline v množstve, ktoré inhibuje patogén;
    (b) produkciu patogénov transgenických rastlín tak, že vektor DNK je stabilne inkorporovaný do genómu rastlinného progénu;
    (c) produkciu APS v bunkách rastlinného progénu v množstve, ktoré je antipatogénne účinné.
  53. 53. Spôsob ochrany rastlín proti fytopatogénu, vyznačený t ý m , že rastlina je ošetrená biokontrolným agent, ktorý je transformovaný jedným alebo viacerými vektormi, ktoré sú schopné spoločne exprimovať všetky biosyntetické enzýmy nevyhnutné pre produkciu antifytopatogénnej látky v množstve, ktoré inhibuje fytopatogén.
  54. 54. Spôsob produkcie veľkého množstva antipatogénnej látky (APS) jednotnej chirality zo skupiny obsahujúcej pyrolnitrín a soraphen, vyznačený tým, že zahŕňa (a) transformáciu hostiteľa jedným alebo viacerými vektormi, ktoré sú spoločne schopné exprimovať všetky biosyntetické enzýmy nevyhnutné pre produkciu APS v hostiteľovi.
    (b) rast hostiteľa v podmienkach, ktoré umožňujú produkciu APS, (c) získavanie APS z hostiteľa.
  55. 55. Zmes, vyznačená tým, že obsahuje antipatogénnu látku (APS) jednotnej chirality produkovanú spôsobom podľa nároku 54.
  56. 56. Zmes, vyznačená tým, že ako aktívnu zložku obsahuje antipatogénnu látku produkovanú rekombinantným
    Ii
    212 biokontrolným agent podľa nároku 46 alebo alternatívne obsahuje suspenziu alebo koncentrát biokontrolného agenta.
  57. 57. Spôsob ochrany rastliny proti fytopatogénu, vyznačený tým, že na rastlinu sa aplikuje zmes, ktorá obsahuje ako aktívnu zložku antipatogénnu látku produkovanú rekombinantným biokontrolným agentom podľa nároku 46 alebo alternatívne obsahuje suspenziu alebo koncentrát biokontrolného agenta v množstve, ktoré inhibuje fytopatogén.
  58. 58. Spôsob pre identifikáciu a izoláciu génu z mikroorganizmu, ktorý je nutný pre biosyntézu antipatogénnej látky (APS), vyznačený tým, že expresia génu prebieha za riadenia regulátora biosyntézy APS a zahŕňa (a) klonovanie knižnice genetických fragmentov z mikroorganizmu do vektora vedľa bezpromótorového reportného génu tak, že expresia reportného génu sa môže vyskytnúť iba v prípade, že funkciu promótora poskytuje klonovaný fragment, (b) transformáciu týchto vektorov do vhodného hostiteľa, (c) identifikáciu transformantov exprímujúcich reportný gén iba v prítomnosti regulátora, a (d) identifikáciu a izoláciu fragmentu DNK, ktorý je operabilne viazaný ku genetickému fragmentu prítomnému v transformantoch, pričom tento fragment kóduje jeden alebo viac biosyntetických enzýmov požadovaných na biosyntézu APS.
  59. 59. Použitie molekuly DNK podľa nároku 1 je vhodné pre genetickú manipuláciu hostiteľa pre expresiu antipatogénnej látky.
  60. 60. Použitie podľa nároku 59 vyznačené tým, že hostiteľ je zo skupiny obsahujúcej rastlinu, baktériu, kvasinku a hubu.
  61. 61. Použitie hostiteľa podľa nároku 46 na ochranu rastliny proti fytopatogénu.
    213
  62. 62. Použitie zmesi podľa nároku 55 alebo 56 na ochranu rast liny proti fytopatogénu.
  63. 63. Použitie molekuly DNK podľa nároku 16 na transfer schopnosti expresie antipatogénnej molekuly z rodičovskej rast liny na jej progény.
    ZtfV-fc’
    1/9
    ο.
    ζ cc
    ο.
    υ
    Ό
    C
    X
    -σ c
    : X az
    Ο.
    ο
    LU
    CC
    Ο.
    Ο cc
    Ο.
    Ο
    U1
    CC
    Οο
    LU
    CC
    ο.
    ο
    UJ
    C • CL X
    - ο. ί/3
    ΧΖ
    - α.
    ω
    -J3
    X
    ΙΌ
    CJ
    Ο
    CU
    ΙΌ
    ΙΌ
    -Q
    Ο
    2/9
    ΓΜ jQ
    O ω®w= en— W©
    -z _pq
    -w
    -w •w @— ©© ®a= l±r ©
    -w
    Xi
    ΙΖΊ
    3/9
    4/9
    EcoRI 3 EcoRl5 Notl
    EcoR^ EcoRI2 I EcoRI·] | | Hindllh Hindlll2 EcoRI EcoRI Notl pPRNlOX/N
    5/9 o
    MD
    LD
    00 r—( CM
    W — tJCM
    WT-f o
    OJ ,jQ pLi
    Pď
    O
    CM §
    o
    O iň o
    v o
    en o
    CM
    X3 o_Q
    O
    X
    6/9
    4Ste <?-<?£O
    CM
    7/9
    Tľ SS-C?o ca en
    ΓΜ xfm r* rn
    ĎO
    03cx o
    <
    £
    X
    X
    Q x
    **K
    va OCM cA-- > cu__- co •<ŕ fM CL. <J < £ f— k 52 O o a. CM CJ ŕ < ž fl < x 52 r*H kO en í“1 VA
    O xŕ oc
    CQ.--E (Z) - VA o5 * CQ ’ >
    Ď4 CQ >
    - - G.
    ου <
    £ 'Λ xtž
    QUJ
    ÍZ)
    QO <
    V)
    0t\ _Q
    O vO
    V .
    -LLl· - .
    UJ - - ΓΜ
    O
    É
    --<Z5
    VA
    T
    - - X*
    2Z £
    x.
    OU <
    £X
    -r- *\
    Q uj
    CO
    OJ
    Ό
    O ^r· „C.
    * W
    M I |V, ja >í «Λ vi (X
    U.
    CC
    O
    CC o
    {/)
    P
    ΓΊ
    J
    8/9
    co m
    JC
    9/9
    E_ w
    o σ>
SK1569-96A 1994-06-08 1995-05-30 A molecule of isolated dna for the synthesis of antipathogenic substances, vectors and hosts comprising this molecule and its use SK156996A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/258,261 US5639949A (en) 1990-08-20 1994-06-08 Genes for the synthesis of antipathogenic substances
PCT/IB1995/000414 WO1995033818A2 (en) 1994-06-08 1995-05-30 Genes for the synthesis of antipathogenic substances

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK156996A3 true SK156996A3 (en) 1997-08-06

Family

ID=22979791

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1569-96A SK156996A3 (en) 1994-06-08 1995-05-30 A molecule of isolated dna for the synthesis of antipathogenic substances, vectors and hosts comprising this molecule and its use

Country Status (18)

Country Link
US (6) US5639949A (sk)
EP (1) EP0759078A1 (sk)
JP (1) JPH10501125A (sk)
KR (1) KR100371904B1 (sk)
CN (2) CN1267557C (sk)
AU (1) AU695364B2 (sk)
BG (1) BG101107A (sk)
BR (1) BR9507948A (sk)
CA (1) CA2192366A1 (sk)
CZ (1) CZ291220B6 (sk)
EE (1) EE9600193A (sk)
HU (1) HUT76534A (sk)
IL (1) IL114018A (sk)
NZ (1) NZ285166A (sk)
PL (1) PL182136B1 (sk)
SK (1) SK156996A3 (sk)
WO (1) WO1995033818A2 (sk)
ZA (1) ZA954686B (sk)

Families Citing this family (626)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5639949A (en) * 1990-08-20 1997-06-17 Ciba-Geigy Corporation Genes for the synthesis of antipathogenic substances
US5716849A (en) * 1994-06-08 1998-02-10 Novartis Finance Corporation Genes for the biosynthesis of soraphen
US6117670A (en) * 1994-06-08 2000-09-12 Novartis Finance Corporation Pyrrolnitrin biosynthesis genes and uses thereof
US7285416B2 (en) 2000-01-24 2007-10-23 Gendaq Limited Regulated gene expression in plants
US7262055B2 (en) 1998-08-25 2007-08-28 Gendaq Limited Regulated gene expression in plants
AUPN283495A0 (en) 1995-05-05 1995-06-01 Australian National University, The Plant promoter activated by fungal infection
US5989903A (en) * 1995-06-07 1999-11-23 American Cyanamid Company Strain for the production of 6-dimethyltetracycline, method for producing the strain and vector for use in the method
US5965429A (en) * 1995-06-07 1999-10-12 American Cyanamid Company Strain for the production of 6-demethyltetracycline, method for producing the strain and vector for use in the method
CA2197160C (en) * 1996-02-22 2007-05-01 Stanley Gene Burgett Platenolide synthase gene
US5955348A (en) * 1997-11-25 1999-09-21 Novartis Ag Genetically modified pseudomonas strains with enhanced biocontrol activity
US5891688A (en) * 1996-12-06 1999-04-06 Novartis Finance Corporation DNA encoding lemA-independent GacA and its use in activating gene expression
AU5854498A (en) * 1996-12-06 1998-06-29 Novartis Ag Genetically modified (pseudomonas) strains with enhanced biocontrol activity
US5756087A (en) * 1996-12-06 1998-05-26 Novartis Finance Corporation Genetically modified Pseudomonas strains with enhanced biocontrol activity
US6033883A (en) 1996-12-18 2000-03-07 Kosan Biosciences, Inc. Production of polyketides in bacteria and yeast
US6096511A (en) * 1997-06-10 2000-08-01 Merck & Co., Inc. Protein elongation factor 2 as a target for antifungal and antiparasitic agents
KR100540287B1 (ko) * 1997-07-10 2006-01-10 코산 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 식물체 내에서 폴리케티드의 생산
US6486384B1 (en) * 1997-09-24 2002-11-26 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for transformation of cereals using cultured shoot meristematic tissue
US6261842B1 (en) 1997-10-23 2001-07-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Microorganism genomics, compositions and methods related thereto
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
FR2775000B1 (fr) * 1998-02-13 2002-02-08 Lvmh Rech Promoteur inductible dans les plantes, sequence incorporant ce promoteur et produit obtenu
FR2775001B1 (fr) * 1998-02-13 2000-05-12 Lvmh Rech Acide nucleique comprenant la sequence d'un promoteur inductible par un stress et une sequence d'un gene codant pour une stilbene synthase, cellule et plante transformees par cet acide nucleique
AU3196099A (en) 1998-03-27 1999-10-18 President And Fellows Of Harvard College Systematic identification of essential genes by (in vitro) transposon mutagenesis
WO1999053762A1 (en) * 1998-04-17 1999-10-28 Microbia, Inc. A method for efficient and highly selective control of microorganisms
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
US20020160441A1 (en) * 1998-06-02 2002-10-31 Merck & Co., Inc. Protein elongation factor 2 as a target for antifungal and antiparasitic agents
AU5209399A (en) 1998-07-10 2000-02-01 Cornell Research Foundation Inc. Recombinant constructs and systems for secretion of proteins via type iii secretion systems
US6538177B1 (en) 1998-07-15 2003-03-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for fumonisin detoxification
US6159736A (en) * 1998-09-23 2000-12-12 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for making insertional mutations using a Tn5 synaptic complex
EP1147229A2 (en) * 1999-02-02 2001-10-24 Bernhard O. Palsson Methods for identifying drug targets based on genomic sequence data
WO2000055340A1 (en) * 1999-03-15 2000-09-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for enhancing the disease resistance of plants
US6642353B1 (en) 1999-03-17 2003-11-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Peptide ligands for the erythropoietin receptor
JP4637372B2 (ja) * 1999-05-21 2011-02-23 カーギル ダウ エルエルシー 有機生成物の合成方法および合成材料
US6787318B1 (en) * 1999-06-01 2004-09-07 Roskamp Research Institute, Llc Assay for evaluating the therapeutic effectiveness of agents in reducing Alzheimer's disease pathology
US20070160615A1 (en) * 1999-06-01 2007-07-12 Jun Tan Methods and compounds for disruption of CD40R/CD40L signaling in the treatment of Alzheimer's disease
SG91822A1 (en) 1999-07-02 2002-10-15 Inst Of Molecular Agrobiology Global regulators of bacterial pathogenic genes as targets for engineering disease resistance
US6388171B1 (en) 1999-07-12 2002-05-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for fumonisin detoxification
MXPA02005868A (es) * 1999-12-15 2002-10-23 Syngenta Participations Ag Composiciones y metodos para reacciones de halogenacion.
