[go: up one dir, main page]

SI9200260A - Lipophilic oligosaccharide antibiotic salt compostition - Google Patents

Lipophilic oligosaccharide antibiotic salt compostition Download PDF

Info

Publication number
SI9200260A
SI9200260A SI19929200260A SI9200260A SI9200260A SI 9200260 A SI9200260 A SI 9200260A SI 19929200260 A SI19929200260 A SI 19929200260A SI 9200260 A SI9200260 A SI 9200260A SI 9200260 A SI9200260 A SI 9200260A
Authority
SI
Slovenia
Prior art keywords
formula
antibiotic
pharmaceutically acceptable
cyclodextrin
hydroxypropyl
Prior art date
Application number
SI19929200260A
Other languages
English (en)
Inventor
Mahesh Patel
Vincent P. Gullo
Roberta Hare
David Loebenberg
James B. Morton
George H. Miller
Reewon Y. Kwon
Original Assignee
Schering Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Schering Corporation filed Critical Schering Corporation
Publication of SI9200260A publication Critical patent/SI9200260A/sl

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6949—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes
    • A61K47/6951—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes using cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
    • C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
    • C07H13/08—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals directly attached to carbocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
    • C07H17/08—Hetero rings containing eight or more ring members, e.g. erythromycins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H9/00—Compounds containing a hetero ring sharing at least two hetero atoms with a saccharide radical
    • C07H9/02—Compounds containing a hetero ring sharing at least two hetero atoms with a saccharide radical the hetero ring containing only oxygen as ring hetero atoms
    • C07H9/04—Cyclic acetals

