SK12312003A3 - Použitie N-fenyl-2-pyridínamínových derivátov proti ochoreniam s účasťou žírnych buniek - Google Patents

Description

Použitie N-fenyl-2-pyridínamínových derivátov proti ochoreniam s účasťou žírnych buniek

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka nového použitia N-fenyl-2-pyridínamínových derivátov všeobecného vzorca I, v ktorom majú symboly a substituenty ďalej uvedené významy, vo voľnej forme alebo vo forme farmaceutický prijateľných solí na prípravu farmaceutickej kompozície na liečenie alergickej rinitídy, alergickej dermatitídy, liekovej alergie alebo potravinovej alergie, angioedému, žihlavky, syndrómu náhleho úmrtia dieťaťa, bronchopulmonálnej aspergilózy, viacnásobnej sklerózy alebo mastocytózy; a spôsobu liečenia teplokrvných živočíchov, výhodne ľudí, pri ktorom sa teplokrvnému živočíchovi, ktorí trpí na jedno z uvedených ochorení podáva terapeuticky účinná dávka zlúčeniny všeobecného vzorca I.

Doterajší stav techniky

Zlúčeniny podlá vynálezu sú genericky a špecificky opísané v patentových prihláškach EP 0 564 409 Al a WO 99/03854.

V dokumente EP 0 564 409 Al sa zlúčeniny podľa vynálezu opisujú ako použiteľné na liečenie rakoviny, trombózy, psoriázy, fibrózy, dermatosklerózy a artériosklerózy. V súlade s predloženým vynálezom sa teraz zistilo, že zlúčeniny podľa vynálezu prekvapujúco vykazujú priaznivé účinky na alergickú rinitídu, alergickú dermatitídu, liekovú alergiu alebo potravinovú alergiu, angioedém, žihlavku, syndróm náhleho úmrtia dieťaťa, bronchopulmonálnu aspergilózu, viacnásobnú sklerózu a ďalej mastocytózu, najmä psie mastocytárne novotvary.

Podstata vynálezu

Predložený vynález sa týka použitia N-fenyl-2-pyridínamínových derivátov všeobecného vzorca I

v ktorom

R¹ znamená 4-pyrazinylovú skupinu; l-metyl-llí-pyrolylovú skupinu; amino- alebo amino-nižší alkyl-substituovanú fenylovú skupinu, kde je aminoskupina v každom prípade valná, alkylovaná alebo acylovaná; ltf-indolylovú skupinu alebo 1/í-imidazolylovú skupinu naviazanú na uhlíkovom atóme päťčlenného kruhu; alebo nesubstituovanú alebo nižšou alkylovou skupinou substituovanú pyridylovú skupinu naviazanú na kruhovom atóme uhlíka a nesubstituovanú alebo substituovanú na atóme dusíka atómom kyslíka;

R² a R³ znamenajú každý nezávisle jeden od druhého atóm vodíka alebo nižšiu alkylovú skupinu;

jeden alebo dva zo substituentov R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ a R⁸ znamenajú každý nitroskupinu,. fiuórsubstituovanú nižšiu alkoxyskupinu alebo skupinu všeobecného vzorca II

-N (R⁹)-C (=X) - (Y) _n-R¹⁰ (II), kde

R⁹ znamená atóm vodíka alebo nižšiu alkylovú skupinu,

X znamená oxoskupinu, tioskupinu, iminoskupinu, N-nižší alkyl-iminoskupinu, hydroximinoskupinu alebo O-nižší alkyl-hydroximinoskupinu,

Y znamená atóm kyslíka alebo skupinu NH, n znamená Ο alebo 1, a

R¹⁰ znamená alifatickú skupinu obsahujúcu aspoň 5 uhlíkových atómov alebo aromatickú, aromatickoalifatickú, cykloalifatickú, cykloalifatickoalifatickú, heterocyklickú alebo heterocyklickoalifatickú skupinu, a zostávajúce substituenty R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ a R⁸ znamenajú každý nezávisle od druhých atóm vodíka, nižšiu alkylovú skupinu, ktorá je nesubstituované alebo substituovaná voľnou alebo alkylovanou aminoskupinou, piperazinylovou skupinou, piperidinylovou skupinou, pyrolidinylovou skupinou alebo morfolinylovou skupinou, alebo nižšiu alkanoylovú skupinu, trifluórmetylovú skupinu, voľnú, éterifikovanú alebo esterifikovanú hydroxyskupinu, volnú, alkylovanú alebo acylovanú aminoskupinu alebo volnú alebo esterifikovanú karboxyskupinu, alebo soli takej zlúčeniny, ktorá obsahuje aspoň jednu skupinu vytvárajúcu sol, na prípravu liečiva na liečenie alergickej rinitídy, alergickej dermatitídy, liekovej alergie alebo potravinovej alergie, angioedému, žihlavky, syndrómu náhleho úmrtia dieťaťa, bronchopulmonálnej aspergilózy, mastocytózy alebo viacnásobnej sklerózy.

1-Metyl-lH-pyrolylovou skupinou je výhodne 1-metyl-lH-pyrol-2-ylová skupina alebo l-metyl-lH-pyrol-3-ylová skupina.

Amino- alebo amino-nižší alkyl-substituovanou fenylcvou skupinou R¹, kde je aminoskupina v každom prípade voľná, alkylované alebo acylovaná, je fenylová skupina substituovaná v ľubovoľnej žiadanej polohe (orto, metá alebo para), pričom alkylovanou aminoskupinou je výhodne mono- alebo di-nižšia alkylaminoskupina, napríklad dimetylaminoskupina a nižšou alkylovou časťou amino-nižšej alkylovej skupiny je výhodne lineárna alkylová _iskupina obsahujúca 1 až 3 uhlíkové atómy, ako je najmä metylové alebo etylová skupina.

lŕí-Indolylovou skupinou naviazanou na uhlíkovom atóme päťčlenného kruhu je lŕf-indol-2-ylová skupina alebo lH-indol-3-ylová skupina.

Nesubstituovanou alebo nižšou alkylovou skupinou substituovanou pyrídylovou skupinou naviazanou na kruhovom atóme uhlíka je nižšou alkylovou skupinou substituovaná alebo výhodne nesubstituovaná 2-, 4- alebo výhodne 3-pyridylová skupina, napríklad 3-pyridylová skupina, 2-metyl-3-pyridylová skupina alebo 4-metyl-3-pyridylová skupina. Pyrídylovou skupinou substituovanou na atóme dusíka atómom kyslíka je skupina odvodená od pyridín-N-oxidu, to znamená N-oxidopyridylová skupina.

Fluórsubstituovanou nižšou alkoxyskupinou je nižšia alkoxyskupina nesúca aspoň jeden, avšak výhodne niekoľko substituentov v podobe atómu fluóru, najmä trifluórmetoxyskupina alebo 1,1,2,2-tetrafluóretoxyskupina.

Ak je X oxoskupina, tioskupina, iminoskupina, N-nižší alkyl-iminoskupina, hydroxyiminoskupina alebo O-nižší alkyl-hydroximinoskupina, je skupinou C=X, v skôr uvedenom poradí, skupina C=0, C=S, C=N-H, C=N-nižšia alkylová skupina, skupina C=N-OH, prípadne C=N-O-nižšia alkylová skupina. Symbol X výhodne znamená oxoskupinu.

Symbol n výhodne znamená 0, to znamená skupina Y nie je prítomná .

Skupina Y, ak je prítomná, znamená výhodne skupinu NH.

Termín nižší označuje v rámci predloženého vynálezu skupiny obsahujúce až 7 uhlíkových atómov, vrátane, výhodne až 4 uhlíkové atómy, vrátane.

Nižšou alkylovou skupinou R¹, R², R³ a R⁹ je výhodne metylová skupina alebo etylová skupina.