CA2331674A1 (en) * 2000-01-28 2001-07-28 Southern Illinois University Isolated polynucleotides and polypeptides relating to loci underlying resistance to soybean cyst nematode and soybean sudden death syndrome and methods employing same
US20030084471A1 (en) 2000-03-16 2003-05-01 David Beach Methods and compositions for RNA interference
EP1728862A1 (en) 2000-03-16 2006-12-06 Genetica, Inc. Methods and compositions for RNA interference
JP4610044B2 (ja) * 2000-05-19 2011-01-12 岩手県 プロモーター遺伝子及び発現ベクター
JP4619487B2 (ja) * 2000-06-01 2011-01-26 岩手県 プロモーター遺伝子
WO2002016583A2 (en) * 2000-08-24 2002-02-28 Maxygen, Inc. Constructs and their use in metabolic pathway engineering
US20040115659A1 (en) * 2001-08-29 2004-06-17 Benjamin Geiger Methods of isolating genes encoding proteins of specific function and of screening for pharmaceutically active agents
IL154128A0 (en) * 2000-08-29 2003-07-31 Yeda Res & Dev Methods of isolating genes encoding proteins of specific function and of screening for pharmaceutically active agents
US6737260B1 (en) * 2000-09-29 2004-05-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Sequences encoding PhzO and methods
US20030157652A1 (en) * 2000-10-23 2003-08-21 Gramajo Hugo Cesar Antibiotic production (II)
CA2322105A1 (en) * 2000-10-23 2002-04-23 Plant Bioscience Limited Antibiotic production (ii)
US7127379B2 (en) * 2001-01-31 2006-10-24 The Regents Of The University Of California Method for the evolutionary design of biochemical reaction networks
WO2002070730A2 (en) * 2001-03-01 2002-09-12 The Regents Of The University Of California Models and methods for determining systemic properties of regulated reaction networks
ATE457359T1 (de) 2001-04-02 2010-02-15 Univ South Florida Auf lps-reagierendes chs1/beige-ähnliches anker- gen und therapeutische anwendungen davon
NZ529597A (en) * 2001-05-30 2005-12-23 Chromos Molecular Systems Inc Plant artificial chromosomes, uses thereof and methods of preparing plant artificial chromosomes
US7456335B2 (en) * 2001-09-03 2008-11-25 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences and their use in methods for achieving pathogen resistance in plants
US7751981B2 (en) * 2001-10-26 2010-07-06 The Regents Of The University Of California Articles of manufacture and methods for modeling Saccharomyces cerevisiae metabolism
US6806060B2 (en) * 2001-12-07 2004-10-19 Icoria, Inc. Methods for the identification of inhibitors of threonine synthase as antibiotics
US20030224363A1 (en) * 2002-03-19 2003-12-04 Park Sung M. Compositions and methods for modeling bacillus subtilis metabolism
DE10212892A1 (de) 2002-03-20 2003-10-09 Basf Plant Science Gmbh Konstrukte und Verfahren zur Regulation der Genexpression
US8949032B2 (en) * 2002-03-29 2015-02-03 Genomatica, Inc. Multicellular metabolic models and methods
CA2480216A1 (en) * 2002-03-29 2003-10-09 Genomatica, Inc. Human metabolic models and methods
US7856317B2 (en) * 2002-06-14 2010-12-21 Genomatica, Inc. Systems and methods for constructing genomic-based phenotypic models
US20030135880A1 (en) * 2002-07-02 2003-07-17 John Steffens Compositions and methods for halogenation reactions
EP2278018A3 (en) 2002-08-07 2012-01-04 BASF Plant Science GmbH Nucleic acid sequences encoding proteins associated with abiotic stress response
US7429691B2 (en) * 2002-09-03 2008-09-30 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for transformation and regeneration of maize
US9453251B2 (en) 2002-10-08 2016-09-27 Pfenex Inc. Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens
US7869957B2 (en) * 2002-10-15 2011-01-11 The Regents Of The University Of California Methods and systems to identify operational reaction pathways
CA2502863A1 (en) * 2002-10-15 2004-04-29 Phytovation B.V. Expressional enhancers from viruses
WO2004035009A2 (en) * 2002-10-15 2004-04-29 The Regents Of The University Of California Methods and systems to identify operational reaction pathways
AU2003284968A1 (en) * 2002-10-25 2004-05-13 University Of South Florida Methods and compounds for disruption of cd40r/cd40l signaling in the treatment of alzheimer's disease
AU2002952597A0 (en) * 2002-11-11 2002-11-28 Schering-Plough Pty. Limited Topical parasiticide formulations and methods of treatment
CN101018864A (zh) 2002-12-26 2007-08-15 先正达合作有限公司 细胞增殖相关多肽及其应用
WO2006032707A2 (en) 2004-09-24 2006-03-30 Basf Plant Science Gmbh Plant cells and plants with increased tolerance to environmental stress
AU2004261260B2 (en) * 2003-08-01 2011-01-27 A & G Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for restoring sensitivity to treatment with HER2 antagonists
BRPI0413118A (pt) 2003-08-01 2006-10-03 Basf Plant Science Gmbh construção de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, processo para a produção de um polipeptìdeo, polipeptìdeo, anticorpo, tecido vegetal, material de propagação, material coletado ou uma planta, método para a avaliação de agonistas e antagonistas de uma atividade de um poliptìdeo codificado pela molécula de ácido nucleico, processo para a identificação de um composto que confere produção de produto quìmico fino aumentada em uma planta ou microorganismo, método para a identificação de um produto genético que confere um aumento na produção de produto quìmico fino em uma célula, método para a produção de uma composição agrìcola, composição, e, uso da molécula de ácido nucleico, do polipeptìdeo, ou da construção de ácido nucleico, ou do produto genético identificado
WO2005023988A2 (en) * 2003-09-04 2005-03-17 Medtrain Technologies, Llc Modulation of cell intrinsic strain to control matrix synthesis, secretion, organization and remodeling
JP2007529199A (ja) 2003-10-23 2007-10-25 イルミジェン バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド ウイルス感染に対する抵抗性に関連する遺伝子である、ｏａｓ１における変異の検出
AU2005206951B2 (en) 2004-01-16 2010-08-19 Pfenex Inc. Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens
AR048669A1 (es) 2004-03-03 2006-05-17 Syngenta Ltd Derivados biciclicos de bisamida
BRPI0508518A (pt) 2004-03-08 2007-08-14 Syngenta Participations Ag proteìna e promotor de semente de milho rica em glutamina
CA2762011C (en) 2004-04-09 2019-05-07 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for control of insect infestations in plants
CA2559760A1 (en) 2004-07-02 2006-07-06 Metanomics Gmbh Process for the production of fine chemicals
AU2005269527B2 (en) 2004-07-26 2011-12-01 Pfenex Inc. Process for improved protein expression by strain engineering
GB0418047D0 (en) 2004-08-12 2004-09-15 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
GB0422401D0 (en) 2004-10-08 2004-11-10 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
US7595187B2 (en) * 2004-11-12 2009-09-29 Wyeth Elaiophylin biosynthetic gene cluster
EP1974049A2 (en) 2004-12-17 2008-10-01 Metanomics GmbH Process for the control of production of fine chemicals
US8519225B2 (en) 2006-02-10 2013-08-27 Monsanto Technology Llc Identification and use of target genes for control of plant parasitic nematodes
US9085774B2 (en) 2005-04-19 2015-07-21 Basf Plant Science Gmbh Methods controlling gene expression
CA2615547A1 (en) 2005-07-21 2007-01-25 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions comprising tebuconazole
WO2007022447A1 (en) * 2005-08-18 2007-02-22 University Of Tennessee Research Foundation Insecticidal compositions and methods of using the same
BRPI0615791B1 (pt) 2005-09-16 2018-04-03 Devgen Nv Rna de fita dupla isolado compreendendo fitas complementares aneladas, método de controle de infestação de peste e uso de uma ração artificial compreendendo a sequência de ribonucleotídeo de fita dupla para tratar infestação de plantas por insetos
MX348513B (es) 2005-09-16 2017-06-16 Devgen Nv Metodos para controlar plagas utilizando arni.
EP1763998B1 (en) 2005-09-16 2007-05-23 Syngenta Participations AG Fungicidal compositions
BRPI0616181B1 (pt) 2005-09-16 2024-03-05 Monsanto Technology Llc Construção de polinucleotídeo isolada, sequência de ribonucleotídeo de fita dupla, microrganismo transgênico, seu método de produção, e métodos para controle de infestação por coleóptero praga, para melhorar o rendimento e a tolerância a estiagem de um cultivo, e para produção de um produto comercial, alimento ou ração
CN101268194A (zh) 2005-09-20 2008-09-17 巴斯福植物科学有限公司 使用ta-siRNA调控基因表达的方法
DK1928238T3 (da) 2005-09-29 2009-08-17 Syngeta Participations Ag Fungicid sammensætning indeholdende cyprodinil
EP2092823A3 (en) 2005-09-29 2009-12-23 Syngenta Participations AG Fungicidal compositions
EP1776864A1 (en) 2005-10-20 2007-04-25 Syngenta Participations AG Fungicidal compositions
CA2628505A1 (en) 2005-11-08 2007-05-18 Basf Plant Science Gmbh Use of armadillo repeat (arm1) polynucleotides for obtaining resistance to pathogens in plants
WO2007087153A2 (en) 2006-01-06 2007-08-02 University Of Georgia Research Foundation Cyst nematode resistant transgenic plants
WO2007080143A1 (en) 2006-01-12 2007-07-19 Basf Plant Science Gmbh Use of stomatin (stm1) polynucleotides for achieving a pathogen resistance in plants
UY30090A1 (es) 2006-01-16 2007-08-31 Syngenta Participations Ag Insecticidas novedosos
WO2007090623A2 (en) 2006-02-09 2007-08-16 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
WO2007095496A2 (en) 2006-02-13 2007-08-23 Monsanto Technology Llc Selecting and stabilizing dsrna constructs
AU2007299219A1 (en) 2006-04-05 2008-03-27 Metanomics Gmbh Process for the production of a fine chemical
WO2007139584A2 (en) * 2006-05-25 2007-12-06 Institute For Advanced Study Methods for identifying sequence motifs, and applications thereof
US9315818B2 (en) 2006-06-07 2016-04-19 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Plant expression constructs and methods of utilizing same
US8188088B2 (en) 2006-06-16 2012-05-29 Syngenta Participations Ag Ethenyl carboxamide derivatives useful as microbiocides
US7847152B2 (en) * 2006-06-30 2010-12-07 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Use of tryptophan indole and anthranilate analogs as plant transformation selection agents
EP2468298B1 (en) 2006-07-13 2015-09-02 Institute For Advanced Study Methods of optimizing vaccine production
EP2069389B1 (en) 2006-08-04 2014-10-08 BP Corporation North America Inc. Glucanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
JP5424881B2 (ja) 2006-09-18 2014-02-26 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 殺有害生物混合物
DK2057178T3 (da) 2006-09-21 2014-02-03 Verenium Corp Phytaser, nucleinsyrer, som koder for dem, og fremgangsmåder til at fremstille og benytte dem
HUE033455T2 (en) 2006-12-21 2017-12-28 Basf Enzymes Llc Amylases and glucoamylases, nucleic acids encoding them, and methods for their preparation and use
AU2008206975B2 (en) 2007-01-15 2013-05-02 Basf Plant Science Gmbh Use of subtilisin (RNR9) polynucleotides for achieving a pathogen resistance in plants
CN101631868B (zh) 2007-02-16 2016-02-10 巴斯福植物科学有限公司 用于在单子叶植物中调节胚特异性表达的核酸序列
EP2425709B1 (en) * 2007-03-09 2017-11-15 Monsanto Technology, LLC Preparation and use of plant embryo explants for transformation
DE102008059357A1 (de) 2007-03-22 2009-04-23 Sumitomo Chemical Co. Ltd. Agrochemische Zusammensetzung zur Bekämpfung oder Prophylaxe von durch pflanzenpathogene Mikroben verursachten Pflanzenkrankheiten
ES2325523B1 (es) 2007-03-22 2010-06-24 Sumitomo Chemical Company, Limited Composicion agricola para controlar o prevenir enfermedades de las plantas provocadas por microbios patogeos de las plantas.