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Description

SESTAVKI SOLI LIPOFILNIH OLIGOSAHARIDNIH ANTIBIOTIKOV
OSNOVE IZNAJDBE
Iznajdba poroča o novih sestavah snovi, ki vsebujejo lipofilne oligosaharidne antibiotike, o njihovi farmacevtski formulaciji, o metodah za izdelavo in o uporabi za zdravljenje ali preprečevanje bakterijskih infekcij pri živalskih organizmih, zlasti sesalcih in ljudeh. Lipofilni oligosaharidni antibiotiki, ki vsebujejo npr. eveminomicine, curamyciue, avilamycine in flambamycine, so člani družine ortosomycina. Ti antibiotiki vsebujejo najmanj en kisel fenolni vodik in dve ortoesterski vezi združeni s preostanki ogljikovodikov. Poišči primera: A.K.Gaungly v Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, (1978),Volume 2, pp. 205-209, Third Edition, John Wiley in sinovi in W.D.011is, et al., Tetrahedron (1979), Volume 35, pp. 105127. Ti lipofilni oligosaharidni antibiotiki kažejo širok spekter biološke aktivnosti proti gram-pozitivnim in nekaterim gram-negativnim bakterijam pri različnih poskusih in vitro in in vivo na živalskih modelih. Do danes ni bilo na voljo nobene farmacevtsko sprejemljive oblike teh antibiotikov za uporabo in vivo.
Opazili smo, da vbrizgavanje lipofilnih oligosaharidnih antibiotikov povzroči neugoden reakcijski sindrom (adverse reaction syndrome - ARS v nadaljevanju). Izraz neugodni reakcijski sindrom, kot je uporabljan tukaj, pomeni pri poskusnih živalih opažene simptome naslednjih tipov: nekoordinacijo, ataksijo, lenobnost, otrdelost zadnjih nog, otežkočeno dihanje in otopelost.
Skratka na voljo ni znane farmacevtsko sprejemljive zmesi teh lipofilnih oligosaharidnih antibiotikov za varno in učinkovito uporabo pri živalih in ljudeh.
Ciklodekstrini so modificirani škrobi, sestavljeni iz glukopiranoznih enot in vsebujejo: aciklodekstrin (sestavljen je iz šestih glukopiranoznih enot), β-ciklodekstrin (sestavljen je iz sedmih glukopiranoznih enot) in γ-ciklodekstrin (sestavljen je iz osmih glukopiranoznih enot).
α-, β- in γ-ciklodekstrini imajo votlinasto lipofilno notranjo površino in hidrofilno zunanjo površino. Taka kombinacija lipofilne potranie in hidrofilne zunanie novršine ie privedla do uporabe ciklodekstrinov in njihovih derivatov za molekularno kompleksaciio in enkapsulacijo mnogih hidrofobnih in/ali neobstojnih zdravil odgovarjajočihvelikosti. Tako popravimo stabilnost, topnost in biološko sposobnost takih zdravil.
Derivate α-, β- in γ-ciklodekstrinov je razkril Jozsef Szejtli v Pharmaceutical Technologv. June 1991, 36-40.
Kompleksi α-, β- in γ-ciklodekstrinov, zmesi in derivati so razkriti v npr. N.Bodor USP 4983586. Bodor razkrije v USP 4983586 metodo za zmanjševanje posledic obaijanja lipofilnih ali vodno nestabilnih zdravil, ki se pojavljajo na mestih injiciranja zdravila ali/in v pljučih po parenteralnem dovajanju. Zdravilo vbrizgavamo v vodni raztopini, ki vsebuje veliko količino (2 do 50 utežnih procentov) hidroksipropil-B-ciklodekstrina.
Josef Pitha v USP 4727064 in The International J. of Pharmaceutics. (1986) 29, 73-82 razkrije uporabo koncentriranih vodnih raztopin hidroksipropil-B-ciklodekstrina 40 do 60 utežnih procentov) za raztapljanje različnih zdravil, kot so: acetaminophen, spolni steroidi, kardialni glikozidi (kot digoxin) in retinojska kislina in njene soh. Poglej tudi primer Pitha USP 4596795, ki razkrije prenašanje spolnih hormonov (testosteron, progesteron in estradiol) v obliki kompleksov s poli-ciklodekstrini ali pa s hidroksipropil-Bciklodekstrinom.
Reference Bodor in Pitha ne omenjajo fenolov ali lipofilnih oligosaharidnih antibiotikov. Janssen Pharmaceurica N.V. International Patent Application No. PCT/EP84/00417 objavljena pod International Publication No. WO85/02767 4. Julija 1985 razkrije farmacevtske zmesi, ki vsebujejo komplekse nestabilnih ali le delno topnih zdravil v vodi z delno zaestrenimi B-ciklodekstrini (v nadaljevanju B-CD), formule B-CD-OR. V tej formuli so preostanki R: hidroksietil, hidroksipropil in dihidroksipropil. Določen del preostankov pa so lahko po izbiri alkilne skupine, najpogosteje merilna in etilna.
Molekulo zdravila s kislimi ali bazičnimi skupinami je moč izkoristiti za povečanje topnosti v vodi s tvorbo soli. Janssen International Publication No. WO 85/02767 trdi, da tvorba soli praviloma zmanjša učinkovitost ali poslabša kemijsko stabilnost spojine. Ta dejstva preprečujejo uporabo metode s tvorbo soli za povečevanje topnosti slabotopnih kislih in bazičnih spojin v vodi.
V publikaciji ni omenjenih lipofilnih oligosaharidnih antibiotikov ali njihovih soli, ki nastopajo v naši iznajdbi.
Različni rodovi bakterij, kot so: gram-pozitivni koki, streptokoki in enterokoki, kakor tudi na methicillin odporni in občutljivi stafilokoki, so postali rezistentni na komercialne antibiotike npr. vancomycin.
Tako se je pojavila potreba po farmacevtsko sprejemljivih spojinah za zdravljenje bakterijskih infekcij, kjer se pojavijo na methicillin odporni in občutljivi stafilokoki ter na vancomycin odporne bakterije.
Prav tako obstaja potreba po farmacevtsko sprejemljivih zmeseh, ki vsebujejo lipofilne oligosaharidne antibiotike, aktivne proti širokemu nizu gram-pozitivnih in gramnegativnih bakterij. Posebej potrebujemo zmesi, ki ne bi povzročile neugodnega reakcijskega sindroma, za parenteralno uporabo.
KRATEK POVZETEK IZNAJDBE
Presenetljivo smo odkrili sredstvo s katerim lahko živim organizmom podajamo lipofilne oligosaharidne antibiotike, ki imajo dobro antibaktericidno aktivnost proti občutljivim gram-pozitivnim in gram-negativnim bakterijam. Zagotovljeno je učinkovito zdravljenje ali zaščita, obenem se izognemo neugodnenu reakcijskemu sindromu. Ta zmes vsebuje lipofilne oligosaharidne antibiotike kombinirane s specifično bazo (vsaj okrog stehiometrične količine) in učinkovino kot je hidroksi -α-, -β- ali -γ- ciklodekstrin, ki ima 2 do 15 hidroksipropilnih skupin na molekulo ciklodekstrina. Taka količina zadostuje za učinkovito dovajanje lipofilnih oligosaharidnih antibiotikov v serum živali, obenem se izognemo tudi neugodnemu reakcijskemu sindromu.
POVZETEK IZNAJDBE
Iznajdba določa sestavo snovi.
Sestavine snovi so:
a.) Lipofilni oligosaharidni antibiotik predstavljen s formulo 1,
OH kjer j e
Rj =
x=NO2- NO, NH2. NHCOCH3. NHOH. NH(C2H5)2. N(C2H5)2. OH ali H: R2=CH3, COCH(CH3)2, COCH3, CO(CH2)3CH3, COCH2CH3 ali H: R3=CH3 ali H
R4=COCH3, CH(OCH3)(CH3), CH(OH)CH3, CHO ali H:
R(5=CH3 ali H 1
R7=CH3 ali H
R8=CH3, CH2OH ali H
R9=CH3 ali H
Y=OH, CH3 ali H
W=C1 ali H
Z=C1 ali H
b. ) Bazo (vsaj okrog stehiometrične količine), ki je sposobna tvorbe farmacevtsko sprejemljive soli z lipofilnim oligosaharidnim antibiotikom, ki je predstavljen s formulo 1.
c. ) Dimetilsulfoksid, glicerol, sorbitan mono-9-octadecenoat, kjer je povprečno Število hidroksipropilnih substituent na molekulo α-, β- ali γ-ciklodekstrina v okviru med 2 do
15. Omenjena količina zadostuje za učinkovito dovajanje omenjenega lipofilnega oligosaharidnega antibiotika (formula 1) v serum živali, obenem preprečimo tudi neugoden reakcijski sindrom.
d. ) 0 do 6 utežnih % (baza, omenjen antibiotik s formulo 1) farmacevtsko sprejemljivega neionskega surfaktanta.
Iznajdba določa sestavo druge snovi. Sesetavine snovi so :
ajLipofilni oligosaharidni antibiotik predstavljen s formulo 2.
kjer je x=NO2, NO, NH2, NHCOCH3, NHC2H5, N(C2H5)2, OH ali y=OH, CH3 ali H R2=H ali CH3 r3=h
R4=H ali CH(OCH3)(CH3)
b. ) Bazo (vsaj okrog stehiometrične količine), ki je sposobna tvorbe farmacevtsko sprejemljive soli z lipofilnim oligosaharidnim antibiotikom, ki je predstavljen s formulo 2.
c. ) hidroksipropil α-, β- ali γ-ciklodekstrina, kjer je povprečno število omenjenih hidroksipropilnih substituent v okviru med 2 do 15. Omenjena količina zadostuje za učinkovito dovajanje omenjenega lipofilnega oligosaharidnega antibiotika (formula 2) v serum živali, obenem preprečimo tudi neugoden reakcijski sindrom.
d. ) 0 do 6 utežnih % (baza, omenjen antibiotik s formulo 2) farmacevtsko sprejemljivega neionskega surfaktanta.
Me Js. .OMe
OH
b. )Vsaj dva ekvivalenta baze, ki je sposobna tvorbe farmacevtsko sprejemljive soli z lipofilnim oligosaharidnim antibiotikom, ki je predstavljen s formulo 3.
c. )Hidroksipropil α-, β- ali γ-ciklodekštrina, kjer je povprečno število omenjenih hidroksipropilnih substituent v okviru med 2 do 15. Omenjena količina zadostuje za učinkovito dovajanje omenjenega lipofilnega oligosaharidnega antibiotika (formula 3) v serum živali, obenem preprečimo tudi neugoden reakcijski sindrom.
d.) O do 6 utežnih % (baza, omenjen antibiotik s formulo 3) farmacevtsko sprejemljivega neionskega surfaktanta.
Farmacevtske spojine, tvoijene z mešanjem snovi, ki vsebujejo : spojine predstavljene s formulami 1, 2 ali 3, bazo (vsaj okrog stehiometrične količine), ki je sposobna tvorbe farmacevtsko sprejemljive soli z lipofilnimi oligosaharidnimi antibiotiki, ki so predstavljeni s formulami 1, 2 ali 3 in hidroksipropil α-, β- ali γ-ciklodekstrin s farmacevtsko sprejemljivim nosilcem. Prav tako so na voljo metode za uporabo teh snovi pri zdravljenju infekcij z občutljivimi gram-pozitivnimi in gram-negativnimi bakterijami pri živalih, posebej pri sesalcih.
Prej omenjene farmacevtske snovi so posebej uporabne za parenteralno injiciranje in vivo. posebej intravenozno pri ljudeh.
Iznajdba prav tako določi metode za preprečitev neugodnega reakcijskega sindroma pri živalih, ki jim parenteralno injiciramo lipofilne oligosaharidne antibiotike, predstavljene s formulami 1, 2 in 3 med simultanim dodajanjem protiinfekcijske količine omenjenega antibiotika.
Iznajdba nadalje določi uporabo lipofilnega oligosaharidnega antibiotika, predstavljenega s formulo 1, za pripravo medikamentov, s katerimi zdravimo in preprečujemo infekcije z občutljivimi gram-pozitivnimi in gram-negativnimi bakterijami pri živalih in ljudeh.
KRATEK OPIS SUK
Na sliki 1 je grafično prikazan časovni potek značilne fermentacije Micromonosporae carbonaceae.var.africanae. NRRL 15099, ATTC 39149.
PODROBEN OPIS IZNAJDBE IN IZBRANIH PRIMEROV
Lipofilni oligosaharidni antibiotiki, npr. eveminomicinski antibiotiki, kažejo uporabno antibakterijsko aktivnost in vitro, toda težko tvorijo popolne vodne raztopine, primerne za varno in učinkovito delovanje in vivo (t.j. brez pojava neugodnega reakcijskega sindroma). Poleg tega soli teh antibiotikov, nastale pri dodatku vsaj približno stehiometrične količine baze, uporabljene pri tej iznajdbi, npr. N-metil glukamina (NMG), ne tvorijo popolnih vodnih raztopin pri preizkušenih pH vrednostih. Opazili smo, da so ob dodatku omenjenih soli, v preizkušanih koncentracijah, v vodo, nastale le koloidne disperzije. Te disperzije so težile k združevanju, na koncu so tvorile gel, posebej v prisotnosti absorbiranega ogljikovega dioksida in pri pH manjšem od 9,3. Opazili smo tudi, da so popolne vodne raztopine nastale pri povečanju molskega razmerja NMG proti spojini s formulo 3 od 2:1 ali 3:1, vse do 12:1. Raztopina v molskem razmerju 12:1 je imela nezaželjeno visok pH, bila je močno zapufrana, dražila je organizme. Tako smo opazili, da je parenteralno injiciranje vodne raztopine, ki je vsebovala 12 molov NMG na 1 mol spojine s formulo 3, v podgane ali višje primate, kot so opice, ni povzročilo neugodnega reakcijskega sindroma (ta je verjetno nastal pri tvorbi gela in obarjanju spojine s formulo 3). Raztopina je po injiciranju povzročila draženje, ki je verjetno nastalo zaradi velike količine NMG baze in visokega pH na mestu injiciranja. Parenteralno injiciranje mešanice, ki je vsebovala 3 do 5 molov NMG na mol spojine s fomulo 3, je vsekakor povečalo neugoden reakcijski sindrom. Različne ciklodekstrinske agense uporabljamo pri pridobivanju specifičnih zdravil (npr. kot v prej omenjenih referencah Bodor in Pitha). Če smo uporabili omenjene ciklodekstrinske agense same v kombinaciji z lipofilnimi oligosaharidnimi antibiotiki, nismo dosegli željenih rezultatov. Tako na primer z uporabo specifičnega ciklodekstrinskega derivata in specifičnega hidroksipropil-B— ciklodekstrina na mol eveminomicinskega antibiotika s formulo 3, nismo uspeli narediti pravih vodnih raztopin, ko smo vzeli 6 molov specifičnega hidroksipropil-B-ciklodekstrina na mol eveminomicinskega antibiotika s formulo 3.
