SK12572001A3

SK12572001A3 - Proteín, peptid, protilátka, spôsob výroby a farmaceutický prostriedok

Info

Publication number: SK12572001A3
Application number: SK1257-2001A
Authority: SK
Inventors: Haruo Onda; Kazuhiro Ogi; Chieko Kitada; Nobuhiro Suzuki; Shoichi Ohkubo; Yasushi Shintani; Kuniko Kikuchi
Original assignee: Takeda Chemical Industries, Ltd.
Priority date: 1999-03-15
Filing date: 2000-03-14
Publication date: 2002-03-05
Also published as: CN1368978A; CA2364941A1; NZ513920A; NO20014300D0; ID30211A; AU2944600A; HUP0200318A2; CZ20013222A3; IL145152A0; EP1164142A1; KR20020007329A; PL350339A1; NO20014300L; WO2000055197A1

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka mimo iného nového sekrečného proteínu.

Doterajší stav techniky

Medzi dosiaľ opísané onkogény patrí veľký počet génov bunkového proliferačného faktora alebo génov receptora, ako je PDGF súvisiaci s mozgovým nádorom (Ross R.: Náture 1993, 362, 801.), erb-B a erb-B1 súvisiaci s rakovinou prsníka (Celí 1983, 35, 718; Burden S.: Neurón 1997, 18, 847.) a podobné a navyše veľký počet génov, ako je signálny transdukciu podporujúci Ki-ras súvisiaci s kolorektálnou rakovinou, N-ras zahrnutý v leukémii, c-mys súvisiaci s transkripčným faktorom aktivujúcim gén podporujúci bunkovú proliferáciu a zahrnutý v leukémii, rakovine prsníka a rakovine žalúdka, mimo iných (Maheswaren: Mol. Celí. Biol. 1994 14(2), 1147.), N-myc zahrnutý v neuroblastóme (Schwab: Náture 1983, 305, 245.), L-myc zahrnutý v rakovine pľúc (Nau: Náture 1985, 318, 69.) a ďalej Bcl-1, Bcl-2, MDM2 a podobné proteíny súvisiace s lymfómom folikulámych B buniek, rakovinou prsníka, rakovinou maternicového čipka alebo proteíny antagonizujúce p53 nádorový supresorový proteín (Reed: Náture 1997, 387, 773; Donehower: Náture 1992, 365, 215). Popri týchto génov zistili sa početné gény fungujúce na potlačovanie proliferácie rakovinových buniek, ako je APC, DPC4, NF-1, NF-2, MTS1, RB, P53 a WT1 (Weinberg: Scientific American 1996, september, 32.). Tieto gény sa identifikovali na základe informácie aminokyselinovej sekvencie poskytnutej analyzovaním špecifických proteínov zistených po malígnej transformácii buniek alebo tkaniva a podrobnosti týchto objavov ich obohacujú. Tieto až dosiaľ objavené gény nie sú sami dostatočné na vysvetlenie onkogenézie a/alebo vyliečenie rakoviny.

Ako výsledok nedávnej analýzy ľudského génu sa potom ďalej opisovali početné oligonukleotidové sekvencie ETS (exprimovanej sekvenčnej tagy) s neznámou funkciou.

Bolo by žiadúce, aby sa vyvinulo nové činidlo na liečenie rakoviny alebo na jej predchádzanie nájdením génov kódujúcich nádorové špecifické proteíny, medzi tými ETS, ktorých funkcie nie sú známe.

Podstata vynálezu

Autori predloženého vynálezu uskutočnili intenzívne výskumy pri pokuse vyriešiť hore uvedený problém. Výsledok bol, že našli gén sekrečného proteínu, ktorý má novú nukleotidovú sekvenciu na základe nukleotidových sekvencii EST, a zistili, že sekrečný proteín ním kódovaný sa špecificky exprimuje v nádorových bunkách.

Výsledkom ďalších výskumov na základe týchto a ďalších zistení je, že autori predloženého vynálezu dokončili predložený vynález.

Predložený vynález teda poskytuje:

1) proteín, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu identickú alebo v podstate identickú s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou ako sekv. id. č. 1 alebo jej soľ,

2) proteín alebo jeho soľ podľa hore uvedeného odstavca ad 1), v ktorom aminokyseiinová sekvencia v podstate identická s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou ako sekv. id. č. 1 znamená aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. id. č. 5,

3) proteín alebo jeho soľ podľa hore uvedeného odstavca ad 1), ktorý sa produkuje v rakovinových bunkách,

4) čiastočný peptid odvodený od hore uvedeného proteínu podľa odstavca ad 1) alebo jeho soľ,

5) čiastočný peptid alebo jeho soľ podľa hore uvedeného odstavca ad 4), ktorý má aminokyselinovú sekvenciu od 26. do 34. aminokyselinového zvyšku v aminokyselinovej sekvencii uvedenej ako sekv. id. č. 1,

6) čiastočný peptid alebo jeho soľ podľa hore uvedeného odstavca ad 4), ktorý má aminokyselinovú sekvenciu od 166. do 190. aminokyselinového zvyšku v aminokyselinovej sekvencii uvedenej ako sekv. id. č. 5,

7) spôsob výroby proteínu podľa hore uvedenéhé odstavca ad 1) alebo čiastočného peptidu podľa hore uvedeného odstavca ad 4) alebo ich soli, ktorý zahrňuje kultivovanie transformantu nesúceho rekombinantný vektor obsahujúci DNA kódujúci proteín podľa hore uvedeného odstavca ad 1) alebo čiastočný peptid podľa hore uvedeného odstavca ad 4), čím dôjde k tvorbe uvedeného proteínu alebo čiastočného peptidu,

8) protilátka oproti proteínu podľa hore uvedeného odstavca ad 1) alebo čiastočnému peptidu podľa hore uvedeného odstavca ad 4) alebo jeho soli,

9) protilátka podľa hore uvedeného odstavca ad 8), ktorá znamená monoklonálnu protilátku,

10) protilátka podľa hore uvedeného odstavca ad 8), ktorá znamená protilátku proti čiastočnému peptidu podľa hore uvedeného odstavca ad 4) alebo jeho soli, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu od 26. do 34. aminokyselinového zvyšku v aminokyselinovej sekvencii uvedenej ako sekv. id. č. 1,

11) protilátka podľa hore uvedeného odstavca ad 8), ktorá znamená protilátku proti čiastočnému peptidu podľa hore uvedeného odstavca ad 4) alebo jeho soli, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu od 166. do 190. aminokyselinového zvyšku v aminokyselinovej sekvencii uvedenej ako sekv. id. č. 5, r 4 -

12) diagnostické činidlo, ktoré obsahuje protilátku podľa hore uvedeného odstavca ad 8),

13) farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje proteín podľa hore uvedeného odstavca ad 1), čiastočný peptid podľa hore uvedeného odstavca ad 4), ich soľ alebo protilátku podľa hore uvedeného odstavca ad 8),

14) spôsob testovania zlúčeniny alebo jej soli, ktorá zvyšuje alebo inhibuje aktivitu proteínu podľa hore uvedeného odstavca ad 1), čiastočného peptidu podľa hore uvedeného odstavca ad 4) alebo ich soli, podľa ktorého sa používa proteín podľa hore uvedeného odstavca ad 1) alebo čiastočný peptid podľa hore uvedeného odstavca ad 4) alebo ich soľ,

15) spôsob testovania podľa hore uvedeného odstavca ad 14), v ktorom aktivita znamená bunkovú proliferačnú aktivitu,

16) zostava na testovanie zlúčeniny alebo jej soli, ktorá zvyšuje alebo inhibuje aktivitu proteínu podľa hore uvedeného odstavca ad 1) alebo čiastočného peptidu podľa hore uvedeného odstavca ad 4) alebo ich soli, ktorá obsahuje proteín podľa hore uvedeného odstavca ad 1) alebo čiastočný peptid podľa hore uvedeného odstavca ad 4) alebo ich soľ,

17) zlúčenina alebo jej soľ, ktorá zvyšuje alebo inhibuje aktivitu proteínu podľa hore uvedeného odstavca ad 1) alebo čiastočného peptidu podľa hore uvedeného odstavca ad 4) alebo ich soli, ktoré je možné získať použitím spôsobu na testovanie podľa hore uvedeného odstavca ad 14) alebo zostavy na testovanie podľa hore uvedeného odstavca ad 16,

18) farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje zlúčeninu alebo jej soľ, ktorá zvyšuje alebo inhibuje aktivitu proteínu podľa hore uvedeného odstavca ad 1) alebo čiastočného peptidu podľa hore uvedeného odstavca ad 4) alebo ich soli, ktoré je možné získať použitím spôsobu na testovanie podľa hore uvedeného odstavca ad 14) alebo zostavy na testovanie podľa hore uvedeného odstavca ad 16) a

19) farmaceutický prostriedok podľa hore uvedeného odstavca ad 18), ktorý sa, mimo iného, určí na predchádzanie rakoviny alebo na jej liečenie.

Predložený vynález ďalej poskytuje:

20) proteín alebo jeho soľ, podľa hore uvedeného odstavca ad 1), pričom aminokyselinová sekvencia v podstate identická s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou ako sekv. id. č. 1 znamená aminokyselinovú sekvenciu, ktorá nemá menšiu ako asi 70%, s výhodou nie menšiu ako asi 80%, výhodnejšie nie menšiu ako asi 90%, ešte výhodnejšie nie menšiu ako asi 95% homológiu s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou ako sekv. id. č. 1,

21) proteín alebo jeho soľ, podľa hore uvedeného odstavca ad 1), pričom aminokyselinová sekvencia v podstate identická s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou ako sekv. id. č. 1 znamená 1) aminokyselinovú sekvenciu pochádzajúcu z delécie 1až 5 (s výhodou 1 až 3) aminokyselinových zvyškov z aminokyselinovej sekvencie uvedenej ako sekv. id. č. 1, 2) aminokyselinovú sekvenciu pochádzajúcu z pridania 1 až 10 (s výhodou 1 až 5 (výhodnejšie 1 až 3)) aminokyselinových zvyškov k aminokyselinovej sekvencii uvedenej ako sekv. id. č. 1, 3) aminokyselinovú sekvenciu pochádzajúcu zo substitúcie niektorým iným aminokyselinovým zvyškom alebo zvyškami 1 až 5 (s výhodou 1 až 3) aminokyselinových zvyškov v aminokyselinovej sekvencii uvedenej ako sekv. id. č. 1 alebo 4) aminokyselinovú sekvenciou pochádzajúcou z ich kombinácie,

22) spôsob testovania podľa hore uvedeného odstavca ad 14), ktorý zahrňuje i) uvedenie substrátu do styku s proteínom podľa hore uvedeného odstavca ad 1) alebo čiastočným peptidom podľa hore uvedeného odstavca ad 4) alebo ich soli, ii) uvedenie substrátu a testovanej zlúčeniny do styku s proteínom podľa hore uvedeného odstavca ad 1) alebo čiastočným peptidom podľa hore uvedeného odstavca ad 4) alebo ich solí, zmeranie aktivity proteínu podľa hore uvedeného odstavca ad 1) alebo čiastočného peptidu podľa hore uvedeného odstavca ad 4) alebo ich soli v každom prípade a porovnanie získaných hodnôt aktivity.

23) farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje zlúčeninu alebo jej soľ, ktorá zvyšuje aktivitu proteínu podľa hore uvedeného odstavca ad 1) alebo čiastočného peptidu podľa hore uvedeného odstavca ad 4) alebo ich soli, ktoré je možné získať použitím spôsobu testovania podľa hore uvedeného odstavca ad 14) alebo zostavy na testovanie podľa hore uvedeného odstavca ad 16),

24) farmaceutický prostriedok podľa hore uvedeného odstavca ad 23), ktorý znamená činidlo na regeneráciu tkaniva pre použitie po excízii chorého tkaniva,

25) farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje zlúčeninu alebo jej soľ, ktorá inhibuje aktivitu proteínu podľa hore uvedeného odstavca ad 1) alebo čiastočného peptidu podľa hore uvedeného odstavca ad 4) aíebo ich soli, ktoré je možné získať použitím spôsobu testovania podľa hore uvedeného odstavca ad 14) alebo zostavy na testovanie podľa hore uvedeného odstavca ad 1

26) farmaceutický prostriedok podľa hore uvedeného odstavca ad 25), ktorý je určený na liečenie rakoviny alebo na jej predchádzanie,

27) spôsob kvantitatívneho stanovenia proteínu podľa hore uvedeného odstavca ad 1) alebo čiastočného peptidu podľa hore uvedeného odstavca ad 4) alebo ich soli, ktorý zahrňuje zreagovanie protilátky podľa hore uvedeného odstavca ad 8) kompetitívne s testovaným roztokom a značenou formou proteínu podľa hore uvedeného odstavca ad 1) alebo čiastočného peptidu podľa hore uvedeného odstavca ad 4) alebo ich soli a stanovenie podielu značenej formy proteínu podľa hore uvedeného odstavca ad 1) alebo čiastočného peptidu podľa hore uvedeného odstavca ad 4) alebo ich soli nadviazané na uvedenú protilátku, a

28) spôsob kvantitatívneho stanovenia proteínu podľa hore uvedeného odstavca ad 1) alebo čiastočného peptidu podľa hore uvedeného odstavca ad 4) alebo ich soli, ktorý zahrňuje zreagovanie testovaného roztoku s protilátkou podľa hore uvedeného odstavca ad 8) imobilizovanou na nosiči a značenou formou protilátky podľa hore uvedeného odstavca ad 8) súčasne alebo postupne a zmeranie aktivity značenej látky na imobilizovanom nosiči, okrem iného.

Predložený vynález tiež poskytuje:

29) hybrid - , ktorý má schopnosť produkovať monoklonálnu protilátku podľa hore uvedeného odstavca ad 9),

30) protilátku podľa hore uvedeného odstavca ad 8), ktorá znamená neutralizujúcu protilátku,

31) protilátku podľa hore uvedeného odstavca ad 8), ktorá znamená humanizovanú protilátku,

32) farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje protilátku podľa hore uvedeného odstavca ad 31),

33) farmaceutický prostriedok podľa hore uvedeného odstavca ad 32), ktorý je určený na liečenie rakoviny alebo na jej predchádzanie,

34) farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje takú zlúčeninu alebo jej soľ, ktorá má inhibičnú aktivitu pri inhibícii proliferácie prirodzených zabíjajúcich buniek proteínom podľa hore uvedeného odstavca ad 1) alebo čiastočným peptidom podľa hore uvedeného odstavca ad 4) alebo ich solí, a

35) farmaceutický prostriedok podľa hore uvedeného odstavca ad 34), ktorý je určený na liečenie rakoviny alebo na jej predchádzanie, a tak ďalej.

Stručný opis obrázkov

Obrázok 1 ukazuje nukleotidovú sekvenciu DNA získanej v príklade 1, ktorá kóduje proteín podľa predloženého vynálezu rovnako ako od nej odvodenú aminokyselinovú sekvenciu.

Obrázok 2 je elektroforetogram, ktorý ukazuje výsledky Northernovho blotovania uskutočneného v príklade 2. V A (pre normálne tkanivá) pás 1 je pre mozog, pás 2 - srdce, pás 3 - skeletálne svalstvo, pás 4 - hrubé črevo, pás 5 - brzlík, pás 6 - slezinu, pás 7 - ľadviny, pás 8 - pečeň, pás 9 - tenké črevo, pás 10 - placentu, pás 11 - pľúca a pás 12 - periférnu krv a v B (pri rakovinových bunkách) pás 1 je pre promyelocytickú leukemickú bunku HL60, pás 2 - cervikálnu rakovinovú bunku Hela, pás 3 - chronickú myelogennú leukemickú bunku K-562, pás 4 - bunku MOLT4 lymfoblastickej leukémie, pás

- bunku Raji Burkittovho lymfómu, pás 6 - bunku SW480 rakoviny hrubého čreva, pás 7 - bunku A549 rakoviny pľúc a pás 9 - bunku G361 melanómu.

Obrázok 3 je elektroforetogram ukazujúci výsledky Northernovho blotovania uskutočneného v príklade 2. V C-1 pás je pre bunku RERF-LC-A1 rakoviny pľúc človeka, pás 2 - bunku NC-H345 rakoviny pľúc človeka, pás 3 bunku NCI-H460 rakoviny pľúc človeka, pás 4 - bunku NCI-H1299 rakoviny pľúc človeka, pás 5 - normálnu ľudskú fetálnu fibroblastovú bunku MRC-5, pás

- normálnu ľudskú fetálnu fibroblastovú bunku WI-38, pás 7 - bunku HT-29 kolorektálnej rakoviny, pás 8 - bunku WiDr kolorektálnej rakoviny a pás 9 bunku MCF-7 rakoviny prsníka.

V C-2 pás 1 je pre bunku GOTO-P3 neuroblastomu, pás 2 - bunku IMR32 neuroblastomu, pás 3 - gliomovú bunku U-251, pás 4 - gliomovú bunku KNS42 a pás 5 - gliomovú bunku KNS81.

V C-3 pás 1 je pre bunku NCI-H345 rakoviny pľúc, pás 2 - bunku IMR-32 neuroblastomu, pás 3 - bunku LNCap rakoviny prostaty, pás 4 - bunku PC-3 rakoviny prostaty, pás 5 - bunku GOTO-P3 neuroblastomu, pás 6 - bunku HL60 promyelocytickej leukémie, pás 7 - bunku Bowes myelomu a pás 8 - bunku MCF-7 rakoviny prsníka.

Obrázok 4 je elektroforetogram ukazujúci výsledky Westernovho blotovania uskutočneného v príklade 4.

Na tomto obrázku pásy 1 a 2 sú pre bunkový lysát, každý pás 3 a 4 pre kultivačný supernatant a pás 5 - prázdny (supernatant kultivácie samotných buniek COS-7).

Obrázok 5 ukazuje nukleotidovú sekvenciu DNA získanú v príklade 5, ktorá kóduje proteín podľa predloženého vynálezu rovnako ako aminokyselinovú sekvenciu od nej odvodenú.

Obrázok 6 je elektroforetogram ukazujúci výsledky Northernovho blotovania uskutočneného v príklade 6.

Na obrázku je pás 9 pre bunku AGS ľudskej rakoviny žalúdka, pás 10 bunku PANC-1 ľudského karcinómu pankreasu, pás 11 - bunku AN3CA ľudského endometriomu, pás 12 - KLE ľudského endometriomu, ako pás 13 tak aj pás 14 - bunku W1353 ľudského chondrómu, pás 15 - bunku SKN ľudského endometriomu a pás 16 - bunku ACHN renálneho adenokarcinómu.

Obrázok 7 ukazuje výsledky stanovenia titrov protilátky v myšom antisére, ktoré sa uskutočnilo v príklade 14.

Na tomto obrázku ukazuje adsorbanciu jamky s pridaným myším antisérom 1, □ s pridaným myším antisérom 2, Δ s pridaným myším antisérom 3, Δ s pridaným myším antisérom 4, β s pridaným myším antisérom 5, O s pridaným myším antisérom 6, | s pridaným myším antisérom 7, a s pridaným myším antisérom 8.

Obrázok 8 ukazuje výsledky kompetitívnej EIA uskutočnenej v príklade

17.

Na tomto obrázku ukazuje hodnotu B/B_o pre monoklonálnu protilátku produkovanú hybridomom č. 39-35, □ hybridomom č. 53-16, Δ hybridomom č.

61-2, Δ hybridomom č. 76-12, β hybridomom č. 85-16, O hybridomom č.

112-3, φ hybridomom č. 128-18, hybridomomč. 139-216 a X hybridomom č. 151-2.

Faktor riedenia pre každý kultivačný supernatant bol nasledujúci.

č. 39-35: 50-krát,

č. 53-16: 50-krát,

č. 61-2: 120-krát,

č. 76-12: 60-krát,

č. 85-16: 120-krát,

č. 112-3: 450-krát,

č. 128-18: 450-krát,

č. 139-26: 120-krát a

č. 151-2: 60-krát.

Obrázok 9 ukazuje výsledky Westernovej blotovacej analýzy proteínu TGC838 a proteínu TGC839 ako sa uskutočnili v príklade 24. Na tomto obrázku každý z pásov 1, 3 a 5 znamená pás, ktorý sa získal elektroforézou kultivačného supernatantu CHO-K1/TGC838N-4, a každý z pásov 2, 4 a 6 kultivačného supernatantu CHOI-K1/618/839F6-3. Protilátka 128-18 (príklad 18) sa použila ako primárna protilátka pre pásy 1 a 2, protilátka 112-3 (príklad 18) pre pásy 3 a 4 a králičie antisérum (príklad 19) pre pásy 5 a 6.

Obrázok 10 ukazuje výsledky Westernovej blotovacej analýzy proteínu TGC838 a proteínu TGC839 uskutočnené v príklade 24. Na obrázku pás 1 a 2 znamená pás, ktorý sa získal elektroforézou kultivačného supernatantu COS7 s pCAN618/H838 DNA do nej zavedenou, pás 5 i pás 6 COS7 s pCAN618/H839F DNA do nej zavedenou, pás 7 i pás 8 COS7 s pCAN618 DNA do nej zavedenou. Ako primárna protilátka sa použilo myšie antisérum (príklad

12).

Obrázok 11 ukazuje výsledky Westernovej blotovacej analýzy proteínu

TGC838 a proteínu TGC839 uskutočnené v príklade 24. Na obrázku pás 3 i pás 4 znamená pás, ktorý sa získal elektroforézou kultivačného supernatantu

C0S7 s pCAN618/H838F DNA do nej zavedenou, pás 5 i pás 6 COS7 s pCAN618/H839F DNA do nej zavedenou a pás 7 i pás 8 COS7 s pCAN618 DNA do nej zavedenou. Ako primárna protilátka sa použil anti-FLAG myší IgG.

Obrázok 12 ukazuje výsledok testu imunoprecipitácie použitím protilátok oproti proteínu TGC838 a proteínu TGC839, ako sa uskutočnil v príklade 25.

Na tomto obrázku pás 1,3i pás 5 je pre kultivačný supernatant buniek COS7 s pCAN618/H838F DNA do nich zavedenou a pás 2, 4 i pás 6 buniek COS7 s pCAN618/H839F DNA do nich zavedenou. Imunoprecipitácia sa uskutočnila použitím protilátky 128-18 (príklad 18) pre pásy 1 a 2 a králičieho antiséra (príklad 19) pre pásy 3 a 4; pásy 5 a 6 sú kontroly (nepridala sa žiadna protilátka).

Obrázok 13 ukazuje výsledky testovania na potvrdenie pridania cukrového reťazca, ako sa uskutočnilo v príklade 26.

Na tomto obrázku pás 1 i pás 2 znamená pás, ktorý sa získal elektroforézou kultivačného supematantu buniek COS7 s pCAN618/H838 DNA do nich zavedenou, pás 3 i pás 4 buniek COS7 s pCAN618/H838F DNA do nich zavedenou, pás 5 i pás 6 buniek COS7 s pCAN618/H839F do nich zavedenou a pás 7 i pás 8 buniek COS7 s pCAN618 DNA do nich zavedenou. Pásy 1, 3 a 5 sú pásy získané na spracovanie s N-glykozidázou.

Obrázok 14 ukazuje pracovnú krivku, ktorá sa získala v príklade 28, zodpovedajúcu tabuľke 1.

Obrázok 15 ukazuje výsledky kvalitatívneho stanovenia TGC838, ktoré sa uskutočnilo v príklade 28.

Na tomto obrázku □ znamená množstvo TGC838 v kultivačnom supernatante CHO-K1/TGC838N-4, v kultivačnom supernatante COS7 s pCAN618/H838 DNA do nej zavedenou, O ^v kultivačnom supernatante SW1353-1 a Δ v kultivačnom supematente SW1353-2.

Obrázok 16 ukazuje výsledky kvalitatívneho stanovenia TGC838, ktoré sa uskutočnilo v príklade 28.

Na tomto obrázku O znamená hladinu TGC838 v plazme zdravých normálnych subjektov, 0 u pacientov s hepatokarcinómom a Δ u pacientov s kolorektálnym karcinómom.

Obrázok 17 ukazuje FACS analýzy uskutočnené v príklade 29.

Na tomto obrázku plná čiara označuje skupinu buniek s pridaním proteínu TGC839FLAG a čiarkovaná čiara skupinu buniek bez pridania proteínu TGC839FLAG.

Obrázok 18 ukazuje výsledky FACS analýzy uskutočnené v príklade 29.

Na tomto obrázku +FITC-TGC839F označuje skupinu buniek s pridaným proteínom TCG839FLAG a -FITC-TCG839F skupinu buniek bez pridania proteínu TGC839FLAG.

Obrázok 19 ukazuje výsledky testovania TGC839 proteínu uskutočneného v príklade 30 kvôli vplyvom cytotoxicity NK buniek. Na tomto obrázku O znamená koncentráciu 0 ng/ml TGC839FLAG, □ koncentráciu 50 ng/ml, Δ koncentráciu 150 ng/ml a 0 koncentráciu 500 ng/ml.

Obrázok 20 ukazuje výsledky testovania proteínu TGC839 uskutočneného v príklade 31 týkajúceho sa vplyvu na proliferáciu buniek NK.

Na tomto obrázku □ a O znamenajú vzorky periférnej krvi pochádzajúcej od rôznych jedincov.

Obrázok 21 ukazuje výsledky testovania proteínu TGC839 uskutočného v príklade 31 týkajúceho sa vplyvu na proliferáciu buniek K562.

Obrázok 22 ukazuje kvalitatívne vyhodnotenie kultivačného supematantu na IFN^y uskutočné v príklade 31.

Najlepšie spôsoby uskutočnenia predloženého vynálezu

Proteín (tu ďalej označovaný ako „proteín podľa predloženého vynálezu), ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu identickú alebo v podstate identickú s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou ako sekv. id. č. 1, môže znamenať proteín odvodený od buniek človeka alebo teplokrvného živočícha (napr. morčaťa, krysy, myši, kuraťa, králika, ošípanej, ovci, dobytka, opice) (napr. hepatocyty, splenocyty, nervové bunky, gliové bunky, pankreatické β bunky, bunky kostnej drene, mesangiové bunky, Langerhansove bunky, kožné bunky, epiteliálne bunky, endoteliálne bunky, fibroblasty, fibrocyty, myocyty, adipocyty, imunocyty (napr. makrofágy, T bunky, B bunky, prirodzené zabíjajúce bunky, žime bunky, neutrofily, basofily, eosinofily, monocyty), megakaryocyty, synoviálne bunky, chondrocyty, osteocyty, osteoblasty, osteoklasty, bunky prsnej žľazy, hepatocyty alebo intersticiálne bunky alebo bunky ich predka, kmeňové bunky alebo rakovinové bunky), alebo akékoľvek tkanivo obsahujúce takéto bunky, napríklad mozog, segment mozgu (ako je napr. čuchový hrbolok, amygdala, bazálny ganglion, hippocampus, talamus, hypotalamus, mozgová kôra, predĺžená miecha, malý mozog), chrbtica, podväzku mozgového, žalúdka, slinivky, ľadvín, pečene, žliaz, štítnej žľazy, žlčníka, kostnej drene, nadľadviniek, kože, svalu, pľúc, tráviaceho traktu (napr. hrubého čreva, tenkého čreva), krvných ciev, srdca, brzlíka, sleziny, submandibulárnej žľazy, periférnej krvi, prostaty, varlat, vaječníkov, placenty, maternice, kostí, kĺbov a skeletálnych svalov alebo od krvných buniek alebo od ich kultivovaných buniek (napr. MEL, M1, CTLL-2, HT2, WEHI-3, HL-60, JOSK-1, K562, ML-1, MOLT-3, MOLT-4, MOLT-10, CCRFCEM, TALL-1, Jurkat, CCRT-HSB-2, KE-37, SKW-3, HUT-78, HUT-102, H9, U937, THP-1, HEL, JK-1, CMK, KO-812, MEG-01), alebo môže znamenať syntetický proteín. Proteín podľa predloženého vynálezu pochádza s výhodou z fetálnych buniek (zvlášť fetálnych buniek mozgu alebo pľúc) človeka alebo teplokrvného živočícha (napr. morčaťa, krysy, myši, kuraťa, králika, ošípanej, ovci, dobytka, opice) alebo pochádza z rakovinových buniek.

