SK132797A3 - Viral vectors and their use for treating hyperproliferative disorders, in particular restenosis - Google Patents
Viral vectors and their use for treating hyperproliferative disorders, in particular restenosis Download PDFInfo
- Publication number
- SK132797A3 SK132797A3 SK1327-97A SK132797A SK132797A3 SK 132797 A3 SK132797 A3 SK 132797A3 SK 132797 A SK132797 A SK 132797A SK 132797 A3 SK132797 A3 SK 132797A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- virus
- adenovirus
- gax
- gene
- cell
- Prior art date
Links
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 title abstract description 13
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 title description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title description 8
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 title description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 54
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 13
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 82
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 69
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 43
- 101150029117 meox2 gene Proteins 0.000 description 32
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 31
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 description 29
- 210000004509 vascular smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 17
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 8
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 6
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 5
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 101100022881 Rattus norvegicus Meox2 gene Proteins 0.000 description 5
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 5
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 5
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 4
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 101100348341 Caenorhabditis elegans gas-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 3
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700005087 Homeobox Genes Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 208000034827 Neointima Diseases 0.000 description 2
- 241000713896 Spleen necrosis virus Species 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 2
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 101150036170 gas-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 210000004026 tunica intima Anatomy 0.000 description 2
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 2,4-D Chemical compound OC(=O)COC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HZLHRDBTVSZCBS-UVJJDBRNSA-N 4-[(e)-(4-aminophenyl)-(4-imino-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene)methyl]-2-methylaniline;hydrochloride Chemical compound Cl.C1=CC(=N)C(C)=C\C1=C(C=1C=C(C)C(N)=CC=1)/C1=CC=C(N)C=C1 HZLHRDBTVSZCBS-UVJJDBRNSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241001212038 Arcola Species 0.000 description 1
- 241001470561 Arracacha virus V Species 0.000 description 1
- PLNJUJGNLDSFOP-UWJYBYFXSA-N Asp-Tyr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PLNJUJGNLDSFOP-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- QPDUWAUSSWGJSB-NGZCFLSTSA-N Asp-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N QPDUWAUSSWGJSB-NGZCFLSTSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100328086 Caenorhabditis elegans cla-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 description 1
- 102100038909 Caveolin-2 Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N DOSPA trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCNC(=O)C(CCCNCCCN)NCCCN)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N 0.000 description 1
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 1
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 108010048671 Homeodomain Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009331 Homeodomain Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000740981 Homo sapiens Caveolin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000713862 Moloney murine sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101100447658 Mus musculus Gas1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- XNCUYZKGQOCOQH-YUMQZZPRSA-N Ser-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O XNCUYZKGQOCOQH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- TZXFLDNBYYGLKA-BZSNNMDCSA-N Tyr-Asp-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 TZXFLDNBYYGLKA-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 206010072810 Vascular wall hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 description 1
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004219 arterial function Effects 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 238000010293 colony formation assay Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M dihydrogenphosphate Chemical compound OP(O)([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000000431 effect on proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 238000001400 expression cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 230000001632 homeopathic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 235000015250 liver sausages Nutrition 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000008747 mitogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- XONPDZSGENTBNJ-UHFFFAOYSA-N molecular hydrogen;sodium Chemical compound [Na].[H][H] XONPDZSGENTBNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 1
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 108700024542 myc Genes Proteins 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 1
- -1 neurofilaments Proteins 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 1
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 description 1
- 229940044476 poloxamer 407 Drugs 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 230000026447 protein localization Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108090000064 retinoic acid receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000003702 retinoic acid receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 102200085102 rs387906955 Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 108020003113 steroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005969 steroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 101150003509 tag gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000216 vascular lesion Toxicity 0.000 description 1
- 230000006439 vascular pathology Effects 0.000 description 1
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
- C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
Oblasť techniky
Predkladaný vynález sa týka novej, zvlášť účinnej metódy liečenia patológií spojených s hyperproliferatívnymi ochoreniami prostriedkami génovej terapie. Spôsob podlá predkladaného vynálezu spočíva, konkrétnejšie, v špecifickom blokovaní proliferácie buniek vaskulárneho hladkého svalstva (vascular smooth-muscle cells - VSMZ) pomocou in vivo prenosu gax génu. Spôsob podlá predkladaného vynálezu je velmi účinne upravený na liečenie postangioplastických restenóz pomocou preexprimovania gax génu vo vaskulárnej stene. Podľa predkladaného vynálezu sa dá gax gén prenášať pomocou vírusových vektorov. Tieto vektory sú výhodne adenovírusové vektory.
su spojene tomu, že gas 6) a gadd
DNA poškodením: gadd34, exprimované v kviscentných
Doterajší stav techniky
Boli izolované rôzne gény, ktoré s blokovaním bunkového oddelenia. Tým dôjde k (rast-blokovania špecifický: gas 1 až (rast-blokovania a vyvolateľný gadd45 a gaddl53) gény sú silne bunkách, to znamená v bunkách, ktoré sú blokované v GO fáze bunkového cyklu (Schneider a kol., Celí 1988, 54: 787-793; Del Sat a kol., Celí 1992, 12: 3514-3521; Cowled a kol.,
Exp. Celí. Res. 1994, 211: 197-202; Brancolini a Schneider,
J. Celí. Biol. 1994, 124: 743-756; Zhan a kol.. Mol. Celí.
4242-4250; Jackman a kol., Cancer Res. 54:
Biol. 1993, 13
5656-5662, 1994) súlade s týmito zisteniami o génovej expresii, mikroinjekcia gas-l proteínu blokuje syntézu DNA (Del Sat a kol., Celí, 1992, 70: 595-607). Naopak pridanie je PDGF (platelet-derived growth odvodený z doštičiek) alebo fetálne týchto génov u in vivo Celí. Biol. 1992, 12:
vzťahu k stavu náprotivok in rastového faktoru ako factor - rastový faktor teľacie sérum znižuje expresiu modelov (Coccia a kol. Mol.
3514-3521). 0 tejto špecifickej expresii vo proliferácie bunky sa tiež javí, že má svoj vivo. Takto je gén gas-1 po vybratí vaječníkov silne exprimovaný v maternici myší (Ferrero a Cairo, Celí. Biol.Int.
1993, 17 857-862). Pri tom istom zvieracom modeli viedlo liečenie estrogénmi k umiestnená v maternici bunkovej proliferáci i, ktorá je a prejavuje sa zvýšením expresie proto-onkogénu c-myc a znížením expresie génu gas-1. Podobne pri hepatitickom modeli proliferácie/regenerácie je expresia génu gas-6 silne obmedzená na dobu 4 hodín po čiastočnej heptatektómii, t.j. v dobe prenosu z GO na GI; táto expresia sa vráti k normálu, pravdepodobne akonáhle bolo raz iniciované delenie hepatocytov (Ferrero a kol., J. Celí. Physiol. 1994, 158: 263-269).
Podstata vynálezu
Predkladáte! vynálezu sa zaujímal o nový gén, t.j. gén gax (rast-blokovania špecifický homeobox) a dokázal, že tento gén má vlastnosti, ktoré sú výhodné hlavne na použitie terapii hyperproliferatívnych chorôb, hlavne
Gax gén bol pôvodne zistený z krysej aorty. Kóduje v génové] restenózy. pripravenej v cDNA knižnici proteín s 303 aminokyselinami. Jeho sekvencia bola charakterizovaná a jeho kol. Mol. Celí. Biol. 1993, určité vlastnosti, ktoré sú cDNA bola klonovaná (Gorski a 6, 3722-3733). Gax gén má podobné vlastnostiam u génov gas a gadd, pretože sa tiež zdá, že reguluje prenos G0/G1 v bunkovom cykle. Rovnakým spôsobom je hladina gax mRNA znížená u krysích VSMC desaťkrát po dvoch hodinách po vystavení PDGF (Gorski a kol. Mol. Celí. Biol. 1993, 6, 3772-3773). Expresia gax génu je preto potlačená v priebehu VSMC mitogénnou odpoveďou.
Jednou z výhod spôsobu podía predkladaného vynálezu je principiálne u dospelých špecifickosť expresie krýs gax gén v kardiovaskulárnom (aorta a srdce) gax génu. Takto je exprimovaný hlavne systéme. Na druhej strane mozgu, blott.
pri demonštrovaní prítomnosti gax mRNÄ v pečeni, žalúdku alebo kostrových svaloch zlyhal northern
Post-angioplastická restenóza hyperproliferatívna choroba, ktorá nechirurgickej intervencii v oblasti škvrny. Vďaka tomu vedie angioplastiou často (až 50 je lokalizovaná sa rozvíja po aterosklerotickej liečenie aterosklerotických léz z prípadov v určitej štúdii) k restenóze, po ktorej nasleduje mechanické poškodenie arteriálnej steny. Kľúčovou udalosťou tohto mechanizmu je proliferácia a migrácia buniek vaskulárneho hladkého svalstva (VSMC) z tunica média smerom do tunica intima, hlavne z dôvodu neprítomnosti chránenia alebo spätnej väzby endoteliálnych buniek v tunica intima. Schopnosť selektívne exprimovať antiproliferatívny gén podía predkladaného vynálezu vo VSMC bunkách je veľmi podstatnou výhodou.
Ďalšou výhodou spôsobu podľa predkladaného vynálezu je skutočnosť, že gax gén patrí do skupiny homeotických génov. Tieto gény kódujú transkripčné faktory, ktoré obsahujú sekvencie (alebo homeodémy), ktoré rozpoznávajú konkrétne oblasti DNA (alebo homeoboxu) (rewiew: Gehring a kol. Celí, 788: 211-223, 1994) Homeodoména krysieho gax proteínu je obsiahnutá medzi aminokyselinami 185 a 245 homeopatické gény, ktoré boli do zahrnuté v kontrole bunkovej priebehu embryogenézy a tak posilňujú terapeutický potenciál spôsobu podía predkladaného vynálezu (review: Lawrence a Morata Celí 78: 181-198, 1994; Krumlauf, Celí 78: 191-201, 1994).