Presenetljivo smo odkrili, da sestava mešanice, ki vsebuje lipofilni oligasoharidni antibiotik s formulo 3, določeno količino specifične baze, npr. NMG, in specifični agens hidroksipropilβ-ciklodekstrin v določenih količinah, in je dodana farmacevtsko sprejemljivim nosilcem, posebej vodi, omogoča obliko raztopine, katero lahko varno in učinkovito uporabimo pri dajanju in vivo. Odkrili smo tudi, da pri mešanju 1 mola lipofilnega oligasoharidnega antibiotika, npr. spojine s formulo 3, z vsaj 2 do približno 12 moli ustrezne baze, npr. NMG, v vodi, in 6 moli B—ciklodekstrina, npr. takšnim, ki vsebuje 3 do 7.5 hidroksipropilnih skupin na eno molekulo B~ciklodekstrina, nastala čista vodna raztopina kompleksa (ugotovljeno z nefelometrijo in iz širine črt pri protonski NMR; glej primer 4). Pri paranteralnem injiciranju takšnih kompleksov v živali ni nastal neugoden reakcijski sindrom, celo pri visokih dozah ne,
t.j. 800mg takšnega kompleksa na kg telesne teže. Glej tabelo 4.
Parenteralno injiciranje vodnih disperzij soli, npr. NMG soli eveminomicinskega antibiotika s formulo 3, v miši in opice je povečalo neugodni reakcijski sindrom, kot bo razvidno iz in vivo rezultatov zbranih v tabeli 1. Le pri injiciranju vodnih raztopin ene od snovi pri tej iznajdbi s sestavo, ki je vsebovala določen kompleksirajoči agens, npr. hidroksipropil-B— ciklodekstrin s približno 3 do 7.5 hidroksipropilnimi skupinami na molekulo cilkodekstrina, in NMG eveminomicinski antibiotik s formulo 3, v živali smo se poplnoma izognili nastanku neugodnega reakcijskega sindroma.
Tabela 2 kaže na zmanjšanje ali preprečitev neugodnega reakcijskega sindroma s parenteralnim injiciranjem čistih vodnih raztopin NMG soli eveminomicinskega antibiotika s formulo 3 z določenimi, npr. hidroksipropil-B--ciklodekstrinskimi agensi iz te iznajdbe, v miši.
Naaraščanje molskega razmetja baze proti eveminomicinskemu antibiotiku s formulo 3 od 2:1 do 9:1 lahko popolnoma odstrani pojav neugodnega reakcijskega sindroma (pri vseh koncentracijah preizkušenih pri parenteranem injiciranju v miši), kot je razvidno iz tabele 3.
PRIMERJALNI ZGLED
TABELA 1
POJAV NEUGODNEGA REAKCIJSKEGA SINDROMA PO INJICIRANJU VODNIH
RAZTOPIN ENEGA MOLA SPOJINE S FORMULO 3 IN DVEH MOLOV NMG
Z ALI BREZ HP-B-CPl
Miši % neugodnega reakcijskega sindroma* 2 * pri naslednjih dozah (MPK2) (Koncentracija injicirane spojine 3: 80mg/ml)
100 (MPK) 200 (MPK) 500 (MPK) 800 (MPK)
34:2NMG 100 3 : 2NMG: 6HP-B-CD5 0 0 0 0
Opice Cynomolgus (Koncentracija injicirane spojine 3: 50mg/ml)
3 2NMG 10 (MPK6) 50 40 (MPK) 80 (MPK)
3 5NMG - 33 50
3 2NMG: 6HP-B-CD __ 0 0
^HP-B-CD je hidroksipropil-B-cikodekstrin, ki vsebuje 7.4 hidroksipropilnih skupin na B-CD molekulo.
2Simptome neugodnega reakcijskega sindroma smo pri živali opazili dve minuti po četrti injekciji (enojna doza).
2MPK je mg zdravila na kg telesne teže miši (skupine 5 do 10, CF—1, povprečna teža 20g, Harlan Sprague Dawley, čas učinkovanja 18 ur).
^Spojina 3 je eveminomicinski antibiotik prikazan s formulo 3 .
5Nastali kompleks. Glej primera 3 in 4.
6MPK je mg zdravila na kg telesne teže opic Cynomogus ( razpon telesne teže od 2.9 do 9.6 kg, Schering Corporation Colony, čas učinkovanja 18 ur). Tri opice smo uporabili pri poskusu s 40 MPK, 5 NMG: 2 opici pa pri ostalih dveh poskusih.
TABELA 2
NEUGODNI REAKCIJSKI SINDROM (ARS7 ) PRI INJICIRANTU VODNIH RAZTOPIN ENEGA MOLA SPOJINE S FORMULO 3 IN DVEH MOLOV NMG TER
SELEKTIVNIH DODATKOV % ARS PRI NASLEDNJIH DOZAH (MPK8 ) ZDRAVIL S FORMULO 3 (20 mg/ml) PRI MIŠIH
INJICIRANO ZDRAVILO
S FORMULO 3
100 200 250 300
TWEEN9 (koncentracija)
3: 2NMG 0 10 100 100
3: 2NMG 0.1% 10 100 100
3: 2NMG 0.25% 80 100 100
3: 2NMG 0.5% 100 100 100
3: 2NMG 1% 100 100 100
3: 2NMG 2% — 0 0 40
3: 2NMG 3% 0 0 0 0
100 200 250 300
3: 2NMG DMSO10 (koncentracija) 0 0 90 100
3: 2NMG 1% 0 40 100 100
3: 2NMG 5% 0 10 20 50
3: 2NMG 10% 0 0 10 50
^Simptomi neugodnega reakcijskega sindroma opaženi pri miših (skupine 5 do 10, CF—1, povprečna teža 20g, Harlan Sprague Dawley. čas učinkovanja 18 ur) dve minuti po četrti injekciji (enojna doza).
^MPK je mg zdravilne substance s formulo 3 na kg telesne teže živali.
9Tween je sorbatan mono-9-oktadekanoat poli(oksi-l,2-etandiil) ali polisorbat 80. na voljo pri ICI Americas Inc.,Wilimington Delaware pod trgovskim imenom Tween 80.
10DMSO je dimetilsulfoksid.
100 200 250 300
Glycerol (koncentracija)
3: 2NMG 0 0 100 100
3: 2NMG 5% 0 90 90 100
3: 2NMG 10% 0 60 100 100
3: 2NMG Dekstran 40 (koncentracija) 0 0 100
3: 2NMG 1% 20 100 -
3: 2NMG 10% 0 50 70 100
Dekstran 7011 12 * (koncentracija)
2NMG 6% 0 90 100
HP-B-CDl3 (molsko razmeije)
2NMG 0 0 100 100
2NMG 1:0.5 0 50
2NMG 1:1.5 0 60
2NMG 1:2.5 0 30
2NMG 1:3 0 10
2NMG 1:3 10
2NMG 1:6 0
11 Dekstran 40 je visokomolekulami polimer glukoze (40000) na voljo pri Sigma Chemical.
1 -Dekstran 70 je visokomolekulami polimer glukoze (70000) na voljo pri Sigma Chemical.
^ΗΡ-β-CD je hodroksipropil-B-ciklodekstrin z 7.4 hidroksipropilnimi skupinami na molekulo ciklodekstrina.
TABELA 3
VPLIV KONCENTRACIJE NMG SOLI LIPOFILNEGA OLIGOSAHARIDNEGA
ANTIBIOTIKA IN MOLSKEGA RAZMERJA NMG PROTI ANTIBIOTIKU PRI
A RS*4 PRI MIŠIH
ZDRAVILO S FORMULO 3 %ARS pri naslednjih dozah zdravila (MPK14 15):
(Koncentracija zdravila)
50 100 200 300 400
316:2NMG (10 mg/ml) 3:2NMG - - 50 - -
(20 mg/ml) 3:2NMG — 20 100 — —
(50 mg/ml) 3:3NMG 70 100 — — —
(20 mg/ml) 3:3NMG — — 0 0 20
(40 mg/ml) 3:3NMG — 0 15 40
(80 mg/ml) 3:5NMG — — 100 -- —
(20 mg/ml) 3:5NMG — 0 0 —
(50 mg/ml) 3:9NMG — — 0 — 40
(20 mg/ml) 3:9NMG — 0 0 0
(40 mg/ml) 3:9NMG — — 0 0 0
(80 mg/ml) - 0 — 0
14ARS je neugoden reakcijski sindrom, katerega sinptomi so opaženi pri miših (skupine 5 do 10, CF--1, povprečna teža 20g, Harlan Sprague Dawley. čas učinkovanja 18 ur) dve minuti po četrti injekciji (enojna doza).
15MPK je mg zdravilne substance s formulo 3 na kg telesne teže živali.
16Spojina 3 je eveminomicinski antibiotik prikazan s formulo 3 .
Morda je še bolj presenetljivo, da smo opazili minimalne ihibitome koncentracije (MIC) pri in vitro eksperimentih in vrednosti 50% zaščitne doze (PDso) pri in vivo primerih za kompleks 3 do 6 molov ΗΡ-β-CD kombiniranega z 1 molom spojine s formulo 3 in 2 ali 3 moli NMG v bistvu enake vrednosti MIC in PD5q za spojino s formulo 3 ter tistih za NMG sol spojine s formulo 3 s ΗΡ-β-CD. Vezavne vrednosri proteinov za kompleks z 2 ali 3 moli NMG na mol spojine s formulo 3 s 6 moli ΗΡ-β-CD so bile med 96% in 98% vezavnih vrednosti za sol spojine s formulo 3 z 2 moloma NMG.
Tako smo presenečeni odkrili farmacevtsko sprejemljive sestave snovi, ki vsebuje lipofilni oligosaharidni antibiotik in omogoča učinkovit vnos takega antibiotika v serum živali, tudi sesalcev, posebej človeka inficiranega z bakterijami, ki so dovzetne za ta zdravila (antibiotiki s formulami 1,2 in 3).
2-hidroksipropilni derivati α-, β- in γ- ciklodekstrina, uporabljenih v tej iznajdbi, imajo okrog 2 do 11 hidroksipropilnih skupin na molekulo ciklodekstrina. Pripravimo jih lahko z reakcijo enega izmed α-, β- ali γ- ciklodekstrina in 1,2-propilen oksida v prisotnosti baze, pri tem nastanejo multikomponentne amorfne mešanice, kot je opisano pri J.Pitha v USP 4727064, J.Pitha, et al. v International Journal of Pharmaceutics (1986),29,73-82 ali pri Muller v USP 4870060. Samokondenzacijske produkte smo odstranili, stopnja substitucije, t.j. število hidroksipropilnih skupin na molekulo α-, β- in γ- ciklodekstrina smo običajno določali s protonsko NMR in/ali masno spektroskopijo v skladu z metodami opisanimi pri J.Pitha v USP 4727064 in v International Journal of Pharmaceutics (1986) 29, 73-82 ali pri C.T. Ras, et al. v Pharmaceutical Research (1990) 7, (No.6) 612-615.
2-hidroksipropilni derivati α-, β- in γ- ciklodekstrina, ki imajo okrog 2 do 15, po možnosti 3 do 9, še bolje 5 do 7.5 hidroksipropilnih skupin na molekulo α-, β- ali γciklodekstrina, lahko pripravimo po običajnih postopkih in so prav tako komercialno na voljo pri Cyclolab (podružnica v lasti CHINOIN-a, Pharmaceutical and Chemical Works. Ltd., 1325 Budapest, Hungary); Walker-Chemie GmbH, Division L. Biotechnology Prinzregentstrasse 22 D-8000, Munchen 22 West Germany; American Maize Hammond, Indiana; Pharmatec Inc, Ρ.Ο.Βοχ 730, Alachua FL 32615 in Janssen, Biotech N.V Lammerdries 55, B-2430 Olen, Belgium.
Količine tega α-, β- in γ- ciklodekstrina, ki zadoščajo učinkovitemu prenosu lipofilnega oligosaharidnega antibiotika v živalski serum, posebej človeški, ne da bi povzročale ARS pri injiciranju farmacevtske mešanice, ki vsebuje lipofilni oligosaharidni antibiotik s formulami 1, 2 ali 3, vsaj stehiometrično količino izbrane baze in količine hidroksipropilnih derivatov α-, β- in γ- ciklodekstrina, v skladu s to iznajdbo, so podane v tekstu na različnih mestih.
Takšna količina hidroksipropil a- ciklodekstrina ( ΗΡ-α-CD) je okrog 5 do 15 molov HP-a-CD na mol lipofilnega oligosaharidnega antibiotika s formulo 1. Takšna količina hidroksipropil B- ciklodekstrina ( HP-B-CD) je okrog 1 do 9, pomožnosti 2 do 6 molov HP-B-CD na mol lipofilnega oligosaharidnega antibiotika s formulo 2 ali 3; takšna količina hidroksipropil -γ- ciklodekstrina ( ΗΡ-γ-CD) je okrog 2 do 8, pomožnosti 3 do 5 molov ΗΡ-γ-CD na mol lipofilnega oligosaharidnega antibiotika s formulo 1. Soli lipofilnega oligosaharidnega antibiotika, prikazanega s formulo 3, so edineo primerne za tvorbo popolnih raztopin v vodi hidroksipropil α-, β- in- γ- ciklodekstrinov, ki imajo okrog 2 do 15 hidroksipropilnih skupin na molekulo ΗΡ-α-CD ali HP-B-CD ali HP-B-CD. Velika izbira HP-B-CD,ki vsebujejo 3.9 do 7.5 hidroksipropilnih skupin na molekulo HPB-CD, pravzaprav preprečujejo ARS pri parenteralnem injiciranju kompleksa 1 mola spojine s formulo 3 in 2 molov NMG ter 6 molov HP-B-CD v miši, kot je prikazano v tabeli 4.
\Ί
Tabela 4
Neugoden reakcijski sindrom^ na parenteralno injekcijo (800 MPK, 80 mg sestavine formula 3 na ml) v miško iz vodne raztopine kompleksov enega mola sestavine s formulo 3 in dveh molov NMG in šestih molov ΗΡ-β-CD, ki ima 3,9 do 7,5 hidroksipropilnih skupin.
število hidroksipropilnih skupin na % neugodnega molekulo ΗΡ-β-CD reakcijskega sindroma
Št. ΗΡ-β-CD 90
7.4 0
7.5 0
7,4 0
7.4 0
7.2 0
6.9 0
6,7 10
6.3 0
6,2 0
5,2 0
4.5 0
4.4 0
4,1 10
3.9 0 ^Neugoden reakcijski sindrom so opazili pri miškah (skupina 10 CF-1, povprečna teža 20 g, Harlan Sprague Dawley, čas učinkovanja 18 ur) v obsegu dveh minut po četrti injekciji (enojna doza).