JP5256753B2 (ja) 2007-03-29 2013-08-07 住友化学株式会社 イソオキサゾリン化合物とその有害生物防除用途
CA2584934A1 (en) 2007-04-17 2008-10-17 University Of Guelph Nitrogen-regulated sugar sensing gene and protein and modulation thereof
PL2204093T3 (pl) 2007-04-25 2012-02-29 Syngenta Participations Ag Kompozycje grzybobójcze
JP2008291012A (ja) 2007-04-27 2008-12-04 Sumitomo Chemical Co Ltd アミド化合物ならびにその植物病害防除用途
US9580719B2 (en) 2007-04-27 2017-02-28 Pfenex, Inc. Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins
JP2008291013A (ja) 2007-04-27 2008-12-04 Sumitomo Chemical Co Ltd アミド化合物およびその植物病害防除用途
WO2008136387A1 (ja) 2007-04-27 2008-11-13 Sumitomo Chemical Company, Limited アミド化合物とその用途
EP2142651B1 (en) 2007-04-27 2013-05-22 Pfenex Inc. Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins
JP2008291022A (ja) 2007-04-27 2008-12-04 Sumitomo Chemical Co Ltd アミド化合物及びその用途
AU2008252998A1 (en) 2007-05-22 2008-11-27 Basf Plant Science Gmbh Plant cells and plants with increased tolerance and/or resistance to environmental stress and increased biomass production-KO
US20100137445A1 (en) 2007-06-29 2010-06-03 Sumitomo Chemical Company ,Limited Plant disease control agent, and plant disease control method
ES2377588T3 (es) 2007-07-16 2012-03-29 Syngenta Participations Ag Insecticidas de antranilamida condensada
US20090023182A1 (en) * 2007-07-18 2009-01-22 Schilling Christophe H Complementary metabolizing organisms and methods of making same
WO2009019289A1 (en) * 2007-08-09 2009-02-12 Novartis Ag Thiopeptide precursor protein, gene encoding it and uses thereof
GB0716414D0 (en) 2007-08-22 2007-10-03 Syngenta Participations Ag Novel insecticides
EP2053046A1 (en) 2007-10-26 2009-04-29 Syngeta Participations AG Novel imidazole derivatives
EP2053044A1 (en) 2007-10-26 2009-04-29 Syngenta Participations AG Novel imidazole derivatives
EP2053045A1 (en) 2007-10-26 2009-04-29 Syngenta Participations AG Novel imidazole derivatives
ES2370959T3 (es) 2007-11-20 2011-12-26 Sumitomo Chemical Company, Limited Compuesto de piridina, composición plaguicida y método para controlar plagas.
AR069894A1 (es) * 2007-12-21 2010-02-24 Basf Plant Science Gmbh Plantas con mayor rendimiento produciendo un knock out (silenciamiento) en genes relacionados con la eficiencia en el uso de nitrogeno (ko nue)"
JP5347463B2 (ja) 2007-12-26 2013-11-20 住友化学株式会社 除草用組成物
GB0800762D0 (en) 2008-01-16 2008-02-27 Syngenta Participations Ag Novel pyridazine derivatives
FR2928070A1 (fr) 2008-02-27 2009-09-04 Sumitomo Chemical Co Composition agricole, utilisation d'un compose pour sa production et procede pour matriser ou prevenir les maladies des plantes.
WO2009116658A1 (ja) 2008-03-21 2009-09-24 住友化学株式会社 植物病害防除組成物
JP5365041B2 (ja) 2008-03-25 2013-12-11 住友化学株式会社 植物病害防除組成物および植物病害防除方法
JP5365047B2 (ja) 2008-03-28 2013-12-11 住友化学株式会社 植物病害防除組成物および植物病害防除方法
JP5369854B2 (ja) 2008-04-21 2013-12-18 住友化学株式会社 有害節足動物防除組成物および縮合複素環化合物
US8487159B2 (en) * 2008-04-28 2013-07-16 Metabolix, Inc. Production of polyhydroxybutyrate in switchgrass
TWI526535B (zh) 2008-09-12 2016-03-21 住友化學股份有限公司 噻唑菌胺對於基因轉殖植物在植物病害之防治方法的用途
TWI489941B (zh) 2008-09-19 2015-07-01 Sumitomo Chemical Co 種子處理劑及保護植物的方法
US20110201649A1 (en) 2008-09-19 2011-08-18 Sumitomo Chemical Company, Limited agricultural composition
JP5355053B2 (ja) 2008-09-19 2013-11-27 住友化学株式会社 有害生物防除用組成物及び有害生物の防除方法
JP2010100611A (ja) 2008-09-26 2010-05-06 Sumitomo Chemical Co Ltd ピリジン化合物及びその有害生物の防除用途
JP2010090089A (ja) 2008-10-10 2010-04-22 Sumitomo Chemical Co Ltd 有害生物防除組成物及び有害生物の防除方法
JP2010090090A (ja) 2008-10-10 2010-04-22 Sumitomo Chemical Co Ltd 有害生物防除組成物及び有害生物の防除方法
WO2010046422A2 (en) 2008-10-22 2010-04-29 Basf Se Use of auxin type herbicides on cultivated plants
WO2010046423A2 (en) 2008-10-22 2010-04-29 Basf Se Use of sulfonylurea herbicides on cultivated plants
JP5365161B2 (ja) 2008-11-25 2013-12-11 住友化学株式会社 植物病害防除用組成物及び植物病害の防除方法
JP5359223B2 (ja) 2008-11-25 2013-12-04 住友化学株式会社 植物病害防除用組成物及び植物病害の防除方法
JP5365159B2 (ja) 2008-11-25 2013-12-11 住友化学株式会社 有害生物防除用組成物及び有害生物の防除方法
JP5417814B2 (ja) 2008-11-25 2014-02-19 住友化学株式会社 植物病害防除用組成物及び植物病害の防除方法
JP5365158B2 (ja) 2008-11-25 2013-12-11 住友化学株式会社 植物病害防除用組成物及び植物病害の防除方法
CN102292101A (zh) 2008-11-26 2011-12-21 五佳医疗股份有限公司 通过serpine2来调节胶原和平滑肌肌动蛋白表达的组合物和方法
MX338502B (es) 2009-01-30 2016-04-20 Sumitomo Chemical Co Semilla recubierta.
US8309530B2 (en) * 2009-02-04 2012-11-13 Washington State University Compositions and methods for modulating ghrelin-mediated conditions
JP2010222342A (ja) 2009-02-26 2010-10-07 Sumitomo Chemical Co Ltd 有害生物防除組成物
JP2010222343A (ja) 2009-02-26 2010-10-07 Sumitomo Chemical Co Ltd 有害生物防除組成物
GB0903955D0 (en) 2009-03-06 2009-04-22 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
GB0904315D0 (en) 2009-03-12 2009-04-22 Syngenta Participations Ag Novel imidazole derivatives
JP2010235603A (ja) 2009-03-13 2010-10-21 Sumitomo Chemical Co Ltd ピリダジノン化合物及びその用途
GB0906515D0 (en) 2009-04-15 2009-05-20 Syngenta Participations Ag Fungical compositions
WO2010127182A1 (en) * 2009-04-29 2010-11-04 Evolugate, Llc Adapting microorganisms for agricultural products
AU2010249500B2 (en) 2009-05-21 2016-03-24 Basf Enzymes Llc Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
UA107938C2 (en) 2009-08-12 2015-03-10 Syngenta Participations Ag Heterocycles with microbicidal properties
BR112012002369A2 (pt) 2009-08-12 2019-09-24 Syngenta Participations Ag heterociclos microbicidas
WO2011022435A2 (en) * 2009-08-17 2011-02-24 Eudes De Crecy Biocontrol microorganisms
US8357634B2 (en) 2009-08-25 2013-01-22 Syngenta Crop Protection Llc N-alkoxycarboxamides and their use as microbiocides
US8450090B2 (en) 2009-10-06 2013-05-28 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for promoting fatty acid production in plants
US8357635B2 (en) 2009-10-16 2013-01-22 Syngenta Crop Protection Llc Microbiocides
WO2011048120A1 (en) 2009-10-22 2011-04-28 Syngenta Participations Ag Synergistic fungicidal composition containing a n-2-(pyrazolyl) ethylphenylcarboxamide
EP2314707A1 (en) 2009-10-26 2011-04-27 Amarna Therapeutics B.V. Method for the expression of a recombinant protein in a mammalian cell
GB0920893D0 (en) 2009-11-27 2010-01-13 Syngenta Participations Ag Plant growth regulation
GB0920892D0 (en) 2009-11-27 2010-01-13 Syngenta Participations Ag Plant growth regulation
CA2779028A1 (en) 2009-11-27 2011-06-03 Syngenta Participations Ag Plant growth regulation
GB0921346D0 (en) 2009-12-04 2010-01-20 Syngenta Participations Ag Chemical compounds
GB0921344D0 (en) 2009-12-04 2010-01-20 Syngenta Participations Ag Chemical compounds
GB0921343D0 (en) 2009-12-04 2010-01-20 Syngenta Participations Ag Chemical compounds
US20130053385A1 (en) 2009-12-18 2013-02-28 Syngenta Limited Method of combating and controlling pests
US8629286B2 (en) 2009-12-22 2014-01-14 Syngenta Crop Protection, Llc Pyrazole derivatives
GB0922376D0 (en) 2009-12-22 2010-02-03 Syngenta Participations Ag Novel compounds
WO2011082913A1 (en) 2010-01-08 2011-07-14 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions containing isopyrazam, azoxystrobin and cyproconazole
US8658644B2 (en) 2010-02-04 2014-02-25 Syngenta Crop Protection, Llc Pyridazine derivatives, processes for their preparation and their use as fungicides
WO2011095459A1 (en) 2010-02-04 2011-08-11 Syngenta Participations Ag Pyridazine derivatives, process for their preparation and their use as fungicides
ES2446726T3 (es) 2010-02-18 2014-03-10 Syngenta Participations Ag Microbiocidas pirazólicos
CN102770433A (zh) 2010-02-24 2012-11-07 先正达参股股份有限公司 新颖的杀微生物剂
EP2538788A1 (en) 2010-02-25 2013-01-02 Syngenta Participations AG Pesticidal mixtures containing isoxazoline derivatives and insecticide or nematoicidal biological agent
BR112012021238A2 (pt) 2010-02-25 2016-06-21 Syngenta Ltd misturas pesticidas contendo derivados de isoxazolina e um fungicida
EA201201325A1 (ru) 2010-03-24 2013-04-30 Зингента Партисипейшнс Аг Пестицидные смеси
ES2602741T3 (es) 2010-04-30 2017-02-22 Syngenta Participations Ag Un método para reducir infecciones virales transmitidas por insectos
BR112012030122B1 (pt) 2010-05-28 2021-03-30 Syngenta Participations Ag Compostos derivados de pirazolcarboxamida, método de controle ou prevenção de infestação de plantas úteis por microrganismos fitopatogênicos e composição para controle e proteção contra microrganismos fitopatogênicos
EP2575469B1 (en) 2010-05-31 2018-03-14 Syngenta Participations AG Pesticidal compositions
US9023760B2 (en) 2010-05-31 2015-05-05 Syngenta Participations Ag 1, 8-diazaspiro [4.5] decane-2, 4-dione derivatives useful as pesticides
US20130210625A1 (en) 2010-05-31 2013-08-15 Syngenta Crop Protection Llc Spiroheterocyclic pyrrolidine derivatives based pesticides
KR20130080485A (ko) 2010-05-31 2013-07-12 신젠타 파티서페이션즈 아게 작물 강화 방법
TW201208573A (en) 2010-05-31 2012-03-01 Syngenta Participations Ag Pesticidal compositions
CN103003276A (zh) 2010-05-31 2013-03-27 先正达参股股份有限公司 作为杀虫剂有用的1,8-二氮杂螺[4.5]癸烷-2,4-二酮衍生物
EP2392210A1 (en) 2010-06-04 2011-12-07 Syngenta Participations AG Methods for increasing stress tolerance in plants
US20130203591A1 (en) 2010-06-09 2013-08-08 Syngenta Crop Protection Llc Pesticidal mixtures including isoxazoline derivatives
US20130210623A1 (en) 2010-06-09 2013-08-15 Syngenta Crop Protection Llc Pesticidal mixtures including isoxazoline derivatives
US20130261069A1 (en) 2010-06-09 2013-10-03 Syngenta Crop Protection Llc Pesticidal mixtures comprising isoxazoline derivatives
HUE026989T2 (en) 2010-06-29 2016-08-29 Fmc Corp 6-acyl-1,2,4-triazine-3,5-dione derivative and herbicides
WO2012001040A1 (en) 2010-07-02 2012-01-05 Syngenta Participations Ag Novel microbiocidal dioxime ether derivatives
BR112013001265A2 (pt) 2010-07-19 2016-05-17 Syngenta Participations Ag microbicidas
US20130252972A1 (en) 2010-07-19 2013-09-26 Syngenta Crop Protection Llc Isoxazole, isothiazole, furane and thiophene compounds as microbicides
TW201211005A (en) 2010-07-29 2012-03-16 Syngenta Participations Ag Novel microbiocidal dioxime ether derivatives
BR112013005973A2 (pt) 2010-09-15 2019-09-24 Metabolix Inc aumento do fluxo de carbono para a produção de poli-hidroxibutirato em culturas de biomassa
EP2619181A1 (en) 2010-09-23 2013-07-31 Syngenta Participations AG Novel microbiocides
JP4991973B2 (ja) 2010-09-29 2012-08-08 東海ゴム工業株式会社 水系ホース用ゴム組成物およびそれを用いて得られる水系ホース
AR083112A1 (es) 2010-10-01 2013-01-30 Syngenta Participations Ag Metodo para controlar enfermedades fitopatogenas y composiciones fungicidas utiles para dicho control
EP2625269A2 (en) 2010-10-06 2013-08-14 BP Corporation North America Inc. Variant cbh i polypeptides with reduced product inhibition