Predkladaný vynález sa tak týka poškodeného rekombinantného vírusu, ktorý obsahuje prinajmenšom jeden vložený gén kódujúci celý alebo časť GAX proteínu alebo
Je zaujímavé, že súčasnej doby identifikované sú proliferácie/rastu v variantu tohto proteínu. Vynález sa týka tiež použitia takých vírusov na liečenie hyperproliferatívnych patológií.
Vo vírusoch podlá predkladaného vynálezu môže byť vložený gén fragmentom komplementárnej DNA (cDNA) alebo genómickej DNA (gDNÄ) alebo hybridný konštrukt skladajúci sa napríklad z cDNA, do ktorej bol vložený jeden alebo viac intrónov. Gén obsahuje tiež syntetické alebo polysyntetické sekvencie. Ako už bolo uvedené, gén môže byť gén kódujúci celý alebo časť GAX proteínu alebo to môže byť variant tohto proteínu. V predkladanom vynáleze označuje pojem variant akýkoľvek mutant, fragment alebo peptid, ktorý má označenie prinajmenšom jednu biologickú vlastnosť GAX, rovnako ako akýkoľvek homológ GAX, ktorý bol získaný z iných zdrojov. Tieto fragmenty a varianty sa dajú získať akoukoľvek technikou známou odborníkom, hlavne genetickými alebo chemickými alebo enzymatickými modifikáciami alebo hybridizáciou alebo expresným klonovaním, umožňujúcim aby boli varianty vybrané podľa ich biologickej aktivity. Genetické modifikácie zahŕňajú supresiu, deléciu, mutáciu atď.
V predkladanom vynáleze je vložený gén, výhodne gén kódujúci celý alebo časť krysieho GAX proteínu alebo jeho ľudského homológu. Ešte výhodnejšie sa jedná o cDNA alebo gDNA.
Všeobecne vložený gén obsahuje tiež sekvencie, ktoré umožňujú aby bol exprimovaný v infikovaných bunkách. Tieto sekvencie môžu byť sekvenciami, ktoré sú prirodzene zodpovedné za expresiu daného génu, pokiaľ sú tieto sekvencie schopné funkcie v infikovanej bunke. Sekvencie môžu byť tiež rôzneho pôvodu (zodpovedajúce za expresiu rôznych proteínov alebo dokonca syntetických proteínov). Hlavne to môžu byť sekvencie eukaryotných alebo vírusových génov alebo odvodené sekvencie, ktoré stimulujú alebo potláčajú transkripciu génu špecifickým alebo nešpecifickým spôsobom a vyvolateľným alebo nevyvolateľným spôsobom. Ako príklad sa môže jednať o promotorovú sekvenciu, ktorá je odvodená z genómu bunky, ktorou je žiadúce infikovať alebo z génu vírusu, hlavne promotorov adenovírusovej E1A a MLP génu, CMV alebo LTR-RSV promotora atď. Eukaryotné promotory, ktoré sa dajú tiež uviesť, sú všadeprítomné promotory (HPRT, vimentín, aktín, tubulín, atď.), promotory prechodného vlákna (desmín, neurof i lamenty, keratín, GFAP, atď.), promotory terapeutického génu (typ MDR, CFTR, faktor VIII, atď.) tkanivo-špecifické promotory (aktín promotor v bunkách hladkého svalu), promotory, ktoré sú, výhodne aktivované v deliacich sa bunkách alebo iné promotory, ktoré reagujú na stimuly (receptory steroidného hormónu, receptory retínovej kyseliny, atď) Navyše, tieto expresné sekvencie sa dajú modifikovať pridaním aktivujúcich sekvencií, regulačných sekvencií, atď. Inak, pokial vložený gén neobsahuje akékoľvek exprimované sekvencie, dajú sa vložiť do genómu poškodeného vírusu v protismere takejto sekvencie.
Navyše, vložený gén všeobecne zahŕňa v smere kódujúcej sekvencie, signálnu sekvenciu, ktorá smeruje syntetizovaný polypeptid do., vylučovacích ciest cieľovej bunky. Aj keď tieto signálne sekvencie môžu byť prirodzené GÄX signálne sekvencie, môže to byt aj iná funkčná signálna sekvencia (napríklad génu pre tymidín kinázu) alebo umelá signálna sekvencia.
Vírusy podľa predkladaného vynálezu sú poškodené vírusy a preto nie sú schopné autonómnej replikácie v cieľovej bunke. Všeobecne gén defektných vírusov, ktoré sa používajú podľa predkladaného vynálezu, neobsahuje prinajmenšom sekvencie, ktoré sú nevyhnutné na replikáciu daného vírusu v infikovanej bunke. Tieto oblasti sa dajú alebo vyňať (celé alebo časť), vyradiť z funkcie alebo ich nahradiť inými sekvenciami, hlavne vloženým génom. S výhodou si poškodený vírus uchováva sekvencie svojho genómu, ktoré sú nevyhnutné na zakapsidovanie vírusových častíc.
Vírus podľa predkladaného vynálezu je odvodený od adenovírusu, adenosúvisiaceho vírusu (AÄV) alebo retrovírusu. Podľa jedného preferovaného vyhotovenia je vírus adenovírus.
Existujú rôzne sérotypy adenovírusu, ktorých štruktúra a vlastnosti predkladaného sa líšia
Z týchto sérotypov sú podľa vynálezu preferované k použitiu typ 2 alebo typ 5 ľudského adenovírusu (Ad 2 alebo Ad 5) alebo adenovírusy zvieracieho pôvodu (pozri prihláška W094/26914). Adenovírusy zvieracieho pôvodu, ktoré sa dajú použiť podľa predkladaného vynálezu sú adenovírusy psie, hovädzie (Mavl, Beard a kol., Virology 75 (1990) 81), bravčové, z paviánov alebo iných opíc (SAV). S výhodou je adenovírus zvieracieho adenovírus, ešte výhodnejšie CAV2 adenovírus alebo A26/61 kmeň (ATCC VR-800), napríklad].
Výhodne podľa predkladaného vynálezu používajú adenovírusy ľudské, psie alebo zmes obidvoch.
Výhodne zahŕňajú poškodené vírusy podľa predkladaného vynálezu ITR, kapsidačnú sekvenciu a nukleovú kyselinu. Ešte je v genóme adenovírusu podľa predkladaného prinajmenšom oblasť El, je nefunkčná. Vírusový pôvodu psí [Manhattan zau]imavejsie vynálezu, že gén sá dá upraviť tak, že je nefunkčný, akoukoľvek technikou známou odborníkom, najmä čiastočnou deléciou alebo k uvažovanému génu (génum) in vitro (na izolovanej úplným odstránením, nahradením, pridaním jednej alebo viac báz Takéto úpravy sa dajú dosiahnuť DNA) alebo in situ, napríklad použitím techník genetickej manipulácie alebo pôsobením mutagenných činidiel. Ďalšou oblasťou sa dá modifikovať najmä oblasť E3 (W095/02697), oblasť E2 (WO94/28938), oblasť E4 (W094/28152, W094/12649 a WO95/02697) a oblasť L5 (W095/02697). Podľa preferovaného vyhotovenia obsahuje adenovírus podľa predkladaného vynálezu deléciu oblastí El a E4. Podľa ďalšieho preferovaného vyhotovenia obsahuje deléciu v oblasti El, do ktorej bola vložená oblasť E4 a sekvencie kódujúce GAX (porov. FR94 13355). Vo vírusoch podľa predkladaného vynálezu delécia v oblasti El siaha cez nukleotidy 455 až 3329 v sekvencii Ad5 adenovírusu.
Poškodené rekombinantné adenovírusy. podľa predkladaného vynálezu sa dajú pripraviť akoukoľvek technikou známou výhodne v integrovanej rekomhinácie. Príkladmi 293 ľudskej embryonálnej odborníkom (Levrero a kol., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Najmä sa pripravujú homológovou rekombináciou medzi adenovírusom a plazmidom, ktorý nesie okrem iného požadovanú DNA sekvenciu. Homológová rekombinácia je vyvolaná po kotransfekci i daného adenovírusu a plazmidu do vhodnej bunkovej línie. Použitá bunková línia by mala výhodne (i) byt transformovateľná uvedenými prvkami a (ii) obsahovať sekvencie, ktoré sú komplementárne k časti genómu poškodeného adenovírusu, forme, aby sa zabránilo riziku bunkových línií je bunková línia ľadviny (Graham a kol., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), ktorá obsahuje, najmä integrovanú do svojho genómu, ľavorukú časť genómu Ad5 adenovírusu (12 %) alebo bunkovú líniu, ktoré sú komplementárne k funkciám E1 a E4 ako bolo opísané, najmä v prihláškach č. W094/26914 a W095(02697).
Následne sú rozmnožené adenovírusy získané a čistené štandardnými molekulárne biologickými technikami ako je ilustrované v príkladoch.
Adenosúvisiace vírusy (AAV) sú DNA vírusy relatívne menšej veľkosti, ktoré sa integrujú, stabilne a miestne špecifickým spôsobom, do genómu infikovaných buniek. Sú schopné infikovať širokú škálu buniek bez ovplyvnenia bunkového rastu, morfológiou alebo diferenciáciou. Navyše sa zdá, že nie sú zahrnuté do ľudských patológií. Genóm AAV bol klonovaný sekvenovaný a charakterizovaný. Zahŕňa približne a obsahuje oblasť prevráteného terminálneho (interved terminál repeat - ITR) s dĺžkou
4700 báz opakovania približne 145 báz na každom konci, ktorá slúži ako východzi bod replikácie nevyhnutných ľavoruká časť vírusu. Zvyšok genómu je rozdelený do dvoch oblastí, ktoré majú kapsidačné funkcie: genómu, ktorá obsahuje rep gén zahrnutý vírusového génu; a pravorukú cap gén kódujúci kapsidový v replikácii vírusu a expresiu časť genómu, ktorá obsahuje proteín vírusu.