Med razvojem sestavin izumljene snovi, smo pripravili sestavine z adicijo lipofilnega oligosaharidnega antibiotika, npr. sestavino, ki je predstavljena s formulo 3 v najmanj stehiometricni količini, npr. okrog 2 do 3 mole prioritetne baze, N-metil glucamin in zadostno količino dimetilsulfoksida ali glicerola ali absorbiranih mono-9-oktadeceonat poli (oksi-l,2-etanedil) derivatov, npr. polisorbat 80 ali Twen 80 ali dekstran, kot npr. dekstrana s 40 ali 70 polisaharidnimi enotami (ki nastanejo z delovanjem bakterije, ki raste na sukroznem substratu, katerega glavne sestavine so D-glukozne enote, ki so vezane pretežno α-D (1—>6). Dekstrana 40 in 70 (povprečna molekulska teža je 40000 oziroma 70000) sta polisaharida, ki ju proizvaja L. mesenteroxide na sukrozi; prav tako tudi zadostne količine dimetilsulfoksida, glicerola, polisorbata 80 ali dekstrana, ki so potrebne za pripravo učinkovitih omenjenih lipofilnih oligosaharidnih antibiotikov v serumu živali, medtem ko istočasno reduciramo ali odpravimo neugoden reakcijski sindrom. Zveze in rezultati so prikazani v tabeli 2. Povečanje količine DMSO in glicerola (do 10 utežnih %) zmanjšajo prisotnost neugodnega reakcijskega sindroma; zadostne količine DMSO in glicerola so okrog 5 do 10 utežnih % oziroma okrog 10 utežnih %. Povečana količina dekstrana prav tako reducira prisotnost neugodnega reakcijskega sindroma; zadostna količina dekstrana 40 in 70 je okrog 2 do 10 oziroma najmanj 6 utežnih %. Količina Twena 80 od 0,1 do okrog 1 utežnega procenta povečuje prisotnost neugodnega reakcijskega sindroma, medtem ko se količine Twena 80, večje od okrog 2-3 utežnih % kažejo v skoraj popolni odsotnosti neugodnega reakcijskega sindroma. Količine Twena 80, večje od 2-3 utežnih % se smatrajo za zadostne (vsi utežni procenti se nanašajo na celotno maso sestavin). Kakorkoli, uporaba hidroksipropil -α, —β—ali γciklodekstrinov je prioritetna za farmacevtsko sprejemljive sestavine izumljene snovi. Glej tabelo 2, zgoraj navedeno.
Baze za uporabo v omenjeni iznajdbi so tiste, ki tvorijo farmacevtsko sprejemljive soli lipofilnih oligosaharidnih antibiotikov s formulami 1, 2 ali 2 in vključujejo primerne organske in anorganske baze. Primerne organske baze vključujejo primarne, sekundarne in terciarne alkil amine, alknolamine, aromatske amine, alkilaromatske amine in ciklične amine. Idealni organski amini vključujejo farmacevtsko sprejemljive baze, izbrane izmed naslednjih: kloroprocain, procain, piperazin, glukamin, N-metilglukamin, N.N-dimetilglukamin etilendiamin, dietanolamin, diisopropilamin, dietilamin, N-benzil-2-feniletilamin, N-Ndibenziletilendiamin, kolin, klemizol, tris(hidroksimetil)-aminometan ali D-glukozamin. Prioritetne baze vsebujejo N-metil glukamin (NMG), dietanolamin in tris(hidroksimetil)aminometan (TRIS). Uporaba NMG v tej iznajdbi je prioritetna. Glej Tabeli 2 in 3. Primerne anorganske baze vsebujejo alkalne kovinske hidrokside, kot npr. natrijev hidroksid. Baze, ki so se izkazale kot koristne pri pripravi sestavin snovi te inovacije so v vodni raztopini pri pH najmanj okrog 9,3. Lizin tvori vodne raztopine s pH manjšim od
9,3 in tak lizin ni primerna baza za omenjeno iznajdbo. Dvovalentni kovinski hidroksidi, kot so zemljoalkalijski hidroksidi in banjev hidroksid niso tvorili vodnih raztopin z lipofilnimi oligosaharidnimi antibiotiki s formulami 1, 2 in 3 v prisotmosti 6 molov HPbCD pri pH najmanj okrog 9,3 in niso bili sprejemljivi kot baze za uporabo pri tej iznajdbi.
Termin najmanj okrog stehiometrične količine se uporablja z ozirom na uporabljeno bazo v tej iznajdbi, pri čemer je mišljena koičina baze, potrebna za snovno kompletno reakcijo (kar pomeni več kot 99% kompletne reakcije) s kislimi fenolnimi vodiki lipofllnih oligosaharidnih antibiotikov s formulami 1, 2, 3, ki imajo enega, dva ali tri fenolne vodike (spojina s formulo 3 ima tri fenolne vodike, od katerih sta samo dva kisla). Pri spojinah s formulama 1, 2, kjer je R5=H, je samo en fenolni vodik na molekulo kisel, in stehiometrična količina farmacevtsko spremljivih baz je najmanj okrog enega mola baze navzgor do 12 molov take baze. Za spojini, ki ju prikazujeta formuli I in 2, kjer je
in za spojino s formulo 3, sta dva kisla fenolna vodika na molekulo te spojine, stehiometrična količina baze, ki jo potrebujemo za kompletno reakcijo z dvema kislima fenolnima vodikoma je najmanj 2 in navzgor do okrog 12 molov farmacevtsko sprejemljive baze, potrebne za to iznajdbo. Za prioritetne lipofilne oligosaharidne antibiotike s formulami 1 in 2, kjer je
R5
in tistega s formulo 2, uporabljamo približno 2 do 6 molov, bolj priporočljiva je uporaba okrog 2,0 do 3,5 molov, najvišjo prioriteto pa ima uporaba okrog 2 do 3 molov farmacevtsko sprejemljive baze, kot je NMG pri konstantnem pH 9,3 v vodni raztopini kot nasprotje raztopinam z višjim pH, ki so bile višje zapufrane, če smo uporabili 6-12 molov NMG. Termin lipofilni oligosaharidni antibiotik se uporablja za izbran lipofilni član iz družine orthomycin antibiotikov, bolj natančno flambamycin, eveminomicini, eveminomicin - tip antibiotikov, curamycin in avilamycin A-N antibiotikov.
Flambamycin, lipofilni oligosaharidni antibiotik, ki ga proizvaja Streptomvces hvgroscopicus DS 23230 ima strukturno formulo I, kjer je Rj=R5=H, Y = OH, R2=COCH(CH3)2, R3=R^=Ry=Rg=R9=CH3, R4=COCH3 in W=Z=C1, kar je odkril W. D. Ollis, Tetrahedron, (1979),35,105-127.
Cyramycin A je flambamycin antibiotik (strukturna formula je predstavljena s formulo 1, kjer so Rj, R3, R4, R5, Rg, R7, Rg, R9, W in Z enaki kot pri flambamycinu z izjemo R2 = COCH3 in Y=H. Glej O. L. Galamarine in ostali, Tetrahedron (1961), 15, 76 in V. Deulofer in ostali, Anales de Ouimica (1972), 68, 789.
Avilamycin A-N antibiotki so lipofilni oligosaharidni antibiotiki, izolirani iz antibiotičnega kompleksa, ki ga proizvaja kultura organizmov Streptomvces viridochromogenes, NRRL 2860. Glej J. L. Merts in ostali, The Journal of Antibiotics (julij 1986) Vol 39 (št. 7) 877-887. Strukturna formula avilamycin A-N antibiotika je predstavljena s formulo 1, kjer je R1=R5=H, Y=H, R2=COCH(CH3)2, COCH3, CO(CH2)3CH3, COCH2CH3 ali H, R3=CH3, R4=COCH3, CH(OH)CH3 ali CHO in R6=CH3 ali H, R7=CH3 ali H, Rg=CH3, CH2OH ali H, R9=CH3 ali H , W=H ali Cl in Z=C1.
Eveminomicin antibiotiki so učinkoviti v tej iznajdbi, vključno z eveminomicini B, C, in D, ki jih izoliramo iz antibiotskega kompleksa, ki ga proizvajajo organizmi Micromonospora carbonacea var, carbonacea NRRL 2972 in različne M. carbonacea var, aurantiaca NRRL 2997, kot je opisano v USP 3,499,078. Eveminomicin derivati imajo nitrozo, hidroksilamino ali amino delež v predelu nitro področja; v eveminomicinh B, C, in D jih lahko dokažemo z redukcijo nitro področja B, C in D eveminomicinov ustrezno s procedurami USP 4,006,225. Prioritetni eveminomicin je N-acetilaminoeveminomicin-D, ki ga predstavlja formula 2, kjer je X=NHCOCH3, Y=H, R4=CH(OCH3)(CH3), R3=R5=H in R2=CH3. Nacetilaminoeveminomicin-D in njegovo di-N-metilglukaminsko sol lahko pripravimo po postopkih USP 4,129,720 , to je z redukcijo nitro področja eveminomicinov B, C in D za proizvodnjo aminoderivatov, ki se naknadno pretvorijo v N-acil, npr. N-acetil, N-alkil, npr. NH(C2H5) ali Ν,Ν-dialkil, npr. N(C2H5)2, derivate. Prav tako so opisane priprave N-acil-Nhidroksilamino-eveminomicin B, C in D derivatov in njihovih farmacevtsko sprejemljivih soli. Preparacija Eveminomicina 7 je predstavljena s formulo 2, kjer je X=OH, Y=H, R4=CH(OCH3)(CH3), R5=H in R2=CH3, kar so odkrili A. K. Ganguly in ostali v J. Chem. Soc. Chem. Comm., 1980, 56-58.
Antibiotiki tipa eveminomicin” so tisti lipofilni oligosaharidni antibiotiki, ki jih predstavlja formula 2, kjer je X=NC>2, NO, NH2, OH. NHCOCH3, NHC2H5, N(C2H5)2, NHOH ali H, Y=OH, R2=CH3 ali H, R3=H, Ρ4=ΟΗ(ΟΟΗ3)(ΟΗ3) ali H in
Spojine s formulo 2, kjer je X=NCb ali NH2, Y=OH, R2=R3=R4=H in
so izolirane iz antibiotičnega kompleksa 13 - 384, ki ga dobimo s fermentacijo organizma Micromonospora carbonacea var, africana. NRRL 15099, ATCC 39149. Antibiotični komponenti 1 (formula 2, X=NC>2 in Y, R2,R3,R4 in R5 so vsi definirani v referenci antibiotika 13 - 384) in 5 (formula 2, X=NH2 in Y, R2,R3,R4 in R5 so vsi definirani v referenci antibiotika 13 - 384) sta odkriti v USP 4,597,968 in 4,735,903, njuni strukturni formuli pa so odkrili A. K. Ganguly in ostali v Heterocvcles (1984) Vol. 28 (št.l) 83 - 88. Antibiotiki tipa eveminomicin s formulo 2, kjer je X=H, NHOH, NHCOCH3 in njihovi acil in alkil derivati so razloženi v USP 4,622,314 in 4,767,748.
Prioritetne sestavine snovi te iznajdbe vključujejo spojine s formulo 2, kjer je R3=H in
X Y Β4 Es Es
NO2 OH CH(OCH3)(CH3) H ch3
OH H
NO2 H H
NO2 H CH(OCH3)(CH3)
NHCOCH3 H M
NO2 OH H OH H 1 H A 00 H
H - - •
NHOH *
NHCOCH3 •
nh2
NHC2H5
N(C2H5)2 *
Antibiotik tipa eveminomicin z najvišjo prioriteto se imenuje 56-deacetil-57-demetil-45-Ode(2-metil-l-oksopropil)-12-O-(2,3,6-trideoksi-3-C-metil-4-O-metil-3-nitro-a-L-arabinohexopiranzoil)-flambamicyn 56-(2,4-dihidroksi-6-metilbenzoat); njegova molekulska formula je C70H97NO38CI2, molekulska teža je 1629, predstavlja pa ga formula 3. Prioritetno spojino s formulo 3 pridobivamo s fermentacijo Micromonospora carbonacea var, africana NRRL 15099, ATCC 39149 ali po možnosti z izboljšanim sevom, katerega obrazložitev je navedena za tem.
Uporabni sev SCC 1413 kulture NRRL 15099, ATCC 39149, prioritetno spojino formule 2 lahko primemo pridobimo z vrsto postopkov, ki so opisani v Primeru 1, USP 4,597,968. V specifičnem primem, v skladu s tem postopkom, je bila začetna faza cepiva za fermentacijo seva SCC 1413 pripravljena s transferom 2,5ml zmrznjene celotne mesne brozge v 50ml kalitvenega medija v 250ml erlenmajerici. Kalitveni medij je sestavljen iz 0,3% govejega ekstrakta, 0,5% triptona, 0,1% dekstroze, 2,4% krompiijevega škroba, 0,5% kvasnega ekstrakta in 0,2% kalcijevega karbonata. Pred sterilizacijo pH medija uravnamo na 7,5. Erlenmajerice inkubiramo pri 30°C na vrtečem mešalu pri 250 rpm 48 ur. Za drugo stopnjo kalitve vsebijejo 2 litrske erlenmajerice s 500ml enakega medija, ki jih cepimo s 5% volumna prve stopnje kalitve. Pogoji inkubacije so enaki kot prej. Tretjo stopnjo cepiva pripravimo analogno drugi stopnji s tem, da traja inkubacija 24 ur.
litrov fermentacije smo na začetku izvršili v 14 litrih NBS laboratorijskih fermentoijih v fermentacijskem mediju, ki vsebuje 0,5% kvasnega ekstrakta, 0,5% kazein hidrolizata, 1% cereloze, 2,0% topnega škroba, 0,4% kalcijevega karbonata in 0,24 mg% kobaltovega klorida. pH medija smo uravnali na 6,7 pred sterilizacijo in na 7,0 pred cepitvijo. Tretjo fazo cepitve (2,5%) smo uporabili za iniciranje fermentacije, ki je bila izvedena pri 30°C z 0,35 vvm zraka in z mešanjem 350 rpm.
Med potekom fermentacije smo produkcijo antibiotika kontrolirali vsakih 24 ur z bioanalizo celotne mesne brozge napram Staphvlococcus aureus 209 P (pH agarja 7,0) in Escherichia coli ATCC 10536 (pH agarja 8,0). Prav tako smo zasledovali - šaržno ali kontinuimo - rast producirajočega organizma, pH in raven raztopljenega kisika. Potek fermentacije v tipičnem 10 litrskem fermentorju je prikazan na Sliki 1.
Izboljšan sev SCC 1413, NRRL 15099, ATCC 39149 smo razvili z uporabo standardnih mutagenih agensov in s tem pridobili seve, ki producirajo izboljšane proizvode prioritetnega antibiotika tipa eveminomicin - spojine s formulo 3. V specifičnem primem smo parent” sev SCC 1413, NRRL 15099, ATCC 39149 izpostavili količini mutagenega agensa,