Alifatická skupina R¹⁰ obsahujúca aspoň 5 uhlíkových atómov výhodne neobsahuje viac ako 22 uhlíkových atómov, všeobecne neobsahuje viac ako 10 uhlíkových atómov, a je ňou taká substituovaná alebo výhodne nesubstituovaná alifatická uhľovodíková, to znamená taká substituovaná alebo výhodne nesubstituovaná alkinylová, alkenylová alebo výhodne alkylová skupina, ako alkylová skupina obsahujúca 5 až 7 uhlíkových atómov, napríklad n-pentylová skupina. Aromatická skupina R¹⁰ obsahuje až 20 uhlíkových atómov a je nesubstituovaná alebo substituovaná, napríklad v každom prípade nesubstituovaná alebo substituovaná naftylová skupina, ako je najmä 2-naftylová skupina, alebo výhodne fenylová skupina, pričom substituenty sa výhodne zvolia zo skupiny zahŕňajúcej kyánoskupinu, nesubsticuované alebo hydroxy-, aminoalebo 4-metylpiperazinyl substituované nižšie alkylové skupiny, ako je najmä metylová skupina, trifluórmetylovú skupinu, voľnú, éterif ikovanú alebo esterif ikovanú hydroxyskupi.nu, voľnú, alkylovanú alebo acylovanú aminoskupinu a voľnú alebo esterifikovanú karboxyskupinu. V aromatickoalifatickéj skupine R¹⁰ je aromatická časť taká, ako je definované skôr, a alifatickou časťou je výhodne nižšia alkylová skupina, ako je najmä alkylová skupina obsahujúca 1 až 2 uhlíkové atómy, ktorá je substituovaná alebo výhodne nesubstituovaná, napríklad benzylová skupina. Cykloalifatická skupina R¹⁰ obsahuje výhodne až 30, výhodnejšie až 20 a najvýhodnejšie až 10 uhlíkových atómov, je mono- alebo polycyklická a je substituovaná alebo výhodne nesubstituovaná, napríklad ako je cykloalkylová skupina, najmä ako je päť- alebo šesťčlenná cykloalkylová skupina, ako je výhodne cyklohexylová skupina. V cykloalifatickoalifatickej skupine R¹⁰ je cykloalifatická časť taká, ako je definované skôr, a alifatickou časťou je výhodne nižšia alkylová skupina, ako je najmä alkylová skupina obsahujúca 1 až 2 uhlíkové atómy, ktorá je substituovaná alebo výhodne nesubstituovaná. Heterocyklická skupina R¹⁰ obsahuje výhodne až 20 uhlíkových atómov a je ňou výhodne nasýtená alebo nenasýtená monocyklická skupina obsahujúca 5 alebo 6 kruhových členov a 1 až 3 heteroatómy, ktoré sa výhodne zvolia zo skupiny zahŕňajúcej atómy dusíka, kyslíka a síry, najmä napríklad tienylová skupina alebo 2-, 3- alebo 4-pyridylová skupina, alebo bialebo tricyklická skupina, v ktorej sú napríklad jedna alebo dve benzénové skupiny anelované (fúzované) na uvedený monocyklický zvyšok. V heterocyklickoalifatickej skupine R¹⁰ je heterocyklická časť taká, ako je definované skôr a alifatickou časťou je výhodne nižšia alkylová skupina, ako je najmä alkylová skupina obsahujúca 1 až’ 2 uhlíkové atómy, ktorá je substituovaná alebo výhodne nesubstituovaná.

Éterifikovanou hydroxyskupinou je výhodne nižšia alkoxyskupina. Esterifikovanou hydroxyskupinou je výhodne hydroxyskupina esterifikovaná organickou karboxylovou kyselinou, ako je nižšia alkánová kyselina, alebo minerálnou kyselinou, ako je halogenovodíková kyselina, napríklad nižšia alkanoyloxyskupina alebo najmä atóm halogénu, ako je jód, bróm alebo najmä fluór alebo chlór.

Alkylovanou aminoskupinou je napríklad nižšia alkylaminoskupina, ako je metylaminoskupina, alebo di-nižší alkyl-aminoskupina, ako je dimetylaminoskupina. Acylovanou aminoskupinou je napríklad nižšia alkanoylaminoskupina alebo benzoylaminoskupina.

Esterifikovanou karboxyskupinou je napríklad nižšia alkoxykarbonylová skupina, ako je metoxykarbonylová skupina.

Substituovaná fenylová skupina môže niesť až 5 substituentov, ako je atóm fluóru, avšak najmä v prípade relatívne veľkých substituentov je všeobecne substituovaná len 1 až 3 substituentami. Príklady substituovanej fenylovej skupiny, ktoré je možné špeciálne uviesť, sú 4-chlórfenylová skupina, pentafluórfenylová skupina, 2-karboxyfenylová skupina, 2-metoxyfenylová skupina,

4-fluórfenylová skupina, 4-kyanofenylová skupina a 4-metylfenylová skupina.

Skupinami vytvárajúcimi sol sú v zlúčenine všeobecného vzorca I skupiny alebo zvyšky so zásaditými alebo kyselinovými vlastnosťami. Zlúčeniny obsahujúce aspoň jednu zásaditú skupinu alebo aspoň jeden zásaditý zvyšok, napríklad voľnú aminoskupinu, pyrazinylový zvyšok alebo pyridylový zvyšok, môžu vytvárať adičné soli s kyselinou, napríklad s anorganickými kyselinami, ako sú kyselina chlorovodíková, kyselina sírová alebo kyselina fosforečná, alebo s vhodnými organickými karboxylovými alebo sulfónovými kyselinami, napríklad alifatickými mono- alebo dikarboxylovými kyselinami, ako sú kyselina trifluóroctová, kyselina octová, kyselina propiónová, kyselina glykolová, kyselina jantárová, kyselina maleinová, kyselina fumarová, kyselina hydroxymaleínová, kyselina jablčná, kyselina vínna, kyselina citrónová alebo kyselina šťaveľová, alebo aminokyselinami, ako je arginín alebo lyzín, aromatickými karboxylovými kyselinami, ako sú kyselina benzoová, kyselina 2-fenoxybenzoová, kyselina 2-aceroxybenzoová, kyselina salicylová, kyselina 4-aminosalicylová, aromatickoalifatickými karboxylovými kyselinami, ako je kyselina mandľová alebo kyselina škoricová, heteroaromatickými karboxylovými kyselinami, ako je kyselina nikotínová alebo kyselina izonikotínová, alifatickými sulfónovými kyselinami, ako je kyselina metán-, etán- alebo 2-hydroxyetánsulfónová, alebo aromazickými sulfónovými kyselinami, napríklad kyselinou benzén-, p-zoluénalebo naftalén-2-sulfónovou. Ak je prítomných niekolko zásaditých skupín, môžu sa vytvárať mono- alebo polykyselinové adičné soli .

Zlúčeniny všeobecného vzorca I obsahujúce kyselinové skupiny, napríklad voľnú karboxyskupinu v substituente R¹⁰, môžu vytvárať soli s kovmi alebo amóniové soli, ako sú soli s alkalickými kovmi alebo s kovmi alkalických zemín, napríklad sodné, draselné, horečna.té alebo vápenaté soli, alebo amóniové soli s amoniakom alebo s vhodnými organickými amínmi, ako sú terciárne monoamíny, napríklad trietylamín alebo tri-(2-hydroxyetyl)amín, alebo s heterocyklickými zásadami, napríklad N-etylpíperidínom alebo N, N'-dimetylpiperazínom.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I obsahujúce ako kyselinové, tak zásadité skupiny môžu vytvárať interné soli.

Na izoláciu alebo purifikáciu, a tiež tak v prípade zlúčenín, ktoré sa ďalej použijú ako medziprodukty, je tiež možné použiť farmaceutický neprijateľné soli. Na terapeutické potreby sa však používajú len farmaceutický prijateľné, netoxické soli, a preto sú tieto soli výhodné.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I je možné použiť na liečenie alebo na prípravu liečiv na liečenie teplokrvných živočíchov, výhodne ľudí.

Termín alergická rinitída, ako je tu použitý, znamená akúkoľvek alergickú reakciu nazálnej mukózy. Taká alergická reakcia sa môže vyskytovať napr. trvalo, napr. jarná konjunktivitída, alebo sezónne, napr. senná nádcha.

Termín alergická dermatitída, ako je tu použitý, znamená najmä atopickú dermatitídu, alergickú kontaktnú dermatitídu a ekzematóznu dermatitídu, avšak zahŕňa tiež napr. seborhoickú dermatitídu, Lichen planus, žihlavku a akné. Atopická dermatitída, ako je tu definovaná, je chronické zápalové kožné ochorenie pozorované u jedincov s dedičnou preddispozíciou k zníženému kožnému prahu proti svrbeniu. Vyznačuje sa predovšetkým extrémnym svrbením, vedúcim k škrabaniu a treniu, ktorých výsledkom sú zasa typické ekzematické lezie. Alergická kontaktná dermatitída, ako je tu definovaná, je forma dermatitídy, ktorá je spôsobená alergickou senzibiláciou proti rozličným látkam, ktoré vyvolávajú zápalové reakcie v koži tých, ktorí vykazujú získanú hypersenzitivitu proti alergénu, ktorá je výsledkom predošlej expozície danému alergénu.

Termín lieková alergia alebo potravinová alergia, ako je tu použitý, sa týka alergickej reakcie vyvolanej liečivom alebo požitými antigénmi, ako sú napríklad jahody, mlieko alebo vajcia .

Termín bronchopulmonálna aspergilóza sa týka infekcie plúc organizmom Aspergillus.

Termín mastocytóza, ako je tu použitý, sa týka systémovej mastocytózy, napríklad mastocytómu, a najmä psích novotvarov zo žírnych buniek.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I sú ďalej súhrnne označované ako zlúčeniny pódia vynálezu.

Žírne bunky hrajú u uvedených alergických porúch dôležitú úlohu ako primárne efektorové bunky. Antigén-špecifická IgE sprostredkovaná degranulácia žírnych buniek vedie k následnému uvoľneniu chemických mediátorov a mnohých cytokínov a k leukotriénovej syntéze. Ďalej sa žírne bunky zúčastňujú na patogenéze viacnásobnej sklerózy.