Ako aminokyselinovú sekvenciu podľa predloženého vynálezu, ktorá je v podstate identická s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou ako sekv. id. č. 1, je možné uviesť mimo iného aminokyselinovú sekvenciu s nie menšou ako asi 70%, s výhodou nie menej ako 80%, výhodnejšie nie menej ako 90%, ešte výhodnejšie nie menej ako 95% homológiou s uvedenou aminokyselinovou sekvenciou uvedenou ako sekv. id. č. 1.

Výhodnými proteínmi podľa predloženého vynálezu, ktoré majú aminokyselinovú sekvenciu v podstate identickú s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou ako sekv. id. č. 1, sú napríklad proteíny s aminokyselinovou sekvenciou v podstate identickou s uvedenou aminokyselinovou sekvenciou uvedenou ako sekv. id. č. 1, ktoré majú v podstate rovnakú aktivitu ako sekvencia proteínu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. id. č. 1.

Podrobnejšie - je možné uviesť proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. id. č. 5 a podobne.

V podstate rovnaká aktivita, ako sa uvádza hore, je napríklad aktivita proliferácie buniek.

Ak sa uvádza „v podstate rovnaká aktivita“, tým sa rozumie, že obidve porovnávané aktivity sú rovnakej kvality (napr. fyziologicky alebo farmakologicky). Je teda výhodné, aby táto aktivita, ako je aktivita proliferácie buniek, bola porovnateľná (napr. asi 0,1 až 100-násobná, s výhodou 0,5 až 10násobná, výhodnejšie 0,5 až 2-násobná). Kvantitatívne prvky, ako je množstvo takejto aktivity a molekulová hmotnosť proteínu, sa však môžu líšiť.

Proliferácia buniek sa môže stanoviť akýmikoľvek všeobecne známymi spôsobmi, napríklad spôsobom testovania, ktorý sa tu ďalej uvádza.

Proteín podľa predloženého vynálezu zahrňuje tiež takzvané muteíny, ako sú napríklad proteíny obsahujúce 1) aminokyselinovú sekvenciu odvodenú od aminokyselinovej sekvencie uvedenej ako sekv. id. č. 1 deléciou 1 až 5 (s výhodou 1 až 3) aminokyselinových zvyškov, 2) aminokyselinovú sekvenciu odvodenú od aminokyselinovej sekvencie uvedenej ako sekv. id. č. 1 pridaním 1 až 10 (s výhodou 1 až 5 (výhodnejšie 1 až 3)) aminokyselinových zvyškov, 3) aminokyselinovú sekvenciu odvodenú od aminokyselinovej sekvencie uvedenej ako sekv. id. č. 1 inzerciou 1 až 5 (s výhodou 1 až 3) aminokyselinových zvyškov, 4) aminokyselinovú sekvenciu odvodenú od aminokyselinovej sekvencie uvedenej ako sekv. id. č. 1 substitúciou niektorým iným aminokyselinovým zvyškom alebo zvyškami 1 až 5 (s výhodou 1 až 3) aminokyselinových zvyškov alebo 5) aminokyselinovou sekvenciou odvodenou od ich kombinácie.

V prípade, že v aminokyselinovej sekvencií existuje inzercia, delécia alebo substitúcia, ako sa uvádza vyššie, miesto alebo miesta inzercie, delécie alebo substitúcie nie sú nijako obmedzené.

V predloženom spise sa proteíny opisujú podľa konvenčnej praxe opisovaním peptidov s N koncom (aminovým koncom) na ľavom konci a C koncom (karboxylový koniec) na pravom konci. V proteíne podľa predloženého vynálezu, typicky proteínu obsahujúceho aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. id. č. 1, C koniec zvyčajne znamená karboxylovú skupinu (—COOH) alebo karboxylát (—COO^-). C koniec môže však znamenať tiež amid (—CONH₂) alebo ester (—COOR).

V hore uvedenom estere R zvyčajne znamená alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, ako je metylová, etylová, propylová, izopropylová alebo butylová skupina, cykloalkylovú skupinu s 3 až 8 atómami uhlíka, ako je cyklopentylová alebo cyklohexylová skupina, arylovú skupinu so 6 až 12 atómami uhlíka, ako je fenylová alebo α-naftylová skupina, aralkylovú skupinu so 7 až 14 atómami uhlíka, napríklad fenyl-alkyl(s 1 až 2 atómami uhlíkKa)ovú skupinu, ako je benzylová alebo fenetylová skupina, alebo a-naftyl-alkyl(s 1 až 2 atómami uhlíka)ovú skupinu, ako je α-naftylmetylová skupina, a ďalej pivaloyloxymetylovú skupinu a podobné, ktoré sa zvyčajne používajú ako estery na orálne opodávanie.

V prípadoch, kde proteín podľa predloženého vynálezu má na iných miestach ako je C koniec karboxylovú (alebo karboxylátovú) skupinu alebo skupiny, tieto proteíny, v ktorých táto karboxylová skupina je amidovaná alebo esterifikovaná, tiež spadajú do rozsahu podľa predloženého vynálezu. Ester môže byť v takom prípade rovnaký ako vyššie uvedený C-koncový ester.

Proteín podľa predloženého vynálezu ďalej zahrňuje tie, ktorých Nkoncový zvyšok aminokyseliny (napr. metioninový zvyšok) sa chráni chrániacou skupinou (napríklad acylovou skupinou s 1 až 6 atómami uhlíka, napríklad formylovou skupinou, alebo alkanoylovou skupinou s 1 až 6 atómami uhlíka, ako je acetylová skupina), tie, v ktorých N-koncový glutamínový zvyšok, vytvorený pri in vivo štiepení, sa previedol na zvyšok pyroglutamovej kyseliny, tie, ktorých substituent(y) na bočnom reťazci (bočných reťazcoch) zvyšku aminokyseliny v molekule (napr. —OH, —SH, aminová skupina, imidazolová skupina, indolová skupina, guanidínová skupina) sa chránia príslušnou chrániacou skupinou (napr. acylovou skupinou s 1 až 6 atómami uhlíka, napríklad formylovou skupinou, alebo alkanoylovou skupinou s 1 až 6 atómami uhlíka, ako je acetylová skupina), a konjugované proteíny, napríklad takzvané glykoproteíny pochádzajúce z nadviazania cukrového reťazca.

Ako špecifické príklady proteínu podľa predloženého vynálezu sú užitočné, okrem iných, proteín pochádzajúci z človeka (obr. 1) s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou ako sekv. id. č. 1 a proteín odvodený od človeka (obr. 5) s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou ako sekv. id. č. 5.

Proteín podľa predloženého vynálezu sa vyznačuje tým, že sa exprímuje špecificky v rakovinových bunkách alebo vo fetálnom mozgu, fetálnych pľúcach alebo podobne, s výhodou v rakovinových bunkách.

Čiastočný peptid podľa predloženého vynálezu, ktorý je derivátom vyššie uvedeného proteínu, môže znamenať akýkoľvek čiastočný peptidový derivát vyššie uvedeného proteínu podľa predloženého vynálezu, ktorý s výhodou má rovnakú aktivitu (napríklad aktivitu proliferujúcu bunky), ako vyššie uvedený proteín podľa predloženého vynálezu. Používajú sa napríklad peptidy, ktoré majú aspoň 20 %, s výhodou nie menej ako asi 50 %, výhodnejšie nie menej ako 70 %, ešte výhodnejšie nie menej ako 90 %, najvýhodnejšie nie menej ako 90 % aminokyselinovej sekvencie predstavujúcej proteín podľa predloženého vynálezu a ktoré majú aktivitu proliferácie buniek.

Z týchto peptidov sú užitočné napríklad tie peptidy, ktoré majú aminokyselinovú sekvenciu pokrývajúcu 22. až 252., 26. až 252. alebo 26. až

34. (zvlášť 26. až 252. alebo 26. až 34., s výhodou zvlášť 26. až 34.) aminokyselinové zvyšky aminokyselinovej sekvencie ako je sekv. id. č. 1 alebo aminokyselinové sekvencie pokrývajúce 22. až 246., 26. až 246. alebo 166. až 190. (zvlášť 26. až 246. alebo 166. až 190., s výhodou zvlášť 166. až 190.) aminokyselinové zvyšky aminokyselinovej sekvencie uvedenej ako sekv. id. č. 5.

V čiastočnom peptide podľa predloženého vynálezu môže byť 1 až 5 (s výhodou 1 až 3) zvyškov aminokyselín deletované z jeho aminokyselinovej sekvencie alebo 1 až 10 (s výhodou 1 až 5 (výhodnejšie 1 až 3)) zvyškov aminokyselín pridané k jeho aminokyselinovej sekvencii alebo 1 až 5 (s výhodou 1 až 3) zvyškov aminokyselín vložené do jeho aminokyselinovej sekvencie alebo 1 až 5 (s výhodou 1 až 3) zvyškov aminokyselín v jeho aminokyselinovej sekvencii substituované niektorými inými zvyškami aminokyselín.

Čiastočný peptid podľa predloženého vynálezu má zvyčajne karboxylovú skupinu (—COOH) alebo karboxylát (-COO^-) ako C koniec, ale, ako sa uvádza vyššie, vzhľadom k proteínu podľa predloženého vynálezu, jeho C koniec môže znamenať amid (—CONH₂) alebo ester (—COOR) (R znamená ako sa uvádza vyššie).

Ďalej potom, podobne ako vyššie uvedený proteín podľa predloženého vynálezu, čiastočný peptid podľa predloženého vynálezu môže zahrňovať tiež tie, v ktorých aminová skupina N-koncového zvyšku aminokyseliny (napr. metioninový zyvšok) sa chráni chrániacou skupinou, tie, v ktorých glutamínový zvyšok na strane N-konca vytvorený pri in vivo štiepení sa previedol na zvyšok pyroglutamovej kyseliny, tie, v ktorých substituent na bočnom reťazci zvyšku aminokyseliny v molekule sa chráni príslušnou chrániacou skupinou, alebo konjugované peptidy, ako sú takzvané glykopeptidy pochádzajúce z nadviazania cukrového reťazca.

Čiastočný peprid podľa predloženého vynálezu sa môže používať ako antigén na tvorbu protilátky a preto nie vždy potrebuje mať aktivitu proliferácie buniek.

Pokiaľ ide o formu soli proteínu alebo čiastočného peptidu podľa predloženého vynálezu, používajú sa soli s fyziologicky prijateľnými kyselinami (napríklad anorganickými kyselinami, organickými kyselinami) alebo zásadami (napríklad alkalických kovov) alebo podobné a, okrem iných, výhodné sú fyziologicky prijateľné adičné soli s kyselinami. Ako takéto soli je možné, okrem iných, používať soli s anorganickými kyselinami (napríklad kyselinu chlorovodíkovú, kyselinu fosforečnú, kyselinu bromovodíkovú, kyselinu sírovú) alebo soli s organickými kyselinami (napríklad kyselinu octovú, kyselinu mravčiu, kyselinu proponovú, kyselinu fumárovú, kyeselinu maleínovú, kyselinu jantárovú, kyselinu vínnu, kyselinu citrónovú, kyselinu jablčnú, kyselinu šťaveľovú, kyselinu benzoovú, kyselinu metánsulfónovú a kyselinu benzénsulfónovú).

Proteín podľa predloženého vynálezu, vrátane jeho soli, sa môže vyrábať z vyššie uvedených buniek človeka alebo teplokrvného živočícha (zvlášť rakovinových buniek alebo podobných) alebo tkaniva človeka alebo teplokrvného živočícha (zvlášť fetálneho mozgu alebo pľúc alebo podobných) všeobecne známym spôsobom čistenia proteínov, alebo sa môže vyrábať kultivovaním transformantu nesúceho DNA kódujúcu tento proteín, ako sa tu bude uvádzať neskôr. Môže sa vyrábať tiež sp ôsobom syntézy peptidov, ako sa tu bude uvádzať ďalej.

Pri výrobe z ľudského alebo cicavčieho tkaniva alebo buniek (zvlášť rakovinových buniek, fetálneho mozgu alebo pľúc alebo podobných) sa ľudské alebo cicavčie tkanivo alebo bunky homogenizujú a potom sa extrahujú napríklad kyselinou a extrakt sa podrobí kombinovaným chromatografickým technikám, ako je chromatografia na obrátených fázach a chromatografia na ionexe, pričom sa proteín môže izolovať a vyčistiť.

Pri syntetizovaní proteínu alebo čiastočného peptidu podľa predloženého vynálezu, vrátane ich solí alebo ich amidovej formy, sa môže na syntézu proteínu použiť syntetická živica, ktorá je všeobecne dostupná na trhu. Ako táto živica sa tu môžu uviesť napríklad chlórmetylové živice, hydroxymetylové živice, benzhydrylaminové živice, aminometylové živice, 4-benzyloxybenzylalkoholové živice, 4-metylbenzhydrylaminové živice, PAM živice,

4-hydroxylmetylmetylfenylacetamidometylové živice, polyakrylamidové živice,

4-(2',4'-dimetoxyfenylhydroxymetyl)fenoxyživice, 4-(2',4'-dimetoxyfenyl-Fmocaminoetyl)fenoxyživice a podobne. Použitím takejto živice sa aminokyseliny s α-aminovou skupinou a príslušne chránenou funkčnou skupinou bočného reťazca podrobia kondenzácii na živici všeobecne známym kondenzačným spôsobom podľa sekvencie požadovaného proteínu. Po poslednej reakcii sa proteín vyštipne zo živice a v ten istý čas sa odstránia rôzne chrániace skupiny. Ďalej sa uskutoční vo veľmi zriedenom roztoku reakcia, pri ktorej sa vytvorí intramolekulová disulfidová väzba, pričom sa môže získať požadovaný proteín alebo jeho amidová forma.

Čo sa týka hore uvedenej kondenzácii chránených aminových skupín, môžu sa použiť rôzne aktivačné reakčné činidlá použiteľné pri syntéze proteínov, zvlášť výhodné sú karbodiimidy. Zvyčajnými karbodiimidmi, okrem iných, sú DCC, Ν,Ν'-diizopropylkarbodiimid a N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)20 karbodiimid. Pre aktiváciu týmito amidmi sa každá chránená aminoskupina môže pridať priamo k živici spoločne s prísadou inhibujúcou racemizáciu (napríklad HOBt, HOOBt) alebo sa každá chránená aminoskupina môže aktivovať ako symetrický anhydrid kyseliny alebo ako HOBt alebo HOOBt ester vopred a potom pridať k živici.

Rozpúšťadlo, ktoré sa používa pri aktivácii chránených aminokyselín alebo pri ich kondenzácii so živicou, sa môže príslušne vybrať z tých, ktoré sú známe ako použiteľné pri kondenzačných reakciách proteínov. Tak sa napríklad môžu použiť amidy kyselín, ako je N,N-dimetylformamid, N,N-dimetylacetamid a N-metylpyrolidón, halogenované uhľovodíky, ako je metylénchlorid a chloroform, alkoholy, ako je trifluóretanol, sulfoxidy, ako je dimetylsulfoxid, pyridín, étery, ako je dioxán a tetrahydrofurán, nitrily, ako je acetonitril a propionitril, estery, ako je metylacetát a etylacetát, a ich príslušné zmesi. Reakčná teplota sa zvyčajne vyberie z rozmedzia, o ktorom je známe, že je použiteľné pri reakciách, pri ktorých sa tvorí väzba, zvyčajne v rozmedzí asi -20 °C až 50 °C. Každý aktivovaný derivát aminokyseliny sa zvyčajne používa v 1,5 až 4-násobnom prebytku. Ak testovanie ninhydrínovou reakciou ukazuje, že kondenzácia je nedostatočná, kondenzačná reakcia sa môže zopakovať bez odstránenia chrániacej skupiny tak, aby sa dosiahla dostatočná kondenzácia. Ak sa nemôže dosiahnuť dostatočná kondenzácia ani opakovaním reakcie, nezreagovaná aminokyselina sa môže stať inertná k nasledujúcim reakciám acetylácie tejto kyseliny použitím anhydridu kyseliny octovej alebo acetylimidazolu.

Ako chrániace skupiny pre aminovú skupinu každého východiskového materiálu sú užitočné napríklad Z, Boe, terc.pentyloxykarbonyl, izobornyloxykarbonyl, 4-metoxybenzyIoxykarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxykarbonyl, trifluóracetyl, ftaloyl, formyl, 2-nitrofenylsulfenyl, difenylfosfinotioyl, F-moc a podobné.

Karboxylová skupina sa môže chrániť napríklad alkylovou esterifikáciou (napr. metylovou, etylovou, propylovou, butylovou, terc.butylovou, cyklopentylovou, cyklohexylovou, cykloheptylovou, cyklooktylovou, 2-adaman21 tylovou alebo podobnou alkylovou esterifikáciou alkylovou skupinou s rovným, rozvetveným alebo cyklickým alkylom), aralkylovou esterifikáciou (napr. benzylovou esterifikáciou, 4-nitrobenzylovou esterifikáciou, 4-metoxybenzylovou esterifikáciou, 4-chlórbenzylovou esterifikáciou alebo benzhydrylovou esterifikáciou), fenacylovou esterifikáciou, tvorbou benzyloxykarbonylhydrazidu, tvorbou terc. butoxykarbonylhydrazidu alebo tvorbou tritylhydrazidu.

Hydroxylové skupina serínu sa môže chrániť esterifikáciou alebo eterifikáciou. Ako skupinu vhodnú na túto esterifikáciu je možné použiť napríklad nižšie alkanoylové skupiny s 1 až 6 atómami uhlíka, ako je acetylová skupina, aroylová skupina, ako je benzoylová skupina, a skupiny odvodené od kyseliny uhličitej, ako je benzyloxykarbonylová a etoxykarbonylová skupina. Ako skupinu vhodnú na eterifikáciu je možné uviesť napríklad benzylovú, tetrahydropyranylovú a terc.butylovú skupinu.

Ako chrániaca skupina fenolickej hydroxylovej skupiny tyrozínu je užitočná napríklad skupina Bzl, Ch-Bzl, 2-nitrobenzylová skupina, Br-Z a terc.butylová skupina.

Ako chrániaca skupina imidazolu histidínu je užitočná napríklad skupina Tos, 4-metoxy-2,3,6-trimetylbenzénsulfonylová skupina, DNP, benzyloxymetylová skupina a skupina Bum, Boe, Trt a Fmoc.

Medzi aktivované formy karboxylovej skupiny každého východiskového materiálu patria, okrem iných, zodpovedajúci anhydrid kyseliny, azid a aktivované estery [estery s alkoholmi (napríklad pentachlórfenolom, 2,4,5-trichlórfenolom, 2,4-dinitrofenolom, kyanmetylalkoholom, p-nitrofenolom, HONB, N-hydroxysukcínimidom, N-hydroxyftalimidom a HOBt)]. Aktivovanou formou aminovej skupiny každého z východiskových materiálov je napríklad zodpovedajúci amid kyseliny fosforečnej.

Ako spôsob odstránenia (eliminácie) chrániacej skupiny je možné, okrem iného, použiť katalytickú redukciu v prúde vodíka v prítomnosti takého katalyzátora, ako je paládiová č erň alebo paládium na uhlí, spracovanie s kyselinou, ako je bezvodá kyselina fluorovodíková, kyselina metánsulfónová, kyselina trifluórmetánsulfónová, kyselina trifluóroctová alebo ich zmes, spracovanie so zásadou, ako je diizopropyletylamín, trietylamín, piperidín alebo piperazin, alebo redukciu sodíkom v kvapalnom amoniaku. Hore uvedené spracovanie eliminačnej reakcie sa zvyčajne uskutočňuje pri teplote od asi -20 °C do 40 °C a pri kyslom spracovaní je účinné pridať vychytávač katiónov, ako je anizol, fenol, tioanizol, m-krezol, p-krezol, dimetylsulfid, 1,4-butánditiol alebo

1,2-etánditiol. 2,4-Dinitrofenylová skupina, ktorá sa používa ako imidazolová chrániaca skupina pre histidín sa môže odstrániť spracovaním s tiofenoiom a formylová skupina, ktorá sa používa ako indolová chrániaca skupina pre tryptofán sa môže odstrániť spracovaním s kyselinou odstraňujúcou chránenie za prítomnosti vyššie uvedeného 1,2-etánditiolu, 1,4-butánditiolu alebo podobne, rovnako ako spracovaním s alkáliou, ako je zriedený vodný hydroxid sodný, zriedený amoniak alebo podobne.

Chránenie funkčnej skupiny, ktorá by sa nemala zahrnúť do reakcie, chrániaca skupina, ktorá sa má použiť, odstránenie chrániacej skupiny a aktivácia funkčných skupín, ktoré sú zahrnuté v reakcii, mimo iných, sa môžu vybrať zo všeobecne známych skupín alebo zo všeobecne známych spôsobov.

Alternatívny spôsob získania proteínu v amidovej forme zahrňuje napríklad najskôr chránenie α-karboxylovej skupiny karboxylového konca aminokyseliny amidáciou, nasleduje predĺženie peptidového (proteínového) reťazca na požadovanú dĺžku reťazca na strane aminovej skupiny, kedy sa získava proteín odvodený od uvedeného peptidového reťazca odstránením iba chrániacej skupiny na N-konci α-aminovej skupiny a proteín odvodený odstránením iba chrániacej skupiny na C-konci karboxylovej skupiny, a obidva proteíny sa v zmesnom rozpúšťadle podrobia kondenzačnej reakcii, ako sa uvádza vyššie. Podrobnosti kondenzačnej reakcie sú uvedené vyššie. Chránený proteín, ktorý sa získa kondenzáciou sa vyčistí a potom sa všetky chrániace skupiny odstránia vyššie uvedenými spôsobmi, pričom sa môže získať požadovaný surový proteín. Tento surový proteín sa môže vyčistiť úplným využitím rôznych známych prostriedkov na čistenie a hlavná frakcia sa lyofilizuje, aby sa získal požadovaný proteín v amidovej forme.

Na získanie proteínu v esterovej forme sa napríklad a-karboxylová skupina karboxylového konca aminokyseliny podrobí kondenzácii s požadovaným alkoholom. Získa sa napríklad ester aminokyseliny, potom nasleduje výroba požadovaného proteínu vo forme esteru rovnakým spôsobom ako pri proteíne vo forme amidu.

Čiastočný peptid alebo jeho soľ podľa predloženého vynálezu sa môžu vyrobiť akýmikoľvek všeobecne známymi spôsobmi syntézy peptidov alebo štiepením proteínu podľa predloženého vynálezu príslušnou peptidázou. Tento spôsob syntézy peptidov môže znamenať syntézu v pevnej fáze alebo syntézu v kvapalnej fáze. Čiastočný peptid alebo aminokyselina schopné konštituovať čiastočný peptid podľa predloženého vynálezu sa skondenzujú so zostávajúcou časťou čiastočného peptidu, nasleduje odstránenie chránenia, ak kondenzačný produkt má chrániacu skupinu (skupiny), pričom sa môže získať požadovaný peptid. Ako všeobecne známe spôsoby kondenzácie a spôsoby odstránenia chrániacich skupín sa môžu uviesť napríklad spôsoby, ktoré sa opisujú v nasledujúcich citáciách:

1) M. Bodansky a M. Ondetti: Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York 1966,

2) Schroeder a Luebke: The Peptide, Academic Press, New York 1965,

3) Nobuo Izumiya a spol: Peputido Gosei no Kisoto Jikken (Peptide Synthesis, Fundamentals and Experiments), Maruzen 1975,

4) Harujai Yajima a Shumpei Sakakibara: Seikagaku Jikken Koza (Lectured in Biochemistry) 1, Tampakushitsu no Kagaku (Chemistry of Proteins) 1977,/1/,205, a

5) Haruaki Yajima (red.): Zoku lyakuhin no Kaihatsu (Development of Drugs, druhý rad), diel 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten.

Po skončení všetkých reakcií sa čiastočný peptid podľa predloženého vynálezu môže vyčistiť a izolovať napríklad príslušnou kombináciou spôsobov, r 24 ktoré sa vyberú z extrakcie rozpúšťadlom, destilácie, chromatografie na kolóne, kvapalinovej chromatografie, rekryštalizácie a tak ďalej. Ak sa hore uvedenými spôsobmi získava čiastočný peptid vo voľnej forme, môže sa premeniť na príslušnú soľ všeobecne známym spôsobom alebo jeho modifikáciou. Ak sa naopak získava vo forme soli, táto soľ sa môže premeniť na voľnú formu alebo inú soľ všeobecne známym spôsobom alebo jeho modifikáciou.

DNA kódujúca proteín podľa predloženého vynálezu môže znamenať akúkoľvek DNA za predpokladu, že obsahuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu vyššie uvedený proteín podľa predloženého vynálezu. Môže znamenať genomovú DNA, genomovú DNA knižnicu, cDNA odvodenú od akýchkoľvek hore uvedených buniek alebo tkanív, cDNA knižnicu odvodenú od akýchkoľvek hore uvedených buniek alebo tkanív, alebo syntetickú DNA. Vektor, ktorý sa používa na konštrukciu knižnice, môže znamenať akýkoľvek vektor, napríklad bakteriofág, plazmid, kozmid alebo fagimid. Je taktiež možná priama amplifikácia reverznou transkriptázovou polymerázovou reťazovou reakciou (tu ďalej stručne označovaná ako RT-PCR) použitím celkovej RNA alebo mRNA frakcie pripravenej z akýchkoľvek hore uvedených buniek alebo tkanív.