N-nitrozogvanidin (NTG), kije sposoben ubiti 90% kulture SCC 1413, ATCC 39149, NRRL 15099. 1500 preživelih izolatov smo vzeli za testiranje biološke aktivnosti napram S.aureus in E. coli, da bi ugotovili napredke, ki jih kaže izboljšana produkcija zahtevanega antibiotika formule 3. Test za ugotavljanje povečane aktivnosti je bil naslednji: izolati enojnih kolonij so kalili v testnih cevkah, ki so vsebovale lOml kalitvenega medija Primera 1 USP 4,597,968, pri stresanju 250 rpm na krožešem mešalniku pri 30°C 48 ur. Fermentacijske študije smo začeli s transferom 2,5ml kal v 250ml erlenmajerico, ki je vsebovala 50ml fermentacijskega medija in nato z inkubacijo pri 30°C 96 ur pri 250 rpm na krožečem mešalniku. Izolacija je dala izboljšan proizvod zahtevanega antibiotika. Rezultati reprezentativne izboljšave seva SCC 1631 so podani v Tabeli 5.
Nadaljnji postopek izboljšave seva smo ponovili z reprezentativnim izboljšanim izolatom SCC 1613, ki smo ga nadalje izpostavili NTG, in to taki količini, ki zadostuje uničenju 90% kulture. Nadaljevali smo s selekcijo izolatov na agamih ploščah, ki vsebujejo 150mg/ml eveminomicina D. Izolati so dali povečano produkcijo zahtevanega antibiotika, ki smo ga zopet selekcionirali s testiranjem biološke aktivnosti napram S. aureus in E.coli. En tak izolat, ki smo ga dobili iz seva SCC 1756, je zadovoljivo proizvajal prioritetni antibiotik s formulo
3.
Nadalje, NTG mutageneza SCC 1756 daje naš sedanji produkcijski sev SCC 2146.
V nadaljnjih mutacijskih procesih smo uporabljali postopke za obe študiji, ki sta že pred tem razloženi. Za kasnejši dve mutacijski študiji smo fermentacijsko brozgo ekstrahirali z etilacetatom, koncenrate pa smo kromatografirali na ploščah za tenkoplastno kromatografijo (Whatman LKGDF) v topnem sistemu, ki vsebuje kloroform : metanol v volumskem razmerju 9:1. Za ugotavljanje naraščajočih titrov spojine s formulo 3, smo plošče za tenkoplastno kromatografijo preiskovali z uporabo Shimadzu CS-930 TLS plate scanner-ja, večjo produkcijo ekstraktov pa kvantitativno z uporabo HPLC. Kombinirani titri so definirani kot vsota spojine s formulo 2 (antibiotik 13-384, komponenta 1 USP 4,597,968) in nitrozo analoga omenjene komponente 1, i.e., antibiotik 13 - 384, komponenta la.
Zgodnja opažanja so pokazala, da čeprav parent (=starševski) sev SCC 1413 hitro raste pri 34 °C, pa je optimalna produkcija antibiotika pri nižjih temperaturah. Ta fenomen smo raziskali pri optimizaciji fermentacije. Rezultati so pokazali, da smo pridobili optimalno produkcijo, ko smo temperaturo znižali od 34 °C na 30 °C po 24 urah inkubacije. Pri vsem nadaljnjem delu v mešalnikih smo upoštevali 24 urno inkubacijo fermentacije pri 34 °C in znižanje temperature na 30 °C, dokler je trajala fermentacija.
Študij medijev smo spremljali v zvezi z izolacijo produkcijsko izboljšanega seva. Vir ogljika in dušika smo raziskovali prav tako kot dodatek mineralov in ostalih kompleksnih hranil. Zamenjavi kazein hidrolizata z mesnim ali ribjim peptonom in substitucija krompirjevega dekstrina (PDP 650) s topnim škrobom sta pri uporabi sevov SCC 1413 in SCC 1631 dali povečano produkcijo antibiotika. Nadaljnjo povečanje produkcije (pri študijah s sevom SCC 1756) spojine s formulo 3 smo opazili pri dodatku com steep liquor” in nikljevega (2) klorida. Veljavni - sedanji fermentacijski medij (41 + l/2Ni), optimalen za spojino s formulo
2. vsebuje 2,2 utežnega % glukoze, 4,0 utežnega % PDP 650 dekstrina, 0,5 utežnega % kvasnega ekstrakta, 0,6 utežnega % mesnega peptona, 0,5 volumskih % com steep liquor”, 2,5x10'^Μ nikljevega klorida in 0,4 utežnega % kalcijevega karbonata. Pred dodatkom kalcijevega karbonata smo pH medija uravnali na 6,7. Tabela 6 prikazuje primeijavi titrov sevov SCC 1413, SCC 1631, SCC 1756 in SCC 2146, ki smo jih pridobili v stresalnih steklenicah (50ml veljavnega-sedanjega produkcijskega medija v 250ml erlenmajerici pri 30 °C, 96 ur, pri 350 rpm). Znaten napredek titra (15 krat večji kot originalni parent SCC 1413) je nazorno prikazan. Titre 555 -750 mg/ml (vsota spojine s formulo 3 in njenega nitroznega derivata) smo dosegli v 100 litrskih fermentacijah z uporabo veljavnega sedanjega produkcijskega medija z našim najboljšim produkcijskim sevom SCC 2146 (Tabela 7).
Tabela 5
rrimerjava sevov stt hi? m sli ioji pri termentaciji Prikaz con inhibiciie (mm) na aaarnih Dloščahi
TESTI
Sev S.aureus pH 7 E. coli pH 8
SCC nerazredčen 1:20 nerazredčen
1631 28.7,28.7
1413 28.7,28.7
22.0
19.0
20, 17.5
H3, 12 H3 f
TEST 2
Sev_S.aureus pH 7_E. coli pH 8
SCC_nerazredčen 1:20_nerazredčen
1631 28.1,28.8 233,23.1 14.8 C1 2 3,15.0 C2
1413 23.8,23.1 205,19.8 12 H·*, 12 H3
1. Značilna je bila dvojna določba
2. Čista cona
3. Motna cona
Tabela 6
Primerjava steklenic SCC-s 1413, 1631, 1756 in 2146 sevov Micromonospora
Carbonacea var, africana NRRL 15099, ATCC 39149
Titer spojine s formulo 3 in njenega nitroznega analoga (1A) (mg/ml) kultura_HNCb)_la(NO)_kombinacija (1+la)
SCC 1413 5 3 8
SCC 1631 14 4 18
SCC 1756 17 16 33
SCC 2146 39 85 124
Tabela 7
100 litrske fermentacije SCC 2146
Titer formule 3 in njenega NO analoga (TA) (mg/ml)
medii 1(NO?U la(NO)2 kombin
41 105 315 420
41 135 170 305
41 + 1/2 Ni2 55 500 555
41 + Ni4 150 575 725
41 + 1/2 Ni2 100 650 750
41 + 1/2 Ni2 130 470 600
Opombe k tabeli 7
1. Antibiotik tipa eveminomiein s formulo 3
2. Nitrozo analog antibiotika s formulo 3
3. Koncentracija niklja (1/2 Ni) = 2.5xlO6M
4. Koncentracija niklja = 5xlO'6M
Izolacija lipofilnega oligosaharidnega antibiotičnega kompleksa vsebujočega spojino formule 3 in nitroznega analoga je bila tako dosežena z uporabo postopka Primer 1C, USP 4,597,968. Fermentacijski brozgi smo pH uravnali na pH 7 in jo dvakrat ekstrahirali z etilacetatom. katerega volumen je dvakratni volumen fermentacijske brozge. Združene etilacetatne ekstrakte smo koncentrirali in nato količino spojine formule 3 in nitroznega analoga določili s HPLC. Nitrozni analog smo preoblikovali v nitro spoljino formule 2 z uporabo oksidanta kot je terciaren butilhidroperoksid (t-BuC^H) z vanadilacetilacetonatom, raztopljenim v aprotičnem organskem topilu pri sobni temperaturi. Potek reakcije smo opazovali npr. s HPLC. Reakcijsko mešanico smo ohladili s trialkilfosfitom in surovi produkt očistili s standardno kromatografsko tehniko, npr. s silikagelsko kolonsko kromatografijo (aceton / CH2CI2) ali s kolono s polihidroksivinilnim polimerom kot je Fractogel (Toyo Pearl). izdeluje ga Toyo Haas, Philadelphia, Pennsylvania.
Farmacevtsko sprejemljiva zgradba izumljene snovi lahko vsebuje razen (a) antibotika s formulo 1, 2, 3, (b) bazo sposobno tvorbe farmacevtsko sprejemljivih soli teh antibiotikov in (c) specifične količine npr. hiroksipropil - α-, β- ali -γ- ciklodekstrina z od 2 do 15 hidroksipropilnimi skupinami na molekulo ciklodekstrina, to je od približno 0 do približno 6,0 utežnih % (bazira na antibiotikih s formulami 1, 2, 3) farmacevtsko sprejemljivega neionskega surfaktanta. Prednostni farmacevtsko sprejemljivi neionski surfaktant je absorbirani mono-9-oktadecenoat poli (oksi-1,2-etanedilni) derivat kot je Tween - 80, toda katerekoli drugi neionski surfaktant tvori farmacevtsko sprejemljive sestavine, ki so npr.. kadar so raztopljene v farmacevtsko sprejemljivem nosilcu, bistre, nemotne in niso vezane na posamezne snovi izmeijene s standardnimi analitičnimi tehnikami, npr. z nefelometrijo. Posebno željene sestavine izumljene snovi vsebujejo 2,85 do 5,70% teže Tween-80 in antiobiotično spojino formule 3.
BIOLOŠKE AKTIVNOSTI
Presenetljivo je odkritje, da ima izumljena snov, ki vsebuje 1 mol spojine formule 3, 2 mola NMG in 6 molov 2-hidroksipropil-p-ciklodekstrina s 7,4 hidroksipropilnimi skupinami na molekulo β- ciklodekstrina, precej enako geometrijsko srednjo vrednost MIC-s (GMM) napram različnim bakterijam in precej enake obvezne vrednosti serumskega proteina kot spojina formule 3 per se. Pričakujemo, da se bodo vse sestavine izumljene snovi enako obnašale.
In vitro antibakterijsko aktivnostne teste smo izvedli s konvencionalnimi agarsko razredčevalnimi metodami na Mueller-Hintonovem agarju. GMM zgoraj omenjene najugodnejše sestavine izumljene snovi in za spojino formule 3 smo dodločili napram različnim bakterijam, npr. Gram pozitivnim in Gram negativnim bakterijam. Termin občutljive Gram pozitivne in Gram negativne bakterijske infekcije pomeni širok razpon Gram pozitivnih bakterijskih infekcij, npr. na methicillin-rezistentni in methicillin-občutljivi stafilokoki, različni sevi streptokokov in enterokokov ter nekatere Gram negativne bakterijske infekcije, npr. E. coli. Klebsiella. Salmonella in Pseudomonas. Spojina formule 3 je imela odlično aktivnost (10 krat večjo aktivnost kot vancomycin) napram methicillinrezistentnim stafilokokom (GMM, O.lmg/ml) in methicillin-občutljivim stafilokokom (GMM 0,5mg/ml). Prav tako je imela spojina formule 3 dobro aktivnost (2 krat večjo učinkovitost kot vancomycin) napram Enterococcus feacalis (GMM, 0.49 mg/ml) in dobro aktivnost (MIC-s, <0.5mg/ml) napram različnim sevom streptokokov in enterokokov, rezistentnih na vancomycin (MIC-s, >128mg/ml). Spojina formule 3 je bila zelo aktivna napram Borrelia burgdorferi (MIC-s. <0,49mg/ml) in Legionella pneumophila in L. longbeacheae (MIC-s, 2,5 mg/ml), bila pa je samo šibko aktivna napram Gram negativnim bakterijam (GMM, >760 mg/ml), Trichomonas vaginalis (MIC-s, >192mg/ml) in Mvcoplasma sp.(MIC-s. 200mg/ml). Opazili nismo nobene navzkrižne rezistence z drugimi antibiotiki.
Spojina formule 3 ima zmerno baktericidno aktivnost napram različnim kliničnim in laboratorijskim sevom stafilokokov. Baktericidna aktivnost spojine formule 2 napram stafilokokom in enterokokom je bila podobna aktivnosti vanomycina. Spojina formule 3 ima dobro aktivnost napram mišjim stafilokokom (PD5q razpona od 0,5 do 25,0 mg/kg), ki je podobna aktivnosti vancomycina (od 0,7 do 28,5 mg/kg).
Upoštevajoč IV navodilo (30mg/kg) spojine formule 3 in dveh molekul NMG smo pri podganah opazili visoke serumske nivoje (do približno 90mg/ml) z dolgim serum beta razpolovnim časom.
Za farmacevtsko sprejemljive sestavine izumljene snovi pričakujemo, da bodo aktivne napram zgoraj omenjenim občutljivim bakterijam, kot tudi napram spirohetam vključno s Treponema pallidum. anaerobom vključno s Clostridium difficile. kot tudi napram Pnevmocvstis. Toxoplasma, praživalim in črevasnim glistam.
Glede na aktivnost spojine formule 3 napram Borrelia burgdofreri in Legionella pneumophila ter L. longbeacheae smo pričakovali, da bodo sestavine spojine vsebujoče spojino formule 2 pri človeškem modelu aktivne napram laimski bolezni in napram legionarski bolezni.
Ta iznajdba vpeljuje metodo zdravljenja ali preprečevanja Gram pozitivnih in Gram negativnih bakterijskih infekcij pri živalih z uporabo določene količine farmacevtsko sprejemljive sestavine izumljene snovi skupaj s farmacevtsko sprejemljivim nosilcem pri živalih, posebno pri človeku, obolelimi za takimi infekcijami.