ES2617563T3 (es) 2010-10-21 2017-06-19 Syngenta Participations Ag Composiciones que comprenden ácido abscísico y un compuesto fungicidamente activo
CN103201265A (zh) 2010-11-12 2013-07-10 先正达参股股份有限公司 新颖的杀微生物剂
WO2012066122A1 (en) 2010-11-18 2012-05-24 Syngenta Participations Ag 2 - (pyridin- 2 -yl) -quinazoline derivatives and their use as microbicides
EP2643312B1 (en) 2010-11-25 2014-09-10 Syngenta Participations AG Microbicidal heterocycles
WO2012069601A1 (en) 2010-11-25 2012-05-31 Syngenta Participations Ag Substituted quinazolines as fungicides
WO2012080419A1 (en) 2010-12-15 2012-06-21 Syngenta Participations Ag Pesticidal mixtures
US20130267415A1 (en) 2010-12-15 2013-10-10 Syngenta Participations Ag Pesticidal mixtures
WO2012090969A1 (en) 2010-12-27 2012-07-05 Sumitomo Chemical Company, Limited Amidine compounds and use thereof for plant disease control
JP5842594B2 (ja) 2010-12-27 2016-01-13 住友化学株式会社 ピリダジノン化合物、それを含有する除草剤及び有害節足動物防除剤
MX353321B (es) 2010-12-30 2018-01-05 Dow Agrosciences Llc Moleculas de acido nucleico dirigidas a la subunidad de atpasa c vacuolar y que confieren resistencia a las plagas de coleopteros.
UY33853A (es) 2010-12-30 2012-07-31 Dow Agrosciences Llc ?moléculas de ácido nucleico que se dirigen a la subunidad h de la atpasa vacuolar y confieren resistencia a plagas de coleópteros?.
AU2011352005B2 (en) 2010-12-30 2017-03-16 Dow Agrosciences Llc Nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran pests
EP2658976A4 (en) 2010-12-30 2014-10-22 Dow Agrosciences Llc NUCLEIC ACID MOLECULES THAT TARGET THE SMALL RHO1 PROTEIN BINDING THE GTP AND CONFERENCE RESISTANCE TO HARMFUL COLEOPTERS
BR112013017060A2 (pt) 2011-01-05 2016-09-20 Syngenta Participations Ag derivados de pirasol-4-il carboxamida como microbiocidas
KR20140051835A (ko) 2011-02-09 2014-05-02 신젠타 파티서페이션즈 아게 살곤충 화합물
BR112013020270A2 (pt) 2011-02-10 2016-07-12 Syngenta Participations Ag derivados de pirazol microbicidas
EP2673272A1 (en) 2011-02-10 2013-12-18 Syngenta Participations AG Microbiocidal pyrazole derivatives
ES2532715T3 (es) 2011-02-21 2015-03-31 Syngenta Participations Ag Nuevos microbicidas de carboxamida
JP2011137030A (ja) 2011-03-01 2011-07-14 Sumitomo Chemical Co Ltd 有害生物防除組成物及び有害生物の防除方法。
WO2012117021A2 (en) 2011-03-03 2012-09-07 Syngenta Participations Ag Novel microbiocidal oxime ethers
TWI535706B (zh) 2011-03-07 2016-06-01 住友化學股份有限公司 水稻栽培中之雜草防治方法
TWI634840B (zh) 2011-03-31 2018-09-11 先正達合夥公司 植物生長調節組成物及使用其之方法
WO2012143395A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Syngenta Participations Ag 4,5-dihydro-isoxazole derivatives as fungicides
WO2012159891A1 (en) 2011-05-20 2012-11-29 Syngenta Participations Ag Endosperm-specific plant promoters and uses therefor
EP2532661A1 (en) 2011-06-10 2012-12-12 Syngenta Participations AG Novel insecticides
AR087008A1 (es) 2011-06-22 2014-02-05 Syngenta Participations Ag Derivados de n-oxi-pirazolo-triazepina-diona
EP2540718A1 (en) 2011-06-29 2013-01-02 Syngenta Participations AG. Novel insecticides
CN103635086B (zh) 2011-06-29 2016-05-18 日本农药株式会社 农业园艺用杀虫剂组合物及其使用方法
WO2013000941A1 (en) 2011-06-30 2013-01-03 Syngenta Participations Ag Microbiocidal heterocycles
EA025423B1 (ru) 2011-06-30 2016-12-30 Зингента Партисипейшнс Аг Микробиоцидные гетероциклы
WO2013007550A1 (en) 2011-07-08 2013-01-17 Syngenta Participations Ag Fungicide mixtures
WO2013011010A1 (en) 2011-07-19 2013-01-24 Syngenta Participations Ag Fungizide mixtures
UY34279A (es) 2011-08-23 2013-04-05 Syngenta Participations Ag Compuestos heterocíclicos activos como microbiocidas, intermediarios, composiciones y usos
TW201325454A (zh) 2011-09-16 2013-07-01 Syngenta Participations Ag 植物生長調控
WO2013037758A1 (en) 2011-09-16 2013-03-21 Syngenta Participations Ag Crop enhancement with cis-jasmone
BR112014008186A2 (pt) 2011-10-07 2017-04-11 Syngenta Participations Ag método para proteção de plantas úteis ou material de propagação de plantas
BR112014009086A2 (pt) 2011-10-18 2017-05-09 Syngenta Participations Ag derivados pirazol microbicidas
CN103889982A (zh) 2011-10-18 2014-06-25 先正达参股股份有限公司 杀微生物的吡唑衍生物
WO2013079350A1 (en) 2011-11-29 2013-06-06 Syngenta Participations Ag Insecticidal triazinone derivatives
TWI572282B (zh) 2011-11-30 2017-03-01 先正達合夥公司 含有螺雜環吡咯啶二酮的殺有害生物混合物
WO2013092460A1 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Syngenta Participations Ag Cyclic bisoxime microbicides
EP2804481A2 (en) 2012-01-17 2014-11-26 Syngenta Participations AG Pesticidal mixtures including spiroheterocyclic pyrrolidine diones
CN104053360B (zh) 2012-01-17 2017-06-09 先正达参股股份有限公司 含螺杂环吡咯烷二酮的杀有害生物混合物
WO2013107794A2 (en) 2012-01-17 2013-07-25 Syngenta Participations Ag Pesticidal mixtures including spiroheterocyclic pyrrolidine diones
KR102022111B1 (ko) 2012-01-17 2019-09-17 신젠타 파티서페이션즈 아게 스피로헤테로사이클릭 피롤리딘 디온을 포함하는 살충 혼합물
WO2013120729A1 (en) 2012-02-13 2013-08-22 Syngenta Participations Ag Plant growth regulation
WO2013127780A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Syngenta Participations Ag Chemical compounds
WO2013127768A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Syngenta Participations Ag Pyridine carboxamide pesticides
WO2013127808A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Syngenta Participations Ag Microbiocidal pyrazole derivatives
EP2820011A1 (en) 2012-03-02 2015-01-07 Syngenta Participations AG Microbiocidal pyrazole derivatives
EP2820012A1 (en) 2012-03-02 2015-01-07 Syngenta Participations AG Microbiocidal pyrazole derivatives
EP2641901A1 (en) 2012-03-22 2013-09-25 Syngenta Participations AG. Novel microbiocides
EP2647626A1 (en) 2012-04-03 2013-10-09 Syngenta Participations AG. 1-Aza-spiro[4.5]dec-3-ene and 1,8-diaza-spiro[4.5]dec-3-ene derivatives as pesticides
WO2013156431A1 (en) 2012-04-17 2013-10-24 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyridyl- and pyrimidyl- substituted thiazole and thiadiazole derivatives
WO2013156433A1 (en) 2012-04-17 2013-10-24 Syngenta Participations Ag Insecticidally active thiazole derivatives
EP2659777A1 (en) 2012-05-04 2013-11-06 Syngenta Participations AG. New use of a pesticide
WO2013167651A1 (en) 2012-05-11 2013-11-14 Syngenta Participations Ag Crop enhancement
EP2671881A1 (en) 2012-06-07 2013-12-11 Syngenta Participations AG. Pesticidally active pyridyl- and pyrimidyl- substituted thiazole derivatives
GB201210398D0 (en) 2012-06-11 2012-07-25 Syngenta Participations Ag Crop enhancement
WO2014023531A1 (en) 2012-08-07 2014-02-13 Syngenta Participations Ag Trifluoromethylpyridine carboxamides as pesticides
AR093243A1 (es) 2012-10-01 2015-05-27 Basf Se Uso de compuestos de n-tio-antranilamida en plantas cultivadas
WO2014060176A1 (en) 2012-10-16 2014-04-24 Syngenta Participations Ag Microbiocidal pyrazole derivatives
WO2014060177A1 (en) 2012-10-16 2014-04-24 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
WO2014079820A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Use of anthranilamide compounds for reducing insect-vectored viral infections
EP2738171A1 (en) 2012-11-30 2014-06-04 Syngenta Participations AG. Pesticidally active tricyclic pyridyl derivatives
AU2013361456A1 (en) 2012-12-18 2015-07-02 Metabolix, Inc. Transcriptional regulation for improved plant productivity
CA2896762A1 (en) 2013-01-01 2014-07-10 A.B. Seeds Ltd. Methods of introducing dsrna to plant seeds for modulating gene expression
WO2014118142A1 (en) 2013-02-01 2014-08-07 Syngenta Participations Ag Microbiocidal pyrazole derivatives
WO2014118143A1 (en) 2013-02-04 2014-08-07 Syngenta Participations Ag Microbiocidal pyrazole derivatives
WO2014154530A1 (en) 2013-03-25 2014-10-02 Syngenta Participations Ag Microbiocidal pyrazole derivatives
CN105072911A (zh) 2013-03-28 2015-11-18 先正达参股股份有限公司 控制新烟碱抗性有害生物的方法
ES2686742T3 (es) 2013-05-23 2018-10-19 Syngenta Participations Ag Formulaciones de mezcla de tanque
EP2810952A1 (en) 2013-06-03 2014-12-10 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Novel pest control methods
US10939682B2 (en) 2013-07-02 2021-03-09 Syngenta Participations Ag Pesticidally active bi- or tricyclic heterocycles with sulfur containing substituents
WO2015007451A1 (en) 2013-07-15 2015-01-22 Syngenta Participations Ag Microbiocidal heterobicyclic derivatives
ES2935766T3 (es) 2013-10-03 2023-03-09 Syngenta Participations Ag Composiciones fungicidas
AR097995A1 (es) 2013-10-14 2016-04-27 Syngenta Participations Ag Método para sembrar filas de cultivos
WO2015055764A1 (en) 2013-10-18 2015-04-23 Syngenta Participations Ag 3-methanimidamid-pyridine derivatives as fungicides
EP2873668A1 (en) 2013-11-13 2015-05-20 Syngenta Participations AG. Pesticidally active bicyclic heterocycles with sulphur containing substituents
LT3071034T (lt) 2013-11-20 2019-03-25 Adama Celsius B.V., Amsterdam (Nl), Schaffhausen Branch Paruošta mišri mikroemulsijos kompozicija
WO2015095750A1 (en) 2013-12-20 2015-06-25 Dow Agrosciences Llc Rnapii-140 nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran pests
EP3083643B1 (en) 2013-12-20 2019-02-27 Syngenta Participations AG Pesticidally active substituted 5,5-bicyclic heterocycles with sulphur containing substituents
BR102014031844A2 (pt) 2013-12-20 2015-10-06 Dow Agrosciences Llc ras oposto (rop) e moléculas de ácido nucleico relacionadas que conferem resistência a pragas de coleópteros e hemípteros
WO2015097237A1 (en) 2013-12-23 2015-07-02 Syngenta Participations Ag Benzoxaborole fungicides
US9877486B2 (en) 2014-01-31 2018-01-30 AgBiome, Inc. Methods of growing plants using modified biological control agents
US10508280B2 (en) 2014-01-31 2019-12-17 AgBiome, Inc. Modified biological control agents and their uses
US10435687B2 (en) 2014-05-07 2019-10-08 Dow Agrosciences Llc Nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran pests
EP3145927B1 (en) 2014-05-19 2017-06-14 Syngenta Participations AG Insecticidally active amide derivatives with sulfur-substituted phenyl or pyridine groups
WO2016015979A1 (en) 2014-07-31 2016-02-04 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
WO2016016131A1 (en) 2014-07-31 2016-02-04 Syngenta Participations Ag Pesticidally active cyclic enaminones
WO2016023954A2 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents
EP3028573A1 (en) 2014-12-05 2016-06-08 Basf Se Use of a triazole fungicide on transgenic plants
ES2806598T3 (es) 2014-12-11 2021-02-18 Syngenta Participations Ag Derivados tetracíclicos activos como plaguicidas con sustituyentes que contienen azufre
MX392360B (es) 2014-12-12 2025-03-24 Syngenta Participations Ag Composiciones y metodos para controlar plagas en plantas.