DNA kódujúca proteín podľa predloženého vynálezu znamená napríklad 1) DNA obsahujúca nukleotidovú sekvenciu uvedenú ako sekv. id. č. 2, alebo DNA, ktorá má nukleotidovú sekvenciu hybridizovateľnú s nukleotidovou sekvenciou uvedenou ako sekv. id. č. 2 pri vysokoselektívnych podmienkach a kódujúca proteín, ktorý má v podstate rovnakú aktivitu (napr. aktivitu proliferujúcu bunky), ako je aktivita proteínu podľa predloženého vynálezu, 2) DNA obsahujúca nukleotidovú sekvenciu uvedenú ako sekv. id. č. 6 alebo DNA, ktorá má nukleotidovú sekvenciu hybridizovateľnú s nukleotidovou sekvenciou uvedenou ako sekv. id. č. 6 pri vysokoselektívnych podmienkach a kódujúca proteín, ktorý má v podstate rovnakú aktivitu (napr. aktivitu proliferujúcu bunky), ako je aktivita proteínu podľa predloženého vynálezu, alebo akúkoľvek inú podobnú.

Podrobnejšie - napríklad, okrem iného, sa používa ako DNA kódujúca proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. id. č. 1, DNA, ktorá má nukleotidovú sekvenciu uvedenú ako sekv. id. č. 2, a ako DNA kódujúca proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. id. č. 5, DNA, ktorá má nukleotidovú sekvenciu uvedenú ako sekv. id. č. 6.

DNA kódujúca čiastočný peptid podľa predloženého vynálezu môže znamenať akúkoľvek DNA za predpokladu, že obsahuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu hore uvedený čiastočný peptid podľa predloženého vynálezu. Môže znamenať genomovú DNA, genomovú DNA knižnicu, cDNA odvodenú od akýchkoľvek hore uvedených buniek alebo tkanív, cDNA odvodenú od akýchkoľvek hore uvedených buniek alebo tkanív alebo syntetickú DNA.

DNA kódujúca čiastočný peptid podľa predloženého vynálezu znamená napríklad 1) DNA, ktorá má čiastočnú nukleotidovú sekvenciu, DNA, ktorá má nukleotidovú sekvenciu uvedenú ako sekv. id. č. 2, alebo DNA, ktorá má nukleotidovú sekvenciu hybridizovateľnú s nukleotidovou sekvenciou uvedenou ako sekv. id. č. 2 pri vysokoselektívnych podmienkach a ktorá má časť nukleotidovej sekvencie DNA kódujúca proteín, ktorý má v podstate rovnakú aktivitu ako je aktivita proteínu podľa predloženého vynálezu, 2) DNA, ktorá má čiastočnú nukleotidovú sekvenciu, DNA, ktorá má nukleotidovú sekvenciu uvedenú ako sekv. id. č. 6, alebo DNA, ktorá má nukleotidovú sekvenciu hybridizovateľnú s nukleotidovou sekvenciou uvedenou ako sekv. id. č. 6 pri vysokoselektívnych podmienkach a ktorá má časť nukleotidovej sekvencie DNA kódujúca proteín, ktorý má v podstate rovnakú aktivitu, ako je aktivita proteínu podľa predloženého vynálezu, alebo akúkoľvek inú podobnú.

Spôsoby klonovania DNA úplne kódujúce proteín alebo čiastočný peptid podľa predloženého vynálezu (tu ďalej pri vysvetlovaní klonovania a expresie DNA kódujúca proteín alebo podobne sa proteín alebo podobne niekedy pre skrátenie označuje ako „proteín podľa predloženého vynálezu“) môžu zahrňovať uskutočnenie amplifikácie všeobecne známym PCR spôsobom použitím syntetických DNA primérov, ktoré majú príslušné čiastočné nukleotidové sekvencie proteínu podľa predloženého vynálezu, alebo triedením DNA inkorporovanej v príslušnom vektore hybridizáciou značenou formou DNA fragmentu alebo syntetickej DNA kódujúcu časť alebo celý proteín podľa predloženého vynálezu. Hybridizácia sa môže uskutočňovať napríklad podľa spôsobu opísaného v Molecular Cloning, druhé vydanie (J. Sambrook a spol., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989.). Ak sa používa komerčná knižnica, môže sa postupovať podľa postupu opísaného v príručke k nej pripojenej.

Nukleotidová sekvencia DNA sa môže modifikovať napríklad prerušovaným duplexovým spôsobom, Kunkelovým spôsobom alebo podobným všeobecne známym spôsobom alebo jeho modifikáciou použitím všeobecne známej zostavy, napríklad Mutan™-G (Takara Shuzo) alebo Mutan™-K (Takara Shuzo).

Klonovaná, proteín kódujúca DNA sa môže použiť napríklad ako taká alebo, ak sa to požaduje, po štiepení reštrikčným enzýmom alebo po pridaní linkera. Uvedená DNA má ATG ako iniciačný kodón translácie na 5'-koncovej strane a môže mať TAA, TGA alebo TAG ako terminačný kodón translácie na 3'-koncovej strane. Tento iniciačný kodón a/alebo terminačný kodón translácie sa môžu použiť tiež ako príslušný syntetický DNA adaptor.

Expresný vektor pre proteín podľa predloženého vynálezu sa môže vyrábať napríklad a) vyštiepením požadovaného DNA fragmentu z DNA kódujúcu proteín podľa predloženého vynálezu a b) pripojením DNA fragmentu do príslušného expresného vektora v mieste po smere reťazca od promótora.

Ako vektor sú užitočné plazmidy odvodené od Escherichia coli (napr. pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), plazmidy odvodené od Bacillus subtilis (napr. pUB110, pTP5, PC194), plazmidy odvodené od kvasiniek (napr. pSH19, pSH15), bakteriofágy, ako je γ fág, retrovíry, vírus vakcínie, baculovíry a ďalšie živočíšne víry a, ďalej pA-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNA/Neo a tak ďalej.

Promótor, ktorý sa používa v praxi podľa predloženého vynálezu, môže znamenať akýkoľvek promótor za predpokladu, že je vhodný pre hostiteľa, ktorý sa používa na expresiu géna a zahrňuje, okrem iného, SRa promótor, SV40 včasný promótor, HIV LTR promótor, CMV promótor a HSV-TK promótor pre živočíšne hostiteľské bunky.

Z nich sa s výhodou používajú CMV (cytomegalovírus) promótor, SRa promótor a podobné. Ak je hostiteľom Escherichia, výhodné sú trp promótor, lac promótor, recA promótor, yPL promótor, Ipp promótor, T7 promótor a podobné, ak je hostiteľom Bacillus, výhodné sú SPO1 promótor, SPO2 promótor, penP promótor a podobné, a ak je hostiteľom kvasinka, výhodnými promótormi sú pHO5 promótor, pGK promótor, GAP promótor, ADH promótor a podobné. Ak hostiteľ znamená bunku hmyzu, výhodné sú polyhedridový promótor, P10 promótor a podobné.

Užitočnými sú, ak sa to požaduje, ako expresný vektor vedľa vyššie uvedených tiež tie, ktoré obsahujú zosilňovač, strihový signál, poly(A)adenylačný signál, selektívny marker, začiatok replikácie SV40 (tu niekedy označovaný ako SV40ori), alebo podobné. Ako selektívny marker je možné uviesť napríklad gén [gén rezistencie na metotrexát (MTX)] dihydrofolátreduktázy (tu niekedy ďalej označovaný ako dhrf), gén amplicilínovej rezistencie (tu niekedy označovaný ako Amp^r), gén rezistencie na neomycín (tu ďalej niekedy označovaný ako Neo^r, G418 rezistencie) a podobné. Zvlášť vtedy, ak sa ako selektívny marker používa dhfr gén použitím buniek čínskeho škrečka deficitných na gén dhfr, môžu sa rekombinantné bunky vybrať tiež použitím média bez tymidínu.

Ďalej potom, ak je to nevyhnutné, signálna sekvencia pre hostiteľa sa pridá na N-koncovú stranu proteinu podľa predloženého vynálezu. Ak je hostiteľom Escherichia, môže sa použiť PhoA signálna sekvencia, OmpA signálna sekvencia alebo podobné. Ak je hostiteľom Bacillus, môže sa použiť α-amylázová signálna sekvencia, subtilicínová signálna sekvencia alebo podobná sekvencia, ak je hostiteľom kvasinka, môže sa použiť MFa signálna sekvencia, SUC2 signálna sekvencia alebo podobná sekvencia, ak je hostiteľom živočíšna bunka, môže sa použiť inzulínová signálna sekvencia, a28 interfemová signálna sekvencia, signálna sekvencia molekuly protilátky alebo podobné sekvencie.

Použitím takto skonštruovaného vektora obsahujúceho DNA proteín podľa predloženého vynálezu sa môže vyrobiť transformant.

Ako hostiteľ sú užitočné napríklad Escherichia, Bacillus, kvasinky, bunky hmyzu, hmyz, živočíšne bunky a tak ďalej.

Ako špecifické príklady Escherichia sa môžu použiť Escherichia coli K12 DH1 [Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 1968, 60, 160.], JM103 [Nucleic Acids Research 1981, 9, 309.], JA221 [Journal of Molecular Biology 1978, 120, 517.], HB101 [Journal of Molecular Biology 1969, 41,459.], C600 [Genetics 1954, 39, 440.] a podobné.

Ako príklady Bacillus, ktoré sa používajú, sa môžu uviesť napríklad Bacillus Subtilis MI114 [Gene1983, 24 (1983.)] a 207-21 [Journal of Biochemistry 1984, 95, 87.].

Ako príklady kvasiniek sa môžu používať Saccharomyces cerevisia AH22, AH22R“, NA87-11A, DKD-5D a 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913 a NCYC2036, Pichia Pastoris KM71 a podobné.

Ako príklady buniek hmyzu sa môžu používať od lariev vojnice na kapuste odvodenej bunkovej línie (bunky Spodoptera frugioerda; Sf bunky), bunky MG1 odvodené od mezenteronu Trichoplusia ni, bunky High Five TM pochádzajúce z vajíčok Trichoplusia ni, bunky odvodené od Mamestra brassicae, bunky odvodené od Estigmenta acrea a podobné, ak je vírom AcNPV, a od priadky morušovej odvodené bunkové línie (Bombyx mori N bunky; BmN bunky) a podobné, ak je vírom BmNPV. Ako Sf bunky sa môžu používať Sf9 bunky (ATCC CRL 1711) a Sf21 bunky (pre obidve: Vaughn J. L. a spol.: In Vivo 1977, 13, 213 až 217.). okrem iných.

Ako hmyz sú užitočné larvy priadky morušovej a podobné [Maeda a spol.: Náture 1985, 315, 592.].

Ako živočíšne bunky sú užitočné napríklad opičie COS-7 bunky, Vero, CHO bunky čínskeho škrečka (tu ďalej stručne označované ako CHO bunky), CHO bunky čínskeho škrečka deficitné na dhfr gén (tu ďalej označované stručne ako CHO(dhfr) bunky), myšie L bunky, myšie AtT-20, myšie myelomové bunky, krysie GH3 a ľudské FL bunky. Ďalej sa môžu používať tiež rôzne normálne ľudské bunky, ako sú hepatocyty, splenocyty, nervové bunky, gliové bunky, pankreatické β-bunky, bunky kostnej drene, mesangiové bunky, Langerhansove bunky, kožné bunky, epiteliálne bunky, endoteliálne bunky, fibroblasty, fibrocyty, myocyty, tukové bunky, imunocyty (napr. makrofágy, T bunky, B bunky, prirodzené zabíjajúce bunky, žírne bunkym neutrofily, basofily, eosinofily, monocyty), megakaryocyty, synoviálne bunky, chondrocyty, osteocyty, osteoblasty, osteoklasty, bunky prsnej žľazy, hepatocyty a intersticiálne bunky, prekurzorové bunky týchto buniek, kmeňové bunky, rakovinové bunky atď.).

Transformácia Escherichia sa môže uskutočniť napríklad spôsobom, ktorý sa opisuje v Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1972, 69, 2110 alebo v Gene 1982, 17, 107.

Transformácia Bacillus sa môže uskutočniť napríklad spôsobom, ktorý sa opisuje v Molecular & General Genetics 1979, 168,111.

Transformácia kvasinkových buniek sa môže uskutočniť napríklad spôsobom, ktorý sa opisuje v Methods in Enzymology 1991, 194, 182 až 187 alebo v Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1978, 75,1929.

Transformácia buniek hmyzu alebo hmyzu sa môže uskutočniť napríklad spôsobom, ktorý sa opisuje v Bio/Technology 1988, 6, 47 až 55.

Transformácia živočíšnych buniek sa môže uskutočniť napríklad spôsobom, ktorý sa opisuje v Saibo Kogaku Bessatsu (Celí Engineering) (zvláštne čísi 8, Shin Saibo Kogaku Jikken Purotokuro (Protocols for Experíments in Celí Engineering, revised) 1995, 263 až 267 (publikované Shujunsha), alebo Virology 1973, 52, 456.

Týmto spôsobom je možné získať transformant, ktorý sa transformuje expresným vektorom, obsahujúcim DNA kódujúcu proteín.

Pri kultivovaní hostiteľa, ktorým je transformant patriaci do rodu Escherichiaalebo Bacillus, je ako médium pre použitie na kultiváciu vhodné kvapalné médium. Toto médium obsahuje zdroj(e) uhlíka, zdroj(e) dusíka, anorganickú látku (anorganické látky) a tak ďalej. Medzi zdroje uhlíka patria, okrem iných, glukóza, dextrín, rozpustný škrob a sacharóza, medzi zdroje dusíka patria, okrem iných, amonné soli, dusičnanové soli, kukuričné médium označované com steep, pepton, kazeín, mäsový extrakt, koláč sojového bôbu, zemiakové extrakty a podobné anorganické a organické látky. Medzi anorganické látky, patria, okrem iných, chlorid draselný, dihydrogénfosforečnan sodný a chlorid horečnatý. Môžu sa pridávať tiež kvasinkový extrakt, vitamíny a/alebo faktory podporujúce rast. Médium má s výhodou pH asi 5 až 8.

Ako médium na kultivovanie Escherichia je výhodné napríklad M9 médium (Miller: Journal of Experíments in Molecular Genetics 1972, 431 až 433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), ktoré obsahuje glukózu a kasaminokyseliny. Pre účinnú funkciu promótora sa môže k nemu pridať, ak je to potrebné, také činidlo, ako je 3p-indolylakrylová kyselina.

Ak je hostiteľom Escherichia, kultivácia sa uskutočňuje zvyčajne asi 3 až 24 hodín pri asi 15 až 43 °C. Ak je to nevyhnutné, môže sa použiť prevzdušňovanie a/alebo miešanie.

Ak je hostiteľom Bacillus, kultivácia sa zvyčajne uskutočňuje asi 6 až 24 hodín pri asi 30 až 40 °C. Ak je to nevyhnutné, môže sa použiť prevzdušňovanie a/alebo miešanie.

Pri kultivovaní hostiteľa, ktorým je kvasinkový transformant, médium znamená napríklad Burkholderovo minimálne médium [Bostian K. L. a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980, 77, 4505.] alebo SD médium [Bitter G. A. a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81, 5330.], ktoré obsahuje 0,5 % hmotn. kasaminokyselín. Hodnota pH média sa s výhodou upraví na asi 5 až 8. Kultivácia sa uskutočňuje všeobecne pri asi 20 až 35 °C počas asi 24 až 72 hodín. Ak je to nevyhnutné, môže sa použiť prevzdušňovanie a/alebo miešanie.

Pri kultivovaní hostiteľa, ktorým je transformant odvodený od bunky hmyzu alebo transformant odvodený od hmyzu, ako médium je užitočné napríklad Graceho hmyzie médium [Grace T. C. C.: Náture 1962, 195, 788.] doplnené 10 % deaktivovaného hovädzieho séra alebo podobnou prísadou. Hodnota pH média sa s výhodou upraví na asi 6,2 až 6,4. Kultivácia sa zvyčajne uskutočňuje 3 až 5 dní pri asi 27 °C. Ak je to nevyhnutné, môže sa použiť prevzdušňovanie a/alebo miešanie.

Pri kultivovaní hostiteľa, ktorým je transformant živočíšnej bunky, ako médium je užitočné napríklad MEM médium [Science 1952, 122, 501.], DMEM médium [Virology 1959, 8, 396.], RPMI 1640 médium [The Journal of the American Medical Association 1967, 199, 519.], 199 médium [Proceedings of the Society for the Biological Medicíne 1950, 73, 1.], každé doplnené o asi 5 až 20 % plodového teľacieho séra. Hodnota pH je s výhodou asi 6 až 8. Kultivácia sa zvyčajne uskutočňuje 15 až 60 hodín pri asi 30 až 40 °C. Ak je to nevyhnutné, môže sa použiť prevzdušňovanie a/alebo miešanie.

Týmto spôsobom je možné spôsobiť, že transformant extraceluláme produkuje proteín podľa predloženého vynálezu.

Proteín podľa predloženého vynálezu sa môže z kultivačnej zmesi oddeliť a vyčistiť napríklad nasledujúcim spôsobom.

Príslušný spôsob extrahovania proteínu podľa predloženého vynálezu z kultivovaných bakteriálnych alebo iných buniek zahrňuje napríklad získanie bakteriálnych alebo iných buniek po kultivácii všeobecne známym spôsobom, nasleduje suspendovanie v príslušnom tlmivom roztoku, ich rozbitie napríklad pôsobením ultrazvuku, spracovanie s lysozymom a/alebo zmrazovanierozmrazovanie a izolovanie surového extračného roztoku obsahujúceho proteín odstreďovaním alebo sfiltrovaním. Tlmivý roztok môže obsahovať činidlo denaturujúce proteín, ako je močovina alebo hydrochlorid guanidínu, alebo povrchovo aktívne činidlo, ako je Triton X-100™. Ak sa proteín sekretuje do kultivačnej kvapaliny, kultivačná hmota sa po kultivácii rozdelí na bakteriálne alebo iné bunky a supematant sa zhromažďuje.

Proteín, ktorý sa získa v takto získanom kultivačnom supernatante alebo extrakte sa môže vyčistiť príslušnou kombináciou všeobecne známych spôsobov delenia/čistenia. Medzi tieto známe spôsoby patria, okrem iných, spôsoby používajúce rozdiely v rozpustnosti, ako je vysoľovanie a zrážanie rozpúšťadlom, spôsob používajúci v princípe rozdiely v molekulových hmotnostiach, ako je dialýza, ultrafiltrácia, gélová filtrácia a elektroforéza na SDS-polyakrylamidovom géli, spôsoby používajúce rozdiely v náboji, ako je chromatografia na ionexe, spôsoby využívajúce špecifickú afinitu, ako je afinitná chromatografia, spôsoby používajúce rozdiel v hydrofóbnosti, ako je vysokoúčinná kvapalinová chromatografia na obrátených fázach, a spôsoby využívajúce rozdiel v izoelektrickom bode, ako je izoelektrická fokusácia.

V prípadoch, keď takto získaný proteín existuje v čistej forme, sa môže premeniť na soľ všeobecne známym spôsobom alebo jeho modifikáciou. Ak sa naopak získava vo forme soli, táto soľ sa môže premeniť na voľnú formu alebo na inú sôľ všeobecne známym spôsobom alebo jeho modifikáciou.

Je taktiež možné arbitrárne modifikovať alebo deletovať čiastočný polypeptid z proteínu, ktorý sa vyrobí transformantom tým, že sa naň pred alebo po jeho vyčistení pôsobí príslušným enzýmom modifikujúcim proteín. Ako enzým modifikujúci proteín je možné použiť napríklad trypsín, chymotrypsín, arginínendopeptidázu, proteínkinázu a glykozidázu.

Prítomnosť alebo aktivita takto vytvoreného proteínu alebo jeho soli podľa predloženého vynálezu sa môže stanoviť napríklad testovaním na nadviazanie s označeným iigandom a enzýmovým imunotestom použitím špecifickej protilátky.

Protilátka oproti proteínu alebo čiastočnému peptidu alebo jeho soli podľa predloženého vynálezu môže znamenať polyklonálnu alebo monoklonálnu protilátku za predpokladu, že môže rozoznať proteín alebo čiastočný peptid alebo ich soľ podľa predloženého vynálezu.

Výhodnou protilátkou oproti čiastočnému peptidu alebo jeho soli podľa predloženého vynálezu sú napríklad protilátky na 1) čiastočný peptid alebo jeho soľ, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu obsahujúcu 22. až 252., 26.. až 252. alebo 26. až 34. (s výhodou 26. až 252. alebo 26. až 34., výhodnejšie 26. až 24.) aminokyselinový zvyšok v aminokyselinovej sekvencii uvedenej ako sekv. id. č. 1, a 2) čiastočný peptid alebo jeho soľ, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu pokrývajúcu 22. až 246., 26. až 246., alebo 166. až 190. (s výhodou 26. až 246., alebo 166. až 190., výhodnejšie 166. až 190.) aminokyselinový zvyšok v aminokyselinovej sekvencii uvedenej ako sekv. id. č. 5.

Protilátka oproti proteínu alebo čiastočnému peptidu alebo proti ich soli podľa predloženého vynálezu (tu ďalej pri vysvetlovaní protilátky sú proteín alebo podobné zlúčeniny niekedy označované iba ako „proteín podľa predloženého vynálezu“) sa môžu vyrábať všeobecne známym spôsobom výroby protilátok alebo antisér použitím proteínu podľa predloženého vynálezu ako antigénu.

Produkcia monoklonálnej protilátky

a) Získanie buniek produkujúcich monoklonálnu protilátku

Proteín podľa predloženého vynálezu sa podáva ako taký alebo spoločne s nosičom alebo riedidlom teplokrvnému živočíchovi v mieste schopnom produkovať po podaní protilátku. Pri príležitosti podávania sa môže kvôli zvýšeniu produkcie protilátky podávať úplné Freundovo adjuvans alebo neúplné Freundovo adjuvans. Všeobecne sa podávanie uskutočňuje raz za dva až šesť týždňov a celkove dvakrát až desaťkrát. Medzi teplokrvné živočíchy, ktoré sa používajú, patria, okrem ďalších, opice, králiky, psi, morčatá, myši, krysy, ovce, kozy, kurence, z ktorých sú výhodné myšli a krysy.

Pri výrobe buniek produkujúcich monoklonálne protilátky sa jednotlivec, v ktorom je rozpoznateľný titer protilátky, vyberie z teplokrvných živočíchov (napr. myši) imunizovaných antigénom a po 2 až 3 dňoch od poslednej iminuzácie sa vyrežú slezinné alebo miechové uzliny a v nich nachádzajúce sa bunky produkujúce protilátku sa spoja s myelomovými bunkami homozoického alebo heterozoického živočícha, pričom sa pripravia hybridómy produkujúce monoklonálnu protilátku. Protilátkový titer vzorky antiséra je možné stanoviť napríklad zreagovaním označeného proteínu, ktorý sa tu uvedie neskôr, s antisérom a zmeraním aktivity značky nadviazanej na protilátku. Postup napojenia sa môže uskutočniť napríklad podľa spôsobu Koehlera a Milsteina [Náture 1975, 256, 495], Ako promótor napojenia je možné uviesť napríklad polyetylénglykol (PEG) a vírus Sendai, z nich je výhodný PEG.

Ako myelomové bunky je možné uviesť napríklad myelomové bunky pochádzajúce z teplokrvného živočícha, ako sú NS-1, P3U1, SP2/0 a AP-1, z nich sú výhodné bunky P3U1. Pomer medzi počtom buniek produkuúcich protilátku (splenocyty) a počtom myelomových buniek je s výhodou asi 1:1 až 20:1. PEG (s výhodou PEG 1000 až PEG 6000) sa pridáva na koncentráciu asi 10 až 80 % a napojenie buniek sa môže účinne uskutočniť inkubáciou pri 20 až 40 ^eC, s výhodou pri 30 až 37 ^eC, počas 1 až 10 minút.

Na testovanie hyridomov produkujúcich monoklonálne protilátky sa môžu použiť rôzne spôsoby. Napríklad je tu možné uviesť spôsob, ktorý zahrňuje pridanie kultivačného supernatantu hybridomu k pevnej fáze (napr. mikrodoska) s proteínovým antigénom na nej adsorbovaným priamo alebo spoločne s nosičom, potom pridanie rádioaktívne označenej alebo enzýmom označenej anti-imunoglobulínovej protilátky (protimyšej imunoglobulínovej protilátky, keď bunky, ktoré sa použijú na napojenie buniek znamenajú myšie bunky) alebo proteínu A a detegovanie monoklonálnej protilátky nadviazanej na pevnú fázu, a spôsob zahrňujúci pridanie kultivačného supernatantu hybridomu k pevnej fáze s anti-imunoglobulínovou protilátkou alebo proteínom A na nej naadsorbovaným, pridanie rádioaktívne označeného alebo enzýmom označeného proteínu a detegovanie monoklonálnej protilátky nadviazanej na pevnú fázu.

Triedenie monoklonálnej protilátky sa môže uskutočniť všeobecne známym spôsobom alebo jeho modifikáciou. Všeobecne sa môže uskutočniť použitím média pre živočíšne bunky doplneného o HAT (hypoxantín, aminopterín a tymidín). Toto médium na rozdelenie a množenie môže znamenať akékoľvek médium za predpokladu, že hybridom na ňom môže rásť. Môže sa použiť napríklad PRM11640 médium doplnené 1 až 20 %, s výhodou 10 až 20 % plodového teľacieho séra, GIT médium (Wako Pure Chemical Ind.) doplnené 1 až 10 % plodového teľacieho séra alebo médium neobsahujúce sérum na kultiváciu hybridomov (SFM-101, Nissui Pharmaceutical) a podobné. Kultivačná teplota je zvyčajne 20 až 40 °C, s výhodou asi 37 °C. Čas kultivácie je zvyčajne 5 dní až 3 týždne, s výhodou 1 až 2 týždne. Kultivácia sa všeobecne môže uskutočniť v prítomnosti 5 % oxidu uhličitého. Protilátkový titer kultivačného supernatantu hybridomu je možné stanoviť rovnakým spôsobom, ako sa uvádza vyššie pri stanovení titra protilátky v antisére.

b) Čistenie monoklonálnej protilátky

Delenie a čistenie monoklonálnych protilátok sa môže uskutočniť všeobecne známym spôsobom, napríklad spôsobom delenia a čistenia imunoglobulínov [napr. vysolovaním, zrážaním alkoholom, izoelektrickým vyzrážaním, elektroforézou, adsorpciou/desorpciou použitím ionexu (napr. DEAE), ultracentrifugáciou, gélovou filtráciou, špecifickým spôsobom čistenia zahrňujúcim izolovanie protilátky samotnej použitím pevnej fázy alebo aktívneho sorbentu s nadviazaným antigénom, ako je proteín A alebo proteín G, a izolovaním protilátky disociáciou väzby].

Produkcia monoklonálnej protilátky

Polyklonálna protilátka podľa predloženého vynálezu sa môže produkovať všeobecne známym spôsobom alebo jeho modifikáciou. Napríklad sa môže vyrobiť imunizovaním teplokrvného živočícha imunogénom (proteínový antigén) samotným alebo konjugátom pripraveným z rovnakej látky a nosným proteínom rovnakým spôsobom, ako bolo uvedené vyššie pri odkaze na produkciu monoklonálnej protilátky, izolovaním materiálu obsahujúceho protilátku proti proteinu podľa predloženého vynálezu z imunizovaného živočícha a oddelením a vyčistením protilátky.