Sestavine izumljene snovi lahko kombiniramo s farmacevtsko sprejemljivimi nosilci npr. steriliziranio vodo, vodnim etanolom,rastlinskimi olji ali polialkoholi, npr. s polietilenglikoli in propilenglikolom, in uporabljamo oralno, parenteralno ali tropsko v različnih oblikah. Najugodnejaša je izbira sterilizirane vode kot nosilca. Sterilizirana voda lahko neobvezno vsebuje farmacevtsko sprejemljive substance, npr. natrijev klorid, kalijev nitrat, glukozo, manitol, dektrozo, sorbitol, ksilitol ali pufre, kot so fosfat, acetat ali citrat, kot konzervanse. Sestavine izumljene snovi so pripravljene s primešanjem lipofilnega oligosaharidnega antibiotika s formulo 1. 2 ali 3, z vsaj približno stehiometrično količino baze, sposobne tvorjenja farmacevtsko sprejemljive sol, in glede na to ustreznega topila, kot je voda ter ustrezne količine, npr. hidroksipropil α-, β- ali γ- ciklodekstrina s približno 2 do 15 hidroksipropilnimi skupinami na molekulo ciklodekstrina. Zaporedje dodajanja ni odlučujoče, toda ugodnejše je, da se vodno raztopino določenega dekstrina primeša k bazi. Alternativna pot pa je, da vodno raztopino dekstrina dodamo potem, ko smo bazo zmešali z lipofilnim oligosaharidnim antibiotikom. Do nastanka vodne raztopine lahko pride pri temperaturi od 15 do 35 °C. Tako nastalo vodno raztopino smo filtrirali, da je nastala čista vodna raztopina kompleksa, ki se ga lahko evaporira ali pa, kar je ugodneje, osuši pri temperaturi pod 0 °C in tako tvori sestavine izumljene snovi v obliki liofiliziranega praška, katerega se z lahkoto rekonstituira z dodatkom ustrezne količine farmacevtsko sprejemljivega nosilca, kot je voda. Farmacevtsko sprejemljiv neionski surfaktant. npr. Tween-80, naj bi tako pri uporabi dodali raztopini pred filtracijo in liofilizacijo. Po alternativni poti, pa lahko vodno raztopino zamrznemo, odmrznemo in nato filtriramo red uporabo kot pri IV. navodilu. Posebnost te iznajdbe je, da farmacevtska sestava te iznajdbe tvori vodno raztopino in kljub temu vsebuje manj kot 20 utežnih %, še raje manj kot 10 ali najraje približno 1,0 do 5,0 utežnih % količine hidroksipropil α-, β- ali γ- ciklodeksrina. Odkritje, da farmacevtske sestavine, uporabne za varno in učinkovito razporeditev lipofilnih oligosaharidnih antibiotikov po serumu živalih, obolelimi za občutljivimi bakterijskimi infekcijami, posebno za občutlivimi Gram pozitivnimi in Gram negativnimi bakterijskimi infekcijami, lahko pripravimom z uporabo manj kot 20 utežnih %, npr. hidroksipropil-P-ciklodekstrina, je posebno presenetljivo glede na navodila Bodor USP 4,983,586 , da uporabimo 20 utežnih % hidroksipropil-p-ciklodekstrina, da se izognemo želiranju ali usedanju zdravila, in glede na navodila Pitha USP 4,727,064 , da uporabimo 40 do 60 utežnih % hidroksipropil-βciklodekstrina za raztapljanje različnih zdravil, vključno s solmi retinojske kisline.
Za oralno uporabo so lahko sestavine te iznajdbe v obliki tablet, kapsul, eliksiijev ali podobnega. Tablete in kapsule lahko vsebujejo taka polnilna sredstva kot sta škrob ali laktoza, tekoče oblike lahko vsebujejo barvila ali začimbe. Tropski preparati so lahko v obliki krem, hidrofobnih ali hidrofilnih masti ter vodnih, nevodnih ali emulzijskih losionov, kot tudi v obliki kontracepcijskih pripomočkov ali pa pudrov. Tipični nosilci za take oblike so voda, olja, masti, poliestri in polialkoholi. Parenteralne oblike, npr. injekcijske doze, so tekočine v obliki raztopin ali suspenzij s tipičnimi nosilci, kot so destilirana voda in slane raztopine. Ugodne so parenteralne oblike, še boljše pa so intravenozne (IV) oblike.
Doza, uporabljena pri katerikoli dozirni obliki, bo odvisna od različnih faktorjev kot so, teža, starost in spol živali, še posebno sesalcev, kot so zdravljeni ljudje, občutljivosti inficirajočega organizma na lipofilne oligosaharidne antibiotike, stanja in resnosti infekcije. Na spločno je doziranje lipofilnih oligosaharidnih antibiotikov s formulami 1, 2, ali 3 približno od 1,0 mg do približno 15 mg na kg telesne teže. Ugodnejše je doiziranje približno po 5 mg na kg telesne teže na dan v razdeljenih dozah. Omenjena doza je prepuščena navodilom zdravnika, prioritetno pa je IV navodilo.
Pri zdravljenju pacientov s sestavinami te iznajdbe je mogoče vključiti druge farmacevtsko aktivne komponente v isto dozirno enoto.
PRIMERI
PRIMER 1
A.) 100 1 fermentacije seva SCC 2146 Micromonospora carbonacea var, africana NRRL 15099, ATCC 39149 izboljšane, kot je bilo navedeno zgoraj, smo obdelali v skladu s postopki, opisanimi v Primeru IB, USP 4,597,968 , razen s tistimi, ki narekujejo izdelavo medija (41 + l/2Ni). Tako smo fermentacijo vzdrževali pri 34 °C 24 ur. Nato smo temperaturo spustili na 30 °C za 72 ur (celoten čas fermentacije je bil 96 ur) in tako znižali hitrost fermentacije. Prezračevalna hitrost je bila 0,35 vvm, mešalna hitrost pa 350 rpm.
glukoza 2.2% (teže)
PDP 650 deksrin 4,0%(teže)
kvasni ekstrakt 0,5% (teže)
mesni pepton 0,6%(teže)
com steep liquor 0,5% (volumna)
(= koruzni ekstrakt)
nikljev klorid 2,5 x 10’6M
kalcijev karbonat 0,4% (teže)
dodamo vodo do skupnega volumna lOOOml
B.) Izolacija
Fermentacij sko brozgo, dobljeno pri Primeru 1A dvakrat ekstrahiramo z 200 1 etilacetata. Združimo etilacetatna ekstrakta in ju koncentriramo. Tako dobimo koncentriran antibiotičen kompleks, ki vsebuje mešanico spojine formule 3 in nitroznega analoga (kot smo določili s HPLC).
PRIMER 2
A.) 919g antibiotičnega kompleksa, proizvedenega, kot smo opisali pri Primeru 1, vsebuje 294g (32%) mešanice nitroznega analoga in spojine formule 3 v molskem razmetju 3,4 : 1, raztopljene v 4,6 1 etilacetata, 68,8g NaHCO3 in 2,98g vanadilacetilacetonata 3M v 2.2.4trimetilpentanu, proizvaja ga Aldrich (0,06 eq). Temu kompleksu smo čez pol ure dodali 394 ml 3M t-butilhidroperoksida. Nato smo temu dodajali porcije po l,45g (0,03 eq) vanadilacetilacetonata pri 0 in čez 1.5, 2.5, 3.5, in 4 ure, tako da smo v 4 urah dodali 0,15 eq vanadilacetilacetonata. Reakcijsko zmes smo nato potopili v ledeno kopel in ji dodali 203 ml (0.5 eq) trietilfosfita (C2H5O)3P. Tako nastalo reakcijsko zmes smo razredčili v enakem volumnu etilacetata in pri tem vzdrževali temperaturo reakcijske mešanice pod 30 °C. Razredčeno etilacetatno reakcijsko mešanico smo dvakrat sprali z vodo. Vodne sloje smo nasolili in ekstrahirali z etilacetatom. Združena organska ekstrasta smo osušili z Mg SO4, filtrirali in koncentrirali. Tako nastali preostanek smo raztopili v minimalnem volumnu acetona in oborili v 7 1 raztopine etiletra in heksana v volumskem razmerju 1:9. Preostanek smo filtrirali, sprali s heksanom, osušenim pod vakuumom, in greli ter tako dobili 928g zmesi s 30% (278g) nitrospojine formule 2.
B.) Preostanek pri Primeru 2A smo očistili na 5 kg silikagela v koloni. Kolono smo sprali z 12 1 CH2CI2, vsebujočega po vrsti 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, (volumskih) acetona. Značilne frakcije smo združili in koncentrirali pri temperaturi pod 35 °C. Tako nastalo oborino smo raztopili v acetonu in oborili v 10 delih 10% raztopine etiletra in heksana. Produkt smo filtrirali in osušili z vakuumom brez gretja. Glavna frakcija je vsebovala 147,5g spojine formule 3 (98,7% čiste). Druge frakcije so vsebovale surovi produkt in smo jih toliko časa obdelovali s ponavljajočo se silikagelsko kromatografijo, dokler nismo dosegli vsaj 96 98% čistega produkta. Strukturo smo določili z NMR in MS in ugotovili, da ustreza formuli 2PRIMER 3A
V 5ml vode smo pripravili raztopino, ki je vsebovala 23,97 N-metilglukamina (NMG) in 570,90mg 2-hidroksipropil-p-ciklodeksrina (HPbCD) s 7,4 hidroksipropilnimi skupinami HPbCD.
Tej raztopini smo dodali lOOmg spojine formule 2· Po rahlem mešanju je nastal homogeni kompleks vsebujoč 20 mg/ml spojine formule 2- Tri komponente zmesi so bile v razmerju lmol spojine formule 2 · 2 mola spojine NMG : 6 molom HPbCD. Tako nastalo raztopino smo filtrirali skozi 0.45 mm membrano, osušili pod temperaturo 0°C in shranili v okolju brez prisotnosti vlage. Za pripravo frmacevtske sestavine smo dodali farmacevtsko sprejemljiv nosilec kot je voda. Podobne rezultate smo dobili z uporabo HPbCD z 3,9 do 7,5 hidroksipropilnimi skupinami na mol β-ciklodeksrina.
Nastanek čiste vodne raztopine homogenega kompleksa v skladu z navodili tega Primera smo potrdili s standardnimi tehnikami, kot sta nefelometrija in meijenje širine pikov pri protonski NMR. Vama in učinkovita priprava farmacevtske sestave čistih vodnih raztopin homogenega kompleksa v skladu s postopki te iznajdbe je bila testirana na različnih in vivo živalskih modelih kot je prikazano v Tabeli 1-4.
PRIMER 3B
Sledimo postopku, opisanem v Primeru 3A, razen da 1750mg HPbCD z 7,4 hidroksipropilnimi skupinami na molekulo dodamo vodni raztopini s 126mg NMG in 350mg spojine s formulo 3. Molamo razmerje treh komponent tako nastale homogene raztopine je bilo lmol spojine s formulo 1 : 3moli NMG : 5molov HPbCD. Tej raztopini smo dodali 500mg zrnatega manitola, USP razvrščanja po stopnjah, in lOmg polisorbata-80 (Tween-80) NF. Utežni delež Tween-80 je bil 2.85% glede na spojino s formulo 3. Tako nastalo raztopino smo filtrirali in ohladili pod 0°C, kot je opisano v Primeru 3 A.
Tako ohlajeno raztopino uskladiščili v ampulah v nevlažnem okolju. Za pripravo farmacevtske sestavine, primerne za uporabo, dodamo 20ml sterilne vode.
PRIMER 4
Naslednji primeri predstavljajo uporabo NMR kemične mikrotitracijske tehnike za določitev konstant kemijskega ravnotežja = ravnotežnih konstant za tvorbo kompleksa 2,4-dihidroksi6-metil-fenilnega obroča (ne-kloro-aromatski obroč) in za 3,5-dikloro-2-metoksi-4-hidroksi6-metil fenilnega obroča (dikloro-aromatski obroč) NMG soli spojine s formulo 3 z 2hidroksipropil-P-ciklodekstrinom (HPbCD) s 7,4 in 3.4 hidroksipropilnimi skupinami na mol HPbCD in z 2-hidroksipropil -γ-ciklodekstrinom (HPgCD) s 4,4 hidroksipropilnimi skupinami na mol HPgCD. Meritve smo naredili z uporabo Varian XL 400 pri 400 Hz in 20°C.
A. ) Pripravili smo raztopino z lOmg spojine s formulo 3 na ml D2O in s 3 ekvivalenti Nmetil glukaminom (NMG). Tej raztopini smo dodali mg porcije HPbCD s 7.4 hidroksipropilnimi skupinami na molekulo HPbCD. Izmerili smo spremembe kemijskega premika 68. metilne skupine v formuli 3 in 54 metilenskih protonov v formuli 3 ob povečanem dodatku HPbCD. Z uporabo standardnih tehnik smo izračunali konstante kemijskega ravnotežja za 50% kompleksacijo. Prav tako smo določili ustrezno število molov HPbCD za doseg 90% kompleksacije (=tvorbo kompleksa) in za vezavo obeh aromatskih obročev. Za dosego 90% kompleksacije na obeh aromatskih mestih je potrebno 6.6 molov HPbCD, 2 mola HPbCD pa sta potrebna za dosego 50% tvorbe kompleksa. Konstante kemijskega ravnotežja so podane v Tabeli 8.
B. ) Uporabili smo postopek opisan v primeru 4A. le da smo uporabili HPbCD z 3.4 hidroksipropilnimi skupinami na mol HPbCD. Rezultati so podani v Tabeli 8. Število molov
HPbCD potrebnih za dosego 90% kompleksacije na obeh aromatskih mestih je bilo 6,6 molov.
C.) Uporabili smo postopek, opisan v Primeru 4C, le da smo uporabili HPgCD s 4,4 hidroksipropilnimi skupinami na mol HPgCD. 4.0 molov HPgCD je bilo potrebnih za dosego 90% kompleksacije, 1.4 molov pa je ustrezalo 50 % kompleksaciji. Rezultati so podani v Tabeli 8 spodaj:
Tabela 8
Konstante kemijskega ravnotežja (litri/mol) za komplekse lmola spojine 3 : 3 molom NMG z HPbCD in HPgCD
mesto tvorbe kompleksa na spojini 2 HPbCD nl=7.4 HPbCDn 1=3,4 HPgCDn2=4.4
ne-kloro-aromatski obroč3 188+5 188+5 355+9
3dikloro-
aromatski^ obroč 953+18 983+34 315+28
^n = pomeni šrevilo hidroksipropilnih skupin na molekulo HPbCD 2n = pomeni šrevilo hidroksipropilnih skupin na molekulo HPgCD 3ne-kloro-aromatski obroč v 3 •^dikloro-aromatski obroč v 3
OH
Z uporabo NMR kemične mikrotitracijske tehnike smo določili kompleksijsko količino HPbCD z 7.4 hidroksipropilnih skupin na molekulo HPbCD odgovarjajočo 1 ml 3:1 NMG soli antibiotika s formulo 3. Ta količina je 6.6 molov za dosego 90% kompleksa (na obeh aromatskih skupinah formule 3) in 2 mola za dosego 50% kompleksa na obeh aromatskih skupinah formule 3.