WO2016091674A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Basf Se Use of cyclaniliprole on cultivated plants
US20160194658A1 (en) 2014-12-22 2016-07-07 Dow Agrosciences Llc Nucampholin nucleic acid molecules to control coleopteran insect pests
WO2016120182A1 (en) 2015-01-30 2016-08-04 Syngenta Participations Ag Pesticidally active amide heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents
US20160264991A1 (en) 2015-03-13 2016-09-15 Dow Agrosciences Llc Rna polymerase i1 nucleic acid molecules to control insect pests
HUE049090T2 (hu) 2015-03-27 2020-09-28 Syngenta Participations Ag Heterobiciklusos származékok mint mikrobiocidek
BR112017021450B1 (pt) 2015-04-07 2021-12-28 Basf Agrochemical Products B.V. Métodos de controle de pragas, método de melhoria da saúde vegetal e semente revestida
US11174467B2 (en) 2015-04-08 2021-11-16 Yield10 Bioscience, Inc. Plants with enhanced yield and methods of construction
BR112017022683A2 (pt) 2015-04-24 2018-07-10 Syngenta Participations Ag derivados policíclicos com heterociclos de anéis com cinco membros substituídos por enxofre ativos em termos pesticidas.
EP3286186B1 (en) 2015-04-24 2020-05-06 Syngenta Participations AG Pesticidally active polycyclic derivatives with sulfur substituted five membered ring heterocyles
BR102016012010A2 (pt) 2015-05-29 2020-03-24 Dow Agrosciences Llc Molécula de ácido nucleico, de ácido ribonucleico (rna) e de ácido ribonucleico de filamento duplo (dsrna), usos de célula, planta e semente, produto primário, bem como métodos para controlar uma população de pragas coleópteras e/ou hemípteras, para melhorar o rendimento de uma cultura, e para produzir uma célula vegetal transgênica e uma planta transgênica
JP2018524336A (ja) 2015-07-01 2018-08-30 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 硫黄含有置換基を有する有害生物防除に活性な多環式誘導体
US10202380B2 (en) 2015-07-01 2019-02-12 Syngenta Participations Ag Pesticidally active tetracyclic derivatives with sulfur containing substituents
CN107922408B (zh) 2015-08-12 2020-09-01 先正达参股股份有限公司 杀微生物的杂二环衍生物
WO2017050685A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 Syngenta Participations Ag Pesticidally active polycyclic derivatives with 5-membered sulfur containing heterocyclic ring systems
EP3353160B1 (en) 2015-09-25 2020-03-04 Syngenta Participations AG Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents
CN108026074A (zh) 2015-09-28 2018-05-11 先正达参股股份有限公司 具有含硫取代基的杀有害生物活性杂环衍生物
WO2017067837A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Syngenta Participations Ag Microbiocidal phenylamidine derivatives
WO2017067839A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Syngenta Participations Ag Microbiocidal phenylamidine derivatives
WO2017080870A1 (en) 2015-11-09 2017-05-18 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
BR112018010347A2 (pt) 2015-11-23 2018-12-04 Syngenta Participations Ag derivados heterocíclicos ativos em termos pesticidas com substituintes contendo enxofre e ciclopropila
BR112018012204B1 (pt) 2015-12-15 2022-03-22 Syngenta Participations Ag Compostos derivados de fenilamidina microbicidas, composição e método de combate, prevenção e controle de doenças fitopatogênicas
EP3393245A1 (en) 2015-12-22 2018-10-31 Syngenta Participations AG Pesticidally active pyrazole derivatives
US20190338302A1 (en) 2016-02-04 2019-11-07 Yield10 Bioscience, Inc. Transgenic land plants comprising a putative transporter protein of an edible eukaryotic algae
EP3411373A1 (en) 2016-02-05 2018-12-12 Syngenta Participations AG Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents
MX2018009857A (es) 2016-02-18 2018-11-09 Syngenta Participations Ag Derivados de pirazol pesticidicamente activos.
AU2017230782B2 (en) 2016-03-10 2021-04-08 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal quinoline (thio)carboxamide derivatives
US10421740B2 (en) 2016-04-07 2019-09-24 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents
WO2017178408A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Syngenta Participations Ag Microbiocidal silicon containing aryl derivatives
EP3448369B1 (en) 2016-04-29 2025-06-25 The Regents of The University of Colorado, A Body Corporate Inhibition or degradation of hdac11 for treating obesity, hyperlipidemia, type ii diabetes, metabolic syndrome or insulin resistance, for promoting weight loss, and/or ameliorating or preventing weight gain
EP3464601B1 (en) 2016-05-27 2024-07-03 The Board of Trustees of the University of Illinois Transgenic plants with increased photosynthesis efficiency and growth
WO2018041729A2 (en) 2016-09-01 2018-03-08 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents
BR112019008492B1 (pt) 2016-10-27 2024-01-30 Syngenta Participations Ag Compostos derivados heterocíclicos ativos em termos pesticidas com substituintes contendo enxofre e hidroxilamina, composição pesticida, método para controle de pragas e método para a proteção de material de propagação de plantas do ataque por pragas
WO2018089237A1 (en) 2016-11-10 2018-05-17 Dow Agrosciences Llc Cytochrome b (cytb) nucleic acid molecules that control pathogens
EP3541779B1 (en) 2016-11-15 2020-12-23 Syngenta Participations AG Microbiocidal phenylamidine derivatives
WO2018091389A1 (en) 2016-11-17 2018-05-24 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents
WO2018095795A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 Syngenta Participations Ag Pesticidally active polycyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2018099812A1 (en) 2016-12-01 2018-06-07 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
US20190308982A1 (en) 2016-12-15 2019-10-10 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
EP3338552A1 (en) 2016-12-21 2018-06-27 Basf Se Use of a tetrazolinone fungicide on transgenic plants
EP3342780A1 (en) 2016-12-30 2018-07-04 Dow AgroSciences LLC Pre-mrna processing factor 8 (prp8) nucleic acid molecules to control insect pests
TWI793104B (zh) 2017-02-21 2023-02-21 瑞士商先正達合夥公司 具有含硫取代基的殺有害生物活性雜環衍生物
WO2018156686A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Yield10 Bioscience, Inc. Transgenic land plants comprising enhanced levels of mitochondrial transporter protein
US10952436B2 (en) 2017-03-20 2021-03-23 Syngenta Participations Ag Microbiocidal quinoline (thio)carboxamide derivatives
WO2018178057A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Syngenta Participations Ag Microbiocidal phenylamidine derivatives with improved plant safety properties
WO2018185185A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
WO2018185191A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
US11472797B2 (en) 2017-04-05 2022-10-18 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
WO2018197315A1 (en) 2017-04-25 2018-11-01 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2018202540A1 (en) 2017-05-02 2018-11-08 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
BR112019023368A2 (pt) 2017-05-08 2020-06-16 Syngenta Participations Ag Derivados de imidazopirimidina contendo substituintes de fenila e piridila contendo enxofre
WO2018206419A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Syngenta Participations Ag Microbiocidal heterobicyclic derivatives
WO2018215304A1 (en) 2017-05-22 2018-11-29 Syngenta Participations Ag Tetracyclic pyridazine sulphur containing compounds and their use as pesticides
CN110770223B (zh) 2017-06-19 2023-08-22 先正达参股股份有限公司 杀有害生物活性吡唑衍生物
EP3649118B8 (en) 2017-07-05 2024-10-09 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
EP3649128A1 (en) 2017-07-07 2020-05-13 Syngenta Participations AG Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2019030358A1 (en) 2017-08-11 2019-02-14 Syngenta Participations Ag ACTIVE PYRAZOLE DERIVATIVES ON THE PESTICIDE PLAN
AR112673A1 (es) 2017-08-11 2019-11-27 Syngenta Participations Ag Derivados de pirazol activos como plaguicidas
AR112672A1 (es) 2017-08-11 2019-11-27 Syngenta Participations Ag Derivados de tiofeno activos como plaguicidas
US20200288713A1 (en) 2017-08-11 2020-09-17 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
EP3447048A1 (en) 2017-08-23 2019-02-27 Syngenta Participations Ag Microbiocidal quinoline (thio)carboxamide derivatives
WO2019053027A1 (en) 2017-09-13 2019-03-21 Syngenta Participations Ag MICROBIOCIDE DERIVATIVES OF QUINOLINE (THIO) CARBOXAMIDE
JP7258859B2 (ja) 2017-09-13 2023-04-17 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 殺微生物性キノリン（チオ）カルボキサミド誘導体
BR112020004754A2 (pt) 2017-09-13 2020-09-15 Syngenta Participations Ag derivados de (tio)carboxamida de quinolina microbiocidas
EP3681867B1 (en) 2017-09-13 2021-08-11 Syngenta Participations AG Microbiocidal quinoline (thio)carboxamide derivatives
ES2908668T3 (es) 2017-09-13 2022-05-03 Syngenta Participations Ag Derivados de quinolina (tio)carboxamida microbiocidas
US11584740B2 (en) 2017-09-13 2023-02-21 Syngenta Participations Ag Microbiocidal quinoline (thio)carboxamide derivatives
EP3681285B1 (en) 2017-09-13 2021-11-17 Syngenta Participations AG Microbiocidal quinoline (thio)carboxamide derivatives
EP3684768B1 (en) 2017-09-18 2024-01-24 Syngenta Participations AG Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
CN111148432B (zh) 2017-10-02 2021-11-23 先正达参股股份有限公司 工程化的杀有害生物蛋白和控制植物有害生物的方法
EP3692038A1 (en) 2017-10-06 2020-08-12 Syngenta Participations AG Pesticidally active pyrrole derivatives
US11459318B2 (en) 2017-10-06 2022-10-04 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrrole derivatives
WO2019076778A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Syngenta Participations Ag HETEROCYCLIC DERIVATIVES HAVING PESTICIDAL ACTIVITY HAVING SUBSTITUENTS CONTAINING SULFUR AND SULFONIMIDAMIDES
WO2019086474A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Syngenta Participations Ag Pesticidally active mesoionics heterocyclic compounds
EA202091234A1 (ru) 2017-11-21 2020-10-05 Зингента Партисипейшнс Аг Фунгицидные композиции
CA3083601A1 (en) 2017-11-28 2019-06-06 Mirimus, Inc. Methods of genetic mediated engineering of rnai models
WO2019110427A1 (en) 2017-12-04 2019-06-13 Syngenta Participations Ag Microbiocidal phenylamidine derivatives
WO2019115404A1 (en) 2017-12-13 2019-06-20 Syngenta Participations Ag Pesticidally active mesoionic heterocyclic compounds
US11758907B2 (en) 2017-12-20 2023-09-19 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for controlling harmful organisms in crops
JP7337810B2 (ja) 2018-01-15 2023-09-04 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 硫黄含有置換基を有する殺有害生物的に活性な複素環式誘導体
EP3790390A1 (en) 2018-05-08 2021-03-17 Syngenta Crop Protection AG Methods of applying one or more certain heteroaryl-1,2,4-triazole and heteroaryl-tetrazole compounds to control damage on plants, propagation material thereof, and plant derived products
WO2019222552A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 University Of Florida Research Foundation Methods and compositions for substituted 2,5-diketopiperazine analogs
WO2019219689A1 (en) 2018-05-18 2019-11-21 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfoximine containing substituents
WO2019229088A1 (en) 2018-05-30 2019-12-05 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2019229089A1 (en) 2018-05-31 2019-12-05 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
CA3102190A1 (en) 2018-06-06 2019-12-12 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfoximine containing substituents