Pokiaľ ide o konjugát imunogén-nosný proteín, ktorý sa má použiť na imunizovanie teplokrvných živočíchov, i keď druhy nosného proteinu a pomer miešania nosiča a hapténu nie sú rozhodujúce, za predpokladu, že sa môže účinne produkovať protilátka proti hapténu zosieťovaním s nosičom a použiť na imunizáciu, hovädzí sérový albumín, hovädzí tyroglobulín, hemokyanín alebo podobná látka sa skondenzuje s hapténom v hmotnostnom pomere asi 0,1 až 20:1, s výhodou asi 1 až 5.Ί.

Na kondenzáciu hapténu k nosiču sa môžu použiť rôzne kondenzačné činidlá, napríklad glutaraldehyd, karbodiimidy, aktívne maleínimidové estery a aktívne esterové činidlá obsahujúce tiolovú alebo ditiopyridylovú skupinu.

Kondenzačný produkt sa podáva ako taký, alebo spoločne s nosičom alebo riedidlom teplokrvnému živočíchovi do miesta, ktoré je schopné po podaní produkovať protilátku. Pri príležitosti podávania sa môže podávať úplné Freundovo adjuvans alebo neúplné Freundovo adjuvans, aby sa zvýšila produkcia protilátky. Zvyčajne sa podávanie uskutočňuje raz za dva až šesť týždňov, celkove asi trikrát až desaťkrát.

Polyklonálna protilátka sa môže izolovať z krvi, ascitickej kvapaliny a tak ďalej, s výhodou z krvi teplokrvného živočícha imunizovaného vyššie uvedeným spôsobom.

r r

Titer polyklonálnej protilátky antiséra sa môže stanoviť rovnakým spôsobom ako stanovenie titra protilátky v antisére, ktoré sa uvádta vyššie. Polyklonálna protilátka sa môže oddeliť a vyčistiť rovnakým spôsobom imunologického delenia a čistenia, ako sa delenie a čistenie monoklonálnej protilátky uvádza vyššie.

V nasledujúcej časti spisu sa opisujú použitia proteínu alebo čiastočného peptidu alebo ich soli podľa predloženého vynálezu (tu niekedy z dôvodu skrátenia označované ako „proteín alebo podobná zlúčenina podľa predloženého vynálezu“) a protilátky proti proteínu alebo čiastočnému peptidu alebo ich soli podľa predloženého vynálezu (tu niekedy označované ako „protilátka podľa predloženého vynálezu“).

1) Terapeutický a/alebo profylaktický prostriedok pre rôzne ochorenia, ktorý obsahuje proteín alebo podobnú zlúčeninu podľa predloženého vynálezu

Proteín alebo podobná zlúčenina podľa predloženého vynálezu vykazuje aktivitu proliferácie buniek a môže sa teda používať ako liečivo, ako je činidlo regenerujúce tkanivo po extrakcii chorého tkaniva (vrátane celkovej a čiastočnej excízie, ale s výhodou čiastočnej excízie).

Pri použití proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu v hore uvedenom prostriedku na liečenie alebo prevenciu sa používa s výhodou vo vyčistenom stave aspoň z 90 %, s výhodou nie menej ako 95 %, výhodnejšie nie menej ako 98 %, ešte výhodnejšie nie menej ako 99 %.

Proteín alebo podobná zlúčenina podľa predloženého vynálezu sa môže používať orálne vo forme tabliet (ak sa to požaduje, potiahnutých cukrom), toboliek, elixírov, mikrotoboliek a tak ďalej alebo neorálne vo forme paranterálnych roztokov, ako sú aseptické roztoky vo vode alebo nejaké iné farmaceutický prijateľné kvapaliny, alebo vo forme suspenzií. Môže sa vyrábať napríklad zmiešaním proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu, okrem iného s fyziologicky prijateľným nosičom, ochuťovacím činidlom, excipiens, riedidlom, ochranným činidlom, stabilizačným činidlom a/alebo väzbovým činidlom, takže sa získajú jednotkové dávkové formy, ako sa to vyžaduje vo všeobecne prijatej farmaceutickej praxi. Množstvo aktívnej zložky v týchto farmaceutických prípravkoch by malo byť dostatočné na to, aby sa získala príslušná dávka v rámci uvedeného rozmedzia.

Medzi prísady, ktoré sa môžu používať pri zostavovaní tabliet a toboliek, mimo iných patria, ale bez obmedzenia na ne, väzbové činidlá, ako je želatína, kukuričný škrob, tragant, a arabská guma, excipines, ako je kryštalická celulóza, napučiavacie činidlá, ako je kukuričný škrob, želatína a kyselina alginová, mazadlá, ako je stearát horečnatý, sladidlá, ako je sacharóza, laktóza a sacharín, a ochucovacie činidlá, ako je máta pieporná, olej gaulteria a čerešne. Ak je jednotkovou formou prípravku tobolka, tobolky môžu ďalej obsahovať kvapalný nosič, ako je olej alebo tuk, popri hore uvedených typoch materiálov. Sterilné prostriedky pre injekcie sa môžu formulovať napríklad rozpustením alebo suspendovaním účinnej zložky v riedidle, ako je voda pre injekcie, alebo v prírodnom rastlinnom oleji, ako je sézamový olej alebo kokosový olej, a tak ďalej, podľa konvenčnej farmaceutickej praxe.

Medzi vodný roztok pre injekcie patria napríklad fyziologický soľný roztok, izotonické roztoky obsahujúce glukózu a/alebo niektoré ďalšie pomocné činidlo (napr. D-sorbitol, D-manitol a chlorid sodný) a podobné. Tieto sa môžu používať v kombinácii s príslušnými činidlami napomáhajúcimi rozpustenie, ako je alkohol (napr. etanol) a polyalkohol (napr. propylénglykol a polyetylénglykol), alebo neiónovým povrchovo aktívnym činidlom (napr. polysorbátom 80™ a HCO-50). Ako olejová kvapalina sa tu môže uviesť napríklad sézamový olej, sojový olej a podobné. Tieto sa môžu používať v kombinácii s benzylbenzoátom, benzylalkoholom alebo podobnými zlúčeninami ako činidlo napomáhajúce rozpúšťaniu. Ďalej sa môže do prostriedka zahrnúť tlmivý roztok (napr. fosforečnanový tlmivý roztok a tlmivý roztok na báze octanu sodného), analgetické činidlo (napr. benzlakoniumchlorid a hydrochlorid prokaínu), stabilizačné činidlo (napr. ľudský sérový albumín a polyetylénglykol), ochranné činidlo (napr. benzylalkohol a fenol) a/alebo antioxidačné činidlo. Vyrobené paranterálne roztoky sa zvyčajne naplnia do príslušných ampuliek.

Takto získané prípravky sú bezpečné, majú nízku toxicitu a môžu sa podávať napríklad ľuďom alebo teplokrvným živočíchom (napr. krysám, myšiam, morčatám, králikom, vtákom, ovciam, ošípaným, dobytku, koňom, mačkám, psom a opiciam).

Dávka proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sa môže meniť v závislosti na ochorení, ktoré sa má liečiť, a na cieli podávania alebo na podobných faktoroch. Zvyčajne sa však proteín alebo podobná zlúčenina podľa predloženého vynálezu, ak sa podáva dospelým ľuďom (s hmotnosťou 60 kg), napríklad ako činidlo regenerujúce tkanivo po excízii chorého tkaniva, podáva v dennej dávke asi 0,1 mg až 100 mg, s výhodou asi 1,0 až 50 mg, výhodnejšie asi 1,0 až 20 mg.

2) Testovanie liečiv pripadajúcich do úvahy pre podávanie pri ochorení

Bunky prirodzeného zabíjača (NK) inhibujú proliferáciu rakovinových buniek. Proteín alebo podobná zlúčenina podľa predloženého vynálezu neovplyvňujú proliferáciu normálnych buniek, ale inhibujú proliferáciu buniek NK a teda sa zlúčenina alebo jej soľ, ktorá má inhibičnú aktivitu na inhibíciu proliferácie buniek NK proteínom alebo podobnou zlúčeninou podľa predloženého vynálezu, môže používať ako liečivo, ako činidlo na liečenie alebo predchádzanie takých ochorení, ako sú napríklad rôzne typy rakovín (napr. rakoviny tela maternice, endometriómu, rakoviny prsníka, karcinómu hrubého čreva a konečníka, rakoviny prostaty, rakoviny pľúc, renálnej rakoviny, neuroblastomu, rakoviny žlčníka a myelomu).

Preto je proteín alebo podobná zlúčenina podľa predloženého vynálezu užitočný ako reakčné činidlo na testovanie zlúčeniny alebo jej soli, ktorá vykazuje aktivitu inhibovania proteínom alebo podobnou zlúčeninou podľa predloženého vynálezu inhibície proliferácie buniek NK.

Predložený vynález teda poskytuje:6J1) spôsob testovania zlúčeniny alebo jej soli (tu sa niekedy uvedená zlúčenina vrátane jej soli označuje ako „inhibitor“, s odkazom na “2) Testovanie liečiv pripadajúcich do úvahy pre podávanie pri ochorení“), ktorá vykazuje aktivitu inhibovania proti inhibícii proliferácie buniek NK proteínom alebo čiastočným peptidom alebo jeho soli podľa predloženého vynálezu, pričom tento spôsob sa vyznačuje tým, že sa používa proteín alebo čiastočný peptid alebo jeho soľ podľa predloženého vynálezu (tu sa niekedy uvedený spôsob ďalej označuje ako „spôsob testovania pre predložený vynález“, pokiaľ ide o “2) Testovanie liečiv pripadajúcich do úvahy pre podávanie pri ochorení“), a 2) zostavu pre testovanie inhibítora, ktorá sa vyznačuje tým, že obsahuje proteín alebo čiastočný peptid alebo ich soľ podľa predloženého vynálezu (tu ďalej sa niekedy táto zostava označuje ako „testovacia zostava podľa predloženého vynálezu, pokiaľ ide o „2) Testovanie liečiv pripadajúcich do úvahy pre podávanie pri ochorení“), a (podrobnejšie) poskytuje:

2) 1) spôsob testovania inhibítora, ktorý obsahuje porovnávanie i) prípadu, v ktorom bunky NK sú v styku s proteínom alebo čiastočným peptidom alebo ich solľami podľa predloženého vynálezu, a ii) prípadu, v ktorom bunky NK a testovaná zlúčenina sú v styku s proteínom alebo čiastočným peptidom alebo ich solľami podľa predloženého vynálezu, a 2) zostavu pre testovanie inhibítora, ktorá sa vyznačuje tým, že sa proteín alebo čiastočný peptid alebo ich soľ podľa predloženého vynálezu uvedie do styku s bunkami NK.

Konkrétne sa hore uvedený spôsob testovania a hore uvedená zostava vyznačujú tým, že sa napríklad meria inhibičná aktivita proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu proliferácie buniek NK v prípadoch ad i) a ad ii) a namerané údaje sa porovnajú.

Inhibičná aktivita proteínu alebo podobnej zlúčenjny podľa predloženého vynálezu na proliferáciu buniek N K sa môže merať napríklad všeobecne známym spôsobom alebo jeho modifikáciou, s výhodou spôsobom, ktorý sa bude opisovať neskôr v časti s príkladmi.

Medzi testované zlúčeniny patria, okrem iných, peptidy, proteíny, nepeptidové zlúčeniny, syntetické zlúčeniny, fermentačné produkty, bunkové « I* ' ' extrakty, rastlinné extrakty, extrakty živočíšneho tkaniva a tak ďalej. Tieto zlúčeniny môžu znamenať nové zlúčeniny alebo známe zlúčeniny.

Napríklad testovaná zlúčenina inhibujúca inhibičnú aktivitu proliferácie NK buniek v hore uvedenom príklade ad ii) nie menej ako asi z 20 %, s výhodou nie menej ako 30 %, výhodnejšie nie menej ako z 50 %, pri porovnaní s hore uvedeným prípadom ad i), sa môže vybrať ako zlúčenina inhibujúca inhibičnú aktivitu proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu proliferácie NK buniek.

Zlúčenina alebo jej soľ, ktorá sa získa spôsobom testovania alebo testovacou zostavou podľa predloženého vynálezu, znamená zlúčeninu vybranú z takých hore uvedených testovaných zlúčenín, napríklad peptidov, proteínov, nepeptidových zlúčenín, syntetických zlúčenín, fermentačných produktov, bunkových extraktov, rastlinných extraktov, extraktov živočíšneho tkaniva a plazmy, a znamená takú zlúčeninu, ktorá má inhibičnú aktivitu na inhibičnú aktivitu proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu proliferácie NK buniek.

Soľ uvedenej zlúčeniny môže znamenať to isté, ako je uvedené hore, kde sa hovorilo o soli proteínu alebo podobnej zlúčenine podľa predloženého vynálezu.

V tých prípadoch, keď sa zlúčenina, ktorá sa získa použitím spôsobu testovania alebo testovacej zostavy podľa predloženého vynálezu používa ako hore uvedené činidlo na liečenie alebo prevenciu, môže sa používať podľa ustálenej praxe. Napríklad tablety, tobolky, elixíry, mikrotobolky, aseptické roztoky, suspenzie a dalšie prípravky sa môžu vyrábať rovnakým spôsobom, ako sa uvádza hore v časti týkajúcej sa farmaceutického prostriedka obsahujúceho proteín alebo podobnú zlúčeninu podľa predloženého vynálezu.

Takto získané prípravky sú bezpečné, majú nízku toxicitu a môžu sa podávať napríklad ľuďom alebo teplokrvným živočíchom (napr. myšiam, krysám, králikom, ovciam, ošípaným, dobytku, koňom, vtákom, mačkám, psom a opiciam).

Dávka uvedenej zlúčeniny alebo jej soli sa môže meniť v závislosti na jej účinnosti, na ochorení, ktoré sa má liečiť, a na cieli podávania, na ceste podávania, alebo na podobných faktoroch. Zvyčajne sa však zlúčenina, ktorá má inhibičnú aktivitu na inhibíciu proteínom alebo podobnou zlúčeninou podľa predloženého vynálezu proliferácie buniek NK, ak sa orálne podáva normálnym dospelým ľuďom (s hmotnosťou 60 kg) na liečenie endometriomu, sa podáva napríklad v dennej dávke asi 0,1 mg až 100 mg, s výhodou asi 1,0 až 50 mg, výhodnejšie asi 1,0 až 20 mg. V prípade neorálneho podávania, ak sa zlúčenina, ktorá má inhibičnú aktivitu na inhibíciu proteínom alebo podobnou zlúčeninou podľa predloženého vynálezu proliferácie buniek NK podáva vo forme parenteráineho roztoku dospelým ľuďom (s hmotnosťou 60 kg) na liečenie endometriomu, napríklad uvedená zlúčenina sa podáva v dennej dávke asi 0,01 mg až 100 mg, s výhodou asi 0,1 až 20 mg, výhodnejšie asi 0,1 až 10 mg intravenóznou injekciou, i keď jednotková dávka zlúčeniny sa môže meniť v závislosti na cieli podávania, na ochorení, ktoré sa má liečiť, alebo na podobných faktoroch. Pri iných živočíchoch sa môže podávať dávka vypočítaná na základe hmotnosti tela 60 kg.

3) Testovanie liečiv pripadajúcich do úvahy pre podávanie pri ochorení

Pretože proteín alebo podobná zlúčenina podľa predloženého vynálezu má aktivitu proiiferujúcej bunky, môže sa použiť zlúčenina alebo jej soľ, ktorá je schopná podporovať funkciu (napr. aktivitu profilerujúcej bunky) proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu, napríklad ako liečivo, ako je činidlo na regeneráciu tkaniva po excízii chorého tkaniva.

Na druhej strane sa môže použiť zlúčenina alebo jej soľ, ktorá je schopná inhibovať funkciu proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu, napríklad ako liečivo, ako je činidlo na liečenie alebo predchádzanie takých ochorení, ako sú rôzne typy rakovín (napr. rakoviny tela maternice, endometriomu, rakoviny prsníka, karcinómu hrubého čreva a konečníka, rakoviny prostaty, rakoviny pľúc, renálnej rakoviny, neuroblastomu, rakoviny žlčníka a myelomu).

Proteín alebo podobná zlúčenina podľa predloženého vynálezu je teda užitočný ako reakčné činidlo na testovanie zlúčeniny alebo jej soli podporujúcej alebo inhibujúce/ funkciu proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu.

Predložený vynález teda poskytuje:

1) 1) Spôsob testovania zlúčeniny alebo jej soli, ktorá podporuje funkciu (napr. aktivitu profilerujúcej bunky) proteínu alebo čiastočného peptidu alebo ich soli podľa predloženého vynálezu [v “ad 3) Testovanie liečiv pripadajúcich do úvahy pre podávanie pri ochorení“ je uvedená zlúčenina alebo jej soľ kvôli skráteniu označovaná niekedy ako „promótor“], alebo zlúčeniny alebo jej soli, ktorá inhibuje funkciu (napr. aktivitu proliferujúcej bunky) proteínu alebo čiastočného peptidu alebo ich solí podľa predloženého vynálezu [v “ad 3) Testovanie liečiv pripadajúcich do úvahy pre podávanie pri ochorení“ sa uvedená zlúčenina alebo jej soľ kvôli skráteniu niekedy označuje ako „inhibítor“], vyznačujúca sa tým, že sa používa proteín alebo čiastočný peptid alebo ich soľ podľa predloženého vynálezu, a 2) zostavu na testovanie takého promótora alebo inhibítora, vyznačujúca sa tým, že obsahuje proteín alebo čiastočný peptid alebo ich soľ podľa predloženého vynálezu [v ad “3) Testovanie liečiv pripadajúcich do úvahy pre podávanie pri ochorení“ sa uvedená zostava kvôli skráteniu niekedy označuje ako „zostava na testovanie podľa predloženého vynálezu“], a konkrétnejšie poskytuje, mimo iného

2) 1) Spôsob testovania promótora alebo inhibítora, ktorý sa vyznačuje tým, že sa porovnáva i) prípad, v ktorom bunky (napr. normálne bunky pochádzajúce z akýchkoľvek rozmanitých hore uvedených tkanív (s výhodou z ľudského tkaniva) alebo rakovinové bunky pochádzajúce z akýchkoľvek z vyššie uvedených typov rakovín) sú v styku s proteínom alebo čiastočným peptidom alebo ich solľami podľa predloženého vynálezu, a ii) prípad, v ktorom bunky (napr. normálne bunky pochádzajúce z akýchkoľvek rozmanitých vyššie uvedených tkanív (s výhodou z ľudského tkaniva) alebo rakovinové bunky pochádzajúce z akýchkoľvek vyššie uvedených typov rakoviny) a testovaná zlúčenina sú v styku s proteínom alebo čiastočným peptidom alebo ich so'ľami podľa predloženého vynálezu, a 2) zostavu na testovanie promótora alebo inhibitora, ktorá sa vyznačuje tým, že sa proteín alebo čiastočný peptid alebo ich soľ podľa predloženého vynálezu privedie do styku s bunkami (napr. normálnymi bunkami pochádzajúcimi z akýchkoľvek rozmanitých vyššie uvedených tkanív (s výhodou z ľudského tkaniva) alebo rakovinovými bunkami pochádzajúcimi z akýchkoľvek uvedených typov rakoviny).

Konkrétne - charakteristickou vlastnosťou hore uvedeného spôsobu testovania je to, že sa napríklad zmeria aktivita proteinu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu proliferácie buniek v prípadoch ad i) a ad ii) a získané údaje sa porovnajú.

Aktivita proteinu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu proliferácie buniek sa môže merať všeobecne známym spôsobom alebo jeho modifikáciou.

Ako bunky sú užitočné napríklad normálne bunky pochádzajúce z akýchkoľvek rozmanitých hore uvedených tkanív (s výhodou ľudského tkaniva) alebo rakovinovej bunky pochádzajúcej z akýchkoľvek hore uvedených typov rakoviny.

Medzi testované zlúčeniny patria, mimo iných, peptidy, proteíny, nepeptidové zlúčeniny, syntetické zlúčeniny, fermentačné produkty, bunkové extrakty, rastlinné extrakty, extrakty živočíšneho tkaniva a tak ďalej. Tieto zlúčeniny môžu znamenať nové zlúčeniny alebo známe zlúčeniny.

Pre uskutočnenie hore uvedeného spôsobu testovania sa vzorka proteinu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu pripraví suspendovaním proteinu alebo podobnej zlúčeniny v tlmivom roztoku, ktorý je vhodný na testovanie. Tlmivým roztokom môže byť akýkoľvek tlmivý roztok, ktorý neinhibuje reakciu proteinu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu s testovanou zlúčeninou; môže znamenať napríklad fosforečnanový tlmivý roztok alebo Tris-hydrochloridový tlmivý roztok s pH okolo 4 až 10 (požadované pH je asi 6 až 8).

Napríklad testovaná zlúčenina podporujúca aktivitu proliferovať bunky v hore uvedenom prípade ad ii) nie menej než z asi 20 %, s výhodou nie menej než 30 %, výhodnejšie nie menej než z 50 %, pri porovnaní s hore uvedeným prípadom ad i), môže sa vybrať ako zlúčenina podporujúca aktivitu proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu proliferovať bunky, a naopak, testovaná zlúčenina inhibujúca aktivitu proliferovať bunky v hore uvedenom prípade ad ii) nie menej než z asi 20 %, s výhodou nie menej než 30 %, výhodnejšie nie menej než z 50 %, pri porovnaní s hore uvedeným prípadom ad i), môže sa vybrať ako zlúčenina inhibujúca aktivitu proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu proliferovať bunky.

Zlúčenina alebo soľ, ktorá sa získa použitím testovania alebo testovacej zostavy podľa predloženého vynálezu, znamená zlúčeninu, ktorá sa vyberie z takýchto hore uvedených testovaných zlúčenín, napríklad peptidov, proteínov, nepeptidových zlúčenín, syntetických zlúčenín, fermentačných produktov, bunkových extraktov, rastlinných extraktov, extraktov živočíšneho tkaniva a plazmy, a znamená zlúčeninu, ktorá podporuje alebo inhibuje funkciu (napr. aktivitu proliferovať bunky) proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu.

Soľ uvedenej zlúčeniny môže znamenať to isté ako sa uvádza vyššie, keď sa hovorilo o soli proteínu alebo podobnej zlúčenine podľa predloženého vynálezu.

V tých prípadoch, keď sa zlúčenina získaná použitím spôsobu testovania alebo testovacej zostavy podľa predloženého vynálezu používa ako hore uvedené činidlo na liečenie alebo prevenciu, môže sa používať podľa zavedenej praxe. Napríklad tablety, tobolky, alixíry, mikrotobolky, aseptické roztoky, suspenzie a ďalšie prípravky sa môžu vyrábať rovnakým spôsobom, ako sa uvádza hore v časti týkajúcej sa farmaceutického prostriedka obsahujúceho proteín alebo podobnú zlúčeninu podľa predloženého vynálezu.

Takto získané prípravky sú bezpečné, majú nízku toxicitu a môžu sa podávať napríklad ľuďom alebo teplokrvým živočíchom (napr. myšiam, krysám, králikom, ovciam, ošípaným, dobytku, koňom, vtákom, mačkám, psom a opiciam).

Dávka uvedenej zlúčeniny alebo jej soli sa môže meniť v závislosti na jej účinnosti, na ochorení, ktoré sa má liečiť, na cieli podávania, na ceste podávania alebo na podobných faktoroch. Zvyčajne sa však zlúčenina, ktorá podporuje funkciu proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu, ak sa orálne podáva normálnym dospelým ľuďom (s hmotnosťou 60 kg) ako činidlo regenerujúce tkanivo po excízii chorého tkaniva, napríklad sa podáva v dennej dávke asi 0,1 mg až 100 mg, s výhodou asi 1,0 až 50 mg, výhodnejšie asi 1,0 až 20 mg. Pri iných živočíchoch sa môže podávať dávka vypočítaná na základe hmotnosti tela 60 kg.

Na druhej strane - ak sa zlúčenina, ktorá inhibuje funkciu proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu podáva orálne na liečenie endometriomu, podáva sa dospelým ľuďom (s hmotnosťou 60 kg) v dennej dávke asi 0,1 mg až 100 mg, s výhodou asi 1,0 až 50 mg, výhodnejšie asi 1,0 až 20 mg. V prípade neorálneho podávania, ak sa zlúčenina, ktorá inhibuje funkciu proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu podáva vo forme parenterálneho roztoku normálnym dospelým ľuďom (s hmotnosťou 60 kg) na liečenie endometriomu, uvedená zlúčenina sa napríklad podáva v dennej dávke asi 0,01 až 30 mg, s výhodou asi 0,1 až 20 mg, výhodnejšie asi 0,1 až 10 mg, intravenóznou injekciou, i keď jednotková dávka uvedenej zlúčeniny sa môže meniť v závislosti na cieli podávania, na ochorení, ktoré sa má liečiť, alebo na podobných faktoroch. Pri iných živočíchoch sa môže podávať dávka vypočítaná na základe hmotnosti 60 kg.

4) Kvantitatívne stanovenie proteínu alebo čiastočného peptidu alebo ich solí podľa predloženého vynálezu

Protilátka oproti proteínu alebo podobná zlúčenina podľa predloženého vynálezu (tu sa niekedy skrátene označuje ako „protilátka podľa predloženého vynálezu) môže špecificky rozoznávať proteín alebo podobnú zlúčeninu podľa predloženého vynálezu a môže sa teda použiť pre kvantitatívne stanovenie proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu v testovanom roztoku, zvlášť napríklad sendvičovou imunoanalýzou.

Predložený vynález teda poskytuje:

i) spôsob kvantitatívneho stanovenie proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu v testovanom roztoku, vyznačujúci sa tým, že sa protilátka podľa predloženého vynálezu nechá kompetitívne zreagovať s testovaným roztokom a označenou formou proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu a stanoví sa percento nadviazania označenej formy proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu na uvedenú protilátku, a ii) spôsob kvantitatívneho stanovenia proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu v testovanom roztoku, vyznačujúci sa tým, že sa testovaný roztok nechá zreagovať s protilátkou podľa predloženého vynálezu imobilizovanou na nosiči a značenou formou inej protilátky podľa predloženého vynálezu súčasne alebo postupne a potom sa zmeria aktivita markeru na imobilizovanom nosiči.

V hore uvedenom spôsobe kvantitatívneho hodnotenia ad ii) sa požaduje, aby jedna z protilátok znamenala protilátku, ktorá rozoznáva N koniec proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu a ďalšia znamená protilátku rozoznávajúcu C koniec proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu.

Ďalej je možné kvantitatívne stanoviť proteín alebo podobnú zlúčeninu podľa predloženého vynálezu použitím monoklonálnej protilátky oproti proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu (tu sa niekedy ďalej označuje ako „monoklonálna protilátka podľa predloženého vynálezu“) a ďalej ho detegovať vyfarbením tkaniva. Na tento účel sa môže použiť molekula protilátky ako taká alebo sa môže použiť F(ab')_2l Fab' alebo Fab frakcia molekuly protilátky.