Claims (10)

  1. PATENTNI ZAHTEVKI
    1. Sestavek, označen s tem, da vsebuje
    a) lipofilni oligosaharidni antibiotik predstavljen s formulo 1 x=NO2, NO, NH2, NHCOCH3, NHOH, NH^Hsb, N(C2Hsi2, OH ali H; R2=CH3. COCH(CH3)2. COCH3, CO(CH2)3CH3. COCHoCHt ali H. R3=CH3 ali H
    R4=COCH3, CH(OCH3)(CH3) ,CH(OH)CH3, CHO ali H;
    ali H
    R6=CH3 ali H Y=OH. CH3 ali H
    R7=CH3 ali H W=C1 ali H
    R8=CH3.CH2OH ali H Z=C1 ali H
    R9=CH3 ali H
    b) najmanj približno stchiometrično količino baze, ki je sposobna tvorbe farmacevtsko sprejemljive soli z lipofilnitn oligosabaridnim antibiotikom s formulo 1,
    c) količino dimctilsulfoksida, glicerol, derivat sorbitan mono-9-oktadecenoat poli(oksi-1.2etandiil), dekstran. hidroksipropil-a-.-B- ali -γ-ciklodekstrin. v katerem je povprečno število hidroksipropilnih substituent na molekulo α-, B- ali γ-ciklodekstrina v obsegu od približno 2 do približno 15 in. da omenjena količina zadostuje za učinkovito dovajanje tega lipofilnega oligosaharidnega antibiotika v serum živali, obenem preprečimo tudi neugoden reakcijski sindrom.
    d) 0 do 6 masnib% (osnova je antibiotik s formulo I) farmacevtsko sprejemljivega ncionskega surfaktanta
  2. 2. Sestavek označen s tem. da vsebuje
    a) spojino predstavljeno s formulo 2
    OH kjer je x=NO2. NO, NH2, NHCOCH3, NHC2H5, N(C2H5)2, OH ali y=OH, CH3 ali H R2=H ali CH3 R3=H
    R4=H ali CH(OCH3)(CH3) m H,
    R5=H ali
    Me iX,
    C=O
    b) najmanj približno stchiometrično količino baze, ki jc sposobna tvorbe farmacevtsko sprejemljive soli z lipofilnim oligosaharidnim antibiotikom, ki jc predstavljen s formulo 2,
    c) hidroksipropil-α-,-B- ali -γ-ciklodekstrin, kjer je povprečno število hidroksipropilnih substituent na molekulo -α-.-β- ali -γ-ciklodekstrina v obsegu od približno 2 do približno 15 in. da omenjena količina zadostuje za učinkovito dovajanje omenjenega lipofilnega oligosaharidnega antibiotika v serum živali, obenem preprečimo tudi neugoden reakcijski sindrom.
    d) od 0 do 6 niasnih% (osnova je spojina s formulo 2) farmacevtsko sprejemljivega neionskega surfaktanta.
  3. 3. Sestavek, označen s tem, da vsebuje
    a) spojino predstavljeno s formulo 3.
    OH
    OH
    b) vsaj dva ekvivalenta baze (na mol oligosaharidnega antibiotika s formulo 3). ki jc sposobna tvorbe farmacevtsko sprejemljive soli z oligosaharidnim antibiotikom, predstavljeno s formulo 3,
    c) hidroksipropil-α-.-Β- ali -γ-ciklodekstrin. ki ima približno 2 do približno 15 hidroksilnih skupin na mol, njegova količina zadostuje za učinkovito dovajanje lipofilnega oligosaharidnega antibiotika v serum živali, obenem preprečimo tudi neugoden reakcijski sindrom, vsebuje še od 0 do 6 utežnih% (osnova je spojina s formulo 3) farmacevtsko sprejemljivega ncionskcga surfaktanta.
  4. 4. Sestavek iz zahtevka 1. označen s tem. da so v njem lipofilni oligosaharidni antibiotiki, predstavljeni s formulo 1. izbrani izmed: flambamicina eveminomicinov. antibiotikov eveminomicinskega tipa. kuramicina in avilamicin A-N antibiotikov.
  5. 5. Farmacevtski sestavek za zdravljenje občutljivih gram-pozitivnih in gram-negativnih bakterijskih infekcij, označen s tem, da vsebuje antiinfekcijsko količino sestavka iz zahtevkov 1,2 ali 3 in njihov farmacevtsko sprejemljiv nosilec.
  6. 6. Sestavek iz zahtevkov 1, 2 ali 3, označen s tem, da je baza izbrana izmed kloroprokaina, prokaina, piperazina, glukamina, N-metilglukamina, Ν',Ν'-dimetilglukamina. etilendiamina, dictanolamina, diizopropilamina. Ν.Ν'-dibcnziletilendiamina. klemizola.
    tris(hidroksimetil)atninometana, D-glukozamina ali NaOH.
  7. 7. Sestavek iz zahtevkov I, 2 ali 3, označen s tem, daje v njemu baza N-metilglukamin.
  8. 8. Sestavek iz zahtevkov 1,2 ali 3, označen s tem, daje v njemu uporabljen hidroksipropil-Bciklodckstrin.
  9. 9. Farmacevtski sestavki iz zahtevka 5, označeni s tem. da je molnmo razmerje (a):(b):(c) 1:2-3:1-6.
  10. 10. Uporaba sestavka iz zahtevkov 1, 2 ali 3, označena s tem. da je namenjena izdelavi zdravila za zdravljenje ali preprečevanje gram-pozitivnih ali gram-negativnih infekcij pri živalih.
SI19929200260A 1991-10-16 1992-10-16 Lipophilic oligosaccharide antibiotic salt compostition SI9200260A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US77786491A 1991-10-16 1991-10-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SI9200260A true SI9200260A (en) 1993-06-30