Novotvary zo žírnych buniek sa vyskytujú ako u ľudí, tak u zvierat. U psov sa novotvary zo žírnych buniek nazývajú mastocytómy a ochorenie je bežné, predstavuje 7% až 21% psích nádorov. Medzi ľudskou mastocytózou, ktorá je obvykle prechodná alebo nebolestivá, a psím novotvarom zo žírnych buniek, ktorý sa chová nepredvídateľne a je často agresívny a metastatický, sa musí robiť rozdiel. Napríklad ludské solitérne mastocytómy v podstate nikdy nemetastázuj ú; oproti tomu sa 50% psích mastocytómov chová malígnym spôsobom, ako je stanovené Hottendorfom & Nielsenom (1969) po pozretí 46 publikovaných správ o nádoroch u 938 psov.

Rakovina je u populácie domácich zvierat spontánnym ochorením. Majitelia domácich zvierat motivovaní predĺžením kvality života ich zvierat často vyhľadávajú špecializovanú starostlivosť a terapiu veterinárnych onkológov v súkromných referenčných veterinárnych nemocniciach a veterinárnych fakultných nemocníc v celej krajine. Terapeutické spôsoby sú u veterinárnych pacientov s rakovinou podobné ako u ludí a zahŕňajú chirurgické ošetrenie, chemoterapiu, radiačnú terapiu a bioterapiu. Zistilo sa, že v Spojených štátoch je 42 miliónov psov a asi 20 miliónov mačiek. Pri použití hrubých odhadov incidencie rakoviny, objaví sa tu asi 4 milióny novo diagnostikovaných karcinómov ročne u psov a podobné množstvo u mačiek.

Kožné nádory zo žírnych buniek sú u psov bežným problémom. Väčšina nádorov zo žírnych buniek je benígna a vylieči sa jednoduchou resekciou; ak je však rekurentná alebo metastázuje do vzdialených. miest, sú terapeutické možnosti obmedzené. Terapeutické možnosti u rekurentných lézií môžu zahŕňať externú radiačnú terapiu lúčmi. U vzdialených metastáz alebo diseminovaného ochorenia vykazuje určité priaznivé účinky použitie chemoterapeutických protokolov zahŕňajúcich Lomustine® a vinblastín. K miestam metastáz nádorov zo žírnych buniek patrí koža, regionálne lymfatické uzliny, slezina, pečeň a kostná dreň.

Postreh/ že u radu línií žírnych buniek sa zistili určité mutácie vedúce k podstatnej aktivácii KIT, naznačuje účasť KIT receptorov v patogenéze mastocytózy. Napríklad bodová mutácia u ľudského c-KIT, spôsobujúca substitúciu Val za Asp816 v fosfotransferázovej doméne a receptorovú autoaktiváciu, sa vyskytuje u dlhodobej línie ľudskej mastocytárnej leukémie (HMC-1) a u príslušného kodónu u dvoch mastocytárnych línií hlodavcov. Ďalej sa táto aktivujúca mutácia zistila in situ u niektorých prípadov ľudskej mastocytózy. Dve ďalšie aktivujúce mutácie sa našli v intracelulárnom juxtamembránovom regióne KIT, to znamená Val560Gly substitúcie u línie ľudských mastocytov HMC-1, a delécie siedmich aminokyselín (Thr573-His579) u mastocytárnej línie hlodavcov nazývanej FMA3.

Zavedenými testovacími' modelmi a najmä tými testovacími modelmi tu opísanými je možné preukázať, že zlúčeniny podlá vynálezu alebo v každom prípade ich farmaceutický prijateľná sol, vedú k účinnej prevencii alebo, výhodne, liečeniu aspoň jedného z ochorení tu uvedených. Odborník v príslušnom odbore je plne schopný zvoliť relevantný testovací model na overenie tu skôr a ďalej uvedených terapeutických indikácií a priaznivých účinkov. Farmakologickú aktivitu je možné napríklad preukázať v rám11 ci klinickej štúdie alebo testovacej procedúry, ako je v podstate opísané ďalej.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Časť A

Príklad 1

Tento príklad ukazuje in vitro účinky zlúčenín podlá vynálezu na SCF-dependentný vývoj rastu kultivovaných ľudských žírnych buniek pochádzajúcich z CD34⁺ pupočných krvných buniek za použitia kultivačného systému opísaného v Kinoshita T., Sawai N. a kol., Blood 1999, 94, 496 až 508. Viac ako 90% izolovaných buniek je podľa prietokovej cytometrickej analýzy CD34-pozitívnych.

Činidlá a protilátky

Zlúčeniny podľa vynálezu sa rozpustia v PBS v koncentrácii 10² M a uchovávajú pri -80°C. All-trans retínová kyselina (Sigma) sa rozpustí v etanole v koncentrácii 10’² M a uchováva sa v ampulkách chránených pred svetlom pri -80°C. Purifikovanú mAb pre tryptázu (MAB1222) je možné získať od Chemicon International Inc., CA. Pre prietokovú cytometrickú analýzu sa získajú mAb pre CD34 (8G12, FITC) a CDllb (leul5, PE) od Becton Dickinson Immunocytometry Systems (Mountain View, CA) a mAb pre CD41 (SZ22, FITC) od Immunotech S.A. (Marseilles, Francúzsko). mAb pre glykoforín A (GPA, JC159, FITC) je možné získať od Dáko (Glostrup, Dánsko). Pre Western blotting a imunoprecipitáciu je možné mAb pre c-kit (NU-c-kit) a pre fosfotyrozín (4G10) získať od Nichirei, respektíve Upstate Biotechnology, Inc. (Lake Placid, NY).

Suspenzná kultivácia

Séra zbavené kvapalnej kultivácie sa prevedú na 24-jamkových kultivačných doskách (#3047; Becton Dickinson). Dvadsať tisíc CD34 ⁺ sa kultivuje v každej z jamiek obsahujúcich 2 ml a-média obohateného 1% BSA, 300 pg/ml celkom železom nasýteného ludského transferínu (asi s 98% čistotou, Sigma) , 16 μς/πιΐ sójového lecitínu (Sigma), 9,6 pg/ml cholesterolu (Nakalai Chemicals Ltd., Japonsko) a. 20 ng/ml SCF, 10 ng/ml GM-CSF, 2 U/ml EPO, 10 ng/ml TPO, rôznej koncentrácie zlúčeniny podlá vynálezu, samotnej alebo v kombinácii. S cieľom zhodnotiť účinky zlúčeniny podlá vynálezu na SCF-dependentný rozvoj žírnych buniek sa ako cieľové bunky použijú bunky desaťtýždňovej kultúry kultivovanej s 20 ng/ml SCF z CD34⁺ pupočných krvných buniek. Päť až desať x 10⁴ 10 týždňov kultivovaných buniek sa inkubuje počas 2 týždňov na 24-jamkových kultivačných doskách obsahujúcich 20 ng/ml SCF s alebo bez rôznych koncentrácií zlúčeniny podľa vynálezu. Dosky sa inkubujú pri 37 °C vo zvlhčenej atmosfére preplachovanej zmesou 5% CO₂, 5% O₂ a 90% N₂. Ak kultivácia pokračuje do 4 týždňov, nahradí sa polovica kultivačného média každé 2 týždne čerstvým médiom s obsahom faktora(ov). Počet životaschopných buniek sa stanovuje pomocou vylučovacieho testu za použitia tryptánovej modrej pomocou hemocytometra.

Kultivácia klonálnych buniek

Analýza kolónie žírnych buniek sa uskutoční v 35 mm Lux suspenzných kultivačných nádobách (#171099; Nunc, IL). Kultivácia pozostáva z desaťtýždňových kultivovaných buniek (4000 buniek/ml) kultivovaných s 10 ng/ml SCF, a-médiom, 0,9% metylcelulózy (Shinetsu Chemical, Japonsko) , 1% BSA, 300 μρ/πιΐ celkom železom nasýteného ludského transferínu, 16 μg/ml sójového lecitínu, 9,6 gg/ml cholesterolu a 100 ng/ml SCF s alebo bez 10⁸ zlúčeniny podľa vynálezu. Nádoby sa inkubujú pri 37°C vo zvlhčenej atmosfére preplachovanej zmesou 5% CO₂, 5% O₂ a 90% N₂. Po 4 týždňoch sa agregáty obsahujúce 30 alebo viac buniek zaznamenávajú ako kolónie žírnych buniek, a tie pozostávajúce z 10 až buniek ako zhluky žírnych buniek. Tridsať jednotlivých kolónií a zhlukov sa vyberie a zafarbí antitryptázovou mAb alebo myšou IgGl pomocou techniky alkalická fosfatáza-anti-alkalická fosfatáza (APAAP). Takmer všetky základné bunky sú pozitívne na tryptázu.