AR115495A1 (es) 2018-06-06 2021-01-27 Syngenta Crop Protection Ag Derivados heterocíclicos con sustituyentes que contienen azufre activos como plaguicidas
UY38281A (es) 2018-06-29 2020-01-31 Syngenta Participations Ag Compuestos de azol-amida pesticidamente activos
WO2020011808A1 (en) 2018-07-13 2020-01-16 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds
WO2020025658A1 (en) 2018-08-03 2020-02-06 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds
US20210238176A1 (en) 2018-08-07 2021-08-05 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds
WO2020030754A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active mesoionic bicyclic heteroaromatic compounds
WO2020035565A1 (en) 2018-08-17 2020-02-20 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active mesoionic bicyclic heteroaromatic compounds
AU2019335193B2 (en) 2018-09-04 2023-04-20 Nuseed Nutritional Us Inc. Genetically engineered land plants that express an increased seed yield protein and/or an increased seed yield RNA
UY38366A (es) 2018-09-13 2020-04-30 Syngenta Participations Ag Compuestos de azol-amida pesticidamente activos
TW202023386A (zh) 2018-09-13 2020-07-01 瑞士商先正達合夥公司 殺有害生物活性唑-醯胺化合物
CN112739685A (zh) 2018-09-19 2021-04-30 先正达农作物保护股份公司 杀微生物的喹啉甲酰胺衍生物
WO2020070049A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Syngenta Participations Ag Pesticidally active benzene- and azine-amide compounds
JP2022504304A (ja) 2018-10-06 2022-01-13 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 殺微生物性キノリンジヒドロ－（チアジン）オキサジン誘導体
WO2020070132A1 (en) 2018-10-06 2020-04-09 Syngenta Participations Ag Microbiocidal quinoline dihydro-(thiazine)oxazine derivatives
CN112888680A (zh) 2018-10-19 2021-06-01 先正达参股股份有限公司 杀有害生物活性的唑-酰胺化合物
TW202035404A (zh) 2018-10-24 2020-10-01 瑞士商先正達農作物保護公司 具有含亞碸亞胺的取代基之殺有害生物活性雜環衍生物
CA3117465A1 (en) 2018-11-02 2020-05-07 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Harmful organism control composition and method for using the same
CN120699009A (zh) 2018-11-05 2025-09-26 先正达农作物保护股份公司 杀有害生物活性的唑-酰胺化合物
WO2020120694A1 (en) 2018-12-14 2020-06-18 Syngenta Participations Ag Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds
AR117291A1 (es) 2018-12-14 2021-07-28 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos heterocíclicos de cianamida con actividad pesticida
GB201821036D0 (en) 2018-12-21 2019-02-06 Syngenta Participations Ag Nematicidal compositions
WO2020127345A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
WO2020141135A1 (en) 2018-12-31 2020-07-09 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
JP2022515896A (ja) 2018-12-31 2022-02-22 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 硫黄含有置換基を有する殺有害生物的に活性な複素環式誘導体
WO2020164994A1 (en) 2019-02-13 2020-08-20 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
WO2020164993A1 (en) 2019-02-13 2020-08-20 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
EP3696175A1 (en) 2019-02-18 2020-08-19 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally active azole-amide compounds
WO2020169526A1 (en) 2019-02-18 2020-08-27 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active cyanamide heterocyclic compounds
CN113382634B (zh) 2019-02-20 2023-09-12 先正达农作物保护股份公司 工程化的杀有害生物蛋白及控制植物有害生物的方法
TW202100015A (zh) 2019-02-28 2021-01-01 瑞士商先正達農作物保護公司 具有含硫取代基之殺有害生物活性雜環衍生物
TW202045011A (zh) 2019-02-28 2020-12-16 瑞士商先正達農作物保護公司 具有含硫取代基之殺有害生物活性雜環衍生物
BR112021017646A2 (pt) 2019-03-08 2021-11-16 Syngenta Crop Protection Ag Compostos de azol-amida ativos em termos pesticidas
EP3935056A1 (en) 2019-03-08 2022-01-12 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2020188014A1 (en) 2019-03-20 2020-09-24 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active azole amide compounds
US20220183294A1 (en) 2019-03-20 2022-06-16 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active azole amide compounds
CN113597426A (zh) 2019-03-22 2021-11-02 先正达农作物保护股份公司 N-[1-(5-溴-2-嘧啶-2-基-1,2,4-三唑-3-基)乙基]-2-环丙基-6-(三氟甲基)吡啶-4-甲酰胺衍生物及相关的化合物作为杀昆虫剂
UY38623A (es) 2019-03-29 2020-10-30 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos de diazina-amida activos como pesticidas
US20230085307A1 (en) 2019-04-01 2023-03-16 Nissan Chemical Corporation Pyridazinone compound and herbicide
JOP20210272A1 (ar) 2019-04-05 2023-01-30 Syngenta Crop Protection Ag مركبات دايازين - أميد نشطة بشكل مبيد للآفات
BR112021020386A2 (pt) 2019-04-11 2021-12-07 Syngenta Crop Protection Ag Compostos de diazina-amida ativos pesticidamente
WO2020254530A1 (en) 2019-06-18 2020-12-24 Syngenta Crop Protection Ag 7-sulfonyl-n-(1,3,4-thiadiazol-2-yl)-quinoxaline-6-carboxamide derivatives and the respective -benzimidazole-5-, -imidazo[4,5-b]pyridine-5-, -3h-furo[3,2b]pyridine-5-, -quinoline-2-, and -naphthalene-2-carboxamide derivatives as pesticides
WO2020262910A1 (ko) * 2019-06-27 2020-12-30 한국화학연구원 브레비바실러스 브레비스 hk544 균주를 이용한 식물병 방제용 조성물
WO2021009311A1 (en) 2019-07-17 2021-01-21 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
JP2022545266A (ja) 2019-08-23 2022-10-26 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 殺有害生物的に活性なピラジン－アミド化合物
WO2021053110A1 (en) 2019-09-20 2021-03-25 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur and sulfoximine containing substituents
UY38885A (es) 2019-09-20 2021-04-30 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos de azetidinil-, pirrolidinil-,piperdinil- o piperazinil-piridinil carbonilo pesticidamente activos
AU2020372700A1 (en) 2019-11-01 2022-05-12 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic compounds
EP3825408A1 (en) 2019-11-19 2021-05-26 FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Methods of multi-species insect pest control
JP7788377B2 (ja) 2019-12-04 2025-12-18 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 殺有害生物的に活性な縮合二環式芳香族複素環式アミノ化合物
WO2021122645A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active azole-amide compounds
EP4085058A1 (en) 2019-12-31 2022-11-09 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
AR120982A1 (es) 2020-01-06 2022-04-06 Syngenta Crop Protection Ag Derivados heterocíclicos activos como plaguicidas con sustituyentes que contienen azufre
WO2021144354A1 (en) 2020-01-15 2021-07-22 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds
WO2021148330A1 (en) 2020-01-20 2021-07-29 Syngenta Crop Protection Ag Method for reducing insect-vectored virus infections in grass plants
GB202000994D0 (en) 2020-01-23 2020-03-11 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
WO2021148639A1 (en) 2020-01-24 2021-07-29 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic compounds
WO2021151926A1 (en) 2020-01-30 2021-08-05 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic amino compounds
BR112022015723A2 (pt) 2020-02-11 2023-02-14 Syngenta Crop Protection Ag Compostos de amina cíclica pesticidamente ativos
WO2021170830A1 (en) 2020-02-27 2021-09-02 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
BR112022017093A2 (pt) 2020-02-27 2023-02-14 Syngenta Crop Protection Ag Compostos de diazina-bisamida ativos em termos pesticidas
WO2021175822A1 (en) 2020-03-02 2021-09-10 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally amidine-substituted benzoic acid amide compounds
US20230126361A1 (en) 2020-03-13 2023-04-27 Syngenta Crop Protection Ag Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola, cercospora sojina and/or cercospora kikuchii
EP4117436A1 (en) 2020-03-13 2023-01-18 Syngenta Crop Protection AG Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola
EP4117433A1 (en) 2020-03-13 2023-01-18 Syngenta Crop Protection AG Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola
EP4117435A1 (en) 2020-03-13 2023-01-18 Syngenta Crop Protection AG Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola
BR112022018272A2 (pt) 2020-03-13 2022-10-25 Syngenta Crop Protection Ag Métodos de controle ou prevenção de infestação de plantas pelo microrganismo fitopatogênico corynespora cassiicola
JP2023516795A (ja) 2020-03-13 2023-04-20 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 植物病原性微生物コリネスポラ・カッシイコラ（Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ ｃａｓｓｉｉｃｏｌａ）による植物の被害を防除又は防止する方法
AR121733A1 (es) 2020-04-08 2022-07-06 Syngenta Crop Protection Ag Derivados microbiocidas de tipo dihidro-(tiazina)oxazina de quinolina
US20240315247A1 (en) 2020-04-08 2024-09-26 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal quinoline dihydro-(thiazine)oxazine derivatives
AR121734A1 (es) 2020-04-08 2022-07-06 Syngenta Crop Protection Ag Derivados microbicidas de tipo dihidropirrolopirazina de quinolina
WO2021213929A1 (en) 2020-04-20 2021-10-28 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active substituted 1,3-dihydro-2h-imidazo[4,5-c]pyridin-2-one derivatives with sulfur containing substituents
WO2021219810A1 (en) 2020-04-30 2021-11-04 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2021224268A1 (en) 2020-05-04 2021-11-11 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
WO2021224409A1 (en) 2020-05-06 2021-11-11 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
AR122484A1 (es) 2020-06-04 2022-09-14 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
AR122189A1 (es) 2020-06-04 2022-08-24 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
AR122187A1 (es) 2020-06-04 2022-08-24 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
AR122485A1 (es) 2020-06-04 2022-09-14 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
WO2021245105A1 (en) 2020-06-04 2021-12-09 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
AR122199A1 (es) 2020-06-04 2022-08-24 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
WO2022013417A1 (en) 2020-07-17 2022-01-20 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2022017975A1 (en) 2020-07-18 2022-01-27 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
AU2021334184A1 (en) 2020-08-31 2023-03-16 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2022049141A1 (en) 2020-09-01 2022-03-10 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
CN116075226A (zh) 2020-09-02 2023-05-05 先正达农作物保护股份公司 具有含硫取代基的杀有害生物活性的杂环衍生物
UY39404A (es) 2020-09-02 2022-03-31 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de 2,2-diflúor-5h-[1,3]dioxol[4,5-f]isoindol-7-ona activos como plaguicidas con sustituyentes que contienen azufre
UY39411A (es) 2020-09-09 2022-04-29 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de indazolil pirazolo[3,4-c] piridina pesticídicamente activos con sustituyentes que contienen azufre
WO2022073932A1 (en) 2020-10-05 2022-04-14 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
UY39505A (es) 2020-11-09 2022-06-30 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones de mezcla fungicida que comprenden un compuesto derivado de la picolinamida como ingrediente activo
WO2022101265A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic compounds
US20240049725A1 (en) 2020-12-21 2024-02-15 Syngenta Crop Protection Ag Compositions comprising cyclotides and other insecticidal peptides and uses thereof
EP4263579A1 (en) 2020-12-21 2023-10-25 Syngenta Crop Protection AG Pesticidal hexatoxin polypeptides and methods of use thereof
WO2022157334A1 (en) 2021-01-21 2022-07-28 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
EP4281185A2 (en) 2021-01-23 2023-11-29 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally active heteroaromatic compounds
WO2022171709A1 (en) 2021-02-11 2022-08-18 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
WO2022175318A1 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Syngenta Crop Protection Ag Insect and acarina pest control