Spôsob kvantitatívneho stanovenia proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu použitím protilátky podľa predloženého vynálezu sa zvlášť neobmedzuje, ale je možné použiť akýkoľvek spôsob testovania za predpokladu, že tento spôsob zahrňuje detekciu chemickými alebo fyzikálnymi prostriedkami, množstvo protilátky, antigénu alebo komplexu protilátka-antigén, ktorý zodpovedá množstvu antigénu (napr. proteínu) v testovanom roztoku a premenenie detegovaného množstva na testovanú hodnotu použitím štandardnej krivky skonštruovanej použitím štandardných roztokov, z ktorých každý obsahuje známe množstvo antigénu. Vhodné sú napríklad nefelometrické, kompetitívne, imunometrické a sendvičové techniky. Z hľadiska citlivosti a špecifičnosti je zvlášť výhodné použiť sendvičový spôsob, o ktorom sa tu zmienime neskôr.

Značka (marker), ktorá sa používa v spôsoboch testovania používajúcich značenú látku znamená napríklad rádioaktívny izotop, enzým, fluorescenčnú látku alebo luminiscenčnú látku. Ako rádioaktívny izotop sa používa napríklad [125|], [i3i|]_j [³H], [¹⁴C] a tak ďalej. Ako enzým je výhodný taký enzým, ktorý je stabilný a má vysokú špecifickú aktivitu, ako je napríklad β-galaktozidáza, βglukozidáza, alkalická fosfatáza, peroxidáza, malát-dehydrogenáza a podobné. Ako fluorescenčná látka sú užitočné napríklad fluoreskamin a fluoresceínizotiokyanát. Ako luminiscenčná látka sú okrem iných užitočné luminol, luminolové deriváty, luciferin a lucigenin. Ďalej sa pre nadviazanie protilátky alebo antigénu na značku môže používať systém biotin-avidin.

Na insolubilizáciu antigénu alebo protilátky sa môže použiť fyzikálna adsorpcia, alebo sa môže použiť tiež spôsob všeobecne používajúci chemickú väzbu na imobiiizovanie a fixovanie proteínu alebo enzýmu. Ako nosič je možné uviesť nerozpustné polysacharidy, ako je agaróza, dextrán a celulóza, syntetické živice, ako je polystyrén, polyakrylamid a silikóny, sklo a tak ďalej.

Podľa sendvičového spôsobu sa proteín podľa predloženého vynálezu v testovanom roztoku môže kvantitatívne stanoviť zreagovaním imobilizovanej monoklonálnej protilátky podľa predloženého vynálezu s testovaným roztokom (primárna reakcia) a ďalej s ďalšou značenou monoklonálnou protilátkou podľa predloženého vynálezu (sekundárna reakcia) a nasledovným zmeraním aktivity značky na imobilizovanom nosiči. Primáme a sekundárne reakcie sa môžu uskutočňovať v obrátenom poradí alebo súčasne v časovom intervale. Značkujúce činidlo a spôsob imobilizácie sa môže vybrať z tých, ktoré sa uvádzajú vyššie. V imunoteste sendvičovým spôsobom protilátka pre použitie ako protilátka alebo značiaca protilátka pevná fáza nemusí vždy obsahovať jedny jediné častice, ale na zlepšenie citlivosti merania sa môže použiť zmes dvoch alebo viacej protilátok.

Pri testovaní proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sendvičovým spôsobom podľa predloženého vynálezu sa monoklonálne protilátky, ktoré sa majú použiť v primárnej reakcii a v sekundárnej reakcii, s výhodou odlišujú v mieste nadviazania na proteín alebo podobnú zlúčeninu podľa predloženého vynálezu. Čo sa týka protilátok, ktoré sa majú použiť v primárnej a sekundárnej reakcii, ak protilátka, ktorá sa použije μβ druhú reakciu rozoznáva C koncovú časť proteínu, alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu, protilátka, ktorá sa má použiť v primárnej reakcii, znamená s výhodou protilátku, ktorá rozoznáva iné miesto než C-koncovú polohu, napríklad N-koncovú polohu.

Monoklonálna protilátka podľa predloženého vynálezu sa môže použiť tiež v iných testovacích systémoch ako sú systémy pre sendvičový spôsob, napríklad pri kompetitívnom, imunometrickom alebo nefelometrickom spôsobe.

Podľa kompetitívneho spôsobu sa antigén v testovanom roztoku a značený antigén nechajú kompetitívne zreagovať s protilátkou, potom sa nezreagovaný značený antigén (F) oddelí od značeného antigénu s nadviazanou protilátkou (B) (B/F delenie), a testuje sa značka B alebo F, čím sa stanoví množstvo antigénu v testovanom roztoku. Spôsob tejto reakcie zahrňuje techniku kvapalnej fázy, ktorá ako protilátku používa rozpustnú protilátku, B/F delenie sa uskutočňuje polyetylénglykolom, okrem iného sa používa druhá protilátka k hore uvedenej protilátke a spôsob imobilizácie, ktorý používa protilátku imobilizovanú na pevnej fáze ako prvú protilátku, alebo používa rozpustnú protilátku ako prvú protilátku a imobilizovanú protilátku ako druhú protilátku.

Podľa imunometrického spôsobu antigén v testovanom roztoku a imobilizovaný antigén sa nechajú kompetitívne zreagovať s daným množstvom značenej protilátky a potom sa pevná fáza a kvapalná fáza od seba oddelia alebo sa antigén v testovanom roztoku nechá zreagovať s prebytkom značenej protilátky, potom sa pridá imobilizovaný antigén, čo spôsobí, že nezreagovaná značená protilátka sa nadviažena pevnú fázu a potom sa pevná a kvapalná fáza od seba navzájom oddelia. Potom sa testuje značka v jednej z fáz a stanoví sa množstvo antigénu v testovanom roztoku.

Pri nefelometrii sa kvantitatívne vyhodocuje nerozpustná zrazenina, ktorá sa vytvorí ako výsledok reakcie antigén-protilátka v géli alebo v roztoku. I keď množstvo antigénu v testovanom roztoku je malé a zrazenina sa získava iba vo veľmi malom množstve, predvídavo sa používa laserová nefelometria využívajúca rozptyl laserových lúčov.

Pri aplikovaní týchto príslušných imunologických spôsobov testovania pri spôsobe kvantitatívneho vyhodnocovania podľa predloženého vynálezu nepožaduje sa zavedenie nejakých zvláštnych podmienok, postupov alebo podobných prvkov. Systémy testovania proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sa môžu skonštruovať na základe technických úvah bežných pre zručných odborníkov z oblasti techniky na zvyčajné podmienky a spôsoby. Pokiaľ ide o podrobnosti týchto bežných technických prostriedkov, je možný odkaz, okrem iného, na prehľadné články a monografie.

Odkazuje sa napríklad na Hiroshie Irie (red.): „Radioimmunoassay“ (publikované 1974, Kodansha); Hiroshi Irie (red.): Radioimmunoassay, Sequeľ (publikované 1979, Kodansha); Eiji Ishikawa a spol. (red.): „Koso Men-eki Sokuteiho (Enzýme Immunoassaya)“ publikované 1978, Igaka Shoin); Eiji Ishikawa a spol. (red.): „Koso Men-eki Sokuteiho (Enzýme Immunoassays)“ (2. vydanie, publikované 1982, Igaka Shoin); Eiji Ishikawa a spol. (red.): „Koso Men-eki Sokuteiho (Enzýme Immunoassays)“ (3. vydanie, publikované 1987, Igaku Shoin); „Methods in Enzymology“, diel 70 (Immunological Techniques (časť A)); to isté, diel 73 (Immunological Techniques (časť B)); to isté, diel 74 (Immunological Techniques (časť C)); to isté, diel 84 (Immunochemical Techniques (časť D: Selected Immunoassays)); to isté, diel 92 (Immunochemical Techniques (časť E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)); to isté, diel 121 (Immunological Techniques (časť I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (všetky hore uvedené publikované Academic Press); a tak ďalej.

Podľa hore uvedeného spôsobu sa proteín alebo podobná zlúčenina podľa predloženého vynálezu môže kvantitatívne stanoviť s dobrou citlivosťou použitím protilátky podľa predloženého vynálezu.

Ak sa pri stanovení koncentrácie proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu použitím protilátky podľa predloženého vynálezu deteguje zvýšenie koncentrácie proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu, môže sa to diagnostikovať tak, že existuje ochorenie, ako sú napríklad rôzne typy rakovín (napr. rakovina tela maternice, endometriom, rakovina prsníka, karcinóm hrubého čreva a konečníka, rakovina prostaty, rakovina pľúc, renálna rakovina, neuroblastom, rakovina žlčníka, a myelom) alebo je veľmi pravdepodobné, že testovaný subjekt bude mať takého ochorenie v budúcnosti.

Protilátka podľa predloženého vynálezu sa môže používať tiež pri detegovaní proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu vyskytujúcich sa v testovanej vzorke, ako je telesná kvapalina alebo tkanivo.

Ďalej sa môže, okrem iného, používať pri výrobe kolóny s protilátkou pre · f použitie pri čistení proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu, pri detegovaní proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu v každej frakcii stupňa jeho čistenia a pri analyzovaní chovania proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu v testovaných bunkách.

5) Farmaceutické prostriedky obsahujúce protilátku podľa predloženého vynálezu

Protilátka podľa predloženého vynálezu, ktorá môže neutralizovať aktivitu proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu (neutralizujúca protilátka), sa môže použiť ako liečivo ako činidlo na liečenie alebo predchádzanie takých ochorení, ako sú napríklad rôzne typy rakovín (napr. rakoviny tela maternice, endometriómu, rakoviny prsníka, karcinómu hrubého čreva a konečníka, rakoviny prostaty, rakoviny pľúc, renálnej rakoviny, neuroblastomu, rakoviny žlčníka a myelomu).

Humanizovaná protilátka oproti proteínu alebo podobnej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sa môže používať ako liečivo, ako činidlo na liečenie alebo predchádzanie takých ochorení, ako sú napríklad rôzne typy rakovín (napr. rakoviny tela maternice, endometriómu, rakoviny prsníka, karcinómu hrubého čreva a konečníka, rakoviny prostaty, rakoviny pľúc, renálnej rakoviny, neuroblastomu, rakoviny žlčníka a myelomu).

Uvedená humanizovaná protilátka sa môže vyrábať spôsobom, ktorý sa opisuje napríklad v Nat. Biotechnol. 1966, 14, 845 až 651; Nat. Genet 1977, 15, 146 až 156; alebo v PNAS 2000, 97(2), 722 až 727.

Ďalej sa tu neutralizujúca protilátka a humanizovaná protilátka podľa predloženého vynálezu súhrnne označujú ako „protilátka podľa predloženého vynálezu“ s odkazom na “5) Farmaceutický prostriedok obsahujúci protilátku podľa predloženého vynálezu“.

Činidlo na liečenie alebo predchádzanie hore uvedených ochorení, ktoré obsahuje protilátku podľa predloženého vynálezu, sa môže podávať buď ako také, alebo vo forme kvapalného prípravku alebo vo forme príslušného farmaceutického prostriedka, orálne alebo neorálne, ľuďom alebo cicavcom (napr. krysám, králikom, ovciam, ošípaným, dobytku, mačkám, psom, opiciam). I keď sa môže dávka meniť v závislosti na cieli podávania, cieli ochorenia, príznaku, ceste podávania alebo na podobných faktoroch, protilátka podľa predloženého vynálezu, ak sa používa na liečenie a/alebo prevenciu endometriomu dospelých ľudí, sa zvyčajne podáva ako jednotková dávka v množstve asi 0,01 mg až 20 mg/kg telesnej hmotnosti, s výhodou asi 0,1 až 10 mg/kg telesnej hmotnosti, výhodnejšie asi 0,1 až 5 mg/kg telesnej hmotnosti, asi raz až päťkrát za deň, s výhodou asi raz až trikrát denne, s výhodou intravenóznej injekcie. V prípade iného neorálneho podávania a orálneho podávania sa môže podávať zodpovedajúca dávka. Ak je príznak zvlášť intenzívny, dávka sa môže podľa príznaku zýšiť.

Protilátka podľa predloženého vynálezu sa môže podávať buď ako taká alebo vo forme príslušného farmaceutického prostriedka. Farmaceutický prostriedok, ktorý sa používa pre hore uvedené podávanie obsahuje hore uvedenú protilátku, alebo jej soľ a farmaceutický prijateľný nosič, riedidlo alebo excipiens. Takýto prostriedok sa pripravuje v dávkovej forme vhodnej na orálne alebo neorálne podávanie.

Tak napríklad medzi prostriedky pre orálne podávanie patria pevné alebo kvapalné dávkové formy, konkrétne tablety (vrátane tabliet poťahovaných cukrom alebo tabliet poťahovaných filmom), pilulky, granule, prášky, tobolky (vrátane mäkkých toboliek), sirupy, emulzie, suspenzie a tak ďalej. Tieto prostriedky sa môžu vyrábať všeobecne známymi spôsobmi a obsahujú nosič, riedidlo alebo excipiens zvyčajne používané v oblasti farmaceutických prostriedkov. Ako nosič alebo excipiens sa u tabliet používajú laktóza, škrob, sacharóza, stearát horečnatý a podobné.

Prostriedok pre neorálne podávanie znamená napríklad parenterálny roztok alebo čípok. Medzi parenterálny roztok patria také dávkové formy, ako sú roztoky pre intravenózne injekcie, subkutánne injekcie, intradermálne injekcie, intramuskulárne injekcie a kvapkadlá. Takéto parenterálne roztoky sa pripravujú podľa všeobecne známych spôsobov, napríklad rozpustením, suspendovaním alebo emulgovaním hore uvedenej protilátky alebo jej soli v sterilnom vodnom alebo olejovitom riedidle, ktoré sa zvyčajne používa na prípravu parenterálnych produktov. Fyziologické soľné alebo izotonické roztoky, ktoré obsahujú napríklad glukózu a ďalšie pomocné činidlá, sa používajú ako vodné riedidlo pre injekcie a môžu sa používať v kombinácii s príslušným činidlom napomáhajúcim rozpustenie, ako je alkohol (napr. etanol), polyalkohol (napr. propylénglykol, polyetylénglykol) alebo neiónovým povrchovo aktívnym činidlom [napr. polysorbátom 80, HCO-50 (polyoxyetylén 50) aduktom hydrogenovaného ricínového oleja]. Ako olejovité riedidlá sú užitočné napríklad sezamový olej a sojový olej. Môžu sa používať v kombinácii s benzylbenzoátom, benzylalkoholom alebo podobnou zlúčeninou ako činidlo napomáhajúce rozpusteniu. Zvyčajne sa pripravený parenterálny roztok naplní do príslušných ampúl. Čipky na rektálne podávanie sa vyrábajú zmiešaním hore uvedenej protilátky alebo jej soli so zvyčajným čipkovým základom.

Hore uvedený farmaceutický prostriedok pre orálne alebo neorálne podávanie sa s výhodou pripravuje vo forme jednotkovej dávkovej formy so zodpovedajúcou dávkou účinnej zložky. Ako príklady takýchto jednotkových dávkových foriem je tu možné spomenúť okrem iného tablety, pilulky, tobolky, parenterálne roztoky (ampule) a čipky. Každá jednotková dávková forma zvyčajne obsahuje 5 až 500 mg účinnej zložky a zvlášť v prípade parenterálnych roztokov každá jednotková dávková forma s výhodou obsahuje 5 až 100 mg a v prípade iných dávkových foriem 10 až 250 hore uvedenej protilátky.

Každý z hore uvedených prostriedkov môže obsahovať niektorú ďalšiu účinnú zložku za predpokladu, že jej zahrnutie do prostriedku nespôsobuje žiadne nepriaznivé interakcie s hore uvedenou protilátkou.

V predloženom spise a obrázkoch sú skratky, ktoré sa používajú na vyjadrenie nukleotidov alebo aminokyselín a podobných zlúčenín založené na biochemickej nomenklatúre IUPAC-IUB komisie alebo ide o konvenčné skratky, ktoré sa používajú v príslušnej oblasti techniky. Nasledujú ich príklady. Ak môže existovať optická izoméria, pokiaľ ide o aminokyseliny, potom sa vždy jedná o L formu, pokiaľ sa neuvádza ináč.

DNA: deoxyribonukleová kyselina cDNA: komplementárna deoxyribonukleová kyselina

A: adenín

T: tymín

G: guanín

C: cytozín

I: inozín

R: adenín (A) alebo guanín (G)

Y: tymín (T) alebo cytozín (C)

M: adenín (A) alebo cytozín (C)

K: guanín (G) alebo tymín (T)

S: guanín (G) alebo cytozín (C)

W: adenín (A) alebo tymín (T)

B: guanín (G), guanín (G) alebo tymín (T)

D: adenín (A), guanín (G) alebo tymín (T)

V: adenín (A), guanín (G) alebo cytozín (C)

RNA: ribonukleová kyselina mRNA: mesengerová ribonukleová kyselina dATP: deoxyadenozín-trifosfát

DTTP: deoxytymidín-trifosfát dGTP: deoxyguanozín-trifosfát dCTP: deoxycytidín-trifosfát

ATP: adenozín-trifosfát

Gly: glycín

Ala: alanín

Val: valín

Leu: leucín lle: izoleucín

Ser: serín

Thr:	treonín
Cys:	cysteín
Met:	metionín
Glu:	kyselina glutamová
Asp:	kyselina aspartová
Lys:	lyzín
Arg:	arginín
His:	histidín
Phe:	fenylalanín
Tyr:	tyrozín
Trp:	tryptofan
Pro:	pral in
Asn:	asparagín
Gin:	glutamín
pGlu:	pyroglutamová kyselina

V predloženom spise sa tie substiuenty, chrániace skupiny a reakčné činidlá, ktoré sa často objavujú, označujú nižšie uvedenými symbolmi:

Me:	metylová skupina
Et:	etylová skupina
Bu:	butylová skupina
Ph:	fenylová skupina
TC:	tiazolidín-4(R)-karboxamidová skupina
Tos:	p-toluénsulfonylová skupina
CHO:	formylová skupina
Bzl:	benzylová skupina
Cl₂-Bzl:	2,6-dichlórbenzylová skupina
MBzl:	metoxybenzylová skupina
MeBzl:	4-metylbenzylová skupina
OcHex:	cyklohexylester
OBzl:	benzylester
Bom:	benzyloxymetylová skupina
Z:	benzyloxykarbonylová skupina

Cl-Z:	2-chlórbenzyloxykarbonylová skupina
Br-Z:	2-brómbenzyloxykarbonylová skupina
Boe:	terc.butoxykarbonylová skupina
DNP:	dinitrofenylová skupina
Trt:	tritylová skupina
Bum:	terc.butoxymetylová skupina
F moc:	Ν-9-fluórenylmetoxykarbonylová skupina
HOBt:	1 -hydroxybenzotriazol
HOOBt:	3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazín
HONB:	1-hydroxy-5-norbomen-2,3-dikarboximid
DCC:	N,N'-dicyklohexylkarbodiimid
DMF:	N,N-dimetylformamid
TEA:	trietylamín
WSCD:	1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid
EDTA:	etyléndiamintetraoctová kyselina
SDS:	dodecylsulfát sodný

V zozname sekvencii spisu predloženej prihlášky majú sekvencie, ktoré sa identifikujäú príslušnými číslami, nasledujúce významy:

Sekv. id. č. 1 ukazuje aminokyselinovú sekvenciu proteínu pochádzajúcu z človeka (proteín TGC839) podľa predloženého vynálezu.

Sekv. id. č. 2 ukazuje nukleotidovú sekvenciu DNA kódujúcu proteín pochádzajúci z človeka podľa predloženého vynálezu, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá sa uvádza ako sekv. id. č. 1.

Sekv. id. č. 3 ukazuje nukleotidovú sekvenciu primémej (syntetickej) DNA, ktorá sa použila v príklade 3.

Sekv. id. č. 4 ukazuje nukleotidovú sekvenciu primárnej (syntetickej) DNA, ktorá sa použila v príklade 3.

Sekv. id. č. 5 ukazuje aminokyselinovú sekvenciu proteínu, ktorý pochádza z človeka (proteín TGC838) podľa predloženého vynálezu.

Sekv. id. č. 6 ukazuje nukleotidovú sekvenciu DNA kódujúcu proteín, ktorý pochádza z človeka podľa predloženého vynálezu, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je uvedená ako sekv. id. č. 5.

Sekv. id. 7 ukazuje nukleotidovú sekvenciu primárnej (syntetickej) DNA, ktorá sa použila v príklade 7 a v príklade 20.

Sekv. id. č. 8 ukazuje nukleotidovú sekvenciu primérnej (syntetickej) DNA, ktorá sa použila v príklade 7.

Sekv. id. č. 9 ukazuje nukleotidovú sekvenciu primérnej (syntetickej) DNA, ktorá sa použila v príklade 20.

Transformant Escherichia coli SURE/pCAN618/H839F, ktorý sa získal v príklade 3, ako sa tu ďalej opisuje, sa uložil v NIBH (National Inštitúte of Bioscience and Human Technology), Ministerstvo medzinárodného obchodu a priemyslu, 1—3 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japonsko, 20. marca 1999, pod prístupovým číslom FERM BP-6677 a v IFO (Inštitúte for Fermentation Osaka), 17—85 Jusohonmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka, Osaka, Japonsko, 25. januára 1999 pod prístupovým číslom IFO 16259.

Transformant Escherichiakoli XL10-Gold/pCAN618/H838F, ktorý sa získal v príklade 7, ako sa tu ďalej opisuje, sa uložil v NIBH (National Inštitúte of Bioscience and Human Technology), Ministerstvo medzinárodného obchodu a priemyslu, 2. augusta 1999 podprístupovým číslom FERM BP-6809 a v IFO (Inštitúte for Fermentation Osaka), 21. júna 1999, pod prístupovýmčíslom IFO 16297.

Hybridomový kloň č. 112-3, ktorý sa získal v príklade 15, ako sa tu ďalej opisuje, sa uložil ako 839N-112 v NIBH (National Inštitúte of Bioscience and

Human Technology), Ministerstvo medzinárodného obchodu a priemyslu, 2. marca 2000, pod prístupovým číslom FERM BP-7068.

Hybridomový kloň č. 118-18, ktorý sa získal v príklade 15, ako sa tu ďalej opisuje, sa uložil ako 839N-128 v NIBH (National Inštitúte of Bioscience and Human Technology), Ministerstvo medzinárodného obchodu a priemyslu, 2. marca 2000, pod prístupovým číslom FERM BP-7069.

CHO-K1/TGC838N-4, ktorý sa získal v príklade 22, ako sa tu ďalej opisuje, sa uložil v NIBH (National Inštitúte of Bioscience and Human Technology), Ministerstvo medzinárodného obchodu a priemyslu, 10. marca 2000, pod prístupovým číslom FERM BP-7088.

CHO-K1/618/839F6-3, ktorý sa získal v príklade 23, ako sa tu ďalej opisuje, sa uložil v NIBH (National Inštitúte of Bioscience and Human Technology), Ministerstvo medzinárodného obchodu a priemyslu, 10. marca 2000, pod prístupovým číslom FERM BP-7089.

Hybridom 839-01, ktorý sa získal v príklade 28, ako sa tu ďalej opisuje, sa uložil v NIBH (National Inštitúte of Bioscience and Human Technology), Ministerstvo medzinárodného obchodu a priemyslu, 10. marca 2000, pod prístupovým číslom FERM BP-7086.

Hybridom 839-02, ktorý sa získal v príklade 28, ako sa tu ďalej opisuje, sa uložil v NIBH (National Inštitúte of Bioscience and Human Technology), Ministerstvo medzinárodného obchodu a priemyslu, 10. marca 2000, pod prístupovým číslom FERM BP-7087.

Nasledujúce príklady podrobnejšie ilustrujú predložený vynález. Tieto príklady však nie sú myslené ako obmedzujúce rozsah predloženého vynálezu. Spôsoby génovej manipulácie, ktoré používajú Escherichia coli sú tie, ktoré sa opisujú v Molecular Cloning.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Selekcia klonu z banky údajov

Kloň, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu charakteristickú pre sekrečnú sekvenciu proteínov, sa vybral z banky údajov, ktorú dodala SmithKline Beecham (SB).

Po translácii nukleotidovej sekvencií každej EST na aminokyselinovú sekvenciu sa teda vybrali EST klony, v ktorých sa Met vyskytuje na 5'-konci a hydrofóbna aminokyselinová sekvencia sa nachádza na 5'-koncovej strane a ďalej hydrofilná a hydrofóbne aminokyselinová sekvencie boli prítomné v smere ich vlákna a 10. až 30. aminokyselinové zvyšky od prvého zvyšku Met predstavovali signálne sekvencie nutné pre sekréciu proteínu. Našiel sa teda jeden z nich, HGS:2772893. Tento kloň sa riadil z SB a pomenoval sa TGC839. Kmeň E. coli, ktorý bol tranformovaný plazmidom, ktorý obsahoval uvedený gén, sa kultivoval konvenčným spôsobom, plazmid sa vyčistil a uvedený gén sa vyštiepil reštrikčnými enzýmami EcoRI a Xhol, pričom sa našli dva génové fragmenty o veľkosti asi 900 nukleotidov a asi 500 nukleotidov. Zistilo sa teda, že veľkosť tohto génu je asi 1400 nukleotidov.

Nukleotidová sekvencia tohto génu sa potom analyzovala fluorescenčným DNA sekvenátorom ABI 377 Prism použitím primérov T^a T3. Zistená nukleotidová sekvencia a aminokyselinová sekvencia sa uvádzajú na obr. 1.

Tento gén kóduje proteín, ktorý má 252. aminokyselinové zvyšky. Vyhodnotilo sa, že na štiepenie signálnej sekvencie dochádza medzi 25. (od N konca) aminokyselinovým zvyškom (Ala) a 26. aminokyselinovým zvyškom (Gly).

Príklad 2

Potvrdenie génovej expresie

Na zistenie funkcie génu, ktorý sa získal v príklade 1 sa uskutočnil výskum týkajúci sa jeho expresie v rôznych ľudských tkanivách a v líniách rakovinových buniek.

Najskôr, použitím ako sondy DNA fragmentu veľkosti asi 900 nukleotidov, ktorý je možné získať štiepením génu pôsobením EcoRI a Xhol, uskutočnila sa Northermova blotovacia analýza mRNA vzoriek, ktoré sa extrahovali z príslušných tkanív a buniek. Nylonové filtre blotované Clontechovým ľudským MTN (multi tissue Northern) blotom alebo blotom mRNA ľudskej rakovinovej bunkovej línie alebo mRNA rôznych ľudských rakovinových bunkových línií zreagovali s DNA sondou značenou izotopom rutinným spôsobom, a po premytí filtrov sa získali autorádiografy a tie sa skúmali na tkanivá alebo bunky vykazujúce expresiu tohto génu.

Expresia tohto génu sa obťažne rozpoznala v normálnych ľudských tkanivách. Ich špecifická expresia sa pozorovala iba v rakovinových bunkách a fetálnom mozgu a pľúc (obr. 2, obr. 3).