Cytochemické a imunologické farbenie

Kultivované bunky sa nanesú na sklenenú doštičku pomocou Cytospin II. Bežným spôsobom sa uskutoční cytochemická reakcia s peroxidázou (POX). Reakcia s mAb proti tryptáze sa deteguje pomocou metódy APAAP (Dáko APAAP Kit Systém, Dáko Corp., CA) , opisuje F. Ma, K. Koike a kol., Br. J. Haematol. 1998, 100, 427-35.

Imunoprecipitácia a Western blotting

Imunoprecipitácia a Western blotting sa uskutočnia spôsobom opísaným v T. Kamijo, K. Koike a kol., Leuk. Res. 1997, 21,

1097-106.

Prietoková cytometrická analýza

Na analýzu povrchových markerov na kultivovaných bunkách, sa 1 až 2 x 10⁵ buniek zhromaždí do plastických skúmaviek a kultivuje s príslušne zriedenou FITC- alebo ΡΕ-mAb, ako opisuje Kinoshita T., Sawai N. a kol., Blood 1999, 94, 496 až 508. Bunky sa dvakrát premyjú, potom sa analyzujú ich povrchové markery pomocou prietokového cytometra FACScan. Životaschopné bunky prechádzajú podlá ich charakteristík predného rozptylu svetla a bočných rozptylových charakteristík. Podiel pozitívnych buniek sa stanoví porovnaním s bunkami zafarbenými FITC- alebo PE-konjugovaným myším izotypovo párovaným Ig.

Detekcia bunkovej apoptózy

Analýza bunkovej apoptózy sa uskutočňuje pomocou prietokovej cytometrickej analýzy za použitia propidiumjodídu (PI, Sigma) v súlade s postupom opísaným v N. Sawai, K. Koike a kol., Stem Cells. 1999, 17, 45 až 53. S cieľom redukovať bunky podliehajúce apoptóze, nekróze alebo už mŕtvych, je možné použiť percolovú gradientovú centrifugáciu. Desať týždňov kultivované bunky sa nanesú na 27% Percoll (Sigma) v α-médiu a 54% Percol v PBS. Po centrifugácii sa bunky zoberú z rozhrania dvoch rôznych koncentrácií roztoku Percol, premyjú sa PBS a podrobia pôsobeniu 1 ml Ortho PermeaFix™ počas 40 minút pri izbovej teplote. Bunky sa potom inkubujú s DNázy jednoduchou RNázou (Sigma) počas 15 minút pri 37°C a farbia PI počas 15 minút. DNA obsah 2 x 10⁴ buniek sa monitoruje pomocou prietokového cytometra. Desať týždňov kultivované bunky (2 x 10⁸) vystavené SCF alebo SCF a zlúčenine podlá vynálezu sa lyžujú počas 10 minút na lade v 100 μΐ hypotonického lyzačného pufra [10 mM Trís (pH 7,5), 10 mM EDTA, pH 8,0, 0,5%

Triton X-100]. Po centrifugácii počas 10 minút pri 14000 g sa supernatant prenesie do novej skúmavky a podrobí pôsobeniu 0,2 mg/ml RNázy A (Sigma) a 0,2 mg/ml Proteinázy K (Sigma) . DNA sa precipituje pomocou 120 μΐ izopropanolu a 20 μΐ 5M NaCI cez noc pri -20°C. Po centrifugácii pri 14000 g sa pelety sušia, rozpustia v 20 μΐ Tris-EDTA a potom sa vzorky analyzujú pomocou gélovej elektroforézy v 2% agaróze a etídiumbromidovéno farbenia .

Analýza hladín histamínu, tryptázy a cytokínu

Koncentrácie histamínu v bunkových lyzátoch získaných ošetrením kultivovaných buniek 0,5% Nonidet P-40 a v supernatante sa stanovujú pomocou Histamíne Radioimmunoassay (RIA) Kit (Immunotech), ako opisuje Kinoshita T., Sawai N. a kol., Blood 1999, 94, 496 až 508.

Štatistická analýza

Všetky pokusy by sa mali uskutočniť aspoň trikrát. Na stano15 venie významného rozdielu medzi dvoma nezávislými skupinami je možné použiť nepárový t-test alebo Mann-Whitney-U test, pokial dáta nie sú normálne rozdelené.

Výsledky získané pre N-{5-[4-(4-metylpiperazínmetyľ)benzoylamido]-2-metylfenyl}-4-(3-pyridyl)-2-pyrimidínamínmonomesylát (STI571B). .

Pridanie STI571B v koncentrácii 10”^e M alebo vyššej ku kultúre s SCF takmer celkom inhibuje generáciu potomstva.

U SCF plus STI571B je počet životaschopných buniek nezmenený v deň 2 a potom klesá v závislosti od času. V deň 14 dosiahne celkový počet buniek zanedbateľnú úroveň. V súlade s výsledkami získanými u 10 týždňov kultivovaných žírnych buniek STI571B v koncentrácii 10^-6 M zjavne znižuje tvorbu buniek u CD34⁺ buniek za stimulácie SCF. Ďalej STI571B vyvoláva programovú smrť kultivovaných žírnych buniek kultivovaných za stimulácie SCF. Percento sub-diploidných jadier sa zvyšuje s kultivačnou periódou. Toto pozorovanie je možné potvrdiť pomocou rozvrstvenia DNA u buniek vystavených SCF plus STI571B pomocou gélovej elektroforézy. STI571B vykazuje svoje inhibičné účinky v skorej fáze vývoja žírnej bunky, a tiež tak rastu neskôr sa objavených žírnych buniek.

Získané výsledky ukazujú inhibíciu SCF-dependentného rastu ľudských žírnych buniek pomocou zlúčenín podľa vynálezu, napríklad STI571B. Preto ukazujú, že je možné zlúčeniny podľa vynálezu použiť na liečenie tu uvedených ochorení.

Časť B: Mastocytóza

Príklad 2: Metódy

Činidlá:

Novartis Pharma; Basel, Švajčiarsko poskytuje soľ I na pou16 žitie v rámci týchto experimentov. Pred zhotovia čerstvé 10 mM zásobné roztoky zlúčeniny v 1 ml fosfátom pufrovaného Gibco-BRL).

každým experimentom sa inhibítora rozpustením roztoku solanky (PBS;

Protilátky:

Polyklonálna králičia anti-KIT protilátka (c-kit Ab-1) sa použije v zriedení 1:500 (c-kit Ab-1; Oncogene, Cambridge, MA). Anti-fosfotyrozínová protilátka (PY20) sa použije v zriedení 1:1000 (PY20 Transduction Laboratories; Lexington, KY) . Peroxidázou konjugovaná kozia anti-myšia protilátka sa použije v zriedení 1:5000 a kozia anti-králičia protilátka v zriedení 1:10000 (Pierce; Rockford, IL) .

Bunkové línie:

BR a C2 línie psích buniek mastocytómu sa získajú od Dr. George Caughey (University of California at San Francisco, San Francisco, CA) . Obidve bunkové línie sa uchovávajú v DMEM obohatenom 2% bovinného teľacieho, 1 mM L-glutamínu, 12,5 mM HEPES (pH 7,5), 0,25 mg/ml histidínu, 1% Penicilín-Streptomycínu a 1% fungizonu. Bunky BR a C2 pochádzajú zo psích mastccytárnych nádorov a pôvodne sa zavedú do dlhodobej kultivácie po počiatočnej pasáži v imunodeficientných myšiach (DeVinney R. a kol., Am J Respir Celí Mol Biol 1990; 3(5) : 413 až 420; Lazarus S.C. a kol., Am J Physiol 1986; 251 (6 Pt 1): C935 až C944). Bunková línia BR vykazuje bodovú mutáciu (T1752C) vedúcu k substitúcii Leucínu za Prolín u aminokyseliny 575 (juxtamembránová doména). Bunková línia C2 vykazuje internú tandemovú duplikáciu (ITD) KIT juxtamembránovej oblasti. Translácia tejto ITD vedie k reduplikácii aminokyselinových zvyškov na 3' konci exonu 11 (London C.A. a kol., Exp Hematol 1999; 27(4): 689 až 697; Ma Y. a kol., J Invest Dermatol 1999; 112(2): 165 až 170).

Proliferačné analýzy:

Bunky sa nanesú na 96-jamkové dosky v hustote 40000 buniek/jamka v normálnom kultivačnom médiu a rôznych koncentráciách soli I. Proliferácia sa hodnotí v 48. až 72. hodine pomocou analýzy založenej na XTT (Roche Molecular Biochemicals; Indianapolis, IN)(Heinrich M.C. a kol., Blood 2000; 96(3): 925 až 32) .

Proteínové lyzáty:

Bunky BR a C2 sa dvakrát premyjú v PBS a potom nechajú v pokoji v Optimom (Gibco-BRL) pri 37°C asi 18 hodín. Bunky sa potom inkubujú 90 minút v prítomností rôznych koncentrácií soli I. Po tejto inkubácii sa bunky peletujú a lyžujú pomocou 100 až 250 μΐ proteínového lyzačného pufra (50 mM Tris, 150 mM NaCI, 1% NP-40, 0,25% deoxycholátu, s prídavkom inhibítorov aprotinínu, leupeptínu, pepstatínu, PMSF a ortovanadátu sodného [Sigma]) . Western imunoblotová analýza sa uskutoční, ako sa opisuje skôr (Hoatlin M.E. a kol., Blood 1998; 91(4): 1418 až 1425; Heinrich

M.C. a kol., Blood 2000; 96(3): 925 až 932).