Family

ID=25111545

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SI19929200260A SI9200260A (en) 1991-10-16 1992-10-16 Lipophilic oligosaccharide antibiotic salt compostition

Country Status (27)

Country Link
US (1) US5624914A (sl)
EP (2) EP0610295A1 (sl)
JP (1) JP2614407B2 (sl)
KR (1) KR100249584B1 (sl)
CN (1) CN1035923C (sl)
AT (1) ATE156019T1 (sl)
AU (1) AU678344B2 (sl)
CA (1) CA2121345C (sl)
DE (1) DE69221252T2 (sl)
DK (1) DK0538011T3 (sl)
ES (1) ES2104845T3 (sl)
FI (1) FI941723A7 (sl)
GR (1) GR3024800T3 (sl)
HK (1) HK1001085A1 (sl)
HR (1) HRP921069B1 (sl)
HU (1) HUT75157A (sl)
IL (1) IL103446A (sl)
MX (1) MX9205922A (sl)
NO (1) NO307326B1 (sl)
NZ (1) NZ244735A (sl)
PH (1) PH31675A (sl)
PL (1) PL170591B1 (sl)
SI (1) SI9200260A (sl)
TW (1) TW221378B (sl)
WO (1) WO1993007904A1 (sl)
YU (1) YU48722B (sl)
ZA (1) ZA927923B (sl)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5948688A (en) * 1991-10-16 1999-09-07 Schering Corporation Method of determining monomeric drug content
US6380172B1 (en) 1991-10-16 2002-04-30 Schering Corporation Monomeric lipophilic oligosaccharide antibiotic compositions
US5652226A (en) * 1995-12-22 1997-07-29 Schering Corporation Water soluble antibiotics
US5776912A (en) * 1996-12-20 1998-07-07 Schering Corporation Lipophilic oligosaccharide antibiotic compositions
US5763600A (en) * 1997-04-18 1998-06-09 Schering Corporation Oligosaccharide antibiotics and process for preparation thereof
AU9597198A (en) * 1997-10-03 1999-04-27 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Imine-forming polysaccharides, preparation thereof and the use thereof as adjuvants and immunostimulants
US6162910A (en) * 1998-11-30 2000-12-19 Schering Corporation Process for preparing lipophilic oligosaccharide antibiotics
CO5231233A1 (es) * 1998-12-18 2002-12-27 Cherinf Corp Proceso para recuperar antibioticos oligosacaridos lipofilic lipofilicos
US6320044B1 (en) 1998-12-18 2001-11-20 Schering Corporation Process for recovering lipophilic oligosaccharide antibiotics
AU2003201A (en) * 1999-12-01 2001-06-12 Byk Gulden Lomberg Chemische Fabrik Gmbh Novel use of lung surfactant
US6861513B2 (en) 2000-01-12 2005-03-01 Schering Corporation Everninomicin biosynthetic genes
ATE416791T1 (de) * 2000-05-02 2008-12-15 Theravance Inc Zusammensetzung die eine zyklodextrin und ein glykopeptid-antibiotikum enthält
US6699505B2 (en) * 2000-10-17 2004-03-02 Massachusetts Institute Of Technology Method of increasing the efficacy of antibiotics by compexing with cyclodextrins
DE10109166A1 (de) * 2001-02-25 2002-09-12 Combinature Biopharm Ag Avilamycin-Derivate
CA2560266A1 (en) * 2004-03-17 2005-09-29 Panacos Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical salts of 3-o-(3',3'-dimethylsuccinyl) betulinic acid
EP1977874A3 (en) * 2004-12-01 2008-10-15 Nitto Denko Corporation Foam Filling Member
EP1868613B1 (en) * 2005-04-12 2012-03-07 Myrexis, Inc. Polymorphs of 3-o-(3',3'-dimethylsuccinyl) betulinic acid di-n-methyl-d-glucamine
JP5503543B2 (ja) * 2007-09-14 2014-05-28 サノフィ パスツール バイオロジクス リミテッド ライアビリティ カンパニー クロストリジウム・ディフィシレトキソイドａおよびｂを含有する薬学的組成物
JP2010095454A (ja) * 2008-10-14 2010-04-30 Cyclochem:Kk 抗菌組成物
WO2012097223A2 (en) * 2011-01-14 2012-07-19 Emory University Oligosaccharide conjugates for targeting bacteria and uses related thereto
WO2016201137A1 (en) 2015-06-10 2016-12-15 Vtesse, Inc. Hydroxypropyl beta-cyclodextrin compositions and methods
CN106317143B (zh) * 2016-08-23 2020-10-30 河北圣雪大成制药有限责任公司 一种提取阿维拉霉素的方法
AU2023220047A1 (en) 2022-02-18 2024-09-19 Beren Therapeutics P.B.C. Compositions of hydroxypropyl-beta-cyclodextrin and methods of purifying the same
CN117024611B (zh) * 2023-03-01 2024-05-17 中国科学院南海海洋研究所 寡糖类抗生素everninomicin高产菌株的构建及活性的应用

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR128F (sl) * 1962-04-02
US3915956A (en) * 1973-07-09 1975-10-28 Schering Corp Reduction products of everninomicins and methods for their manufacture
US3920629A (en) * 1973-09-19 1975-11-18 Schering Corp Desevernitrose everninomicins and method for their manufacture
US4006225A (en) * 1973-10-31 1977-02-01 Schering Corporation Method of using reduction products of everninomicins as antibacterial agents and pharmaceutical compositions useful therefor
US4027016A (en) * 1976-01-19 1977-05-31 Schering Corporation Everninomicin antibacterial derivatives, electrochemical method for their manufacture, method for their use as antibacterial agents, and pharmaceutical compositions useful therefor
US3998708A (en) * 1976-01-19 1976-12-21 Schering Corporation Electrochemical process for preparing hydroxylaminoeverninomicins
US4129720A (en) * 1977-02-14 1978-12-12 Schering Corporation Aminoeverninomicin and derivatives thereof
US4597968A (en) * 1982-08-06 1986-07-01 Schering Corporation Antibiotic 13-384 complex from Micromonospora carbonacea var africana
DE3346123A1 (de) * 1983-12-21 1985-06-27 Janssen Pharmaceutica, N.V., Beerse Pharmazeutische praeparate von in wasser schwerloeslichen oder instabilen arzneistoffen und verfahren zu ihrer herstellung
US4596795A (en) * 1984-04-25 1986-06-24 The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health & Human Services Administration of sex hormones in the form of hydrophilic cyclodextrin derivatives
US4727064A (en) * 1984-04-25 1988-02-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Pharmaceutical preparations containing cyclodextrin derivatives
US4735903A (en) * 1984-06-21 1988-04-05 Schering Corporation Micromonospora carbonacea var africana
US4870060A (en) * 1985-03-15 1989-09-26 Janssen Pharmaceutica Derivatives of γ-cylodextrin
US4622314A (en) * 1985-10-15 1986-11-11 Schering Corporation Substituted oligosaccharide antibiotics
US4767748A (en) * 1985-10-15 1988-07-30 Schering Corporation Substituted oligosaccharide antibodies
US5002935A (en) * 1987-12-30 1991-03-26 University Of Florida Improvements in redox systems for brain-targeted drug delivery
US5017566A (en) * 1987-12-30 1991-05-21 University Of Florida Redox systems for brain-targeted drug delivery
KR0166088B1 (ko) * 1990-01-23 1999-01-15 . 수용해도가 증가된 시클로덱스트린 유도체 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
CA2121345C (en) 1998-08-25
EP0610295A1 (en) 1994-08-17
HU9401104D0 (en) 1994-07-28
CN1035923C (zh) 1997-09-24
ES2104845T3 (es) 1997-10-16
YU48722B (sh) 1999-07-28
MX9205922A (es) 1994-08-31
ATE156019T1 (de) 1997-08-15
DE69221252T2 (de) 1998-01-22
FI941723A0 (fi) 1994-04-14
YU92192A (sr) 1996-01-09
DE69221252D1 (de) 1997-09-04
AU678344B2 (en) 1997-05-29
NO941276D0 (no) 1994-04-08
JPH06510546A (ja) 1994-11-24
NO941276L (no) 1994-04-08
GR3024800T3 (en) 1998-01-30
US5624914A (en) 1997-04-29
TW221378B (sl) 1994-03-01
EP0538011B1 (en) 1997-07-30
PH31675A (en) 1999-01-18
KR100249584B1 (ko) 2000-04-01
DK0538011T3 (da) 1997-09-08
NZ244735A (en) 1995-12-21
HRP921069B1 (en) 1999-12-31
FI941723A7 (fi) 1994-04-14
EP0538011A1 (en) 1993-04-21
IL103446A0 (en) 1993-03-15
IL103446A (en) 1997-02-18
HRP921069A2 (en) 1994-12-31
WO1993007904A1 (en) 1993-04-29
CA2121345A1 (en) 1993-04-29
AU2780692A (en) 1993-05-21
NO307326B1 (no) 2000-03-20
ZA927923B (en) 1993-04-26
HK1001085A1 (en) 1998-05-22
CN1073359A (zh) 1993-06-23
HUT75157A (en) 1997-04-28
PL170591B1 (pl) 1997-01-31
JP2614407B2 (ja) 1997-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SI9200260A (en) Lipophilic oligosaccharide antibiotic salt compostition
HK1001085B (en) Lipophilic oligosaccharide antibiotic salt compositions
CN102215690B (zh) 抗微生物组合物
UA75083C2 (uk) Похідні глікопептидфосфонатів
US5776912A (en) Lipophilic oligosaccharide antibiotic compositions
CN113413389A (zh) 一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的制剂及其制备方法和用途
JP7526175B2 (ja) Ｂｃｌ－２阻害剤のシクロデキストリンに基づく製剤
JP3597239B2 (ja) 安定な点眼剤
EP0399716B1 (en) Hypoallergenic steroidal anesthetic/hypnotic compositions
EP0165123A2 (fr) Dérivés lipophiles de muramylpeptides ayant des propriétés d&#39;activation des macrophages, compositions les contenant et procédé pour les obtenir
US7795207B2 (en) Lipopeptide compositions
CA2371942A1 (en) Pseudomycin antifungal compositions and methods for their use
CN101370524A (zh) 脂肽组合物
EP1994938A1 (en) New lipoglycodepsipeptide compositions
JPH05271237A (ja) ランカシジン群抗生物質包接体
AU2015276911A2 (en) Methods for treating infections
JPH02172913A (ja) ポリプレニル系化合物含有注射剤