Príklad 3

Konštrukcia expresného vektora na expresiu ľudského TGC839 proteínu v živočíšnych bunkách

Na expresiu ľudského TGC839 proteínu v živočíšnych bunkách sa skonštruoval expresný vektor. Pri tejto príležitosti, na uľahčenie neskoršej detekcie expresného produktu, na C-koncovú stranu proteínu TGC839 sa zaviedla FLAG sekvencia (DYKDDDDK) pozostávajúca z 8 aminokyselinových zvyškov.

Proteín TGC839, ktorý má pridanú FLAG sekvenciu, sa tu ďalej niekedy označuje špecificky ako „TGC839FLAG proteín“.

Najskôr sa použitím syntetickej DNA navrhnutej pre EcoRI reštrikčné miesto, ktoré sa objavuje bezprostredne proti smeru translačného iniciačného kodónu ATG (5’-GCGCTCGAATTCCACCATGGCAGCAGCCGCCGCTACCAAG 3': SEKV. ID. č. 3) a syntetickej DNA navrhnuej pre aminokyselinovú sekvenciu reprezentovanú DYKDDDDK, ktorá sa objavuje na C konci proteínu TGC839 a je nasledovaná terminačným kodónom a ďalej Notl reštrikčným miestom (5'-GCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCTCTAGGACTCTCCTCAGATGCCAGGGAGGATGAAGCAG 3': sekv. id. č. 4) s cDNA fragmentom kódujúcim proteín TGC839, ktorý sa použil ako templát, uskutoční PCR a je možné tak získať DNA fragment, ktorý obsahuje ORF z TGC839. Tento DNA fragment sa podrobil dvojnásobnému štiepeniu reštrikčnými enzýmami EcoRI (Takara Shuzo) a Eagl (New England Biolabs), potom nasledovalo zavedenie do pCAN618 v jeho mieste EcoRI-Notl, pričom je možné získať v živočíšnych bunkách expresný vektor pCAN618/H839F pre expresiu TGC839FLAG, ľudský proteín TGC839 s FLAG sekvenciou na Ckoncovej strane. Kmeň Escherichia coli SÚRE sa transformoval uvedeným pCAN618/H839F všeobecne známym spôsobom. Získa sa tak Escherichia coli SURE/pCAN618/H839F.

Príklad 4

Sekrečná expresia ľudského TGC839 proteínu do supernatantu kultúry COS-7

Na potvrdenie skutočnosti, že ľudský TGC839 proteín je sekrečným proteínom, uskutočnila sa expresia TGC839FLAG proteínu použitím buniek COS-7 a kontrolovalo sa, či sa sekretoval do média alebo nie. Deň pred transfekciou expresným vektorom skonštruovaným v príklade 3 sa bunky COS7 vysiali s hustotou 4.10⁵ buniek/jamku a kultivovali v médiu DMEM (GibcoBRL) doplnenom 10 % FBS (Hydroclone) v inkubátore s oxidom uhličitým počas 24 hodín. Po 24 hodinách od transfekcie použitím pCAN618/H839 DNA a Effectenu (Qiagen) sa médium vymenilo za Opti-MEM médium (Gibco-BRL) (1 ml) doplnené 0,1 mM ABSF [hydrochlorid 4-(2-aminoetyl)benzénsulfonylfluoridu] (Wako Pure Chemical) a 0,05 % CHAPS {[3-(3-cholamidopropyl)dimetylamonio]propánsulfonová kyselina} (Dojin Kagaku) a v inkubácii sa ďalej pokračuje 36 hodín, kultivačný supernatant sa preniesol do Eppendorfovej skúmavky a odstreďoval. Po odstránení plávajúcich buniek a skoncentrovaní na 1/10 použitím Centricomu 10 (Amicon) sa potom pridal SDS-PAGE tlmivý roztok pre vzorku obsahujúcu rovnaké množstvo DTT a zmes sa podrobila SDS-PAGE. Uskutočnilo sa Westernovo blotovanie použitím anti-FLAG myšej IgC monoklonálnej protilátky (M12; 5 mg/ml, Sigma) ako primárnej protilátky a HRP (chrenovou peroxidázou)-označená anti-myšia IgG protilátka (1/2000, Amersham) alko druhá protilátka.

Výsledkom bolo, že TGC839FLAG proteín sa detegoval ako jediný pás s molekulovou hmotnosťou asi 34 000 intracelulárne a v kultivačnom supernatante ako taký a širší pás ako ten, ktorý sa zistil intracelulárne (obr. 4). Z tohto hľadiska sa vyhodnotilo, že TGC839 proteín sa sekretuje do média s cukrovým reťazcom, ktorý sa pridá na každej z dvoch glykozylačných miest Ntypu vyskytujúcich sa v tomto proteíne.

Príklad 5

Selekcia klonu z banky údajov

Po translácii nukleotidovej sekvencie každej EST na aminokyselinovú sekvenciu sa teda vybrali EST klony, v ktorých sa Met vyskytuje na 5'-konci a hydrofóbna aminokyselinová sekvencia sa nachádza na 5'-koncovej strane a ďalej hydrofilné a hydrofóbne aminokyselinové sekvencie boli prítomné v smere ich viákna a 10. až 30. aminokyselinové zvyšky od prvého zvyšku Met predstavovali signálnu sekvenciu nevyhnutnú pre sekréciu proteínu. Našiel sa teda jeden z nich, HGS:951123. Tento kloň sa riadil z SB a nazval sa TGC838.

Kmeň E. coli, ktorý sa transformoval plazmidom obsahujúcim uvedený gén sa kultivoval konvenčným spôsobom, plazmid sa vyčistil a uvedený gén sa vyštiepil reštrikčnými enzýmami EcoRI a Xhol, pričom sa našli dva génové fragmenty veľkosti asi 1000 nukleotidov a asi 400 nukleotidov. Zistilo sa teda, že veľkosť tohto génu je asi 1400 nukleotidov.

Nukleotidová sekvencia tohto génu sa potom analyzovala fluorescenčným DNA sekvenátorom ABI 377 Prism použitím primérov T7 a T3. Zistená nukleotidová sekvencia a aminokyselinová sekvencia sa uvádzajú na obr. 5.

Tento gén kóduje proteín, ktorý má 246 aminokyselinových zvyškov. Vyhodnotilo sa, že k štiepeniu signálnej sekvencie dochádza medzi 25. (od N konca) aminokyselnovým zvyškom (Ala) a 26. aminokyselinovýrn zvyškom (Gly).

Príklad 6

Potvrdenie génovej expresie

Na vyhodnotenie funkcie génu, ktorý sa získal v príklade 5 sa uskutočnil výskum týkajúci sa jeho expresie v rôznych ľudských tkanivách a v líniách rakovinových buniek.

Najprv použitím DNA fragmentu veľkosti asi 1000 nukleotidov ako sondy, ktorý je získateľný štiepením génu pôsobením EcoRI a Xhol, sa uskutočnila Northernova blotovacia analýza mRNA vzoriek, ktoré sa extrahovali z príslušných tkanív a buniek. Nylonové filtre blotované Clontechovým ľudským MTN (multi tissue Northern) blotom alebo blotom mRNA ľudskej rakovinovej bunkovej línie alebo mRNA rôznych ľudských rakovinových bunkových línií zreagovali s DNA sondou značenou izotopom rutinným spôsobom, a po premytí filtrov sa získali autorádiogramy a tie sa skúmali na tkanivá alebo bunky vykazujúce expresiu tohto génu.

Expresia tohto génu sa obťažne rozpoznala v normálnych ľudských tkanivách. Ich špecifická expresia sa pozorovala iba v rakovinových bunkách a fetálnom mozgu a pľúcach (obr. 6).

Príklad 7

Konštrukcia expresného vektora na expresiu ľudského TGC838 proteínu v živočíšnych bunkách

Na expresiu ľudského TGC839 proteínu v živočíšnych bunkách sa skonštruoval expresný vektor. Pri tejto príležitosti, na uľahčenie neskoršej detekcie expresného produktu, na C-koncovú stranu proteínu TGC838 sa zaviedla FLAG sekvencia (DYKDDDDK) pozostávajúca z 8 aminokyselinových zvyškov.

Proteín TGC839, ktorý má pridanú FLAG sekvenciu, sa tu ďalej niekedy označuje špecificky ako „TGC839FLAG proteín“. Najskôr sa použitím syntetickej DNA navrhnutej pre EcoRI reštrikčné miesto, ktoré sa objavuje bezprostredne proti smeru translačného iniciačného kodónu ATG (5'GCGCTGGAATTCCCACCATGGCAGCAGCCGCCGCTACCAAGATCCTTCTG TGCCTCCCGCTTCT 3': sekv. id. č. 3': sekv. id. č. 7) a syntetickej DNA navrhnuej pre aminokyselinovú sekvenciu reprezentovanú DYKDDDDK, ktorá sa objavuje na C konci proteínu TGC838 a je nasledovaná terminačným kodónom a ďalej Notl reštrikčným miestom (5'-TTGCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGATGCCAGGGAGGATGAAGCAGGGGAGGATGATG 3': sekv. id. č. 8) s cDNA fragmentom kódujúcim proteín TGC838, ktorý sa použil ako templát, uskutoční PCR. Je možné tak získať DNA fragment, ktorý obsahuje ORF z TGC838. Tento DNA fragment sa podrobil dvojnásobnému štiepeniu reštrikčnými enzýmami EcoRI a Notl, potom nasledovalo zavedenie do pCAN618 v jeho mieste EcoRI-Notl, pričom je možné získať expresný vektor pCAN618/H838F pre expresiu TGC838FLAG, ľudský proteín TGC838 s FLAG sekvenciou na C-koncovej strane v živočíšnych bunkách.

Plazmid pCAN618/H838F podľa predloženého návrhu sa zaviedol do kmeňa Escherichia coli XL10-Gold. Je tak možné získať transformant Escherichiacoli XL10-Gold/pCAN618/H838F.

Príklad 8

Čistenie ľudského TGC839 proteínu z kultivačného supernatantu buniek COS7

Pretože sa v príklade 4 dokázalo, že TGC839 proteín sa sekretuje do kultivačného supernatantu buniek COS-7, sa ľudský TGC839FLAG proteín vyčistil z tohto kultivačného supernatantu buniek COS-7. Deň pred transfekciou expresným vektorom skonštruovaným v príklade 3 sa do desiatich 10cm misiek vysejú bunky COS-7 s hustotou 2.10⁶ buniek/doštičku a kultivujú sa v médiu DMEM (Gibco-BRL) doplnenom 10 % FBS (Hyclone) v inkubátore s oxidom uhličitým počas 24 hodín. 24 hodín od transfekcie pomocou pCAN618/H839F DNA a Efectenu (Qiagen) sa médium vymenilo za Opti-MEM médium (GibcoBRL) (4 ml) doplnené 0,1 mM ABASF (Wako Pure Chemical) a 0,05 % CHAPS (Dojin Kagaku) a v inkubácii sa ďalej pokračuje 36 hodín. Kultivačný supematant sa z 10 cm misiek zoberie a prenesie sa do 50 ml centrifugačnej skúmavky. Odstreďuje sa, aby sa odstránili plávajúce bunky a sfiltruje sa 0,2 pm ultrafiltračnou membránou. K tomuto filtrátu sa pridá dvadsaťkrát skoncentrované TBS na konečnú jednonásobnú koncentráciu. Po dvoch opakovaniach adsorpcie na ΑΝΤΙ FLAG M2-agarosovom afinitnomgéli (Sigma) sa požadovaný proteín eluuje tlmivým roztokom glycín-HCI (pH 3,5). Eluát sa podrobí zámene tlmivého roztoku za PBS pomocou odsoľovacej kolóny (PD-10, Amersham Pharmacia) a potom sa zahustí pomocou Centriplus-10, Centricon120 (Amicon) na asi 60 μΙ, takže sa získa čistá vzorka. Táto vyčistená vzorka sa podrobí SDS-PAGE, nasleduje vyfarbenie CBB, pričom sa pozoroval jediný široký pás okolo molekulovej hmotnosti 45 000.

ŕ ŕ ŕ r

Príklad 9

Stanovenie sekvencie aminokyselín na N-konci vyčisteného ľudského TGC839FLAG proteínu gl vyčistenej vzorky, ktorá sa získala v príklade 8, sa aplikuje na aminokyselinový sekvenátor v plynnej fáze, LF3000 proteínový sekvenátor (Beckman-Coulter), aby sa stanovila aminokyselinová sekvencia na N-konci. Výsledkom bolo, že sa zistili aminokyselinové zvyšky: 1. glycín (5,10 pmólu), 2. arginín (6,53 pmólu), 3. alanín (3,97 pmólu) a 4. asparagín (6,92 pmólu) v tomto poradí z N konca.

Na základe hore uvedených zistení sa zistilo, že proteín TGC839 sa sekretuje ako ľudský maturovaný TGC839 proteín začínajúc 26. aminokyselinovým (glycínovým) zvyškom do média po odštiepení signálnej sekvencie pozostávajúcej z 25 aminokyselinových zvyškov na N-konci ľudského TGC839 prekurzorového proteínu.

Príklad 10

Príprava Gly-Arg-Ala-Asp-Pro-His-Ser-Leu-Cys: peptidu TGC-839 (26 až 34)

Boe skupina z 2,27 g východiskového materiálu Boc-Cys(MBzl)-OBzl sa odstránila pôsobením 4N HCI v etylacetáte, HCI soľ sa zneutralizovala ekvimolárnym množstvom TEA a skondenzovala s Boc-Leu vo vode v prítomnosti HONB/WSCD.HCI. Reakčná zmes sa extrahovala etylacetátom, extrakt sa premyl 0,1 N HCI a 5% vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného, vysušil nad bezvodým síranom sodným a rozpúšťadlo sa odstránilo. Tento zvyšok sa prekryštalizoval z etylacetátu a hexánu a kryštály sa izolovali odfiltrovaním. 2,3 g (80,3 %). Použitím tohoto Boc-Leu-Cys(MBzl)-OBzl sa uskutočnila kondenzácia s Boc-Ser(Bzl) a s Boc-His(Bom). Získalo sa 1,23 g Boc-His(Bom)-Ser(Bzl)-Leu-Cys(MBzl)-OBzl (zlúčenina vzorca I). Počínajúc s Pro-OBzl sa syntetizoval Boc-Asp(OcHex)-Pro-OBzl a ten sa katalytický zredukoval, aby sa odstránil benzylester. Získal sa olejovitý Boc-Asp(OcHex)68

Pro-OH (zlúčenina vzorca II). Vychádzajúc z Ala-OBzl, ktorý sa skondenzuje s Boc-Arg(Tos) a Boc-Gly, získa sa Boc-Gly-Arg(Tos)-Ala-OBzl, ktorý sa podrobí katalytickej redukcii. Výsledný Boc-Gly-Arg(Tos)-Ala-OH (zlúčenina vzorca III) sa izoloval odfiltrovaním ako prášok zo zmesi acetonitrilu s dietyléterom. Boe skupina z 0,407 g zlúčeniny vzorca I sa odstránila spracovaním so 4N HCl v etylacetáte. Výsledný produkt sa rozpustil v DMF, zneutralizoval 62 μΙ TEA a potom skondenzoval s 0,23 g zlúčeniny vzorca II použitím 225 mg HOBt a 160 mg WSCD.HCI. Reakčná zmes sa extrahovala etylacetátom, extrakt sa premyl 5% vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného, vysušil nad bezvodým síranom sodným a rozpúšťadlo sa potom odstránilo. Zvyšok sa izoloval ako prášok z acetonitrilu a dietyléteru odfiltrovaním. Získa sa 338 mg (63,8 %) BocAsp(OcHex)-Pro-His(Bom)-Ser(Bzl)-Leu-Cys(MBzl)-OBzl (zlúčenina vzorca IV). Boe skupina zo 187 mg zlúčeniny vzorca IV sa odstránila spracovaním so 4N HCl v etylacetáte. Výsledná zlúčenina vzorca IV sa rozpustila v DMF, zneutralizovala 22 μΙ TEA a potom skondenzovala s 90 mg zlúčeniny vzorca III použitím 79 mg HOBt a 56 mg WSCD.HCI. Rozpúšťadlo sa odstránilo a z etylacetátu sa izolovalo 228 mg gélovitého Boc-Gly-Arg(Tos)-Ala-Asp(OcHePro-His(Bom)-Ser(Bzl)-Leu-Cys(MBzl)-OBzl. Ôasť (117,8 mg) tohto produktu sa nechala reagovať 60 minút s 10 ml bezvodej kyseliny fluorovodíkovej v prítomnosti 974 mg p-krezolu pri 0 °C, čím sa odstránili všetky chrániace skupiny. Peptidová frakcia sa frakcionovala na kolóne s nosičom Sephadex™ G-25 (2,0 krát 80 cm) v 50% kyseline octovej vo vode. Hlavná frakcia sa ďalej naniesla na chromatografickú kolónu s obrátenými fázami (2,6 krát 8,0 cm) naplnenou nosičom Lichroprep™ RP-18. Hlavná frakcia sa lyofilizovala. Získalo sa tak 30 mg bieleho prášku. Analýza hmotnostnej spektrometrie (M+H)⁺: 955,4 (vypočítaná hodnota: 955,4). HPLC elučná doba: 10,5 minúty. Podmienky ma kolóne boli nasledovné. Kolóna: Wakosil 5C189T, 4,6 x 100 mm. Eluent: použitie roztoku A (0,1 % TFA vo vode) a roztoku B (acetonitril obsahujúci 0,1 % TFA), elúcia lineárnym koncentračným gradientom od pomeru A/B 95:5 do 45:55 (25 minút). Prietok: 1,0 ml/minútu.

Príklad 11

Príprava imunogénu obsahujúceho TGC-839 peptid (26 až 34)

Z TGC-839 peptidu (26 až 34), ktorý sa získal hore v príklade 1 a hovädzieho tyroglobulínu (BTG) sa pripravil konjugát a ten sa použil ako imunogén. 10,5 g BTG sa teda rozpustilo v 0,9 ml 0,1 M fosorečnanového tlmivého roztoku (pH 6,7). Tento roztok sa zmiešal so 100 pg DMF roztoku obsahujúceho 1,2 mg N-(y-maleinimidobutyryloxy)sukcínimidu (GMBS) a reakcia prebiehala 30 minút pri teplote miestnosti. Prebytok reakčného činidla GMBS sa odstránil na kolóne s nosičom Sephadex G-25 ekvilibrovaným 0,1 M fosorečnanovým tlmivým roztokom (pH 6,5), ktorý obsahoval 2mM EDTA, potom sa pridalo 7,5 mg BTG s maleinimidovou skupinou a zmiešal sa z roztokom 1,5 mg TGC-839 peptidu (26 až 34) v 0,2 ml DMF. Reakcia trvá dva dni pri 4 °C. Potom sa reakčná zmes dialyzuje proti fyziologickému roztoku dva dni pri 4 °C.

Príklad 12

Imunizácia

Sedemtýždňové myši samičky BALB/C sa subkutánne imunizovali asi 120 pg/zviera imunogenného konjugátu TGC-839 peptidu (26 až 34) s BTG, ktorý sa opisoval hore v príklade 11 spolu s kompletným Freundovým adjuvans. O šesť týždňon neskôr sa podala zosilňovacia injekcia rovnakej dávky imunogénu spoločne s neúplným Freundovým adjuvans a o jeden týždeň neskoršie sa izolovali vzorky krvi.

Príklad 13

Príprava enzýmom označeného antigénu. Príprava TGC-839 peptidu (26 až 34) značeného chreňovou peroxidázou (HRP)

TGC-839 peptid (26 až 34), ktorý sa získal vyššie v príklade 10 sa zosieťoval s HRP (pre enzýmový imunotest, Boehringer Mannheim) a tento produkt sa použil ako označený antigén pre enzýmový imunotest (EIA). 11,6 mg HRP sa teda rozpustilo v 0,95 ml 0,1 M fosforečnanového tlmivého roztoku, pH 6,7, a tento roztok sa zmiešal s 50 μΙ DMF roztoku obsahujúcemu 1,2 mg GMBS. Reakcia trvala 30 minút pri teplote miestnosti. Reakčná zmes sa frakcionovala na kolóne s nosičom Sephadex G-25 ekvilibrovanej 0,1 M fosforečnanovým tlmivým roztokom, pH 6,5. Takto pripravený maleinimidovaný HRP (27 mg) sa zmiešal s 0,38 mg TGC-839 peptidu (26 až 34), ktorý sa pripravil v príklade 10 a reakcia sa uskutočňovala jeden deň pri 4 °C. Potom sa reakčná zmes rozdelí na frakcie na nosiči Ultrogel AcA54 (Pharmacia) ekvilibrovanom 0,1 M fosforečnanovým tlmivým roztokom, pH 6,5. Získa sa tak TGC-839 peptid (26 až 34) označený HRP.

Príklad 14

Meranie proti látkových titrov antiséra pochádzajúceho z myší imunizovaných TGC-839 peptidom (26 až 34)

Myšie antisérum sa meralo na protilátkový titer spôsobom, ktorý sa uvedie nižšie. Na prípravu mikrodoštičiek s nadviazanou antimyšou imunoglobulínovou protilátkou sa 0,1 M uhličitanový tlmivý roztok, pH 9,6, ktorý obsahuje 100 pg/ml kozie antimyšie imunoglobulínové protilátky (IgG frakcia, Kappel) rozdelí na 100μΙ podiely do jamiek mikrotitrovacích dosiek s 96 jamkami a nechá sa stáť 24 hodín pri 4 °C. Potom sa dosky premyjú fosforečnanovým tlmivým soľným roztokom (PBS, pH 7,4) a na blokovanie nadbytočných väzbových miest jamiek sa PBS, pH 7,2, obsahujúci 25 % Block

Ace (Snow Brand Milk Products) a 0,1 % NaN₃ rozdelia po 300μΙ podieloch do jamiek. Nasleduje spracovanie počas aspoň 24 hodín.

Do každej hore uvedenej jamky mikrodoštičiek s nadviazanou antimyšou imunoglobulínovou protilátkou sa pridá 100μΙ myšieho antiséra zriedeného tlmivým roztokom EC [0,02M, fosforečnanový tlmivý roztok, pH 7,0, obsahujúci 0,2 % BSA, 0,4M NaCl, 0,4 % Block Ace, 0,05 % CHAPS [3-[(cholamidopropyl)dimetylamonio]propánsulfónová kyselina, 2mM EDTA a 0,1 % NaN₃] a reakcia sa uskutočňuje 16 hodín pri 4 °C. Potom sa dosky premyjú PBS, pH 7,4 a do každej jamky sa pridá 100 μΙ 120-násobného zriedenia HRPoznačeného TGC-839 peptidu (26 až 34), ktorý sa vyrobil v príklade 13 ako zriedený tlmivým roztokom C [0.02M fosforečnanový tlmivý roztok, pH 7,0, obsahujúci 1 % BSA, 0,4M NaCl a 2mM EDTA]. Reakcia sa uskutočňuje 7 hodín pri teplote miestnosti. Potom sa dosky premyjú PBS, pH 7,4 a enzýmová aktivita na každej pevnej fáze sa zmeria pridaním 100 μΙ TMB mikrojamkového perioxidázového substrátového systému (Kirkegaard & Perry Lab., činidlo: Funakoshi Yakuhin) a reakcia sa uskutočňuje 10 minút pri teplote miestnosti. Po skončení reakcie pridaním 100 μΙ 1M kyseliny fosforečnej sa zmeria absorbancia pri 450 nm použitím čítačky dosiek (MTB-120, Corona). Výsledky sa uvádzajú na obrázku 7. Pri všetkých 8 imunizovaných myšiach sa pozorovalo zvýšenie protilátkového titra na TGC-839 peptid (26 až 34).

Príklad 15

Produkcia monoklonálnej TGC-peptidovej (26 až 34) protilátky

Myšie číslo 3 a 8, ktoré vykazovali relatívne vysoké protilátkové titry, sa podrobili konečnej imunizácii intravenóznym podávaním 240 pg imunogénu TGC-839 peptid (26 až 34) - BTG. Štyri dni po konečnej imunizácii sa od každej myši vyrezala slezina a za tlaku sfiltrovala sitom v nehrdzavejúcej ocele. Bunky sa nechali plávať v Eaglovom minimálnom esenciálnom médiu (MEM). Získala sa tak suspenzia splenocytov. Bunky, ktoré sa použili pre napojenie buniek boli myelomové bunky P3-X63.Ag8.U1 (P3U1) pochádzajúce z myššej BALB/C (Current Topics in Microbiology and Immunology1978, 81, 1.). Napojenie buniek sa uskutočnilo podľa pôvodného spôsobu (Náture 1975, 256, 495.). Splenocyty, respektíve bunky P3U1, sa teda trikrát premyli médiom MEM bez séra, a splenocyty a bunky P3U1 sa spolu zmiešali v pomere 6,6:1. Táto zmes sa odstreďovala 15 minút pri 750 otáčkach za minútu. Týmto odstreďovaním sa bunky usadili. Po dostatočnom odstránení supematantu sa usadenina mierne rozláme na kúsky, pridá sa 0,3 ml 45% polyetylénglykolu (PEG) 6000 (KochLight) a napojenie sa uskutoční tým, že sa zmes nechá stáť 7 minút v nádrži s 37 °C teplou vodou. Po napojení sa k bunkám postupne pridáva MEM. Po celkovom pridaní 15 ml MEM sa zmes odstreďuje 15 minút pri 750 otáčkach za minútu a supernatant sa odstráni. Tento bunkový sediment sa nechá plávať v GIT médiu (Wako Pure Chemicals) obsahujúcom 10 % plodového teľacieho séra (GIT - 10% FCS) na koncentráciu 2.10⁵ buniek P3U1 na ml a bunková suspenzia sa vyseje v 1ml dávkach do 168 jamiek multidosiek s 24 jamkami (Linbro). Potom sa bunky inkubujú pri 37 °C v inkubátore s 5 % oxidu uhličitého. Po 24 hodinách sa do každej jamky pridá 1 ml GIT -10% FCS média obsahujúceho HAT (I.IO^M hypoxantín, 4.10'⁷M aminopterín a 1,6.10'³M tymidín). Tým sa iniciuje kultúra selektívnej HAT. Táto kultúra selektívnej HAT potom pokračuje s 1 ml starého média odstráneného a 1 ml HAT média pridaného namiesto 4 dní na 7 dní po začiatku inkubácie. Proliferácia hybridomov sa zaznamenala 9. deň po napojení buniek. Supernatant sa izoloval.