Príklad 3

Zlúčenina I inhibuje konštitutívne aktivovanú KIT kinázu súvisiacu so psími mastocytárnymi nádormi.

Na testovanie účinnosti zlúčeniny I v zmysle inhibície kinázovej aktivity mutantných foriem psích KIT sa použijú dve bunkové línie (BR a C2) , ktoré exprimujú dve rôzne konštitutívne aktivované izoformy KIT. Mutácie KIT u týchto bunkových línií sú obidve umiestnené v juxtamembránovej doméne a sú homológne mutáciám pozorovaným u ludských gastrointestinálnych stromálnych nádorov (GISTs) (Lux M.L. a kol., Am J Pathol 2000; 156(3): 791 až 795; Rubín B.P. a kol., Cancer Res 2001; 61(22): 8118 až 8121). Lyzáty pripravené z buniek BR alebo C2 sa vyšetrujú protilátkou anti-P-Tyr a hodnotí sa aktivácia KIT receptora pomocou merania autofosforylácie. Ako je opísané skôr, pozoruje sa KIT autofosforylácia u týchto buniek za absencie SLF (Ma Y. a kol., J Invest Dermatol 1999; 112(2): 165 až 170; Ma Y. a kol., Journal of Investigative Dermatology 2000; 114(2): 392 až 394) . Inhibícia KIT autofosforylácie pomocou zlúčeniny I je závislá od dávky s kompletnou inhibíciou pozorovanou za použitia 10 a 1,0 μΜ dávok. Takmer kompletná inhibícia sa pozoruje za použitia 0,1 μΜ dávky. Obmedzená autofosforylácia c-kit sa pozoruje použitím 0,001 až 0,01 μΜ dávok zlúčeniny I. Zlúčenina I tak nielen inhibuje autofosforyláciu mutovaného c-kit receptora u týchto buniek, ale je tiež silnejším inhibítorom tohto mutovaného receptora ako neupraveného typu c-kit receptora (IC₅₀ 100 až 200 nM) (Heinrich M.C. a kol., Blood 2000; 96(3): 925 až 932). Na stanovenie či zlúčenina I moduluje expresiu KIT proteínu, sa membrána odlúpne a znova vyšetrí protilátkou anti-c-kit. Nepozoruje sa žiadna zmena expresie c-kit proteínu u buniek ošetrených zlúčeninou I. Preto zlúčenina I znižuje autofosforyláciu mutantného psieho KIT polypeptidu pomocou inhibície KIT kinázovej aktivity skôr ako pomocou regulácie v zmysle zníženia expresie KIT proteínu .

Príklad 4

Zlúčenina I inhibuje proliferáciu bunkových línií psích mastocytárnych nádorov

Na testovanie biologického účinku v zmysle inhibície kinázovej aktivity mutantného c-kit receptora sa bunky BR alebo C2 kultivujú 48 až 72 hodín v prítomnosti rôznych koncentrácií zlúčeniny I. Pri koncentráciách inhibítora vo výške 0,1 až 10 μΜ sa proliferácia znižuje o 90 až 95%, v porovnaní s bunkami ošetrenými len médiom. Čiastočná inhibícia proliferácie sa pozoruje pri dávkach 0,001 až 0,01 μΜ zlúčeniny I. Zníženie proliferácie pozorované pri dávkach 0,01 až 10 μΜ inhibítora je štatisticky významné (p < 0,001). Preto zlúčenina I inhibuje proliferáciu buniek BR a C2 v rovnakom rozsahu dávkovej odpovede, ako sa pozoruje u inhibície autofosforylácie receptora. Morfologické pozorovania inhibítorom ošetrených buniek odhaľujú zmeny konzistentné s apoptózou (dáta nie sú uvedené).

Tabuľka 1: BR bunky

	Priemery	ο *0	SD	% SD
Bunky	0, 929	100%	0,030447	3%
5 μΜ	0,083	9%	0,001732	0%
1 μΜ	0,105	11%	0,002	0%
0,1 μΜ	0, 105	11%	0,002082	0%
0,01 μΜ	0,479	52%	0,043016	5%
0,001 μΜ	0,781	84%	0,033081	4%

Tabuľka 2: C2 bunky

	Priemery	Ο. 0	SD	% SD
Bunky	1,236	100%	0,04417	4%
5 μΜ	0,032	3%	0,005686	0%
1 μΜ	0,037	3%	0,013868	1%
0,1 μΜ	0, 028	2%	0,003512	0%
0,01 μΜ	0,754	61%	0,185236	15%
0,001 μΜ	1,065	86%	0,055245	4%

Tabuľky 1 a 2:

Bunky BR alebo C2 sa umiestnia do 96-jamkových dosiek v koncentrácii 40000 buniek/jamka a kultivujú v normálnom kultivačnom médiu a rozličných koncentráciách zlúčeniny I. Bunková proliferácia sa meria v 72. hodine pomocou analyzačného systému založeného na XTT. Každá koncentrácia zlúčeniny I sa analyzuje trikrát. Výsledky sa vyjadria ako percento maximálnej proliferácie (len bunky, žiadna zlúčenina I) ± štandardná odchýlka (SD). Uvedené sú reprezentatívne výsledky jedného zo šiestich pokusov.

Kompozícia pre domáce zvieratá a ludí

Príklad 5

Kapsuly so. 4-[(4-metyl-l-piperazin-l-ylmetyl)-N-[4-mety1-3-[ [4-(3-pyridinyl)-2-pyrimidinyl]amino]fenyl]benzamidmetánsulfonátom, kryštálovou formou β

Kapsuly obsahujúce 11,95 mg zlúčeniny uvedenej v názve (= sol I), čo zodpovedá 10,0 mg zlúčeniny I (voľnej zásady), ako účinnú látku sa pripravia v nasledujúcom zložení:

Zloženie:

Sol I

Celulóza MK GR Crospovidon XL Aerosil 200 Stearát horečnatý

11,95 mg 9,2 mg 1,5 mg 0,2 mg 0,15 mg 23,0 mg

Kapsuly sa pripravia zmiešaním zložiek a plnením zmesi do tvrdých želatínových kapsúl s veľkosťou 1.

Príklad 6

Kapsula so 4-[(4-metyl-l-piperazin-l-ylmetyl)-N-[4-metyl-3-[[4-(3-pyridinyl)-2-pyrimidinyl]amino]fenyl]benzamidmetánsulfonátom, kryštálovou formou β

Kapsuly obsahujúce 10,0 mg zlúčeniny uvedenej v názve (= soľ I) ako účinnú látku sa pripravia v nasledujúcom zložení:

Zloženie:
Účinná látka	10,0 mg
Avicel	20,0 mg
PVPPXL	1,5 mg
Aerosil	0,2 mg
Stearát horečnatý	0,15 mg

31,85 mg

Kapsuly sa pripravia zmiešaním zložiek a plnením zmesi do tvrdých želatínových kapsúl s velkosťou 1.

Príklad 7

Kapsuly so 4-[(4-metyl-l-piperazin-l-ylmetyl)-N-[4-metyl-3-[[4-(3-pyridinyl)-2-pyrimidinyl]amino]fenyl]benzamidmetánsulfonátom, kryštálovou formou β

Kapsuly obsahujúce 119,5 mg zlúčeniny uvedenej v názve (= mesylát zlúčeniny I), čo zodpovedá 100 mg zlúčeniny I (volnej zásady), ako účinnú látku sa pripravia v nasledujúcom zložení:

Zloženie:

Mesylát zlúčeniny I 119,5 mg

Celulóza MK GR 92 mg

Crospovidon XL 15 mg

Aerosil 2 mg

Stearát horečnatý 1,5 mg

230 mg

Kapsuly sa pripravia zmiešaním zložiek a plnením zmesi do tvrdých želatínových kapsúl s velkosťou 1.

Príklad 8

Príklad prospektívneho radu prípadov domácich zvierat - psov s meratelnými kožnými nádormi zo žírnych buniek

Študovanými pacientmi sú domáce zvieratá - psy s meratelnými a histologický potvrdenými nádormi zo žírnych buniek. Prípady sú obmedzené na prípady s meratelnými léziami prístupnými pre biopsiu.

Kritériá na zaradenie sú:

histologický potvrdené merateľné kožné nádory zo žírnych buniek, prípady budú vyžadovať sériovú biopsiu pomocou 2 mm Keyesovej punkcie pred a v priebehu terapie, histologický stupeň (II-stredný alebo III-slabo diferenciovaný), stav telesnej aktivity (performácia status) 0 alebo 1 (Modifikovaný Karnofsky - Tabulka 3), informovaný súhlas majiteľa.