US20240315245A1 (en) 2021-02-19 2024-09-26 Syngenta Crop Protection Ag Insect and acarina pest control
CN116887676A (zh) 2021-02-26 2023-10-13 先正达农作物保护股份公司 杀有害生物组合物
AR124935A1 (es) 2021-03-01 2023-05-24 Syngenta Crop Protection Ag Formulaciones plaguicidas
WO2022200364A1 (en) 2021-03-25 2022-09-29 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
EP4313966A1 (en) 2021-03-30 2024-02-07 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally active cyclic amine compounds
UY39696A (es) 2021-03-31 2022-10-31 Syngenta Crop Protection Ag Derivados microbiocidas de quinolin/quinoxalin-benzotiazina como agentes fungicidas, en particular c
AR125342A1 (es) 2021-04-16 2023-07-05 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos de amina cíclica activos como plaguicidas
BR112023021626A2 (pt) 2021-04-20 2024-02-20 Syngenta Crop Protection Ag Derivados microbiocidas de quinolina/quinoxalina isoquinolina
JP2024517342A (ja) 2021-05-14 2024-04-19 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 種子処理組成物
US20240260577A1 (en) 2021-05-14 2024-08-08 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
WO2022253841A1 (en) 2021-06-02 2022-12-08 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfoximine containing substituents
WO2022258481A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active diazine-amide compounds
CR20240002A (es) 2021-06-24 2024-02-13 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de 2-[3-[1 [(quinazolin-4-il)amino]etil]pirazin-2-il]tiazol-5-carbonitrilo y compuestos similares como plaguicidas
WO2022268813A1 (en) 2021-06-24 2022-12-29 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
WO2022268815A1 (en) 2021-06-24 2022-12-29 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
WO2023280999A1 (en) 2021-07-07 2023-01-12 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
EP4376616A1 (en) 2021-07-27 2024-06-05 Syngenta Crop Protection AG Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor
EP4377312A1 (en) 2021-07-29 2024-06-05 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic compounds
WO2023012081A1 (en) 2021-08-05 2023-02-09 Syngenta Crop Protection Ag Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor
JP2024531177A (ja) 2021-08-10 2024-08-29 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 殺有害生物剤としての２，２－ジフルオロ－５Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｆ］イソインドール－７－オン誘導体
CN117813005A (zh) 2021-08-13 2024-04-02 先正达农作物保护股份公司 杀真菌组合物
MX2024002008A (es) 2021-08-19 2024-03-05 Syngenta Crop Protection Ag Metodo para controlar plagas resistentes a diamidas y compuestos para el mismo.
AR127103A1 (es) 2021-09-22 2023-12-20 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
US20240389596A1 (en) 2021-09-23 2024-11-28 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
EP4416144A1 (en) 2021-10-14 2024-08-21 Syngenta Crop Protection AG Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives
UY39992A (es) 2021-10-25 2023-05-15 Syngenta Crop Protection Ag Derivados heterocíclicos activos como plaguicidas con sustituyentes que contienen azufre
US20250042875A1 (en) 2021-10-27 2025-02-06 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active pyridazinone compounds
AR127682A1 (es) 2021-11-19 2024-02-21 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas de aureobasidina
AR127767A1 (es) 2021-11-26 2024-02-28 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
CN118891256A (zh) 2021-12-10 2024-11-01 先正达农作物保护股份公司 杀有害生物活性的哒嗪酮化合物
WO2023105065A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
WO2023105064A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
WO2023110710A1 (en) 2021-12-13 2023-06-22 Syngenta Crop Protection Ag Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor
EP4197333A1 (en) 2021-12-15 2023-06-21 Syngenta Crop Protection AG Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor
WO2023111215A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal pyridine-substituted benzothiazine derivatives
US20250143299A1 (en) 2022-02-01 2025-05-08 Globachem Nv Methods and compositions for controlling pests in vegetables
WO2023148343A1 (en) 2022-02-04 2023-08-10 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
WO2023148369A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2023148368A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
US20250143304A1 (en) 2022-02-10 2025-05-08 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
WO2023187191A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2023203038A1 (en) 2022-04-19 2023-10-26 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
US20250344697A1 (en) 2022-04-26 2025-11-13 Syngenta Crop Protection Ag Enantiomerically enriched fungicides for the control of resistant phytopathogenic fungi
AR129265A1 (es) 2022-05-12 2024-08-07 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos de alcoxi-heteroaril-carboxamida o tioamida
EP4543873A1 (en) 2022-06-21 2025-04-30 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic compounds
AR129873A1 (es) 2022-07-11 2024-10-09 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
WO2024022910A1 (en) 2022-07-26 2024-02-01 Syngenta Crop Protection Ag 1-[1-[2-(pyrimidin-4-yl)-1,2,4-triazol-3-yl]ethyl]-3-[2,4-dichloro-5-phenyl]urea derivatives and similar compounds as pesticides
WO2024033374A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Syngenta Crop Protection Ag Novel arylcarboxamide or arylthioamide compounds
WO2024038054A1 (en) 2022-08-16 2024-02-22 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
WO2024056732A1 (en) 2022-09-16 2024-03-21 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active cyclic amine compounds
UY40448A (es) 2022-09-30 2024-04-30 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas adecuadas para el control de enfermedades causadas por hongos fitopatógenos, especialmente Phakopsora pachyrhizi, en plantas útiles, especialmente soja
EP4608813A1 (en) 2022-10-25 2025-09-03 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2024089216A1 (en) 2022-10-27 2024-05-02 Syngenta Crop Protection Ag Novel sulfur-containing heteroaryl carboxamide compounds
EP4612143A1 (en) 2022-10-31 2025-09-10 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2024110554A1 (en) 2022-11-23 2024-05-30 Syngenta Crop Protection Ag N-[(1 -[2-[6-(pyridazin-3-yl]-1,2,4-triazol-3-yl]ethyl]-quinazolin-4-amine and n-[1-[3-(6-(pyridazin-3-yl)pyrazin-2-yl]ethyl]-8-quinazolin-4-amine derivatives as pesticides
EP4622969A1 (en) 2022-11-24 2025-10-01 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally active cyclic amine compounds
WO2024121264A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Syngenta Crop Protection Ag Insecticidal compound based on pyrazole derivatives
WO2024121261A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Syngenta Crop Protection Ag Insecticidal compound based on pyrazole derivatives
WO2024121262A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Syngenta Crop Protection Ag Insecticidal compound based on pyrazole derivatives
WO2024121263A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Syngenta Crop Protection Ag Insecticidal compound based on pyrazole derivatives
WO2024126388A1 (en) 2022-12-12 2024-06-20 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2024126404A1 (en) 2022-12-14 2024-06-20 Syngenta Crop Protection Ag Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives
CN120476107A (zh) 2022-12-15 2025-08-12 先正达农作物保护股份公司 可用作杀有害生物剂的新型的二环-甲酰胺化合物
CN120359205A (zh) 2022-12-16 2025-07-22 先正达农作物保护股份公司 苯并咪唑衍生物
WO2024133551A1 (en) 2022-12-21 2024-06-27 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active pyridazine compounds
WO2024133426A1 (en) 2022-12-21 2024-06-27 Syngenta Crop Protection Ag Method for controlling diamide resistant pests and compounds therefor
AR131541A1 (es) 2023-01-07 2025-04-09 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos de carboxamida novedosos
WO2024149772A1 (en) 2023-01-10 2024-07-18 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
EP4655293A1 (en) 2023-01-23 2025-12-03 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
CN120693061A (zh) 2023-02-13 2025-09-23 先正达农作物保护股份公司 杀有害生物活性双环化合物
AU2024235487A1 (en) 2023-03-14 2025-09-25 Syngenta Crop Protection Ag Control of pests resistant to insecticides
WO2025201636A1 (en) 2023-03-31 2025-10-02 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active 2,2-dihalocyclopropyl compounds
WO2024213650A1 (en) 2023-04-13 2024-10-17 Syngenta Crop Protection Ag Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives
TW202446263A (zh) 2023-04-13 2024-12-01 瑞士商先正達農作物保護股份公司 殺真菌組成物
AR132354A1 (es) 2023-04-13 2025-06-18 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de pirazolo[1,5-a]piridina
WO2024213651A1 (en) 2023-04-13 2024-10-17 Syngenta Crop Protection Ag Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives
AR132352A1 (es) 2023-04-13 2025-06-18 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de imidazo[1,2-a]pirazina
AR132353A1 (es) 2023-04-13 2025-06-18 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de pirazolo[1,5-a]piridina
AR132351A1 (es) 2023-04-13 2025-06-18 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de imidazo[1,2-a]pirazina
AR132358A1 (es) 2023-04-13 2025-06-18 Syngenta Crop Protection Ag Derivados bicíclicos de imidazo
WO2024213653A1 (en) 2023-04-13 2024-10-17 Syngenta Crop Protection Ag Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives
WO2025214612A1 (en) 2023-04-14 2025-10-16 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active 2,2-dihalocyclopropyl compounds
WO2024218261A1 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Syngenta Crop Protection Ag Method and composition for treating plant propagation materials
WO2024217995A1 (en) 2023-04-20 2024-10-24 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active dihydropyridinone derivatives
WO2024223858A1 (en) 2023-04-28 2024-10-31 Syngenta Crop Protection Ag Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola
WO2025021537A1 (en) 2023-07-21 2025-01-30 Syngenta Crop Protection Ag Benzimidazole derivatives
WO2025022007A1 (en) 2023-07-27 2025-01-30 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active quinazoline compounds
WO2025022008A1 (en) 2023-07-27 2025-01-30 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active quinazoline compounds
WO2025031989A1 (en) 2023-08-04 2025-02-13 Syngenta Crop Protection Ag Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola
WO2025031913A1 (en) 2023-08-04 2025-02-13 Syngenta Crop Protection Ag Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola
WO2025031990A1 (en) 2023-08-04 2025-02-13 Syngenta Crop Protection Ag Methods of controlling or preventing infestation of soybean plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola
AR133450A1 (es) 2023-08-07 2025-10-01 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
WO2025032100A1 (en) 2023-08-07 2025-02-13 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
WO2025032129A1 (en) 2023-08-08 2025-02-13 Syngenta Crop Protection Ag Novel aminoindane and aminotetraline compounds
WO2025045835A1 (en) 2023-08-30 2025-03-06 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active oxoindole compounds
WO2025045837A1 (en) 2023-08-31 2025-03-06 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active indazole compounds
WO2025045838A2 (en) 2023-08-31 2025-03-06 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active benzisothiazole compounds
TW202513532A (zh) 2023-09-15 2025-04-01 瑞士商先正達農作物保護股份公司 用於製備鏡像異構物富集的脂肪族胺之方法
WO2025068511A1 (en) 2023-09-27 2025-04-03 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
AR134020A1 (es) 2023-10-04 2025-11-26 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones y métodos para controlar la infestación de plantas por insectos
AR134032A1 (es) 2023-10-04 2025-11-26 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones y métodos para el control de la infestación de plantas por insectos
AR133997A1 (es) 2023-10-04 2025-11-19 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones y métodos para controlar la infestación de plantas por insectos
AR133996A1 (es) 2023-10-04 2025-11-19 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones y métodos para controlar la infestación de plantas por insectos
AR134010A1 (es) 2023-10-04 2025-11-26 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones y métodos para controlar la infestación de plantas por insectos
AR134011A1 (es) 2023-10-04 2025-11-26 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones y métodos para controlar la infestación de plantas por hongos fitopatógenos
AR134019A1 (es) 2023-10-04 2025-11-26 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones y métodos para controlar la infestación de plantas por insectos
AR133995A1 (es) 2023-10-04 2025-11-19 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones y métodos para controlar la infestación de plantas por hongos fitopatógenos
AR134012A1 (es) 2023-10-04 2025-11-26 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones y métodos para controlar la infestación de plantas por hongos fitopatógenos
WO2025088131A1 (en) 2023-10-26 2025-05-01 Syngenta Crop Protection Ag Method of controlling phytopathogenic fungi using jawsamycin
WO2025087761A1 (en) 2023-10-27 2025-05-01 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active cyclic amine compounds
WO2025104032A1 (en) 2023-11-14 2025-05-22 Syngenta Crop Protection Ag Novel carboxamide compounds
WO2025109114A1 (en) 2023-11-24 2025-05-30 Syngenta Crop Protection Ag Novel carboxamide compounds
WO2025114133A1 (en) 2023-11-29 2025-06-05 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
WO2025132349A1 (en) 2023-12-19 2025-06-26 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active quinazoline compounds
WO2025132758A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active quinazoline compounds
WO2025132754A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active quinazoline compounds
WO2025149629A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Syngenta Crop Protection Ag Novel carboxamide compounds
WO2025149637A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Syngenta Crop Protection Ag Novel carboxamide compounds
WO2025196226A1 (en) 2024-03-20 2025-09-25 Syngenta Crop Protection Ag Thiobicycle derivatives
WO2025219337A1 (en) 2024-04-15 2025-10-23 Syngenta Crop Protection Ag Use of strigolactone derivatives and analogues as nitrification inhibitors
WO2025247783A1 (en) 2024-05-29 2025-12-04 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active dihydro-benzoxazinone compounds
WO2025248032A1 (en) 2024-05-31 2025-12-04 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active indazole compounds
WO2025252553A1 (en) 2024-06-04 2025-12-11 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active 2,2-dihalocyclopropyl compounds
WO2025252732A1 (en) 2024-06-04 2025-12-11 Syngenta Crop Protection Ag Nitrogen-containing 6-membered bicyclic derivatives with microbiocidal activity
WO2025252556A1 (en) 2024-06-05 2025-12-11 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active 2,2-dihalocyclopropyl compounds
WO2025252786A1 (en) 2024-06-05 2025-12-11 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidal compositions
WO2025252655A1 (en) 2024-06-06 2025-12-11 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active pyridopyrimidone compounds
WO2025257023A1 (en) 2024-06-12 2025-12-18 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
WO2025257024A1 (en) 2024-06-12 2025-12-18 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
WO2025257413A1 (en) 2024-06-13 2025-12-18 Syngenta Crop Protection Ag Pecticidally active dihydroazole derivatives
WO2025256333A1 (en) 2024-06-13 2025-12-18 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active aminoheterocycle derivatives
WO2025257072A1 (en) 2024-06-14 2025-12-18 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active 2-oxobenzimidazole compounds
EP4667451A1 (en) 2024-06-21 2025-12-24 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally-active 2,2-dihalocyclopropyl compounds

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3681331A (en) * 1970-04-02 1972-08-01 Hoffmann La Roche 1-hydroxy-6-amino alkoxy-phenazine 5,10-dioxides
JPS5444758B1 (sk) * 1971-03-25 1979-12-27
US4306027A (en) * 1976-09-10 1981-12-15 Cornell Research Foundation, Inc. Pesticidally resistant rhizobium and agronomic use thereof
US4456684A (en) * 1982-09-08 1984-06-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method for screening bacteria and application thereof for field control of diseases caused by Gaeumannomyces graminis
HU194306B (en) * 1983-05-16 1988-01-28 Gyogyszerkutato Intezet Process for influencing biosynthesis of antibiotics with in vivo genetical recombination
US4940840A (en) * 1984-03-26 1990-07-10 Dna Plant Technology Corporation Novel chitinase-producing bacteria and plants
US4952496A (en) * 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
US4695455A (en) * 1985-01-22 1987-09-22 Mycogen Corporation Cellular encapsulation of pesticides produced by expression of heterologous genes
FR2584090B1 (fr) * 1985-06-27 1987-08-28 Roussel Uclaf Nouveaux supports, leur preparation et les intermediaires obtenus, leur application a la synthese d'oligonucleotides et les nouveaux nucleosides et oligonucleotides relies aux supports ainsi obtenus
US5041290A (en) * 1985-10-02 1991-08-20 Ciba-Geigy Corporation Method of protecting useful plants from diseases caused by soil-borne and seed-borne pathogens by treating seeds with cultures of microorganisms
US5049379A (en) * 1987-07-27 1991-09-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Fungicidal toxin and method and inoculum for controlling root rot and damping off
US4798723A (en) * 1986-07-28 1989-01-17 Lubrizol Genetics, Inc. Agricultural products from Pseudomonas cepacia strains and methods of preparation
US4880745A (en) * 1986-08-09 1989-11-14 Tochigi Prefecture Pseudomonas gladioli and a process for biologically controlling fusarium diseases using Pseudomonas gladioli pv. gladioli
GB8724252D0 (en) * 1987-10-15 1987-11-18 Ici Plc Fungicides
EP0294053B1 (en) * 1987-06-04 1994-08-10 Taki Chemical Co., Ltd. Composition for agricultural use
US4970147A (en) * 1988-03-17 1990-11-13 The General Hospital Corporation Oxygen regulatable gene expression
EP0349353A1 (fr) * 1988-03-22 1990-01-03 Institut Pasteur Séquences d'ADN comprenant la partie fonctionnelle du locus sacU et du locus sacUh de B.SUBTILIS, vecteurs contenant ces séquences, et leur utilisation dans des procédés de production de protéines
GB8811435D0 (en) * 1988-05-13 1988-06-15 Ici Plc Fungicides
US4975277A (en) * 1988-08-02 1990-12-04 United States Of America Biological control of postharvest rots in fruits using Pseudomonas cepacia and pyrrolnitrin produced therefrom
FI104264B (fi) * 1988-08-11 1999-12-15 Dsm Ip Assets Bv Menetelmä sekundääristen metaboliittien tuoton parantamiseksi käyttämällä rykelmöityjä biosynteettisiä geenejä
IE62559B1 (en) * 1989-02-02 1995-02-08 Ici Plc Fungicides
US5068105A (en) * 1989-03-13 1991-11-26 W. R. Grace & Co.-Conn. Fungal formulation for biocontrol of soilborne plant pathogens
GB8908875D0 (en) * 1989-04-19 1989-06-07 Ici Plc Fungicides
US5279951A (en) * 1989-05-08 1994-01-18 Research Association For Utilization Of Light Oil Cultivation of transformed microorganisms
IL95019A0 (en) * 1989-08-09 1991-06-10 Mycogen Corp Process for encapsulation of biologicals
GB8923407D0 (en) * 1989-10-17 1989-12-06 Ici Plc Antifungal microorganism
US4997381A (en) * 1990-02-26 1991-03-05 Oh Tae J Dual functional, electrical plug use in conjunction with an electric appliance
EP0468220A3 (en) * 1990-07-26 1992-09-23 American Cyanamid Company Cloning of the biosynthetic pathway genes for chlortetracycline production from streptomyces aureofaciens & their expression in steptomyces lividans
EP0471564A3 (en) * 1990-08-16 1992-11-25 Mycogen Corporation Translational enhancement in pseudomonas
EP0472494A3 (en) * 1990-08-20 1992-10-21 Ciba Geigy Ag Anti-pathogenic biocontrol agents, genes encoding antibiotics synthesis and the use of said antibiotics
US5639949A (en) * 1990-08-20 1997-06-17 Ciba-Geigy Corporation Genes for the synthesis of antipathogenic substances
US5695541A (en) * 1990-11-13 1997-12-09 Liphatech, Inc. Process for preparation of bacterial agricultural products
FI104498B (fi) * 1991-10-31 2000-02-15 Thomae Gmbh Dr K Biosynteettinen menetelmä kemiallisten yhdisteiden valmistamiseksi
WO1994001561A1 (en) * 1992-07-02 1994-01-20 Novartis Ag Gene activating element

Also Published As

Publication number Publication date
BR9507948A (pt) 1997-11-18
US5698425A (en) 1997-12-16
CZ291220B6 (cs) 2003-01-15
US5723759A (en) 1998-03-03
WO1995033818A3 (en) 1995-12-28
CN1267557C (zh) 2006-08-02
CZ360196A3 (cs) 1998-01-14
US5679560A (en) 1997-10-21
AU2417895A (en) 1996-01-04
BG101107A (en) 1997-11-28
AU695364B2 (en) 1998-08-13
PL182136B1 (en) 2001-11-30
EP0759078A1 (en) 1997-02-26
IL114018A (en) 2005-11-20
ZA954686B (en) 1995-12-08
IL114018A0 (en) 1995-10-31
CA2192366A1 (en) 1995-12-14
HU9603383D0 (en) 1997-01-28
US5817502A (en) 1998-10-06
US5639949A (en) 1997-06-17
WO1995033818A2 (en) 1995-12-14
CN1152941A (zh) 1997-06-25
EE9600193A (et) 1997-06-16
KR100371904B1 (ko) 2003-12-01
CN1626662A (zh) 2005-06-15
PL317998A1 (en) 1997-05-12
HUT76534A (en) 1997-09-29
JPH10501125A (ja) 1998-02-03
NZ285166A (en) 1998-04-27
US5643774A (en) 1997-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK156996A3 (en) A molecule of isolated dna for the synthesis of antipathogenic substances, vectors and hosts comprising this molecule and its use
US5716849A (en) Genes for the biosynthesis of soraphen
CN100390284C (zh) Cry3B杀虫蛋白在植物中的提高表达
CN101686705A (zh) 来自Bacillus thuringiensis的半翅目和鞘翅目活性的毒素蛋白
US5662898A (en) Genes for the synthesis of antipathogenic substances
US6174860B1 (en) Insecticidal toxins and nucleic acid sequences coding therefor
US6117670A (en) Pyrrolnitrin biosynthesis genes and uses thereof
US6281413B1 (en) Insecticidal toxins from Photorhabdus luminescens and nucleic acid sequences coding therefor
JP2002504336A (ja) フォトラブドゥスからの殺昆虫性毒素
CN100368544C (zh) 新的来自嗜线虫致病杆菌的杀虫毒素以及编码此毒素的核酸序列
JP5054267B2 (ja) 新規トキシン
US7091399B2 (en) Transgenic plants expressing insecticidal proteins and methods of producing the same
EP0649469A1 (en) Gene activating element
RU2240003C2 (ru) Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, химерный ген, рекомбинантный вектор, штамм бактерий, токсин, инсектицидная композиция, способ получения токсина, способ получения устойчивого к насекомым растения и способ борьбы с насекомыми
AU3028699A (en) Insecticidal toxins from photorhabdus
MXPA00010308A (en) Novel insecticidal toxins from xenorhabdus nematophilus