Protilátkový titer kultivačného supematantu sa zmeral spôsobom, ktorý sa opisoval v príklade 14 s istými modifikáciami. Tak 100 μΙ kultivačného supematantu a 100 μΙ 200-násobného zriedenia HRP-označeného TGC-839 peptidu (26 až 34), ktorý sa zriedil tlmivým roztokom C, sa pridalo do každej jamky mikrodoštičiek s nadviazanou antimyšou imunoglobulínovou protilátkou. Reakcia bežala cez noc pri 4 °C. Doštičky sa premyli PBS. Potom sa spôsobom, ktorý sa opisoval v príklade 14 merala enzýmová aktivita na každej pevnej fáze. Zo 168 jamiek, ktoré boli pozitívne čo sa týka proti látkového titra, sa vybralo 60 jamiek a hybridomy sa skladovali v mraze. Hybridomy z 9 jamiek, menovite hybridomy č. 39, č. 53, č. 61, č. 76, č. 85, č. 112, č. 128, č. 139 a č.

r f

151 sa ďalej podrobili klonovaniu spôsobom zrieďovania. Pri uskutočňovaní klonovania sa do každej jamky ako kŕmnej bunky pridalo 5.10⁵ tymocytov myšej BALB/C. Po klonovaní sa rovnakým spôsobom stanovil protilátkový titer každého kultivačného supernatantu. Pozitívne klony sa detegovali v 6 jamkách z 20 jamiek pochádzajúcich z č. 39, v 2 jamkách pochádzajúcich z č. 53, v 5 jamkách z 20 jamiek pochádzajúcich z č. 61, v 9 jamkách z 20 jamiek pochádzajúcich z č. 76, v 8 jamkách z 20 jamiek pochádzajúcich z č. 85, v 3 jamkách zo 40 jamiek pochádzajúcich z č. 112, v 13 jamkách z 50 jamiek pochádzajúcich z č. 128, v 2 jamkách z 30 jamiek pochádzajúcich z č. 139 a v 4 jamkách z 20 jamiek pochádzajúcich z č. 151.

Z týchto sa klony č. 39-35, č. 53-16, č. 61-2, č. 76-12, č. 85-16, č. 112-3, č. 128-18, č. 139-26 a č. 151-2 vybrali ako hybridomy produkujúce monoklonálny TGC-839 peptidovú (26 až 34) protilátku.

Príklad 16

Stanovenie skupiny a podskupiny monoklonálnych protilátok

Podľa postupu, ktorý sa opisoval v príklade 14, sa pripravili mikrodosky s nadviazanou protikráličou IgG protilátkou. Tak sa 0,1 M uhličitanový tlmivý roztok, pH 9,6, obsahujúci 100 pg/ml kozej protikrálikovej imunoglobulínovej protilátky (IgG frakcia, Kappel) rozdelí na 100μΙ podiely do jamiek mikrodosiek s 96 jamkami a nechá sa stáť 24 hodín pri 4 °C. Dosky sa potom premyjú fosforečnanovým soľným tlmivým roztokom (PBS, pH 7,4) a na blokovanie madbytočných väzbových miest na každej jamke sa do jamiek rozdelí v 300μΙ podieloch PBS, pH 7,2, obsahujúci 25 % Block Ace (Snow Brand Milk Products) a 0,1 % NaN₃. Nasleduje spracovanie počasaspoň 24 hodín pri 4 °C. Potom sa na mikrodosky s nadviazanou protikráličou IgG protilátkou pridá 50 μΙ tlmivého roztoku EC a 100 μΙ subtypovo špecifickej protilátky obsiahnutej v zostave BioRad Isotyping kit. Reakcia sa nechá bežať jeden deň pri 4 °C. Dosky sa premyjú PBS, pH 7,4, potom sa pridá každý z hore uvedených hybridomových kultivačných supematantov a reakcia sa nechá bežať jeden deň pri 4 °C.

Dosky sa premyjú PBS, pH 7,4, do každej jamky sa pridá 100 μΙ 400-násobné zriedenie HRP-označeného TGC-839 peptidu (26 až 34), ktorý sa vyrobil v príklade 13 (zriedeného tlmivým roztokom C) a reakcia sa nechá bežať 6 hodín pri teplote miestnosti. Dosky sa premyjú PBS, pH 7,4, a nakaždej pevnej fáze sa zmeria enzýmová aktivita spôsobom, ktorý sa opisuje v príklade 14. Výsledkom bolo, že skupina a podskupina každej z monoklonálnych protilátok produkovaných hore uvedenými hybridomami boli nasledujúce: č. 39-35 (lgG3), č. 53-16 (lgG3), č. 61-2 (lgG2a,3ó, č. 76-12 (lgG3), č. 85-16 (lgG2, k), č. 112-3 (lgG1), č. 128-18 (lgG1, k), č. 139-26 (lgG1) a č. 151-2 )lgG2a).

Príklad 17

Kompetitívna EIA

Reaktivita TGC839 peptidu (26 až 34) každej vybranej monoklonálnej anti-TGC-839 peptidovej (26 až 34) protilátky sa skúmala kompetitívnou EIA. Najskôr sa spôsobom, ktorý sa opisuje v príklade 14, stanovil protilátkový titer každého kultivačného supernatantu, ktorý obsahoval monoklonálnu protilátku. Stanovila sa koncentrácia protilátky, ktorá sa použije v kompetitívnej EIA. Potom sa do každej jamky mikrodoštičiek s nadviazanou antimyšou imunoglobulínovou protilátkou pridá 50 μΙ roztoku protilátky zriedenej tlmivým roztokom C na zvolené koncentrácie, 50 μΙ jedného zo seriálových zriedení (0, 0,156, 0,625, 2,5, 10, 40 ng/ml) TGC-839 peptidu (26 až 34) v tlmivom roztoku C a 50 μΙ HRP-označeného TGC-839 peptidu (26 až 34) (1500násobného zriedenia tlmivým roztokom C). Reakcia sa nechá bežať jeden deň pri 4 °C. Potom sa dosky premyjú PBS, pH 7,4 a enzýmová aktivita na každej pevnej fáze sa stanoví spôsobom, ktorý sa opisuje v príklade 14. Výsledky sú uvedené na obrázku 8. Nadviazanie týchto monoklonálnych protilátok na HRPoznačený TGC-839 peptid (26 až 34) sa inhibovalo z 33 až 92 % 40 ng/ml TGC-839 peptidu (26 až 34). Zistilo sa teda, že tieto protilátky reagujú s TGC839 peptidom (26 až 34). Zvlášť č. 128-18 a č. 112-3 vykazovali vysoké hladiny afinity s hodnotami 50% inhibicie nadviazania v pojmoch B/B_o, ktoré boli 2 ng/ml, respektíve 7 ng/ml, pričom B/B_o znamená: [množstvo HRP-označeného

TGC-839 peptidu (26 až 34) nadviazaného na každú protilátku v prítomnosti TGC-839 peptidu (26 až 34)/množstvo HRP-označeného TGC-839 peptidu (26 až 34) nadviazaného na každú protilátku v neprítomnosti TGC-839 peptidu (26 až 34).

Príklad 18

Expresia hybridomov v kvapaline myších ascitov

Skúšala sa expresia hybridomov č. 128-18 a 112-3 v kvapaline myších ascitov. Každý z hore uvedených hybridomov (1 až 3.10⁶ buniek/zviera) sa podal intraperitoneálne myšiam (samičky, BALB/C), ktorým sa vopred podalo intraperitoneálne 0,5 ml minerálneho oleja. Po 6 až 2 0 dňoch sa izolovali kvapaliny ascitov obsahujúcich protilátku. Získané monoklonálne protilátky sa vyčistili z kvapaliny ascitov získanej na kolóne s Proteínom A. Okolo 25 ml každej kvapaliny ascitov sa teda zriedilo rovnakým objemom viažúceho tlmivého roztoku (1,5M glycín, pH 9,0, obsahujúci 3,5M NaCl a 0,05 % NaN₃) a nanieslo na kolónu s nosičom Recombinant Protein A-agarose (Repligen), ktorá sa vopred akvilibrovala väzbovým tlmivým roztokom. Špecifická protilátka sa eluovala elučným tlmivým roztokom (0,1 M citrátový tlmivý roztok, pH 3,0, obsahujúci 0,05 % NaN₃). Eluát sa dialyzoval proti PBS, pH 7,4, dva dni pri 4 °C. Potom sa sterilné sfiltroval použitím 0,22μιτι filtra (Millipore) a skladoval pri 4 °C alebo pri -80 °C. Takto získané monoklonálne protilátky sa označili 128-15 protilátka, respektíve 112-3 protilátka.

Príklad 19

Produkcia králičieho antiséra rozoznávajúceho čiastočné peptidy pochádzahúce z TGC-838

Rovnakým spôsobom, ako sa uvádza v príklade 10, sa syntetizoval peptid pozostávajúci z 25 aminokyselinových zvyškov zodpovedajúcich Tyr₁₆sCysigg (Met zodpovedajúci iniciačnému kodónu translácie sa počítal ako prvý) proteínu TGC838. Konjugát sa pripravil tak, že sa nechá zreagovať 8,2 mg tohto peptidu s 19,7 mg Keyhoke Lympet hemokyanínu použitím N-(6maleinimidokaproyloxy)sukcínimidu vo fosforečnanovom tlmivom roztoku (20mM, pH 7,4) obsahujúcom 8M močovinu a 0,9% NaCl 15 hodín pri teplote miestnosti. Králiky sa subkutánne imunizovali takto získaným konjugátom v niekoľkých dávkach zmiešaných s adjuvans. Po imunizácii sa krv izolovala a odstred’ovala, aby sa oddelili korpuskulárne zložky. Získa sa tak antisérum.

Príklad 20

Konštrukcia TGC838 expresného vektora

Na expresiu ľudského TGC838 proteinu v živočíšnych bunkách sa skonštruoval expresný vektor. Najskôr sa použitím syntetickej DNA navrhnutej pre EcoRI reštrikčné miesto, ktoré sa objavuje bezprostredne proti smeru translačného iniciačného kodónu (5'-GCGCTGAATTCCCACCATGGCAGCAGCCGCCGCTACCAAGATCCTTCTGTGCCTCCCGCTTCT 3’: sekv. id. č. 7) a syntetickej DNA navrhnutej pre miesto rozpoznateľné reštrikčným enzýmom Notl, ktoré sa zdá byť bezprostredne v smere vlákna terminačného kodónu (5'TTGCGGCCGCTCAGATGCCAGGGAGGATGAAGCAGGGGAGGATGATG 3': sekv. id. č. 9), s cDNA fragmentom kódujúcim proteín TGC838 ako templát, uskutoční PCR. Tak je možné získať DNA fragment obsahujúci ORF z TGC838. Tento DNA fragment sa štiepil reštrikčnými enzýmami EcoRI a Notl, nasledovalo zavedenie do pCAN618 v jeho mieste EcoRI-Notl, pričom je možné získať expresný vektor pCAN618/H838 pre expresiu ľudského proteinu TGC838 v živočíšnych bunkách.

Príklad 21

Expresia TGC838 a TGC839 proteínov v COS7 bunkách

Bunky COS7 (4.10⁵ buniek/jamku) sa inkubovali v DMEM (médium;

Gibco-BRL) doplnenom 10 % FBS (plodové hovädzie sérum) na doskách so 6 jamkami počas 24 hodín. Do týchto buniek sa zaviedol expresný vektor pCAN618/H838 DNA, pCAN618/H838F DNA alebo pCAN618/H839F, ktoré sa získali v príklade 20, príklade 3 alebo v príklade 7, použitím LipofectAMINE (Gibco-BRL) a v inkubácii sa pokračovalo ďalších 18 hodín. Potom sa médium vymenilo za Opti-MEM médium (Gibco-BRL) obsahujúcom 0,05 % CHAPS a v inkubácii sa ďalej pokračuje 24 hodín. Každý kultivačný supematant sa izoloval, odstreďovaním sa zbavil plávajúcich buniek a buď ako taký alebo po zahustení ultrafiltráciou (Centricon-10, Amicon) sa skúmal na exprimovaný produkt.

Príklad 22

Expresia proteínu TGC838 v bunkách CHO-K1

Expresný vektor TGC838 proteínu sa zaviedol do CHO-K1 buniek spôsobom koprecipitácie s fosforečnanom vápenatým. Najskôr sa 1.10⁵ buniek CHO-K1 24 hodín inkubuje v 10cm miske obsahujúcej Hamovo F12 médium (Gibco BRL) obsahujúce 10 % FBS. Oddelene sa k hore uvedeným CHO-K1 bunkám pridá koprecipitát, ktorý sa získal v príklade 20 koprecipitáciou pCAN618/H838 DNA fosforečnanom vápenatým použitím zostavy CelIPhect Transformation Kit (Pharmacia). Po 12 hodinovej inkubácii sa bunky premyjú dvoma 5ml podielmi Hamovho F12 média (bez FBS), pridajú sa 3 ml glycerolového roztoku (15% glycerol, 150mM NaCl, 20mM HEPES (pH 7,4)) a zmes sa nechá stáť 3 minúty. Bunky sa jedenkrát premyjú 5 ml Hamovho F12 média (bez FBS) a pridá sa Hamovo F12 médium, ktoré obsahuje 10 % FBS. Nasleduje 36 hodín inkubácie. Médium sa nahradí Hamovým F12 médiom, ktoré obsahuje 500 pg/ml Geneticinu (Wako Pure Chemical) a 10 % FBS a v inkubácii sa pokračuje ďalších 24 hodín. Potom na získanie expresného bunkového klonu, ktorý pochádza z jednej bunky obmedzujúcim spôsobom zrieďovania sa uskutoční inkubácia buniek v rôznych pomeroch riedenia v Hamovom F12 médiu, ktorý obsahuje 500 pg/ml Geneticinu a 10% FBS na doskách s 96 jamkami. Týmto spôsobom je možné získať od jednej bunky odvodenú bunkovú líniu CHO-K1 exprimujúcu TGC838 proteín CHOK1/TGC838N-4. Izolácia kultivačného supematantu z CHO-K17TGC838N-4 sa premení po 24 hodinovej inkubácii po výmene média za Opti-MEM, ktorý obsahuje 0,05 % CHAPS na logaritmickú fázu rastu buniek. Supernatant sa zbaví plávajúcich buniek odstreďovaním a potom sa skúma na expresný produkt.

Príklad 23

Expresia TGC839 proteínu v bunkách CHO-K1

Expresný vektor TGC839 proteínu sa zaviedol do CHO-K1 buniek spôsobom koprecipitácie s fosforečnanom vápenatým rovnakým spôsobom, ako sa opisuje v príklade 22. pCAN618/H839F DNA, ktorá sa získala v príklade 3 sa zavedie do buniek CHO-K1 kultivovaných na 10cm miske a vyberie sa použitím Geneticinu. Z vyrastených buniek sa bunky po expresii vyberú najskôr selekciou kolónií a potom sa získa obmedzujúcim spôsobom zrieďovania bunková línia CHO-K1, CHO-K1/618/839F6-3, exprimujúca TGC839 proteín, pochádzajúci z jedninej bunky. Izolácia kultivačného supernatantu z CHOK1/618/839F6-3 sa uskutoční rovnakým spôsobom ako v príklade 22.

Príklad 24

Westernova blotová analýza TGC838 proteínu a TGC839 proteínu

SDS-vzorka tlmivého roztoku, ktorá obsahuje merkaptoetanol sa pridá ku kultivačnému supernatantu získaného v príkladoch 21 až 23 (kultivačný supernatant, ktorý sa získal s bunkami COS7 alebo CHO-K1 s expresným vektorom pCAN618/H838 alebo pCAN618/H838F DNA alebo expresným vektorom pCAN618/H839F DNA do nich zavedeným) a zmes sa podrobí elektroforéze naPeptide-PAGE (TEFCO). Nasleduje elektrický prenos na PVDF membránu (Amersham). Ako primárna protilátka sa použije králičie antisérum, ktoré sa získalo v príklade 19 (2000-násobné zriedenie), myšie antisérum, ktoré sa získalo v príklade 12 (50 000-násobné zriedenie), myší IgG, ktorý sa získal v príklade 18 (2 pg/ml) alebo anti-FLAG myší IgG (10 pg/ml, Sigma) a ako druhá protilátka sa použije HRP (chrenovou peroxidázou) označená protimyšia IgG protilátka (2000-násobné zriedenie, Amersham) alebo HRP označená protikráličia IgG protilátka (2000-násobné zriedenie, Amersham). Vyvinutie larvy sa uskutoční použitím ECLplus Westernovho blotovacieho detekčného systému (Amersham). Výsledkom je zistenie, že TGC838 proteín a TGC839 proteín sa sekretujú do kultivačného supernatantu (obr. 9). Taktiež sa zistilo pri kultivačnom supernatante, ktorý sa získal s bunkami COS7 nesúcimi pCAN618/H838 alebo pCAN618/838F DNA do nich zavedenú, že sekrečné produkty sú svojou pohyblivosťou elektroforeticky identické a pretože sa nemôžu detekovať protilátkami na anti FLAG peptidy sa zistilo, že TGC838 proteín sa sekretuje vo forme pochádzajúcej zo spracovania C konca (obr. 10 a obr. 11).

Prl· iad 25

Imunoprecipitácia za použitia protilátok na TGC838 proteín a TGC839 proteín

Nosič Proteín G Sepharose (10 μΙ; Pharmacia) sa spracoval 30 minút s TBS-T/BSA (25mM Tris-HCI (pH 7,2), 150mM NaCl, 0,05% Tween 20, 0,01% BSA). Potom sa pridalo 10 μΙ myšieho IgG alebo 5 μΙ králičieho antiséra, každé zriedené TBS-T/BSA, a reakcia sa nechá bežať dve hodiny. Po troch premytiach TBS-T/BSA sapridá kultivačný supernatant, ktorý sa získal v príklade 21 (kultivačný supernatant z buniek COS7 nesúcich expresný vektor pCAN618/H838F DNA alebo expresný vektor pCAN618/H839F DNA, zahustený ultrafiltráciou) a reakcia sa nechá bežať dve hodiny. Po štvornásobnom premytí TBS-T/BSA sa pridá tlmivý roztok SDS-vzorky a nadviazaný proteín sa eluuje pri 90 °C dve minúty. K eluátu sa pridá rovnaký objem tlmivého roztoku SDS-vzorky, ktorý obsahuje 2-merkaptoetanol a zmes sa podrobí elektroforéze na Peptide-PAGE (TEFCO). Nasleduje elektrický prenos na PVDF membránu (Amersham) a ďalej nasleduje analýza Westemovým blotovaním (obr. 12). Ako primárna protilátka sa použije myšie antisérum (č. 8 myši; ktoré sa opisuje v príklade 14) a ako druhá protilátka sa použije HRP označená protimyšia IgG protilátka (2000-násobné zriedenie). Vyvinutie farby sa uskutoční použitím EDLplus Westernovho blotovacieho detekčného systému (Amersham).

Príklad 26

Potvrdenie pridania cukrového reťazca k TGC838 proteínu a TGC839 proteínu

Na potvrdenie skutočného pridania cukrového reťazca do dvoch N-typov glykozylačných miest, ako sa očakáva z aminokyselinových sekvencii TGC838 proteínu a TGC839 proteínu, uskutočnila sa eliminácia cukrového reťazca spracovaním s enzýmom. Kultivačný supernatant, ktorý sa získal v príklade 21 z buniek COS7 sa 10-násobne skoncentroval ultrafiltráciou a podrobil eliminácii cukrového reťazca použitím zostavy „N-glycosidase F deglycosylation kit (Boehringer). Reakčný produkt sa skoncentroval ultrafiltráciou a potom sa podrobil analýze Westemovým blotovaním rovnakým spôsobom, ako sa opisuje hore v príklade 24. Výsledkom bolo, že ako TGC838 proteín tak aj TGC839 proteín vykazovali posun k miestu s menšou molekulovou hmotnosťou s asi 10 000, čo jasne ukazuje na skutočné pridanie N-typu cukrového reťazca (Obr. 13).

Príklad 27

Kultivácia ľudskej bunkovej línie chondrosarkómu (SW1353) a izolácia kultivačného supematantu

Bunky SW1353 sa nechali rásť do neskorej logaritmickej fázy v médiu L15 (ICNN Biochemicals), ktoré obsahovalo 10 % FBS. Kultivačný supernatant sa izoloval. Plávajúce bunky sa odstránili odstreďovaním a supernatant sa skontroloval na produkt expresie.

Príklad 28

Získanie EIA systému použitím anti-TGC839FLAG monoklonálnej protilátky

Nasledujúcim spôsobom sa pripravil TGC839FLAG. 1000 ml kultivačného supematantu TGC839FLAG produkujúcich buniek CHO-K1/61881

839 F 6-3, ktoré sa získali v príklade 23 sa teda skoncentrovalo na 20 ml zariadením s dutými vláknami. K tomuto koncentrátu sa pridala 1/10 500mM MOPS tlmivého roztoku (pH 7,5), ktorý obsahoval 1,5M NaCI a táto zmes sa pre adsorpciu TGC839FLAG naniesla na 5 ml afinitného gélu Anti-FLAG M2 (Sigma) ekvilibrovaného 50mM MOPS tlmivým roztokom (pH 7,5), obsahujúcim 150mM NaCI. Tento gél sa riadne premyl 50mM MOPS tlmivého roztoku (pH 7,5) obsahujúcim 150mM NaCI a potom sa TCG839FLAG eluoval 100mM glycín-HCI tlmivým roztokom (pH 3,5). Eluát, ktorý obsahoval TGC839FLAG sa ďalej zneutralizoval 1M Tris-HCI tlmivým roztokom (pH 9,0) a potom sa zahustil na 1 ml použitím zariadenia Centricon 30 (Amicon). Koncentrácia proteínu vo vyčistenej vzorke sa stanovila použitím činidla na testovanie BCA proteínu (PIERCE). Výsledkom bolo, že z 1000 ml kultivačného supernatantu bolo možné získať okolo 500 pg TGC839FLAG.

Bunky, ktoré produkujú anti-TGC839FLAG monoklonálnu protilátku, sa produkovali rovnakým spôsobom ako sa opisuje v príklade 15. Myši sa teda imunizovali TGC839FLAG, ktorý sa vyčistil podľa hore uvedeného spôsobu. Potom sa z myší izolovali splenocyty a napojili na P3X63Ag8U.1 myšie myelomové bunky. Získajú sa tak hybridómy. Potom sa z klonov, ktoré vykazovali protilátkový titer na TGC839FLAG vybrali hybridom 839-01, ktorý produkuje monoklonálnu protilátku č. 839-01 a hybridom 839-02, ktorý produkuje monoklonálnu protilátku č. 839-02 ako hybridómy produkujúce antiTGC839FLAG monoklonálnu protilátku.

EIA systém používajúci anti-TGC839FLAG monoklonálnu protilátku sa pripravil nasledujúcim spôsobom. Polystyrénové perličky (s priemerom 0,3 cm) (Immunochemical) sa ponorili do 50mM MOPS tlmivého roztoku (pH 7,5) obsahujúceho anti-TGC839FLAG monoklonálnu protilátku č. 839-01 (20 pg/ml) cez noc pri 4 °C a potom sa trikrát premyli 50mM tlmivého roztoku (pH 7,5) obsahujúcom 1 % BSA. Perličky sa potom ponorili do 50mM tlmivého roztoku (pH 7,5), ktorý obsahoval 1 % BSA a ďalej sa nechali stáť cez noc pri 4 °C. Získajú sa tak perličky s anti-TGC839FLAG monoklonálnou protilátkou. Oddelene sa anti-TGC839FLAG monoklonálna protilátka č. 839-02 označila peroxidázou (POD, Roche) konvenčným spôsobom (spôsobom, ktorý sa opisuje v Eiji Ishikawa: Koso Hyosiki Ho (Methods of Enzýme Labeling), 1991, strana 62, Gakkai Shuppan Center).

Testovanie TGC839FLAG sa uskutočnilo použitím reakčných činidiel, ktoré sa pripravili hore opísaným spôsobom a plno automatizovaným zariadením na chemiluminiscenčný enzýmový imunotest Spherelight 180 (Olympus Optical Co.). V hore uvedenom testovacom zriadení sa teda jedna z hore uvedených perličiek s anti-TGC839FLAG monoklonálnou protilátkou nechala zreagovať s 50 μΙ štandardného roztoku TGC839FLAG, ktorý sa upravil na jednu z vopred stanovených koncentrácií 90 μΙ 50mM MOPS tlmivým roztokom (pH 7,5), ktorý obsahoval 2 % BSA počas 7 minút pri 37 °C. Potom sa gulička odobrala a premyla fyziologickým soľným roztokom. Táto gulička sa potom nechala zreagovať so 140 μΙ roztoku s POD-označenou antiTGC839FLAG monoklonálnou protilátkou zriedenou 50mM MES tlmivým roztokom (pH 6,5), ktorý obsahoval 2 % BSA na koncentráciu 5 μΙ protilátky/ml počas 7 minút pri 37 °C. Potom sa gulička premyla fyziologickým soľným roztokom a ďalej sa nechala zreagovať so 140 μΙ 50mM Tris-HCl tlmivého roztoku (pH 8,5), ktorý obsahoval 5mM luminiol a 0,02 % peroxidu vodíka. Zmeralo sa množstvo vyžarovaných impulzov (počet impulzov za sekundu) (tabuľka 1). Výsledkom bolo získanie pracovnej krivky, ktorá sa uvádza na obr.

14.

Tabuľka 1

Koncentrácia TGC839FLAG (ng/ml)	Počet impulzov za sekundu
0,01	6 834
0,1	48 003
1	565 938
10	5 909 534
100	37 024 872

Použitím takto získaného EIA systému sa kvantitatívne vyhodnotil TGC838 v kultivačných supematantoch pochádzajúcich z rôznych bunkových línií a vzoriek plazmy odobratých od normálnych zdravých subjektov a od pacientov s rakovinou. Kultivačné supernatanty CHO-K1/TGC838N-4 a COS7/TGC838 buniek sa získali nasledujúcim spôsobom. CHO-K1/TGC838N4 bunky, ktoré sa získali v príklade 22 sa kultivovali až do subkonfluentného stavu na doskách so 6 jamkami. Potom sa kultivačná kvapalina nahradila médiom Opti-MEM (Lifetech Oriental) obsahujúcim 0,05 % CHAPS a v inkubácii sa pokračovalo počas dvoch dní. Na druhej strane sa spôsobom, ktorý sa opisuje v príklade 21 izoloval kultivačný supernatant buniek COS7/TGC838. Kultivačný supernatant SW1353 buniek sa izoloval po kultivácii na médiu MEM doplnenom 10 % plodového hovädzieho séra až do subkonfluentného stavu. Ď?'ej sa kvantitatívne vyhodnotil TGC838 vo vzorkách plazmy, ktoré sa odobrali od normálnych zdravých subjektov (5 mužov (M) a 3 ženy (F) a od pacientov s rakovinou (6 prípadov hepatocelulámeho karcinómu (HCC), 3 prípady rakoviny hrubého čreva). Príslušné výsledky sú uvedené v tabuľke 2, tabuľke 3 a v tabuľke 4 rovnako ako na obr. 15 a na obr. 16, kde sú obsahy TGC838 vo vzorkách plazmy odobraných zdravým normálnym subjektom a pacientom s rakoviny uvedené v pojmoch absorbancie pri 490 nm. Obsahy TGC838 v supematantoch, ktoré sa získali z rôznych kultivovaných buniek sa uvádzajú v pojmoch spracovaných z pracovnej krivky skonštruovanej použitím obsahov vyčisteného rekombinantného TGC838 proteínu ako kontroly.