(a) Kritériá na vylúčenie sú:

súbežná cytotoxická chemoterapia, v priebehu 30 dní štúdie sa nesmie začať užívať prednison a nesteroidné protizápalová liečivá; ak sa prednison alebo nesteroidné protizápalová liečivá podávajú po čas dlhší ako 30 dní, je možné s ich podávaním pokračovať, abnormálny test sérových žlčových kyselín (pečeňové funkcie) .

Tabuľka 3

Stav telesnej aktivity (Modifikovaný Karnofsky)

Stupeň	Opis
0	Normálna aktivita
1	Obmedzená aktivita; znížená aktivita oproti stavu pred ochorením
2	Oslabená; pohyblivý len pre životné aktivity; dôsledne sa vyprázdňuje a močí na prijateľných miestach

3	Nepohyblivý; musí sa nútiť do jedla; neschopný udržať močenie a vyprázdňovanie na prijateľné miesta
4	Mŕtvy

Hodnotenie pred liečbou zahŕňa u všetkých prípadov fyzikálne vyšetrenie, kompletný krvný obraz, buffy-coat, sérovú biochémiu, rozbor moču, sérovej žlčovej kyseliny (na lacno a post-prandiálne) , dokumentáciu veľkosti regionálnych lymfatických uzlín, abdominálne radiografy a abdominálny ultrazvuk. Terapeutickým režimom je 25 mg/kg PO QD x 60 dní soli I.

V terapii sa vo všetkých prípadoch pokračuje počas 60 dní, pokial sa nezaznamená progresia ochorenia. V prípadoch zaznamenania čiastočnej odpovede alebo kompletnej odpovede je možné uvažovať o pokračovaní v terapii počas ďalších 60 dní. Prípady úspešne dokončenej terapie sú spôsobilí na opakovaný vstup do štúdie.

Tabuľka 4

Plán liečenia a klinického hodnotenia

Činnosť	Deň 0	Deň 7	Deň 14	Deň 2 8	ql4 dní
Klinický staging1	X			X	X
Fyzikálne vyšetrenie	X	X	X	X	X
Meranie objemu nádoru2	X	X	X	X	X
Štart soli I 25 mg/kg QD	X
Farmakokinetika3	X
Incisná biopsia4	X			X
Opakovaný staging				X

¹ Počiatočný staging (určenie stupňa závažnosti choroby) zahŕňa fyzikálne vyšetrenie, CBC, žltohnedý povlak, sérovú biochémiu, testy pečeňových funkcií (sérovej žlčovej kyseliny), rozbor moču, abdominálne rádiografy a abdominálny ultrazvuk. Opätovné hodnotenie môže zahŕňať samotné fyzikálne vyšetrenie a·meranie objemu nádoru alebo opakovaný klinický staging.

² Objem nádoru sa meria v deň 0, 7, 14, 28 a každých 14 dní. Terapeutická odpoveď sa definuje proti meratelnej(ným) kožnej(ným) lézie(ám) a ďalším léziám nájdeným pri stagingu (CR, PR, SD, PD - definované ďalej).

³ Odber plazmy od prvých piatich vstupujúcich prípadov sa uskutoční v hodine 0, 0,5, 1, 2, 5, 8, 12, 15, 24 po prvej dávke soli I.

⁴ Incisné biopsie z definovanej(ých) meratelnej(ých) lezie(ii) sa odoberú v deň 0 a 28 u všetkých prípadov. Ďalšie biopsie sa odoberú v čase čiastočnej odpovede (PR) a po kompletnej objektívnej odpovedi.

Hodnotí sa účinnosť zlúčeniny I proti meratelným kožným nádorom zo žírnych buniek pomocou klinických výstupov.

Biologické výstupy je možné získať zo sériových biopsií odobraných z kožných nádorov a z krvných vzoriek dostupných v priebehu liečenia.

Klinické výstupy zahŕňajú mieru odpovede meratelných nádorov, objektívnu odozvu proti meratelným nádorom a čas dc progresie meratelného nádoru. Zaznamenávajú sa všetky nepriaznivé vedľajšie účinky.

Objektívne odozvy (odpovede) nádorov, ako sú definované ďalej, sa pozorujú pri liečení zlúčeninou I a ukazujú účinnosť terapeutického režimu.

Najmä je možné pozorovať kompletné odpovede a čiastočné odpovede na liečenie zlúčeninou I. Ďalej je možné pozorovať, že viac zvierat užívajúcich terapiu vykazuje stabilné ochorenie, zatial čo menej ošetrovaných zvierat vykazuje progresívne ochorenie. Je možné tiež pozorovať, že menej zvierat užívajúcich terapiu vykazuje relaps ochorenia v porovnaní s neošetrovanými zvieratami. Čas do progresie, čas trvania remisie a prežitie sa môžu u zvierat s terapiou zlúčeninou I zvyšovať.

Kompletná odpoveď (CR) sa definuje ako zmiznutie všetkých klinických prejavov rakoviny a akýchkoľvek známok týkajúcich sa rakoviny.

Čiastočná odpoveď (PR) sa definuje ako 50% alebo vyššie zníženie súčtu výsledkov meraní reprezentatívnych lézií, bez zvýšenia veľkosti akejkoľvek lézie alebo objavenie sa akýchkoľvek nových lézií.

Stabilné ochorenie (SD) sa definuje ako žiadna odpoveď alebo odpoveď menšia ako odpoveď definovaná pre čiastočnú odpoveď alebo progresívne ochorenie bez objavenia sa akýchkoľvek nových lézií alebo zhoršenia klinických príznakov.

Progresívne ochorenie (PD) sa definuje ako nepochybné zvýšenie, aspoň 50%, veľkosti akejkoľvek meratelnej lézie alebo objavenie sa nových lézií.

Relaps (R) sa definuje ako objavenie sa nových lézií alebo opätovné objavenie sa starých lézií u psov, ktorí vykazovali kompletnú odpoveď; u psov, ktorí vykazovali len čiastočnú odpoveď, relaps sa definuje ako aspoň 50% zvýšenie súčtu výsledkov meraní reprezentatívnych lézií, v porovnaní s meraniami získanými v čase maximálnej odpovede.

Čas do progresie (TTP) sa zaznamenáva od dňa 0 protokolu. TTP sa definuje ako počet dní od začiatku terapie (od dňa 0) do relapsu (R).

Čas trvania remisie sa definuje ako počet dní od objektívnej odpovede (PR alebo CR) do relapsu.

Prežitie sa definuje ako počet dní od začiatku terapie zlúčeninou I do smrti. Príčina smrti sa zaznamenáva, avšak môže zahŕňať progresiu ochorenia, toxicitu a ďalšie.

Získané výsledky ukazujú inhibíciu mastocytárnych novotvarov zlúčeninami podľa vynálezu, napr. STI571B.

Výhodné sú zlúčeniny podľa vynálezu, v ktorých jeden alebo dva zo substituentov R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ a R⁸ znamenajú každý nitroskupinu alebo skupinu všeobecného vzorca II, kde R⁹ znamená atóm vodíka alebo nižšiu alkylovú skupinu, X znamená oxoskupinu, tioskupínu, iminoskupinu, N-nižší alkyl-iminoskupinu, hydroximinoskupinu alebo O-nížší alkyl-hydroximinoskupinu, Y znamená atóm kyslíka alebo skupinu NH, n znamená 0 alebo 1 a R¹⁰ znamená alifatickú skupinu obsahujúcu aspoň 5 uhlíkových atómov alebo aromatickú, aromatickoalifatickú, cykloalifatickú, cykloalifatickoalifatickú, heterocyklickú alebo heterocyklickoalífatickú skupinu, a zostávajúce substituenty R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ a R⁸ znamenajú každý nezávisle od druhých atóm vodíka, nižšiu alkylovú skupinu, ktorá je nesubstituované alebo substituovaná voľnou alebo alkylovanou aminoskupinou, piperazinylovou skupinou, piperidinylovou skupinou, pyrolidinylovou skupinou alebo morfolinylovou skupinou, alebo nižšiu alkanoylovú skupinu, trifluórmetylovú skupinu, voľnú, éterifikovanú alebo esterifikovanú hydroxyskupinu, voľnú, alkylovanú alebo acylovanú aminoskupinu alebo voľnú alebo esterifikovanú karboxyskupinu, a zostávajúce substituenty majú významy definované skôr.