Použitie vektorov odvodených od AAV pre prenos génu in vitro a in vivo bolo opísané v literatúre (pozri, najmä, WO 91/18088; WO 93/092239; US 4, 797,368, US5,139,941, EP 488 528). Tieto prihlášky opisujú rôzne konštrukty odvodené od ÄAV, v ktorých sú rep alebo cap gény odstránené a nahradené požadovaným génom a použitie týchto konštruktov na prenos požadovaného génu in vitro (do kultivovaných buniek) alebo in vivo (priamo do organizmu). Poškodené rekombinantné AVV podľa predkladaného vynálezu sa dá vyhotoviť kotransekciou plazmidu obsahujúceho požadovanú nukleokyselinovú sekvenciu, ktorá je obklopená dvoma AAV prevráteného terminálneho opakovania (ITR) a plazmidu nesúceho AAV kapsidačné gény (rep a capgény), do bunkovej línie, ktorá je infikovaná ľudským pomocným vírusom (napríklad adenovírus). AAV rekombinanty, ktoré boli tak vyrobené, boli čistené štandardnými technikami. Vynález opisuje preto aj AAV odvodený rekombinantný vírus, ktorého genóm obsahuje sekvenciu kódujúcu GAX, ktorá je obklopená ÄAV ITR. Vynález sa týka plazmidu obsahujúceho sekvenciu kódujúcu GAX, ktorá
Taký plazmid sa dá použiť tak GAX sekvencia s plazmidom, tam kde je to je zahrnutý do lipozómového vektora je obklopená dvoma ITR a AAV ako je na prenos vhodné, ktorý (pseudovírus).
Konštrukcia bola rozsiahle rekombinantných retrovírusových literatúre: pozri vektorov najmä EP 7 (1985)
Najmä sú deliacesa spracovaná v
453242, EP 178220, Bernstein a kol. Gent. Eng 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, atčf retrovírusy integračné vírusy, ktoré infikujú bunky. Retrovírusový genóm zahŕňa hlavne dve LTR, kapsidačné sekvencie a tri kódujúce oblasti (gag, pol a env). U rekombinantných vektorov odvodených od retrovírusov sú gény gag, pol a env všeobecne odstránené, celé alebo čiastočné a nahradené požadovanou heterológovou nukleokyselinovou sekvenciou. Tieto vektory sa dajú konštruovať z rôznych typov retrovírusov ako sú najmä MoMuLV (murine Moloney leukaemia virus tiež označovaný ako MoMLV), MSV (murine Moloney sarcoma virus), HaSV (Harvey ο
sarcoma vírus), SNV (spleen necrosis vírus), RSV (Rous sarcoma vírus“) alebo iný priateľský vírus.
Všeobecne, aby boli skonštruované rekombinantné retrovírusy obsahujúce sekvenciu kódujúcu GAX podľa predkladaného vynálezu, je konštruovaný plazmid, ktorý obsahuje najmä LTR, kapsidašnú sekvenciu a kódujúcu sekvenciu, ktorá je potom použitá na transfekciu toho, čo je nazývané enkapsidačná bunková línia, ktorá je schopná doplňovať retrovírusove funkcie, ktoré chýbajú u plazmidov. Všeobecne sú enkapsidačné bunkové línie schopné exprimovať gény gag a env. Také enkapsidačné bunkové línie boli opísané v doterajšom stave techniky, najmä bunková línia PÄ317 (US 4,861,719), bunková línia PsiCRIP (WO 90/02806) a bunková línia GP+envAm-12 (W089/07150). Navyše, rekombinantné retrovírusy môžu obsahovať modifikácie v LTR na potlačenie transkripčnej aktivity rovnako ako enkapsidačné sekvencie, ktoré zahŕňajú časť gag génu (Bender a kol. J. Virol. 61 (1987) 1,963). Rekombinantné retrovírusy, ktoré boli vyrobené, boli následne čistené bežnými technikami.
Použitie poškodených rekombinantných adenovírusov na liečenie restenózy je veľmi výhodné. Adenovírusy majú vysokú infekčnú kapacitu na proliferujúce bunky vaskulárneho hladkého svalstva. To umožňuje použiť relatívne malé množstvá aktívnej zložky (rekombinantného adenovírusu), ktoré vedú k účinnému a veľmi rýchlemu pôsobeniu v liečených miestach. Adenovírusy podľa predkladaného vynálezu sú tiež schopné exprimovať veľkými rýchlosťami vložený gax gén, čo vedie k veľmi účinnému terapeutickému pôsobeniu. Navyše vďaka ich epizomálnej povahe zotrvávajú adenovírusy podľa predkladaného vynálezu v proliferujúci ch bunkách na obmedzenú dobu a tak majú prechodný vplyv, ktorý je vynikajúcim spôsobom upravený na žiadaný terapeutický efekt.
Predkladaný vynález sa týka tiež farmaceutického prostriedku, ktorý obsahuje jeden rekombinantných -vírusov, ktoré už alebo viac poškodených boli opísané. Také prostriedky môžu byť v takej podobe, ktorá je vhodná na predkladaného pri jateľné na plánovaný spôsob ich podávania povrchovou, orálnou, parenterálnou, intranazálnou, intravenóznou, subkutánnou, intraorakulárnou atď. cestou.
Výhodne obsahuje prostriedok podía vynálezu excipienty, ktoré . sú farmaceutický najmä na injekcie do bunkovej sú najmä sterilné, izotonické roztoky soli (hydrogén alebo dihydrogénfosforečnan sodný, chlorid sodný, draselný, vápenatý alebo horečnatý, atď. alebo zmesi takých solí), alebo suché, najmä lyofi 1 izované prostriedky, ktoré sa rekonštituujú pridaním sterilizovanej vody alebo fyziologického roztoku na i njekovateľné roztoky. Excipient tiež môže byť hydrogél, ktorý sa pripravuje z akéhokoľvek biokompatibiIného alebo nejedovatého (homo alebo hetero) polyméru. Také polyméry boli opísané, napríklad v prihláške WO 93/08845. Niektoré z nich ako najmä tie z etylénoxidu alebo propylénoxidu sú komerčne dostupné.
injekovateľné steny. Tieto prostriedky, excipienty ktoré súvisia s sa dajú poškodené predkladaného vynálezu obsahujúceho ktorú možno
Pri liečení patológií, hyperproliferatívnymi chorobami rekomhinantné adenovírusy podía podávať rôznymi cestami, najmä injekčné. S výhodou sú pri liečení restenózy adenovírusy podía predkladaného vynálezu podávané priamo do steny krvnej cievy pomocou angioplastického balónika, ktorý je pokrytý hydrofilným filmom (napríklad hydrogélom), ktorý je nasýtený adenovírusmi alebo pomocou iného katétra infúznu komôrku pre roztok adenovírusu, aplikovať presne do miesta liečenia a umožňuje adenovírusom miestne a účinné uvoľnenie v mieste liečenej bunky. Tento spôsob podávania výhodne umožňuje infikovať veíké množstvo (až 9,6 ss) buniek tunica média, ktoré tvorí preferovaný cieľ na liečenie restenózy, kým štandardné spôsoby podávania (napríklad intravenóznej injekcie) neumožňujú aby boli bunky infikované v takom rozsahu.
Spôsob liečenia podía predkladaného vynálezu výhodne pozostáva z podávania prostriedku, ktorý obsahuje hydrogél nasýtený rekombinantnými adenovírusmi do liečeného miesta. Hydrogél môže byt umiestnený priamo na povrchu liečeného tkaniva, napríklad v priebehu chirurgického zákroku.
Výhodne je hydrogél podávaný na liečené miesto pomocou katétra, napríklad balónikového katétra, najmä pri angioplasti i. Zvlášť výhodným spôsobom je, ak nasýtený hydrogél je dodávaný na liečené miesto pomocou balónikového katétra.
Dávky vírusu, ktoré sa používajú do injekcií, sa dajú upraviť podľa podmienok najmä podľa použitého spôsobu podávania a žiadaného trvania liečenia. Všeobecne sú rekombinantné vírusy podľa predkladaného vynálezu podávané vo forme dávok 104 až 1014 pfu/ml. V prípade AAV a adenovírusu sa dá použiť dávka 106 až 1O10 pfu/ml. Pojem pfu ('jednotka tvorby doštičiek) zodpovedá infekčnej sile suspenzie virónov a je určený infikovaním vhodnej bunkovej kultúry a meraním, všeobecne po 48 hodinách, počtu doštičiek infikovaných buniek. Techniky určenia pfu titra vírusového roztoku'sú dohre dokumentované v literatúre.
Predkladaný vynález ponúka nový a veľmi účinný prostriedok liečenia alebo prevencie patológií, ktoré súvisia s hyperproliferatívnymi chorobami ako je restenóza.
Ďalej sa dá toto liečenie použiť na ľuďoch, rovnako, ako na akýchkoľvek zvieratách ako sú ovce, hovädzí, dobytok, domáce zvieratá (psi, mačky, atď.) kone, ryby, atď.
Predkladaný vynález je úplnejšie opísaný v nasledujúcich príkladoch, ktoré sú len ilustratívne a nijako neobmedzujúce.
Opis obrázkov
Obrázok 1: Obrázok 2: Obrázok 3:
Obrázok 3A
Obrázok 3B Obrázok 4:
Obrázok 5:
Obrázok 6:
Obrázok 7:
Zobrazenie plazmidu pCOl.
Zobrazenie plazmidu pXL-CMV-GaxHΛ
Jadrové umiestnenie GÄXH-HA proteínu vo VSMC transfekovaných pXL-CMV-GaxH.
VSMC transfekované s vektorom pCGN (chýba GAX inzert).
VSMC transfekované s vektorom pXL-CMV-GaxHA . Jadrové umiestnenie GAX-HA proteínu vo VSMC transfekovaných Ad-CMV-Gax.
Vplyv Ad-CMV-GAX na proliferáciu VSMC (t = 24 hodín)
- VSMC sú sčítané po 24 hodinách po pôsobení
Ad-CMV-Gax (1000 pfu/bunka) alebo kontrolným adenovírusom (Ad-RSV-pGal, 1000 pfu/bunka).
Bunkový rast je blokovaný (0,5 % FSC) alebo stimulovaný (FSC 20 %).
Vplyv Ad-CMV-GAX na proliferáciu VSMC (t = 48 hodín).
- VSMC sú sčítané po 48 hodinách po pôsobení
Ad-CMV-Gax (1000 pfu/bunka) alebo kontrolným adenovírusom (Ad-RSV-QGal, 1000 pfu/bunka).
Bunkový rast je blokovaný (0,5% FCS) alebo stimulovaný (FSC 20%).
Vplyv Äd-CMV-GAX na životnosť VSMC, ktoré sú inkubované v prítomnosti fetálneho teľacieho séra (FSC 20%).
- experimentálne podmienky, porov. obrázok 6.
Obrázok 7A: bunky, ktoré nie sú liečené adenovírusom
Obrázok 7B: bunky, ktoré sú liečené Ad-RSV-pGal
Obrázok 7C: bunky, ktoré sú liečené Ad-CMV-Gax
Obrázok 8: Vplyv Ad-CMV-Gax a Ad-RSV-pGal na krysiu karotídovú artériu po pôsobení balónikového katétra.
Obrázok 8A: meranie povrchovej oblasti v intime
Obrázok 8B Obrázok 8C Obrázok 9: Obrázok 9A Obrázok 9B meranie pomeru intima ku médiu meranie luminárneho zúženia
Arteriálny prierez kontrolných a liečených ciev kontrolné cievy liečené Ad-RSV-SGal cievy liečené Ad-CMV-Gax.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Všeobecné molekulárne biologické techniky
Štandardné metódy používané v molekulárnej biológii, ako sú preparatívne extrakcie plazmidovej DNA, centrifugácie plazmidovej DNA v gradiente chloridu cesného, elektroforéza na agarózovom alebo akrylamidovom géli, čistenie fragmetov DNA elektroelúciou, extrakciou proteínu fenolom alebo zmesou fenol/chloroform, zrážaním DNA v soľnom médiu pomocou etanolu alebo izopropanolu, prevedenie do Eschericia coli, atď.,...,sú odborníkom dobre známe a sú.rozsiahlym, spôsobom opísané v literatúre [Maniatis T., a kol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982; Ausubel F.M., a kol. (editori), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987].
Plazmidy typu pBR322 a pUC a fágy série M13 boli získané komerčne (Bethesda Research Laboratories).
Na ligáciu sa DNA fragmenty oddeľujú podľa veľkosti elektroforeticky na agarózovom alebo akrilamidovom géli, extrahujú a potom inkubujú v prítomnosti T4 DNA ligázy (Biolabs) podľa odporúčania dodávateľa.
5' predĺžené konce sa dajú pri používaní vyplniť Klenowovým fragmentom E. coli DNA polymerázy I (Biolabs) podľa údajov výrobcu. 3' predĺžené konce sú zničené v prítomnosti T4 DNA polymerázy (Biolabs), ktorá sa používa podľa odporúčania výrobcu. 5'predížené konce sú zničené opatrným pôsobením SI nukleázy.
vitro miestne špecifickú mutagenézu pomocou ých oligonukleotidov je možné uskutočniť spôsobom Taylorom a kol. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) ] použitím súpravy distribuovanej firmou Amersham.
In syntet ick vyvinutým 8749-8764
Príklad 1: konštrukcia vektora pXL-CMV-GaxHA nesúceho gén kódujúci krysí gax proteín pod kontrolou CMVpromotora.
Tento príklad opisuje konštrukciu vektora, ktorý obsahuje cDNA kódujúcu gax proteín (krysí) a adenovírusové sekvencie, ktoré umožňujú rekombináciu. Ku N-koncu gax proteínu bol predaný epitop chrípkového vírusu hemaglutinín (epitop HA1), zahŕňajúci 18 aminokyselín. Také pridanie epi topu umožňuje sledovať expresiu gax, najmä imunofluorescenčnými technikami, použitím epitopu. Okrem svojej citlivosti táto umožňuje vylúčiť ako in vivo tak in vitro, šum pozadia, ktorý zodpovedá expresii endogénnych gax proteinov.
protilátok HA1 metóda zároveň
1.1. Konštrukcia plazmidu pCOl
A - Konštrukcia plazmidu pCE
EcoRl/Xbal fragment zodpovedajúci ľavorukému koncu genómu adenovírusu Ad5 bol najprv klonovaný medzi Acor a Xba miestami vektora pIC19H. Tým bol generovaný plazmid pCA. Plazmid pCA bol potom prestrihnutý Hinfi a jeho 5'predížené konce boli vyplnené Klenowovým fragmentom E. coli DNA polymerázy I; potom bolo všetko prestrihnuté Ecor. Fragment plazmidu pCA, ktorý bol takto generovaný a ktorý obsahuje ľavoruký koniec genómu adenovírusu Ad5, bol potom klonovaný medzi EcoRI a Smal miestami vektora pIC2OH (Marsh a kol., Gene 32 (1984) 481). Tým bol generovaný plazmid pCB. Plazmid pCB bol potom prestrihnutý EcoRI a jeho 5'predlžené konce boli vyplnené Klenowovým fragmentom E. coli DNA polymerázy
I; všetko potom bolo prestrihnuté BamHI. Fragment plazmidu pCB, ktorý bol takto generovaný a ktorý obsahuje lavoruký koniec genómu adenovírusu Ad5 , potom bol klonovaný medzi Nrul a BglII miestami vektora pIC2OH. Tým bol generovaný plazmid pCE ktorého výhodná charakteristika spočíva v prvých 382 pároch báz adenovírusu Ad5, ktoré nasleduje mnohonásobné klonovacie miesto.
B - konštrukcia plazmidu pCD'
Sau3A (3346)/SstI (3645) a SstI (3545)/NarI (5519) fragmenty z genómu adenovírusu Ad5 boli najprv spolu ligované a klonované medzi Clal a BamHI miestami vektora pIC2OH, čím bol generovaný plazmid pPY53. Sall/Taql fragment z plazmidu pPY53 (pripraveného z dam-pozadia), obsahujúci časť genómu adenovírusu Ad5 medzi miestami Sau3A (3346) a Tagl (5207) potom bol klonovaný medzi Sali a Clal miestami vektora pIC20H, čím bol generovaný plazmid pCA'. Tagl (5207)/NarI (5519) fragment . genómu.· Ad5 adenovírusu, pripraveného z dam- pozadia,a Sall-Tagl fragment z plazmidu pCA'potom boli spolu ligované a klonované medzi Sali a NarI miestami vektora pIC20H. Tým bol generovaný plazmid pCC'. NarI (5519)/NruI (6316) fragment genómu adenovírusu Ad5, pripraveného z dam- pozadia a Sall/NarI fragment z plazmidu pCC' potom boli spolu ligované a klonované medzi Sali a Nrul miestami vektora pIC20H. Tým bol generovaný plazmid pCD'.
C- Konštrukcia plazmidu pCOl
Čiastočným odbúravaním plazmidu pCD' pomocou Xhol a potom úplným odbúravaním pomocou Sali bol generovaný fragment, ktorý obsahoval sekvenciu adenovírusu Ad5 od miesta Sau3A (3446) až k miestu Nrul (6316). Tento fragment bol klonovaný do Sali miesta plazmidu pCE. Tým bol generovaný plazmid pCOl (obrázok 1), ktorý obsahoval lavorukú časť adenovírusu Ad5 až do miesta Hinfl (382), mnohonásobného klonovacieho miesta a Sau3A (3446)/NruI (6316) fragmentu adenovírusu Ad5 .
1.2 Konštrukcia vektora pXL-CMV-GaxHA (porov. obrázok 2)
Gax cDNA bol klonovaný medzi Xbal a vektora pCGN (Tanaka a Herr, Celí 60: Výsledný vektor, pCGN-Gax, obsahoval
BamHI miestami 375-386, 1990). promotorovú a enhancerovú sekvenciu cytomegalovírusu (CMV) (-522, +72; Boshart a kol., Celí, 41: 521-530, 1985), hlavnú sekvenciu kinázy, vrátane AUG tri aminokyseliny 6: 1309-1315, herpes simplex virus tymidín inicializačného kodónu, rovnako ako prvé (+55, +104; Rusconi a Yamamoto, EMBO J.,
1987), sekvencie kódujúce HA1 epitop [Y P Y D V P D Y A SLGGP (sekvencie id. č. 1)], krysí gax cDNA a, nakoniec polyadenylačnú sekvenciu králičieho β-globínového génu (Päbo a kol., Celí, 35: 445-453, 1983).