Tabuľka 2

Č.	Absorbancia	Stred
M1	0,028	0,027	0,028
M2	0,021	0,019	0,020
M3	0,021	0,018	0,020
M4	0,028	0,030	0,029
M5	0,039	0,035	0,037
F1	0,034	0,036	0,035
F2	0,024	0,022	0,023
F3	0,024	0,028	0,026
Stred		-	0,027

Tabuľka 3
£	Absorbancia	Stred
HCC-1	0,067	0,070	0,069
HCC-2	0,070	0,063	0,067
HCC-3	0,083	0,078	0,081
HCC-4	0,090	0,098	0,093
HCC-5	0,125	0,131	0,128
Hrubé črevo -1	0,024	0,030	0,027
Hrubé črevo - 2	0,126	0,124	0,125
Hrubé črevo - 3	0,081	0,100	0,091
Stred	-		0,085

Tabuľka 4

Kultivačná kvapalina TGC838 (ng/ml)

CHO-K1/TGC838N-4 pôvodná 111,04

CHO-K1/TGC838N-410násobok 10,75

CHO-K1/TGC838N-4 100násobok 1,06

COS7/TGC838 pôvodný 113,21

COS7/TGC838 10násobok 10,38

COS7/TGC838 100 násobok 0,98

SW1353 (bunková línia ľudského chondrosarkómu)-1 pôvodná 10,58

SW1353 (bunková línia ľudského chondrosarkómu)-1 10násobok 0,93

SW1353 (bunková línia ľudského chondrosarkómu)-1 100násobok 0,07

SW1353 (bunková línia ľudského chondrosarkómu)-2 pôvodná 16,29

SW1353 (bunková línia ľudského chondrosarkómu)-2 10násobok 1,32

SW1353 (bunková línia ľudského chondrosarkómu)-2 10Onásobok 0,11

Príklad 29

Identifikácia buniek viažúcich TGC839 proteín FACS

1) Príprava korpuskulárnych buniek

Korpuskulárne bunky sa pripravili z ľudskej periférnej krvi špecifickým gratitačným odstreďovaním. Ľudská peridéma krv (40 ml) doplnená o 0,1 % dvojsodnej soli EDFTA sa zriedila rovnakým objemom PBS. Do 15ml odstredivkových skúmaviek sa distribuoval Ficoll-Paque PLUS (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Švédsko, 17-1440-02) po 3,5ml dávkach a prevrstvil sa 7ml podielmi zriedenej krvi. V každej skúmavke sa korpuskulárna vrstva pozostávajúca z lymfocytov a monocytov oddelila a izolovala tridsaťminútovým odstreďovaním pri 400 x g. K izolovaným korpuskulárnym bunkám sa pridali 3 objemy PBS, zmes sa odstreďovala a takto premyté bunky sa izolovali, ďalej premyli trikrát PBS a znovu izolovali.

2) Vyfarbovanie získaných korpuskulárnych buniek

Ku každým 2.10⁶ korpuskulárnym bunkám sa pridalo 100 μΙ premývacieho roztoku (PBS/0,1 % NaNVI % FBS) obsahujúceho 10 ng/μΙ TGC839-FLAG proteínu alebo premývacieho roztoku samého (negatívna kontrola). Výsledná suspenzia sa udržovala jednu hodinu na 4 °C, aby sa mohla reakcia uskutočniť. Potom sa reakčné médium odstránilo odstreďovaním a korpuskulárne bunky po reakcii sa premyli dvoma 500μΙ podielmi premývcieho roztoku. Potom sa premývacie vody odstránili, na suspendovanie buniek sa pridalo 100 μΙ premývacieho roztoku, ktorý obsahoval 10 ng/μΙ antiFLAG M2 protilátky (Sigma, Mo., USA, F-3165) a reakcia sa nechala 40 minút pri 4 °C. Bunky sa premyli dvomi 500μΙ podielmi premývacieho roztoku. Potom sa k susendovaným bunkám pridalo 100 μΙ premývacieho roztoku, ktorý obsahoval 10 ng/μΙ FITC-označené kozie antimyšie imunoglobulínové protilátky (PharMingen, Ka., USA, 12064D). Reakcia sa nechala bežať 40 minút v tme pri 4 °C. Bunky sa premyli dvomi 500μΙ podielmi premývacieho roztoku. Bunky sa opäť suspendovali v 100 μΙ premývacieho roztoku, pridalo sa 20 μΙ roztoku PE(fykoerytrínom)-označené anti-ľudské CD56 protilátky (B159) (PharMingen, Ka., USA, 31665X) a po premiešaní sa reakcia nechala bežať 25 minút v tme pri teplote miestnosti. Bunky sa potom premyli dvomi 1000μΙ podielmi premývacieho roztoku a ďalej sa suspendovali v 500 μΙ premývacieho roztoku, kúsky buniek a podobné čiastočky sa odstránili cedidlom buniek a suspenzia sa analyzovala pomocou FACS.

3) Analýza pomocou FACS

Na analýzu sa ako FACS použil FACSscan od Becton Dickinson (NJ., USA) a ako Software sa použil program CellQuest, verzia 1.2.2 od Becton Dickinson. Každá vzorka sa analyzovala tak, aby sa získali údaje merania pre 1.10⁵ buniek.

r r r *

Výsledkom bolo, že po analýze údajov počtu buniek nadviazaných na TGC839FLAG proteín, čo sa uskutočnilo vynesením počtu buniek (os y) oproti FITC intenzite (os x), sa u všetkých buniek, ktoré sa podrobili meraniu zistilo, že vzorka s pridaným TGC839-FLAG proteínom poskytla väčší počet FITCzafarbených buniek pri porovnaní s negatívnou kontrolou bez pridania TGC839-FLAG proteínu. Potvrdila sa teda prítomnosť lymfocytov viažúcich sa na TGC839 proteín (obr. 17). Z toho je možné tiež predpokladať, že lymfocytová frakcia obsahovala bunky, ktoré viažu TGC839 proteín.

Ďalej sa potom pri všetkých bunkách podrobených meraniu skúmala distribúcia buniek vynesením SSC (zložky stranového rozptylu svetla) (os y) oproti FITC intenzite (os x) a oddelila sa skupina buniek nadviazaných na TGC839-FLAG (R1). Pri skupine buniek R1 sa potom skontrolovala distribúcia vynesením PE intenzitx (os y) oproti FITC intenzite (os x) a uvedená skupina sa rozdelila na skupinu buniek nadviazanú na TGC839-FLAG a exprimujúcu C D 56 (R2) a na skupinu buniek nadviazanú na TGC839-FLAG, ale u ktorých chýba expresia CD56 (R3), pričom sa dokázalo, že väčšina buniek nadviazaných na TGC839-FLAG exprimuje CD56. Zistilo sa teda, že receptory pre TGC839 sa exprimovali na bunkách NK (obr. 18 a tabuľka 5). To ďalej predpokladá, že receptory pre TGC838 sa exprímujú na bunkách NK.

Tabuľka 5

	R1	R2	R3
Skupina buniek s pridaným Počet pozitívnych buniek z 10⁵ TGC839-FLAG proteínom skúmaných buniek	119	117	2
	Pomer pozitívnych buniek (%)	0,12	0,12	0,00
Skupina buniek bez pridaného TGC839-FLAG	Počet pozitívnych buniek z 10^b skúmaných buniek	61	61	0
proteínu (negatívna kontrola)	Pomer pozitívnych buniek (%)	0,06	0,06	0,00

Príklad 30

Účinky TGC839 proteínu na cytotoxicitu NK buniek

Z čerstvej ľudskej periférnej krvi sa použitím Ficoll-Paque (Pharmacia) izolovali leukocyty a NK bunky sa z nej získali použitím zostáv MACS a NK celí isoiation kit (obidve Miltenyi Biotec). Získané bunky sa inkubovali v RPMI 1640 médiu, ktorý obsahoval 10 % FBS a IL15 (50 ng/ml, R & D Systems) 24 hodín. Po premytí sa bunky ďalej kultivovali v RPMI 1640 médiu (Gibco BRL) doplnenom 10 % FBS a IL 12 (1 ng/ml; R & D Systems) a TGC839FLAG (0 až 500 ng/ml) počas 16 hodín a po premytí sa skúmali na cytotoxicitu ako efektorové bunky. Na druhej strane sa línia K562 (ATTC) buniek ľudskej leukémie označila ⁵¹Cr a použila ako cieľová bunka. 5.10⁶ K562 buniek sa premylo RPMI 1640 médiom, potom sa pridalo 100 pCi [⁵¹Cr]Na₂CrO₄ (NEN) a značenie sa uskutočňovalo jednu hodinu pri 37 °C. Bunky sa premyli a potom sa inkubovali v RPM11640 médiu obsahujúcom 10 % FBS počas jednej hodiny. Bunky sa premyli a vysiali na dosky s 96 jamkami (10⁴ buniek/jamku). K nim sa pridali hore uvedené efektorové bunky v jeden až dvanásťnásobku a inkubácia sa uskutočnila v priebehu 7 hodín. Rádioaktivita uvoľnená do kultivačného supernatantu sa merala γ-počítačom (Beckman). Cytotoxicita sa vypočítala nasledovne (obr. 19):

Cytotoxicita = (uvoľnená rádioaktivita - spontánne uvoľnená rádioaktivita)/(maximum uvoľnenej rádioaktivity - spontánne uvoľnená rádioaktivita). 100 (%)

Príklad 31

Účinky TGC839 proteínu na proliferáciu NK buniek a K562 buniek

NK bunky sa získali z ľudskej krvi rovnakým spôsobom ako v príklade 1. Získané bunky sa inkubovali v RPMI 1640 médiu, ktorý obsahoval 10 % FBS a

IL15 (50 ng/ml) 24 hodín a potom sa premyli. Tieto NK bunky (10⁵buniek/jamku) a K562 bunky (2.10⁴ buniek/jamku sa vysiali na dosky s 96 jamkami a inkubovali v RPMI 1640 médiu obsahujúcom 10 % FBS a IL12 (1 ng/ml) a TGC839FLAG (0 až 500 ng/ml) počas 40 hodín. V priebehu posledných 12 hodín sa uskutočnilo značenie pôsobením BrdU. Proliferácia buniek sa skontrolovala pomocou zostavy na proliferáciu buniek „Celí proliferation ELISA kit“ (Boehringer). Na detekciu sa merala absorbancia pri 450 nm (A₄₅o) (obr. 20, obr. 21).

Po odstránení buniek odstreďovaním sa kvantitatívne v každom kultivačnom supematante vyhodnotil IFN-γ použitím zostavy „Quantokine IFN^y immunoassay kit (R & D Systems) (obr. 22).

Priemyselná aplikovateľnosť

Proteín alebo podobná zlúčenina podľa predloženého vynálezu má napríklad aktivitu proliferovať bunky, okrem iného, a teda sa môže používať ako činidlo regenerujúce tkanivo po excícii chorého tkaniva. Ďalej potom je proteín podľa predloženého vynálezu užitočný ako reakčné činidlo na testovanie zlúčeniny alebo jej soli, ktorá podporuje alebo inhibuje aktivitu proteínu podľa predloženého vynálezu. Od inhibítora, ktorý sa získal takýmto testovaním sa očakáva, že bude užitočný ako činidlo na liečenie alebo predchádzanie rôznych druhov rakoviny (napr. rakoviny tela maternice, endometriomu, rakoviny prsníka, rakoviny hrubého čreva a konečníka, rakoviny prostaty, rakoviny pľúc, renálnej rakoviny, neurobiastomu, rakoviny žlčníka, a myelomu).

Navyše protilátka oproti proteínu podľa predloženého vynálezu môže špecificky rozoznávať proteín podľa predloženého vynálezu a môže sa teda použiť pri kvantitatívnom stanovení proteínu podľa predloženého vynálezu v testovaných vzorkách a môže sa používať ako diagnostické činidlo pre rôzne hore uvedené rakoviny. Navyše humanizovaná protilátka oproti proteínu podľa predloženého vynálezu sa môže použiť ako činidlo na liečenie alebo prevenciu rôznych hore uvedených rakovín.

1/6

ZOZNAM SEKVENCII <110> Takeda Chemical Industries, Ltd.

<1 20> Protcin, peptid, protilátka, spôsob výroby a farmaceutický prostriedol <Ι30> B00033 <I5O> JP 11-068302 <151> 15.03.1999 <150> JP 11-213635 <151> 28.07.1999 <150> JP 11-222200 <151> 05.08.1999 <160> 9 <210> 1 <211> 252 <212> PRT <213> človek <400> 1

Met Ala 1

Ala

Ala Ala 5

Ala Thr Lys 1Ie Leu Leu Cys Leu Pro Leu Leu

10

15

Leu

Ser

Gly

Trp

Ser

Arg

Ala

Gly

Arg

Ala

Asp

Pro

His

Ser

20

25

30

Leu

Cys

Tyr

Asp

íle

Thr

Val

íle

Pro

Lys

Phe

Arg

Pro

Gly

Pro

Arg

35

40

45

Trp

Cys

Ala

Val

Gin

Gly

Gin

Val

Asp

Glu

Lys

Thr

Phe

Leu

His

Tyr

50

55

60

Asp

Cys

Gly

Asn

Lys

Thr

Val

Thr

Pro

Val

Ser

Pro

Leu

Gly

Lys

65

70

75

80

Leu

Asn

Val

Thr

Ala

Trp

Lys

Ala

Gin

Asn

Pro

Val

Leu

Arg

Glu

90 95

2/6

Val

Asp 1le

Leu

i Thr

Glu

i Gin

Leu

Arg Asp

i I le

Gin

Leu Glu

i Asn

100

105

110

Tyr

Thr

Pro Lys

Glu

Pro

Leu

Thr

Leu

Gin

Ala

Arg

Mel

Ser Cys

Glu

115

120

125

Gin

Lys

Ala Glu

Gly

His

Ser

Gly

Ser

Trp

Gin

Phe

Ser Phe

Asp

130

135

140

Gly

Gin

íle Phe

Leu

Phe

Asp

Ser

Glu

Lys

Arg

Met

Trp Thr

Thr

145

150

155

160

Val

His

Pro Gly

Ala

Arg

Lys

Me l

Lys

Glu

Lys

Trp

Glu

Asn Asp

Lys

165

170

175

Val

Ala MeL

Ser

Phe

His

Tyr

Phe

Ser

Met

Gly

Asp

Cys líc

Gly

180

185

190

Trp

Leu

Glu Asp

Phe

Leu

Me í

Gly

Met

Asp

Ser

Thr

Leu

Glu Pro

Ser

195

200

205

Ala

Gly

Ala Pro

Leu

Ala

Met

Ser

Gly

Thr

Gin

Leu Arg

Ala

210

215

220

Thr

Ala

Thr Pro

Ser

Phe

Ala

Ser

Ser Pro

Ala

225

230

235

240

Ser

Ser Leu ,

Ala

Ser

Glu

Ser

Pro

Leu

Glu

245 250 252 .

<210> 2 <21l> 75G <2 J 2> DNA <213> človek <400> 2

ATGGCAGCAG CCGCCGCTAC CAAGATCCTT CTGTCCCTCC CGCTTCTGCT CCTGCTGTCC 60

GGCTGGTCCC GGGCTGGGCG AGCCGACCCT CACTCTCTTT GCTATGACAT CACCGTCATC 120

CCTAAGTTCA GACCTGGACC ACGGTGGTGT GCGGTTCAAG GCCAGGTGGA TGAAAAGACT 180

TTTCTTCACT ATGACTGTGG CAACAAGACA GTCACACCTG TCAGTCCCCT GGGGAAGAAA 240

3/6

CTAAATGTCA CAACGGCCTG GAAAGCACAG AACCCAGTAC TGAGAGAGGT GGTGGACATA 300

CTTACAGAGC AACTGCGTGA CATTCAGCTG GAGAATTACA CACCCAAGGA ACCCCTCACC 360

CTGCAGGCCA GGATGTCTTG TGAGCAGAAA GCTGAAGGAC ACAGCAGTGG ATCTTGGCAG 420

TTCAGTTTCG ATGGGCAGAT CTTCCTCCTC TTTGACTCAG AGAAGAGAAT GTGGACAACG 480

GTTCATCCTG GAGCCAGAAA GATGAAAGAA AAGTGGGAGA ATGACAAGGT TGTGGCCATG 540

TCCTTCCATT ACTTCTCAAT GGGAGACTGT ATAGGATGGC TTGAGGACTT CTTGATGGGC 600

ATGGACAGCA CCCTGGAGCC AAGTGCAGGA GCACCACTCG CCATGTCCTC AGGCACAACC 660

CAACTCAGGG CCACAGCCAC CCCCTCATCC TTTGCTGCCT CCTCATCATC CTCCCCTGCT 720

TCATCCTCCC TGGCATCTGA GGAGAGTCCT TTAGAG 756 <210> 3 <21l> 40 <212> DNA <21 3> umelá sekvencia <220>

<223>

<400) 3

GCGCTCGAAT TCCACCATGG CAGCAGCCGC CGCTACCAAG 40 <210> 4 <211> 76 <212> DNA <213) umelá sekvencia <220>

<223>

<400> 4

GCGGCCGCTC ACTTGTCATC GTCGTCCTTG TAGTCCTCTA AAGGACTCTC CTCAGATGCC 60 AGGGAGGATG AAGCAG 76 <210> 5 <211> 246 <212> PRT %

4/6 <Z13> človek <400> 5

Met

Ah

i Ala Ah

t Ala Ah

i Thi

Lyj

i Ih

! Lei

i Let

i Cys

i Leu

i Pre

i Leu

1

5

10

15

Leu

i Leu

Ser

Gly

' Trp

i Ser

Arg Ala

Gly

Arg

í Ala

Asp

' Pro

His

Ser

20

25

30

Leu

Cys

Tyr

Asp

íle

Thr

Val

lle

Pro

Lys

Phe

Arg

Pro

Gly

Pro

Arg

35

40

45

Trp

Cys

Ala

Val

Gin

Gly

Gin

Val

Asp

Glu

Lys

Thr

Phe

Leu

His

Tyr

50

55

60

Asp

Cys

Gly

Asn

Lys

Thr

Val

Thr

Pro

Val

Ser

Pro

Leu

Gly

Lys

65

70

75

80

Leu

Asn

Val

Thr

Ala

Trp

Lys

Ala

Gin

Asn

Pro

Val

Leu

Arg

Glu

85

90

95

Val

Asp

I le

Leu

Thr

Glu

Gin

Leu

Arg

Asp

íle

Gin

Leu

Glu

Asn

100

105

110

Tyr

Thr

Pro

Lys

Glu

Pro

Leu

Thr

Leu

Gin

Ala

Arg

Mel

Ser

Cys

Glu

115

120

125

Gin

Lys

Ala

Glu

Gly

His

Ser

Gly

Ser

Trp

Gin

Phe

Ser

Phe

Asp

130

135

140

Gly

Gin

lle

Phe

Leu

Phe

Asp

Ser

Glu

Lys

Arg

Me t

Trp

Thr

145

150

155

160

Val

His

Pro

Gly

Ala

Arg

Lys

Mel

Lys

Glu

Lys

Trp

Glu

Asn

Asp

Lys

165

170

175

Val

Ala

Met

Ser

Phe

His

Tyr

Phe

Ser

Mel

Gly

Asp

Cys

íle

Gly

180

185

190

Trp

Leu

Glu

Asp

I’he

Leu i

Mel

Gly

Mel

Asp

Ser

Thr

Leu i

Glu '

Pro ;

Ser

195

200

205

Ala

Gly

Ala

Pro

Leu

Ala 1

Met

Ser

Ser i

Gly '

Thr

Thr i

Gin 1

Leu i

Mg t

Ma

5/6

2	10			215
Thr A	la Thr Thr	Leu	lle	Leu
225			230
Phe 11	le Leu Pro	Gly	íle
		245	246
<210>	6
<211>	738
<212>	DNA
<213>	človek

220

Cys Leu Leu íle íle Leu Pro Cys 235 240 <400> 6

ATGGCAGCAC CCGCCGCTAC CAAGATCCTT GGCTGGTCCC GGGCTGGGCG AGCCGACCCT CCTAAGTTCA GACCTGGACC ACGGTGGTGT TTTCTTCACT ATGACTGTGG CAACAAGACA CTAAATGTCA CAACGGCCTG GAAAGCACAG

CTTACAGAGC AACTGCGTGA CATTCAGCTG CTGCAGGCCA GGATGTCTTG TGAGCAGAAA TTCAGTTTCG ATGGGCAGAT CTTCCTCCTC GTTCATCCTG GAGCCAGAAA GATGAAAGAA TCCTTCCATT ACTTCTCAAT GGGAGACTGT ATGGACAGCA CCCTGGAGCC AAGTGCAGGA CAACTCAGGG CCACAGCCAC CACCCTCATC ľTCATCCTCC CTGGCATC <210> 7 <211> 63 <212> DNA <213) umelá sekvencia <220>

<223>

CTGTGCCTCC CGCTTCTGCT CCTGCTGTCC 60 CACTCTCTTT GCTATGACAT CACCCTCATC 120 GCGGTTCAAG GCCAGGTGGA TGAAAAGACT 180 GTCACACCTG TCAGTCCCCT GGGGAAGAAA 240 AACCCAGTAC TGAGAGAGGT GGTGGACATA 300 GAGAATTACA CACCCAAGGA ACCCCTCACC 360 GCTGAAGGAC ACAGCAGTGG ATCTTGGCAG 420 TTTGACTCAG AGAAGAGAAT GTGGACAACG 480 AAGTGGGAGA ATGACAAGGT TGTGGCCATG 540 ATAGGATGGC TTGAGGACTT CTTGATGGGC 600 GCACCACTCG CCATGTCCTC AGGCACAACC 660 CÚTGCTGCC TCCTCATCAT CCTCCCCTGC 720

738 %

6/6 ' <400> 7

GCGCTGAATT CCCACCATGG CAGCAGCCGC CGCTACCAAG ATCCTTCTGT GCCTCCCGCT 60 TCT . 63 <21 O> 8 <211> 71 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>

<223>

<400> 8

TTGCGGCCGC TCACTTGTCA TCGTCGTCCT TGTAGTCGAT GCCAGGGAGG ATGAAGCAGG 60 GGAGGATGAT G 71 <210> 9 <211> 47 <212> DNA <21 3> umelá sekvencia <220>

<223>

<400> 9

TTGCGGCCGC TCAGATGCCA GGGAGGATGA AGCAGGGGAG GATGATG ?F 4257-200/

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Proteín, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu identickú alebo v podstate identickú s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou ako sekv. id. č. 1 alebo jej soľ.
2. Proteín alebo jeho soľ podľa nároku 1, v ktorom aminokyselinová sekvencia v podstate identická s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou ako sekv. id. č. 1 znamená aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. id. č. 5.
3. Proteín alebo jeho soľ podľa nároku 1, ktorý sa produkuje v rakovinových bunkách.
4. Čiastočný peptid alebo jeho soľ, odvodené od proteínu podľa nároku 1.
5. Čiastočný peptid alebo jeho soľ podľa nároku 4, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu od 26. do 34. aminokyselinového zvyšku v aminokyselinovej sekvencii uvedenej ako sekv. id. č. 1.
6. Čiastočný peptid alebo jeho soľ podľa nároku 4, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu od 166. do 190. aminokyselinového zvyšku v aminokyselinovej sekvencii uvedenej ako sekv. id. č. 5.
7. Spôsob výroby proteínu podľa nároku 1 alebo čiastočného peptidu podľa nároku 4 alebo ich soli, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje kultivovanie transformantu nesúceho rekombinantný vektor obsahujúci DNA kódujúci proteín podľa nároku 1 alebo čiastočný peptid podľa nároku 4, čím dôjde k produkcii uvedeného proteínu alebo čiastočného peptidu.
8. Protilátka proti proteínu definovanému v nároku 1 alebo čiastočnému peptidu definovanému v nároku 4 alebo ich soli.
9. Protilátka podlá nároku 8, ktorá znamená monoklonálnu protilátku.
10. Protilátka podľa nároku 8, ktorá znamená protilátku proti čiastočnému peptidu podľa nároku 4 alebo jeho soli, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu od 26. do 34. aminokyselinového zvyšku v aminokyselirwej sekvencii uvedenej ako sekv. id. č. 1.
11. Protilátka podľa nároku 8, ktorá znamená protilátku proti čiastočnému peptidu podľa nároku 4 alebo jeho soli, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu od 166. do 190. aminokyselinového zvyšku v aminokyselínovej sekvencii uvedenej ako sekv. id. č. 5.
12. Diagnostické činidlo, vyznačujúce sa tým, že obsahuje protilátku podlá nároku 8.
13. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje proteín podľa nároku 1, čiastočný peptid podľa nároku 4, ich soľ alebo protilátku podlá nároku 8.
14. Spôsob testovania zlúčeniny alebo jej soli, ktorá zvyšuje alebo inhibuje aktivitu proteínu podľa nároku 1 alebo čiastočného peptidu podľa nároku 4 alebo ich soli, vyznačujúci sa tým, že sa používa proteín podľa nároku 1, čiastočný peptid podľa nároku 4 alebo ich soľ.
15. Spôsob testovania podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že aktivita znamená bunkovú proliferačnú aktivitu.
16. Zostava na testovanie zlúčeniny alebo jej soli, ktorá zvyšuje alebo inhibuje aktivitu proteínu podľa nároku 1, čiastočného peptidu podľa nároku 4 alebo ich soli, vyznačujúca sa tým, že táto zostava obsahuje proteín podľa nároku 1 alebo čiastočný peptid podľa nároku 4 alebo ich soľ.

ŕ *
17. Zlúčenina alebo jej soľ, ktorá zvyšuje alebo inhibuje aktivitu proteínu podľa nároku 1 alebo čiastočného peptidu podľa nároku 4 alebo ich soli, ktoré je možné získať použitím spôsobu testovania podľa nároku 14 alebo zostavy na testovanie podľa nároku 16.
18. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje zlúčeninu alebo jej soľ, ktorá zvyšuje alebo inhibuje aktivitu proteínu podľa nároku 1 alebo čiastočného peptidu podľa nároku 4 alebo ich soli, ktoré je možné získať použitím spôsobu testovania podľa nároku 14 alebo zostavy na testovanie podľa nároku 16.
19. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 18, vyznačujúci sa tým, že je určený na liečenie rakoviny alebo na jej predchádzanie.
20. Hybridom, vyznačujúci sa tým, že má schopnosť produkovať monoklonálnu protilátku podľa nároku 9.
21. Protilátka podľa nároku 8, ktorá znamená neutralizujúcu protilátku.
22. Protilátka podľa nároku 8, ktorá znamená humanizovanú protilátku.
23. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje protilátku podľa nároku 22.
24. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že je určený na liečenie rakoviny alebo na jej predchádzanie.
25. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje takú zlúčeninu alebo jej soľ, ktorá má inhibičnú aktivitu pri inhibícii proliferácie prirodzených zabíjajúcich buniek proteínom podľa nároku 1 alebo čiastočným peptidom podľa nároku 4 alebo ich solí.
26. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že je určený na liečenie rakoviny alebo na jej predchádzanie.