Výhodné sú zlúčeniny podlá vynálezu, v ktorých

R¹ znamená pyridylovú skupinu alebo N-oxidopyridylovú skupinu, pričom každá z nich je naviazaná na uhlíkovom atóme,

R² a R³ znamenajú každý atóm vodíka,

R⁴ znamená atóm vodíka alebo nižšiu alkylovú skupinu,

R⁵ znamená atóm vodíka, nižšiu alkylovú skupinu alebo trifluórmetylovú skupinu,

R⁶ znamená atóm vodíka,

R⁷ znamená nitroskupinu, fluórsubstituovanú nižšiu alkoxyskupinu alebo skupinu všeobecného vzorca II, kde R⁹ znamená atóm vodíka,

X znamená oxoskupinu, n znamená 0 a

R¹⁰ znamená pyridylovú skupinu viazanú na uhlíkovom atóme, fenylovú skupinu, ktorá je nesubstituovaná alebo substituovaná atómom halogénu, kyanoskupinou, nižšou alkoxyskupinou, karboxyskupinou, nižšou alkylovou skupinou alebo 4-metylpiperazinylmetylovou skupinou, alebo alkylovú skupinu obsahujúcu 5 až 7 uhlíkových atómov, tienylovú skupinu, 2-naftylovú alebo cyklohexylovú skupinu, a

R⁸ znamená atóm vodíka.

Špeciálne výhodné sú zlúčeniny podľa vynálezu, v ktorých aspoň jeden zo substituentov R⁴ a R⁸ je nižšia alkylová skupina a zostávajúce substituenty majú významy definované skôr.

Výhodné sú najmä zlúčeniny podlá vynálezu, v ktorých R¹ znamená pyridylovú skupinu naviazanú na uhlíkovom atóme,

R², R³, R⁵, R⁶ a R⁸ znamenajú každý atóm vodíka,

R⁴ znamená nižšiu alkylovú skupinu,

R⁷ znamená skupinu všeobecného vzorca II, kde

R⁹ znamená atóm vodíka,

X znamená oxoskupinu, n znamená - 0 a

R¹⁰ znamená 4-metylpiperazinylmetylovú skupinu.

Najvýhodnejšia je zlúčenina podlá vynálezu všeobecného vzorca I, ktorou je CGP 57148B {N-{5-[4-(4-metylpiperazinometyl)benzoylamido]-2-metylfenyl}-4-(3-pyridyl)-2—pyrimidínamínmonomesylát} .

Veľmi výhodne sa zlúčenina podľa vynálezu používa vo forme jej monomesylátovej soli.

Podľa jedného výhodného uskutočnenia vynálezu sa ošetrované ochorenie zvolí zo skupiny zahŕňajúcej alergickú rinitídu, alergickú dermatitídu, liekovú alergiu a potravinovú alergiu. Podľa iného uskutočnenia vynálezu je ošetrovaným ochorením viacnásobná skleróza. Podľa ďalšieho uskutočnenia vynálezu sa ošetrované ochorenie zvolí zo skupiny zahŕňajúcej angioedém, žihľavku, syndróm náhleho úmrtia dieťaťa a bronchopulmonálnu aspergilózu. Ďalej je možné zlúčeniny podlá vynálezu použiť na liečenie systémovej mastocytózy, najmä mastocytómu. Posledne menované ochorenie je malígnym ochorením s rozsiahlym metastázovaním, najmä u psov. Tak sú zlúčeniny podľa vynálezu použiteľné najmä na prípravu liečiva na liečenie psích mastocytárnych novotvarov.

Zlúčeniny podľa vynálezu sú genericky a špecificky opísané v patentových prihláškach EP 0 564 409 Al a WO 99/03854, najmä v nárokoch vedených na zlúčeniny a výsledných produktoch príkladov, podstata výsledných produktov, farmaceutických prípravkov a nárokov je týmto zhrnutá do predloženej prihlášky odkazom na tieto publikácie. Zahrnuté sú tiež príslušné stereoizoméry, ako I príslušné polymorfy, napr. kryštálové modifikácie, ktoré sú tam opísané.

V dokumente EP 0 564 409 Al sa zlúčeniny podľa vynálezu opisujú ako použiteľné na liečenie rakoviny, trombózy, psoriázy, fibrózy, dermatosklerózy a artériosklerózy. V súlade s predloženým vynálezom sa teraz zistilo, že zlúčeniny podľa vynálezu prekvapujúco vykazujú priaznivé účinky na alergickú rinitídu, alergickú dermatitídu, liekovú alergiu alebo potravinovú alergiu, angioedém, žihľavku, syndróm náhleho úmrtia dieťaťa, bronchopulmonálnu aspergilózu, viacnásobnú sklerózu a ďalej mastocytózu, najmä psie mastocytárne novotvary.

V súlade s konkrétnymi nálezmi vynálezu poskytuje predložený vynález tiež spôsob liečenia teplokrvných živočíchov, vrátane ludí, pri ktorom sa terapeuticky účinná dávka zlúčeniny podlá vynálezu podáva tomuto teplokrvnému živočíchovi, výhodne človeku alebo psovi, velmi výhodne človeku, trpiacemu jedným z tu uvedených ochorení.

Vynález sa tiež týka spôsobu podávania zlúčeniny podľa vynálezu alebo .jej farmaceutický prijateľnej soli psiemu jedincovi so psími mastocytárnymi novotvarmi, ktoré zahŕňa podávanie farmaceutický účinného množstva zlúčeniny podľa vynálezu alebo jej farmaceutický prijateľnej soli psovi raz denne po čas výhodne presahujúci 1 mesiac, 2 mesiace alebo dokonca 3 mesiace. Vynález sa týka najmä takého spôsobu, pri ktorom sa podáva denná dávka predstavujúca asi 20 až 200 mg, výhodne 80 až 160 mg, najmä 125 mg soli I.

Výhodne sa vynález týka použitia alebo spôsobu, pri ktorom sa denná dávka monometánsulfónovej soli 4-(4-metylpiperazin-l-ylmetyl) -N- [4-metyl-3- (4-pyridin-3-yl) pyrimidin-2-ylamino) fenyl] benzamidu všeobecného vzorca I podáva psovi a uvedená denná dávka zahŕňa množstvo uvedenej monometánsulfonátovej soli dostatočné na udržanie plazmatických hladín vo výške aspoň 0,2 μΜ.

Termín spôsob liečenia, ako je tu použitý, sa týka tiež najmä spôsobu prevencie tu uvedených ochorení, to znamená profylaktického podávania farmaceutickej kompozície obsahujúcej zlúčeninu podía vynálezu zdravým pacientom na prevenciu vzplanutia tu uvedených ochorení.

Predložený vynález sa týka tiež farmaceutickej kompozície na liečenie aspoň jedného z ochorení tu uvedených obsahujúcej zlúčeninu podľa vynálezu. Farmaceutická kompozícia na liečenie aspoň jedného z ochorení tu uvedených obsahuje účinné množstvo zlúčenín podľa vynálezu spolu s farmaceutický prijatelnými nosičmi, ktoré sú vhodné na topické, enterálne, napríklad orálne alebo rektálne, alebo parenterálne podávanie, a môžu byť anorganické alebo organické, pevné alebo kvapalné. Pri orálnom podá30 vaní sa používajú najmä tablety alebo želatínové kapsuly obsahujúce zlúčeniny podlá vynálezu spolu s riedidlami alebo/a lubrikantami, napríklad kyselinou kremičitou, mastencom, kyselinou stearovou alebo jej sólami, alebo/a polyetylénglykolom, avšak tiež lótia, gélmi alebo krémami. Tablety môžu obsahovať spojivá, škroby, želatínu, metylcelulózu, nátriumkarboxymetylcelulózu alebo/a polyvinylpyrolidón, dezintegračné činidlá alebo/a effervescentné zmesi, alebo adsorbenty, farbivá, ochuťovadlá a sladidlá. Zlúčeniny pódia vynálezu je možné tiež použiť vo forme parenterálne podávatelných kompozícií alebo vo forme infúznych roztokov. Topické podávanie je napríklad podávanie na kožu. Ďalšou formou topického podávania je podávanie do oka, napr. na liečenie jarnej konjunktivitídy. Farmaceutické kompozície môžu byť sterilizované alebo/a môžu obsahovať pomocné látky, napríklad konzervačné látky, stabilizačné činidlá, zvlhčovadlá alebo/a emulgačné činidlá, solubilizačné činidlá, soli na reguláciu osmotického tlaku alebo/a pufry. Predmetné farmaceutické kompozície sa pripravujú známym spôsobom, napríklad pomocou bežného miesenia, granulácie, poťahovania, rozpustenia alebo lyofilizácie a obsahujú asi od 1% do 100%, najmä od asi 1% do asi 20%, účinnej(ných) látky(tok).

Zlúčeniny podľa vynálezu je možné napríklad formulovať, ako je opísané v príklade 4 a 6 v dokumente WO 99/03854.

Použitý dávkový rozsah zlúčenín podlá vynálezu závisí od faktorov odborníkovi v odbore známych, ktoré zahŕňajú druh teplokrvného živočícha, telesnú hmotnosť a vek, spôsob podávania, konkrétnu použitú zlúčeninu a liečené ochorenie. Ak tu nie je uvedené inak, podávajú sa zlúčeniny podlá vynálezu výhodne raz až štyrikrát denne alebo ihneď ako je spozorovaná alergická reakcia. Ďalej sa zlúčeniny podlá vynálezu, najmä N-{5-[4-(4-metylpiperazinometyl)benzoylamido]-2-metylfenyl) - 4-(3-pyridýl)-2-pyrimidínamín (STI571B), výhodne podávajú teplokrvnému .živočíchovi, najmä človeku, v dávke pohybujúcej sa v rozsahu predstavujúcom asi 10 až 750 mg/deň, výhodne 30 až 600 mg/deň, výhod31 nejšie 30 až 300 mg/deň.