Vektor pCGN-Gax bol potom prestrihnutý XmnI a Sfil a vzniknutý .fragment . obsahujúci promotor, cDNA a polyadenylačnú sekvenciu, bol po úprave podľa Klanowa vložený do EcoRV miesta člnkového vektora pCOl, ktorý obsahoval adenovírusové sekvencie potrebné na rekombináciu. Plazmid, ktorý hol získaný bol označený pXL-CMV-GaxHA (porov. obrázok 2).
Príklad 2: demonštrácia proliferačne inhibičných vlastností plazmidu pXL-CMV-gax-HA.
Tento príklad opisuje postupy, ktoré sa dajú použiť na demonštráciu kvality homológových rekombinačných vektorov (porov. príklad 1), v ohľade expresie (detekcie gax proteínu a HA epitopu) a v ohľade aktivity (vplyv na proliferáciu).
Bunky vaskulárneho hladkého svalstva (vascular smooth-muscle cells - VSMC) boli kultivované enzymatickým odbúravaním NZW králičej aorty spôsobom upraveným podľa
Chamley a kol. (Celí Tissue Res. 177: 503-522 1977). Stručne povediac, po vybratí bola aorta inkubovaná pri 37°C počas 45 minút v prítomnosti kolagenázy (kolagenáza II, Cooper Biomedical). Druhé odbúravanie sa potom uskutočňovalo počas dvoch hodín v prítomnosti kolagenázy a elastázy (Biosys), čím bola získaná bunková suspenzia. Bunky boli udržiavané v prítomnosti 20% fetálneho teľacieho séra a použité na všetky testy (porov. ďalej). Vo všetkých týchto experimentoch boli bunky hladkého svalstva charakterizované imunoznačením pomocou anti-aSM aktín protilátky (F-3777, Sigma).
Na overenie kvality expresných vektorov (porov. Príklad 1), boli prítomnosť a umiestnenie gax proteínu monitorované u každého konštruktu imunofluorescenciou. Aby bolo možné uskutočniť toto sledovanie, bunky hladkého
3T3 bunky boli transfekované plazmidmi a pCGNgax v prítomnosti zmesi DOSPA/DOPE (Lipofectamine, Gibco BRL). Bunky boli inkubované v prítomnosti komplexu v médiu neobsahujúcom fetálne teľacie sérum 8 hodín (optimálne trvanie: 8 hodín na SMC). Po inkubácii počas 24 hodín v prítomnosti fetálneho teľacieho séra boli bunky kultivované na mikroskopickej doštičke (Titertek), pri sledovaní imunofluorescencie, počas ďalších 24 hodín. Bunky boli potom fixované v prítomnosti 4% paraformaldehydu a následne permabi1 izované prídavkom 0,1% tritónu. Po nasýtení buniek v prítomnosti hovädzieho séra albumínu (BSA, Sigma), bola pridaná na úspešne uskutočnenie pokusu anti-HA protilátka (12CA5, Boehringer Mannheim) a potom protilátka konjugovaná s fluoresceínom.
Imunofluorescenčné pokusy uskutočnené súčasne na NIH3T3 bunkách a na primárnej kultúre králičích VSMC dokázali, že pCGNgax tak člnkový plazmid pXL-CMV-GaxHA proteín, ktorý je umiestnený v jadre (porov. kontrolný plazmid; 3B: plazmid
Navyše bolo možné po extrakcii jadrových svalstva alebo pXL-CMV-Gax HA
DNA/1ipozóm počas 4 až ako plazmid naozaj kódujú obrázok 3A:
pXL-CMV-GÄäaxHA ) proteínov z buniek transfekovaných pXL-CMV-Gax dokázať, pomocou Western blottu, proteín, ktorý je detekovaný protilátkou proti HA epitopu.
Potom bol zisťovaný vplyv uvedených vektorov na proliferáciu bunky. Aby bolo možné toto určenie vykonať bola použitá nepriama metóda, ktorá je založená na meraní tvorby kolónie. Stručne povedané, NIH3T3 myšacej embryonáln'e j bunky boli použité k uskutočneniu testu vzniku kolónie upraveným spôsobom podľa Schweighoffer a kol. (Mol. Celí. Biol. 1993, 13: 39-43). Stručne povediac, bunky sú kontrastekované s plazmidom, ktorý nesie gén rezistencie na neomycin a s prebytkom požadovaného vektora (pCGNgax alebo pXL-CMV-GaxHA). Po selekcii v G41S boli kolónie zafarbené roztokom karbolfuchsínu (Diagnostica, Merck) a spočítané. Výsledky reprezentatívneho experimentu, ktoré sú uvedené v tabuľke 1, demonštrujú zníženie počtu kolónií v prípade buniek transfekovaných pCGNgax.
Tabuľka 1
| Podmienky transfekcie 3T3 buniek | Počet kolónii po selekcii v G418 |
| pCGN (5 (jg) + pSV2neo (1 pg) (§) | 183 + 28 (*) |
| pCGNgax (5pg) + pSV2neo (IM?) | 93 + 11 |
(§) pCGN kontrolný vektor: neprítomnosť gax inzertu (*) P < 0,01
Príklad 3: Konštrukcia rekombinantného adenovírusu Ad-CMVgax
Vektor pXL-CMV-GaxHA, pripravený podľa príkladu 1, bol následne 1inearizovaný a kontrasfekovaný na rekombináciu s poškodeným adenovírusovým vektorom do pomocných buniek (bunková línia 293), ktorej dodávajú funkcie kódované oblasťami adenovírusu El (E1A a E1B).
Adenovírus Ad-CMVgax bol získaný prostriedkami in vivo homológnou rekombináciou medzi adenovírusom Ad.RSVpgal (Stratford Perricaudet a kol., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626) a vektorom pXL-CMV-GaxHA podľa nasledujúceho postupu: vektor pXL-CMV-GaxHA, linearizovaný s enzýmom XmnI a adenovírus Ad.RSVPgal, linearizovaný s Clal, boli kotransfekované do bunkovej línie 293 v prítomnosti fosforečnanu vápenatého aby mohla prebiehať homológna rekombinácia. Rekombinantné adenovírusy, ktoré boli týmto spôsobom generované, boli vybrané doštičkovým čistením. Po izolácii bol rekombinantný adenovírus rozmnožený v bunkovej línii 293, čo vedie ku kvapaline nad kultúrou, ktorá obsahuje nevyčistené rekombinantné poškodené adenovírusy, ktoré majú titer 10 pfu/ml.
Vírusové častice boli čistené odstreďovaním v gradiente chloridu cesného podľa známych postupov (pozri najmä Graham a kol., Virológie 52 (1973) 456). Adenovírus Ad-CMVgax bol uchovávaný pri - 80°C v 20% (hmôt.) glyceroli.
Príklad 4: demonštrácia proliferačno inhibičných vlastností adenovírusu Ad-CMVgax.
inkubovaná v kontrolného adenovírus prítomnosti adenovírusu exprimujúci adenovírusu (ad-RSV(3Gal :
Tento príklad opisuje postupy, ktoré sa dajú použiť na demonštráciu kvality rekombinantného adenovírusu, čo sa týka produkcie gax proteínu a čo sa týka biologickej aktivity (vplyv na bunkovú proliferáciu).
Králičia aorta bola
Ad-CMVgaxHA a rekombinantný β-galaktozidázu s kontrolou RSV promotora), ktorý je riedený v médiu (DMEM, 0,5 % FCS). Po jednej hodine pri 37°C vo vlhkej atmosfére bolo médium, obsahujúce roztok adenovírusu odsaté a nahradené novým médiom (DMEM, 0,5 % FCS) počas 18 až 24 hodín. Potom bolo pridané médium, bohaté na FCS (konečná koncentrácia FCS: 20 %), aby sa stimulovala proliferácia buniek a bunky boli po 24 hodinách a po 48 hodinách spočítané.
Navyše, 24 hodín po pridaní roztoku adenovírusu bola monitorovaná expresia gax proteinu bunkami VSMC technikou opísanou v príklade 2, najmä značením jadra prostriedkami imunofluorescencie (lokalizácie proteinu) a tiež Western blottom. Proteín produkovaný rekombinantným adenovírusom je účinne detekovaný protilátkami, ktoré rozpoznávajú HA epitop a majú rovnakú elektroforetickú mobilitu ako gax proteín, ktorý je detekovaný v jadre VSMC, ktoré boli transfekované s pCGNgax alebo pXL-CMV-GaxHA. Obrázok 4 ilustruje umiestnenie Gax proteinu vo VSMC, ktoré boli inkubované v prítomnosti Ad-CMVgaxHA.
Výsledky reprezentatívneho experimentu, ktoré sú uvedené na obrázku 4, demonštrujú značné zníženie počtu buniek po pridaní Ad-CMVgaxHA vírusu. Na druhej strane toto zníženie počtu buniek nebolo pozorované po pôsobení kontrolného adenovírusu použitého, v rovnakej koncentrácii (M.O.I. 1000). Súčasne sme pomocou imunofluorescencie overili, že táto vysoká infekčnosť umožňuje ako β-gal značkovému génu (použitie anti-E.Coli β-gal protilátky, Monosan) tak gax proteinu (použitie anti-HA protilátky, porov. príklad 2), aby boli exprimované vo viac než 90 % populácie králičích VSMC.
Pridanie ad-RSV-^gal vírusu je spojené so slabým cytostatickým efektom (-13 %) po kultivácii počas 24 hodín v prítomnosti fetálneho teľacieho séra (20 %). Za rovnakých experimentálnych podmienok viedlo pôsobenie Ad-CMVgaxHA k 57 % zníženie počtu buniek (porov. obrázok 5). Biologická aktivita Ad-CMVgaxHA vírusu je veľmi zrejmá po 48 hodinách kultivácie a dokonca môže súvisieť i s bunkovou smrťou (porov. obrázky 6 a 7).
Tak je blokovanie proliferácie, ktorá je spôsobená Ad-CMVdaxHA, spojené so značným znížením počtu buniek, ktoré sa dajú detekovať po kultivácii počas 24 hodín (porov. obrázok 5). Je zaujímavé, že tento vplyv Ad-CMVgaxHA bol pozorovaný u buniek, ktoré boli stimulované vysokou koncentráciou FCS (20 %), ale nie u buniek, ktoré boli zbavené FCS (0,5 &) (porov. obrázok 6). Tento príklad preto ukazuje, že rekombinantný adenovírus, ktorý kóduje gax proteín, môže účinne blokovať bunkové delenie bez akéhokoľvek značného vplyvu na životnosť buniek, ktoré sú blokované v GO fáze ich cyklu.
Vplyv Ad-CMVgaxHA adenovírusu na životnosť VSMC v kultúre je ďalej ilustrovaný obrázkom 7.
Inhihičné vlastnosti Ad-CMVgaxHA na syntézu DNA boli potvrdené pokusy o začlenení hrómdeoxyuridínu (BrdU). Stručne povedané, po 24 hodinách po pridaní adenovírusu boli inkubované VSMC v prítomnosti FCS (10 % až 20 %) a BrdU (10 μΜ), ktorý je do buniek začleňovaný miesto tymínu pri fáze DNA syntézy a dá sa detekovať špecifickými protilátkami. Začlenenie BrdU holo kvantifikované pomocou prietokovej cytometri e.
Ten istý spôsob prietokovej cytometrie bol použitý na
I , vizualizáciu postupu králičích ‘VSMC buniek, upravených Ad-CMVgaxHA, v ich bunkovom cykle. Pôsobenie Ad-CMVgaxHA je spojené s blokovaním bunkového cyklu vo fáze GO/G1.
Príklad 5: inhihícia intimálnej hyperplazie pomocou adenovírus-gax in vivo.
Tento príklad ukazuje účinnosť rekombinantných adenovírusov v modeli vaskulárnej patológie.
Použitý model arteriálnej lézie je založený na obrusovaní krysej karotídy (Clows a kol., Lab. Invest. 49 (1983) 327-333). U tohto modelu, VSMC dediferencujú, proliferujú a migrujú do formy neointimy, ktorá môže čiastočne pohlcovať artériu, do dvoch týždňov poškodenia.
Sprague-Dawley krysy boli anestetikované intraperitoneálnou injekciou pentoharbitálu (45 mg/kg). Nasledovala vonkajšia karotídová arteriotómia, krysie karotídové artérie boli obnažené balónikovým katétrom a vystavené 1.10 pfu Ad-CMVgaxHA alebo Ad-RSVPGal. Adenovírus bol použitý v roztoku obsahujúcom 15 % poloxaméru 407, ktorý uľahčuje prenos génu adenovírusu. Dvadsať minút po inkubácii bol roztok vírusu odobraný a boli odstránené ligatúry, čím bola obnovená cirkulácia. Krysy boli utratené po dvoch týždňoch a na reze liečených ciev boli uskutočnené kvantitatívne morfometrické analýzy. Výsledky sú uvedené na obrázkoch 8 a 9.
Získané výsledky ukazujú, že všetkých deväť Ad--RSVP-Gal transfekovaných karotídových artérií malo silnú VSMC proliferáciu a rozvoj značného neointimálneho zhrubnutia. Plocha neointimy bola 0,186 +/- 0,02 mm2 (SEM) s rozsahom 0,10 až 0,28. Luminálna patentencia bola príslušne zúžená na 40 +/- 4 (rozsah 21 až 63), obrázok 8C. Pomer intima : média bol 1,51 +/- 0,l(rozsah 0,87 až 2,17). Tieto výsledky boli podobné výsledkom získaným skôr u kontrolných ciev, na ktoré sa pôsobilo fyziologickým roztokom. Na rozdiel od toho, pôsobenie Ad-CMVfaxHA značne, znížilo patologickú reakciu na poškodenie balónikom. U ciev liečených Ad-CMVgaxHA bola priemerná plocha neointimálna lézia 0,076 +/- 0,02 mm2 (rozsah 0 až 0,19), luminálne zoslabenie bolo znížené na
17,5 +/-5 %. Štatistická analýza potvrdila, že liečenie Ad-CMVgaxHA značne inhibuje rozvoj intimálneho zhrubnutia relatívne ku kontrolám Äd-RSVp-Gal. Konkrétne, liečenie Ad-CMVgaxHA znížilo pomer intima: média o 69 %, intimálnu plochu o 59 % a luminálne zoslabenie o 56 % (obrázky 8A a 8B). Značný vplyv na intimálnu hyperplaziu bol ďalej zdôraznený výsledkami získanými z prierezu kontrolných (obrázok 9A) alebo liečených (obrázok 9B) zvierat.
Tento príklad demonštruje veľmi účinnú aktivitu pri zostavovaní rastu konštruktu Ad-CMVgaxHA in vivo. Táto aktivita je veľmi špecifická a nebola pozorovaná u kontrolných zvierat. Prezentované výsledky jasne ukazujú terapeutickú aktivitu Ad-CMVgaxHA na vaskulárnu morfológiu a najmä na hyperplaziu, ktorá je spojená s postangioplastickou restenózou. Použitie vírusu ako je adenovírus, na prenos Gax génu in vivo je zvlášť účinné. Tento spôsob je ďalej výhodný, pretože je založený na nahradení génu. Tento spôsob je jedinečný v tom, že spôsobuje účinnosť dopravy a génovú terapiu do dvoch terapeutických vlastností: zastavenie rastu a konštitutívnu expresiu vo vaskulárnom systéme. Prenos Gax génu podľa predkladaného vynálezu vyvoláva špecifickú regresiu hyperproliferatívneho ochorenia vaskulárnej cievy a následne tak normalizuje arteriálne funkcie. Miestny prenos Gax génu podľa predkladaného vynálezu je tiež výhodný najmä v tom, že nevadí reendotelizačnému procesu, ktorý nasleduje po lézii artérie. Navyše okrem priameho vplyvu na bunkovú proliferáciu a vaskulárnu morfológiu, prenos gax génu podľa predkladaného vynálezu môže mať aj užitočný nepriamy vplyv na syntézu extracelulárnej matrice a na remodeláci u. Tieto výsledky ukazujú, že prenos Gax génu podľa predkladaného vynálezu je výrazný nový pokrok v liečení vaskulárnuch lézii, ktoré vznikajú po angioplasti i.
Zoznam sekvencií (1) Všeobecné informácie:
(i) Vynálezca:
Meno: ČASE WESTERN RESERVE UNIVERSITY Ulica:
Mesto: Cleveland Štát: Ohio Krajina: USA Poštový kód: 44106 (i) Vynálezca:
Meno: Branellec, Didier
Ulica: 1, Rue Saint-Benoit
Mesto: 94210 La Varenne-Saint Hilaire
Štát:
Krajina: Francúzsko Poštový kód: .
(i) Vynálezca:
Meno: Walsh, Kenneth Ulica: 207 Judy Farm Road Mesto: Carlisle Štát: Massachusetts Krajina: USA Poštový kód: 01741 (i) Vynálezca:
Meno: 34 Brenton Road Mesto: Weston Štát: Massachusetts Krajina: USA
Poštový kód: 02193 (ii) Názov vynálezu: Vírusové vektory a ich použitie na liečenie hyperproliferatívnych ochorení, najmä restenózy (iii) Počet sekvencii: 1 (iv) Korešpondenčná adresa:
(A) Adresa: Rhone-Poulenc Rorer Inc.
(B) Ulica: 500 Arcola Rd. 3C43 (C) Mesto: Collegeville (D) štát: PA (E) Krajina: USA (F) Poštový kód: 19426 (v) Forma čitateľná pre počítač (A) Typ média: disketa (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (CT Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Pate'ntln Release č. 1.0,
Verzia č. 1.30 (vi) Údaje o súčasnej prihláške:
(A) Číslo prihlášky: PCT (B) Dátum podania:
(C) Klasifikácia:
(vii) Údaje o predchádzajúcej prihláške:
(A) Číslo prihlášky: Fr 95-04234 (B) Dátum podania: 31.3.1995 (viii) Informácie o právnom zástupcovi /agentovi/ (A) Meno: Savitzki, Martin F.
(B) Registračné číslo: 26,699 (C) Číslo referencie / označenie: ST95022-US (ix) Telekomunikačné údaje:
(A) Telefón: (610)454-3816 (B) Telefax: (610)454-3808 (2) Údaje o sekvencii id. č. 1:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 14 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (C) Vláknitosť:
(D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (v) Typ fragmentu: vnútorný (ix) Opis sekvencie: sekvencie id. č. 1:
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Gly Gly Pro
Priemyselná využiteľnosť
Vírusové vektory podľa predkladaného priemyselne využiteľné pri výrobe liekov hyperproliferatívnvch ochorení, najmä restenózy vynálezu sú na liečenie
PATENTOVÉ
Claims (17)
1. Poškodený rekombinantný vírus obsahujúci prinajmenšom jeden vložený gén kódujúci celý alebo časť GAX proteínu alebo variantu tohto proteínu.
2. Vírus podľa nároku 1, v ktorého genórae chýbajú oblasti, ktoré sú nevyhnutné na jeho replikáciu v infikovanej bunke.
3. Vírus podľa nároku 1 alebo 2, ktorý je adenovírus, výhodne typu Ad 5 alebo Ad 2.
4. Vírus podľa nároku 1 alebo 2, ktorý je adenovírus zvieracieho, výhodne psieho pôvodu.
5. Vírus podía jedného z nárokov 1 alebo 2, v ktorom vložený gén kóduje celý alebo časť krysieho GAX proteínu alebo variantu tohto proteínu.
6. Vírus podľa nároku 5, v ktorom vložený gén kóduje krysí GAX proteín alebo jeho ľudský homológ.
7. Vírus podľa jedného z nárokov 1 alebo 2, v ktorom vložený gén je cDNA.
8. Vírus podľa jedného z nárokov 1 až 2, v ktorom vložený gén je gDNA.
9. Vírus podľa jedného z nárokov 1 až 2, v ktorom vložený gén obsahuje sekvencie, ktoré mu umožňujú byt exprimovaným v infikovanej bunke.
10. Vírus podľa jedného z nárokov 1 až 2, v ktorom vložený gén obsahuje signálnu sekvenciu, ktorá smeruje syntetizovaný polypeptid do sekrečných ciest cieľovej bunky .
11. Adenovírus podľa nároku 3 alebo 4, ktorý obsahuje deléciu celej alebo časti oblasti E1.
12. Adenovírus podľa nároku 11, ktorý navyše obsahuje deléciu celej alebo časti oblasti E4.
13. Vírus podľa nároku 1 alebo 2, ktorý je adenosúvi s iaci vírus (adeno-associated virus-AAV).
14. Vírus podľa nároku 1 alebo 2, ktorý je retrovírus.
15. Použitie vírusu podľa jedného z nárokov 1 až 2 na prípravu farmaceutického prostriedku, ktorý je určený na liečenie alebo prevenciu patológií, ktoré súvisia s hyperproliferatívnymi ochoreniami.
16. Použitie podľa nároku 15, na prípravu farmaceutického prostriedku, ktorý je určený na liečenie restenózy.
17. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje jeden alebo viac poškodených
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9504234A FR2732357B1 (fr) | 1995-03-31 | 1995-03-31 | Vecteurs viraux et utilisation pour le traitement des desordres hyperproliferatifs, notamment de la restenose |
| PCT/US1996/004493 WO1996030385A1 (en) | 1995-03-31 | 1996-03-28 | Viral vectors and their use for treating hyperproliferative disorders, in particular restenosis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK132797A3 true SK132797A3 (en) | 1998-07-08 |
Family
ID=9477928
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1327-97A SK132797A3 (en) | 1995-03-31 | 1996-03-28 | Viral vectors and their use for treating hyperproliferative disorders, in particular restenosis |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5851521A (sk) |
| EP (1) | EP0817791A4 (sk) |
| JP (1) | JPH11503314A (sk) |
| KR (1) | KR19980703454A (sk) |
| CN (1) | CN1190402A (sk) |
| AP (1) | AP1011A (sk) |
| AU (1) | AU701345B2 (sk) |
| BR (1) | BR9608449A (sk) |
| CA (1) | CA2216878A1 (sk) |
| CZ (1) | CZ308897A3 (sk) |
| FR (1) | FR2732357B1 (sk) |
| HU (1) | HUP9801767A3 (sk) |
| OA (1) | OA10516A (sk) |
| SI (1) | SI9620059A (sk) |
| SK (1) | SK132797A3 (sk) |
| WO (1) | WO1996030385A1 (sk) |
Families Citing this family (53)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5856121A (en) * | 1994-02-24 | 1999-01-05 | Case Western Reserve University | Growth arrest homebox gene |
| US7423125B2 (en) * | 1995-08-01 | 2008-09-09 | Vegenics Limited | Antibodies to VEGF-C |
| FR2740344B1 (fr) * | 1995-10-31 | 1997-11-21 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Application de la proteine gax au traitement de cancers |
| FR2754822B1 (fr) * | 1996-10-18 | 1998-11-27 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Polypeptides comprenant des domaines de la proteine gax, impliques dans la repression de transcription et/ou interagissant avec d'autres proteines, acides nucleiques correspondants et leurs utilisations |
| US6335010B1 (en) * | 1996-11-08 | 2002-01-01 | University Of California At San Diego | Gene therapy in coronary angioplasty and bypass |
| WO2000041732A1 (en) | 1999-01-19 | 2000-07-20 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Hydrogel compositions for controlled delivery of virus vectors and methods of use thereof |
| US6730313B2 (en) | 2000-01-25 | 2004-05-04 | Edwards Lifesciences Corporation | Delivery systems for periadventitial delivery for treatment of restenosis and anastomotic intimal hyperplasia |
| WO2001062942A2 (en) | 2000-02-25 | 2001-08-30 | Ludwig Institute For Cancer Research | MATERIALS AND METHODS INVOLVING HYBRID VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR DNAs AND PROTEINS AND SCREENING METHODS FOR MODULATORS |
| US20030100889A1 (en) * | 2001-07-05 | 2003-05-29 | Nicolas Duverger | Method of administration of a gene of interest to a vascular tissue |
| US20030180936A1 (en) * | 2002-03-15 | 2003-09-25 | Memarzadeh Bahram Eric | Method for the purification, production and formulation of oncolytic adenoviruses |
| WO2007068784A1 (en) | 2005-12-14 | 2007-06-21 | Licentia Ltd | Novel neurotrophic factor protein and uses thereof |
| US20080215137A1 (en) * | 2003-04-30 | 2008-09-04 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Therapeutic driving layer for a medical device |
| US20040220656A1 (en) * | 2003-04-30 | 2004-11-04 | Epstein Samuel J. | Coated medical devices and methods of making the same |
| JP2007505603A (ja) * | 2003-09-12 | 2007-03-15 | ヴァーテックス ファーマシューティカルズ、 インコーポレイテッド | プロテアーゼ活性および肝障害のための動物モデル |
| ATE507240T1 (de) | 2004-03-05 | 2011-05-15 | Vegenics Pty Ltd | Materialien und verfahren für wachstumsfaktorbindende konstrukte |
| US7582442B2 (en) * | 2004-03-16 | 2009-09-01 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and compositions for using aleveolar macrophage phospholipase A2 |
| US7319015B2 (en) * | 2004-03-16 | 2008-01-15 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and compositions for using alveolar macrophage phospholipase A2 |
| GB0416487D0 (en) | 2004-07-23 | 2004-08-25 | Isis Innovation | Modified virus |
| WO2006014798A2 (en) * | 2004-07-27 | 2006-02-09 | Mount Sinai School Of Medicine | Methods and compositions for using sax2 |
| FI20050753A7 (fi) | 2004-09-03 | 2006-03-04 | Licentia Oy | Uudet peptidit |
| US7531523B2 (en) * | 2005-02-17 | 2009-05-12 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Sodium channel protein type III alpha-subunit splice variant |
| KR100747646B1 (ko) | 2005-02-25 | 2007-08-08 | 연세대학교 산학협력단 | 데코린 유전자를 포함하는 유전자 전달 시스템 및 이를 포함하는 약제학적 항종양 조성물 |
| WO2007022287A2 (en) | 2005-08-15 | 2007-02-22 | Vegenics Limited | Modified vegf and pdgf with improved angiogenic properties |
| US20080200408A1 (en) * | 2005-09-30 | 2008-08-21 | Mccormack Kenneth | Deletion mutants of tetrodotoxin-resistant sodium channel alpha subunit |
| US7972813B2 (en) * | 2005-09-30 | 2011-07-05 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Tetrodotoxin-resistant sodium channel alpha subunit |
| US20090214496A1 (en) * | 2006-01-30 | 2009-08-27 | Licentia Ltd. | Bmx/etk tyrosine kinase gene therapy materials and methods |
| EP2548579B1 (en) | 2006-05-17 | 2015-09-02 | The Ludwig Institute for Cancer Research | Targeting VEGF-B regulation of fatty acid transporters to modulate human diseases |
| FI20070808A0 (fi) | 2007-10-25 | 2007-10-25 | Mart Saarma | GDNF:n silmukointivariantit ja niiden käytöt |
| JP5309159B2 (ja) | 2008-01-09 | 2013-10-09 | コングク ユニバーシティ インダストリアル コーオペレーション コーポレーション | バキュロウイルスを利用したワクチン |
| US20090196854A1 (en) * | 2008-02-04 | 2009-08-06 | Kytos Biosystems S.A. | Methods and compositions for use of crl 5803 cells for expression of biotherapeutics and encapsulated cell-based delivery |
| FI20080326A0 (fi) | 2008-04-30 | 2008-04-30 | Licentia Oy | Neurotroofinen tekijä MANF ja sen käytöt |
| US8052970B2 (en) * | 2008-06-30 | 2011-11-08 | The Regents Of The University Of Michigan | Lysosomal phospholipase A2 (LPLA2) activity as a diagnostic and therapeutic target for identifying and treating systemic lupus erythematosis |
| KR101230913B1 (ko) | 2009-11-06 | 2013-02-07 | 중앙대학교 산학협력단 | 나노입자-기반된 유전자 운반체 |
| KR101232123B1 (ko) | 2010-10-08 | 2013-02-12 | 연세대학교 산학협력단 | 재조합된 유전자발현 조절서열을 가지는 종양 특이적 발현이 개선된 유전자 전달체 |
| AU2012255143A1 (en) | 2011-05-19 | 2014-02-20 | The Regents Of The University Of Michigan | Integrin alpha-2 binding agents and use thereof to inhibit cancer cell proliferation |
| KR101427200B1 (ko) | 2011-11-24 | 2014-08-07 | 주식회사 바이로메드 | 아데노바이러스 생산 신규 세포주 및 그의 용도 |
| WO2013079687A1 (en) | 2011-11-30 | 2013-06-06 | The Chancellor, Masters And Scholars Of The University Of Oxford | Inkt cell modulators and methods of using the same |
| GB201120860D0 (en) | 2011-12-05 | 2012-01-18 | Cambridge Entpr Ltd | Cancer immunotherapy |
| WO2013184209A1 (en) | 2012-06-04 | 2013-12-12 | Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. | Mif for use in methods of treating subjects with a neurodegenerative disorder |
| PT3421602T (pt) | 2012-09-06 | 2021-05-31 | Univ Chicago | Polinucleótidos antisenso para induzir o salto de exão e métodos de tratamentos de distrofias |
| KR101429696B1 (ko) | 2012-11-21 | 2014-08-13 | 국립암센터 | 안전성 및 항암활성이 증가된 재조합 아데노바이러스 및 이의 용도 |
| US9745558B2 (en) | 2013-02-18 | 2017-08-29 | Vegenics Pty Limited | VEGFR-3 ligand binding molecules and uses thereof |
| WO2014191630A2 (en) | 2013-05-28 | 2014-12-04 | Helsingin Yliopisto | Non-human animal model encoding a non-functional manf gene |
| HUE052604T2 (hu) | 2015-04-08 | 2021-05-28 | Univ Chicago | Készítmények és eljárások 2C típusú végtag-öv izomdisztrófia javítására exon-átugrás alkalmazásával |
| CN108289920A (zh) | 2015-10-12 | 2018-07-17 | 汉阳大学校产学协力团 | 用于基因转移和基因治疗的腺病毒复合物 |
| JP7187448B2 (ja) | 2016-09-20 | 2022-12-12 | ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲーエムベーハー | 新しいプロモーター |
| EA201990718A1 (ru) | 2016-09-20 | 2019-10-31 | Векторы аденовируса собачьих | |
| CA3036291A1 (en) | 2016-09-20 | 2018-03-29 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | New ehv insertion site orf70 |
| BR112019005415A2 (pt) | 2016-09-20 | 2019-10-22 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | nova vacina contra influenza suína |
| JP7558808B2 (ja) | 2017-12-13 | 2024-10-01 | ジーンメディスン・カンパニー・リミテッド | 組換えアデノウイルスおよびこれを含む幹細胞 |
| US12258395B2 (en) | 2018-06-11 | 2025-03-25 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Materials and methods for treating stress-related disorders and cancer |
| WO2024228167A1 (en) | 2023-05-03 | 2024-11-07 | Iox Therapeutics Inc. | Inkt cell modulator liposomal compositions and methods of use |
| WO2025113643A1 (en) | 2023-12-01 | 2025-06-05 | Gilead Sciences Inc. | Anti-fap-light fusion protein and use thereof |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8424757D0 (en) * | 1984-10-01 | 1984-11-07 | Pasteur Institut | Retroviral vector |
| FR2573436B1 (fr) * | 1984-11-20 | 1989-02-17 | Pasteur Institut | Adn recombinant comportant une sequence nucleotidique codant pour un polypeptide determine sous le controle d'un promoteur d'adenovirus, vecteurs contenant cet adn recombinant, cellules eucaryotes transformees par cet adn recombinant, produits d'excretion de ces cellules transformees et leurs applications, notamment a la constitution de vaccins |
| US4797368A (en) * | 1985-03-15 | 1989-01-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector |
| US5139941A (en) * | 1985-10-31 | 1992-08-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | AAV transduction vectors |
| US4861719A (en) * | 1986-04-25 | 1989-08-29 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | DNA constructs for retrovirus packaging cell lines |
| EP0432216A1 (en) * | 1988-09-01 | 1991-06-19 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Recombinant retroviruses with amphotropic and ecotropic host ranges |
| US5585362A (en) * | 1989-08-22 | 1996-12-17 | The Regents Of The University Of Michigan | Adenovirus vectors for gene therapy |
| CA2039921A1 (en) * | 1990-04-16 | 1991-10-17 | Xandra O. Breakefield | Transfer and expression of gene sequences into central nervous system cells using herpes simplex virus mutants with deletions in genes for viral replication |
| WO1991018088A1 (en) * | 1990-05-23 | 1991-11-28 | The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce | Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors |
| US5173414A (en) * | 1990-10-30 | 1992-12-22 | Applied Immune Sciences, Inc. | Production of recombinant adeno-associated virus vectors |
| US5252479A (en) * | 1991-11-08 | 1993-10-12 | Research Corporation Technologies, Inc. | Safe vector for gene therapy |
| EP1321526A3 (en) * | 1992-11-18 | 2003-07-02 | Arch Development Corporation | Adenovirus-mediated gene transfer to cardiac and vascular smooth muscle |
| CA2592997A1 (en) * | 1992-12-03 | 1994-06-09 | Genzyme Corporation | Pseudo-adenovirus vectors |
| FR2705361B1 (fr) * | 1993-05-18 | 1995-08-04 | Centre Nat Rech Scient | Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique. |
| FR2705686B1 (fr) * | 1993-05-28 | 1995-08-18 | Transgene Sa | Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes. |
| ES2310924T3 (es) * | 1993-07-13 | 2009-01-16 | Centelion | Vectores adenovirales defectivos y utilizacion en terapia genica. |
| US5856121A (en) * | 1994-02-24 | 1999-01-05 | Case Western Reserve University | Growth arrest homebox gene |
-
1995
- 1995-03-31 FR FR9504234A patent/FR2732357B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-03-28 SI SI9620059A patent/SI9620059A/sl not_active IP Right Cessation
- 1996-03-28 CN CN96193929A patent/CN1190402A/zh active Pending
- 1996-03-28 WO PCT/US1996/004493 patent/WO1996030385A1/en not_active Ceased
- 1996-03-28 EP EP96912530A patent/EP0817791A4/en not_active Withdrawn
- 1996-03-28 AU AU55315/96A patent/AU701345B2/en not_active Ceased
- 1996-03-28 AP APAP/P/1997/001117A patent/AP1011A/en active
- 1996-03-28 JP JP8529747A patent/JPH11503314A/ja not_active Ceased
- 1996-03-28 CZ CZ973088A patent/CZ308897A3/cs unknown
- 1996-03-28 CA CA002216878A patent/CA2216878A1/en not_active Abandoned
- 1996-03-28 BR BR9608449-9A patent/BR9608449A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-03-28 SK SK1327-97A patent/SK132797A3/sk unknown
- 1996-03-28 KR KR1019970706858A patent/KR19980703454A/ko not_active Ceased
- 1996-03-28 HU HU9801767A patent/HUP9801767A3/hu unknown
- 1996-09-30 US US08/723,726 patent/US5851521A/en not_active Ceased
-
1997
- 1997-09-29 OA OA70089A patent/OA10516A/en unknown
-
2000
- 2000-12-21 US US09/740,876 patent/USRE37933E1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP9801767A2 (hu) | 1998-10-28 |
| USRE37933E1 (en) | 2002-12-10 |
| AU5531596A (en) | 1996-10-16 |
| OA10516A (en) | 2002-04-22 |
| HUP9801767A3 (en) | 1999-04-28 |
| AP9701117A0 (en) | 1996-03-28 |
| WO1996030385A1 (en) | 1996-10-03 |
| MX9707549A (es) | 1998-07-31 |
| AU701345B2 (en) | 1999-01-28 |
| CZ308897A3 (cs) | 1998-03-18 |
| KR19980703454A (ko) | 1998-11-05 |
| EP0817791A4 (en) | 1998-07-15 |
| FR2732357A1 (fr) | 1996-10-04 |
| SI9620059A (sl) | 1998-06-30 |
| AP1011A (en) | 2001-09-22 |
| EP0817791A1 (en) | 1998-01-14 |
| BR9608449A (pt) | 1999-11-30 |
| JPH11503314A (ja) | 1999-03-26 |
| FR2732357B1 (fr) | 1997-04-30 |
| US5851521A (en) | 1998-12-22 |
| CN1190402A (zh) | 1998-08-12 |
| CA2216878A1 (en) | 1996-10-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK132797A3 (en) | Viral vectors and their use for treating hyperproliferative disorders, in particular restenosis | |
| Smith | Viral vectors in gene therapy | |
| AU738651B2 (en) | Promoter for smooth muscle cell expression | |
| JPH11511980A (ja) | Ｍｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性のアンタゴニスト及び癌治療におけるその使用 | |
| EP0752002A1 (en) | Inhibition of arterial smooth muscle cell proliferation | |
| EP0938553B1 (en) | Dna encoding dp-75 and a process for its use | |
| CN100357433C (zh) | 可用于基因治疗和治疗性筛选的eNOS突变 | |
| US7329741B2 (en) | Polynucleotides that hybridize to DP-75 and their use | |
| KR100336551B1 (ko) | 망막아종 단백질의 조직 특이적 발현 | |
| JPH11514881A (ja) | Ｇａｘタンパク質の癌治療への応用 | |
| US11952599B2 (en) | Single adeno-associated virus (AAV)-sized nucleotide for use in CRISPR interference or activation | |
| WO1996015245A1 (en) | A process of inhibiting non-neoplastic pathological cell proliferation | |
| SK51199A3 (en) | Polypeptides comprising gax protein domains, involved in repressing transcription and/or interacting with other proteins, corresponding nucleic acids and their use | |
| MXPA04011944A (es) | Secuencias de control del gen corin humano. | |
| KR19990022193A (ko) | 델타 피62, 이의 변이체, 핵산 서열 및 용도 | |
| MXPA97007549A (en) | Viral vectors and their use to treat disordershiperproliferativos, in particular resteno | |
| US7169764B1 (en) | Promoter for smooth muscle cell expression | |
| US7541343B2 (en) | Inhibiting cellular proliferation by expressing yin yang-1 | |
| AU2002308413B2 (en) | Yin yang 1 | |
| WO1996029423A1 (en) | Compositions and methods for inducing infection by retroviral vectors outside of their host range | |
| HK1018066A (en) | Viral vectors and their use for treating hyperproliferative disorders, in particular restenosis | |
| AU2002308413A1 (en) | Yin yang 1 |