U psov sa, v závislosti od druhu, veku, konkrétneho stavu, spôsobu podávania a daného klinického obrazu, podávajú teplokrvnému živočíchovi s hmotnosťou asi 5 kg účinnej dávky, napríklad dennej dávky vo výške asi 20 až 200 mg, výhodne 80 až 160 mg, najmä 125 mg. U dospelých psov s hmotnosťou asi 5 kg s neresekovateľnými alebo/a metastatickými malígnymi psími mastocytárnymi novotvarmi je možné odporučiť počiatočnú dávku vo výške 125 mg denne. U psov s nedostatočnou odpoveďou po zhodnotení odpovede na terapiu 125 mg denne, je možné bezpečne uvažovať o zvýšení dávky a psy môžu byť liečení, pokial z terapie ťažia a za neprítomnosti obmedzujúcich toxicít. Dávky je možné titrovať tak, že sa dosiahnu plazmatické hladiny vo výške aspoň 0,2 μΜ (mikromolárny), výhodne aspoň 0,5 μΜ, výhodnejšie aspoň 1 μΜ. Dosiahnutie alebo/a udržanie plazmatických hladín vo výške asi 1 μΜ je obzvlášť výhodné.

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použitie N-fenyl-2-pyridínamínového derivátu všeobecného vzorca I v ktorom

   R¹ znamená 4-pyrazinyiovú skupinu; 1-metyl-lH-pyrolylovú skupinu; amino- alebo amino-nižší alkyl-substituovanú fenylovú skupinu, kde je aminoskupina v každom prípade voľná, alkylovaná alebo acylovaná; IH-indolylovú skupinu alebo lH-imidazolylovú skupinu naviazanú na uhlíkovom atóme päťčlenného kruhu; alebo nesubstituovanú alebo nižšou alkylovou skupinou substituovanú pyridylovú skupinu naviazanú na kruhovom atóme uhlíka a nesubstituovanú alebo substituovanú na atóme dusíka atómom kyslíka;

   R² a R³ znamenajú každý nezávisle jeden od druhého atóm vodíka alebo nižšiu alkylovú skupinu;

   jeden alebo dva zo substituentov R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ a R⁸ znamenajú každý nitroskupinu, fluórsubstituovanú nižšiu alkoxyskupinu alebo skupinu všeobecného vzorca II

   -N (R⁹)-C (=X) - (Y) _n-R¹⁰ (II), kde

   R⁹ znamená atóm vodíka alebo nižšiu alkylovú skupinu,

   X znamená oxoskupinu, tioskupinu, iminoskupinu, N-nižší alkyl33

   -iminoskupinu, alkyl-iminoskupinu, hydroximinoskupinu alebo O-nižší alkyl-hydroximinoskupinu,

   Y znamená atóm kyslíka alebo skupinu NH, n znamená 0 alebo 1, a

   R¹⁰ znamená alifatickú skupinu obsahujúcu aspoň 5 uhlíkových atómov ' alebo aromatickú, aromatickoalifatickú, cykloalifatickú, cykloalifatickoalifatickú, heterocyklickú alebo heterocyklickoalifatickú skupinu, a zostávajúce substituenty R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ a R⁸ znamenajú každý nezávisle od druhých atóm vodíka, nižšiu alkylovú skupinu, ktorá je nesubstituovaná alebo substituovaná voľnou alebo alkylovanou aminoskupinou, piperazinylovou skupinou, piperidinylovou skupinou, pyrolidinylovou skupinou alebo morfolinylovou skupinou, alebo nižšiu alkanoylovú skupinu, trifluórmetylovú skupinu, voľnú, éterifikovanú alebo esterifikovanú hydroxyskupinu, voľnú, alkylovanú alebo acylovanú aminoskupinu alebo voľnú alebo esterifikovanú karboxyskupinu, alebo soli takej zlúčeniny, ktoré obsahuje aspoň jednu skupinu vytvárajúcu sol, na prípravu liečiva na liečenie alergickej rinitídy, alergickej dermatitídy, liekovej alergie alebo potravinovej alergie, angioedému, žihlavky, syndrómu náhleho úmrtia dieťaťa, bronchopulmonálnej aspergilózy, mastocytózy alebo viacnásobnej sklerózy.
2. 2. Použitie zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa nároku 1, v ktorom jeden alebo dva zo substituentov R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ a R⁸ znamenajú každý nitroskupinu alebo skupinu všeobecného vzorca II, kde R⁹ znamená atóm vodíka alebo nižšiu alkylovú skupinu,

   X znamená oxoskupinu, tioskupinu, imínoskupinu, N-nižší alkyl-imínoskupinu, hydroximinoskupinu alebo O-nižší alkyl-hydroximinoskupinu,

   Y znamená atóm kyslíka alebo skupinu NH, n znamená 0 alebo 1, a

   R¹⁰ znamená alifatickú skupinu obsahujúcu aspoň 5 uhlíkových atómov alebo aromatickú, aromatickoalifatickú, cykicalifatickú, cykloalifatickoalifatickú, heterocyklickú alebo heterocyklickoalifatickú skupinu, a zostávajúce substituenty R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ a R⁸ znamenajú každý nezávisle od druhých atóm vodíka, nižšiu alkylovú skupinu, ktorá je nesubstituovaná alebo substituovaná volnou alebo alkylovanou aminoskupinou, piperazinylovou skupinou, piperidinylovou skupinou, pyrolidinylovou skupinou alebo morfolinylovou skupinou, alebo nižšiu alkanoylovú skupinu, trifluórmetylovú skupinu, volnú, éterifikovanú alebo esterifikovanú hydroxyskupinu, voľnú, alkvlovanú alebo acylovanú aminoskupinu alebo volnú alebo esterifikovanú karboxyskupinu, a zostávajúce substituenty majú významy definované v náreku 1, alebo farmaceutický prijateľné soli takej zlúčeniny, ktorá obsahuje aspoň jednu skupinu vytvárajúcu sol.
3. 3. Použitie zlúčeniny všeobecného vzorca I podlá nároku 1, v ktorom

   R¹ znamená pyridylovú skupinu naviazanú na uhlíkovom atóme,

   R², R³, R⁵, R⁵ a R⁸ znamenajú každý atóm vodíka,

   R⁴ znamená nižšiu alkylovú skupinu,

   R⁷ znamená skupinu všeobecného vzorca II, kde R⁹ znamená atóm vodíka,

   X znamená oxoskupinu, n znamená 0 a

   R¹⁰ znamená 4-metylpiperazinylmetylovú skupinu, alebo jej farmaceutický prijateľné soli.
4. 4. Použitie zlúčeniny všeobecného vzorca I podlá nároku 1, pričom zlúčeninou je N-{5-[4-(4-metylpiperazinometyl)benzoylamido]-2-metylfenyl}-4-(3-pyridyl)-2~pyrimidínamín alebo jeho farmaceutický prijateľná sol.

   5. Použitie zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa lubovolného z nárokov 1 až 4, pri ktorom sa zlúčenina použije vo forme jej monomesylátovej soli. 6. Použitie zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa lubovolného

   z nárokov 1 až 5 na prípravu liečiva na liečenie psích novotvarov zo žírnych buniek.
5. 7. Spôsob liečenia teplokrvného živočícha s alergickou rinitídou, alergickou dermatitídou, liekovou alergiou alebo potravinovou alergiou, angioedémom, žihlavkou, syndrómom náhleho úmrtia dieťaťa, bronchopulmonálnou aspergilózou, mastocytózou alebo viacnásobnou sklerózou, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podávanie zlúčeniny všeobecného vzorca I podlá ľubovoľného z nárokov 1 až 5 živočíchovi v množstve, ktoré je terapeuticky účinné proti aspoň jednému z uvedených ochorení, pri ktorom môže byť zlúčenina všeobecného vzorca I tiež vo forme farmaceutický prijateľnej soli.
6. 8. Spôsob liečenia psov trpiacich psími novotvarmi zo žírnych buniek, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podávanie dávky účinnej proti psím novotvarom zo žírnych buniek zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa lubovolného z nárokov 1 až 5 uvedené36 mu psovi.
7. 9. Použitie alebo spôsob podľa nároku 6 alebo 8, pri ktorom sa dospelému psovi podáva denná dávka vo výške 20 až 200 mg 4- (4-metylpiperazin-l-ylmetyl)-N-[4-metyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidín-2-ylamino)fenyl]benzamidu alebo jeho farmaceuticky prijateľnej soli.
8. 10. Použitie alebo spôsob podľa nároku 1 alebo 7, pri ktorom sa človeku podáva denná dávka vo výške 30 až 400 mg 4-(4-metylpiperazin-l-ylmetyl) -N-[4-metyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2~ylamino)fenyl]benzamidu alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli.